ホーム > 特許ランキング > Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＡＧ
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-28
(45)【発行日】2023-12-06
(54)【発明の名称】フィブリノーゲン検査
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20231129BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20231129BHJP
C12N 9/64 20060101ALI20231129BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
C12Q1/37
C12N9/64 Z
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2020537653
(86)(22)【出願日】2019-01-25
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-05-06
(86)【国際出願番号】 EP2019051926
(87)【国際公開番号】W WO2019068940
(87)【国際公開日】2019-04-11
【審査請求日】2022-01-24
(31)【優先権主張番号】18153494.2
(32)【優先日】2018-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】523032847
【氏名又は名称】ペンタファーム アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(72)【発明者】
【氏名】ヤンセン， マイケル， ヨハネス
(72)【発明者】
【氏名】プン， サン
【審査官】中村 直子
(56)【参考文献】
【文献】特開昭６０－０６６９９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特公昭５７－０１０７１８（ＪＰ，Ｂ１）
【文献】特表２０１２－５２２４９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５３３０３３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
Ｃ１２Ｑ １／３７
Ｃ１２Ｎ ９／６４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法であって、サンプルにセリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］及び検出基質を添加することを含み、
前記検出基質は、前記セリンエンドペプチダーゼの作用を介した酵素的切断によって、検出可能な成分を放出する検出基質であり、
前記検出可能な成分を検出することを含む、方法。
【請求項2】
酵素的切断反応を含み、フィブリノーゲンの酵素的切断は、前記サンプル中に存在する検出基質の酵素的切断と競合する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
酵素的切断の速度は、前記サンプル中のフィブリノーゲンレベルに依存する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記検出基質の酵素的切断の速度が、前記サンプル中の前記フィブリノーゲンレベルに反比例する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＣａＣｌ２の非存在下において及び／又はトロンビン活性の非存在下において実行される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
トロンビン阻害剤の存在を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
検量線の生成及び／又はフィブリノーゲン標準物質の生成／存在を含まない、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記サンプルは、血液又は血漿から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
中央血液検査室若しくは中央臨床検査室、緊急治療室、病院外でさえも生じる緊急事態、医療現場、個人の家、小牧場、家畜小屋、又は簡易迅速検査（ＰＯＣＴ）環境において使用される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法の実行に使用するための診断キットであって、
セリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］と、
前記セリンエンドペプチダーゼの作用を介した酵素的切断によって、検出可能な成分を放出する検出基質と、を含む、診断キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本発明は、サンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための新規で直接的な方法に関し、この方法は、緊急事態において特に有用である。新規な方法は、トロンビン形成に依存せず、一般的に使用される血液凝固アッセイに都合の悪い経口抗凝固薬又は他の化学物質の存在によって干渉されない。
【0002】
フィブリノーゲンは、主に肝臓によって合成され、正常範囲は１．５～３ｍｇ／ｍｌ血漿の間にある。フィブリノーゲンは、出血障害及び血栓形成において生じるクロット形成の一部である。通常の条件下では、フィブリノーゲン構成体は、トロンビン（第ＩＩａ因子）の作用によって活性化され、フィブリノーゲンのアルファポリペプチド鎖及びベータポリペプチド鎖のＮ末端から２つの短いペプチド、すなわちフィブリノペプチドＡ及びＢが切断される。フィブリンモノマーの新しく形成されたＮ末端は、フィブリンモノマーのＣ末端と自然に相互作用し、フィブリンポリマーを形成し、これは、第ＸＩＩＩａ因子の影響下で、架橋され、クロット形成としても知られている架橋フィブリンポリマーを形成する。
【0003】
大量の失血の場合、トロンビン又はプロトロンビンは、レベルが非常に低下しているが、凝固カスケードをまだ十分に維持することができ、フィブリノーゲンが、危機的なレベルに達する第１の重要な凝固因子となる。血餅の質は、フィブリノーゲン濃度に非常に依存している。そのため、フィブリノーゲンの状況は、緊急入院に際して重要な情報となる。瞬時の正確なフィブリノーゲンレベル決定は、術前、術中、及び術後の段階で、特に、たとえば心臓又は肝臓の手術などのような出血リスクが高い外科手術の準備において医学的戦略を生み出すための最優先事項となる。フィブリノーゲンレベルが危機的な濃度を下回る場合、患者は、フィブリノーゲン濃縮物及びその他同種のもので補充される必要がある。
【0004】
現在、すべての利用可能な検査は、様々なレベルで引き起こされる血液凝固カスケードに依存し、サンプル中のフィブリノーゲンレベルを直接的に決定できない。血液又は血漿などのようなサンプルへのＣａＣｌ２の追加と同時に血液凝固の形成が測定される。検査の精度は、すべて前記血液凝固カスケードの様々な部分にねらいを定めるたとえばヘパリン、ビタミンＫアンタゴニスト、又は直接的若しくはいわゆる新規経口抗凝血薬（ＤＯＡＣ若しくはＮＯＡＣ）などのような薬剤によって非常に影響を及ぼされる又は干渉される。これらの干渉する薬剤は、患者に高いリスクを引き起こすかもしれない間違った結果をもたらし得る。
【0005】
最近のスタンダードは、高度な専門技術と共に、多くの時間を要し且つ特別なバッファー及びトロンビン試薬を必要とするいわゆる「Ｃｌａｕｓｓアッセイ」（Ｍａｃｋｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００２ Ｊｕｎ；８７（６）：９９７－１００５）である。検量線の作成は簡単ではない。この方法は、フィブリノーゲン濃度を求めた基準サンプルにおける血液凝固能力と検査サンプルにおける血液凝固能力との間での比較に基づく。他の因子、たとえば、定量化において無視することができない血液凝固の間の第ＸＩＩＩ因子の関与、薬剤若しくはホルモンのような内因性若しくは外因性の発生源に由来する血液構成要素の違い、及び／又は様々なサプライヤーからの機器及び試薬における違いが、この方法を、多くのパラメーターからの干渉を受けやすいものにしている。よって、フィブリノーゲンレベルを直接測定することは不可能である。
【0006】
さらなる利用可能な方法は、プロトロンビン時間（ＰＴ）の決定であり、これは、終点測定の点からＣｌａｕｓｓアッセイに似ている、すなわち、血漿フィブリノーゲンレベルは、血液凝固カスケードに関与する因子の光学測定又は機械的強度測定によって間接的に定められる。この方法でも、フィブリノーゲンレベルの直接的な測定は不可能である。Ｃｌａｕｓｓアッセイと比較して、ＰＴの結果は、さらに変化しやすい。ＤＯＡＣ／ＮＯＡＣによる干渉を無視することができない。
【0007】
別の可能な方法は、抗原－抗体特異的相互作用の原理を使用する、免疫に基づくＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡ技術は、１ｍｌ当たりｎｇの範囲での濃度の検出に基づく、すなわち、ＥＬＩＳＡに適合する範囲に達するように、１００万倍の濃サンプル希釈を必要とし、これは、測定の間に、非常に間違えやすく、時間がかかり、且つ誤差を招く。さらに、この検査は、典型的に、４時間の臨床検査時間を必要とし、したがって、緊急事態に適用可能ではない。検査の実行及び／又は判断は、熟練の技術者による多くの専門的技術を必要とする。
【0008】
したがって、緊急事態においてだけでなく、簡易迅速（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ）検査（ＰＯＣＴ）が付き物の臨床検査室、個人の家、又は小牧場若しくは家畜小屋などのような獣医の一般的な作業環境において、フィブリノーゲンレベルの（毎日の）測定を容易にし、凝固カスケードから独立して機能する、フィブリノーゲンレベルの定量的決定をもたらし、したがって抗凝固薬又は他の干渉する化学物質によって（悪）影響を及ぼされない、より正確で、信頼でき、直接的で、プラットフォーム非依存性で、且つ高速な方法を開発することは、現在進行中の課題である。
【0009】
驚いたことに、発明者らは、今や、ヒト又は動物の両方において適用可能である、サンプル中のフィブリノーゲンレベルの直接的及び定量的測定を可能にするそのような検査方法を開発した。新規な検査方法は、凝固カスケードの活性化を必要とせず、したがって、先行技術の検査方法、たとえばＣｌａｕｓｓアッセイ又はＰＴとは対照的に、トロンビンの形成から独立して機能する。
【0010】
新規な検査は、酵素反応速度に基づき、セリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］、特にヘビ毒セリンエンドペプチダーゼ、好ましくはベノンビンＡ［ＥＣ ３．４．２１．７４］の活性が、たとえば血液又は血漿などのような与えられたサンプル中のフィブリノーゲンレベルに反比例する。新規な検査は、血液の凝固から独立して、すなわち、独立して且つトロンビン活性の測定なしで機能する。たとえば、ＣａＣｌ２を介してのトロンビンの活性化に基づき、クロット形成が測定される米国特許第４６９２４９６号明細書又は国際公開第２００１３６６６６号パンフレットにおいて記載される方法と異なり、新規な検査方法の原理は、血液の凝固カスケードの、たとえば内因的及び外因的経路両方の（意図的な）阻害に基づく。したがって、本発明によれば、フィブリノーゲンレベルは、サンプル中のフィブリノーゲン濃度の増加に反比例する、本明細書において定義されるセリンエンドペプチダーゼの酵素反応速度の変化を介して測定される。
【0011】
したがって、本発明は、たとえば血液又は血漿などのようなサンプル中のフィブリノーゲンを測定するための新規な方法及びたとえば血液又は血漿などのようなサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するために使用される診断キットに関し、前記方法は、ＣａＣｌ２の非存在下において及び／又はトロンビン活性の非存在下において実行される。
【0012】
特に、本発明は、たとえば血液又は血漿などのようなサンプル中のフィブリノーゲンを測定するための新規な方法及びそのようなサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するために使用される診断キットに関し、前記方法は、検量線の生成なしで及び／又はたとえばフィブリノーゲン標準物質などのような任意のさらなる基準物質の存在なしで直接適用される。
【0013】
さらに、本発明は、たとえば血液又は血漿などのようなサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法において及びそのような測定に使用される診断キットにおいて使用されるセリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］、特にヘビ毒セリンエンドペプチダーゼ、好ましくはベノンビンＡ［ＥＣ ３．４．２１．７４］に関する。
【0014】
さらに、本発明は、たとえば血液又は血漿などのようなサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法において及びそのような測定に使用される診断キットにおいて使用される（検出）基質、たとえば人工又は天然の（検出）基質、好ましくは人工の（検出）基質に関し、前記方法は、特に、セリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］、特にヘビ毒セリンエンドペプチダーゼ、好ましくはベノンビンＡ［ＥＣ ３．４．２１．７４］による前記基質の触媒的切断を含む。
【0015】
さらに、本発明は、たとえば血液又は血漿などのようなサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法において、及びそのような測定に使用される診断キットにおいて、及びそのような測定に使用される診断キットにおいて使用される、検出可能な成分に関し、前記方法は、特に、前記セリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］、特にヘビ毒セリンエンドペプチダーゼ、好ましくはベノンビンＡ［ＥＣ ３．４．２１．７４］の作用を介しての（検出）基質の触媒的切断による前記検出可能な成分の放出を含む。
【0016】
本明細書において使用されるように、フィブリノーゲンに関する用語「レベル」、「状況」、又は「濃度」は、本明細書において区別なく使用される。たとえば血液又は血漿などのような、与えられたサンプル中のフィブリノーゲンのレベルは、セリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］について検出された活性に反比例する。
【0017】
本明細書において使用される用語「酵素活性」は、タンパク分解活性、すなわち、当技術分野において知られており、本明細書において定義される方法を通して測定することができる（検出）基質からの検出可能な成分の放出をもたらす、本明細書において定義される（検出）基質の切断を指す。
【0018】
一実施形態では、本明細書において定義される方法／診断キットは、たとえば、クロット形成をもたらすフィブリン重合の阻害剤、特に、ヘパリンを含むが、これに限定されないトロンビン阻害剤などのようなプロテアーゼ阻害剤を含む。
【0019】
たとえば血液又は血漿などのようなサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法において使用される、本発明の実行に及びそのような測定に使用される診断キットにおいて使用される適したセリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］、特にヘビ毒セリンエンドペプチダーゼ、好ましくはベノンビンＡ［ＥＣ ３．４．２１．７４］は、たとえば、好ましくはＢ．モジェニ（Ｂ．ｍｏｏｊｅｎｉ）、カイサカ（Ｂ．ａｔｒｏｘ）、ジャララカ（Ｂ．ｊａｒａｒａｃａ）、Ｅ．ピラミダム（Ｅ．ｐｙｒａｍｉｄｕｍ）、カーペットバイパー（Ｅ．ｃａｒｉｎａｔｕｓ）、Ａ．ロドストマ（Ａ．ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）、タイワンハブ（Ｐ．ｍｕｃｒｏｓｑｕａｍａｔｕｓ）、Ｃ．ロドストマ（Ｃ．ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）、又はヒガシダイヤガラガラヘビ（Ｃ．ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）から選択されるアメリカヘビ属、マムシ属、トゲクサリヘビ属（Ｅｃｈｉｓ）、ハブ属、カロセラスマ属（Ｃａｌｌｏｓｅｌａｓｍａ）、トリメレスルス属、又はガラガラヘビ属由来のヘビ毒などのようなヘビ毒酵素から選択されてもよい。より好ましくは、酵素は、ボスロプス・モジェニ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｍｏｏｊｅｎｉ）（バトロキソビンとして知られている）若しくはカイサカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ）の毒から単離される又はバトロキソビン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４９７１など）と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、若しくはさらに１００％などのように少なくとも約５５％同一である酵素であり、カロビン（ｃａｌｏｂｉｎ）、アンクロッド（商品名Ｖｉｐｒｉｎｅｘ（登録商標）の下で売られている）、フラボキソビン（ｆｌａｖｏｘｏｂｉｎ）、クロタラーゼ（ｃｒｏｔａｌａｓｅ）として知られている酵素及び本明細書において定義されるセリンエンドペプチダーゼ活性を有するさらなる酵素を含むが、これらに限定されない。
【0020】
そのような測定に使用される診断キットを含む本発明の実行に使用される適した（検出）基質は、任意の人工又は天然の（検出）基質、特に人工の基質から選択されてもよく、これは、本明細書において定義されるセリンエンドペプチダーゼの作用を介して触媒的に切断することができ、本明細書において定義される基質からの検出可能な成分の放出をもたらす。
【0021】
したがって、一実施形態では、本発明は、たとえば血液又は血漿などのようなサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法において及びそのような測定に使用される診断キットにおいて使用される検出可能な成分に連結された（検出）基質に関する。
【0022】
検出方法は、ＰＯＣデバイス又は臨床検査において現在使用されている機械的（非クロットベースの）、電流測定（電気化学）、光学、電気機械的、光電気化学、電気発生、又はフォトメカニカル（ｐｈｏｔｏ－ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）検出を含むが、これらに限定されない。検出方法／技術は、検出可能な成分に連結された前記（検出）基質、特に人工の基質から前記セリンエンドペプチダーゼの前記酵素的切断によって放出された検出可能な成分の検出／測定に基づく。（検出）基質、特に人工の基質からの検出可能な成分の放出は、適切な方法／技術にとって検出可能な／測定可能なシグナルにおける変化をもたらす。特に、検出可能な成分は、（光）電気化学、電流発生（ａｍｐｅｒｏｇｅｎｉｃ）、色素生成、及び／又は蛍光発生を原理とする方法を通して検出することができる／測定することができる。
【0023】
一実施形態では、人工の基質は、表１における式（Ｉ）～（Ｘ）による基質、たとえば商品名Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ（登録商標）ＴＨ、Ｅｌｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＴＨ、Ｈ－Ｄ－フェニルアラニル－ピペコリル－アルギニン－ｐ－アミノ－ｐ－メトキシジフェニルアミン（ＰＰＡＡＭ）、トルオールスルホニル－グリシル－プロリニル－アルギニン－４－アミド－２－クロロフェノールの下で知られているものなど、又は国際公開第２００９０５３８３４号パンフレット（たとえば段落［００４７］）、国際公開第２００００５０４４６号パンフレット（たとえば５～６頁）、若しくは国際公開第２０１６０４９５０６号パンフレット（たとえば段落［００１８］及び［００１９］）による基質、又はＮ末端部に代替の保護基を有する式（Ｉ）～（Ｘ）の基質並びに／又は保護基と式（Ｉ）～（Ｘ）において示される第１のＮ末端アミノ酸との間にさらなるアミノ酸が導入された式（Ｉ）～（Ｘ）の基質を含むが、これらに限定されない。当業者は、どの保護基、たとえばブチルオキシカルボニル、ホルミル、及びその他同種のものを使用するべきであるかを知っている。
【0024】
【表1】
【0025】
サンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための本明細書において記載される方法及びそのような測定に使用される診断キットは、本明細書において定義される酵素のタンパク分解活性の検出を含み、前記方法は、たとえばＸｐｒｅｃｉａ Ｓｔｒｉｄｅ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ｉ－Ｓｔａｔ（登録商標）システム（Ａｘｏｎｌａｂ／Ａｂｂｏｔｔ）、ＥＳＲ若しくはｑＬａｂｓシステム（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ＆Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｒｅ ＩＮＲａｔｉｏ（登録商標）システム（Ａｌｅｒｅ（商標））、ＬａｂＰａｄ（登録商標）（Ａｖａｌｕｎ（登録商標））、ｍｉｃｒｏＩＮＲ（ｉＬｉｎｅ（登録商標） Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｍｉｓｓｉｏｎ（登録商標）ＰＴ（Ａｃｏｎ（登録商標））、又は血液分析の分野における検査室をベースとする検査若しくはＰＯＣＴのための当技術分野において使用される若しくは知られている他のシステムなどのような、そのようなタンパク分解活性の検出に適した任意のデバイスで実行することができる。
【0026】
本明細書において定義されるサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法及びそのような測定に使用される診断キットは、本明細書において定義される特定の検出可能な成分、すなわち、検出基質に連結された、たとえば蛍光発生基、色素生成基、電流発生基、及び／又は（光）化学基などのようなタンパク分解活性の検出を容易にする任意の化学基又は粒子群に連結された、定義される人工の及び／又は天然の基質、特に人工の基質に対する、たとえばバトロキソビンなどのような、本明細書において定義されるセリンエンドペプチダーゼのタンパク分解活性を測定することを含む。タンパク分解活性は、時間との関係、すなわちタンパク分解活性によるシグナル生成の速度で測定され、検出されるシグナルは、当技術分野において知られている様々な技術によって検出可能である、人工の及び／又は天然の、特に人工の基質の触媒的切断活性を指す。この速度は、フィブリノーゲンの存在によって影響を及ぼされる。ｐＮＡなどのような本明細書において定義される検出可能成分のタンパク分解放出は、たとえばＯＤ４０５などのような特定のＯＤで測定することができる。放出されるｐＮＡが多くなるほど、ＯＤ４０５が高いほど、たとえばバトロキソビンなどのような酵素が速く働くほど、反応中に存在するフィブリノーゲンは少ない。
【0027】
本明細書において使用されるように、「ＯＤ４０５」の測定は、４０５ｎｍの光線での光学濃度（ＯＤ）の測定を意味する。放出されたｐＮＡは、反応に色を与え、これを最大吸収（４０５ｎｍである）で測定することができる。
【0028】
したがって、サンプル中のハイレベルのフィブリノーゲン、すなわち、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌサンプルのレベルは、最も急勾配の曲線をもたらす、サンプル中少なくとも約０．３～０．６ｍｇ／ｍｌサンプルの又はフィブリノーゲンが全くないフィブリノーゲンレベルと比較して、最小の急勾配の曲線をもたらす（検出、切断される基質が少ないことを指す）（図１を参照されたい）。シグナル生成の速さは、サンプル中のフィブリノーゲン濃度に直接依存し、フィブリノーゲンの酵素的切断と検出可能な成分を含有する（人工の及び／又は天然の）基質の酵素的切断との間の競合の指標となり、両方の反応は、本明細書において定義されるセリンエンドペプチダーゼの活性によって触媒される。
【0029】
本発明の実行に使用される適したサンプルは、たとえばヒト又はたとえばウシ、ウマ、若しくは家で飼われる一般的なペットなどのような動物から単離されたなどのように、好ましくは哺乳類から単離された、未知の濃度のフィブリノーゲンを含有する任意の液体、特に血液又は血漿であってもよい。血液サンプルの場合、血液は、バキュテナー中に収集されてもよい全（静脈若しくは動脈）血キャピラリーサンプルの形態で患者／検査対象から又は指穿刺によって、新たに採取されてもよい（すなわち未処理の血液サンプル）。サンプルは、凍結サンプルの使用を含む任意の他の形態でさらに処理されてもよい（すなわち処理済みの血液サンプル）。本明細書において記載される方法はまた、未処理の形態をした又はたとえば凍結された、分離された、及びその他同種のものなどのように処理済みの形態をした血漿サンプルにも適用可能である。
【0030】
一実施形態では、本発明は、本明細書において定義されるサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法であって、前記サンプルは新鮮な全血から選択される方法及びそのような測定に使用される診断キットに関し、測定には、好ましくは、電流発生又は色素生成（検出）基質が存在する。
【0031】
一実施形態では、本発明は、本明細書において定義されるサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法であって、前記サンプルは血漿から選択される方法及びそのような測定に使用される診断キットに関し、測定には、好ましくは、色素生成又は電流発生（検出）基質が存在する。
【0032】
これまでに知られている典型的な臨床検査と比較した、本明細書において定義される、フィブリノーゲンレベルを測定するための方法及びそのような測定に使用される診断キットのいくつかの有利な特徴は、以下のとおりである：
（１）たとえば通常のＰＴと比較して、使用が簡単である
（２）検量線の生成を必要としない、すなわち、基準物質、たとえばフィブリノーゲン標準物質が必要とされない
（３）低費用で迅速に結果が出る
（４）患者サービスがずっと向上している、すなわちフィブリノーゲンレベルがより迅速でより正確に測定され、ふさわしい医学的又は外科的介入が、ずっと速く、より確実に決まる
（５）サンプルの輸送及び処理におけるリスク及び費用の低下
（６）たとえばヘパリン、ＮＯＡＣ、及び／又はＤＯＡＣなどのような抗凝血薬による干渉がない
（７）多段階カスケードに頼るアッセイと比較して、（好ましくは）単一の酵素ステップをターゲティング
（８）たとえばｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）などのようなデバイスのＩＮＲ機能だけに注目すると、ＰＴ－ＩＮＲ結果は、各患者のフィブリノーゲンレベルを考慮に入れた場合、ずっと信頼できるものになる。
（１）たとえば通常のＰＴと比較して、使用が簡単である
（２）検量線の生成を必要としない、すなわち、基準物質、たとえばフィブリノーゲン標準物質が必要とされない
（３）低費用で迅速に結果が出る
（４）患者サービスがずっと向上している、すなわちフィブリノーゲンレベルがより迅速でより正確に測定され、ふさわしい医学的又は外科的介入が、ずっと速く、より確実に決まる
（５）サンプルの輸送及び処理におけるリスク及び費用の低下
（６）たとえばヘパリン、ＮＯＡＣ、及び／又はＤＯＡＣなどのような抗凝血薬による干渉がない
（７）多段階カスケードに頼るアッセイと比較して、（好ましくは）単一の酵素ステップをターゲティング
（８）たとえばｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）などのようなデバイスのＩＮＲ機能だけに注目すると、ＰＴ－ＩＮＲ結果は、各患者のフィブリノーゲンレベルを考慮に入れた場合、ずっと信頼できるものになる。
【0033】
一態様では、本発明は、以下のステップを含む、サンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法及びそのような測定に使用される診断キットに関する：
（１）サンプル、たとえば指穿刺によって採取されたヒト若しくは動物の血液、バキュテナーからの静脈血若しくは動脈血、又は血漿などのような、たとえば患者又は検査対象から採取された血液を提供すること；
（２）たとえばセリンエンドペプチダーゼ、検出可能な成分に連結された検出基質、任意選択で阻害剤、物理チャネル、及びデバイス中に見つけられる検出器又は検出器の一部などのような必要な構成要素をすべて含む、それぞれのカートリッジ又は検査ストライプ（検出システム又はデバイスに依存）の中へのサンプルの挿入；
（３）それぞれのデバイスの中へのカートリッジ又は検査ストライプの挿入；並びに
（４）結果、すなわちサンプル中のフィブリノーゲンレベルの報告及び伝達を含むサンプルの分析。
（１）サンプル、たとえば指穿刺によって採取されたヒト若しくは動物の血液、バキュテナーからの静脈血若しくは動脈血、又は血漿などのような、たとえば患者又は検査対象から採取された血液を提供すること；
（２）たとえばセリンエンドペプチダーゼ、検出可能な成分に連結された検出基質、任意選択で阻害剤、物理チャネル、及びデバイス中に見つけられる検出器又は検出器の一部などのような必要な構成要素をすべて含む、それぞれのカートリッジ又は検査ストライプ（検出システム又はデバイスに依存）の中へのサンプルの挿入；
（３）それぞれのデバイスの中へのカートリッジ又は検査ストライプの挿入；並びに
（４）結果、すなわちサンプル中のフィブリノーゲンレベルの報告及び伝達を含むサンプルの分析。
【0034】
本発明による方法及び／又は診断キットは、上記に明記されるものを含むが、これらに限定されない、任意の知られている、検査室をベースとする凝固分析機器などのような、様々な知られている検査デバイスで実行することができる。
【0035】
検査システム／デバイスに依存して、新規な方法及び／又は診断キットは、湿式化学又はドライケミストリーで使用することができる、すなわち、構成要素（基質、酵素、阻害剤、及びその他同種のものを含む）は、たとえばチューブ／カートリッジ中でのように液体形態をしている又は構成要素（基質、酵素、阻害剤、及びその他同種のもの）は、たとえば検査ストリップ上でのように固体形態をしている。測定されるサンプル、たとえば血液又は血漿サンプルは、前記構成要素と接触させられ、それぞれのシグナルが、最適なデバイスによって測定される。検査デバイスは、タブレットコンピュータ又はスマートフォンなどのような遠隔装置に接続されてもよい。
【0036】
一実施形態では、本明細書において定義されるフィブリノーゲンレベルの測定及びそのような測定に使用される診断キットは、処理済みの又は未処理のサンプル、特に血液又は血漿サンプル、好ましくはヒト血液又は血漿サンプルにおいて、Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）システムを使用して実行され、基質は、表１に列挙される式（Ｉ）～（Ｘ）による基質、Ｎ末端部に代替の保護基を有する式（Ｉ）～（Ｘ）の基質、及び／又は保護基と式（Ｉ）～（Ｘ）において示される第１のＮ末端アミノ酸との間にさらなるアミノ酸が導入された式（Ｉ）～（Ｘ）の基質からなる群から選択される基質を含むが、これらに限定されない、ただし、ｐＮＡは、ＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）システムに適した別の検出可能な成分、たとえばＥｌｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＴＨとして市販で入手可能な、たとえばフェニレンジアミンと置き換えられることを条件とする。前記基質は、好ましくは、本明細書において定義されるセリンエンドペプチダーゼ、特にバトロキソビンと共にインキュベートされ、ＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）デバイスなどのようなデバイスによって測定される／分析される電気化学（又は検出成分に依存して他のシグナル）シグナルをもたらす。シグナル生成について測定された速さは、検査されたサンプル中のフィブリノーゲン濃度に反比例する。
【0037】
さらなる実施形態では、本明細書において定義されるフィブリノーゲンレベルの測定及びそのような測定に使用される診断キットは、処理済みの又は未処理のサンプル、特に血液又は血漿サンプル、好ましくはヒト血液又は血漿サンプルを含むが、これらに限定されないサンプルにおいて、Ａｘｏｎｌａｂ／Ａｂｂｏｔｔのｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）を使用して実行され、たとえばＨ－Ｄ－フェニルアラニル－ピペコリル－アルギニン－ｐ－アミノ－ｐ－メトキシジフェニルアミン（ＰＰＡＡＭ）などのような基質又は表１に列挙される式（Ｉ）～（Ｘ）による基質、Ｎ末端部に代替の保護基を有する式（Ｉ）～（Ｘ）の基質、及び／若しくは保護基と式（Ｉ）～（Ｘ）において示される第１のＮ末端アミノ酸との間にさらなるアミノ酸が導入された式（Ｉ）～（Ｘ）の基質からなる群から選択される基質を含むが、これらに限定されない基質であり、ただし、ｐＮＡは、たとえばｐ－メトキシジフェニルアミンなどのような、ｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）デバイスに適した別の検出可能な成分と置き換えられることを条件とする。前記基質は、好ましくは、本明細書において定義されるセリンエンドペプチダーゼ、特にバトロキソビンと共にインキュベートされ、たとえばｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）デバイスなどのような適したデバイスによって測定される／分析される電気化学シグナルをもたらす。測定されたシグナルは、検査されたサンプル中のフィブリノーゲン濃度に反比例する。計算の結果は、シグナルとフィブリノーゲン濃度との間で直線的又は非直線的となり得る（図１を参照されたい）。
【0038】
当分野において知られている他のデバイスで実行するために、本明細書において定義されるフィブリノーゲンレベルの測定に使用される診断キットを含む、本明細書において定義されるフィブリノーゲンレベルの測定は、当業者に知られているそれぞれのデバイスにさらに適合されてもよい。
【0039】
本発明の一態様では、患者又は検査対象のフィブリノーゲンレベルは、緊急事態において測定される、すなわち、結果は、できるだけ速く入手可能になるべきである。デバイス検出システムに依存して、サンプル中のフィブリノーゲンレベルは、約７、５、４、３、又はさらに約２分などのように、約１０分未満の範囲内で測定することができる。
【0040】
したがって、本発明は、本明細書において定義されるサンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法に関し、結果、すなわちサンプル中に存在するフィブリノーゲンのレベルは、本明細書において記載される（検出）基質のタンパク質分解切断の開始から数えて、約７、５、４、３、又はさらに約２分などのように、約１０分未満の範囲内で入手可能となる。
【0041】
本発明による直接的なフィブリノーゲン測定は、血液凝固時間、トロンビン活性又は抗トロンビン活性、組織因子アッセイなどを含むが、これらに限定されない他の凝固検査と組み合わせることができる。
【0042】
本明細書において使用されるように、本明細書において記載されるサンプル中のフィブリノーゲンレベルの測定に関する用語「分析」は、デバイス及び（検出）基質に依存する特定のアルゴリズムの実行を含み、基質は、天然の又は人工の基質、特に人工の基質であってもよく、サンプル中のフィブリノーゲン濃度と直接相関するセリンエンドペプチダーゼの反応速度が測定される。用語「基質」及び「検出基質」は、区別なく本明細書において使用される。
【0043】
用語「バトロキソビン・モジェニ（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ ｍｏｏｊｅｎｉ）」又は「バトロキソビン」又は「レプチラーゼ」又は「デフィブラーゼ」は、本明細書において区別なく使用され、アメリカヘビ属の毒から、特にＢ．モジェニ（Ｂ．ｍｏｏｊｅｎｉ）から単離されたセリンプロテアーゼを定義する。
【0044】
本明細書において使用されるように、用語「ヘビ毒セリンエンドペプチダーゼ」は、動物から直接単離される酵素だけでなく、バトロキソビン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４９７１）に対して少なくとも５５％の同一性を有する組換え酵素をもたらす発酵又は細胞培養によって産生され、本明細書において記載されるようにフィブリノーゲンを切断することができる酵素を含む、天然の酵素の（配列）情報に基づいて人工的に合成される酵素をも意味する。
【0045】
本明細書において使用されるように、本明細書において区別なく使用される用語「患者」及び「検査対象」は、本発明によるフィブリノーゲンレベルが測定される対象（ヒト又は動物）を意味する。したがって、それは、一般的に使用される意味で健康な及び健康でない対象の両方を含む。
【0046】
本明細書において使用されるように、用語「高フィブリノーゲンレベル」は、たとえば（ヒト）血液又は血漿などのような１ｌサンプル中約少なくとも５ｇのフィブリノーゲンの濃度を意味する。本明細書において使用される用語「低フィブリノーゲンレベル」は、たとえば（ヒト）血液又は血漿などのような１ｌサンプル中約０．３～０．６ｇのフィブリノーゲンの範囲にある濃度を意味する。
【0047】
本明細書において使用される用語「酵素の速度」は、ミカエリス－メンテン式の「ｖ」などのように、単位時間当たりに生成される酵素の（切断）産物又は検出可能な成分の量を意味する。
【0048】
特に、本発明は、以下の実施形態を特徴とする：
（１）ヘビ毒セリンエンドペプチダーゼによる検出基質、好ましくは人工の検出基質の触媒作用による切断を含む、１つ又はそれ以上の酵素ステップを介してサンプル中のフィブリノーゲンレベルを直接測定するための方法。
（２）ヘビ毒セリンエンドペプチダーゼの作用による検出基質の触媒作用による切断のステップを含む、サンプル中のフィブリノーゲンレベルを直接測定するための方法であって、フィブリノーゲンレベルは、前記検出基質の触媒作用による切断から測定されるシグナルに反比例する方法。
（３）フィブリノーゲンレベルの測定は、サンプル、好ましくはヒト又は動物サンプル、より好ましくは血液又は血漿サンプル中に存在する抗凝血薬によって干渉されない、本明細書において定義される上記の方法。
（４）検出基質は、測定の間に切り離された後、（光）電気化学的に、電流発生的に、色素生成的に、及び／又は蛍光発生的に検出することができる検出可能な成分に連結されている、本明細書において定義される上記の方法。
（５）ヘビ毒セリンエンドペプチダーゼは、好ましくはボスロプス・モジェニ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｍｏｏｊｅｎｉ）、カイサカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ）、ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ）、エキス・ピラミダム（Ｅｃｈｉｓ ｐｙｒａｍｉｄｕｍ）、カーペットバイパー（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓ）、アグキストロドン・ロドストマ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）、タイワンハブ（Ｐｒｏｔｏｂｏｔｈｒｏｐｓ ｍｕｃｒｏｓｑｕａｍａｔｕｓ）、クロタラス・ロドストマ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）、及びヒガシダイヤガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）からなる群から選択される、アメリカヘビ属、マムシ属、トゲクサリヘビ属、ハブ属、カロセラスマ属、トリメレスルス属、又はガラガラヘビ属のヘビ毒を起源とする、本明細書において定義される上記の方法。
（６）好ましくは上記の又は本明細書において定義される方法を使用することによる、前記エンドペプチダーゼによって触媒的に切断される人工の検出基質と共にヘビ毒セリンエンドペプチダーゼを含む、サンプル中のフィブリノーゲンレベルの測定のための診断アッセイ。
（７）中央血液検査室若しくは中央臨床検査室、緊急治療室、病院外でさえも生じる緊急事態、医療現場、個人の家、小牧場、家畜小屋、又は簡易迅速検査（ＰＯＣＴ）環境において使用される、上記の又は本明細書において定義される方法／アッセイ。
（８）サンプル中のフィブリノーゲンレベルの決定におけるヘビ毒セリンエンドペプチダーゼの使用であって、前記サンプル中のフィブリノーゲンのレベルは、人工の基質を触媒する酵素の速度に反比例する使用。
（９）好ましくはヒト又は動物からのサンプル、より好ましくは血液又は血漿中のフィブリノーゲンレベルを測定するために使用されるデバイスであって、ヘビ毒セリンエンドペプチダーゼの作用によって触媒される基質に連結された蛍光発生、色素生成、又は電流発生検出成分の切断は、センサーによって検出することができ、前記検出シグナルは、サンプル中のフィブリノーゲンレベルに反比例するデバイス。
（１）ヘビ毒セリンエンドペプチダーゼによる検出基質、好ましくは人工の検出基質の触媒作用による切断を含む、１つ又はそれ以上の酵素ステップを介してサンプル中のフィブリノーゲンレベルを直接測定するための方法。
（２）ヘビ毒セリンエンドペプチダーゼの作用による検出基質の触媒作用による切断のステップを含む、サンプル中のフィブリノーゲンレベルを直接測定するための方法であって、フィブリノーゲンレベルは、前記検出基質の触媒作用による切断から測定されるシグナルに反比例する方法。
（３）フィブリノーゲンレベルの測定は、サンプル、好ましくはヒト又は動物サンプル、より好ましくは血液又は血漿サンプル中に存在する抗凝血薬によって干渉されない、本明細書において定義される上記の方法。
（４）検出基質は、測定の間に切り離された後、（光）電気化学的に、電流発生的に、色素生成的に、及び／又は蛍光発生的に検出することができる検出可能な成分に連結されている、本明細書において定義される上記の方法。
（５）ヘビ毒セリンエンドペプチダーゼは、好ましくはボスロプス・モジェニ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｍｏｏｊｅｎｉ）、カイサカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ）、ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ）、エキス・ピラミダム（Ｅｃｈｉｓ ｐｙｒａｍｉｄｕｍ）、カーペットバイパー（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓ）、アグキストロドン・ロドストマ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）、タイワンハブ（Ｐｒｏｔｏｂｏｔｈｒｏｐｓ ｍｕｃｒｏｓｑｕａｍａｔｕｓ）、クロタラス・ロドストマ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）、及びヒガシダイヤガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）からなる群から選択される、アメリカヘビ属、マムシ属、トゲクサリヘビ属、ハブ属、カロセラスマ属、トリメレスルス属、又はガラガラヘビ属のヘビ毒を起源とする、本明細書において定義される上記の方法。
（６）好ましくは上記の又は本明細書において定義される方法を使用することによる、前記エンドペプチダーゼによって触媒的に切断される人工の検出基質と共にヘビ毒セリンエンドペプチダーゼを含む、サンプル中のフィブリノーゲンレベルの測定のための診断アッセイ。
（７）中央血液検査室若しくは中央臨床検査室、緊急治療室、病院外でさえも生じる緊急事態、医療現場、個人の家、小牧場、家畜小屋、又は簡易迅速検査（ＰＯＣＴ）環境において使用される、上記の又は本明細書において定義される方法／アッセイ。
（８）サンプル中のフィブリノーゲンレベルの決定におけるヘビ毒セリンエンドペプチダーゼの使用であって、前記サンプル中のフィブリノーゲンのレベルは、人工の基質を触媒する酵素の速度に反比例する使用。
（９）好ましくはヒト又は動物からのサンプル、より好ましくは血液又は血漿中のフィブリノーゲンレベルを測定するために使用されるデバイスであって、ヘビ毒セリンエンドペプチダーゼの作用によって触媒される基質に連結された蛍光発生、色素生成、又は電流発生検出成分の切断は、センサーによって検出することができ、前記検出シグナルは、サンプル中のフィブリノーゲンレベルに反比例するデバイス。
【0049】
以下の実施例は、単なる例証であり、決して本発明の範囲を限定するようには意図されない。本出願の全体にわたって引用されるすべての参考文献、特許出願、特許、及び公開特許出願の内容、特に国際公開第２００９０５３８３４号パンフレット、国際公開第２００００５０４４６号パンフレット、又は国際公開第２０１６０４９５０６号パンフレットにおいて開示される基質は、参照によって本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】図１は、フィブリノーゲンレベルとそれらのシグナル（ここでは、たとえば、Ｙ軸上に示される４０５ｎｍでの吸収として）との間の関係を秒時間（Ｘ軸）毎に示す図である。実線は、高濃度のフィブリノーゲンを示し、点線は、低濃度のフィブリノーゲンを示し、破線は、サンプル中のフィブリノーゲンが０であることを示す。詳しくは、本文を参照されたい。
【図2】図２は、フィブリノーゲンレベル（Ｘ軸上にｇ／Ｌで示す）の間の関係は、ｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）システムを使用した場合にメトキシジフェニルアミンによって生成される電気シグナル（Ｙ軸）に反比例することを示す図である。
【図3】図３は、フィブリノーゲンレベル（Ｘ軸上にｇ／Ｌで示す）の間の関係は、ＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）システムを使用した場合にフェニレンジアミンによって生成される電気シグナル（Ｙ軸）に反比例することを示す図である。
【図4】図４は、人工の基質としてＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ及び酵素としてバトロキソビンを用いる、０、２０％、又は４０％の市販で入手可能なヒト血漿におけるヒト血漿フィブリノーゲンの酵素反応速度のモデリングを示す図である。Ｐｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ－バトロキソビンのＫｍは、同じような速度のＶｍａｘを保持しながら、それぞれ０．６７及び１．３５ｇ／Ｌのフィブリノーゲンの存在下において約２倍及び５倍超増加した。基質濃度をＸ軸上に示し、酵素活性をＹ軸上に示す。詳しくは、本文を参照されたい。
【図5】図５は、人工の基質としてＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ及び酵素としてバトロキソビンを用いる０、３０％、又は６０％の市販で入手可能なヒト血漿におけるヒト血漿フィブリノーゲンの酵素反応速度のモデリングを示す図である。Ｐｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ－バトロキソビンのＫｍは、同じような速度のＶｍａｘを保持しながら、それぞれ０．８及び１．５６ｇ／Ｌのフィブリノーゲンの存在下において約２．５倍及び５倍超増加した。基質濃度をＸ軸上に示し、酵素活性をＹ軸上に示す。詳しくは、本文を参照されたい。
【図6A】図６は、規定サンプル中のフィブリノーゲンレベルの決定を示す図である。図６Ａは、様々な血漿Ｃｉｔｒｏｌ－１（ＰＬ）濃度でのｐＮＡ放出曲線を示す。ＰＬは、還元し、１．６～１５０％の示される濃度まで希釈し、理論上のフィブリノーゲン（Ｆｇ）濃度を、バトロキソビン、Ｐｅｆａｃｈｒｏｍ ＴＨ、及びＰｅｆａｂｌｏｃ ＦＧの存在下において室温で実行される反応において０．０４～３．７５ｇ／Ｌとした。分毎にプレートリーダー（Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）によって記録されたＯＤ４０５値を初期バックグラウンドＯＤ４０５値に対して補正した。ＯＤ４０５補正値の平均を、３つのサンプルからの標準偏差のエラーバーと共にＹ軸にプロットし、Ｘ軸は、１０分以内の記録時間を示す。様々なフィブリノーゲン濃度を表す各曲線（様々な図形及び影によって表される、詳細については図の凡例を参照されたい）をプロットし、各記録の間を直線でつなげた。
【図6B】図６Ｂは、様々な記録時間のフィブリノーゲン濃度と補正済みＯＤ４０５との間の関係を示す、典型的な標準曲線を示す。Ｘ軸は、反応における計算済みのフィブリノーゲン濃度であり、Ｙ軸は、３回の反復実験からの補正済みＯＤ４０５である。各曲線は、様々な記録時間、たとえば４、６、７、１０、及び１５分（凡例）でのフィブリノーゲン濃度－シグナルの関係を表す。様々な記録時間での回帰線（実線）及びそれらの９５％信頼区間（実線の間の点線内に含まれる）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７によって生成した。
【図6C】図６Ｃは、様々な血漿ＰＬ濃度並びに他の２つの市販で入手可能なコントロール血漿、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍａ Ｐ及びＬｏｗ ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓｓａｙｅｄ ｐｌａｓｍａ（Ｌｏｗ ＰＬ）でのｐＮＡ放出曲線を示す。血漿はすべて、指示に従って１００％の血漿まで還元した。ＰＬは、反応において０．０８～１．２５ｇ／Ｌのフィブリノーゲン濃度に及ぶ標準曲線を生成するために段階希釈し、明確にするために、３．１％及び５０％希釈のみをプロットする。他の２つの血漿、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍａ Ｐ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）及びＬｏｗ ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓｓａｙｅｄ ｐｌａｓｍａ（ＩＬ）は、反応をバトロキソビン、Ｐｅｆａｃｈｒｏｍ ＴＨ、及びＰｅｆａｂｌｏｃ ＦＧの存在下において室温で実行した同じ実験ランに含めた。毎分記録されたＯＤ４０５値は、初期バックグラウンドＯＤ４０５値に対して補正した。ＯＤ４０５補正値の平均は、３つのサンプルからの標準偏差のエラーバーと共にＹ軸にプロットし、Ｘ軸は、１０分以内の記録時間を示す。様々なフィブリノーゲン濃度を表す各曲線（様々な図形及び影によって表される、詳細については図の凡例を参照されたい）をプロットし、各記録の間を直線でつなげた。
【図6D】図６Ｄは、フィブリノーゲン濃度と１０分目の記録時間での補正済みＯＤ４０５との間の関係を示す標準曲線を示す。Ｘ軸は、ＰＬを使用する反応における計算済みのフィブリノーゲン濃度であり、Ｙ軸は、３回の反復実験からの補正したＯＤ４０５である。実線の回帰線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７によって生成した。Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍａ Ｐ及びＬｏｗ ＰＬのフィブリノーゲン濃度を推測するために、２つの血漿のＯＤ４０５補正値を書き入れ（矢印付きの点線）、よって、反応において血漿が５０％の濃度であった場合のＯＤシグナルをフィブリノーゲン濃度に変換する。
【図6E】図６Ｅは、様々な時点でのＣｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍａ Ｐ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）及びＬｏｗ ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓｓａｙｅｄ ｐｌａｓｍａ（ＨｅｍｏｓＩＬ）について推測されるフィブリノーゲン濃度を示す。Ｙ軸は、希釈していない場合のこれらの２つの血漿、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍａ Ｐ（黒丸）及びＬｏｗ ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓｓａｙｅｄ ｐｌａｓｍａ（白丸）のフィブリノーゲン濃度を示し、エラーバーは標準偏差を表す。Ｘ軸は、図６ｃ及び６ｄにおいて説明される１０分以内の反応の記録時間である。点線内の斜線部分は、これらの２つの血漿の９５％信頼区間を表し、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍａ Ｐは点によって陰をつけ、Ｌｏｗ ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓｓａｙｅｄ ｐｌａｓｍａは斜線によって陰をつける。詳しくは、本文を参照されたい。
【図7A】図７は、ＰＴ及びａＰＴＴにおける抗凝固薬による干渉を検査したことを示す図である。図７Ａは、ＲｏｃｈｅのｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルの様々な濃度の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ反応のミカエリス－メンテン酵素反応速度のプロットを示す。Ｘ軸は、増加するＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨの濃度を表し、Ｙ軸は、室温におけるバトロキソビンの酵素活性を表す。曲線は、ＲｏｃｈｅのｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルの非存在下（コントロール）での及び０．０３×～２×の推奨される使用濃度での酵素活性の関係を表す。プロテアーゼ阻害剤カクテルの使用量が増加すると、バトロキソビンの酵素活性は抑制された。この抑制は、阻害のタイプが混合したものであり、Ｖｍａｘは低下し、Ｋｍは増加した。
【図7B】図７Ｂは、図７ａにおいて示されるように、ＲｏｃｈｅのｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルの様々な濃度の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質のミカエリス－メンテン定数（Ｋｍ）（図７Ｂ）を示す。パラメーターは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７によって推測した。阻害剤カクテルの濃度がバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質反応において増加した場合、Ｋｍは増加したが、逆のことがＶｍａｘについて当てはまった。エラーバーは、Ｋｍ又はＶｍａｘの平均値のあたりの９５％信頼区間を表し、より高い阻害剤濃度で実行した反応から得られた値のエラーバーは、信頼区間が非常に大きかったため省略した。バトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質反応は、一般的なプロテアーゼ阻害剤のカクテルによって影響を受けたが、血液の凝固の典型的な治療用及び非治療用阻害剤によっては影響を受けなかった。詳しくは、本文を参照されたい。
【図7C】図７Ｃは、図７ａにおいて示されるように、ＲｏｃｈｅのｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルの様々な濃度の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質のＶｍａｘ（図７Ｃ）を示す。パラメーターは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７によって推測した。阻害剤カクテルの濃度がバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質反応において増加した場合、Ｋｍは増加したが、逆のことがＶｍａｘについて当てはまった。エラーバーは、Ｋｍ又はＶｍａｘの平均値のあたりの９５％信頼区間を表し、より高い阻害剤濃度で実行した反応から得られた値のエラーバーは、信頼区間が非常に大きかったため省略した。バトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質反応は、一般的なプロテアーゼ阻害剤のカクテルによって影響を受けたが、血液の凝固の典型的な治療用及び非治療用阻害剤によっては影響を受けなかった。詳しくは、本文を参照されたい。
【図8A】図８は、本発明のバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ酵素反応を使用する様々なＤＯＡＣによる干渉試験を示す図である。図８Ａは、ダビガトランの様々な濃度の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍ ＴＨ反応のミカエリス－メンテン酵素反応速度のプロットを示す。Ｘ軸は、増加するＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨの濃度を表し、Ｙ軸は、室温におけるバトロキソビンの酵素活性を表す。曲線は、０ｎｇ／ｍＬ（ネガティブコントロールとして）及び３１～５００ｎｇ／ｍＬのダビガトランの存在下における酵素活性の関係を表す。ダビガトランの使用量を増加させても、バトロキソビンの酵素活性を有意に抑制しなかった。
【図8B】図８Ｂは、０．１３～２．０μｇ／ｍＬアルガトロバンの様々な濃度の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍ ＴＨ反応のミカエリス－メンテン酵素反応速度のプロットを示す。検査は、図８Ａにおけるように実行した。
【図8C】図８Ｃは、３８～６００ｎｇ／ｍＬリバロキサバンの様々な濃度の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍ ＴＨ反応のミカエリス－メンテン酵素反応速度のプロットを示す。検査は、図８Ａにおけるように実行した。図８Ｃは、ダビガトラン、アルガトロバン、及びリバロキサバンの様々な濃度の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍ ＴＨ反応のミカエリス－メンテン酵素反応速度のプロットを示す。Ｘ軸は、増加するＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨの濃度を表し、Ｙ軸は、室温におけるバトロキソビンの酵素活性を表す。各薬剤治療のより詳細なプロットについては、個々のグラフ（８ａ：ダビガトラン、８ｂ：アルガトロバン、８ｃ：リバロキサバン）を参照されたい。薬剤の使用量を増加させても、バトロキソビンの酵素活性を有意に抑制しなかった。
【図8E】図８Ｅは、図８ａ～８ｄにおいて示されるように、ダビガトラン、アルガトロバン、又はリバロキサバンの様々な濃度の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質のＶｍａｘを示す。Ｋｍは、すべての阻害剤のすべての濃度によって有意に影響を受けたわけではなかった。バトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質反応のＫｍは、フィブリノーゲンの存在によってさらに影響を及ぼされたので、このフィブリノーゲン検査の原理は、ＤＴＩ及びＤＸａＩの存在に十分に抵抗性であるはずである。非常に高用量の薬剤の存在は、わずかにＶｍａｘを低下させることがあり得るが、フィブリノーゲンアッセイに対する効果は、ごくわずかであると考えることができる。エラーバーは、Ｋｍ又はＶｍａｘの平均値のあたりの９５％信頼区間を表す。詳しくは、本文を参照されたい。
【図9A】図９は、化学物質による干渉を示す図である。図９Ａは、凝固及びフィブリン溶解の経路を阻害することが知られている化学物質の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍ ＴＨ反応のミカエリス－メンテン酵素反応速度のプロットを示す。Ｘ軸は、増加するＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨの濃度を表し、Ｙ軸は、室温におけるバトロキソビンの酵素活性を表す。曲線は、６Ｕ／ｍＬのフラグミン（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能な低分子ヘパリン）並びに１０ＴＩＵ／ｍＬアプロチニン及び０．１Ｍ ６－アミノカプロン酸の組み合わせの存在下における酵素活性の関係を表す。未処置の反応（コントロール）と比較して、これらの作用物質は、有意に活性に影響を及ぼさなかった。
【図9C】図９Ｃは、凝固及びフィブリン溶解の経路を阻害することが知られている化学物質の存在下におけるバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質のＶｍａｘを示す。Ｋｍは、すべての阻害剤のすべての濃度によって有意に影響を受けたわけではなかった。バトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ基質反応のＫｍは、フィブリノーゲンの存在によってずっと影響を及ぼされたので、このフィブリノーゲン検査の原理は、これらの阻害剤の存在に十分に抵抗性であるはずである。エラーバーは、Ｋｍ又はＶｍａｘの平均値のあたりの９５％信頼区間を表す。詳しくは、本文を参照されたい。
【図10】図１０は、バトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ反応の適応性を実証するための２つの異なるＰＬ濃度でのｐＮＡ放出曲線を示す図である。ＰＬは、適切な量のバトロキソビン及びＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ（詳細については凡例を参照されたい）における３７℃での反応ランにおいて、それぞれおよそ０．１及び０．７ｇ／Ｌのフィブリノーゲン濃度を有する反応液を生成するために４％及び２４％まで希釈した。毎分（Ｘ軸）記録されたＯＤ４０５値は、初期バックグラウンドＯＤ４０５値に対して補正した、よってＹ軸は補正済みのＯＤ４０５である。ＯＤ４０５補正値の平均は、３つのサンプルからの標準偏差のエラーバーと共にＹ軸にプロットし、Ｘ軸は、１０分以内の記録時間を示す。ＯＤ４０５補正値の平均をつなぐ直線によって表される各曲線は、様々な条件（詳細については凡例を参照されたい）での反応速度を示す。
【0051】
［実施例］
［実施例１：ＰＴ－ＩＮＲ及びＡＣＴ機能を備えたＰｏＣデバイスでの全血フィブリノーゲンレベルの測定］
ｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）簡易迅速システム（Ａｘｏｎｌａｂ／Ａｂｂｏｔｔ）を使用するサンプル中のフィブリノーゲンレベルの測定を本明細書において記載するが、これにより、デバイスのユーザーが非常に短時間の内に検査対象（患者）のフィブリノーゲンレベルを決定するのを可能にするはずである。
［実施例１：ＰＴ－ＩＮＲ及びＡＣＴ機能を備えたＰｏＣデバイスでの全血フィブリノーゲンレベルの測定］
ｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）簡易迅速システム（Ａｘｏｎｌａｂ／Ａｂｂｏｔｔ）を使用するサンプル中のフィブリノーゲンレベルの測定を本明細書において記載するが、これにより、デバイスのユーザーが非常に短時間の内に検査対象（患者）のフィブリノーゲンレベルを決定するのを可能にするはずである。
【0052】
この検査は、組織因子によって引き起こされるＩＮＲ情報が得られる以外は、ｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）によって提供される既存のプロトロンビン時間（ＰＴ）とまさに同様に機能するはずである。新たなフィブリノーゲンは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換するためにヘビ毒タンパク質、バトロキソビンを利用する。トロンビン様セリンプロテアーゼに対するＰＰＡＡＭ又はＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ（登録商標）ＴＨを含む人工の検出基質及びバトロキソビンの存在下において、前記人工の基質は、フィブリノーゲンと競合する。検査においてバトロキソビン及びＰＰＡＡＭの量を固定すると、フィブリノーゲン濃度とその量の検出基質ＰＰＡＡＭによって生成される電気化学シグナルとの関係を決定することができる。フィブリノーゲンは、バトロキソビンについてＰＰＡＡＭと競合し、反比例するフィブリノーゲンレベルと電気化学シグナルとの間の関係をもたらす（図２）。
【0053】
［実施例２：Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）によるフィブリノーゲンアッセイ］
Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨのＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）ＸＳ簡易迅速デバイスを使用する、サンプル中のフィブリノーゲンレベルの測定を本明細書において記載するが、これにより、デバイスのユーザーが非常に短時間の内に検査対象（患者）の全血サンプル中のフィブリノーゲンレベルを決定するのを可能にするはずである。
Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨのＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）ＸＳ簡易迅速デバイスを使用する、サンプル中のフィブリノーゲンレベルの測定を本明細書において記載するが、これにより、デバイスのユーザーが非常に短時間の内に検査対象（患者）の全血サンプル中のフィブリノーゲンレベルを決定するのを可能にするはずである。
【0054】
この検査は、ＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）ＸＳによって提供される既存のプロトロンビン時間（ＰＴ）検査とまさに同様に機能するはずである。新たなフィブリノーゲン検査は、サンプルフィブリノーゲンをフィブリンに変換するためにヘビ毒タンパク質、バトロキソビンを利用する。Ｅｌｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＴＨ又はＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ（登録商標）ＴＨ、すなわちトロンビン様セリンプロテアーゼに対する基質を含む人工の検出基質及びバトロキソビンの存在下において、前記人工の基質は、フィブリノーゲンと競合する。検査においてバトロキソビン及び検出基質の量を固定すると、フィブリノーゲン濃度とその量の活性検出基質によって生成される電気化学シグナルとの関係を決定することができる。フィブリノーゲンが、バトロキソビンについて検出基質と競合するので、フィブリノーゲンレベルと電気化学シグナルとの間の関係は互いに反比例する（図３）。
【0055】
［実施例３：標準的な分光光度計を用いるフィブリノーゲンアッセイ］
様々なヒト血漿濃縮物と共に検出可能な成分パラ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）を含有するＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ及びバトロキソビンを使用するフィブリノーゲンレベルの測定を、ＣＬ－ＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で使用した。さらに、酵素バトロキソビン（Ｅ）による切断についての、天然の基質としてのフィブリノーゲンと人工の基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ（登録商標）ＴＨとの間の競合を測定した。
様々なヒト血漿濃縮物と共に検出可能な成分パラ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）を含有するＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ及びバトロキソビンを使用するフィブリノーゲンレベルの測定を、ＣＬ－ＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で使用した。さらに、酵素バトロキソビン（Ｅ）による切断についての、天然の基質としてのフィブリノーゲンと人工の基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ（登録商標）ＴＨとの間の競合を測定した。
【0056】
異なる希釈３０％及び６０％の市販で入手可能なヒト血漿を、フィブリノーゲンの供給源として使用した。異なるフィブリノーゲンレベル、それぞれ０．８及び１．５６ｇ／Ｌのサンプルを調製した。酵素活性は、毎分放出されるｐＮＡの量に基づいて計算した。ｐＮＡの量は、４０５ｎｍでの吸収に正比例する。様々な濃度のＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ及びフィブリノーゲンを、ｐＮＡ放出の速度に関して、（Ｅ）の存在下において検査し、結果及び分析を図４及び表２に要約する。
【0057】
ミカエリス－メンテン酵素反応速度モデリングに基づくと、フィブリノーゲンの存在は、酵素－基質反応のミカエリス－メンテン定数（Ｋｍ）を変化させていたが、反応の最大酵素反応速度（Ｖｍａｘ）は有意には変化しなかった。Ｋｍの増加及び同じようなＶｍａｘは、フィブリノーゲンとＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨの間の非阻害性の競合を一貫して実証した。
【0058】
この場合ほぼ一定であるＫｃａｔは、１秒当たり１活性部位当たりの基質分子の最大数を示し、（Ｓ）及び（Ｅ）の両方の濃度も反応において同じであるミカエリス－メンテン式に基づくと、Ｋｍの増加は、酵素反応速度（ｖ）に有意に影響を与える。フィブリノーゲンの存在による酵素反応速度の変化は、容易に測定することができ、フィブリノーゲン濃度の推測をもたらす。人工の基質（Ｓ）としてＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨを使用して、発明者らは、表２に示すように、様々なレベルのヒト血漿由来のフィブリノーゲンの存在下において、酵素（Ｅ）としてのバトロキソビンによるｐＮＡ生成のｖをモニターした。ｖの変化は、フィブリノーゲンの存在によるものであり、ｖの減少は、フィブリノーゲン濃度の増加に正比例し、これは、ミカエリス－メンテン酵素反応速度に基づくとＫｍの増加によるものであった。
【0059】
【表2】
【0060】
ここでは人工の基質（Ｓ）としてＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨを続けて使用し、発明者らは、様々なレベルのヒト血漿由来のフィブリノーゲンの存在下においてバトロキソビンによるｐＮＡ生成のｖをモニターした（表２）。ｖの変化は、フィブリノーゲンの存在によるものであり、ｖの減少は、フィブリノーゲン濃度の増加に反比例し、これは、ミカエリス－メンテン酵素反応速度に基づくとＫｍの増加によるものであった。
【0061】
［実施例４：標準的な分光光度計を用いるフィブリノーゲンアッセイ］
様々なヒト血漿濃縮物と共に検出可能な成分ｐ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）を含有するＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ及びバトロキソビンを使用するフィブリノーゲンレベルの測定を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で使用した。さらに、酵素バトロキソビン（Ｅ）による切断についての、天然の基質としてのフィブリノーゲンと人工の基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ（登録商標）ＴＨとの間の競合を測定した。
様々なヒト血漿濃縮物と共に検出可能な成分ｐ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）を含有するＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ及びバトロキソビンを使用するフィブリノーゲンレベルの測定を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で使用した。さらに、酵素バトロキソビン（Ｅ）による切断についての、天然の基質としてのフィブリノーゲンと人工の基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ（登録商標）ＴＨとの間の競合を測定した。
【0062】
異なる希釈３０％及び６０％の市販で入手可能なヒト血漿を、フィブリノーゲンの供給源として使用した。異なるフィブリノーゲンレベル、それぞれ０．８及び１．５６ｇ／Ｌのサンプルを調製した。酵素活性は、毎分放出されるｐＮＡの量に基づいて計算した。ｐＮＡの量は、４０５ｎｍでの吸収に正比例する。様々な濃度のＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨ及びフィブリノーゲンを、ｐＮＡ放出の速度に関して、（Ｅ）の存在下において検査し、結果及び分析を図５及び表３に要約する。
【0063】
ミカエリス－メンテン酵素反応速度モデリングに基づくと、フィブリノーゲンの存在は、酵素－基質反応のミカエリス－メンテン定数（Ｋｍ）を変化させていたが、反応の最大酵素反応速度（Ｖｍａｘ）は有意には変化しなかった。Ｋｍの増加及び同じようなＶｍａｘは、フィブリノーゲンとＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨの間の非阻害性の競合を一貫して実証した。
【0064】
この場合ほぼ一定であるＫｃａｔは、１秒当たり１活性部位当たりの基質分子の最大数を示し、（Ｓ）及び（Ｅ）の両方の濃度も反応において同じであるミカエリス－メンテン式に基づくと、Ｋｍの増加は、酵素反応速度（ｖ）に有意に影響を与える：
フィブリノーゲンの存在による酵素反応速度の変化は、容易に測定することができ、フィブリノーゲン濃度の推測をもたらす。人工の基質（Ｓ）としてＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨを使用して、発明者らは、表３に示すように、様々なレベルのヒト血漿由来のフィブリノーゲンの存在下において、酵素（Ｅ）としてのバトロキソビンによるｐＮＡ生成のｖをモニターした。ｖの変化は、フィブリノーゲンの存在によるものであり、ｖの減少は、フィブリノーゲン濃度の増加に反比例し、これは、ミカエリス－メンテン酵素反応速度に基づくとＫｍの増加によるものであった。
【数1】
フィブリノーゲンの存在による酵素反応速度の変化は、容易に測定することができ、フィブリノーゲン濃度の推測をもたらす。人工の基質（Ｓ）としてＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨを使用して、発明者らは、表３に示すように、様々なレベルのヒト血漿由来のフィブリノーゲンの存在下において、酵素（Ｅ）としてのバトロキソビンによるｐＮＡ生成のｖをモニターした。ｖの変化は、フィブリノーゲンの存在によるものであり、ｖの減少は、フィブリノーゲン濃度の増加に反比例し、これは、ミカエリス－メンテン酵素反応速度に基づくとＫｍの増加によるものであった。
【0065】
【表3】
【0066】
ここでは人工の基質（Ｓ）としてＰｅｆａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＴＨを続けて使用し、発明者らは、様々なレベルのヒト血漿由来のフィブリノーゲンの存在下においてバトロキソビンによるｐＮＡ生成のｖをモニターした（表３）。ｖの変化は、フィブリノーゲンの存在によるものであり、ｖの減少は、フィブリノーゲン濃度の増加に正比例し、これは、ミカエリス－メンテン酵素反応速度に基づくとＫｍの増加によるものであった。
【0067】
［実施例５：バトロキソビン酵素反応速度によって決定される血漿フィブリノーゲン濃度］
フィブリノーゲンレベルの測定を、市販で入手可能であった、十分に特徴付けられた血漿を使用して実行し、血液サンプル中のフィブリノーゲン測定のこの革新的な原理の実現可能性について吟味した。
フィブリノーゲンレベルの測定を、市販で入手可能であった、十分に特徴付けられた血漿を使用して実行し、血液サンプル中のフィブリノーゲン測定のこの革新的な原理の実現可能性について吟味した。
【0068】
十分に受け入れられている現在のフィブリノーゲンアッセイは、クロットベースのＣｌａｕｓｓ検査である。Ｓｉｅｍｅｎｓ及びＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＩＬ）から入手可能なコントロール血漿をフィブリノーゲン測定においてコントロールとして標準的なＣｌａｕｓｓ検査において使用し、フィブリノーゲン濃度を十分に特徴付けた（表４）。血漿フィブリノーゲン決定におけるこの色素生成フィブリノーゲンアッセイの実現可能性について簡単に検査するために、検量線を、段階希釈Ｃｉｔｒｏｌ－１、Ｓｉｅｍｅｎｓのコントロール血漿から得た（図６ａ、６ｂ）。異なるフィブリノーゲンレベルを有する２つの他の血漿（表４）、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍａ Ｐ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）及びＬｏｗ ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓｓａｙｅｄ ｐｌａｓｍａ（ＩＬ）は、アッセイし、Ｃｉｔｒｏｌ－１を使用して生成した検量線から内挿することによってそれらのフィブリノーゲン濃度を推測した（詳細については図６ｃ、６ｄ、及び６ｅを参照されたい）。
【0069】
【表4】
【0070】
図６において記載される現条件に基づいて、アッセイは、０．０５及び０．３ｇ／Ｌのフィブリノーゲンレベルの間で良好に区別又は分離することができた（図６ａ及び６ｂ）。フィブリノーゲン濃度と４０５ｎｍのＯＤとして測定可能なシグナルとの間の反比例する関係は、この臨床的に特徴付けられたコントロール血漿において明確に実証された（図６ａ及び６ｂ）。検量線を生成し、２つの血漿のフィブリノーゲン濃度を推測した（図６ｃ及び６ｄ）。これらの２つの血漿の推測値は、血漿のサプライヤーによって示される値と非常によく一致していた（図６ｅ／表４）。よって、フィブリノーゲンレベルが異常に低い臨床的に重要な血漿サンプルは、バトロキソビン酵素反応速度に基づいて、本発明の方法を使用して正確に推測された。
【0071】
［実施例６：バトロキソビン酵素反応速度に基づくフィブリノーゲン測定における直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）及び直接ＦＸａ阻害剤（ＤＸａＩ）の干渉試験］
本実施例では、本発明の方法の有利な特性を、直接トロンビン阻害剤又は直接ＦＸａ阻害剤からの干渉について検査した。
本実施例では、本発明の方法の有利な特性を、直接トロンビン阻害剤又は直接ＦＸａ阻害剤からの干渉について検査した。
【0072】
患者がフィブリノーゲンレベルの推測を必要とした緊急事態では、フィブリノーゲン検査は、多くの干渉因子からできるだけ自由でなければならない。ＤＴＩ及びＤＸａＩを含む直接経口抗凝血薬（ＤＯＡＣ）の使用は、多くの疾患において血栓症を予防するのに、より一般的なものになってきている。本実施例では、発明者らは、発明者らのフィブリノーゲン測定方法におけるこの種のこれらの代表的な薬剤の干渉を判断するために、発明者らの新たな方法において３つのプロテアーゼ阻害剤、ダビガトラン（ＤＴＩ）、アルガトロバン（ＤＴＩ）、及びリバロキサバン（ａＤＸａＩ）を検査した。これらの医薬品の阻害効果を評価するために、発明者らは、バトロキソビンとその基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨとの間の酵素反応速度におけるこれらの作用物質の効果を調査した。バトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ酵素反応を、Ｒｏｃｈｅから購入したプロテアーゼ阻害剤のカクテル、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下において検査した（図７ａを参照されたい）。Ｖｍａｘ及びＫｍのような酵素反応速度パラメーターをミカエリス－メンテン酵素反応速度モデルに基づいて推測すると、酵素反応に対するカクテルの阻害効果が明確に見え（図７ａ）、ミカエリス－メンテンパラメーター、Ｖｍａｘ及びＫｍは、阻害が混合していることを示す（図７ｂ及び７ｃ）。
【0073】
酵素反応速度試験の確立と共に、ＤＴＩ及びＤＸａＩの干渉を、２つの一般的な血液の凝固検査、すなわちプロトロンビン時間（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）におけるこれらの薬剤の効力を検査することによってスタートさせた。これらのＤＴＩ及びＤＸａＩの存在下において、これらの２つの検査は、血液凝固時間の遅延を表すであろう。この原理に基づき、発明者らは、ＰＴ及びａＰＴＴにおいて報告されたピーク及びトラフ血漿濃度を適用することによって、これらの薬剤の効力を判断した。結果を表５に示す：それぞれＤＴＩ及びＤＸａＩとして示される直接トロンビン阻害剤及び直接ＦＸａ阻害剤は、プロトロンビン時間（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に基づき、血液凝固の時間を遅延させることができた。ダビガトランについて報告された最大及びトラフ濃度は、４４７～１０ｎｇ／ｍＬの間であり、リバロキサバンは５３５～６ｎｇ／ｍＬであった。コントロール血漿は、異なる量及び種類の阻害剤を個々に加え、ＰＴ及びａＰＴＴの血液凝固時間をＢＣＳ－ＸＰ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって記録した。
【0074】
【表5】
【0075】
作用機序及び濃度に基づく強～弱の効力の範囲を検出すると、結果は文献と一致した。
【0076】
トロンビン及びＦＸａの阻害における薬剤の効力を実証したので、ダビガトラン、アルガトロバン、及びリバロキサバンの干渉効果について、バトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ酵素反応において試験した。酵素反応速度試験では、発明者らは、バトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ反応の中に０～５００ｎｇ／ｍＬのダビガトランを含めた（図８ａを参照されたい）。同じような試験を、０～２μｇ／ｍＬの範囲の間の薬剤アルガトロバンについて実行した（図８ｂを参照されたい）。加えて、０～６００ｎｇ／ｍＬのリバロキサバンをこの酵素反応速度試験に適用した（図８ｃを参照されたい）。本試験では、発明者らは、Ｒｏｃｈｅのプロテアーゼ阻害剤のカクテルでのようなＤＴＩ及びＤＸａＩによる強力な阻害効果を観察しなかった（図８ａ～８ｃを比較）。各薬剤の最高用量でＶｍａｘに非常にわずかな低下があったかもしれないが、Ｋｍは、様々な薬剤及び濃度の全体にわたってまさに一定であり続けた（図８ｅ及び８ｆ）。Ｋｍは、フィブリノーゲンの存在によってシフトする主なパラメーターであるので、すなわち、フィブリノーゲン濃度が高いほど、Ｋｍは大きくなり増加するので（詳細については実施例３及び４を参照されたい）、アッセイは、典型的なＤＴＩ及びＤＸａＩ又は一般的なＤＯＡＣによって干渉されるのを無視することができると言っても過言ではない。
【0077】
［実施例７：クロットベースのアッセイに影響を与えることが知られている化学物質の干渉試験］
本実施例では、本発明の方法の有利な特性を、クロットベースのアッセイに影響を与えることが知られている化学物質の干渉について検査した。
本実施例では、本発明の方法の有利な特性を、クロットベースのアッセイに影響を与えることが知られている化学物質の干渉について検査した。
【0078】
前の実施例において実行した検査と同じように、バトロキソビンとその基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨとの間の酵素反応速度を評価した。クロットベースのアッセイにおいて干渉することが実証されている、可能性として考えられる干渉物質は、ヘパリン（分画されていないヘパリン及び低分子ヘパリン、ＵＦＨ及びＬＭＷＨを含む）、ヒルジン、ＥＤＴＡ、並びにフィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）である。ヘパリン及びヒルジンは、血栓症の治療における治療物質である。血漿におけるＦＤＰの存在の増加は、フィブリン溶解及びフィブリノーゲン溶解を増加させる条件による。正常ＦＤＰレベルは、約５～８μｇ／ｍＬである。より高いＦＤＰ濃度は、クロット形成を阻害することが知られている。アプロチニン及び６－アミノカプロン酸のような出血の治療においてフィブリン溶解を阻害するための医薬品もまた、本試験に含めた。加えて、血漿増補液において使用されるコロイドヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を干渉活性試験にかけた。
【0079】
最初に、超高濃度の低分子ヘパリン（フラグミン）、アプロチニン及び６－アミノカプロン酸をバトロキソビン－Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＴＨ酵素反応におけるそれらの干渉について検査した（図９ａを参照されたい）。予測Ｖｍａｘ及びＫｍは、未処置コントロールと有意には異なっていなかった（図９ｂ及び９ｃ）。よって、フィブリノーゲン測定のための本発明の方法がこれらの物質によって干渉されないと結論づけても差し支えない。
【0080】
発明者らはさらに、同じ手法を使用して、分画されていないヘパリン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ：４Ｕ／ｍＬまで）、カルシウムキレート剤ＥＤＴＡ（８ｍＭまで）、ヒルジン（４Ｕ／ｍＬまで）、ＨＥＳ（５ｍｇ／ｍＬまで）、ＦＤＰ（５７μｇ／ｍＬまで）の干渉を判断した。発明者らは、有意な干渉がこれらのすべての物質から生じるのを観察せず、これらの物質に対する本発明の方法の非依存性又は非干渉をさらに示した（データ示さず）。
【0081】
［実施例８：適応可能な酵素的条件］
典型的なＰｏＣデバイス、すなわちｉＳＴＡＴ及びＣｏａｇｕＣｈｅｃｋは、検査の間に体温までそれらの血液サンプルを温めるので、発明者らは、体温で操作された場合のこの原理について試験した。発明者らは、発明者らがシグナル出力を増加させ、低フィブリノーゲン濃度で良好な区別を可能にするために、いくつかのパラメーターを調整した。
典型的なＰｏＣデバイス、すなわちｉＳＴＡＴ及びＣｏａｇｕＣｈｅｃｋは、検査の間に体温までそれらの血液サンプルを温めるので、発明者らは、体温で操作された場合のこの原理について試験した。発明者らは、発明者らがシグナル出力を増加させ、低フィブリノーゲン濃度で良好な区別を可能にするために、いくつかのパラメーターを調整した。
【0082】
体温に対する、バトロキソビン酵素反応速度に基づく本発明のフィブリノーゲン検出方法の適合は、実行に成功した。酵素及び基質の濃度のようなパラメーターは、血漿中の低フィブリノーゲン濃度で望ましい性能をもたらすように調整した（図１０を参照されたい）。
さらなる実施形態は以下のとおりである。
［実施形態１］
サンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法であって、血液の凝固カスケードは、阻害される、好ましくは内因的及び外因的経路の両方の阻害である方法。
［実施形態２］
酵素的切断反応を含み、フィブリノーゲンの酵素的切断は、前記サンプル中に存在する検出基質の酵素的切断と競合する、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］
実施形態１若しくは２に記載の又はフィブリノーゲンの酵素的切断のためのセリンエンドペプチダーゼの使用を含む方法。
［実施形態４］
酵素的切断の速度は、前記サンプル中のフィブリノーゲンレベルに依存する、実施形態２又は３に記載の方法。
［実施形態５］
前記サンプル中の前記フィブリノーゲンレベルに反比例するセリンエンドペプチダーゼのタンパク分解活性を測定することを含む、実施形態２～４のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態６］
ＣａＣｌ２の非存在下において及び／又はトロンビン活性の非存在下において実行される、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態７］
プロテアーゼ阻害剤、好ましくはフィブリン重合の阻害剤、より好ましくはトロンビン阻害剤の存在を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態８］
検量線の生成及び／又はフィブリノーゲン標準物質の生成／存在を含まない、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態９］
前記サンプルは、血液又は血漿から選択される、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態１０］
中央血液検査室若しくは中央臨床検査室、緊急治療室、病院外でさえも生じる緊急事態、医療現場、個人の家、小牧場、家畜小屋、又は簡易迅速検査（ＰＯＣＴ）環境において使用される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態１１］
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法の実行に使用される診断キット。
［実施形態１２］
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１１の診断キットにおいて使用されるセリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］、好ましくはヘビ毒セリンエンドペプチダーゼ、より好ましくはベノンビンＡ［ＥＣ ３．４．２１．７４］。
［実施形態１３］
特に、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１１の診断キットにおいて使用される、実施形態１２に記載のセリンエンドペプチダーゼと組み合わせた、検出基質、好ましくは人工の検出基質。
［実施形態１４］
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１１に記載の診断キットにおいて使用される、好ましくは、実施形態１２に記載のセリンエンドペプチダーゼと組み合わせた検出可能な成分及び／又は実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法若しくは実施形態１１の診断キットにおいて使用される、実施形態１３に記載の検出基質と組み合わせた、検出可能な成分。
さらなる実施形態は以下のとおりである。
［実施形態１］
サンプル中のフィブリノーゲンレベルを測定するための方法であって、血液の凝固カスケードは、阻害される、好ましくは内因的及び外因的経路の両方の阻害である方法。
［実施形態２］
酵素的切断反応を含み、フィブリノーゲンの酵素的切断は、前記サンプル中に存在する検出基質の酵素的切断と競合する、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］
実施形態１若しくは２に記載の又はフィブリノーゲンの酵素的切断のためのセリンエンドペプチダーゼの使用を含む方法。
［実施形態４］
酵素的切断の速度は、前記サンプル中のフィブリノーゲンレベルに依存する、実施形態２又は３に記載の方法。
［実施形態５］
前記サンプル中の前記フィブリノーゲンレベルに反比例するセリンエンドペプチダーゼのタンパク分解活性を測定することを含む、実施形態２～４のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態６］
ＣａＣｌ２の非存在下において及び／又はトロンビン活性の非存在下において実行される、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態７］
プロテアーゼ阻害剤、好ましくはフィブリン重合の阻害剤、より好ましくはトロンビン阻害剤の存在を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態８］
検量線の生成及び／又はフィブリノーゲン標準物質の生成／存在を含まない、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態９］
前記サンプルは、血液又は血漿から選択される、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態１０］
中央血液検査室若しくは中央臨床検査室、緊急治療室、病院外でさえも生じる緊急事態、医療現場、個人の家、小牧場、家畜小屋、又は簡易迅速検査（ＰＯＣＴ）環境において使用される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態１１］
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法の実行に使用される診断キット。
［実施形態１２］
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１１の診断キットにおいて使用されるセリンエンドペプチダーゼ［ＥＣ ３．４．２１］、好ましくはヘビ毒セリンエンドペプチダーゼ、より好ましくはベノンビンＡ［ＥＣ ３．４．２１．７４］。
［実施形態１３］
特に、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１１の診断キットにおいて使用される、実施形態１２に記載のセリンエンドペプチダーゼと組み合わせた、検出基質、好ましくは人工の検出基質。
［実施形態１４］
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１１に記載の診断キットにおいて使用される、好ましくは、実施形態１２に記載のセリンエンドペプチダーゼと組み合わせた検出可能な成分及び／又は実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法若しくは実施形態１１の診断キットにおいて使用される、実施形態１３に記載の検出基質と組み合わせた、検出可能な成分。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図7c】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【図9c】
【図10】