特許 7393429 ローリングサークル増幅方法、シーケンシングライブラリの調製方法及び調製されたＤＮＡナノスフィア

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-28

(45)【発行日】2023-12-06

(54)【発明の名称】ローリングサークル増幅方法、シーケンシングライブラリの調製方法及び調製されたＤＮＡナノスフィア

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20231129BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20231129BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20231129BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20231129BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20231129BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20231129BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20231129BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12N9/00

C12N9/12

C12Q1/6844 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

C40B40/06

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2021532178

(86)(22)【出願日】2018-12-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-31

(86)【国際出願番号】 CN2018119335

(87)【国際公開番号】W WO2020113460

(87)【国際公開日】2020-06-11

【審査請求日】2021-06-03

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】521242587

【氏名又は名称】深▲せん▼華大智造極創科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】廖莎

(72)【発明者】

【氏名】陳奥

(72)【発明者】

【氏名】章文蔚

(72)【発明者】

【氏名】徐崇鈞

(72)【発明者】

【氏名】沈寒▲じえ▼

(72)【発明者】

【氏名】何琳

(72)【発明者】

【氏名】許軍強

【審査官】井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５８３５８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１２９２１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０８５６４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５３７９９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００９／００９８６１２（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１１

Ｃ１２Ｑ １／６８４４

Ｃ４０Ｂ ４０／０６

Ｃ１２Ｎ ９／００

Ｃ１２Ｎ ９／１２

Ｃ１２Ｑ １／６８６

Ｃ１２Ｑ １／６８６９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ローリングサークル増幅方法であって、前記方法は、二本鎖ＤＮＡと媒介配列を同じシステムで順次変性及びアニーリングすることにより、媒介配列は変性した一本鎖ＤＮＡの両端と相補的に対になるステップと、前記システムにリガーゼとポリメラーゼを併せて導入し、前記リガーゼの作用下で前記一本鎖ＤＮＡの両端を接続すると同時に、前記ポリメラーゼの作用下で前記媒介配列をプライマーとして使用し、前記一本鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用してローリングサークル増幅反応を行い、増幅産物を取得するステップと、を含むことを特徴とし、
前記システムに含まれるバッファは、ＢＧＩＳＥＱ（商標）－５００ ＳＥ５０シーケンシングライブラリ調製キットのＤＮＢ（商標）調製バッファＩである、
ローリングサークル増幅方法。

【請求項2】

前記二本鎖ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅により得られた二本鎖ＤＮＡ及び接続産物から選ばれ、 前記接続産物は、ＤＮＡが切断された後にアダプターが追加されたＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項3】

前記媒介配列は、前記二本鎖ＤＮＡの変性後の２つの一本鎖ＤＮＡのうちの一方の一本鎖ＤＮＡの両端のみと相補的に対になることを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項4】

前記リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼであることを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項5】

前記ポリメラーゼはＰｈｉ ２９ポリメラーゼであることを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項6】

前記変性は９５℃で行われることを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項7】

前記アニーリングは４０℃で行われることを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項8】

前記リガーゼとポリメラーゼの作用下での反応は３０℃で行われ、
任意選択に、前記リガーゼとポリメラーゼの作用下での反応は２０ｍｉｎ以上行われることを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項9】

前記システムにＡＴＰをさらに導入し、前記リガーゼにエネルギーを提供することを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項10】

前記システムに添加される前記二本鎖ＤＮＡの量はフェムトモル（ｆｍｏｌ）レベルであることを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項11】

前記システムに添加される前記二本鎖ＤＮＡの量は１フェムトモル以上であり、好ましくは１０フェムトモル以上であり、より好ましくは４０フェムトモル以上であることを特徴とする請求項１０に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項12】

前記方法はＢＧＩ（商標）シーケンシングプラットフォームで使用されるローリングサークル増幅方法であることを特徴とする請求項１に記載のローリングサークル増幅方法。

【請求項13】

シーケンシングライブラリの調製方法であって、前記方法は、ＤＮＡナノスフィアを調製するステップを含み、該ステップは、二本鎖ＤＮＡと媒介配列を同じシステムで順次変性及びアニーリングすることにより、媒介配列は変性した一本鎖ＤＮＡの両端と相補的に対になるステップと、前記システムにリガーゼとポリメラーゼを併せて導入し、前記リガーゼの作用下で前記一本鎖ＤＮＡの両端を接続すると同時に、前記ポリメラーゼの作用下で前記媒介配列をプライマーとして使用し、前記一本鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用してローリングサークル増幅反応を行い、ＤＮＡナノスフィアを取得するステップと、を含むことを特徴とし、
前記システムに含まれるバッファは、ＢＧＩＳＥＱ（商標）－５００ ＳＥ５０シーケンシングライブラリ調製キットのＤＮＢ（商標）調製バッファＩである、
シーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項14】

前記二本鎖ＤＮＡはＰＣＲ増幅により得られた二本鎖ＤＮＡ及び接続産物から選ばれ、前記接続産物は、ＤＮＡが切断された後にアダプターが追加されたＤＮＡであることを特徴とする請求項１３に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項15】

前記方法は、前記二本鎖ＤＮＡを取得するように、ＤＮＡナノスフィアを調製するステップの前に、ＤＮＡ切断、アダプターの追加ステップをさらに含み、任意選択的に、アダプターの追加の後にＰＣＲ増幅ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項16】

前記媒介配列は、前記二本鎖ＤＮＡの変性後の２つの一本鎖ＤＮＡのうちの一方の一本鎖ＤＮＡの両端のみと相補的に対になることを特徴とする請求項１３に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項17】

前記リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼであり、前記ポリメラーゼはＰｈｉ ２９ポリメラーゼであることを特徴とする請求項１３に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項18】

前記変性は９５℃で行われ、前記アニーリングは４０℃で行われることを特徴とする請求項１３に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項19】

前記リガーゼとポリメラーゼの作用下での反応は３０℃で行われ、
任意選択に、前記リガーゼとポリメラーゼの作用下での反応は２０ｍｉｎ以上行われることを特徴とする請求項１３に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項20】

前記システムにＡＴＰをさらに導入し、前記リガーゼにエネルギーを提供することを特徴とする請求項１３に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項21】

前記システムに添加される前記二本鎖ＤＮＡの量はフェムトモル（ｆｍｏｌ）レベルであることを特徴とする請求項１３に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項22】

前記システムに添加される前記二本鎖ＤＮＡの量は１フェムトモル以上であり、好ましくは１０フェムトモル以上であり、より好ましくは４０フェムトモル以上であることを特徴とする請求項２１に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項23】

前記方法はＢＧＩ（商標）シーケンシングプラットフォームで使用されるシーケンシングライブラリの調製方法であることを特徴とする請求項１３に記載のシーケンシングライブラリの調製方法。

【請求項24】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のローリングサークル増幅方法又は請求項１３～２３のいずれか一項に記載のシーケンシングライブラリの調製方法によりＤＮＡナノスフィアを得ることを含む、
ＤＮＡナノスフィアの製造のための方法。

【請求項25】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のローリングサークル増幅方法又は請求項１３～２３のいずれか一項に記載のシーケンシングライブラリの調製方法によりＤＮＡナノスフィアを得ることを含む、
ＤＮＡナノスフィアを用いてシーケンシングするための方法。

【請求項26】

ライブラリ調製においてＤＮＡの初期量を減らすための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のローリングサークル増幅方法又は請求項１３～２３のいずれか一項に記載のシーケンシングライブラリの調製方法の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はシーケンシング技術分野に関し、具体的に、ＤＮＡナノスフィアを調製するローリングサークル増幅方法、シーケンシングライブラリの調製方法及び調製されたＤＮＡナノスフィアに関する。

【背景技術】

【0002】

ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、一本鎖環状ＤＮＡ／ＲＮＡをテンプレートとして使用し、ＤＮＡ／ＲＮＡを大量に複製するプロセスである。迅速、正確、必要なテンプレート量が少ないなどの特徴を有するので、現在、既に生物医学技術や生物ナノ技術分野で重要な研究手段となっている。ＲＣＡ方法で形成されたＤＮＡナノスフィア（ＤＮＢ）に基づく北京ゲノミクス機関（ＢＧＩ）のシーケンシング方法は、増幅に発生するエラー率を蓄積しないため、シーケンシングの正確さのソースの点で他のシーケンシングプラットフォームも優れ、幅広く使用されている。しかしながら、ＤＮＢは一本鎖環状ＤＮＡをテンプレートとして調製してなる必要があるため、ライブラリ調製では一本鎖環状化の追加の調製プロセスが必要になり、ライブラリ調製の複雑さが増加した。具体的に、サンプル調製では、先に一本鎖環状ＤＮＡを取得する必要があり、そのライブラリ調製手順は、ＤＮＡ抽出、切断、アダプターの追加、ＰＣＲ増幅（選択可能である）、精製、一本鎖環状化、精製などのステップを含む。図１に示すように、従来のＤＮＢ調製の技術において、二本鎖ＤＮＡの変性した一本鎖の両端が媒介配列（Ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ）と相補的に対になり、Ｔ４リガーゼの作用下で環状化され、次に、線状ＤＮＡを消化し、磁気ビーズの精製を行い、次に、Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼの作用下でローリングサークル増幅（ＲＣＡ）してＤＮＢを取得する。

【0003】

ＤＮＢに基づくシーケンシング方法には、後続の環状化と精製の２つのステップを追加するため、サンプル調製の難しさと時間が増加すると同時に、サンプル調製のコストが増加する。また、環状化効率や精製効率などの総合的な要因の影響により、これらの２つのステップの効率はわずか１０％～３０％であり、サンプルの投入量が大幅に増加する。したがって、現在のＤＮＢに基づくシーケンシング技術は大量のサンプルを必要とし、その希少サンプルシーケンシングでの使用範囲を制限してしまう。ＰＣＲ増幅によってサンプル量の不足という欠陥を補うことができるが、ＰＣＲがエラーを導入することがあり、業界ではますます認められなくなる。

【発明の概要】

【0004】

本発明は、ローリングサークル増幅方法、シーケンシングライブラリの調製方法及び調製されたＤＮＡナノスフィアを提供し、該方法では、一本鎖環状化ＤＮＡをテンプレートとして使用せず、二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして直接使用してＤＮＢの調製を行い、ＤＮＢ調製プロセスで一本鎖環状化プロセスの必要がなくなり、ＤＮＢ調製手順を簡素化し、調製時間を節約し、調製コストを削減し、且つサンプルの使用量を減少する。

【0005】

第１態様によれば、一実施例はローリングサークル増幅方法を提供し、二本鎖ＤＮＡと媒介配列（Ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ）を同じシステムで順次変性及びアニーリングすることにより、媒介配列は変性した一本鎖ＤＮＡの両端と相補的に対になるステップと、上記システムにリガーゼとポリメラーゼを併せて導入し、上記リガーゼの作用下で上記一本鎖ＤＮＡの両端を接続すると同時に、上記ポリメラーゼの作用下で上記媒介配列をプライマーとして使用し、上記一本鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用してローリングサークル増幅反応を行い、好ましい実施例においてＤＮＡナノスフィアである増幅産物を取得するステップと、を含む。

【0006】

好ましい実施例において、上記二本鎖ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅により得られた二本鎖ＤＮＡ及び接続産物から選ばれ、接続産物は、ＤＮＡが切断された後にアダプターが追加されたＤＮＡである。

【0007】

好ましい実施例において、上記媒介配列は、上記二本鎖ＤＮＡの変性後の２つの一本鎖のうちの一方の一本鎖ＤＮＡの両端のみと相補的に対になる。

【0008】

好ましい実施例において、上記リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。

【0009】

好ましい実施例において、上記ポリメラーゼはＰｈｉ ２９ポリメラーゼである。

【0010】

好ましい実施例において、上記変性は９５℃で行われる。

【0011】

好ましい実施例において、上記アニーリングは４０℃で行われる。

【0012】

好ましい実施例において、上記リガーゼとポリメラーゼの作用下での反応は３０℃下で行われる。

【0013】

好ましい実施例において、上記リガーゼとポリメラーゼの作用下での反応は２０ｍｉｎ以上行う。

【0014】

好ましい実施例において、上記システムにＡＴＰをさらに導入し、上記リガーゼにエネルギーを提供する。

【0015】

好ましい実施例において、システムに添加される上記二本鎖ＤＮＡの量はフェムトモル（ｆｍｏｌ）レベルである。

【0016】

好ましい実施例において、システムに添加される上記二本鎖ＤＮＡの量は１フェムトモル以上であり、好ましくは１０フェムトモル以上であり、より好ましくは４０フェムトモル以上である。

【0017】

好ましい実施例において、上記方法はＢＧＩシーケンシングプラットフォームで使用されるローリングサークル増幅方法である。

【0018】

第２態様によれば、一実施例においてシーケンシングライブラリの調製方法を提供し、ＤＮＡナノスフィアを調製するステップを含み、該ステップは、二本鎖ＤＮＡと媒介配列（Ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ）を同じシステムで順次変性及びアニーリングすることにより、媒介配列は変性した一本鎖ＤＮＡの両端と相補的に対になるステップと、上記システムにリガーゼとポリメラーゼを併せて導入し、上記リガーゼの作用下で上記一本鎖ＤＮＡの両端を接続すると同時に、上記ポリメラーゼの作用下で上記媒介配列をプライマーとして使用し、上記一本鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用してローリングサークル増幅反応を行い、ＤＮＡナノスフィアを取得するステップと、を含む。

【0019】

好ましい実施例において、上記二本鎖ＤＮＡはＰＣＲ増幅により得られた二本鎖ＤＮＡ及び接続産物から選ばれ、接続産物は、ＤＮＡが切断された後にアダプターが追加されたＤＮＡである。

【0020】

好ましい実施例において、上記方法は、上記二本鎖ＤＮＡを取得するように、ＤＮＡナノスフィアを調製するステップの前に、ＤＮＡ切断、アダプターの追加ステップをさらに含み、任意選択的に、アダプターの追加の後にＰＣＲステップをさらに含む。

【0021】

好ましい実施例において、上記媒介配列は、上記二本鎖ＤＮＡの変性後の２つの一本鎖のうちの一方の一本鎖ＤＮＡの両端のみと相補的に対になる。

【0022】

好ましい実施例において、上記リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼであり、上記ポリメラーゼはＰｈｉ ２９ポリメラーゼである。

【0023】

好ましい実施例において、上記変性は９５℃で行われ、上記アニーリングは４０℃で行われる。

【0024】

好ましい実施例において、上記リガーゼとポリメラーゼの作用下での反応は３０℃下で行われる。

【0025】

好ましい実施例において、上記リガーゼとポリメラーゼの作用下での反応は２０ｍｉｎ以上行う。

【0026】

好ましい実施例において、上記システムにＡＴＰをさらに導入し、上記リガーゼにエネルギーを提供する。

【0027】

好ましい実施例において、システムに添加される上記二本鎖ＤＮＡの量はフェムトモルレベルである。

【0028】

好ましい実施例において、システムに添加される上記二本鎖ＤＮＡの量は１フェムトモル以上であり、好ましくは１０フェムトモル以上であり、より好ましくは４０フェムトモル以上である。

【0029】

好ましい実施例において、上記方法はＢＧＩシーケンシングプラットフォームで使用されるシーケンシングライブラリの調製方法である。

【0030】

第３態様によれば、一実施例において、第１態様のローリングサークル増幅方法又は第２態様のシーケンシングライブラリの調製方法により得られたＤＮＡナノスフィアを提供する。

【0031】

第４態様によれば、一実施例において、シーケンシングにおける第３態様のＤＮＡナノスフィアの用途を提供する。

【0032】

好ましい実施例において、第１態様のローリングサークル増幅方法又は第２態様のシーケンシングライブラリの調製方法は、ライブラリ調製においてＤＮＡの初期量を減らすために使用される。

【0033】

本発明のローリングサークル増幅方法は、二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用し、一本鎖環状化及び精製ステップを必要とせずに、ＰＣＲ精製後又はアダプターを追加した二本鎖ＤＮＡをＤＮＢ調製に使用することができ、サンプル調製手順を簡素化し、時間とコストを削減する。より優れた利点は、後続の一本鎖環状化及び精製のステップの必要がないため、必要なサンプルの量が大幅に削減し、ＰＣＲ増幅が行われなくても、後続のシーケンシングの必要を満たすことができ、ＰＣＲ増幅によるエラーを回避することである。したがって、この方法は、ＰＣＲフリー（ＰＣＲ ｆｒｅｅ）のサンプル調製方法の発展に役に立ち、ＰＣＲフリーのサンプル及び希少サンプルのＤＮＢ調製に対して、この方法の利点はより明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】従来の技術におけるＤＮＡナノスフィアを調製するローリングサークル増幅方法の原理模式図である。

【図2】本発明の実施例におけるＤＮＡナノスフィアを調製するローリングサークル増幅方法の原理模式図である。

【図3】第１サイクル（ｃｙｃｌｅ１）シーケンシングにおける従来の技術と本発明の方法によって調製されたＤＮＢのローディング効率（ＢＩＣ）、ローディング品質（Ｆｉｔ）及びＤＮＢ品質値を反映するＥＳＲ値の様子である。

【図4】従来の技術によって調製されたＤＮＢシーケンシングで示される４種の塩基分布曲線図であり、曲線１－４はそれぞれ塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇパーセンテージを示す。

【図5】本発明の方法によって調製されたＤＮＢシーケンシングで示される４種の塩基分布曲線図であり、曲線１－４はそれぞれ塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇパーセンテージを示す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

以下、具体的な実施形態を通じて図面を参照しながら、本発明を更に説明する。以下の実施形態において、本発明がより良く理解されるために、数多くの細部が説明される。しかしながら、当業者は、そのうちの一部の特徴が異なる状況で省略できるが、又は他の素子、材料、方法によって取り替えることができることを容易に認識することができる。

【0036】

また、明細書で説明される的特点、操作又は特徴について、任意の適切な方法で組み合わせて様々な実施形態を形成することができる。同時に、方法の説明における各ステップ又は動作を、当業者に自明の方法で順次交換又は調整することができる。したがって、明細書及び図面における様々な順序は、ある実施例を明確に説明することのみを目的として、ある順序に従わなければならないことが特に明記されていない限り、必要な順序を意味するものではない。

【0037】

図２に示すように、本発明の実施例におけるＤＮＡナノスフィアを調製するローリングサークル増幅方法は、二本鎖ＤＮＡと媒介配列（Ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ）を同じシステムで順次変性及びアニーリングすることにより、媒介配列は変性した一本鎖ＤＮＡの両端と相補的に対になるステップと、システムにリガーゼとポリメラーゼを同時に導入し、リガーゼの作用下で一本鎖ＤＮＡの両端を接続すると同時に、ポリメラーゼの作用下で媒介配列をプライマーとして、一本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてローリングサークル増幅反応を行い、ＤＮＡナノスフィアを取得するステップと、を含む。

【0038】

本発明の実施例において、媒介配列の両端はそれぞれ変性した一本鎖ＤＮＡの両端と相補的に対になるため、変性した一本鎖ＤＮＡの両端を一体に引き寄せることができ、次に、リガーゼの作用下で一本鎖ＤＮＡの両端を接続して環状ＤＮＡを形成し、ローリングサークル増幅反応のテンプレートとする。本発明の実施例において、媒介配列は、二本鎖ＤＮＡの変性した２つの一本鎖のうちの１つの一本鎖ＤＮＡのみの両端と相補的に対になる配列である可能性があり、２つの一本鎖のうちの１つの一本鎖を選択して環状化し、この環状化された一本鎖をローリングサークル増幅反応のテンプレートとしてＤＮＡナノスフィアを生成する。無論、好ましい形態として、媒介配列は２種又はその以上の配列である可能性があり、二本鎖ＤＮＡの変性した２つの一本鎖ＤＮＡの両端と相補的に対になることができ、このような２つの一本鎖はともに環状化してローリングサークル増幅反応のテンプレートとして使用されることができる。

【0039】

本発明の実施例において、二本鎖ＤＮＡは任意のソースからの二本鎖ＤＮＡである可能性がある。好ましい実施例として、二本鎖ＤＮＡはＰＣＲ増幅によって得られた二本鎖ＤＮＡであり、特にライブラリ構築プロセス（例えばシーケンシングライブラリ構築プロセス）におけるＰＣＲ増幅ステップによって得られた二本鎖ＤＮＡである。該方法は二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲ精製後の二本鎖ＤＮＡは、一本鎖の環状化及び精製ステップを必要とせずに、ＤＮＢ調製に使用できるため、サンプル調製手順を簡素化し、時間とコストを削減する。

【0040】

本発明の実施例において、一本鎖ＤＮＡの両端を接続するためのリガーゼは、一本鎖ＤＮＡの環状化接続に適する任意のリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（リガーゼ）、Ｔ３ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（リガーゼ）、Ｔ７ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（リガーゼ）、Ｔａｑ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（リガーゼ）などであってもよく、好ましい実施例において、リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。

【0041】

本発明の実施例において、ローリングサークル増幅反応を触媒するためのポリメラーゼはローリングサークル増幅反応に適する任意のポリメラーゼ、例えば、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ｂｓｔポリメラーゼなどであってもよく、好ましい実施例において、ポリメラーゼはＰｈｉ ２９ポリメラーゼである。

【0042】

本発明の実施例において、二本鎖ＤＮＡは、熱変性及びアルカリ変性などを含むが、これらに限定されないが、任意の適切な方法で変性させることができる。しかしながら、操作の利便性及び後続の反応への悪影響がないという観点から、好ましい実施例において、熱変性を使用して二本鎖ＤＮＡを変性処理する。例えば、１つの好ましい実施例において、変性は９５℃で行われる。変性時間は１分間以上であってもよく、好ましくは３分間以上であり、特に好ましくは３分間である。

【0043】

本発明の実施例において、媒介配列と変性した一本鎖ＤＮＡのアニーリングは適切な温度で行うことができ、具体的に、媒介配列の両端と変性した一本鎖ＤＮＡの両端との相補的に対になる塩基配列の長さ、塩基組成などの要素によって決定されることができ、一般的に、両端の相補的に対になる塩基配列の長さが長いほど、対応するアニーリング温度が相対的に高くすることができ、両端の相補的に対になる塩基のＧＣ含有量が高いほど、対応するアニーリング温度が相対的に高くすることができる。１つの好ましい実施例において、アニーリングは４０℃で行われる。

【0044】

本発明の実施例において、リガーゼとポリメラーゼの作用下での、反応温度や時間などの反応条件は、選択されたリガーゼとポリメラーゼの種類に応じて決定できる。反応効率を確保するために、選択されたリガーゼとポリメラーゼの最適な反応条件（特に反応温度）がほぼ同じ又はできるだけ近いことをできるだけ確保する。例えば、１つの好ましい実施例において、リガーゼにはＴ４ ＤＮＡリガーゼが用いられ、ポリメラーゼにはＰｈｉ ２９ポリメラーゼが用いられ、反応は３０℃で行うと効果が良い。対応的に、反応時間もリガーゼとポリメラーゼの種類に応じて決定でき、一般的に、リガーゼとポリメラーゼによって触媒される反応がいずれも比較的十分な反応程度を達成できることをできるだけ確保する。１つの好ましい実施例において、リガーゼにはＴ４ ＤＮＡリガーゼが用いられ、ポリメラーゼにはＰｈｉ ２９ポリメラーゼが用いられる場合、反応時間は２０ｍｉｎ以上であると効果が良く、特に３０℃で２０ｍｉｎ反応させると、効果が良い。

【0045】

本発明の実施例において、選択されたリガーゼの具体的な種類に応じて、ＡＴＰを添加して、リガーゼにエネルギーを提供する必要もある。例えば、１つの好ましい実施例において、リガーゼにはＴ４ ＤＮＡリガーゼが用いられ、システムにＡＴＰを導入してＴ４ ＤＮＡリガーゼにエネルギーを提供する。

【0046】

本発明の方法は一本鎖環状化と精製ステップを必要とせずに、サンプル調製手順を簡素化すると同時に、より優れた利点は、必要なサンプルの量が大幅に低下し、ＰＣＲ増幅を行わなくても、後続のシーケンシングの必要を満たすことができ、ＰＣＲ増幅によるエラーを避けることである。好ましい実施例において、システムに添加される二本鎖ＤＮＡの量がフェムトモル（ｆｍｏｌ）レベルまで低くすることができ、例えば、いくつかの好ましい実施例において、システムに添加された二本鎖ＤＮＡの量は１フェムトモル以上であり、好ましくは１０フェムトモル以上であり、より好ましくは４０フェムトモル以上である。本発明の方法は、ＰＣＲフリー（ＰＣＲ ｆｒｅｅ）のサンプル調製方法の発展に寄与し、ＰＣＲフリーのサンプル及び希少サンプルのＤＮＢ調製に対して、この方法の利点はより明らかである。

【0047】

本発明の方法はＤＮＢに基づく様々なシーケンシングプラットフォームに適用し、特に北京ゲノミクス機関（ＢＧＩ）シーケンシングプラットフォームに適用し、シーケンシング策略はＢＧＩＳＥＱ－５００ ＳＥ５０シーケンシングなどであってもよい。

【0048】

本発明の一実施例において、シーケンシングライブラリの調製方法を提供し、ＤＮＡナノスフィアを調製するステップを含み、該ステップは、二本鎖ＤＮＡと媒介配列（Ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ）を同じシステムで順次変性及びアニーリングすることにより、媒介配列は変性した一本鎖ＤＮＡの両端と相補的に対になるステップと、上記システムにリガーゼとポリメラーゼを併せて導入し、上記リガーゼの作用下で上記一本鎖ＤＮＡの両端を接続すると同時に、上記ポリメラーゼの作用下で上記媒介配列をプライマーとして使用し、上記一本鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用してローリングサークル増幅反応を行い、ＤＮＡナノスフィアを取得するステップと、を含む。

【0049】

好ましい実施例において、上記二本鎖ＤＮＡはＰＣＲ増幅によって得られた二本鎖ＤＮＡである。好ましい実施例において、上記方法は、ＤＮＡナノスフィアを調製するステップの前に、ＤＮＡ切断、アダプターの追加及びＰＣＲステップをさらに含み、上記二本鎖ＤＮＡを取得するようにする。好ましい実施例において、上記媒介配列は、上記二本鎖ＤＮＡの変性後の２つの一本鎖のうちの一方の一本鎖ＤＮＡの両端のみと相補的に対になる。好ましい実施例において、上記リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼであり、上記ポリメラーゼはＰｈｉ ２９ポリメラーゼである。好ましい実施例において、上記変性は９５℃で行われ、上記アニーリングは４０℃で行われる。好ましい実施例において、上記リガーゼとポリメラーゼの作用下での反応は３０℃下で２０ｍｉｎ以上行う。好ましい実施例において、上記システムにＡＴＰをさらに導入し、上記リガーゼにエネルギーを提供する。好ましい実施例において、システムに添加される上記二本鎖ＤＮＡの量はフェムトモルレベルである。好ましい実施例において、システムに添加される上記二本鎖ＤＮＡの量は１フェムトモル以上であり、好ましくは１０フェムトモル以上であり、より好ましくは４０フェムトモル以上である。好ましい実施例において、上記方法は、ＢＧＩシーケンシングプラットフォームに用いられるシーケンシングライブラリの調製方法である。

【0050】

本発明の実施例によって調製されたＤＮＡナノスフィアは、コンピュータ上で直接シーケンシングすることができるため、本発明の一実施例において、シーケンシングにおいて本発明の実施例によって調製されたＤＮＡナノスフィアの用途を提供する。

【0051】

以下、実施例を通じて本発明を詳しく説明し、説明する必要があるのは、該実施例は例示的なものであり、本発明の保護範囲を制限するものとして理解されるべきではない。

【0052】

実施例１：２種の方法の比較
（１）ＤＮＢ調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）サンプルについて、ＢＧＩＳＥＱ－５００ ＳＥ５０シーケンシングのライブラリ調製キット（深▲せん▼華大智造科技有限公司）（インサートフラグメントが平均１７０ｂｐである）明細書に準じ、ＤＮＡ抽出、切断、アダプターの追加、ＰＣＲ増幅、精製、定量などのプロセスを行う。

【0053】

１ｐｍｏｌ ＰＣＲ産物を取って、ライブラリ調製キット明細書に準じ、媒介配列（Ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ）を使用して環状化及び磁気ビーズ（ｂｅａｄｓ）精製を行い、ｑｕｂｉｔで定量し、このプロセスには、約１ｈから１．５ｈかかり、２５０ｆｍｏｌの一本鎖環状化ＤＮＡを取得する。ＢＧＩＳＥＱ－５００ ＳＥ５０シーケンシングキットの明細書に準じ、４０ｆｍｏｌの一本鎖環状化ＤＮＡを取ってＤＮＢを調製する。ｑｕｂｉｔで定量し、ＤＮＢ濃度は１２ｎｇ／ｕｌであり、ＤＮＢをＡと名付け、使用に供する。

【0054】

本発明の方法に従って、それぞれ１２０ｆｍｏｌ、８０ｆｍｏｌ、４０ｆｍｏｌのＰＣＲ産物を取って、以下のステップに従ってＤＮＢ調製を行う。

【0055】

（ａ）下記表１の反応系を構成する。

【0056】

（ｂ）表１の反応系をＰＣＲ装置に置き、下記表２のステップに従って変性及びアニーリングを行う。ステップが一番目の４℃に入ったら、ＢＧＩＳＥＱ－５００ ＳＥ５０シーケンシングキットの明細書に従って酵素ミックス（Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ）ＩとＩＩを添加し、Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼを含み、１ｕｌ ＢＧＩのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（６０Ｕ／ｕｌ）と１ｕｌ ＡＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加し、均一に混合した後「ｓｋｉｐ（スキップ）」ボタンを押し、３０℃に入って２０ｍｉｎ行い、４℃に入った後ＤＮＢ調製キット内のストップバッファ液を添加し、ｑｕｂｉｔで定量する。１２０ｆｍｏｌ、８０ｆｍｏｌ及び４０ｆｍｏｌのＰＣＲ産物によって得られたＤＮＢ濃度はそれぞれ３７ｎｇ／ｕｌ、２３ｎｇ／ｕｌ、１１ｎｇ／ｕｌであり、それぞれＢ、Ｃ、Ｄを名付け、使用に供する。

【0057】

【0058】

上記異なるＤＮＢ調製方法を比較し、ＰＣＲ産物からＤＮＢまで、従来の方法は１．５ｈから２ｈかかり、本発明の方法は３０ｍｉｎ内だけでＤＮＢを取得することができ、且つ多くの手動操作を短縮し、人工エラーを減少する。サンプル投入量から算出すると、本発明の方法で４０ｆｍｏｌのＰＣＲ産物を使用して得られたＤＮＢ量は、従来の方法で１６０ｆｍｏｌのＰＣＲ産物を使用して得られたＤＮＢ量に相当し、即ち本発明の方法に必要なサンプルの量は、従来の技術のわずか２５％である。

【0059】

（２）ＤＮＢローディング
従来のＤＮＢ調製方法によって得られたＤＮＢ Ａと本発明の方法であるＤＮＢ調製方法によって得られたＤＮＢ ＤをＢＧＩＳＥＱ５００ ＳＥ５０シーケンシングキット明細書に従ってＤＮＢローディングを行い、第１サイクル（ｃｙｃｌｅ１）シーケンシングを行う。２種の方法によって得られたＤＮＢのローディング状況を比較し、２種の方法のＤＮＢローディング効率と品質を分析する。図３に示すように、２種の方法はローディング効率（ＢＩＣ）とローディング品質（Ｆｉｔ）に有意差がないと同時に、ＥＳＲ（ＤＮＢ品質値を反映）を比較すると、有意差もない。本発明のＤＮＢ調製方法はＤＮＢ品質とローディング効率に影響を及ぼさないことを示している。

【0060】

実施例２ 本発明の方法の適用性
実施例１で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライブラリを使用し、平均インサートフラグメントが１７０ｂｐであり、本発明の方法の幅広い適用性を証明するために、ヒトのライブラリＮＡ１２８７８を使用して平均インサートフラグメント３２０ｂｐ及び４００ｂｐを使用して試験を行う。ＢＧＩＳＥＱ５００ ＰＥ１００及びＰＥ１５０ライブラリ調製キットに従って、ＤＮＡ抽出、切断、アダプターの追加、ＰＣＲ増幅、精製、定量などのプロセスを行う。

【0061】

２種のライブラリについてそれぞれ４０ｆｍｏｌを取って、実施例１の本発明のＤＮＢ調製方法に従ってＤＮＢの調製及び定量を行い、それぞれＨ４００ライブラリ及びＨ３２０ライブラリとしてマークし、次に、シーケンシング明細書に従ってＳＥ５０シーケンシングを行う。ＢＧＩ５００オフラインレポートは、この方法によって調製されたＤＮＢが、Ｈ４００でも、Ｈ３２０であっても、そのシーケンシング品質が良好であり、Ｑ３０が９０％よりも大きくし且つＥＳＲが８５％よりも大きくし、チップの歩留まり率が８５％よりも大きくし、いずれも該ライブラリシーケンシングの標準パラメータ（≧９０％ Ｑ３０、≧８０％ ＥＳＲ、≧８０％チップ歩留まり率）を超え、その他のシーケンシング指標（例えばｌａｇ、ｒｕｎｏｎ）も、いずれも基本パラメータ（≦０．１）を満たすことを示している。これらの結果は、本発明のＤＮＢ調製方法が異なるインサートフラグメント及び異なる種類のライブラリに適用できることを表す。以上の結果は、本発明の方法がシーケンシング品質に影響を及ぼさないことを示している。

【0062】

本発明の方法はＣＧ及びＡＴバイアス（ｂｉａｓ）を導入するかどうかを試験するために、Ｈ４００ライブラリを使用し、従来の方法と本発明の方法を用いてそれぞれＰＥ１００シーケンシングを行う。ＤＮＢ調製方法は実施例１に説明するように、２種の方法によって調製されたＤＮＢはそれぞれを１枚のチップの２つのシーケンシングレーン（ｌａｎｅ）にローディングし、ＰＥ１００シーケンシングはＢＧＩＳＥＱ５００ ＰＥ１００キットに従ってローディング及びシーケンシングを行う。従来の方法のシーケンシングデータ統計結果を表３及び図４に示し、本発明の方法のシーケンシングデータ統計結果を表４及び図５に示す。両者は、Ｑ３０、エラー率（ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）及びＧＣ含有量にすべて有意差がないが、塩基分布の状況を比較すると、従来の方法にＡＴバイアス（ｂｉａｓ）が存在し、特にリード長２（ｒｅａｄ２）の表現がより明らかであり、本発明の方法にはＡＴバイアスがほとんど存在しない。

【0063】

【0064】

【0065】

以上で具体的な例を使用して本発明を説明し、本発明を理解するのを助けるためにのみ使用され、本発明を限定するために使用されない。当業者にとって、本発明の構想に基づいて、いくつかの簡単な推論、変形又は置換を行うこともできる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】