特許 7394393 トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-30

(45)【発行日】2023-12-08

(54)【発明の名称】トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20231201BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20231201BHJP

   C12N 1/00 20060101ALN20231201BHJP

【ＦＩ】

C12M1/34 B

C12Q1/04

C12N1/00 B

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020521072

(86)(22)【出願日】2019-04-05

(86)【国際出願番号】 JP2019015049

(87)【国際公開番号】W WO2019225171

(87)【国際公開日】2019-11-28

【審査請求日】2022-03-15

(31)【優先権主張番号】P 2018098830

(32)【優先日】2018-05-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】314012076

【氏名又は名称】パナソニックＩＰマネジメント株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100115381

【弁理士】

【氏名又は名称】小谷 昌崇

(74)【代理人】

【識別番号】100162765

【弁理士】

【氏名又は名称】宇佐美 綾

(72)【発明者】

【氏名】石堂 太郎

(72)【発明者】

【氏名】狩集 慶文

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－０２９１３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／０１１８３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1994, Vol.58, No.4, pp.616-620

【文献】Microbial Cell Factories, 2015, Vol.14:63, pp.1-15

【文献】日本農芸化学会誌, 1966, Vol.40, No.4, pp.209-212

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｑ １／００

Ｃ１２Ｎ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

人工細胞壁と、前記人工細胞壁の上部に設けられた試験試料液投入部と、前記人工細胞壁の下部に設けられた培養液貯留部とを有し、
試験試料液が前記試験試料液投入部に配置され、
前記試験試料液投入部において、前記試験試料液が５０～７０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含むこと、前記試験試料液のｐＨが５～５．５であること、及び、前記試験試料液の電気伝導度が７～１５ｍＳ／ｃｍであること、並びに、
検出対象とするトマト病原性真菌が、トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、トマトすすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、トマト葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）から選択される少なくとも一つであることを特徴とする、トマト病原性真菌の検出装置。

【請求項2】

前記人工細胞壁が、孔径２～７μｍの貫通孔を有し、かつ厚み５～１５０μｍの基板と、当該基板の片面に設けられた厚み０．５～２μｍのセルロース膜とを少なくとも備える、請求項１に記載のトマト病原性真菌の検出装置。

【請求項3】

前記クエン酸塩緩衝液におけるクエン酸塩が、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸カリウムから選択される少なくとも一つである、請求項１または２に記載のトマト病原性真菌の検出装置。

【請求項4】

トマト非病原性真菌である、ビスコグニオークシア（Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ）属真菌、ペニシリアム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属真菌、フォーマ（Ｐｈｏｍａ）属真菌、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属真菌を検出しない、請求項１～３のいずれかに記載のトマト病原性真菌の検出装置。

【請求項5】

前記トマト非病原性真菌が、ビスコグニオークシア マーリティマ（Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、ペニシリアム オルソニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ）、フォーマ マルティーロストラッタ（Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ）またはトリコデルマ アスパーレラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）である、請求項４に記載のトマト病原性真菌の検出装置。

【請求項6】

請求項１～５のいずれかに記載の検出装置を用いて、トマト病原性真菌を選択的に検出することを含む、トマト病原性真菌の検出方法。

【請求項7】

検出対象とするトマト病原性真菌が、トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、トマトすすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、トマト葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）から選択される少なくとも一つであって、
人工細胞壁と、前記人工細胞壁の上部に設けられた試験試料液投入部と、前記人工細胞壁の下部に設けられた培養液貯留部とを有する検出装置を用い、
５０～７０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含むこと、ｐＨが５～５．５であること、及び、電気伝導度が７～１５ｍＳ／ｃｍであることを特徴とする試験試料液を、前記試験試料液投入部に投入するステップを含む、
トマト病原性真菌の検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた選択的検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

植物病原性真菌については、植物侵入性に係る性質として、植物表面に付着器を形成して付着後、気孔組織等細孔を探してそこから菌糸を植物体中に伸ばす、あるいは菌糸から植物細胞壁分解酵素（セルラーゼ、ペクチナーゼ）を分泌するなどの特徴がある。

【0003】

これらを利用して、例えば、特許文献１では、微多孔膜支持体を用いた真菌計量方法を開示している。また、非特許文献１では、植物病原性卵菌の１種であるＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅの偽菌糸が、水平に成長するより下方向にあたかも潜ろうとすること、及び３μｍの孔を有するＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）膜を貫通することを開示している。

【0004】

また、この性質に着目し、本発明者らは既に、植物病原性卵菌類の判定方法を提案している（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２００５－２８７３３７号公報

【文献】特許第６１６７３０９号公報

【文献】国際公開第２０１８／０１１８３５号

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｐａｕｌ Ｆ． Ｍｏｒｒｉｓ．ｅｔ．ａｌ．“Ｃｈｅｍｏｔｒｏｐｉｃ ａｎｄ Ｃｏｎｔａｃｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ Ｈｙｐｈａｅ ｔｏ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ”，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９８）１１７：１１７１－１１７８

【文献】Ｎｏｂｏｒｕ Ｓｈｉｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｉｎｅａｌ Ｓａｌｔ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”， Ａｎｎ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ． Ｓｏｃ． Ｊａｐａｎ ５３： １９１－１９７ （１９８７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の対象植物であるトマトでは、真菌による病害の比率が高く、その原因となる病原性真菌は、トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、トマトすすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、トマト葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ ）の３種で大半を占めると言われている。これら病原性真菌について、灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）は多犯性で他の植物でも感染するが、すすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、及び葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）は、トマトのみの感染例しかなく、植物特異性が高い病原性真菌である。本発明らは、これらトマトに特異的ともいえる病原性真菌について、実際のトマトの葉にどのような菌が居るか不明である段階、すなわち、発症前段階においてトマト病原性真菌を検知することが必要と考え検討を行った。

【0008】

一方、特許文献２に記載されているような本発明者らの使用する選択的真菌検出の基本技術である人工細胞壁を用いた病原性真菌の選別技術は、植物病原菌ならばトマト病原性真菌に限らず検出する可能性がある。つまり、仮に他の植物の病原性真菌がトマトの葉に付着していると、これをトマト病原性真菌として検出してしまう恐れがある。トマト栽培は種ではなく苗からの栽培が大半で、苗圃場では、他の植物との混栽や、同じ施設におけ
る複数の植物での使いまわしなどで、トマト病原性真菌以外の植物病原性真菌のトマト苗への付着可能性は否定できない。また、実際の栽培現場、ビニールハウス等の栽培施設においても、前記の苗圃場と同じく、トマト以外の植物の病原性真菌のトマト苗への付着可能性がある。これを放置すると、トマト病原性真菌以外の植物病原性真菌が、人工細胞壁を用いた病原性真菌の選別技術において擬陽性を提示するおそれがあり、無用の投薬、苗更新など栽培に多大な不都合が生じる場合がある。

【0009】

この擬陽性発生可能性について、研究・調査を行ったところ、実際に、トマト病原性真菌以外の真菌で、検討途上の人工細胞壁を用いた検出方法において、擬陽性を提示する真菌に遭遇した。それは、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ属真菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属真菌、Ｐｈｏｍａ属真菌、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属真菌の４種類であり、これらを検知しないための検討が必要になった。

【0010】

本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、トマト病原性真菌の選択的検出装置および検出方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者等は、鋭意検討した結果、下記構成の検出装置によって上記課題を解消し得ることを見出し、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることによって本発明を完成した。

【0012】

すなわち、本発明の一つの局面に関するトマト病原性真菌の検出装置は、人工細胞壁と、前記人工細胞壁の上部に設けられた試験試料液投入部と、前記人工細胞壁の下部に設けられた培養液貯留部とを有し、前記試験試料液投入部において、試験試料液が５０～７０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含むこと、及び、前記試験試料液のｐＨが５～５．５であることを特徴とする。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、簡易かつ安全に、トマト病原性真菌を選択的に検出できる装置および方法を提供することができる。本発明によって、トマト病原性真菌による発症前段階で菌の存在を検知することができ、その際には、トマト以外の植物病原菌による擬陽性の提示を回避できるため、産業利用上非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、本実施形態の検出装置の一例を示す概略断面図である。

【図2】図２は、本実施形態の検出装置が備える人工細胞壁の一例を示す概略断面図である。

【図3】図３は、本実施形態の検出装置の一例を示す概略断面図である。

【図4】図４は、実施例１においてトマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）が人工細胞壁を貫通した様子を示す人工細胞壁裏面の顕微鏡写真である。

【図5】図５は、比較例１の結果を示すグラフである。

【図6】図６は、実施例１の結果を示すグラフである。

【図7】図７は、比較例２の結果を示すグラフである。

【図8】図８は、比較例３の結果を示すグラフである。

【図9】図９は、比較例４の結果を示すグラフである。

【図10】図１０は、比較例５の結果を示すグラフである。

【図11】図１１は、比較例６の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明に係る実施形態について具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。

【0016】

本実施形態に係る、トマト病原性真菌を検出する装置１は、図１に示すように、人工細胞壁２と、前記人工細胞壁２の上部に設けられた試験試料液投入部３と、前記人工細胞壁２の下部に設けられた培養液貯留部４とを有し、前記試験試料液投入部３において、試験試料液５が５０～７０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含むこと、及び、前記試験試料液５のｐＨが５～５．５であることを特徴とする。

【0017】

試験試料液投入部３は試験試料液５を投入するための容器であるが、当該容器は上端にフランジを具備していることが望ましい。そして、試験試料液投入部３の底面は、人工細胞壁２で形成されている。

【0018】

人工細胞壁２は、図２に示すように、貫通孔２２を有する基板２１と、前記基板２１の片面に設けられたセルロース膜２３とを少なくとも備えていることが好ましい。このような人工細胞壁を使用することによって、標的とするトマト病原性真菌を選択的に検出することがより容易になる。

【0019】

前記貫通孔２２は、基板２１の表側の面から裏側の面まで貫通しており、当該貫通孔の孔径は２～７μｍ（断面積４．５～３８．５μｍ^２）であることが好ましい。孔径が前記範囲であることによって、標的の病原性真菌をより確実に選択的に検出することができる。

【0020】

また、標的の病原性真菌をより確実に選択的に検出するためには、セルロース膜２３の厚みも調整することが好ましい。具体的には、セルロース膜２３の厚みは、０．５～２μｍであることが好ましい。

【0021】

本実施形態の人工細胞壁２において、基板２１の貫通孔２２の孔径およびセルロース膜２３の膜厚を上記範囲のように調整することによって、トマト非病原性真菌は、セルロース膜２３を貫通しないものが多いため、トマト非病原性真菌の一部をこの段階で排除することができると考えられる。一方、本実施形態で標的とするトマト病原性真菌は選択的に基板の裏面に現れる。

【0022】

また、前記基板２１の厚みは特に限定されないが、一例として５～１５０μｍ程度であることが好ましい。

【0023】

図１に示されるように、試験試料液投入部３の内部に、試験試料液５が供給される。このようにして、試験試料液５がトマト病原性真菌を含有している場合、基板２１の表側の面上にトマト病原性真菌が存在することになる。

【0024】

本実施形態において、試験試料液５は、主にトマトの葉に付着した真菌を含む液（菌回収液）であり、標的の病原性真菌を含んでいる可能性のある液体であれば特に限定はされない。例えば、トマトの葉を洗浄するために使用した後の液体やトマトの葉を浸漬した液体である。

【0025】

本実施形態では、この試験試料液５のｐＨが５～５．５であり、かつ、試験試料液５が５０～７０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含んでいることが重要である。このような構成により、病原性真菌の検出において擬陽性を示す妨害菌（トマト非病原性真菌）を排除することができ、標的のトマト病原性真菌を選択的に検出することが可能となる。

【0026】

前記試験試料液５のｐＨが５未満であったり、５．５を超えたりすると、トマト病原性真菌の検出を妨害するトマト非病原性真菌を全て排除することができないおそれがある。また、前記試験試料液に含まれるクエン酸塩緩衝液の濃度が５０ｍＭ未満となると、トマト病原性真菌の検出を妨害するトマト非病原性真菌を全て排除することができないおそれがある。一方で、前記クエン酸塩緩衝液の濃度が７０ｍＭを超えると、標的とするマト病原性真菌の一部までも排除してしまうおそれがある。

【0027】

前記クエン酸塩は、特に限定はされないが、クエン酸一価塩であることが好ましく、より具体的には、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸カリウムなどであることが好ましい。

【0028】

さらに、前記試験試料液５において、ＥＣ（電気伝導度）は、通常、７～１５ｍＳ／ｃｍ程度であることが好ましい。

【0029】

本実施形態の検出装置が標的とするトマト病原性真菌は、トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、トマトすすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、トマト葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）から選択される少なくとも一つであることが好ましい。

【0030】

また、本実施形態の検出装置は、トマト葉に存在する場合があるが、トマト非病原性真菌である真菌、例えば、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ属真菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属真菌、Ｐｈｏｍａ属真菌、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属真菌を検出しないことが好ましい。より具体的には、前記トマト非病原性真菌は、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍである。

【0031】

なお、本明細書において、用語「トマト病原性」とは、トマトに対して病原性を有していることを意味する。用語「トマト非病原性」とは、トマトに対して病原性を有していないことを意味する。真菌が病原性を有しているとしても、トマトに対して病原性を有していないのであれば、その真菌は「トマト非病原性」である。言い換えれば、真菌がトマトに対して悪影響を与えないのであれば、その真菌は「トマト非病原性」である。用語「トマト非病原性」に含まれる接頭語「非」は、「トマト」を修飾せず、接頭語「非」は「病原性」を修飾する。

【0032】

本実施形態の検出装置において、前記人工細胞壁２の下部に設けられた培養液貯留部４には、培養液が入れられている。培養液としては、真菌が培養できる培養液であれば特に限定はされず、一般的な培地や培養液を使用できる。例えば、一般的な真菌培養用培地であるポテトデキストロース培地、サブローデキストロース培地等が使用可能である。なお、真菌の培養を加速するために、培養液貯留部４だけでなく、前記試験試料液５にも培養液を添加してもよい。

【0033】

本実施形態の検出装置では、一定の培養期間を経た後、前記人工細胞壁２のセルロース膜２３の裏面に、トマト病原性真菌が現れているかどうかを観察することによって、試料中におけるトマト病原性真菌の存否を検出する。観察の手段は特に限定はされないが、例えば、図３に示すように、顕微鏡６を人工細胞壁２の下部に配置して、当該顕微鏡６によって光学的に観察することができる。

【0034】

真菌の培養期間は特に限定はされないが、７２時間以上であることが好ましい。また、培養温度については、２０～２８℃程度とすることが好ましい。

【0035】

さらに、本発明には、上述したような検出装置を用いて、トマト病原性真菌を選択的に検出することを含む、トマト病原性真菌の検出方法が包含される。

【0036】

本実施形態のトマト病原性真菌の検出方法は、上述した検出装置を用いる限り、その他の工程については特に限定はされないが、例えば、前記検出装置の試験試料液投入部３に試験試料液を投入する工程、試験試料液を検出装置内で静置する工程（培養する工程）、静置後、前記検出装置の人工細胞壁２（セルロース膜２３）の裏面を観察する工程、および、前記セルロース膜２３の裏面に真菌が観察された場合、前記試験試料液はトマト病原性真菌を含んでいると判定する工程を含む。

【0037】

本明細書は、上述したように様々な態様の技術を開示しているが、そのうち主な技術を以下に纏める。

【0038】

本発明の一つの局面に係るトマト病原性真菌の検出装置は、人工細胞壁と、前記人工細胞壁の上部に設けられた試験試料液投入部と、前記人工細胞壁の下部に設けられた培養液貯留部とを有し、前記試験試料液投入部において、試験試料液が５０～７０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含むこと、及び、前記試験試料液のｐＨが５～５．５であることを特徴とする。

【0039】

このような構成により、簡易かつ安全に、トマト病原性真菌を選択的に検出できる装置および方法を提供することができる。

【0040】

さらに、前記検出装置において、前記人工細胞壁が、孔径２～７μｍの貫通孔を有し、かつ厚み５～１５０μｍの基板と、当該基板の片面に設けられた厚み０．５～２μｍのセルロース膜とを少なくとも備えることが好ましい。これにより、上述した効果をより確実に得ることができると考えられる。

【0041】

また、前記検出装置において、前記クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸カリウムから選択される少なくとも一つであることが好ましい。これにより、上述した効果をより確実に得ることができると考えられる。

【0042】

さらに、前記検出装置において、検出対象とするトマト病原性真菌が、トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、トマトすすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、トマト葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）から選択される少なくとも一つであることが好ましい。そのような場合に、上述した効果をより発揮できると考えられる。

【0043】

また、前記検出装置が、トマト葉に存在する場合があるが、トマト非病原性真菌である、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ属真菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属真菌、Ｐｈｏｍａ属真菌、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属真菌を検出しないことが好ましい。そのような場合に、上述した効果をより発揮できると考えられる。

【0044】

前記トマト非病原性真菌が、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍであることがより好ましい。

【0045】

本発明のさらなる局面に係るトマト病原性真菌の検出方法は、上記検出装置を用いて、トマト病原性真菌を選択的に検出することを含むことを特徴とする。

【0046】

以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0047】

［真菌類の調製］
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａの培養）
トマト病原菌の一つで、トマト灰色カビ病の病原性真菌であるＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａが、ポテトデキストロース寒天培地（ＤｉｆｃｏＴＭ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ）に接種された。次いで、培地は摂氏２５度の温度下で１週間静置された。Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａは岐阜大学応用生物科学部に所属する清水准教授より与えられた。その後、十分に菌糸が生育したＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ培養ポテトデキストロース寒天培地をブラックライト照射下に４日間以上放置後、室温環境に２週間以上放置し、胞子形成を促した。前記処理を行ったＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ培養ポテトデキストロース寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。

【0048】

（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａの培養）
トマト病原菌の一つで、トマトすすカビ病の病原性真菌であるＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａが、ポテトデキストロース寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２８度の温度下で１週間静置された。Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａは国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 遺伝資源センターより分譲を受けた（ＭＡＦＦ Ｎｏ．３０６７２８）。その後、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ菌糸は、ポテトデキストロース寒天培地からゴボウ粉末寒天培地に移植され、さらに、１～２週間、摂氏２８度の温度下で静置され、再度菌糸が十分生育した後、菌糸表面を白金耳、筆等で擦るなどの機械的ストレスを与え、その後、ブラックライト照射下に４日間以上放置後、室温環境に２週間以上放置し、再度胞子形成を促した。前記処理を行ったＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ培養ゴボウ粉末寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。

【0049】

（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａの培養）
トマト病原菌の一つで、トマト葉カビ病の病原性真菌であるＰａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａが、ポテトデキストロース寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２３度の温度下で１～２週間静置された。Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａは国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 遺伝資源センターより分譲を受けた（ＭＡＦＦ Ｎｏ．７２６７４４）。その後、十分に菌糸が生育したＰａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ培養ポテトデキストロース寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。

【0050】

（Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍの培養）
トマト病原菌ではないが、トマト葉に存在した、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍを、トマト葉から採取し、分離後、ポテトデキストロース寒天培地に接種した。分離源のトマトは複数の場所から採取した。分離方法は、清澄な樹脂容器または樹脂袋中に採取したトマト葉数枚を０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）を含む生理食塩水からなる菌回収液とともに投入し、１分間攪拌して葉に付着した菌を菌回収液へ移し、この菌回収液を希釈して、ストレプトマイシン硫酸塩（Ｗａｋｏ）１００ｍｇ／Ｌを含むポテトデキストロース寒天培地に、平板寒天塗抹法で塗布後、摂氏２５度で数日培養して出現した真菌コロニーから分離した。同定は、（一般財団法人）日本食品分析センター多摩研究所に依頼した。前記の単離後ポテトデキストロース寒天培地に接種されたＢｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍは、摂氏２５度の温度下で１週間静置された。その後、十分に菌糸が生育した、あるいは胞子形成が十分になされた、これら４菌種培養ポテトデキストロース寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。

【0051】

［人工細胞壁の調製］
検出装置における人工細胞壁は次のように用意された。

【0052】

まず、セルロース（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ、商品名：Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ－１０１）がイオン液体に溶解され、１％の濃度を有するセルロース溶液が調製された。イオン液体は、１－Ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）であった。該セルロース溶液は、摂氏６０度に加温され、次に、セルロース溶液が、底面にポリエチレンテレフタラートフィルムを有する容器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品名：Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＰＩＳＰ １２Ｒ ４８）の裏面にスピンコート法により３０秒間、２０００ｒｐｍの回転速度で塗布された。前記ポリエチレンテレフタラートフィルムは、図２の人工細胞壁における基板２１として機能し、３μｍの直径を有する複数の貫通孔をランダムに有していた。このようにして、ポリエチレンテレフタラートフィルムの裏側の面に、０．５マイクロメートルの厚みを有するセルロース膜が形成された。

【0053】

この底面のポリエチレンテレフタラートフィルム裏面にセルロース膜が形成された容器は、エタノール中で１２時間、室温で静置された。このようにして、１－Ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅは、エタノールに置換・除去された後、最後に真空デシケーター内で乾燥された。このようにして、本実施例・比較例で供試する人工細胞壁が得られた。

【0054】

［トマト病原性真菌の検出装置の調製］
前記の人工細胞壁とした、底面のポリエチレンテレフタラートフィルム（基板）裏面にセルロース膜が形成された容器を培地容器（培養液貯留部）に重ね、トマト病原性真菌の検出装置とした。培地容器は２４ウェル平底培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、商品名：２４ Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｌｕｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ）であり、培地容器と人工細胞壁形成容器の間に、液体の培地（培養液）６００μＬが、人工細胞壁形成容器の裏面が接するように充填された。該液体の培地は、希薄ポテトデキストロース液体培地（ＤｉｆｃｏＴＭ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ ２．４ｇ／Ｌ 水溶液）であった。

【0055】

［実施例１］
前記人工細胞壁形成容器の内部に、２００個の、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ、Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍの菌糸片と胞子を含む、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を別々に添加し、実施例においてはクエン酸ナトリウム緩衝液を、上記で得られた破砕菌糸・胞子混合懸濁液との合計体積が２００μＬになるよう添加し、試験試料液を得た。前記試験試料液におけるクエン酸ナトリウム緩衝液濃度は、破砕菌糸・胞子混合懸濁液と合わせて２００μＬにしたとき、６０ｍＭになるよう調製して添加した。添加後の人工細胞壁形成容器の内部のクエン酸ナトリウム緩衝液は、ｐＨ５．５、ＥＣ１３ｍＳ／ｃｍであった。

【0056】

そして、前記の７種の真菌が添加された試験試料液を、上記で調製した検出装置に配置し、当該検出装置を、摂氏２５度の温度で静置し、２４時間間隔で観察を行った。２４時間ごとに、前記人工細胞壁を貫通して、その裏面に観察される菌糸の数が、光学顕微鏡を介した目視により数えられた。光学顕微鏡での観察写真の一例（トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ））を図４に示す。

【0057】

［比較例１］
クエン酸ナトリウム緩衝液と代わりに滅菌精製水を用いた以外は、実施例１と同様にして試験を行った。

【0058】

［考察］
比較例１の結果を図５に、実施例１の結果を図６にそれぞれ示す。

【0059】

図５において、トマト葉に存在する場合があるが、検知から排除すべきトマト非病原性真菌である、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍの４種は、検知すべきトマト病原性真菌のＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ、Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａより早く人工細胞壁貫通菌糸が観察され、本比較例ではトマト病原性真菌の選択的検出ができなかった。

【0060】

これに対し、実施例結果である図６においては、７２ｈ時点で、トマト病原性真菌であるＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ、及びＰａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ は、トマト葉に存在する場合があるが、検知から排除すべきトマト非病原性真菌、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍの４種より早く人工細胞壁貫通菌糸が観察され、実施例１ではトマト病原性真菌の選択的検出が可能となっていることが確かめられた。

【0061】

［比較例２］
検出装置の培地にも、試験試料液と同濃度（６０ｍＭ）のクエン酸ナトリウム緩衝液を投入し、かつ、培養液のｐＨも５．５となるように調製した以外は、実施例１と同じように試験を行った。結果を図７に示す。

【0062】

図７から明らかなように、比較例２では、どの真菌も人工細胞壁を貫通せず、生育もしなかった。

【0063】

［比較例３］
試験試料液のｐＨを４．５に変更した以外は、実施例１と同じように試験を行った。比較例３における培養７２時間後の侵入菌糸数の結果を図８に示す。

【0064】

図８から明らかなように、比較例３では、妨害菌（トマト非病原性真菌）の一部が人工細胞壁を貫通してしまい、すべての妨害菌を排除することができなかった。

【0065】

［比較例４］
試験試料液のｐＨを６に変更した以外は、実施例１と同じように試験を行った。比較例４における培養７２時間後の侵入菌糸数の結果を図９に示す。

【0066】

図９から明らかなように、比較例４においても、妨害菌（トマト非病原性真菌）の一部が人工細胞壁を貫通してしまい、すべての妨害菌を排除することができなかった。

【0067】

以上の比較例３および４の結果より、試験試料液のｐＨは、トマト病原性真菌の選択的
検出のために重要な要素の一つであることが示された。

【0068】

［比較例５］
試験試料液のｐＨを５とし、試験試料液中のクエン酸ナトリウム緩衝液濃度を１００ｍＭとした以外は、実施例１と同じように試験を行った。比較例５における培養７２時間後の侵入菌糸数の結果を図１０に示す。

【0069】

図１０の結果から、比較例４においては、妨害菌（トマト非病原性真菌）だけでなく、標的であるトマト病原性真菌も一部排除してしまうことがわかった。

【0070】

［比較例６］
試験試料液のｐＨを５とし、試験試料液中のクエン酸ナトリウム緩衝液濃度を４０ｍＭとした以外は、実施例１と同じように試験を行った。比較例６における培養７２時間後の侵入菌糸数の結果を図１１に示す。

【0071】

図１１から明らかなように、比較例６では、妨害菌（トマト非病原性真菌）の一部が人工細胞壁を貫通してしまい、すべての妨害菌を排除することができなかった。

【0072】

以上の比較例５および６の結果より、試験試料液におけるクエン酸ナトリウム緩衝液濃度が、トマト病原性真菌の選択的検出のために重要な要素の一つであることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0073】

本開示のトマト病原性真菌の検出装置は、擬陽性を示すトマト非病原性真菌を排除して標的のトマト病原性真菌を選択的に検出することができる。このため、本開示の検出装置は、トマトに悪影響を及ぼすトマト病原性真菌の排除や、その他、トマトに関わる農業等の技術分野において好適に利用できる。

【符号の説明】

【0074】

１ 検出装置
２ 人工細胞壁
３ 試験試料液投入部
４ 培養液貯留部
５ 試験試料液
６ 顕微鏡
２１ 基板
２２ 貫通孔
２３ セルロース膜

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】