(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-30
(45)【発行日】2023-12-08
(54)【発明の名称】カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、浸出液及びその調製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/415 20060101AFI20231201BHJP
A61K 36/60 20060101ALI20231201BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20231201BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20231201BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20231201BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20231201BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20231201BHJP
C07K 1/34 20060101ALI20231201BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20231201BHJP
C12Q 1/6895 20180101ALN20231201BHJP
【ＦＩ】
C07K14/415 ZNA
A61K36/60
A61P11/06
A61P11/02
A61P17/04
A61P37/08
C07K1/14
C07K1/34
C12Q1/686 Z
C12Q1/6895 Z
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021558495
(86)(22)【出願日】2019-06-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-15
(86)【国際出願番号】 CN2019088605
(87)【国際公開番号】W WO2020186624
(87)【国際公開日】2020-09-24
【審査請求日】2021-11-26
(31)【優先権主張番号】201910210654.X
(32)【優先日】2019-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521436898
【氏名又は名称】中国医学科学院北京協和医院
【氏名又は名称原語表記】ＰＥＫＩＮＧ ＵＮＩＯＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
【住所又は居所原語表記】Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ （Ｅａｓｔ）， １ Ｓｈｕａｉｆｕｙｕａｎ， Ｗａｎｇｆｕｊｉｎｇ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｄｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００７３０（ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】尹佳
(72)【発明者】
【氏名】周俊雄
(72)【発明者】
【氏名】程▲シェン▼
(72)【発明者】
【氏名】顧建青
(72)【発明者】
【氏名】李欣
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０１３９２０２３（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０３１３１７５２（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７６６９７４３（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０１７９１３９９（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２５５２９００（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０１９７２４７２（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０１３９２０１７（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ２、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ３、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ４、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ５、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ６、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ７、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ８、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ９、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １０、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １１、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １２、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １３、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １４、及び配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １５を含むカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、体積比で０．２～０．４％のフェノール、体積比で４５～５５％のグリセリン、並びに４．５～５．５ｇ／ＬのＮａＣｌを含み、ｐＨ値が６．０～８．０であることを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
【請求項2】
前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の活性濃度が５００００～２０００００ＢＡＵ／ｍｌであり、蛋白濃度が０．４０～１．６０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
【請求項3】
前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の総蛋白濃度が０．４０～１．６０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
【請求項4】
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出に基づいて、前記カナムグラ花粉アレルゲン抽出物の蛋白は主に、１０ｋＤａ、１１．８ｋＤａ、１２．３ｋＤａ、１３．５ｋＤａ、１５．２ｋＤａ、１５．３２ｋＤａ、１６．４５ｋＤａ、１６．６１ｋＤａ、１９ｋＤａ、２８ｋＤａ、３７ｋＤａ、４２ｋＤａ、４５ｋＤａ、５２ｋＤａ、６６ｋＤａ、７６ｋＤａに分布することを特徴とする請求項１に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
【請求項5】
ホロ蛋白マススペクトル検出に基づいて、主に、配列番号３８～配列番号７１の特性ペプチドセグメントを含むが、これらに限られないことを特徴とする請求項１に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
【請求項6】
カナムグラ花粉を採集し、常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥を行うステップＳ１と、乾燥後の花粉を脱脂して、乾燥するステップＳ２と、
脱脂乾燥後のカナムグラ花粉を重量ｇ体積ｍｌ比１:５０～１:１０でｐＨ７．９～８．２のリン酸塩-塩水緩衝液に入れ、２～８℃で２２～２６ｈ攪拌し、それを浸漬抽出するステップＳ３と、
ステップＳ３後の浸漬抽出液を取り、遠心分離により上清液を取り、上清液をろ過及び除菌ろ過するステップＳ４と、
ろ過後の上清液を限外ろ過濃縮し、限外ろ過濃縮液を得るステップＳ５と、
前記限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過した後、真空凍結乾燥してカナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得るステップＳ６と、
前記カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品をｐＨ６．５～７．５リン酸塩―塩水緩衝液で再溶解させてカナムグラ花粉アレルゲン原液を調製し、２～８℃で放置し、等体積で滅菌のグリセリンと均一に混合し、溶液のｐＨ値を６．０～８．０に調整するステップＳ７と、
を含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液の調製方法。
【請求項7】
ステップＳ２において、前記花粉脱脂は、花粉とアセトンとの重量ｇ体積ｍｌ比１：５～１:１で、上層液体が上澄みになるまで脱脂処理を繰り返ることを特徴とする請求項６に記載の調製方法。
【請求項8】
ステップＳ４において、前記遠心分離の条件は、８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度２～８℃、時間１５～２０ｍｉｎであり、前記ろ過及び除菌ろ過において、まず、４０００メッシュのろ過布でろ過した後、板紙、０．４５μｍ及び０．２２μｍのろ膜で順次にろ過することを特徴とする請求項６に記載の調製方法。
【請求項9】
前記限外ろ過濃縮は、３ＫＤ限外ろ過膜により限外ろ過を行い、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦０．０２ ｍｇ／ｍｌである場合に、限外ろ過を中止させ、限外ろ過透過液における総蛋白含有量＞０．０２ ｍｇ／ｍｌである場合に、限外ろ過膜を交換した後、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦０．０２ ｍｇ／ｍｌとなるまで限外ろ過透過液の限外ろ過を繰り返し、ステップＳ６において、前記真空凍結乾燥の条件は、-５０～-３５℃で凍結し、２～８ｍｂａｒ真空圧力で、-２５℃で乾燥し、水分含有量≦３％に制御することを特徴とする請求項６に記載の調製方法。
【請求項10】
前記ステップＳ１は、さらに原料カナムグラ花粉に対して鏡検識別および／またはＤＮＡ鑑定を行うステップを含み、ＤＮＡ鑑定方法は、プライマーとして配列番号１、配列番号２を用い、識別のカナムグラ花粉原料をＰＣＲ増幅させ、増幅製品を検出することであることを特徴とする請求項６に記載の調製方法。
【請求項11】
カナムグラ花粉の収集、乾燥、脱脂、抽出、限外ろ過濃縮、凍結乾燥によって製造される、請求項１～５のいずれか一項に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液の凍結乾燥品の製造方法であって、自然脱落法でカナムグラ花粉を収集する収集ステップ（１）と、
花粉が付着しなくなるまで常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥で乾燥し、乾燥後の花粉を１５０～２５０メッシュのサンプルふるいに通過させる乾燥ステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた花粉とアセトンをそれぞれｇ及びｍｌとして１：５～１:１の重量体積比で脱脂処理し、攪拌または振動脱脂３０分間した後、静置して分層させ、上層液を注出し、新たなアセトンを入れ、上層液体が上澄みになるまで脱脂を繰り返し、脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥で４８時間～７２時間乾燥する脱脂ステップ（３）と、
脱脂乾燥後のカナムグラカナムグラ花粉を重量体積比１:５０～１:１０でｐＨ７．９～８．２のリン酸塩―塩水緩衝液１０Ｌに入れ、２～８℃で２２～２６ｈ攪拌し、浸漬抽出し、抽出後の浸出液を取り、遠心分離力８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度２～８℃、時間１５～２０分間とすることにより遠心分離し、上清液を回収し、まず、４０００メッシュのろ過布でろ過した後、ろ液を順次に板紙、０．４５μｍ及び０．２２μｍろ膜で順次にろ過させる抽出ステップ（４）と、
ろ過後の浸出液を３ＫＤ限外ろ過膜で限外ろ過し、限外ろ過濃縮液及び限外ろ過透過液をサンプルとして取り、その総蛋白含有量を検出し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦０．０２ｍｇ／ｍｌである場合に、透過液を直接排棄し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量＞０．０２ｍｇ／ｍｌである場合に、限外ろ過膜の完全性テストを行い、限外ろ過膜が破損しないと、透過液を排棄し、限外ろ過膜が破損すると、限外ろ過膜を交換した後、透過液の限外ろ過を繰り返る限外ろ過濃縮ステップ（５）と、
限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過した後、-５０～-３５℃で凍結し、２～８ｍｂａｒ真空圧力で、-２５℃で乾燥し、水分含有量≦３％に制御するという凍結乾燥プロセス条件によって、カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得る凍結乾燥ステップ（６）と、
を含む、製造方法。
【請求項12】
浸出液浸出液過敏性喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎及び慢性じんま疹を含むアレルギー疾患の診断及びその特異免疫治療の製剤であって、
請求項１～５のいずれか一項に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液又は請求項１１に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液凍結乾燥品を含む、製剤。
【請求項13】
前記カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物凍結乾燥品を含む製剤は、錠剤又は口腔内崩壊錠であり、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液を含む製剤は、注射液、舌下ドロップ、アレルゲン貼付剤又はアレルゲン浸出液希釈液であることを特徴とする請求項１２に記載の製剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物技術分野に関し、具体的には、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸漬抽出物、浸出液及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
人々はアレルギー疾患に対する認識は「花粉症」から始まり、花粉症は過敏性鼻炎とも称する。１９１１年に、ＮｏｏｎとＦｒｅｅｍａｎは初めて花粉抽出液を用いて花粉症を治療し、アレルギー疾患治療の歴史はここから始まった。現在、アレルギー疾患は、世界の重大な衛生問題の１つである。工業化国家において、２５％を超える人口は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻結膜炎及びアレルギー性皮膚炎に悩まされ、その中で、アレルギー性喘息が最も一般的である。感作花粉の吸入はアレルギー性喘息やそのほかの気道アレルギー疾患の最も重要な要因である。ＶＲＴＡ―Ｌ．Ａなどは、５０％ほどのアレルギー疾患患者が草類花粉に過敏することを発見した。カナムグラ（Ｈｕｍｕｌｕｓｓｃａｎｄｅｎｓ）はバラ目クワ科カナムグラ属に属し、一年または複数年の蔓草本植物であり、生長条件要求が少なく、溝と道端の荒れ地でよく生まれ、開花期が７～９月である。新疆ウイグル自治区と青海省を除いて、中国の各省にも分布し、一般的な雑草の１つである。カナムグラは、例えば日本、韓国、ベトナムなどの外国にも分布する。カナムグラ花粉症は中国の北の地域によく見られる。夏や秋の季節で、中国の北の大部の都市で、カナムグラ花粉の空気における含有量がヨモギ属花粉に次ぐが、個別の地域ですらヨモギ属花粉より高い。
尹佳さんの「夏秋季花粉症患者が過敏性鼻炎と過敏性喘息を合併する状況及びそれらの関係研究」によれば、カナムグラ花粉症が北京の夏秋季花粉症患者の５８％を占めることが分かった。趙京さんの「北京児童の気道過敏性疾患と皮膚アレルゲン試験の調査」によれば、１３～１４歳の児童に対する北京気道アレルギー疾患流行病学調査結果から、カナムグラ花粉敏感者が４．２％であることが分かった。任華麗さんの「北京地域成人過敏性鼻炎吸入アレルゲンスペクトル分析」によれば、北京の住民において過敏性鼻炎に診断した成人患者２６５例を選択し、永久性、季節性の２組の合計１６種類の標準化アレルゲンに対して検出し、主なアレルゲン配列を分析し、カナムグラは１８．１１％であることが分かった。田芳潔さんの「北京地域アレルギー鼻炎の吸入性アレルゲン調査」によれば、北京地域アレルギー鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ，ＡＲ）の主な吸入性アレルゲンに対して調査を行い、カナムグラが１７．２９％を占めることが分かった。李勇さんの「台州地域１０１３例アレルギー鼻炎患者アレルゲンスペクトル分析」によれば、台州地域アレルギー鼻炎患者のアレルゲン分布状況を調査し、カナムグラ花粉過敏者が２４８例で、３０．５８％を占めることが分かった。劉杰さんの「チンタオ地域空気伝染花粉及びそのα感作性調査」によれば、チンタオ市の空気伝染花粉の種類、数や発散特性は、主にマツ属花粉であり、２番目はカナムグラとヨモギ属であることが分かった。蘭海燕さんの「河北省遷安地域空気伝染花粉調査」によれば、遷安地域の空気伝染花粉種類、発散特性及び感作状況を調査し、空気伝染花粉の散るピークは春、秋であり、花粉種類はマツ属、コウヨウザン属、プラタナス属、ナシ属、サイプレス属、ヤナギ属、ヨモギ属、カナムグラ、ブタクサなどがあることが分かった。朱香順さんの「イ坊市花粉症患者において主な感作花粉種属分析」によれば、イ坊市花粉症患者において主な感作花粉種類における感作花粉がカナムグラで、６８％を占め、２番目がカナムグラ、夏秋季花粉I、ブタクサ、スズカケノキであることが分かった。孫立英さんの「上海中心エリア空気伝染花粉調査」によれば、上海市年間空気伝染花粉の種類や数及びその分布特徴を分析し、秋に、カンナビス類及びグラミナス花粉が主であり、主にカナムグラ属（５９．０１％）、グラミナス（１８．４５％）やヨモギ属（５．３２％）であることが分かった。
以上のカナムグラ花粉流行病学調査研究によれば、カナムグラ花粉過敏は幅広く中国各地に分布し、北の地域では、カナムグラ花粉は花粉過敏の主な感作原である。
現在のアレルゲン特異免疫治療の方法は、主に、皮下注射投薬免疫治療と舌下投薬免疫治療に分けられる。皮下注射投薬免疫治療は、すでに１００年以上の歴史を持ち、その安全性と有効性は証明された。20世紀９０年代最初に、アレルゲン舌下ドロップワクチンが誕生し、１９９８年に、ＷＨＯはアレルゲン舌下ドロップワクチンの安全と有効を開示した。
しかしながら、舌下投薬免疫脱感作の方式は、皮下注射免疫投薬に比べて、治療周期が長く、短時間内に治療効果が明らかではなく、平均脱感作周期が３～５年である。１つの治療周期では、舌下投薬方式免疫脱感作投薬量は皮下注射投薬量の１００倍である。このため、皮下注射投薬免疫脱感作の方式は舌下投薬に比べて、患者コンプライアンスが悪いが、治療周期が短く、効果が速く、治療費用が低い。したがって、２種類の投薬方式は相互に補い合って作り上げる。現在、カナムグラ花粉アレルゲンに用いられる皮下注射免疫製剤の安定性が悪く、蛋白含有量と生物力価とも時間に従って低下し、成分不明の試薬が特定時間に保存した後、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を診断するとき、陽性率が低下し、正確性が低い。
尹佳さんの「夏秋季花粉症患者が過敏性鼻炎と過敏性喘息を合併する状況及びそれらの関係研究」によれば、カナムグラ花粉症が北京の夏秋季花粉症患者の５８％を占めることが分かった。趙京さんの「北京児童の気道過敏性疾患と皮膚アレルゲン試験の調査」によれば、１３～１４歳の児童に対する北京気道アレルギー疾患流行病学調査結果から、カナムグラ花粉敏感者が４．２％であることが分かった。任華麗さんの「北京地域成人過敏性鼻炎吸入アレルゲンスペクトル分析」によれば、北京の住民において過敏性鼻炎に診断した成人患者２６５例を選択し、永久性、季節性の２組の合計１６種類の標準化アレルゲンに対して検出し、主なアレルゲン配列を分析し、カナムグラは１８．１１％であることが分かった。田芳潔さんの「北京地域アレルギー鼻炎の吸入性アレルゲン調査」によれば、北京地域アレルギー鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ，ＡＲ）の主な吸入性アレルゲンに対して調査を行い、カナムグラが１７．２９％を占めることが分かった。李勇さんの「台州地域１０１３例アレルギー鼻炎患者アレルゲンスペクトル分析」によれば、台州地域アレルギー鼻炎患者のアレルゲン分布状況を調査し、カナムグラ花粉過敏者が２４８例で、３０．５８％を占めることが分かった。劉杰さんの「チンタオ地域空気伝染花粉及びそのα感作性調査」によれば、チンタオ市の空気伝染花粉の種類、数や発散特性は、主にマツ属花粉であり、２番目はカナムグラとヨモギ属であることが分かった。蘭海燕さんの「河北省遷安地域空気伝染花粉調査」によれば、遷安地域の空気伝染花粉種類、発散特性及び感作状況を調査し、空気伝染花粉の散るピークは春、秋であり、花粉種類はマツ属、コウヨウザン属、プラタナス属、ナシ属、サイプレス属、ヤナギ属、ヨモギ属、カナムグラ、ブタクサなどがあることが分かった。朱香順さんの「イ坊市花粉症患者において主な感作花粉種属分析」によれば、イ坊市花粉症患者において主な感作花粉種類における感作花粉がカナムグラで、６８％を占め、２番目がカナムグラ、夏秋季花粉I、ブタクサ、スズカケノキであることが分かった。孫立英さんの「上海中心エリア空気伝染花粉調査」によれば、上海市年間空気伝染花粉の種類や数及びその分布特徴を分析し、秋に、カンナビス類及びグラミナス花粉が主であり、主にカナムグラ属（５９．０１％）、グラミナス（１８．４５％）やヨモギ属（５．３２％）であることが分かった。
以上のカナムグラ花粉流行病学調査研究によれば、カナムグラ花粉過敏は幅広く中国各地に分布し、北の地域では、カナムグラ花粉は花粉過敏の主な感作原である。
現在のアレルゲン特異免疫治療の方法は、主に、皮下注射投薬免疫治療と舌下投薬免疫治療に分けられる。皮下注射投薬免疫治療は、すでに１００年以上の歴史を持ち、その安全性と有効性は証明された。20世紀９０年代最初に、アレルゲン舌下ドロップワクチンが誕生し、１９９８年に、ＷＨＯはアレルゲン舌下ドロップワクチンの安全と有効を開示した。
しかしながら、舌下投薬免疫脱感作の方式は、皮下注射免疫投薬に比べて、治療周期が長く、短時間内に治療効果が明らかではなく、平均脱感作周期が３～５年である。１つの治療周期では、舌下投薬方式免疫脱感作投薬量は皮下注射投薬量の１００倍である。このため、皮下注射投薬免疫脱感作の方式は舌下投薬に比べて、患者コンプライアンスが悪いが、治療周期が短く、効果が速く、治療費用が低い。したがって、２種類の投薬方式は相互に補い合って作り上げる。現在、カナムグラ花粉アレルゲンに用いられる皮下注射免疫製剤の安定性が悪く、蛋白含有量と生物力価とも時間に従って低下し、成分不明の試薬が特定時間に保存した後、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を診断するとき、陽性率が低下し、正確性が低い。
【発明の概要】
【0003】
上述した技術的問題を解決するために、本発明はカナムグラ花粉アレルゲン浸出液を提供し、この浸出液は特異性が高く、カナムグラ感作蛋白成分抽出が充分であり、且つ割合が恒常となり、総生物力価が安定であり、有効期間が長い。アレルギー疾患の皮膚プリックテスト診断及び特異免疫治療に効果的に応用でき、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を効果的に診断し、それに対して特異免疫治療を行うことができる。
上記の目的を実現するために、本発明は以下の技術的方案を利用する。
上記の目的を実現するために、本発明は以下の技術的方案を利用する。
【0004】
カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １を含み、
配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ２を含み、
配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ３を含み、
配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ４を含み、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ５を含み、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ６を含み、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ７を含み、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ８を含み、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ９を含み、
配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １０を含み、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １１を含み、
配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １２を含み、
配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １３を含み、
配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １４を含み、
配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １５を含む。
配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ２を含み、
配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ３を含み、
配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ４を含み、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ５を含み、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ６を含み、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ７を含み、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ８を含み、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ ９を含み、
配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １０を含み、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １１を含み、
配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １２を含み、
配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １３を含み、
配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １４を含み、
配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Ｈｕｍ ｓｃ １５を含む。
【0005】
前記遺伝子は、例えば配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９―２０で示されるアミノ酸配列をコードし、それぞれ配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６―３７で示される配列に対応するものであるカナムグラ花粉花粉アレルゲン浸漬抽出物をコードするための遺伝子。
前記カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、体積比で０．２～０．４％のフェノール、体積比で４５～５５％のグリセリン、及び４．５～５．５ｇ／ＬのＮａＣｌを含み、ｐＨ値が６．０～８．０であるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
好ましくは、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の活性濃度が５００００～２０００００ＢＡＵ／ｍｌであり、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の総蛋白濃度が０．４０～１．６０ｍｇ／ｍｌであり、前記カナムグラ花粉のアレルゲン蛋白含有量が０．０８～０．３２ｍｇ／ｍｌである。
前記カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、体積比で０．２～０．４％のフェノール、体積比で４５～５５％のグリセリン、及び４．５～５．５ｇ／ＬのＮａＣｌを含み、ｐＨ値が６．０～８．０であるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
好ましくは、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の活性濃度が５００００～２０００００ＢＡＵ／ｍｌであり、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の総蛋白濃度が０．４０～１．６０ｍｇ／ｍｌであり、前記カナムグラ花粉のアレルゲン蛋白含有量が０．０８～０．３２ｍｇ／ｍｌである。
【0006】
さらに、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出に基づいて、前記カナムグラ花粉アレルゲン抽出物の蛋白は主に、１０ｋＤａ（具体的な分子量は６．３ ｋＤａ、７．０ｋＤａ、８．０９ｋＤａ、８．８ｋＤａ、９．６ｋＤａ、１０．０３ｋＤａ、１０．２２ｋＤａである）、１１．８ ｋＤａ、１２．３ ｋＤａ、１３．５ ｋＤａ 、１５．２ ｋＤａ、 １５．３２ ｋＤａ、１６．４５ ｋＤａ 、１６．６１ ｋＤａ、１９ ｋＤａ（具体的には、１９．０４ ｋＤａ、１９．１８ ｋＤａ、１９．９９ ｋＤａ）、２８ ｋＤａ、３７ ｋＤａ、４２ ｋＤａ、４５ ｋＤａ、５２ ｋＤａ、６６ ｋＤａ、７６ ｋＤａに分布する。
カナムグラ花粉を採集し、常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥を行うステップＳ１と、
乾燥後の花粉を脱脂、乾燥するステップＳ２と、
カナムグラ花粉を採集し、常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥を行うステップＳ１と、
乾燥後の花粉を脱脂、乾燥するステップＳ２と、
【0007】
脱脂乾燥後のカナムグラ花粉を重量ｇ体積ｍｌ比１:５０～１:１０でｐＨ７．９～８．２のリン酸塩-塩水緩衝液に入れ、２～８℃で２２～２６ｈ攪拌し、それを浸漬抽出するステップＳ３と、
ステップＳ３後の浸漬抽出液を取り、遠心分離により上清液を取り、上清液をろ過及び除菌ろ過するステップＳ４と、
ろ過後の上清液にを限外ろ過濃縮し、限外ろ過濃縮液を得るステップＳ５と、
前記限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過した後、真空凍結乾燥してカナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得るステップＳ６と、
前記カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品をｐＨ６．５～７．５リン酸塩―塩水緩衝液で再溶解させてカナムグラ花粉アレルゲン原液を調製し、２～８℃で放置し、等体積で滅菌のグリセリンと均一に混合し、溶液のｐＨ値を６．０～８．０に調整するステップＳ７と、
を含む前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の調製方法。
前記調製方法において、好ましくは、ステップＳ２において、前記花粉脱脂は、花粉とアセトンとの重量ｇ体積ｍｌ比１：５～１:１で上層液体が上澄みになるまで脱脂処理を繰り返る。
前記調製方法において、好ましくは、ステップＳ４において、前記遠心分離の条件は、８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度２～８℃、時間１５～２０ｍｉｎであり、前記ろ過及び除菌ろ過において、まず、４０００メッシュのろ過布でろ過した後、板紙、０．４５μｍ及び０．２２μｍのろ膜で順次にろ過する。
ステップＳ３後の浸漬抽出液を取り、遠心分離により上清液を取り、上清液をろ過及び除菌ろ過するステップＳ４と、
ろ過後の上清液にを限外ろ過濃縮し、限外ろ過濃縮液を得るステップＳ５と、
前記限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過した後、真空凍結乾燥してカナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得るステップＳ６と、
前記カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品をｐＨ６．５～７．５リン酸塩―塩水緩衝液で再溶解させてカナムグラ花粉アレルゲン原液を調製し、２～８℃で放置し、等体積で滅菌のグリセリンと均一に混合し、溶液のｐＨ値を６．０～８．０に調整するステップＳ７と、
を含む前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の調製方法。
前記調製方法において、好ましくは、ステップＳ２において、前記花粉脱脂は、花粉とアセトンとの重量ｇ体積ｍｌ比１：５～１:１で上層液体が上澄みになるまで脱脂処理を繰り返る。
前記調製方法において、好ましくは、ステップＳ４において、前記遠心分離の条件は、８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度２～８℃、時間１５～２０ｍｉｎであり、前記ろ過及び除菌ろ過において、まず、４０００メッシュのろ過布でろ過した後、板紙、０．４５μｍ及び０．２２μｍのろ膜で順次にろ過する。
【0008】
前記調製方法において、好ましくは、ステップＳ５において、前記限外ろ過濃縮は、３ＫＤ限外ろ過膜により限外ろ過を行い、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦０．０２ ｍｇ／ｍｌである場合に、限外ろ過を中止させ、限外ろ過透過液における総蛋白含有量＞０．０２ ｍｇ／ｍｌである場合に、限外ろ過膜を交換した後、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦０．０２ ｍｇ／ｍｌとなるまで限外ろ過透過液の限外ろ過を繰り返る。
前記調製方法において、好ましくは、ステップＳ６において、前記真空凍結乾燥の条件は、-５０～-３５℃で凍結し、２～８ｍｂａｒ真空圧力で、-２５℃で乾燥し、水分含有量≦３％に制御する。
前記調製方法において、好ましくは、前記ステップＳ１は、さらに、原料カナムグラ花粉に対して鏡検識別および／またはＤＮＡ鑑定を行うステップを含み、ＤＮＡ鑑定方法は、プライマーとして配列番号１、配列番号２を用い、識別のカナムグラ花粉原料をＰＣＲ増幅させ、増幅製品を検出することである。
前記調製方法において、好ましくは、前記リン酸塩―塩水緩衝液は４．５～５．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．０３％～０．０５％のリン酸二水素カリウム、１．５％～２％二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、及び０．２％～０．４％のフェノールを含む。
カナムグラ花粉アレルゲンの調製において、浸漬抽出するとき、発明人は、様々な浸出液を試した上、それらの浸浸漬抽出効率を比較した。用いた浸出液は、０．８％の塩化ナトリウム、ｐＨ５．０ のリン酸水素二ナトリウム―クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０のリン酸水素二ナトリウム―クエン酸緩衝液、ｐＨ７．５のリン酸水素二ナトリウム―リン酸二水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム―リン酸二水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．２のｃｏｃａ'ｓ液、ｐＨ８．９のＴｒｉｓ―塩酸緩衝液、ｐＨが７．９～８．２であり、４．５～５．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含有し、重量％含有量が０．０３％～０．０５％であるリン酸二水素カリウム、１．５％～２％二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、０．２％～０．４％のフェノールなどを含む。実験の結果、ｐＨが７．９～８．２であり、４．５～５．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含有し、重量％含有量が０．０３％～０．０５％であるリン酸二水素カリウム、１．５％～２％二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、０．２％～０．４％のフェノールを利用すれば、浸漬抽出効率が高く、調製したカナムグラ花粉アレルゲン浸出液を長期間に効果的に保存でき、安定性が高いことが分かった。
前記調製方法において、好ましくは、ステップＳ６において、前記真空凍結乾燥の条件は、-５０～-３５℃で凍結し、２～８ｍｂａｒ真空圧力で、-２５℃で乾燥し、水分含有量≦３％に制御する。
前記調製方法において、好ましくは、前記ステップＳ１は、さらに、原料カナムグラ花粉に対して鏡検識別および／またはＤＮＡ鑑定を行うステップを含み、ＤＮＡ鑑定方法は、プライマーとして配列番号１、配列番号２を用い、識別のカナムグラ花粉原料をＰＣＲ増幅させ、増幅製品を検出することである。
前記調製方法において、好ましくは、前記リン酸塩―塩水緩衝液は４．５～５．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．０３％～０．０５％のリン酸二水素カリウム、１．５％～２％二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、及び０．２％～０．４％のフェノールを含む。
カナムグラ花粉アレルゲンの調製において、浸漬抽出するとき、発明人は、様々な浸出液を試した上、それらの浸浸漬抽出効率を比較した。用いた浸出液は、０．８％の塩化ナトリウム、ｐＨ５．０ のリン酸水素二ナトリウム―クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０のリン酸水素二ナトリウム―クエン酸緩衝液、ｐＨ７．５のリン酸水素二ナトリウム―リン酸二水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム―リン酸二水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．２のｃｏｃａ'ｓ液、ｐＨ８．９のＴｒｉｓ―塩酸緩衝液、ｐＨが７．９～８．２であり、４．５～５．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含有し、重量％含有量が０．０３％～０．０５％であるリン酸二水素カリウム、１．５％～２％二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、０．２％～０．４％のフェノールなどを含む。実験の結果、ｐＨが７．９～８．２であり、４．５～５．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含有し、重量％含有量が０．０３％～０．０５％であるリン酸二水素カリウム、１．５％～２％二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、０．２％～０．４％のフェノールを利用すれば、浸漬抽出効率が高く、調製したカナムグラ花粉アレルゲン浸出液を長期間に効果的に保存でき、安定性が高いことが分かった。
【0009】
本発明はさらに、カナムグラ花粉の収集、乾燥、脱脂、抽出、限外ろ過濃縮、凍結乾燥によって製造されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液凍結乾燥品であって、
自然脱落法でカナムグラ花粉を収集する収集ステップ（１）と、
花粉が付着しなくなるまで常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥で乾燥し、乾燥後の花粉を１５０～２５０メッシュのサンプルふるいに通過させる乾燥ステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた花粉とアセトンをそれぞれｇ及びｍｌとして１：５～１:１の重量体積比で脱脂処理し、３０分間振動脱脂した後、静置して分層させ、上層液を注出し、新たなアセトンを入れ、上層液体が上澄みになるまで脱脂を繰り返し、脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温で４８時間～７２時間乾燥する脱脂ステップ（３）と、
脱脂乾燥後のカナムグラカナムグラ花粉を重量体積比１:５０～１:１０でｐＨ７．９～８．２のリン酸塩―塩水緩衝液１０Ｌに入れ、２～８℃で２２～２６ｈ攪拌し、浸漬抽出し、抽出後の浸出液を取り、遠心分離力８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度２～８℃、時間１５～２０分間とすることにより遠心分離し、上清液を回収し、まず、４０００メッシュのろ過布でろ過した後、ろ液を順次に板紙、０．４５μｍと０．２２μｍろ膜で順次にろ過させる抽出ステップ（４）と、
ろ過後の浸出液を３ＫＤ限外ろ過膜で限外ろ過し、限外ろ過濃縮液及び限外ろ過透過液をサンプルとして取り、その総蛋白含有量を検出し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦０．０２ ｍｇ／ｍｌである場合に、透過液を直接排棄し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量＞０．０２ ｍｇ／ｍｌである場合に、限外ろ過膜の完全性テストを行い、限外ろ過膜が破損しないと、透過液を排棄し、限外ろ過膜が破損すると、限外ろ過膜を交換した後、透過液の限外ろ過を繰り返る限外ろ過濃縮ステップ（５）と、
限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過を行った後、-５０～-３５℃で凍結し、２～８ｍｂａｒ真空圧力で、―２５℃で乾燥し、水分含有量≦３％に制御するという凍結乾燥プロセス条件によって、カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得る凍結乾燥ステップ（６）と、
を含むことによって製造されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液凍結乾燥品を提供する。
自然脱落法でカナムグラ花粉を収集する収集ステップ（１）と、
花粉が付着しなくなるまで常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥で乾燥し、乾燥後の花粉を１５０～２５０メッシュのサンプルふるいに通過させる乾燥ステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた花粉とアセトンをそれぞれｇ及びｍｌとして１：５～１:１の重量体積比で脱脂処理し、３０分間振動脱脂した後、静置して分層させ、上層液を注出し、新たなアセトンを入れ、上層液体が上澄みになるまで脱脂を繰り返し、脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温で４８時間～７２時間乾燥する脱脂ステップ（３）と、
脱脂乾燥後のカナムグラカナムグラ花粉を重量体積比１:５０～１:１０でｐＨ７．９～８．２のリン酸塩―塩水緩衝液１０Ｌに入れ、２～８℃で２２～２６ｈ攪拌し、浸漬抽出し、抽出後の浸出液を取り、遠心分離力８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度２～８℃、時間１５～２０分間とすることにより遠心分離し、上清液を回収し、まず、４０００メッシュのろ過布でろ過した後、ろ液を順次に板紙、０．４５μｍと０．２２μｍろ膜で順次にろ過させる抽出ステップ（４）と、
ろ過後の浸出液を３ＫＤ限外ろ過膜で限外ろ過し、限外ろ過濃縮液及び限外ろ過透過液をサンプルとして取り、その総蛋白含有量を検出し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦０．０２ ｍｇ／ｍｌである場合に、透過液を直接排棄し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量＞０．０２ ｍｇ／ｍｌである場合に、限外ろ過膜の完全性テストを行い、限外ろ過膜が破損しないと、透過液を排棄し、限外ろ過膜が破損すると、限外ろ過膜を交換した後、透過液の限外ろ過を繰り返る限外ろ過濃縮ステップ（５）と、
限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過を行った後、-５０～-３５℃で凍結し、２～８ｍｂａｒ真空圧力で、―２５℃で乾燥し、水分含有量≦３％に制御するという凍結乾燥プロセス条件によって、カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得る凍結乾燥ステップ（６）と、
を含むことによって製造されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液凍結乾燥品を提供する。
【0010】
過敏性喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎及び慢性じんま疹を含むアレルギー疾患の診断、及びその特異免疫治療の製剤への、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液及びカナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品の使用。
さらに、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物凍結乾燥品を錠剤、口腔内崩壊錠の調製に用い、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液を注射液、舌下ドロップ、アレルゲン貼付剤、アレルゲン浸出液希釈液の調製に用いる。本発明により提供されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液をカナムグラ花粉過敏性疾患を治療する薬物の調製に用いる。
さらに、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物凍結乾燥品を錠剤、口腔内崩壊錠の調製に用い、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液を注射液、舌下ドロップ、アレルゲン貼付剤、アレルゲン浸出液希釈液の調製に用いる。本発明により提供されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液をカナムグラ花粉過敏性疾患を治療する薬物の調製に用いる。
【0011】
具体的には、本発明により提供されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液または凍結乾燥品を用い、治療有効量または診断有効量のカナムグラ花粉アレルゲン、及び薬学的に受け入れ可能担体により、カナムグラ花粉過敏性疾患を治療する薬物を調製することができる。
【0012】
カナムグラ花粉過敏性疾患を治療するための薬物は医学的に受け入れ可能な剤型に調製でき、医師により患者年齢、体重及び疾患状况などの要素で患者に有益な剤量を決定して施用する。カナムグラ花粉過敏性疾患を治療するための薬物の剤型は、経口剤、（皮下）注射剤、舌下口腔内製剤、エアロゾル、鼻腔製剤、または皮膚プリック剤などの液体剤型から選ばれ、好ましくは、（皮下）注射剤、舌下口腔内製剤、または皮膚プリック剤を選ぶ。（皮下）注射剤、舌下口腔内製剤は、一般的に、特異免疫治療の常用の剤型であるが、皮膚プリック剤は、体内アレルゲン検出の常用の剤型である。
【0013】
本発明のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液をカナムグラ花粉による過敏性疾患の診断（即ち、アレルゲン皮膚プリック診断試験）に用いるとき、本発明のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液以外に、一般的に、陰性対照液、陽性対照液、及びプリック針を含む。陰性対照液は、一般的には、人体に対して無過敏性反応の液体（例えば、グリセリンと塩溶液の混合物など）であり、陽性対照液は、一般的には、１．０～５．０ｍｇ／ｍｌのリン酸ヒスタミン／ヒスタミン二塩酸塩溶液である。
本発明により調製されたカナムグラ花粉アレルゲン浸出液はパッチテストに応用できる。その原理は、感作物質（アレルゲン）を患者皮膚に敷き、皮膚または粘膜を介して、身体に入った後、抗原提示細胞により、抗原をＴリンパ球に提示し、特異性Ｔリンパ球を活性化させ、炎症反応を誘発させる。
本発明により調製されたカナムグラ花粉アレルゲン浸出液はパッチテストに応用できる。その原理は、感作物質（アレルゲン）を患者皮膚に敷き、皮膚または粘膜を介して、身体に入った後、抗原提示細胞により、抗原をＴリンパ球に提示し、特異性Ｔリンパ球を活性化させ、炎症反応を誘発させる。
【0014】
本発明の有益な効果は以下の通りである。
１、カナムグラは北の地域においての主な花粉アレルゲンであり、本発明により提供されるカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液は、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を効果的に診断してそれに対して特異免疫治療を行うことができる。
２、安定剤グリセリンを入れ、安定性と徐放作用を向上させ、投薬の有効性と安全性を向上させる。
３、アレルギー疾患皮下注射免疫脱感作投薬方式は、舌下ドロップ投薬方式に比べて、効果が速く、周期が短い。治療周期全体の投薬剤量は舌下ドロップ投薬量（約１００倍）より遥かに少なく、その治療費用は舌下ドロップ投薬免疫脱感作よりはるかに安く、患者の医療負担を低減させる。
４、本発明は、原液として、調製したアレルゲン浸出液を用い、プリックテストを行い、それぞれアレルギー専門医臨床総合特異性診断と血清特異性ＩｇＥ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ，ｓＩｇＥ）診断に対比し、皮内試験結果と臨床総合特異性診断及び血清ｓＩｇＥとの診断の結果が一致し、優れた感度と特異度を有し、安全性が良好である。
本発明により提供されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液は、特異性が高い特徴を有し、カナムグラ感作蛋白成分抽出が充分であり、総生物力価が安定であり、有効期が長く、無菌効果がよい。アレルギー疾患の皮膚プリックテスト診断及び特異免疫治療に効果的に利用でき、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を効果的に診断してそれに対して特異免疫治療を行うことができる。標準化制御を実現でき、使用有効期を延長させ、よい経済的な利益をもたらす。
５、本発明は、調製したアレルゲン浸出液を１：１０３～１０８で希釈した後、体外好塩基球活性化試験を行い、臨床特異性でカナムグラ過敏患者を診断でき、一部の体外ｓＩｇＥ検出偽陽性を避け、それとともに、アレルゲン皮膚試験（プリックまたは皮内）による一部のヨモギ属花粉過敏患者の過敏性ショックのリスクを避けることができる。
本発明の方法によれば、凍結乾燥して再構成した後に取得した浸出液は、北京協和医院で調製したカナムグラ花粉アレルゲン注射原液に比べて、さらに安定であり、生物力価と蛋白含有量とも安定であり、且つ有効期間は３年である。
１、カナムグラは北の地域においての主な花粉アレルゲンであり、本発明により提供されるカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液は、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を効果的に診断してそれに対して特異免疫治療を行うことができる。
２、安定剤グリセリンを入れ、安定性と徐放作用を向上させ、投薬の有効性と安全性を向上させる。
３、アレルギー疾患皮下注射免疫脱感作投薬方式は、舌下ドロップ投薬方式に比べて、効果が速く、周期が短い。治療周期全体の投薬剤量は舌下ドロップ投薬量（約１００倍）より遥かに少なく、その治療費用は舌下ドロップ投薬免疫脱感作よりはるかに安く、患者の医療負担を低減させる。
４、本発明は、原液として、調製したアレルゲン浸出液を用い、プリックテストを行い、それぞれアレルギー専門医臨床総合特異性診断と血清特異性ＩｇＥ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ，ｓＩｇＥ）診断に対比し、皮内試験結果と臨床総合特異性診断及び血清ｓＩｇＥとの診断の結果が一致し、優れた感度と特異度を有し、安全性が良好である。
本発明により提供されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液は、特異性が高い特徴を有し、カナムグラ感作蛋白成分抽出が充分であり、総生物力価が安定であり、有効期が長く、無菌効果がよい。アレルギー疾患の皮膚プリックテスト診断及び特異免疫治療に効果的に利用でき、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を効果的に診断してそれに対して特異免疫治療を行うことができる。標準化制御を実現でき、使用有効期を延長させ、よい経済的な利益をもたらす。
５、本発明は、調製したアレルゲン浸出液を１：１０３～１０８で希釈した後、体外好塩基球活性化試験を行い、臨床特異性でカナムグラ過敏患者を診断でき、一部の体外ｓＩｇＥ検出偽陽性を避け、それとともに、アレルゲン皮膚試験（プリックまたは皮内）による一部のヨモギ属花粉過敏患者の過敏性ショックのリスクを避けることができる。
本発明の方法によれば、凍結乾燥して再構成した後に取得した浸出液は、北京協和医院で調製したカナムグラ花粉アレルゲン注射原液に比べて、さらに安定であり、生物力価と蛋白含有量とも安定であり、且つ有効期間は３年である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】カナムグラ花粉原料ＩＴＳ２配列ＰＣＲ電気泳動結果を示す図である。
【図2】異なるロットのカナムグラ花粉の異なる脱脂時間における脂肪含有量変化トレンドを示す図である。
【図3】カナムグラ花粉浸出液総蛋白含有量と浸漬抽出時間との関係を示す図である。
【図4】カナムグラ花粉アレルゲン浸出液のＳＤＳ―ＰＡＧＥ蛋白電気泳動結果（成分識別を示す）を示す図である。
【図5】カナムグラ花粉アレルゲン浸出液とカナムグラ過敏患者血清のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ反応検出結果（カナムグラアレルゲン成分識別を示す）を示す図である。
【図6a】新規鑑定のカナムグラ花粉感作蛋白２Ｄゲル電気泳動図を示す。
【図6b】Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ図を示す。
【図7】カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品のｐＨ値の長期間安定性試験におけるテスト結果を示す図である。
【図8】カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品のフェノール含有量の長期間安定性試験におけるテスト結果を示す図である。
【図9】カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品の塩化ナトリウム含有量の長期間安定性試験におけるテスト結果を示す図である。
【図10】カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品の総蛋白含有量の長期間安定性試験におけるテスト結果を示す図である。
【図11】カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品の総アレルゲン活性の長期間安定性試験におけるテスト結果を示す図である。
【図12】カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品の主な感作蛋白含有量Ｈｕｍ ｓ ３の長期間安定性試験におけるテスト結果を示す図である。
【図13】カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品を臨床カナムグラ花粉過敏患者体外に応用させる好塩基球活性化試験結果の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために用いられるが、本発明を限定するものではない。本発明の精神および本質から逸脱せずに、本発明に対して行われる修正または置換は、本発明の範囲に含まれる。
特別指定がない限り、実施形態で使用される技術的手段は、当業者に周知の従来の手段である。
特別指定がない限り、実施形態で使用される技術的手段は、当業者に周知の従来の手段である。
【0017】
実施例１ カナムグラ花粉原料の識別
原料の識別と純度が後続のアレルゲン診断及び治療製剤にとって極めて重要となるため、本実施例は、ＤＮＡ特異性配列検出と顕微鏡検によりカナムグラ原料に対して二重識別及品質管理を行った。
１、カナムグラ花粉ＤＮＡ抽出
天根快速ＤＮＡ抽出増幅キット（天根生化ＫＧ２０３）を用いる。
抽出方法は、カナムグラ花粉サンプル５ｍｇを量り取り、１．５ｍＬの遠心分離管に置き、Ｂｕｆｆｅｒ １ １００μｌを加えた後、一回限りの擂粉木棒でサンプルを徹底的に摺り砕いた後、Ｂｕｆｆｅｒ ２ １００μｌを加えた後、振蕩して均一に混合し、遠心分離分離機１２０００ｒ／ｍｉｎにより５ｍｉｎ遠心分離した後、上清液を新たな遠心分離管に入れ、ＤＮＡ鋳型として控えた。
２、プライマーの設計及び合成
プライマー配列は以下の通りであった。
Ｈｕｍ ＩＴＳ２―Ｆ（配列番号１）：５'―ＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣ―３'
Ｈｕｍ ＩＴＳ２―Ｒ（配列番号２）：５'―ＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＡＣＴＣ―３'
プライマー配列は上海生工生物工程有限公司により合成された。合成後、サブパッケージにして、―２０℃に保存した。
３、ＰＣＲ反応体系
ＰＣＲ増幅キット（天根生化）。抽出したＤＮＡに対して、表１に示す５０μｌ体系の配合ＰＣＲ反応体系を用いた。
４、ＰＣＲ反応条件は表２を参照
ＰＣＲ増幅後の反応液に対し、１％アガロオリゴ糖電気泳動を行い、１００ｍＡで２０ｍｉｎ電気泳動して観察し、電気泳動結果は図１に示す。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は３ロットのカナムグラ花粉ＰＣＲ製品であり、Ｌｍｉｘは上述した３ロットのカナムグラ花粉混合原料ＰＣＲ製品であり、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒは図１に示す。
５、シークエンシング
ＰＣＲ製品純化回収キット（生工ＳＫ１１４１）により、ＰＣＲ製品を回収し、シークエンシングを行い、シークエンシング結果番号Ｈｕｍ ｓ ＩＴＳ２は配列番号３に示した。
６、カナムグラの顕微鏡検
カナムグラ花粉顕微鏡下の形態学識別は、花粉粒球形となり、極面輪郭が円形であり、直径が２６．７ミクロン×２７．５ミクロンであり、３穴を有し、たまに４穴を有し、均一に赤道に配列した。穴の所に、外壁外部がやや厚く、穴環を形成する。外壁層がはっきりしなく、表面に細粒状装飾を有した。
原料の識別と純度が後続のアレルゲン診断及び治療製剤にとって極めて重要となるため、本実施例は、ＤＮＡ特異性配列検出と顕微鏡検によりカナムグラ原料に対して二重識別及品質管理を行った。
１、カナムグラ花粉ＤＮＡ抽出
天根快速ＤＮＡ抽出増幅キット（天根生化ＫＧ２０３）を用いる。
抽出方法は、カナムグラ花粉サンプル５ｍｇを量り取り、１．５ｍＬの遠心分離管に置き、Ｂｕｆｆｅｒ １ １００μｌを加えた後、一回限りの擂粉木棒でサンプルを徹底的に摺り砕いた後、Ｂｕｆｆｅｒ ２ １００μｌを加えた後、振蕩して均一に混合し、遠心分離分離機１２０００ｒ／ｍｉｎにより５ｍｉｎ遠心分離した後、上清液を新たな遠心分離管に入れ、ＤＮＡ鋳型として控えた。
２、プライマーの設計及び合成
プライマー配列は以下の通りであった。
Ｈｕｍ ＩＴＳ２―Ｆ（配列番号１）：５'―ＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣ―３'
Ｈｕｍ ＩＴＳ２―Ｒ（配列番号２）：５'―ＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＡＣＴＣ―３'
プライマー配列は上海生工生物工程有限公司により合成された。合成後、サブパッケージにして、―２０℃に保存した。
３、ＰＣＲ反応体系
ＰＣＲ増幅キット（天根生化）。抽出したＤＮＡに対して、表１に示す５０μｌ体系の配合ＰＣＲ反応体系を用いた。
【表1】
【表2】
５、シークエンシング
ＰＣＲ製品純化回収キット（生工ＳＫ１１４１）により、ＰＣＲ製品を回収し、シークエンシングを行い、シークエンシング結果番号Ｈｕｍ ｓ ＩＴＳ２は配列番号３に示した。
６、カナムグラの顕微鏡検
カナムグラ花粉顕微鏡下の形態学識別は、花粉粒球形となり、極面輪郭が円形であり、直径が２６．７ミクロン×２７．５ミクロンであり、３穴を有し、たまに４穴を有し、均一に赤道に配列した。穴の所に、外壁外部がやや厚く、穴環を形成する。外壁層がはっきりしなく、表面に細粒状装飾を有した。
【0018】
実施例２ カナムグラ花粉脱脂及び浸出のキー・プロセスにおける重要なパラメータの決定
１、カナムグラ花粉脱脂プロセスにおけるパラメータの決定
（１）カナムグラ花粉（ｇ）とアセトン（ｍｌ）を１：２の重量体積比（ｗ／ｖ）で脱脂処理を行った。最適な脱脂時間を決定するために、異なるロット（異なる採集時間）のカナムグラ花粉の異なる脱脂時間サンプルに対して脂肪含有量検出を行った。
海能ＳＯＸ５００脂肪テスターによりカナムグラ花粉において脂肪含有量を測定し、ソックスレー抽出及び乾燥称量の方法により、抽出前後の花粉重量の変化を比較し、対応する脂肪含有量を取得し、脂肪含有量結果により脱脂後花粉に対して質量制御を行った。
結果は、図２を参照する。アセトン脱脂時間が３０ｍｉｎになった後、脂肪含有量が脱脂時間に従ってほとんど下がらないため、脱脂時間を３０ｍｉｎに決定した。
（２）脱脂パラメータの検証は、異なるロット（異なる採集時間）のカナムグラ花粉に対して３０ｍｉｎ脱脂を行った後、脂肪含有量を検出し、結果が表３に示した。
結果によれば、カナムグラ花粉において脂肪含有量が０．５％～３％であるため、後の脱脂では、脱脂後のカナムグラ花粉の脂肪含有量が０．５％～３％を下げる可能性があり、つまり、花粉総重量も０．５％～３％を下げるべきである。
２、カナムグラ花粉蛋白浸漬抽出プロセスにおける重要なパラメータを決定
（１）カナムグラ花粉（ｇ）とアセトン（ｍｌ）を１：２の重量体積比（ｗ／ｖ）で３０分間攪拌または振動脱脂処理し、静置して分層させ、上層液体の上澄み状況を観察し、上層液体が上澄みになるまでに、繰り返して脱脂し、脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温で４８時間以上乾燥した。
（２）脱脂乾燥後のカナムグラ花粉を重量体積比１:１０でｐＨ７．９～８．２のリン酸塩―塩水緩衝液１０Ｌに入れ、２～８℃で、攪拌速度２５０ｒｐｍで、攪拌時間がそれぞれ３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ、１８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈなどになった抽出点に、抽出後の抽出液と浸出液を全部遠心分離桶に入れ、バランスを調整し、遠心分離力８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度４℃、時間１５～２０分間で、遠心分離し、上清液を回収した。
（３）遠心分離後の上清液を、まず、４０００メッシュろ過布でろ過した後、板紙でろ過し、０．４５μｍと０．２２μｍのろ膜で順次にろ過し、カナムグラ花粉粗抽出液を取得した。
サンプルを取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により蛋白含有量を測定し、結果は、カナムグラ花粉浸出液総蛋白含有量と浸漬抽出時間の関係を示す図３を参照する。
図３に示すように、蛋白抽出プロセスにおいて、攪拌抽出時間に従って、蛋白抽出含有量が増加し、抽出時間２４ｈにおける含有量が最大９８２±１０μｇ／ｍｌになった。蛋白類物質の抽出時間が長すぎると、その蛋白含有量に影響を与えるため、抽出時間が２２～２６ｈ左右であることが好ましい。
１、カナムグラ花粉脱脂プロセスにおけるパラメータの決定
（１）カナムグラ花粉（ｇ）とアセトン（ｍｌ）を１：２の重量体積比（ｗ／ｖ）で脱脂処理を行った。最適な脱脂時間を決定するために、異なるロット（異なる採集時間）のカナムグラ花粉の異なる脱脂時間サンプルに対して脂肪含有量検出を行った。
海能ＳＯＸ５００脂肪テスターによりカナムグラ花粉において脂肪含有量を測定し、ソックスレー抽出及び乾燥称量の方法により、抽出前後の花粉重量の変化を比較し、対応する脂肪含有量を取得し、脂肪含有量結果により脱脂後花粉に対して質量制御を行った。
結果は、図２を参照する。アセトン脱脂時間が３０ｍｉｎになった後、脂肪含有量が脱脂時間に従ってほとんど下がらないため、脱脂時間を３０ｍｉｎに決定した。
（２）脱脂パラメータの検証は、異なるロット（異なる採集時間）のカナムグラ花粉に対して３０ｍｉｎ脱脂を行った後、脂肪含有量を検出し、結果が表３に示した。
【表3】
２、カナムグラ花粉蛋白浸漬抽出プロセスにおける重要なパラメータを決定
（１）カナムグラ花粉（ｇ）とアセトン（ｍｌ）を１：２の重量体積比（ｗ／ｖ）で３０分間攪拌または振動脱脂処理し、静置して分層させ、上層液体の上澄み状況を観察し、上層液体が上澄みになるまでに、繰り返して脱脂し、脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温で４８時間以上乾燥した。
（２）脱脂乾燥後のカナムグラ花粉を重量体積比１:１０でｐＨ７．９～８．２のリン酸塩―塩水緩衝液１０Ｌに入れ、２～８℃で、攪拌速度２５０ｒｐｍで、攪拌時間がそれぞれ３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ、１８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈなどになった抽出点に、抽出後の抽出液と浸出液を全部遠心分離桶に入れ、バランスを調整し、遠心分離力８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度４℃、時間１５～２０分間で、遠心分離し、上清液を回収した。
（３）遠心分離後の上清液を、まず、４０００メッシュろ過布でろ過した後、板紙でろ過し、０．４５μｍと０．２２μｍのろ膜で順次にろ過し、カナムグラ花粉粗抽出液を取得した。
サンプルを取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により蛋白含有量を測定し、結果は、カナムグラ花粉浸出液総蛋白含有量と浸漬抽出時間の関係を示す図３を参照する。
図３に示すように、蛋白抽出プロセスにおいて、攪拌抽出時間に従って、蛋白抽出含有量が増加し、抽出時間２４ｈにおける含有量が最大９８２±１０μｇ／ｍｌになった。蛋白類物質の抽出時間が長すぎると、その蛋白含有量に影響を与えるため、抽出時間が２２～２６ｈ左右であることが好ましい。
【0019】
実施例３ カナムグラ花粉原料プロセス
１、花粉採集
自然脱落法でカナムグラ花粉を収集した。花粉が粘着しないまでに、常温または真空またはフルイドベッド乾燥を行った。乾燥後の花粉を１５０～２５０メッシュサンプルふるいに通過させ、本実施例において、１８０メッシュサンプルふるいが好ましい。
２、乾燥
花粉が粘着しないまでに、通風して花粉を６～４８ｈ自然乾燥し、または真空乾燥し、またはフルイドベッド乾燥した。
３、脱脂
取得した花粉（ｇ）とアセトン（ｍｌ）を１：５～１:１の重量体積比（ｗ／ｖ）で脱脂処理を行った。本実施例において、１：２が好ましい。３０分間攪拌または振動脱脂した後、静置して分層させ、上層液体の上澄み状況を観察した。上層液を注出し、新たなアセトンを入れ、上層液体が上澄みになるまでに、繰り返して脱脂した。
４、再乾燥
脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温で６～４８ｈ乾燥、または真空乾燥、またはフルイドベッド乾燥を行った。
５、不純物制御
（１）顕微鏡で、粒子計数法により測定した。不純物粒子の含有量は、胞子含有量≦１％、無関係花粉含有量≦２％、そのほかの不純物含有量≦１０％という標準を満たすべきである。
（２）重金属及び有害元素
総重金属≦５０ ｍｇ／ｋｇ、ヒ素≦５ ｍｇ／ｋｇ。
（３）アセトン残留
アセトン残留量≦０．５％（体積分率）。
１、花粉採集
自然脱落法でカナムグラ花粉を収集した。花粉が粘着しないまでに、常温または真空またはフルイドベッド乾燥を行った。乾燥後の花粉を１５０～２５０メッシュサンプルふるいに通過させ、本実施例において、１８０メッシュサンプルふるいが好ましい。
２、乾燥
花粉が粘着しないまでに、通風して花粉を６～４８ｈ自然乾燥し、または真空乾燥し、またはフルイドベッド乾燥した。
３、脱脂
取得した花粉（ｇ）とアセトン（ｍｌ）を１：５～１:１の重量体積比（ｗ／ｖ）で脱脂処理を行った。本実施例において、１：２が好ましい。３０分間攪拌または振動脱脂した後、静置して分層させ、上層液体の上澄み状況を観察した。上層液を注出し、新たなアセトンを入れ、上層液体が上澄みになるまでに、繰り返して脱脂した。
４、再乾燥
脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温で６～４８ｈ乾燥、または真空乾燥、またはフルイドベッド乾燥を行った。
５、不純物制御
（１）顕微鏡で、粒子計数法により測定した。不純物粒子の含有量は、胞子含有量≦１％、無関係花粉含有量≦２％、そのほかの不純物含有量≦１０％という標準を満たすべきである。
（２）重金属及び有害元素
総重金属≦５０ ｍｇ／ｋｇ、ヒ素≦５ ｍｇ／ｋｇ。
（３）アセトン残留
アセトン残留量≦０．５％（体積分率）。
【0020】
実施例４ カナムグラ花粉アレルゲン原液（凍結乾燥品）の調製プロセス
１、実施例３のカナムグラ花粉原料プロセスによりカナムグラ花粉原料を調製した。
２、浸漬抽出
脱脂乾燥後のカナムグラ花粉を重量体積比１:５０～１:１０、本実施例において、１：２０で、ｐＨ７．９～８．２のリン酸塩―塩水緩衝液１０Ｌに入れ、２～８℃で２２～２６ｈ攪拌して浸漬抽出させた。リン酸塩―塩水緩衝液（ｐＨ ８．２）１０００ｍｌを例とする調合方法は表４に示した。リン酸塩―塩水緩衝液を充分に溶解させた後、除菌ろ過を行い、２～８℃で放置し、３０日以内に保存した。
３、固液分離
抽出後の浸出液を取り、浸出液全体を遠心分離桶に入れ、バランスを調製し、遠心分離力８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度２～８℃、時間１５～２０分間により、遠心分離を行い、上清液を回収した。
４、上澄み
遠心分離分離後の上清液を、まず、４０００メッシュろ過布でろ過した後、ろ液を板紙でろ過し、０．４５μｍと０．２２μｍろ膜で順次にろ過した。
５、限外ろ過、透析、濃縮
ろ過後の浸出液に対し、３ＫＤまたは１ＫＤ限外ろ過膜でタンジェント流限外ろ過を行い、好ましくは、本実施例において、３ＫＤ限外ろ過膜で限外ろ過を行った。透析液は、２５～１２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を用い、本実施例において、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３が好ましい。蛋白含有量品質標準に基づき、適当な体積までに限外ろ過して濃縮し、蛋白含有量から品質標準の総蛋白含有量までの区間を検出した。限外ろ過濃縮液、限外ろ過透過液を取り、それらの総蛋白含有量を検出した。限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦０．０２ ｍｇ／ｍｌとなったとき、透過液を直接排棄し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量＞０．０２ ｍｇ／ｍｌとなったとき、限外ろ過膜に対して完全性テストを行い、限外ろ過膜が破損しなければ、透過液を排棄し、限外ろ過膜が破損すれば、限外ろ過膜を交換した後、透過液に対して繰り返して限外ろ過を行った。
６、無菌ろ過
０．２２μｍ膜で除菌ろ過を行った。
７、凍結乾燥
―５０～―３５℃で凍結し、２～８ｍｂａｒ真空圧力で、―２５℃で乾燥し、水分含有量≦３％に制御するという凍結乾燥プロセス条件により、カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を取得した。
１、実施例３のカナムグラ花粉原料プロセスによりカナムグラ花粉原料を調製した。
２、浸漬抽出
脱脂乾燥後のカナムグラ花粉を重量体積比１:５０～１:１０、本実施例において、１：２０で、ｐＨ７．９～８．２のリン酸塩―塩水緩衝液１０Ｌに入れ、２～８℃で２２～２６ｈ攪拌して浸漬抽出させた。リン酸塩―塩水緩衝液（ｐＨ ８．２）１０００ｍｌを例とする調合方法は表４に示した。リン酸塩―塩水緩衝液を充分に溶解させた後、除菌ろ過を行い、２～８℃で放置し、３０日以内に保存した。
【表4】
抽出後の浸出液を取り、浸出液全体を遠心分離桶に入れ、バランスを調製し、遠心分離力８０００～１２０００ｇ、遠心分離温度２～８℃、時間１５～２０分間により、遠心分離を行い、上清液を回収した。
４、上澄み
遠心分離分離後の上清液を、まず、４０００メッシュろ過布でろ過した後、ろ液を板紙でろ過し、０．４５μｍと０．２２μｍろ膜で順次にろ過した。
５、限外ろ過、透析、濃縮
ろ過後の浸出液に対し、３ＫＤまたは１ＫＤ限外ろ過膜でタンジェント流限外ろ過を行い、好ましくは、本実施例において、３ＫＤ限外ろ過膜で限外ろ過を行った。透析液は、２５～１２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を用い、本実施例において、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３が好ましい。蛋白含有量品質標準に基づき、適当な体積までに限外ろ過して濃縮し、蛋白含有量から品質標準の総蛋白含有量までの区間を検出した。限外ろ過濃縮液、限外ろ過透過液を取り、それらの総蛋白含有量を検出した。限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦０．０２ ｍｇ／ｍｌとなったとき、透過液を直接排棄し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量＞０．０２ ｍｇ／ｍｌとなったとき、限外ろ過膜に対して完全性テストを行い、限外ろ過膜が破損しなければ、透過液を排棄し、限外ろ過膜が破損すれば、限外ろ過膜を交換した後、透過液に対して繰り返して限外ろ過を行った。
６、無菌ろ過
０．２２μｍ膜で除菌ろ過を行った。
７、凍結乾燥
―５０～―３５℃で凍結し、２～８ｍｂａｒ真空圧力で、―２５℃で乾燥し、水分含有量≦３％に制御するという凍結乾燥プロセス条件により、カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を取得した。
【0021】
実施例５ カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品の調製プロセス
１、再構成
実施例４で調製したカナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品をリン酸塩―塩水緩衝液（ｐＨ ６．５～７．５、調合方法は表５を参照）で再構成させ、総蛋白含有量を品質標準２倍範囲区間にさせた。２～８℃で放置した。
２、半製品配合
原液再構成後、クリーンホールにてＡ級清潔条件下で、再構成液と予め湿熱滅菌（１２１℃、３０分間）して等体積で冷却のグリセリンとを均一に混合し、溶液のｐＨ値を６．０～８．０に調製した。
３、半製品を除菌ろ過し、無菌サブパッケージで製品にさせ
クリーンホール内Ａ級清潔条件下で、半製品を０．２２μｍろ膜で除菌ろ過させ、無菌サブパッケージで製品にさせ、ｐＨ６．０～８．０の浅黄色乃至茶褐色液体、即ちカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液製品を取得した。
１、再構成
実施例４で調製したカナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品をリン酸塩―塩水緩衝液（ｐＨ ６．５～７．５、調合方法は表５を参照）で再構成させ、総蛋白含有量を品質標準２倍範囲区間にさせた。２～８℃で放置した。
【表5】
原液再構成後、クリーンホールにてＡ級清潔条件下で、再構成液と予め湿熱滅菌（１２１℃、３０分間）して等体積で冷却のグリセリンとを均一に混合し、溶液のｐＨ値を６．０～８．０に調製した。
３、半製品を除菌ろ過し、無菌サブパッケージで製品にさせ
クリーンホール内Ａ級清潔条件下で、半製品を０．２２μｍろ膜で除菌ろ過させ、無菌サブパッケージで製品にさせ、ｐＨ６．０～８．０の浅黄色乃至茶褐色液体、即ちカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液製品を取得した。
【0022】
実施例６ カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品の質量制御
１、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液総蛋白成分ＳＤＳ―ＰＡＧＥ法識別
還元型ＳＤＳ―ＰＡＧＥ法により、分離ゲル濃度が４～１２％であり、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果は図３に示した。ＭはＧｅｎｓｔａｒ Ｍ２２３―０１ Ｍａｒｋｅｒであり、Ｒは凍結乾燥内部参照品（即ち、凍結乾燥したカナムグラ花粉アレルゲン原液）であり、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は異なるロットのカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液であり、その蛋白は主に６．３～７６ｋＤａに分布し、具体的には、１０ｋＤａ（具体的な分子量は６．３ ｋＤａ、７．０ｋＤａ、８．０９ｋＤａ、８．８ｋＤａ、９．６ｋＤａ、１０．０３ｋＤａ、１０．２２ｋＤａである）、１１．８ ｋＤａ、１２．３ ｋＤａ、１３．５ ｋＤａ 、１５．２ ｋＤａ、 １５．３２ ｋＤａ、１６．４５ ｋＤａ 、１６．６１ ｋＤａ、１９ ｋＤａ（具体的には、１９．０４ ｋＤａ、１９．１８ ｋＤａ、１９．９９ ｋＤａ）、２８ ｋＤａ、３７ ｋＤａ、４２ ｋＤａ、４５ ｋＤａ、５２ ｋＤａ、６６ ｋＤａ、７６ ｋＤａに分布した。
鑑定した感作蛋白分子量、配列、過敏血清陽性率、対応ホロ蛋白マススペクトル鑑定ペプチドセグメント概況は表６に参照する。
２、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液総アレルゲン成分Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法識別
還元型ＳＤＳ―ＰＡＧ電気泳動を用い、分離ゲル濃度が４～１２％であり、０．２μｍ ＰＶＤＦ ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＲ―ＰＳＱ転写フィルムを用い、一次抗体血清反応希釈度が１：３であり、室温で２ｈ雑交し、そして、４℃冷蔵庫で一晩雑交し、１×ＰＢＳＴで３回洗い、１０ｍｉｎ／回となった。二次抗体Ｍｓ ｍＡｂ ｔｏ Ｈｕ ＩｇＥ（ａｂ９９８０６）が１：１０００であり、室温で２ｈ雑交し、１×ＰＢＳＴで３回洗い、１０ｍｉｎ／回となった。ＥＣＬ現像液のＡ液とＢ液を１:１で均一に混合した後、露光して顕色させた。
結果は図４に示した。ＭはＧｅｎｓｔａｒ Ｍ２２３―０１ Ｍａｒｋｅｒであり、Ｒは内部参照品であり、Ｎは浸出液と健康被験者血清の反応ストリップであり、Ｐ１～２４はそれぞれ浸出液と臨床確診のカナムグラ過敏陽性患者２４例（ｓＩｇＥ≧３級、皮膚試験≧+++、典型的な夏秋花粉症病史）の血清反応ストリップ結果であり、感作Ｈｕｍ ｓｃ １―Ｈｕｍ ｓｃ １１の分子量及び過敏血清陽性率は表６に示した。これによって、血清陽性率最大のＨｕｍ ｓ ３（９．６ｋＤａ）がカナムグラ花粉の主な感作蛋白（血清陽性率最大が６８．９％）であることが分かった。
３、感作蛋白配列測定
本発明の製品により、対応の感作蛋白（表６を参照）に対して全蛋白配列測定を行い、カナムグラ花粉原料においてそれぞれの感作蛋白対応ｍＲＮＡに対してヌクレオチドフル・シークエンシングを行い、感作蛋白コード、配列識別子及びアミノ酸フル・配列、対応ｍＲＮＡフル・配列結果は表６を参照する。そのうち、Ｈｕｍ ｓ ３は主な感作蛋白であった。
本発明に含まれるカナムグラ感作蛋白のフル・配列は順次に以下となった。
Ｈｕｍ ｓｃ １感作蛋白フル・配列は、配列番号４に示した。
Ｈｕｍ ｓｘ ２感作蛋白フル・配列は、配列番号５に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ２感作蛋白フル・配列は、配列番号６に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ３感作蛋白フル・配列は、配列番号７に示した。
Ｈｕｍ ｓ ３感作蛋白フル・配列は、配列番号８（本出願者がこの前に発見したＮＣＢＩデータベースにおけるＨｕｍ ｓ ３：ＡＤＢ９７９１９．１蛋白配列に完全に合致するが、ｍＲＮＡが第１５位で同義的置換が発生した）に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ４感作蛋白フル・配列は、配列番号９に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ５感作蛋白フル・配列は、配列番号１０に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ６感作蛋白フル・配列は、配列番号１１に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ７感作蛋白フル・配列は、配列番号１２に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ８感作蛋白フル・配列は、配列番号１３に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ９感作蛋白フル・配列は、配列番号１４に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １０感作蛋白フル・配列は、配列番号１５に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １１感作蛋白フル・配列は、配列番号１６に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １２感作蛋白フル・配列は、配列番号１７に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １３感作蛋白フル・配列は、配列番号１８に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １４感作蛋白フル・配列は、配列番号１９に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １５感作蛋白フル・配列は、配列番号２０に示した。
カナムグラ花粉原料においての前記それぞれの感作蛋白対応ｍＲＮＡがヌクレオチドフル・シークエンシングを行った後、それらのｍＲＮＡ対応配列は以下の通りであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２１に示した。
Ｈｕｍ ｓｘ ２感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２２に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ２感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２３に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ３感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２４に示した。
Ｈｕｍ ｓ３感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２５に示した。（ＮＣＢＩ番号ＦＪ９６７１１７．１に比べて、第１５位ヌクレオチドがＴ→Ｃ同義的置換を行った）
Ｈｕｍ ｓＣ ４感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２６に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ５感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２７に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ６感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２８に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ７感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２９に示した。
ｓＨｕｍ ｓＣ８感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３０に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ ９感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３１に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １０感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３２に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １２感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３４に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １３感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３５に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １４感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３６に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １５感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３７に示した。
本発明において新規鑑定したカナムグラ花粉蛋白（Ｈｕｍ ｓｃ １―１５）に対し、本発明は高解像度の両方向電気泳動（２Ｄ）にＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ技術（１５例のカナムグラ花粉過敏患者陽性血清池と反応する）を加え、上記の蛋白とカナムグラ花粉過敏患者外周血におけるｓＩｇＥが結合できることを証明し、このため、感作蛋白となっている。２Ｄのゲル電気泳動図は図６（ａ）に示し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ結果は図６（ｂ）示した。
４、質量スペクトル検出
カナムグラアレルゲン浸出液に対し、ホロ蛋白マススペクトル分析を行い、カナムグラアレルゲンがＳＤＳ―ＰＡＧＥ分離した後に対応するガムテープに対し、それぞれサンプルを取り、質量スペクトル鑑定を行い、以下のペプチドセグメントを含むが、これらに限られない。
Ｈｕｍ ｓｃ ３質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号３８：ＴＡＤＡＡＨＳＡＡＤＳＶＱＥＧＫであった。
Ｈｕｍ Ｓ ３質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号３９：ＡＣＴＳＬＹＤＫ
配列番号４０：ＡＣＴＳＬＹＤＫＹＹＱＮＣＶＭＫ
配列番号４１：ＬＰＰＧＡＣＩＤＳＥＮＹＲ
配列番号４２：ＬＰＰＧＡＣＩＤＳＥＮＹＲＫ
配列番号４３：ＳＩＹＰＳＮＹＡＥＣＡＴＴＨＨＮＩＣＧＤＬＱＧ
配列番号４４：ＹＹＱＮＣＶＭＫであった。
Ｈｕｍ ｓｃ ４質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号４５：ＹＥＳＣＬＬＳＨＩＳＣＤＦＤＳＣＫ
配列番号４６：ＡＤＣＦＴＴＣＤＳＹＹＰＫ
配列番号４７：ＩＫＨＤＤＩＣＮＧＬＰであった。
Ｈｕｍ ｓｃ ７質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号４８：ＡＣＧＳＬＹＤＫ
配列番号４９：ＡＣＧＳＬＹＤＫＹＹＱＮＣＶＭＫ
配列番号５０：ＹＹＱＮＣＶＭＫ
配列番号５１：ＬＰＨＧＡＣＩＤＤＥＮＹＱＮＣＬＫ
配列番号５２：ＮＮＩＧＳＣＮＩＮＴＣＦＥＤＴＳＫ
配列番号５３：ＳＩＹＰＮＮＹＧＤＣＡＴＴＨＨＤＩＣＧＤＬＱＧであった。
Ｈｕｍ ｓｃ ９質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号５４：ＩＩＳＨＨＹＮＥＫ
配列番号５５：ＩＩＳＨＨＹＮＥＫＲ
配列番号５６：ＬＶＫＩＩＳＨＨＹＮＥＫ
配列番号５７：ＮＶＰＴＬＩＤＡＲ
配列番号５８：ＲＮＶＰＴＬＩＤＡＲ
配列番号５９：ＶＩＧＰＴＴＬＲであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １１質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号６０：ＴＬＥＱＶＥＩＫ
配列番号６１：ＧＴＴＬＩＥＣＧＦＳＷＤＷＧＫ
配列番号６２：ＱＳＨＨＴＤＩＹＴＰＥＧＰＮＣＲであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １２質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号６３：ＩＥＱＶＤＶＲ
配列番号６４：ＮＶＬＤＧＫＱＤＬＳＶＹＣＫ
配列番号６５：ＱＤＬＳＶＹＣＫ
配列番号６６：ＮＮＥＦＮＴＱＩＬＳＹＫ
配列番号６７：ＥＦＨＮＶＱＩＦＭＰＥＳＬＮＣＲ
配列番号６８：ＳＦＴＦＤＣＦＤＷＧＫであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １３質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号６９：ＡＦＬＤＡＨＮＡＩＲであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １５質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号７０：ＡＹＬＤＡＨＮＡＶＲ
配列番号７１：ＴＬＥＤＹＡＱＫであった。
備考：ＳＤＳ―ＰＡＧＥ解像度は限界があり、１０ｋＤａ蛋白総体血清陽性率は６６．７％であり、Ｈｕｍ ｓｃ ３とＨｕｍ Ｓ ３は同じ蛋白であり、１９ｋＤａ蛋白総体血清陽性率は２４．１％である。
５、理化学的性質検出
このカナムグラアレルゲン浸出液は理化学的性質検出を行った後、その品質標準は表７に示した。
６、総アレルゲン活性測定
アレルゲン浸出液には治療有効量または診断有効量のカナムグラ花粉アレルゲンが含まれるとき、競争性ＥＬＩＳＡ法により、相対生物力価５００００ ＢＡＵ／ｍｌ～２０００００ ＢＡＵ／ｍｌ、蛋白濃度０．４０～１．６０ｍｇ／ｍｌであったことを測定した。
７、主な感作蛋白Ｈｕｍ ｓ ３含有量検出
二抗体モノクローナル抗体サンドイッチ測定法ＥＬＩＳＡ法により、カナムグラ花粉アレルゲン浸出液における主な感作蛋白含有量を検出した。複数のロットの検出により、その変動範囲０．０８～０．３２ｍｇ／ｍｌを決定した。
８、無菌検査
非無菌生長してはならなかった。
１、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液総蛋白成分ＳＤＳ―ＰＡＧＥ法識別
還元型ＳＤＳ―ＰＡＧＥ法により、分離ゲル濃度が４～１２％であり、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果は図３に示した。ＭはＧｅｎｓｔａｒ Ｍ２２３―０１ Ｍａｒｋｅｒであり、Ｒは凍結乾燥内部参照品（即ち、凍結乾燥したカナムグラ花粉アレルゲン原液）であり、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は異なるロットのカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液であり、その蛋白は主に６．３～７６ｋＤａに分布し、具体的には、１０ｋＤａ（具体的な分子量は６．３ ｋＤａ、７．０ｋＤａ、８．０９ｋＤａ、８．８ｋＤａ、９．６ｋＤａ、１０．０３ｋＤａ、１０．２２ｋＤａである）、１１．８ ｋＤａ、１２．３ ｋＤａ、１３．５ ｋＤａ 、１５．２ ｋＤａ、 １５．３２ ｋＤａ、１６．４５ ｋＤａ 、１６．６１ ｋＤａ、１９ ｋＤａ（具体的には、１９．０４ ｋＤａ、１９．１８ ｋＤａ、１９．９９ ｋＤａ）、２８ ｋＤａ、３７ ｋＤａ、４２ ｋＤａ、４５ ｋＤａ、５２ ｋＤａ、６６ ｋＤａ、７６ ｋＤａに分布した。
鑑定した感作蛋白分子量、配列、過敏血清陽性率、対応ホロ蛋白マススペクトル鑑定ペプチドセグメント概況は表６に参照する。
２、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液総アレルゲン成分Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法識別
還元型ＳＤＳ―ＰＡＧ電気泳動を用い、分離ゲル濃度が４～１２％であり、０．２μｍ ＰＶＤＦ ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＲ―ＰＳＱ転写フィルムを用い、一次抗体血清反応希釈度が１：３であり、室温で２ｈ雑交し、そして、４℃冷蔵庫で一晩雑交し、１×ＰＢＳＴで３回洗い、１０ｍｉｎ／回となった。二次抗体Ｍｓ ｍＡｂ ｔｏ Ｈｕ ＩｇＥ（ａｂ９９８０６）が１：１０００であり、室温で２ｈ雑交し、１×ＰＢＳＴで３回洗い、１０ｍｉｎ／回となった。ＥＣＬ現像液のＡ液とＢ液を１:１で均一に混合した後、露光して顕色させた。
結果は図４に示した。ＭはＧｅｎｓｔａｒ Ｍ２２３―０１ Ｍａｒｋｅｒであり、Ｒは内部参照品であり、Ｎは浸出液と健康被験者血清の反応ストリップであり、Ｐ１～２４はそれぞれ浸出液と臨床確診のカナムグラ過敏陽性患者２４例（ｓＩｇＥ≧３級、皮膚試験≧+++、典型的な夏秋花粉症病史）の血清反応ストリップ結果であり、感作Ｈｕｍ ｓｃ １―Ｈｕｍ ｓｃ １１の分子量及び過敏血清陽性率は表６に示した。これによって、血清陽性率最大のＨｕｍ ｓ ３（９．６ｋＤａ）がカナムグラ花粉の主な感作蛋白（血清陽性率最大が６８．９％）であることが分かった。
３、感作蛋白配列測定
本発明の製品により、対応の感作蛋白（表６を参照）に対して全蛋白配列測定を行い、カナムグラ花粉原料においてそれぞれの感作蛋白対応ｍＲＮＡに対してヌクレオチドフル・シークエンシングを行い、感作蛋白コード、配列識別子及びアミノ酸フル・配列、対応ｍＲＮＡフル・配列結果は表６を参照する。そのうち、Ｈｕｍ ｓ ３は主な感作蛋白であった。
本発明に含まれるカナムグラ感作蛋白のフル・配列は順次に以下となった。
Ｈｕｍ ｓｃ １感作蛋白フル・配列は、配列番号４に示した。
Ｈｕｍ ｓｘ ２感作蛋白フル・配列は、配列番号５に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ２感作蛋白フル・配列は、配列番号６に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ３感作蛋白フル・配列は、配列番号７に示した。
Ｈｕｍ ｓ ３感作蛋白フル・配列は、配列番号８（本出願者がこの前に発見したＮＣＢＩデータベースにおけるＨｕｍ ｓ ３：ＡＤＢ９７９１９．１蛋白配列に完全に合致するが、ｍＲＮＡが第１５位で同義的置換が発生した）に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ４感作蛋白フル・配列は、配列番号９に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ５感作蛋白フル・配列は、配列番号１０に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ６感作蛋白フル・配列は、配列番号１１に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ７感作蛋白フル・配列は、配列番号１２に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ８感作蛋白フル・配列は、配列番号１３に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ９感作蛋白フル・配列は、配列番号１４に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １０感作蛋白フル・配列は、配列番号１５に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １１感作蛋白フル・配列は、配列番号１６に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １２感作蛋白フル・配列は、配列番号１７に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １３感作蛋白フル・配列は、配列番号１８に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １４感作蛋白フル・配列は、配列番号１９に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ １５感作蛋白フル・配列は、配列番号２０に示した。
カナムグラ花粉原料においての前記それぞれの感作蛋白対応ｍＲＮＡがヌクレオチドフル・シークエンシングを行った後、それらのｍＲＮＡ対応配列は以下の通りであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２１に示した。
Ｈｕｍ ｓｘ ２感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２２に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ２感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２３に示した。
Ｈｕｍ ｓｃ ３感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２４に示した。
Ｈｕｍ ｓ３感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２５に示した。（ＮＣＢＩ番号ＦＪ９６７１１７．１に比べて、第１５位ヌクレオチドがＴ→Ｃ同義的置換を行った）
Ｈｕｍ ｓＣ ４感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２６に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ５感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２７に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ６感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２８に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ７感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号２９に示した。
ｓＨｕｍ ｓＣ８感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３０に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ ９感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３１に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １０感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３２に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １２感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３４に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １３感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３５に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １４感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３６に示した。
Ｈｕｍ ｓＣ １５感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号３７に示した。
本発明において新規鑑定したカナムグラ花粉蛋白（Ｈｕｍ ｓｃ １―１５）に対し、本発明は高解像度の両方向電気泳動（２Ｄ）にＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ技術（１５例のカナムグラ花粉過敏患者陽性血清池と反応する）を加え、上記の蛋白とカナムグラ花粉過敏患者外周血におけるｓＩｇＥが結合できることを証明し、このため、感作蛋白となっている。２Ｄのゲル電気泳動図は図６（ａ）に示し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ結果は図６（ｂ）示した。
４、質量スペクトル検出
カナムグラアレルゲン浸出液に対し、ホロ蛋白マススペクトル分析を行い、カナムグラアレルゲンがＳＤＳ―ＰＡＧＥ分離した後に対応するガムテープに対し、それぞれサンプルを取り、質量スペクトル鑑定を行い、以下のペプチドセグメントを含むが、これらに限られない。
Ｈｕｍ ｓｃ ３質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号３８：ＴＡＤＡＡＨＳＡＡＤＳＶＱＥＧＫであった。
Ｈｕｍ Ｓ ３質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号３９：ＡＣＴＳＬＹＤＫ
配列番号４０：ＡＣＴＳＬＹＤＫＹＹＱＮＣＶＭＫ
配列番号４１：ＬＰＰＧＡＣＩＤＳＥＮＹＲ
配列番号４２：ＬＰＰＧＡＣＩＤＳＥＮＹＲＫ
配列番号４３：ＳＩＹＰＳＮＹＡＥＣＡＴＴＨＨＮＩＣＧＤＬＱＧ
配列番号４４：ＹＹＱＮＣＶＭＫであった。
Ｈｕｍ ｓｃ ４質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号４５：ＹＥＳＣＬＬＳＨＩＳＣＤＦＤＳＣＫ
配列番号４６：ＡＤＣＦＴＴＣＤＳＹＹＰＫ
配列番号４７：ＩＫＨＤＤＩＣＮＧＬＰであった。
Ｈｕｍ ｓｃ ７質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号４８：ＡＣＧＳＬＹＤＫ
配列番号４９：ＡＣＧＳＬＹＤＫＹＹＱＮＣＶＭＫ
配列番号５０：ＹＹＱＮＣＶＭＫ
配列番号５１：ＬＰＨＧＡＣＩＤＤＥＮＹＱＮＣＬＫ
配列番号５２：ＮＮＩＧＳＣＮＩＮＴＣＦＥＤＴＳＫ
配列番号５３：ＳＩＹＰＮＮＹＧＤＣＡＴＴＨＨＤＩＣＧＤＬＱＧであった。
Ｈｕｍ ｓｃ ９質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号５４：ＩＩＳＨＨＹＮＥＫ
配列番号５５：ＩＩＳＨＨＹＮＥＫＲ
配列番号５６：ＬＶＫＩＩＳＨＨＹＮＥＫ
配列番号５７：ＮＶＰＴＬＩＤＡＲ
配列番号５８：ＲＮＶＰＴＬＩＤＡＲ
配列番号５９：ＶＩＧＰＴＴＬＲであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １１質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号６０：ＴＬＥＱＶＥＩＫ
配列番号６１：ＧＴＴＬＩＥＣＧＦＳＷＤＷＧＫ
配列番号６２：ＱＳＨＨＴＤＩＹＴＰＥＧＰＮＣＲであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １２質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号６３：ＩＥＱＶＤＶＲ
配列番号６４：ＮＶＬＤＧＫＱＤＬＳＶＹＣＫ
配列番号６５：ＱＤＬＳＶＹＣＫ
配列番号６６：ＮＮＥＦＮＴＱＩＬＳＹＫ
配列番号６７：ＥＦＨＮＶＱＩＦＭＰＥＳＬＮＣＲ
配列番号６８：ＳＦＴＦＤＣＦＤＷＧＫであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １３質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号６９：ＡＦＬＤＡＨＮＡＩＲであった。
Ｈｕｍ ｓｃ １５質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号７０：ＡＹＬＤＡＨＮＡＶＲ
配列番号７１：ＴＬＥＤＹＡＱＫであった。
【表6】
５、理化学的性質検出
このカナムグラアレルゲン浸出液は理化学的性質検出を行った後、その品質標準は表７に示した。
【表7】
アレルゲン浸出液には治療有効量または診断有効量のカナムグラ花粉アレルゲンが含まれるとき、競争性ＥＬＩＳＡ法により、相対生物力価５００００ ＢＡＵ／ｍｌ～２０００００ ＢＡＵ／ｍｌ、蛋白濃度０．４０～１．６０ｍｇ／ｍｌであったことを測定した。
７、主な感作蛋白Ｈｕｍ ｓ ３含有量検出
二抗体モノクローナル抗体サンドイッチ測定法ＥＬＩＳＡ法により、カナムグラ花粉アレルゲン浸出液における主な感作蛋白含有量を検出した。複数のロットの検出により、その変動範囲０．０８～０．３２ｍｇ／ｍｌを決定した。
８、無菌検査
非無菌生長してはならなかった。
【0023】
実施例７ カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品安定性試験
実施例５に調製したカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液製品に対し、２～８℃で長期間安定性研究試験を行い、３つのロットのサンプルにそれぞれ０ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月及び１２ヶ月のｐＨ値変化、フェノール含有量、塩化ナトリウム含有量、蛋白含有量、総アレルゲン活性、主な感作蛋白Ｈｕｍ ｓ ３含有量の変化を検出し、結果は図７～図１２に示した。
上述した安定性結果において、１２ヶ月の長期間試験では、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液の品質管理パラメータが不規則波動したが、実験誤差による可能性があるが、それにしても、品質標準管理範囲内にあり、且つ、異なるロットの間の変化トレンドがほぼ一致し、本発明によるカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液は、２～８℃条件で、少なくとも１２ヶ月内に安定に保存することができることが分かった。このため、カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品の有効期間は、３６ヶ月と推定された。
実施例５に調製したカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液製品に対し、２～８℃で長期間安定性研究試験を行い、３つのロットのサンプルにそれぞれ０ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月及び１２ヶ月のｐＨ値変化、フェノール含有量、塩化ナトリウム含有量、蛋白含有量、総アレルゲン活性、主な感作蛋白Ｈｕｍ ｓ ３含有量の変化を検出し、結果は図７～図１２に示した。
上述した安定性結果において、１２ヶ月の長期間試験では、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液の品質管理パラメータが不規則波動したが、実験誤差による可能性があるが、それにしても、品質標準管理範囲内にあり、且つ、異なるロットの間の変化トレンドがほぼ一致し、本発明によるカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液は、２～８℃条件で、少なくとも１２ヶ月内に安定に保存することができることが分かった。このため、カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品の有効期間は、３６ヶ月と推定された。
【0024】
実施例８ 評価応用１
本発明によるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液により、カナムグラ花粉過敏に対し、臨床特異性皮膚試験診断を行い、有効性と安全性を評価した。方法は以下の通りであった。２０１５年８月２４日から２０１６年９月２１日までの間に、北京協和医院アレルギー科の外来診療で、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎、過敏性喘息、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎等の過敏性疾患にかかった患者１０２６例を選択した。被験者に対し、カナムグラ花粉アレルゲン皮膚プリックテスト（Ｓｋｉｎ ｐｒｉｃｋ ｔｅｓｔ，ＳＰＴ）を行い、原液を用い、平均膨疹径（Ｍｅａｎ ｗｈｅａｌ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ＭＷＤ）を判定標準とし、花粉ｓＩｇＥを標準とし、ＲＯＣ分析を行い、異なる診断分割点下で、カナムグラ花粉アレルゲン浸出液を用い、診断カナムグラ花粉過敏の正確性を分析した。それとともに、不良事件を記録し、安全性を評価した。結果（Ｒｅｓｕｌｔｓ）には、外来診療患者１０２６例（４～７０歳）を含み、脱落症例がなく、除去率が２２．１％であった。安全セット（Ｓａｆｅｔｙ Ｓｅｔ，ＳＳ）は１０２６例であり、フル・アナリシス・セット（Ｆｕｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｔ，ＦＡＳ）は９９０例であり、パー・プロトコル・セット（Ｐｅｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｓｅｔ，ＰＰＳ）は７９９例であった。年齢は、最小が６歳、最大が６７歳であった。ＰＰＳのＲＯＣ曲線を分析し、カナムグラ花粉ＳＰＴの最適な診断閾値がＭＷＤ ６．７５ｍｍであり、特異度が９５％ときの診断閾値はＭＷＤ ８．２５ｍｍであることを推定した。それぞれＭＷＤ ３ｍｍ（国際通用閾値）、６．７５ｍｍ、８．２５ｍｍを診断閾値とした。本発明のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液をカナムグラ花粉過敏の診断に用いる感度を順次に低下し、それぞれ０．９３６６（９５％ＣＩ：０．９１５９ ～ ０．９５７２）、０．５４８５（９５％ＣＩ：０．５０６４ ～ ０．５９０６）、０．４２１６（９５％ＣＩ：０．３７９８ ～ ０．４６３４）であり、特異度は順次に上昇し、それぞれ０．０９１３（９５％ＣＩ：０．０５６５ ～ ０．１２６１）、０．８５１７（９５％ＣＩ：０．８０８８ ～ ０．８９４７）、０．９６９６（９５％ＣＩ：０．９４８８ ～ ０．９９０３）であった。１０２６例患者では、７例は８回の不良事件が行われ、不良事件発生率が０．６８％（７／１０２６）であり、主な症状は、鼻水、くしゃみ、鼻のかゆみ、呼吸困難、目のかゆみ、胸部圧迫感、局部皮膚プリック反応などであった。深刻な不良事件はなかった。結論は、本発明のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液はカナムグラ花粉過敏の診断に用い、診断価値が高く、安全性がよく、カナムグラ花粉アレルゲン特異性体内診断の臨床検査方法として利用されることができる。
実施例９ 評価応用２
本発明によるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液により、カナムグラ花粉過敏患者全血に対し、好塩基球活性化試験を行い、臨床特異性過敏体外診断することができる。この検出方法は、ＩｇＥまたは非ＩｇＥにより誘発された過敏反応にも適用でき、一部のｓＩｇＥ体外診断には偽陰性、偽陽性が存在する患者の確診及び一部の過敏性ショック患者が皮膚試験診断に不適合の状況にも利用されることができる。
本発明によるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液により、カナムグラ花粉過敏に対し、臨床特異性皮膚試験診断を行い、有効性と安全性を評価した。方法は以下の通りであった。２０１５年８月２４日から２０１６年９月２１日までの間に、北京協和医院アレルギー科の外来診療で、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎、過敏性喘息、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎等の過敏性疾患にかかった患者１０２６例を選択した。被験者に対し、カナムグラ花粉アレルゲン皮膚プリックテスト（Ｓｋｉｎ ｐｒｉｃｋ ｔｅｓｔ，ＳＰＴ）を行い、原液を用い、平均膨疹径（Ｍｅａｎ ｗｈｅａｌ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ＭＷＤ）を判定標準とし、花粉ｓＩｇＥを標準とし、ＲＯＣ分析を行い、異なる診断分割点下で、カナムグラ花粉アレルゲン浸出液を用い、診断カナムグラ花粉過敏の正確性を分析した。それとともに、不良事件を記録し、安全性を評価した。結果（Ｒｅｓｕｌｔｓ）には、外来診療患者１０２６例（４～７０歳）を含み、脱落症例がなく、除去率が２２．１％であった。安全セット（Ｓａｆｅｔｙ Ｓｅｔ，ＳＳ）は１０２６例であり、フル・アナリシス・セット（Ｆｕｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｔ，ＦＡＳ）は９９０例であり、パー・プロトコル・セット（Ｐｅｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｓｅｔ，ＰＰＳ）は７９９例であった。年齢は、最小が６歳、最大が６７歳であった。ＰＰＳのＲＯＣ曲線を分析し、カナムグラ花粉ＳＰＴの最適な診断閾値がＭＷＤ ６．７５ｍｍであり、特異度が９５％ときの診断閾値はＭＷＤ ８．２５ｍｍであることを推定した。それぞれＭＷＤ ３ｍｍ（国際通用閾値）、６．７５ｍｍ、８．２５ｍｍを診断閾値とした。本発明のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液をカナムグラ花粉過敏の診断に用いる感度を順次に低下し、それぞれ０．９３６６（９５％ＣＩ：０．９１５９ ～ ０．９５７２）、０．５４８５（９５％ＣＩ：０．５０６４ ～ ０．５９０６）、０．４２１６（９５％ＣＩ：０．３７９８ ～ ０．４６３４）であり、特異度は順次に上昇し、それぞれ０．０９１３（９５％ＣＩ：０．０５６５ ～ ０．１２６１）、０．８５１７（９５％ＣＩ：０．８０８８ ～ ０．８９４７）、０．９６９６（９５％ＣＩ：０．９４８８ ～ ０．９９０３）であった。１０２６例患者では、７例は８回の不良事件が行われ、不良事件発生率が０．６８％（７／１０２６）であり、主な症状は、鼻水、くしゃみ、鼻のかゆみ、呼吸困難、目のかゆみ、胸部圧迫感、局部皮膚プリック反応などであった。深刻な不良事件はなかった。結論は、本発明のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液はカナムグラ花粉過敏の診断に用い、診断価値が高く、安全性がよく、カナムグラ花粉アレルゲン特異性体内診断の臨床検査方法として利用されることができる。
実施例９ 評価応用２
本発明によるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液により、カナムグラ花粉過敏患者全血に対し、好塩基球活性化試験を行い、臨床特異性過敏体外診断することができる。この検出方法は、ＩｇＥまたは非ＩｇＥにより誘発された過敏反応にも適用でき、一部のｓＩｇＥ体外診断には偽陰性、偽陽性が存在する患者の確診及び一部の過敏性ショック患者が皮膚試験診断に不適合の状況にも利用されることができる。
【0025】
試験原理は、アレルゲンと患者全血細胞反応が人体内アレルギープロセスを模擬でき、即ち、特異性ＩｇＥ抗体と対応するアレルゲンとは細胞表面に架橋結合され、細胞内信号カスケード接続を活性化し、好塩基球（ＣＣＲ３が持続して好塩基球に表現され、その特異性表記であった）の活性化脱粒子をさせた。この脱粒子のプロセスにおいて、細胞内複合物は膜貫通蛋白ＣＤ６３（ｇｐ５３）に影響を与え、細胞表面に表現させ、細胞外基質に露出させた。このため、フローサイトメトリー原理（抗人走化因子受容体ＣＣＲ３―フィコエリトリン（ａｎｔｉ―ＣＣＲ３―ＰＥ）により好塩基球に対して表記を行い、抗人ＣＤ６３モノクローン抗体―フルオレセインイソチオシアナート（ａｎｔｉ―ＣＤ６３―ＦＩＴＣ）を用い、活性化状態の好塩基球に表記し、非特異性細胞活性化剤ｆＭＬＰを陽性品質管理とする）により、好塩基球脱粒子のパーセント変化により、被験者が特定アレルゲンに対して過敏になるか否かを判定した。方法は、健康被験者、カナムグラ過敏患者を選択し、そのＥＤＴＡ抗凝全血サンプルを取り、刺激緩衝液（陰性対照）、カナムグラアレルゲン浸出液（１：１０３～１０１０希釈比例を最適化させ、本実施例において、１：１０８にした）、ｆＭＬＰ刺激液（陽性品質管理）を好塩基球の賦活剤として、全血に入れ、そして、ａｎｔｉ―ＣＤ６３―ＦＩＴＣ、ａｎｔｉ―ＣＣＲ３―ＰＥを入れて染色し、４８ｈ内に、フローサイトメーターで検出を行った。結果は、図１３を参照する。健康被験者は陰性対照、カナムグラアレルゲン浸出液、陽性対照を好塩基球活性化物とするとき、その好塩基球活性化率はそれぞれ＜１５％、＜１５％、≧１５％となり、カナムグラ花粉過敏患者は陰性対照、カナムグラアレルゲン浸出液、陽性対照を好塩基球活性化物とするとき、その好塩基球活性化率はそれぞれ＜１５％、≧１５％、≧１５％となる。結論は、このカナムグラアレルゲン浸出液は、活性化物として好塩基球活性化試験に応用でき、その判断標準により臨床診断を効果的に行うことができる。
【0026】
上記は、本発明の好ましい実施形態にすぎない。本発明の技術原理から逸脱しない限り、当業者にとって、いくつかの改善および修正を行うことができる。これらの改善および修正は、本発明の保護範囲に含まれるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】