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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-01
(45)【発行日】2023-12-11
(54)【発明の名称】熱安定性が向上したトランスグルタミナーゼ変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20231204BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20231204BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231204BHJP
C12N 1/11 20060101ALI20231204BHJP
C12N 1/13 20060101ALI20231204BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231204BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231204BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231204BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231204BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20231204BHJP
A23L 5/40 20160101ALI20231204BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N9/10 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/11
C12N1/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A23L33/135
A23L5/40
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021576243
(86)(22)【出願日】2020-12-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-24
(86)【国際出願番号】 CN2020142185
(87)【国際公開番号】W WO2022141411
(87)【国際公開日】2022-07-07
【審査請求日】2022-01-21
(31)【優先権主張番号】202011586610.6
(32)【優先日】2020-12-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521554985
【氏名又は名称】泰興市東聖生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＩＸＩＮＧ ＤＯＮＧＳＨＥＮＧ ＢＩＯ－ＴＥＣＨ ＣＯ．，ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】１ Ｌｉａｎｔｏｎｇ Ｓｔ， Ｈｕａｎｇｑｉａｏ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｔａｉｘｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ
(73)【特許権者】
【識別番号】514262886
【氏名又は名称】江南大学
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １８００ Ｌｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｉｎ Ｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】劉松
(72)【発明者】
【氏名】王興隆
(72)【発明者】
【氏名】杜建輝
(72)【発明者】
【氏名】銭源
(72)【発明者】
【氏名】周景文
(72)【発明者】
【氏名】陳堅
(72)【発明者】
【氏名】堵国成
【審査官】菅原 洋平
(56)【参考文献】
【文献】特開２００２－２５３２７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Applied Microbiology and Biotechnology，2008年，81，523-532
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ９／００－９／９９
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ａ２３Ｌ ３３／１３５
Ａ２３Ｌ ５／４０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
トランスグルタミナーゼ変異体であって、配列番号１に示されたアミノ酸配列を含み、配列番号１の１～４５位は、配列番号３に示される配列によって置換され、さらに、配列番号１の２３４位及び３３２位は、それぞれヒスチジン及びプロリンによって置換されている、トランスグルタミナーゼ変異体。
【請求項2】
請求項１に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項3】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクター、又は宿主細胞。
【請求項4】
（ａ）請求項１に記載の変異体を発現することに適合する条件で請求項３に記載の宿主細胞を培養し、（ｂ）前記変異体を回収することを含む、請求項１に記載の変異体を生成する方法。
【請求項5】
請求項１に記載のトランスグルタミナーゼ変異体の成熟酵素を含む組成物であって、前記成熟酵素は、２３４位及び３３２位がそれぞれヒスチジン及びプロリンによって置換されている配列番号１の４６～３７６位からなるポリペプチドである、組成物。
【請求項6】
生肉加工、ソーセージ類製品、魚肉団子、挽肉加工、豆製品及び／又は乳製品において食品の外観、口当たり及び／又は安定性を変える方法であって、上記食品の加工過程において請求項１に記載のトランスグルタミナーゼ変異体又はその成熟酵素を添加することを含み、前記成熟酵素は、２３４位及び３３２位がそれぞれヒスチジン及びプロリンによって置換されている配列番号１の４６～３７６位からなるポリペプチドである、ことを特徴とする方法。
【請求項7】
生肉加工、ソーセージ類製品、魚肉団子、挽肉加工、豆製品及び／又は乳製品において食品の外観、口当たり及び／又は安定性を変える方法であって、上記食品の加工過程において請求項５に記載の組成物を添加して処理を行うことを含むことを特徴とする方法。
【請求項8】
請求項１に記載のトランスグルタミナーゼ変異体又は請求項５に記載の組成物の、食品処理、加工及び転化における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、熱安定性が向上したトランスグルタミナーゼ変異体に関し、生物分野及び食品分野に属する。
【背景技術】
【0002】
ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｅｓｉｓ ＡＡＴ６５８１７）由来のトランスグルタミナーゼ（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ、ＴＧａｓｅ、ＥＣ ２．３．２．１３）は、中国及び国際市場で広く販売されている主流となっている酵素製剤である。それは、一般的に用いられるトランスアミナーゼであり、タンパク質及び小分子中のグルタミン残基のγカルボキシアミド基とアシル受容体中のアミノ基との反応を触媒することにより両者の共有結合の形成を促進する。ＴＧａｓｅは、食品加工分野における応用が非常に広く、肉類、豆製品及び乳製品の加工にＴＧａｓｅを添加することにより食品の外観、口当たり及び安定性を変えることがある。
【0003】
ＴＧａｓｅに対する研究及び応用に伴い、その熱安定性が低いことはその実際の応用を制限する１つの主な問題であることが発見する。ＴＧａｓｅは、食品加工過程、例えば、挽肉、ミートボール、乳製品及び豆製品等を加工するために用いられ、ＴＧａｓｅ触媒架橋を達成するために高温処理が必要であり、ＴＧａｓｅの熱安定性が低く、通常の操作時に温度を４０℃に制御する必要があり、且つ損耗が早いため、必要とされる添加量が多い（特許公開番号：ＣＮ１０９９０７１１１Ａ、ＣＮ２０１８１０４８０３３５．６、ＣＮ１１０７７１８１１Ａ、ＣＮ１０６９０１２０５Ｂ、ＣＮ２０１８１１５９９４５１．６を参照）。
【0004】
熱安定性がとても重要であるため、現在、酵素熱安定性を改造する方法は、合理的設計及び指向性進化を主とする。合理的設計とは、機械シミュレーションの手段により、酵素構造における不安定な領域を決定し、且つアミノ酸突然変異を導入して酵素の安定性を向上させることである。指向性進化は、宿主細胞に基づく指向性進化及び酵素遺伝子に基づく指向性進化を含み、前者は、物理的、化学的等の手段により宿主細胞に対して変異誘発を行うことにより、必要な酵素の形質を得るが、後者は、主に酵素遺伝子に対してランダム突然変異、相同体の遺伝子組換えを行うことにより指向性進化を実現する。現在、ＴＧａｓｅに対して熱安定性を向上させる関連報告は、（１）ランダム突然変異により高安定型ＴＧａｓｅ突然変異点を得て（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２００８．０６．００５）、（２）、（１）で得られた単一点突然変異に対して、部位飽和突然変異、及びＤＮＡ組換えを行うことにより、安定性の高いＴＧａｓｅ組み合わせ変異体を得て（ＤＯＩ １０．１００７／ｓ ００７２６－０１１－１０１５－ｙ）、（３）、（１）及び（２）でスクリーニングされた突然変異点に基づいてさらなる突然変異を行う（ＤＯＩ：１０．１０８０／０９１６８４５１．２０１７．１４０３８８１）。しかしながら、現在報告された高安定型ＴＧａｓｅ突然変異体について、水浴条件下で６０℃でインキュベートしたものは、金属浴条件下で６０℃でインキュベートしたものよりも安定性が低く、改良の余地が大きい。挽肉、トウモロコシ粉、豆製品の加工等のような実際の応用過程において、ＴＧａｓｅを混入した後に、処理温度は、一般的に４０－７０℃であるが、ＴＧａｓｅは、６０℃の条件で安定性が極めて低いため、添加量が高いが利用率が低いという問題をもたらす。したがって、設計改造により高安定型ＴＧａｓｅを得ることは、工業応用において特に重要である。
【発明の概要】
【0005】
上記問題を解決するために、本発明は、熱安定性が改善されたトランスグルタミナーゼ変異体を提供する。
【0006】
本発明のトランスグルタミナーゼ変異体は、配列番号１に示されたポリペプチドの１－４５位に対応する置換を含み、配列番号３に置換され、さらに、配列番号１に示されたポリペプチドの２３４位及び３３２位に対応する置換（それぞれ配列番号１のトランスグルタミナーゼの成熟領域の１８９位、２８７位に対応する）を含み、
ｉ）前記トランスグルタミナーゼ変異体の成熟領域は、配列番号１に示された４６－３７６位のポリペプチドの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドであり、及び／又は、
ｉｉ）前記トランスグルタミナーゼ変異体の成熟領域は、配列番号２に示されたヌクレオチドの１３９位－１１２８位の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドであり、
前記トランスグルタミナーゼ変異体は中性プロテアーゼで処理された後、活性を有する酵素が得られる。
ｉ）前記トランスグルタミナーゼ変異体の成熟領域は、配列番号１に示された４６－３７６位のポリペプチドの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドであり、及び／又は、
ｉｉ）前記トランスグルタミナーゼ変異体の成熟領域は、配列番号２に示されたヌクレオチドの１３９位－１１２８位の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドであり、
前記トランスグルタミナーゼ変異体は中性プロテアーゼで処理された後、活性を有する酵素が得られる。
【0007】
一実施形態において、前記２３４位の置換は、配列番号１配列のトランスグルタミナーゼの成熟領域の１８９位に対応し、ヒスチジン（Ｈ）に置換され、３３２位の置換は、配列番号１配列のトランスグルタミナーゼの成熟領域の２８７位に対応し、プロリン（Ｐ）に置換される。
【0008】
一実施形態では、前記トランスグルタミナーゼ変異体は、Ｄ１８９Ｈ／Ａ２８７Ｐと名付けられる。
【0009】
本発明は、さらに、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、ならびに前記変異体又はその成熟酵素を生成する方法に関する。また、本発明は、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体又はその成熟酵素を含む組成物に関する。
【0010】
本発明は、さらに、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体又はその成熟酵素を生成する方法に関し、これらの方法は、
ａ）前記変異体を発現することに適合する条件で本発明の宿主細胞を培養することと、
ｂ）前記変異体を必要に応じて回収することとを含む。
ａ）前記変異体を発現することに適合する条件で本発明の宿主細胞を培養することと、
ｂ）前記変異体を必要に応じて回収することとを含む。
【0011】
本発明は、さらに、生肉加工、ソーセージ類製品、魚肉団子、挽肉加工、豆製品及び／又は乳製品において食品の外観、口当たり及び／又は安定性を変える方法に関し、前記方法は、上記食品加工過程において本発明に記載されたトランスグルタミナーゼ変異体又は本発明に記載された前記組成物を添加して処理を行うことを含む。
【0012】
本発明は、さらに、前記トランスグルタミナーゼ変異体又はその成熟酵素又は本発明に記載された組成物の食品処理、加工及び転化での使用に関する。
【0013】
一実施形態において、食品の品質、稠度、弾性、水分又は粘度を保持するか又は改善するために用いられる。
【0014】
一実施形態において、前記食品は、チーズ、ヨーグルト、アイスクリーム、マヨネーズ及び肉類から選択される。
【0015】
一実施形態において、ここで前記食品は、魚類である。
【0016】
一実施形態では、異なる密度のゼラチンを形成し低脂肪の予備調理食品を製造するために用いられる。
【0017】
定義又は用語：
トランスグルタミナーゼ：用語「トランスグルタミナーゼ（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ、ＴＧａｓｅ）」、「Ｒ－グルタミニル－ペプチドアミダーゼ－γ－グルタミン－トランスフェラーゼ」、「グルタミルトランスフェラーゼ」は酵素の命名法により定義されたＥＣ ２．３．２．１３類における酵素である。本発明の目的を達成するために、実施例に記載された手順に基づいてトランスグルタミナーゼの活性を決定する。一態様では、本発明の変異体は、配列番号．１のポリペプチドのトランスグルタミナーゼの活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％を有する。
トランスグルタミナーゼ：用語「トランスグルタミナーゼ（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ、ＴＧａｓｅ）」、「Ｒ－グルタミニル－ペプチドアミダーゼ－γ－グルタミン－トランスフェラーゼ」、「グルタミルトランスフェラーゼ」は酵素の命名法により定義されたＥＣ ２．３．２．１３類における酵素である。本発明の目的を達成するために、実施例に記載された手順に基づいてトランスグルタミナーゼの活性を決定する。一態様では、本発明の変異体は、配列番号．１のポリペプチドのトランスグルタミナーゼの活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％を有する。
【0018】
コード配列：用語「コード配列」とは、ポリヌクレオチドを意味し、前記ポリヌクレオチドはトランスグルタミナーゼ変異体のアミノ酸配列を直接規定する。コード配列の境界は、一般的に、オープンリーディングフレームにより決定され、前記オープンリーディングフレームは開始コドン（例えば、ＡＴＧ、ＧＴＧ又はＴＴＧ）で始まり、且つ終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ）で終わる。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はそれらの組み合わせであってもよい。
【0019】
制御配列：用語「制御配列」とは、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドの発現のために必要とされる核酸配列を意味する。各制御配列は、前記トランスグルタミナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドに対して、天然（即ち、同じ遺伝子に由来する）又は外因性の（即ち、異なる遺伝子に由来する）ものであってもよく、又は互いに対して天然又は外因性のものであってもよい。このような制御配列は、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを含むが、これらに限定されない。制御配列は少なくともプロモータ、及び転写及び翻訳終結シグナルを含む。制御配列と本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域の連結を促進する特異的制限部位を導入するために、制御配列にはリンカーが提供されてもよい。
【0020】
発現：用語「発現」は、トランスグルタミナーゼ変異体の生成に関するいかなるステップを含み、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むが、それらに限定されない。
【0021】
発現ベクター：用語「発現ベクター」とは直鎖又は環状ＤＮＡ分子を意味し、前記分子は、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、且つその発現に用いられる制御配列に操作可能に連結される。
【0022】
断片：用語「断片」は、ポリペプチドのアミノ基及び／又はカルボキシル基末端に１つ又は複数（例えば、いくつか）のアミノ酸を欠失するポリペプチドを意味し、ここで前記断片はトランスグルタミナーゼ活性を有する。一態様では、断片は、配列番号１のアミノ酸４６－３７６（即ちプロ酵素領域配列の長さを含まない）の数の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を含むが、１００％未満である。
【0023】
宿主細胞：用語「宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターで形質転換、トランスフェクション、形質導入などをしやすい任意の細胞タイプを意味する。用語「宿主細胞」は、複製期間に生じる変異のため、親細胞と全く同一ではない任意の親細胞の子孫を包含するものとする。
【0024】
改善された熱安定性：用語「改善された熱安定性」とは、親トランスグルタミナーゼに対して改善されたトランスグルタミナーゼ変異体の特徴を意味する。
【0025】
単離：用語「単離された」とは、自然界に存在しない形態又は環境中の物質を意味する。単離された物質の非限定的な実例は、（１）任意の非天然に存在する物質と、（２）自然界に関連する１種又は多種又は全部の天然に存在する成分から少なくとも部分的に除去された任意の物質であって、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド又は補因子を含むがこれらに限定されない物質、（３）自然界に発見されたような物質に対して人工的に修飾された任意の物質、又は（４）その天然に関連する他の成分に対して前記物質の量を増加させることにより修飾された任意の物質（例えば、前記物質をコードする遺伝子の複数のコピーか、前記物質をコードする遺伝子に天然に関連するプロモータよりも強いプロモータの使用）と、を含む。単離された物質は、発酵液サンプルに存在してもよい。
【0026】
成熟ポリペプチド：用語「成熟ポリペプチド」とは、翻訳及び、Ｎ－末端の加工、Ｃ－末端切断、グリコシル化作用、リン酸化作用等のような任意の翻訳後の修飾の後にその最終形態にあるポリペプチドを意味する。一態様では、本特許において前記成熟ポリペプチドは、即ちトランスグルタミナーゼの成熟酵素であり、配列番号１のアミノ酸４６－３７６位である。当業者の周知のように、宿主細胞は、同じポリヌクレオチドで発現された２種以上の異なる成熟度のポリペプチド（即ち、異なるＣ－末端及び／又はＮ－末端アミノ酸を有する）の混合物を生成することができる。
【0027】
成熟ポリペプチドコード配列：用語「成熟ポリペプチドコード配列」とは、トランスグルタミナーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一態様では、前記成熟ポリペプチド、即ち成熟酵素のコード配列は、配列番号２のヌクレオチド１３９－１１２８である（即ち、プロ酵素領域に対応するコドン配列を含まない）。
【0028】
突然変異体：用語「突然変異体」とは、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【0029】
核酸構築物：用語「核酸構築物」とは、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を意味し、前記核酸分子は、天然に存在する遺伝子から単離され、又は本来自然界に存在しない形で核酸を含有するように修飾されたセグメントであるか、又は合成されたものであり、前記核酸分子は、１つ又は複数の制御配列を含む。
【0030】
親又は親トランスグルタミナーゼ：用語「親」又は「親トランスグルタミナーゼ」とは、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体を発生させるように変えるトランスグルタミナーゼを意味する。本特許の前記親は、即ち、配列番号１に対応するアミノ酸配列である。前記親トランスグルタミナーゼは、天然に存在する（野生型）ポリペプチド又はその変異体又は断片であってもよく、又は合成により生成されたものであってもよい。
【0031】
配列同一性：２つのアミノ酸配列の間又は２つのヌクレオチド配列の間の関連度は、パラメータ「配列同一性」により説明される。
【0032】
安定性：本発明のトランスグルタミナーゼ変異体の熱安定性は、異なる試験条件期間又はその後に暴露された後、前記トランスグルタミナーゼの残留活性又は残留性能として示すことができる。親トランスグルタミナーゼ（例えば、配列番号１に示すような親トランスグルタミナーゼ）の既知の活性又は性能に対して示される。
【0033】
変異体：用語「変異体」とは、トランスグルタミナーゼ活性を有し、１つ又は複数（例えばいくつか）の部位に変化した（即ち置換され、挿入され、及び／又は欠失した）ポリペプチドを意味する。置換とは、異なるアミノ酸で、ある部位に占めているアミノ酸を代替することを意味し、欠失とは、ある部位に占めているアミノ酸を除去することを意味し、挿入とは、隣接し、且つある部位に占めているアミノ酸の後ろにアミノ酸を添加することを意味する。本発明の変異体は、配列番号１のポリペプチドアミノ酸配列を有し、且つ１－４５位に置換が発生し、置換されたアミノ酸配列は配列番号３で示される配列であり、その上に、２３４及び３３２位（即ち配列番号１に示されるトランスグルタミナーゼ成熟酵素の１８９及び２８７位）に置換が同時に発生し、置換されたアミノ酸は、それぞれヒスチジン及びプロリンである。本発明の変異体はトランスグルタミナーゼ活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％を有する。
【0034】
野生型トランスグルタミナーゼ：用語「野生型」トランスグルタミナーゼとは、自然界に天然に存在している微生物（例えば、細菌、酵母、糸状菌）で発現されるトランスグルタミナーゼを意味する。
【0035】
本発明の変異体に対する説明において、参考のために、以下で記載される命名法を改編した。承認されたＩＵＰＡＣの一文字又は三文字のアミノ酸の略語を採用する。
【0036】
置換：アミノ酸置換について、元のアミノ酸、部位、置換されたアミノ酸という命名法を使用する。したがって、部位２２６位でのスレオニンがアラニンで置換されることを「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表す。複数の突然変異は、記号（「－」）により分けられ、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ－Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ－Ｓ４１１Ｆ」は、２０５位及び４１１位でのグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）がそれぞれアルギニン（Ｒ）及びフェニルアラニン（Ｆ）で置換されることを代表する。
【発明の効果】
【0037】
本発明に係るトランスグルタミナーゼ変異体は、親に対してプロ酵素の置換を行い、即ち示された配列番号１の１－４５位に置換が発生し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｎｉｆｅｒｕｓトランスグルタミナーゼのプロ酵素領域配列（例えば配列番号３に示すとおりである）に置換され、且つ示された配列番号１のトランスグルタミナーゼの２３４及び３３２位（即ち成熟領域部分の１８９位及び２８７位）に突然変異が発生した後に得られる。変異体の成熟酵素の６０℃半減期は、３５．５７分であり、親成熟酵素の１１．３１分よりも２１４．５％向上した。
【0038】
本発明のトランスグルタミナーゼ変異体は、顕著に改善された熱安定性を有し、食品の処理、加工及び転化等の面で応用することができ、食品の品質、稠度、弾性、水分又は粘度を保持するか又は改善するために用いられる。熱安定性が改善されたトランスグルタミナーゼ変異体は、例えば肉代用品の挽肉加工及びミートボール加工のようなより過酷な工業環境において安定して応用することに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】親及び変異体成熟酵素の初期酵素活性及び６０℃半減期である。
【図2】親と変異体が大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１で発現された後に、全細胞はＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動により分析されたものであり、Ｍは、タンパク質量マーカーｍａｒｋｅｒであり、単位は、ｋＤａであり、１は、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１で親を発現させた後の全細胞電気泳動分析であり、２は大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１で変異体を発現させた後の全細胞電気泳動分析である。
【図3】親と変異体成熟酵素は、精製して得られたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であり、Ｍはタンパク質量マーカーｍａｒｋｅｒであり、単位はＫｄａであり、１は親成熟酵素であり、２は変異体成熟酵素である。
【発明を実施するための形態】
【0040】
本発明は、親トランスグルタミナーゼに比べて改善されたトランスグルタミナーゼ変異体に関する。より具体的には、本発明は、親トランスグルタミナーゼ（特に配列番号１に示されたようなトランスグルタミナーゼ）に比べて、改善された熱安定性を有するトランスグルタミナーゼ変異体に関する。
【0041】
本発明によれば以下の方法でトランスグルタミナーゼの酵素活性、熱安定性、動力学的パラメータを測定する。
【0042】
酵素活性試験
酵素活性試験基質溶液Ａ：２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭのヒドロキシルアミン、１０ｍＭの還元型グルタチオン、３０ｍＭのＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシンであり、ｐＨを６．０に調節する。
酵素活性試験基質溶液Ａ：２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭのヒドロキシルアミン、１０ｍＭの還元型グルタチオン、３０ｍＭのＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシンであり、ｐＨを６．０に調節する。
【0043】
酵素活性試験停止溶液Ｂ：３ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ、５％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌに溶解する）及び１２％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を等体積混合して溶液の配合を完了する。
【0044】
酵素活性の定義：一単位の酵素活性は、毎分に１μｍｏｌの基質を触媒して生成物を形成する酵素量として定義された。
【0045】
酵素活性試験の検量線の作成：６４８ｍｇの標準品Ｌ－グルタミン酸－γ－モノヒドロキサム酸に１００ｍｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ２００ｍＭを入れ、溶液をｐＨ６．０に調節し、且つＴｒｉｓ－ＨＣｌ２００ｍＭ、ｐＨ６．０溶液に対して２倍希釈法で５つの段階に順に希釈し、該溶液と基質溶液Ａとをそれぞれ３７℃で５分保温し、その後に６０μＬの標準品溶液を１５０μＬの基質溶液Ａに加え、３７℃で１０分水浴した後に６０μＬの停止溶液Ｂを添加し、１００００ｒｐｍで１分遠心分離した後に２００μＬの上澄み液を取って５２５ｎｍでの吸光値を測定する。吸光値対ヒドロキサム酸の量で直線を作り、直線の傾きで変換係数Ｋを得て、サンプルの酵素活性の測定において吸光度を得た後にＫでヒドロキサム酸の生成量を算出することができる。
【0046】
測定方法：タンパク質サンプルと１５０μＬの基質溶液Ａに対して３７℃で５分インキュベートし、その後に６０μＬのタンパク質サンプルに１５０μＬの基質溶液Ａを添加し、３７℃で１０分水浴した後に６０μＬの試験停止溶液Ｂを添加する。反応液を１００００ｒｐｍで１分遠心分離し、２００μＬの上澄み液を取って波長が５２５ｎｍの吸光値を測定する。ブランク対照は６０μＬの試験停止溶液Ｂに６０μＬのタンパク質サンプルを添加し、さらに１５０μＬの基質溶液Ａを添加して１００００ｒｐｍで１分遠心分離した後に２００μＬの上澄み液を取って５２５ｎｍでの吸光値を測定する。実験群で得られた吸光値から対照群で取得された吸光値を減算し、且つ酵素活性検量線に代入すれば、タンパク質が添加された質量に対応する酵素活性を得て、該酵素活性でタンパク質濃度を割ってタンパク質酵素比活性Ｕ／ｍｇを得る。
【0047】
熱安定性試験
６０℃の水浴条件での半減期を測定し、具体的な方法について、まず親トランスグルタミナーゼ成熟酵素及び変異体成熟酵素タンパク質溶液を０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、一定量の該サンプルを６０℃の水浴で連続的に加熱インキュベートし、０～１０分内に毎分にサンプリングし、１０～４０分になると、２分ごとにサンプリングし、取り出されたサンプルは、いずれも、直ちに２０℃の条件で氷浴される。取ったサンプルに対してそれぞれ酵素活性を測定することにより、経時変化の残留酵素活性比を取得し、Ｏｒｉｇｉｎａｌ２０１８におけるＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ－ＥｘｐＤｅｃ１によりそれに対して非線形フィッティングを行い、フィッティング公式を取得した後に算出された酵素活性が初期の５０％まで低下することに対応する時間を半減期とする。
６０℃の水浴条件での半減期を測定し、具体的な方法について、まず親トランスグルタミナーゼ成熟酵素及び変異体成熟酵素タンパク質溶液を０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、一定量の該サンプルを６０℃の水浴で連続的に加熱インキュベートし、０～１０分内に毎分にサンプリングし、１０～４０分になると、２分ごとにサンプリングし、取り出されたサンプルは、いずれも、直ちに２０℃の条件で氷浴される。取ったサンプルに対してそれぞれ酵素活性を測定することにより、経時変化の残留酵素活性比を取得し、Ｏｒｉｇｉｎａｌ２０１８におけるＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ－ＥｘｐＤｅｃ１によりそれに対して非線形フィッティングを行い、フィッティング公式を取得した後に算出された酵素活性が初期の５０％まで低下することに対応する時間を半減期とする。
【0048】
示差走査熱量測定
親と変異体の純粋なタンパク質溶液（溶媒がＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０である）を取り、濃度が１．５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、示差走査熱量測定で溶解温度試験を行う。タンパク質の所在する溶媒を内部参照とし、走査温度は４０～９０℃で、昇温速度は１℃／分であり、圧力は３ａｔｍであり、最終的にタンパク質の溶解温度を取得する。
親と変異体の純粋なタンパク質溶液（溶媒がＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０である）を取り、濃度が１．５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、示差走査熱量測定で溶解温度試験を行う。タンパク質の所在する溶媒を内部参照とし、走査温度は４０～９０℃で、昇温速度は１℃／分であり、圧力は３ａｔｍであり、最終的にタンパク質の溶解温度を取得する。
【0049】
動力学的パラメータ測定
ミカエリス定数（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ ｃｏｎｓｔａｎｔ）ＫＭの試験方法について、親及び変異体のタンパク質溶液を０．０５ｍｇ／ｍｌに希釈し、試験方法は酵素活性測定法を参照する。基質溶液ＡをＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシンの含有量に応じて１０種類に配置する必要があり、他の成分は不変であり、Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシンの含有量は、それぞれ３ｍＭ、６ｍＭ、９ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭ、１８ｍＭ、２１ｍＭ、２４ｍＭ、２７ｍＭ及び３０ｍＭである。酵素活性試験方法で、親及び変異体の異なるＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシン含有量に対する基質溶液Ａ中の基質変換量を測定し、即ち１０分の反応時間内に基質であるＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシンを触媒して生成物の量に変換する。以上で取得された変換量数値に基づいて、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ２０１８により取得された数値に非線形フィッティングを行い、Ｇｒｏｗｔｈ／Ｓｉｇｍｏｄｉａｌ－Ｈｉｌｌを用いてフィッティングを行い、且つＫＭ及びＶｍａｘ値を取得し、酵素濃度換算によりｋｃａｔ値を取得する。これを基礎として、ＫＭ／ｋｃａｔで酵素触媒効率を得る。
ミカエリス定数（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ ｃｏｎｓｔａｎｔ）ＫＭの試験方法について、親及び変異体のタンパク質溶液を０．０５ｍｇ／ｍｌに希釈し、試験方法は酵素活性測定法を参照する。基質溶液ＡをＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシンの含有量に応じて１０種類に配置する必要があり、他の成分は不変であり、Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシンの含有量は、それぞれ３ｍＭ、６ｍＭ、９ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭ、１８ｍＭ、２１ｍＭ、２４ｍＭ、２７ｍＭ及び３０ｍＭである。酵素活性試験方法で、親及び変異体の異なるＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシン含有量に対する基質溶液Ａ中の基質変換量を測定し、即ち１０分の反応時間内に基質であるＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシンを触媒して生成物の量に変換する。以上で取得された変換量数値に基づいて、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ２０１８により取得された数値に非線形フィッティングを行い、Ｇｒｏｗｔｈ／Ｓｉｇｍｏｄｉａｌ－Ｈｉｌｌを用いてフィッティングを行い、且つＫＭ及びＶｍａｘ値を取得し、酵素濃度換算によりｋｃａｔ値を取得する。これを基礎として、ＫＭ／ｋｃａｔで酵素触媒効率を得る。
【0050】
本発明のトランスグルタミナーゼは、配列番号１に示されたポリペプチドの１～４５位に対応する置換（置換は配列番号３）を含み、及び配列番号１に示されたポリペプチドの２３４位、３３２位に対応する置換（それぞれ配列番号１のトランスグルタミナーゼの成熟領域の１８９位、２８７位に対応する）を含み、
ｉ）前記トランスグルタミナーゼの成熟領域は配列番号１に示された４６～３７６位のポリペプチドの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドであり、及び／又は
ｉｉ）前記トランスグルタミナーゼの成熟領域は、配列番号２に示されたヌクレオチドの１３９位～１１２８位の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドである。
ｉ）前記トランスグルタミナーゼの成熟領域は配列番号１に示された４６～３７６位のポリペプチドの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドであり、及び／又は
ｉｉ）前記トランスグルタミナーゼの成熟領域は、配列番号２に示されたヌクレオチドの１３９位～１１２８位の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドである。
【0051】
前記１～４５位に置換が発生し、置換後のアミノ酸配列が配列番号３である。
【0052】
一実施形態において、前記トランスグルタミナーゼは、２３４位（即ち配列番号１配列のトランスグルタミナーゼ成熟領域の１８９位）で、ヒスチジン（Ｈ）に置換された。
【0053】
一実施例において、前記トランスグルタミナーゼは、３３２位（即ち配列番号１のトランスグルタミナーゼ成熟領域の２８７位）で、プロリン（Ｐ）に置換された。
【0054】
一実施例において、前記トランスグルタミナーゼ変異体、配列番号１に示されたポリペプチドとを比べ、１～４５位は配列番号３で置換され、且つ配列番号１に示されたトランスグルタミナーゼ成熟領域と比べて１８９位と２８７位の置換だけが発生し、６０℃の半衰期は２１４．５％に向上した。
【0055】
表１は配列番号１に示された親成熟酵素と変異体成熟酵素に比べれば、成熟領域の１８９位及び２８７位の置換のみが発生したトランスグルタミナーゼ変異体の相対的な熱安定性が挙げられた。
【0056】
【0057】
変異体の製造
当分野で知られている任意の変異誘発プログラム（例えば、部位特異的変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム突然変異誘発、シャッフリングなど）を用いて本発明のトランスグルタミナーゼ変異体を製造することができる。
当分野で知られている任意の変異誘発プログラム（例えば、部位特異的変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム突然変異誘発、シャッフリングなど）を用いて本発明のトランスグルタミナーゼ変異体を製造することができる。
【0058】
部位特異的変異誘発は、前記親トランスグルタミナーゼをコードするポリヌクレオチドのうちの１つ又は複数の規定部位に１つ又は複数（例えば、いくつか）の突然変異を導入する技術である。
【0059】
所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲを介してインビトロで部位特異的変異誘発を実現することができる。またカセット式突然変異誘発によりインビトロ部位特異的変異誘発を行うことができ、前記カセット式突然変異誘発は制限酵素が親トランスグルタミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中の部位で切断された後に突然変異を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドに連結することに関する。一般的に、消化プラスミドとオリゴヌクレオチドの制限酵素は同じであり、それによりプラスミドとインサートの粘着末端を互いに連結することができるようになった。
【0060】
また、本分野で知られている方法によりインビボで部位特異的変異誘発を実現することも可能である。
【0061】
本発明では、任意の部位特異的変異誘発プログラムを用いることができる。変異体を製造するために用いられるいくつかの購入可能なキットが存在する。
【0062】
合成遺伝子の構築には、興味のあるポリペプチドをコードするように、設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が必要とされる。遺伝子合成は、様々な技術を利用して行うことができる。
【0063】
既知の変異誘発、組換え及び／又はシャッフリング方法を使用し、その後に関連するスクリーニングプログラムを行うことにより単一又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入をすることができ、それを確認することができる。
【0064】
変異誘発／シャッフリング方法はハイスループット、自動化のスクリーニング方法と組み合わせて宿主細胞で発現されたクローンされ、変異誘発されたポリペプチドの活性を検出することができる。宿主細胞から活性ポリペプチドをコードする変異誘発されたＤＮＡ分子を回収し、且つ本分野の標準方法を用いて迅速に配列決定することができる。これらの方法はポリペプチド中の各アミノ酸残基の重要性を迅速に決定することを可能にする。
【0065】
合成遺伝子構築、及び／又は部位特異的変異誘発、及び／又はランダム変異誘発、及び／又はシャッフリングを組み合わせることにより半合成遺伝子構築を実現する。半合成構築は一般的には合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスとＰＣＲ技術とを組み合わせたものである。したがって、遺伝子の限定領域は、デノボ合成することができるが、他の領域は部位特異的変異誘発されたプライマーを用いて増幅することができるが、他の領域ではエラープローンＰＣＲ又は非エラープローンＰＣＲ増幅を行うことができる。その後、ポリヌクレオチドのサブ配列をシャッフリングすることができる。
【0066】
ポリヌクレオチド
本発明は、さらに、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードする単離したポリヌクレオチドに関する。いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。いくつかの態様において、本発明は、トランスグルタミナーゼ変異体を生成する方法に関し、前記方法は、ａ）前記トランスグルタミナーゼ変異体を発現することに適合する条件で本発明の宿主細胞を培養し、及び（ｂ）前記トランスグルタミナーゼ変異体を回収することを含む。
本発明は、さらに、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードする単離したポリヌクレオチドに関する。いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。いくつかの態様において、本発明は、トランスグルタミナーゼ変異体を生成する方法に関し、前記方法は、ａ）前記トランスグルタミナーゼ変異体を発現することに適合する条件で本発明の宿主細胞を培養し、及び（ｂ）前記トランスグルタミナーゼ変異体を回収することを含む。
【0067】
核酸構築物
本発明は、さらに、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードし、１つ又は複数の制御配列に操作可能に接続されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、前記１つ又は複数の制御配列は制御配列と適合する条件下でコード配列の適切な宿主細胞における発現をガイドする。
本発明は、さらに、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードし、１つ又は複数の制御配列に操作可能に接続されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、前記１つ又は複数の制御配列は制御配列と適合する条件下でコード配列の適切な宿主細胞における発現をガイドする。
【0068】
様々な方式でポリヌクレオチドを操作してトランスグルタミナーゼ変異体の発現を提供することができる。発現ベクターに応じて、ポリヌクレオチドがベクターに挿入される前にそれを操作することは理想的であるか又は必要である。組換えＤＮＡ方法を利用してポリヌクレオチドを修飾するための技術は当業者に周知である。
【0069】
制御配列はプロモータであってもよく、即ち宿主細胞により前記ポリヌクレオチドを発現するためのポリヌクレオチドを識別する。プロモータはトランスグルタミナーゼ変異体発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモータは宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってもよく、変異型、切断型及びハイブリッド型プロモータを含み、且つコードされた、宿主細胞と相同又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子を取得することができる。
【0070】
発現ベクター
本発明は、さらに、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータ、及び転写及び翻訳終結シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。様々なヌクレオチド及び制御配列は共に連結されて組換え発現ベクターを生成することができ、前記組換え発現ベクターは、このような部位にトランスグルタミナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを挿入するか又は置換することを許可するように、１つ又は複数の適切な制限部位を含むことができる。代替的に、ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現のための適切なベクターに挿入することにより前記ポリヌクレオチドを発現することができる。発現ベクターを生成する時に、コード配列はこのようにベクターに位置することで、コード配列を発現のための適切な制御配列と操作可能に連結する。
本発明は、さらに、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータ、及び転写及び翻訳終結シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。様々なヌクレオチド及び制御配列は共に連結されて組換え発現ベクターを生成することができ、前記組換え発現ベクターは、このような部位にトランスグルタミナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを挿入するか又は置換することを許可するように、１つ又は複数の適切な制限部位を含むことができる。代替的に、ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現のための適切なベクターに挿入することにより前記ポリヌクレオチドを発現することができる。発現ベクターを生成する時に、コード配列はこのようにベクターに位置することで、コード配列を発現のための適切な制御配列と操作可能に連結する。
【0071】
組換え発現ベクターは組換えＤＮＡプログラムにより容易にプログラミングされ、ポリヌクレオチド発現を引き起こすことができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、一般的には、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との相性に依存する。ベクターは、直鎖又は環状のプラスミドであってもよい。
【0072】
ベクターは自己複製ベクターであってもよく、即ち染色体の外部エンティティとして存在するベクターであり、その複製は染色体の複製と独立し、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体又は人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を確保するためのいかなる手段を含んでもよい。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入される時に、ゲノムに組み込まれ且つそれに組み込まれた１つ又は複数の染色体と共に複製されるベクターであってもよい。また、単独のベクター又はプラスミド又は２つ以上のベクター又はプラスミドを使用することができ、それは、共に宿主細胞ゲノムに導入されるトータルＤＮＡを含有し、又はトランスポゾンを使用することができる。
【0073】
ベクターは、形質転換細胞、トランスフェクション細胞、形質導入細胞等の細胞を容易に選択可能な１つ又は複数の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは遺伝子であり、その生成物は殺生物剤耐性又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性等を提供する。
【0074】
細菌選択マーカーの例は、バチラスリケニホルミス又はバチルスズブチリスｄａｌ遺伝子、又は抗生剤への耐性（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、又はテトラサイクリン耐性）を付与したマーカーである。酵母宿主細胞の適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３を含むがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞に使用される選択的マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニリルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、それにその等価物を含むがそれらに限定されない。アスペルギルス細胞に好ましく使用されるのはアスペルギルスニジュランス又はアスペルギルスオリゼーａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子及びストレプトマイセスヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子である。
【0075】
ベクターは、宿主細胞のゲノム中にベクターを組み込むことを可能にするか、又は細胞中でゲノムから独立してベクターを自己複製した１つ又は複数のエレメントを含むことが好ましい。
【0076】
宿主細胞ゲノムに組み込むために、ベクターはトランスグルタミナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列又は相同あるいは非相同組換えを介してゲノムに組み込む任意の他のベクター要素に依存することができる。代替的に、前記ベクターは相同組換えにより宿主細胞ゲノムの染色体内の正確な位置に組み込まれたようにガイドする別のポリヌクレオチドを含んでもよい。正確な位置で組み込む可能性を増加させるために、組み込み要素は、十分な数の核酸、例えば、１００～１０，０００個の塩基対、４００～１０，０００個の塩基対及び８００～１０，０００個の塩基対を含有すべきであり、相同組換えの確率を向上させるために、前記核酸は、対応する標的配列と高い配列同一性を有する。組み込み要素は、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相同の任意の配列であってもよい。また、組み込み要素は、非コードされるか又はコードされたポリヌクレオチドであってもよい。一態様で、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。
【0077】
自己複製するために、ベクターはさらに複製開始点を含むことができ、前記複製開始点はベクターが検討中の宿主細胞において自己複製することを可能にする。複製開始点は、細胞において機能し、自己複製を生じさせるいずれのプラスミドレプリコンであってもよい。用語「複製開始点」又は「プラスミドレプリコン」とはプラスミド又はベクターが体内にコピーできるポリヌクレオチドを意味する。
【0078】
細菌複製開始点の例は、大腸菌での複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４の複製開始点であり、バチルス属で複製を可能にするプラスミドｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１の複製開始点である。
【0079】
酵母宿主細胞における複製開始点の例は、２μｍの複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせが挙げられる。
【0080】
糸状菌細胞に有用である複製開始点の例は、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１（Ｇｅｍｓら、１９９１、Ｇｅｎｅ［遺伝子］９８：６１－６７、Ｃｕｌｌｅｎら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．［核酸の研究］１５：９１６３－９１７５、ＷＯ００／２４８８３）である。ＷＯ００／２４８８３に開示された方法でＡＭＡ１遺伝子の単離及び前記遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築を完了することができる。
【0081】
１つ以上のコピーされた本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することによりトランスグルタミナーゼ変異体の生成を増加させることができる。配列の少なくとも１つの別のコピーを宿主細胞ゲノムに組み込むか又は前記ポリヌクレオチドと共に増幅可能な選択性マーカー遺伝子を含むことにより前記ポリヌクレオチドの増加したコピー数を取得することができ、ここで適切な選択的試薬の存在下で細胞を培養することは、選択マーカー遺伝子を含む増幅されたコピーされた細胞、及びこの前記ポリヌクレオチドからの他のコピーを選択することができる。
【0082】
上記のような要素に連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するためのプログラムは、当業者に周知である。
【0083】
宿主細胞
本発明は、さらに、組換え宿主細胞に関し、前記組換え宿主細胞は、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードし、１つ又は複数の制御配列に操作可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記１つ又は複数の制御配列は、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体の生成をガイドする。ポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターを宿主細胞に導入することにより、前記構築物又はベクターは染色体組み込み体又は自己複製された染色体外ベクターとして維持され、前述のとおりである。用語「宿主細胞」は、複製期間に生じる変異により、親細胞と全く同一ではない任意の親細胞の子孫を包含するものとする。宿主細胞の選択は、トランスグルタミナーゼ変異体をコードする遺伝子及びその由来に大きく依存する。
本発明は、さらに、組換え宿主細胞に関し、前記組換え宿主細胞は、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体をコードし、１つ又は複数の制御配列に操作可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記１つ又は複数の制御配列は、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体の生成をガイドする。ポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターを宿主細胞に導入することにより、前記構築物又はベクターは染色体組み込み体又は自己複製された染色体外ベクターとして維持され、前述のとおりである。用語「宿主細胞」は、複製期間に生じる変異により、親細胞と全く同一ではない任意の親細胞の子孫を包含するものとする。宿主細胞の選択は、トランスグルタミナーゼ変異体をコードする遺伝子及びその由来に大きく依存する。
【0084】
宿主細胞は、トランスグルタミナーゼ変異体の組換え生成に有用な任意の細胞であってもよく、例えば原核細胞又は真核細胞であってもよい。
【0085】
原核宿主細胞は、任意のグラム陽性又はグラム陰性細菌であってもよい。グラム陽性細菌は、バチルス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、ジオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オセアノバシラス属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属及びストレプトマイセス属を含むが、これらに限定されない。グラム陰性細菌は、カンピロバクター属、大腸菌、フラボバクテリウム、フゾバクテリウム属、ヘリコバクター属、イリオバクター属、ナイセリア属、シュードモナス属、サルモネラ菌属、及びウレアプラズマ属を含むが、これらに限定されない。
【0086】
宿主細胞は、真核生物であってもよく、例えば哺乳動物、昆虫、植物又は真菌細胞であってもよい。
【0087】
生成方法
本発明は、さらに、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体を生成する方法に関し、前記方法は、ａ）前記トランスグルタミナーゼ変異体を発現することに適合する条件で本発明の宿主細胞を培養し、（ｂ）前記トランスグルタミナーゼ変異体を回収することを含む。
本発明は、さらに、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体を生成する方法に関し、前記方法は、ａ）前記トランスグルタミナーゼ変異体を発現することに適合する条件で本発明の宿主細胞を培養し、（ｂ）前記トランスグルタミナーゼ変異体を回収することを含む。
【0088】
本分野で知られている方法を使用することにより、トランスグルタミナーゼ変異体を産生するのに適した栄養培地中で宿主細胞を培養する。例えば、振盪フラスコで培養するか、又は適切な培地中でトランスグルタミナーゼ又は変異体発現及び／又は単離を可能にする条件下で実験室又は工業発酵タンク(ファーメンター)で小規模又は大規模発酵（連続発酵、バッチ発酵、バッチ供給発酵又は固体発酵を含む）を行うことにより細胞を培養することができる。本分野で知られている手順を使用して、炭素及び窒素源及び無機塩を含む適切な栄養培地に培養する。好適な培地は、商業的供給元から取得するか又は開示された組成に応じて製造することができる。トランスグルタミナーゼ変異体が栄養媒体に分泌されると、前記トランスグルタミナーゼ変異体は培地から直接回収することができる。トランスグルタミナーゼ変異体が分泌されなければ、それは細胞溶解液から回収することができる。
【0089】
本分野で知られているトランスグルタミナーゼ変異体に対する特異的方法を用いてトランスグルタミナーゼ変異体を検出することができる。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素産物の形成又は酵素基質の消失を含むが、それらに限定されない。例えば、酵素測定を使用してトランスグルタミナーゼ変異体の活性を決定することができる（例えば実施例に記載のとおりである）。
【0090】
本分野で知られている方法を用いてトランスグルタミナーゼ変異体を回収することができる。例えば、従来の手順により栄養媒体からトランスグルタミナーゼ変異体を回収することができ、前記従来の手順は、収集、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含むが、それらに限定されない。
【0091】
本分野で知られている様々な手順によりトランスグルタミナーゼ変異体を精製して実質的に純粋なトランスグルタミナーゼ変異体を取得することができ、前記手順は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水作用クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除クロマトグラフィーであってもよい）、電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動）、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ又は抽出を含むが、これらに限定されない。
【0092】
代替可能な態様において、トランスグルタミナーゼ変異体を回収することではなく、トランスグルタミナーゼ変異体を発現する本発明の宿主細胞を前記トランスグルタミナーゼ変異体の供給源として用いる。
【0093】
発酵液配合物又は細胞組成物
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドを含む発酵液配合物又は細胞組成物に関する。前記発酵液生成物は、さらに、発酵過程で使用される他の成分を含み、例えば細胞（本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含む宿主細胞、これらの宿主細胞は標的ポリペプチドを生成するために用いられる）、細胞断片、バイオマス、発酵培地及び／又は発酵生成物のようなものを含む。いくつかの実施例において、組成物は、１種又は多種の有機酸、死滅した細胞及び／又は細胞破片及び培地の細胞を死滅させた全培養液である。
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドを含む発酵液配合物又は細胞組成物に関する。前記発酵液生成物は、さらに、発酵過程で使用される他の成分を含み、例えば細胞（本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含む宿主細胞、これらの宿主細胞は標的ポリペプチドを生成するために用いられる）、細胞断片、バイオマス、発酵培地及び／又は発酵生成物のようなものを含む。いくつかの実施例において、組成物は、１種又は多種の有機酸、死滅した細胞及び／又は細胞破片及び培地の細胞を死滅させた全培養液である。
【0094】
ここで使用される用語「発酵液」は、細胞発酵により生成され、回収又は精製を経てないか、又は、回収又は精製を最低限にした製剤を意味する。例えば、微生物培養物がタンパク質合成（例えば、宿主細胞発現酵素が有する）を可能にし、且つタンパク質を細胞培地に分泌する炭素制限条件下で飽和までインキュベートして成長させると、発酵液を生成する。前記発酵液は、発酵終了時に得られる発酵材料の分画されていない又は分画された内容物を含んでもよい。一般的には、前記発酵液は分画されず、且つ使用された培地及び例えば遠心により微生物細胞（例えば、糸状菌細胞）を除去した後に存在する細胞破片を含む。いくつかの実施例において、発酵液は使用された細胞培地、細胞外酵素及び活力を有する及び／又は活力がない微生物細胞を含有する。
【0095】
一実施例において、発酵液配合物及び細胞組成物は第１有機酸成分（少なくとも１種の１～５個の炭素を含む有機酸及び／又はその塩）及び第２有機酸成分（少なくとも１種の６個以上の炭素を含む有機酸及び／又はその塩）を含有する。具体的な実施例において、第１有機酸成分は酢酸、ギ酸、プロピオン酸、その塩又は前述の２種以上の混合物であり、且つ前記第２有機酸成分は安息香酸、シクロヘキサンカルボン酸、４－メチルペンタン酸、フェニル酢酸、その塩又は前述の２種以上の混合物である。
【0096】
一態様では、組成物は、１種又は多種の有機酸を含有し、且つ必要に応じて死滅した細胞及び／又は細胞破片を含む。一実施例において、細胞が死滅した全培養液からこれらの死滅した細胞及び／又は細胞破片を除去することにより、これらの成分を含まない組成物を提供する。
【0097】
これらの発酵液配合物又は細胞組成物は、さらに、防腐剤及び／又は抗微生物（例えば、制菌剤）を含むことができ、ソルビトール、塩化ナトリウム、ソルビン酸カリウム、及び本分野の既知の他の試薬を含むが、それらに限定されない。
【0098】
前記細胞が死滅した全培養液又は組成物は、発酵終了時に得られる発酵材料の分画されていない内容物を含有してもよい。一般的には、前記細胞が死滅した全培養液又は組成物は、使用された培地、及び微生物細胞（例えば、糸状菌細胞）を飽和まで成長させ、炭素制限条件下でタンパク質を合成するようにインキュベートした後に存在する細胞破片を含む。いくつかの実施例において、前記細胞が死滅した全培養液又は組成物は、使用された細胞培地、細胞外酵素及び死滅した糸状菌細胞を含有する。いくつかの実施例において、本分野の既知の方法を使用して細胞を死滅させる全培養液又は組成物に存在する微生物細胞を透過処理及び／又は分解することができる。
【0099】
ここに記載の全培養液又は細胞組成物は、一般的には、液体であるが、不溶性成分、例えば、死滅した細胞、細胞破片、培地成分及び／又は１種又は多種の不溶性酵素を含有することができる。いくつかの実施例において、不溶性成分を除去して清澄液組成物を提供することができる。
【0100】
組成物
また、本発明は、本発明の変異体トランスグルタミナーゼを含む組成物に関する。
また、本発明は、本発明の変異体トランスグルタミナーゼを含む組成物に関する。
【0101】
これらの組成物は、本発明の変異体トランスグルタミナーゼを主酵素成分として含むことができ、例えば、一成分組成物である。代替的に、組成物は多種の酵素活性を含むことができ、例えば、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、β－アミラーゼ、プルラナーゼの群から選択される１つ又は複数（例えば、いくつか）の酵素である。
【0102】
実施例１
以下、そのうちの１つの具体的な実施形態を参照して部分的なトランスグルタミナーゼ変異体の製造及び熱安定性について説明する。
以下、そのうちの１つの具体的な実施形態を参照して部分的なトランスグルタミナーゼ変異体の製造及び熱安定性について説明する。
【0103】
係る大腸菌ＪＭ１０９及び大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ｔａｋａｒａ－タカラバイオ（北京）株式会社から購入され、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）プラスミドは、Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入され（上記菌株大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、購入可能であり、特許手続き上の寄託を行う必要がない）、中性プロテアーゼは、北京ｓｏｌａｒｂｉｏ社（品番Ｚ８０３２）から購入され、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｎａｔｉｏｎ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＢＫＬ）Ｋｉｔ及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、タカラバイオ（北京）株式会社から購入され、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質濃度測定キット（界面活性剤互換型）は、上海ｂｅｙｏｔｉｍｅ社から購入された。
【0104】
係る培地について：
ＬＢ液体培地：酵母粉末５．０ｇ／Ｌ、トリプトン１０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０．０ｇ／Ｌ、アンピシリン１００μｇ／Ｌ。
ＬＢ液体培地：酵母粉末５．０ｇ／Ｌ、トリプトン１０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０．０ｇ／Ｌ、アンピシリン１００μｇ／Ｌ。
【0105】
ＬＢ固体培地：酵母粉末５．０ｇ／Ｌ、トリプトン１０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０．０ｇ／Ｌ、寒天粉１５ｇ／Ｌ、アンピシリン１００μｇ／Ｌ。
【0106】
ＴＢ培地：酵母エキス２４ｇ／Ｌ、トリプトン１２ｇ／Ｌ、三水和リン酸水素二カリウム１２．８４ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．３１ｇ／Ｌ、グリセリン４ｍＬ／Ｌ、アンピシリン１００μｇ／Ｌ。
【0107】
１．突然変異体の構築：
親の遺伝子（ヌクレオチド配列は、配列番号２に示すとおりであり、アミノ酸配列は、配列番号１に示すとおりである）は、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺ社に依頼して合成を行い、且つ制限酵素部位ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩによりプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）に挿入され、ｐＥＴ－２２ｂ－ｔｇａｓｅ（配列番号４）を得た。プロ酵素が置換されたトランスグルタミナーゼ（即ち配列番号１の１－４５位の置換部位配列番号３に対応する）は、遺伝子の上流の溶解促進タンパク質タグＴｒｘＡを含み、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺ社に依頼して合成し、且つ制限酵素部位ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩによりプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）に挿入されてｐＥＴ－２２ｂ－ｐｒｏＣ／ｔｇａｓｅ（配列番号５）を得た。
親の遺伝子（ヌクレオチド配列は、配列番号２に示すとおりであり、アミノ酸配列は、配列番号１に示すとおりである）は、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺ社に依頼して合成を行い、且つ制限酵素部位ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩによりプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）に挿入され、ｐＥＴ－２２ｂ－ｔｇａｓｅ（配列番号４）を得た。プロ酵素が置換されたトランスグルタミナーゼ（即ち配列番号１の１－４５位の置換部位配列番号３に対応する）は、遺伝子の上流の溶解促進タンパク質タグＴｒｘＡを含み、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺ社に依頼して合成し、且つ制限酵素部位ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩによりプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）に挿入されてｐＥＴ－２２ｂ－ｐｒｏＣ／ｔｇａｓｅ（配列番号５）を得た。
【0108】
突然変異体Ｄ１８９Ｈは、プラスミドｐＥＴ－２２ｂ－ｐｒｏＣ／ｔｇａｓｅをテンプレートとし、１８９ｈｆ／１８９ｈｒをプライマーとし、ＰＣＲ及び線形ＤＮＡの環状化により取得し、取得されたプラスミドはｐＥＴ－２２ｂ－ｐｒｏＣ／ｔｇａｓｅ／Ｄ１８９Ｈであった。変異体Ｄ １８９Ｈ／Ａ２８７ＰはプラスミドｐＥＴ－２２ｂ－ｐｒｏＣ／ｔｇａｓｅ／Ｄ１８９Ｈをテンプレートとし、２８７ｍｆ／２８７ｍｒをプライマーとし、ＰＣＲ及び線形ＤＮＡの環状化により得られ、得られたプラスミドはｐＥＴ－２２ｂ－ｐｒｏＣ／ｔｇａｓｅ／Ｄ１８９Ｈ／Ａ２８７Ｐであった。以上で使用されるべき全てのプライマーは表２に示すとおりである。ＰＣＲ過程は、タカラバイオ（北京）株式会社ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのプロトコール、線形ＤＮＡ環状化方法は、タカラバイオ（北京）株式会社Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｎａｔｉｏｎ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＢＫＬ）Ｋｉｔのプロトコールを参照した。
【0109】
【0110】
２．突然変異体酵素の製造方法
構築されたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（北京ＴＩＡＮＧＥＮバイオテクノロジー社から購入した）に形質転換し、形質転換生成物をＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で１０時間培養し、且つ形質転換体を選び出して配列測定を行い、配列決定が正確な組換えプラスミド形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を取得して対応するトランスグルタミナーゼ変異体を発現する組換え大腸菌を得た。
構築されたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（北京ＴＩＡＮＧＥＮバイオテクノロジー社から購入した）に形質転換し、形質転換生成物をＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で１０時間培養し、且つ形質転換体を選び出して配列測定を行い、配列決定が正確な組換えプラスミド形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を取得して対応するトランスグルタミナーゼ変異体を発現する組換え大腸菌を得た。
【0111】
得られた組換え大腸菌をＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で１０時間培養して形質転換体をピックアップしてＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。３７℃で１０時間培養して１％の播種量でＴＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に移した。３７℃で大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＯＤ６００１．０～１．５に培養し、最終濃度が０．０１ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加して組換えタンパク質の発現を誘導した。ＩＰＴＧを加えた後に培養温度を２０℃に変えて３６時間連続的に培養した。全ての液体培養はいずれも振盪培養され、回転速度は、２２０ｒｐｍである。
【0112】
発酵後にサンプルを７５００ｒｐｍで１０分遠心分離し菌体を収集し、発酵液の総体積の５分の１のＴｒｉｓ－ＨＣｌ５０ｍＭを加え、ｐＨ８．０で菌体を懸濁し、且つ１０分氷浴した。サンプルを氷上に置いて超音波破壁を行い、且つ１２０００ｒｐｍで１５分遠心分離した後に上澄液を回収し、上澄液に２００ｍｇ／ｍｌの中性プロテアーゼ溶液（中性プロテアーゼは、北京Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入され、品番Ｚ８０３２）を添加してトランスグルタミナーゼを活性化し、インキュベーション条件は３７℃で３０分水浴することである。インキュベートしたサンプルを１２０００ｒｐｍで２０分遠心分離した後に上澄み液を取り、且つニッケルイオンアフィニティー精製方法によりタンパク質精製を行い、具体的な方法は、ニッケルイオンアフィニティー精製カラムに、導電性バランスになるまで水とＴｒｉｓ－ＨＣｌ５０ｍＭ、２０ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．８溶液を順にかけ、その後にサンプルを通し、且つＴｒｉｓ－ＨＣｌ５０ｍＭ、２０ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．８溶液を用いて再度導電性バランスになるまで洗浄され、次に溶液Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ５０ｍＭ、１８０ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．８溶液によりタンパク質を溶出し、且つタンパク質を回収した。精製過程全体はＡＫＴＡ ｐｕｒｅ装置で行われ、Ａ２８０波長吸収ピークを観察したことによりタンパク質収集時間及び収集量を決定した。収集されたタンパク質サンプルは、ゲルクロマトグラフィーによりタンパク質溶液脱塩を行い、具体的な方法について、導電性バランスになるまでゲルカラムに水とＴｒｉｓ－ＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨが８．０である溶液をかけ、次にゲルカラムにタンパク質サンプルを通し、その後に、Ａ２８０波長で吸収ピークが出現したまでＴｒｉｓ－ＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨ８．０溶液を通し続けてタンパク質を収集し、導電性が変化する時に収集をタイムリーに停止した。タンパク質濃度はＢＣＡテスト法を採用し、具体的な方法は、上海ｂｅｙｏｔｉｍｅ社Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質濃度測定キット（界面活性剤互換型）プロトコールを参照する。
【0113】
【0114】
【0115】
表３から、変異体トランスグルタミナーゼ成熟酵素は親トランスグルタミナーゼ成熟酵素に比べれば、６０℃（Ｔ１／２
６０℃）で半減期及び溶解温度（Ｔｍ）が顕著に向上すると分かる。
【0116】
図１から、変異体トランスグルタミナーゼ成熟酵素は親トランスグルタミナーゼ成熟酵素に比べれば、６０℃（Ｔ１／２
６０℃）で半減期が顕著に向上し、酵素比活性も僅かに向上すると分かる。
【0117】
図２から、親と変異体はそれぞれ大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１における発現を実現すると分かる。ここで、親は、タンパク質の分子量が４９ＫＤａより僅かに低いところに明らかなバンドが見え、理論的な大きさである４３．３ＫＤａに近い。変異体Ｄ１８９Ｈ／Ａ２８７Ｐタンパク質分子量４９～６２ＫＤａの間に明らかなバンドが見え、理論的な大きさである５６．５ＫＤａに近い。
【0118】
図３から、タンパク質は、精製された後にバンドが単一であり、タンパク質の純度が予想に合致することを示す。
【0119】
実施例２：トランスグルタミナーゼ成熟酵素変異体のうさぎ肉ジャーキー加工における応用
実施例１で調製された変異体トランスグルタミナーゼ成熟酵素（ＴＧａｓｅ－Ｄ１８９Ｈ／Ａ２８７Ｐ）を利用してウサギ肉ジャーキー加工を行い、具体的には以下のとおりである：
Ｓ１．ウサギ肉を挽砕し、鶏肉をブロックに切断して、混合肉を得た。
実施例１で調製された変異体トランスグルタミナーゼ成熟酵素（ＴＧａｓｅ－Ｄ１８９Ｈ／Ａ２８７Ｐ）を利用してウサギ肉ジャーキー加工を行い、具体的には以下のとおりである：
Ｓ１．ウサギ肉を挽砕し、鶏肉をブロックに切断して、混合肉を得た。
【0120】
Ｓ２．食塩、複合リン酸塩及び水を均一に混合した後、Ｓ１で得られた混合肉を加え、均一に混合し、ラップフィルムで密封した後、１２時間漬けて、漬け肉を得た。
【0121】
Ｓ３．漬け肉をホモジナイズすることにより、混合挽肉を得た。
【0122】
Ｓ４、Ｓ３で得られた混合挽肉にトランスグルタミナーゼ、卵白タンパク質、ショウガ粉、ブレンドスパイス等を添加し、温度４℃で均一に撹拌することにより、混合挽肉を得た。
【0123】
Ｓ５．Ｓ４で得られた混合挽肉をラップフィルムで密封した後、温度が６０℃の水浴条件で０．２時間放置した後、押出成形し、乾燥させ、自然冷却したことにより、半製品を得た。
【0124】
Ｓ６．Ｓ５で得られた半製品を焼いて、複合ウサギジャーキーを得る。
【0125】
相関配列
配列番号１の配列は以下のとおりである（親、下線部分はプロ酵素配列であり、残りは成熟領域配列である）：
ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳＡＧＰＳＦＲＡＰＤＰＤＤＲＶＴＰＰＡＥＰＬＤＲＭＰＤＰＹＲＰＶＮＧＲＡＥＴＶＶＮＮＹＩＲＫＷＱＱＶＹＳＨＲＤＧＲＫＱＱＭＴＥＥＱＲＥＷＬＳＹＧＣＶＧＶＴＷＶＮＳＧＱＹＰＴＮＲＬＡＦＡＳＦＤＥＤＲＦＫＮＥＬＫＮＧＲＰＲＳＧＥＴＲＡＥＦＥＧＲＶＡＫＥＳＦＤＥＥＫＧＦＱＲＡＲＥＶＡＳＶＭＮＲＡＬＥＮＡＨＤＥＳＡＹＬＤＮＬＫＫＥＬＡＮＧＮＤＡＬＲＮＥＤＡＲＳＰＦＹＳＡＬＲＮＴＰＳＦＫＥＲＮＧＧＮＨＤＰＳＲＭＫＡＶＩＹＡＫＨＦＷＳＧＱＤＲＳＳＳＡＤＫＲＫＹＧＤＰＤＡＦＲＰＡＰＧＴＧＬＶＤＭＳＲＤＲＮＩＰＲＳＰＴＳＰＧＥＧＦＶＮＦＤＹＧＷＦＧＡＱＴＥＡＤＡＤＫＴＶＷＴＨＧＮＨＹＨＡＰＮＧＳＬＧＡＭＨＶＹＥＳＬＦＲＮＷＳＥＧＹＳＤＦＤＲＧＡＹＶＩＴＦＩＰＫＳＷＮＴＡＰＤＫＶＫＱＧＷＰ
配列番号１の配列は以下のとおりである（親、下線部分はプロ酵素配列であり、残りは成熟領域配列である）：
ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳＡＧＰＳＦＲＡＰＤＰＤＤＲＶＴＰＰＡＥＰＬＤＲＭＰＤＰＹＲＰＶＮＧＲＡＥＴＶＶＮＮＹＩＲＫＷＱＱＶＹＳＨＲＤＧＲＫＱＱＭＴＥＥＱＲＥＷＬＳＹＧＣＶＧＶＴＷＶＮＳＧＱＹＰＴＮＲＬＡＦＡＳＦＤＥＤＲＦＫＮＥＬＫＮＧＲＰＲＳＧＥＴＲＡＥＦＥＧＲＶＡＫＥＳＦＤＥＥＫＧＦＱＲＡＲＥＶＡＳＶＭＮＲＡＬＥＮＡＨＤＥＳＡＹＬＤＮＬＫＫＥＬＡＮＧＮＤＡＬＲＮＥＤＡＲＳＰＦＹＳＡＬＲＮＴＰＳＦＫＥＲＮＧＧＮＨＤＰＳＲＭＫＡＶＩＹＡＫＨＦＷＳＧＱＤＲＳＳＳＡＤＫＲＫＹＧＤＰＤＡＦＲＰＡＰＧＴＧＬＶＤＭＳＲＤＲＮＩＰＲＳＰＴＳＰＧＥＧＦＶＮＦＤＹＧＷＦＧＡＱＴＥＡＤＡＤＫＴＶＷＴＨＧＮＨＹＨＡＰＮＧＳＬＧＡＭＨＶＹＥＳＬＦＲＮＷＳＥＧＹＳＤＦＤＲＧＡＹＶＩＴＦＩＰＫＳＷＮＴＡＰＤＫＶＫＱＧＷＰ
【0126】
配列番号２の配列は以下のとおりである（親、下線部分はプロ酵素配列であり、残りは成熟領域配列である）：
ＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＡＡＧＴＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＡＡＣＣＴＡＣＣＧＣＣＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＧＣＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＣＧＣＴＣＡＡＣＧＡＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＣＣＧＴＣＧＴＴＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＡＴＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＴＡＴＡＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＴＡＧＣＣＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＡＧＡＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＧＴＧＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＡＴＴＴＴＡＴＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＣＣＡＴＧＡＴＣＣＡＡＧＣＡＧＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＣＣＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＡＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＴＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＡＧＣＣＴＧＴＴＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＣＴＡＴＡＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＡＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＡ
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【0127】
配列番号３の配列は以下のとおりである：
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【0128】
配列番号４の配列は以下のとおりである（二重下線部分がプロ酵素領域に対応する遺伝子であり、波線部分がトランスグルタミナーゼ成熟酵素に対応する遺伝子である）：
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【0129】
配列番号５の配列は以下のとおりである（一重下線部分はＴｒｘＡ配列であり、二重下線部分はプロ酵素置換後のプロ酵素領域配列であり、波線部分はトランスグルタミナーゼ成熟領域配列である）：
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【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】