特許7395198インターロイキン１βに関連する病態の治療のためのピリジン－スルホンアミド化合物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-01
(45)【発行日】2023-12-11
(54)【発明の名称】インターロイキン１βに関連する病態の治療のためのピリジン－スルホンアミド化合物
(51)【国際特許分類】
C07D 401/04 20060101AFI20231204BHJP
C07D 401/14 20060101ALI20231204BHJP
C07D 213/74 20060101ALI20231204BHJP
C07D 405/14 20060101ALI20231204BHJP
A61K 31/4545 20060101ALI20231204BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20231204BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20231204BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20231204BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20231204BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231204BHJP
A61P 19/06 20060101ALI20231204BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231204BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231204BHJP
【ＦＩ】
C07D401/04 CSP
C07D401/14
C07D213/74
C07D405/14
A61K31/4545
A61K31/496
A61P1/16
A61P9/00
A61P11/00
A61P19/02
A61P19/06
A61P35/00
A61P37/02
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021525717
(86)(22)【出願日】2019-11-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-18
(86)【国際出願番号】 EP2019081410
(87)【国際公開番号】W WO2020099603
(87)【国際公開日】2020-05-22
【審査請求日】2022-06-01
(31)【優先権主張番号】18380017.6
(32)【優先日】2018-11-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】516375012
【氏名又は名称】アリンキー バイオファーマ
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＬＩＮＫＹ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ
【住所又は居所原語表記】ｃ／Ｆａｒａｄａｙ ７，３ａ ｐｌｔ．，Ｅｄｉｆｉｃｉｏ ＣＬＡＩＤ（ＰＣＭ），Ｃａｍｐｕｓ ｄｅ Ｃａｎｔｏｂｌａｎｃａ，２８０４９ Ｍａｄｒｉｄ（ＥＳ）
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ベガ ミゲル
(72)【発明者】
【氏名】カラスコ エステル
(72)【発明者】
【氏名】ゴメス パトリシア
(72)【発明者】
【氏名】カンポス ペドロ
(72)【発明者】
【氏名】ゴメス－レイノ フアン
(72)【発明者】
【氏名】ペレス フアン ヘスス
(72)【発明者】
【氏名】メセグエル アンヘル
【審査官】柳本 航佑
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００８／０９１８６３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００８／０２４２８４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２００７－５００７１９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ ４０１／００ －４０１／１４
Ｃ０７Ｄ ２１３／００ －２１３／９０
Ｃ０７Ｄ ４０５／００ －４０５／１４
Ａ６１Ｋ ３１／４５４５
Ａ６１Ｋ ３１／４９６
Ａ６１Ｐ １／１６
Ａ６１Ｐ １１／００
Ａ６１Ｐ ３７／０２
Ａ６１Ｐ ９／００
Ａ６１Ｐ １９／０２
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ １９／０６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ：【化1】
Ｒ１はＣ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、ハロゲンで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロゲンで置換されたＣ１～４アルキル、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択される１つ又は２つの置換基で任意に置換された芳香環又は複素芳香環であり、 Ｙ１はＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｏ（ＣＯ）及びＮＨＣ（Ｏ）からなる群より選択され、
Ｘ１はＮＨ、Ｏ又はＣＨ２であり、
ｎ１は０又は１であり、
Ｘ３は存在しないか、又はＮＲｙであり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立してＣ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル、Ｃ２～４アルキニル又はＨであり、
ＬはＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）又はＣＨ２であり、
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、独立してＮ及びＣＨから選択され、
Ｒ３はＨ、ハロゲン、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ａＲ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ａ、ＯＲ２ａ、ＮＲ２ａＲ２ｂ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ａ、ＮＲ２ａＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、１つ以上のハロゲンで任意に置換されたＣ１～４アルキル、１つ以上のハロゲンで任意に置換されたＣ２～４アルケニル、及び１つ以上のハロゲンで任意に置換されたＣ２～４アルキニルからなる群より選択され、ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、独立してＨ、Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル及びＣ２～４アルキニルからなる群より選択される）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項2】
式Ｉａ：【化2】
Ｒ１がＣ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、ハロゲンで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロゲンで置換されたＣ１～４アルキル、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択され、
Ｒ２が水素であるか、又は、
Ｒ１がＲ２と共に、Ｃ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、ハロゲンで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロゲンで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－及びハロゲンからなる群より選択される１つ若しくは２つの置換基で任意に置換された５員若しくは６員の芳香環、複素芳香環、環若しくは複素環を形成し、
Ｘ１、ｎ１、Ｙ１、Ｘ３、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｌ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｒ３は、請求項１に定義されるとおりである）を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ｙ１がＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）及びＣ（Ｏ）ＮＨからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
Ｘ１がＮＨ又はＯであり、ｎ１が１である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
Ｘ３がＮＲｙである、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
Ｒｘ及びＲｙが独立してＣ１～４アルキルである、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項7】
Ｒｘ及びＲｙがメチルである、請求項６に記載の化合物。
【請求項8】
ＬがＯである、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項9】
Ｚ１及びＺ３がＣＨである、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項10】
Ｒ３がＨ、ハロゲン及びＣ（Ｏ）ＮＨ２からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項11】
Ｒ３がＣｌ及びＣ（Ｏ）ＮＨ２からなる群より選択される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項12】
【化3】
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項14】
医薬品として使用される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、自己炎症性疾患、心血管疾患、変形性関節症、肺癌又は痛風の治療に使用される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規クラスのピリジン－スルホンアミド化合物及びそれを含む組成物に関する。本発明の化合物及び組成物（医薬組成物等）を、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）に関連する疾患、例えば炎症性疾患及び線維性疾患の治療における医薬品として使用することができる。
【背景技術】
【0002】
ＩＬ－１は、自己炎症性疾患から関節リウマチまで広範なヒト病理に関与することが示されており、ＩＬ－１遮断薬（ＩＬ－１Ｒａ、アナキンラ；抗ＩＬ－１ｂモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、カナキヌマブ；及び抗ＩＬ－１ａ、ＭＡＢｐ１）は、臨床使用が認可されているか、又はこれらの障害の幾つかにおいて評価されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
【0003】
ＩＬ－１は、以前から炎症及び先天免疫と関連付けられていた。このサイトカインが、種々の微生物又は環境チャレンジに応答した先天免疫及び炎症の形成及び指向において差別的役割を果たすことが現在明らかである。さらに、過去１０年間で、ＩＬ－１ベータ（ＩＬ－１β）の役割についての前臨床研究は、免疫病理、線維性疾患、変性疾患、心血管疾患及び癌におけるその役割を理解するために古典的炎症を超えて拡大している。さらに、ＩＬ－１βの遮断の効果についての臨床研究（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）から、１００００人を超える患者において、ＩＬ－１の遮断がアテローム性動脈硬化症による心血管死亡率だけでなく、肺癌、変形性関節症及び痛風を含む様々な疾患を防ぐことが示されている。この知見は、疾患機序の多様性、更には共通性を明らかにし、ＩＬ－１が有望な薬物標的であるだけでなく、炎症及び免疫のパラダイムとなることを示唆している（非特許文献９）。
【0004】
ＩＬ－１βの産生及びその後の分泌は、主にｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）及びインフラマソームの活性化に依存する。第１段階では、炎症性刺激又は感染、ＴＬＲ４受容体を介したシグナル伝達がｐｒｏ－ＩＬ－１β産生を誘発する。第２段階では、インフラマソーム活性化カスパーゼ－１が、タンパク質分解によりＩＬ－１βを血流中に放出する。このサイトカインは、数ある重要な機能の中でもＴ細胞の活性化及び抗原認識に関与する。興味深いことに、ＩＬ－１βの産生は、ＴＬＲ４受容体のシグナル伝達経路内のタンパク質群であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の作用に依存する。ｐ３８、ＪＮＫ及びＥＲＫ等のＭＡＰＫは、ＩＬ－１βの産生に関連する遺伝子プロモーターに結合する核因子を活性化する。このため、ＭＡＰＫの阻害は、炎症性疾患及び病態の状況でＩＬ－１βの産生を回避するのに有効なアプローチである。
【0005】
ＩＬ－１βによって引き起こされる炎症性疾患及び病態の中でも、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）が非常に重要である。これらの疾患の臨床的必要性は満たされておらず、主に対症療法に焦点を合わせたごく僅かな治療的アプローチしかない。
【0006】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）
特に、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、アルコールを殆ど又は全く摂取しない個体におけるアルコール性脂肪性肝疾患の組織学的特徴を有する一般的な肝障害である（非特許文献１０、非特許文献１１）。ＮＡＦＬＤは、肝臓が主に脂質代謝に関与することから、この臓器でより高頻度の事象である細胞内の脂質の異常貯留（一般に脂肪症と定義される）に起因する。ＮＡＦＬＤは、肝細胞の破壊による肝臓の炎症、脂肪症、壊死及び線維症を特徴とする脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む様々な組織学的形態を有する。
特に、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、アルコールを殆ど又は全く摂取しない個体におけるアルコール性脂肪性肝疾患の組織学的特徴を有する一般的な肝障害である（非特許文献１０、非特許文献１１）。ＮＡＦＬＤは、肝臓が主に脂質代謝に関与することから、この臓器でより高頻度の事象である細胞内の脂質の異常貯留（一般に脂肪症と定義される）に起因する。ＮＡＦＬＤは、肝細胞の破壊による肝臓の炎症、脂肪症、壊死及び線維症を特徴とする脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む様々な組織学的形態を有する。
【0007】
肝臓イメージングシステムが、肝臓構造及び脂肪症の存在の評価にも有用である。しかしながら、肝生検が依然として肝線維症の評価のための至適基準であるが、この分析方法は、その侵襲性のためにあらゆる研究で行うことはできない。肝臓生化学及び代謝の非侵襲的評価が、肝疾患の定義に、例えばＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨにおいて用いられることが多い（非特許文献１２、非特許文献１３）。血漿を用いて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び／又はガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）等の高レベルの酵素、並びに肝臓起源の他のタンパク質（ハプトグロビン、総ビリルビン、アルファ－２－ミクログロブリン、レジスチン、切断型又は無傷サイトケラチン－１８を含む）の存在が、血清グルコース及びインスリン耐性パラメーターに加えて一般に測定される。
【0008】
肝線維性疾患、特にＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの効果的な治療の手段は、依然として不十分である。ＮＡＳＨを有する患者の治療は確立されておらず、幾つかの治療選択肢が臨床試験において試験されている（非特許文献１３、非特許文献１４）。これらの研究は、多くの異なるファミリーの化学化合物（フィブラート、チアゾリジンジオン、ビグアニド、スタチン、カンナビノイド）及び治療標的（核内受容体、アンジオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素）の使用を伴う。
【0009】
ｃ－Ｊｕｎ発現が脂肪症からＮＡＳＨへの疾患進行と相関することが示されている（非特許文献１５）。ＪＮＫ１ノックアウトマウスが食餌性脂肪性肝炎及び肝線維症に抵抗性を示し、ＪＮＫ１が慢性炎症を誘導することで肝線維症の発症に寄与することも示されている（非特許文献１６）。
【0010】
マウス動物モデルがＮＡＳＨの前臨床ｉｎ ｖｉｖｏモデルとして開発されている（非特許文献１７）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、高脂肪食に対して感受性があり、ヒトＮＡＳＨにおいて観察されるものと同じ症状を多く発現することから最もよく用いられている。ストレプトゾトシンの注射がマウスモデルを高脂肪食に対して感作し、ＮＡＳＨを発症させることが更に知られている。
【0011】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、慢性炎症及びその後の肺の進行性瘢痕化を特徴とする間質性肺疾患である。間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、様々な程度の炎症及び線維症を特徴とする実質性肺疾患の異質群である。これらの幾つかは、薬物、自己免疫性結合組織疾患、吸入有機抗原に対する過敏性、又はサルコイドーシス等の既知の要因（precipitant）によって二次的に起こり得るが、他の特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）は、特定可能な原因を有しない。特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、避けられない肺機能の低下、進行性呼吸不全及び高い死亡率を伴う慢性の進行性線維症を特徴とするＩＩＰの最も侵攻性の形態の１つである（非特許文献１８）。
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、慢性炎症及びその後の肺の進行性瘢痕化を特徴とする間質性肺疾患である。間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、様々な程度の炎症及び線維症を特徴とする実質性肺疾患の異質群である。これらの幾つかは、薬物、自己免疫性結合組織疾患、吸入有機抗原に対する過敏性、又はサルコイドーシス等の既知の要因（precipitant）によって二次的に起こり得るが、他の特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）は、特定可能な原因を有しない。特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、避けられない肺機能の低下、進行性呼吸不全及び高い死亡率を伴う慢性の進行性線維症を特徴とするＩＩＰの最も侵攻性の形態の１つである（非特許文献１８）。
【0012】
ここ数年で、２つの新規の抗線維化療法剤であるピルフェニドン及びニンテダニブが開発され、ＩＰＦを有する多くの患者の治療が提供された。残念なことに、疾患修飾因子としてのそれらのプロファイルは不十分であり、新たな治療法が必要とされている。
【0013】
ＩＬ－１βレベルの上昇は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）を患う患者の肺における炎症促進及び線維化促進環境に寄与することが知られている（非特許文献１９）。前臨床研究では、肺線維症の動物モデルにより、ＩＬ－１βの一時的発現が肺線維症につながる急性肺損傷及び慢性修復を誘導することが示された（非特許文献２０、非特許文献２１）。さらに、ＩＰＦのブレオマイシン誘導性肺損傷モデルにより、肺線維症におけるＩＬ－１βの役割が広く実証された（非特許文献２２、非特許文献２３）。
【0014】
ＩＰＦにおけるＭＡＰＫの役割も動物及びヒト研究の焦点であり、活性化ＭＡＰＫがＩＰＦを有する患者の肺ホモジネートにおいて対照と比較して顕著に増加すると結論付けられている（非特許文献２４）。さらに、ＪＮＫ阻害は、ＩＰＦの動物モデルにおいて肺リモデリング及び肺線維症全身性マーカーを低減する（非特許文献２５）。ＩＰＦにおける研究結果により、ＩＰＦの発生及び進行の主要な誘導因子の１つとして活性化ＭＡＰＫ及びその後のＩＬ－１βの産生が指摘される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0015】
【文献】Dinarello, 2009
【文献】Gabay et al., 2010
【文献】Garlanda et al., 2013
【文献】Udalova et al., 2016
【文献】Aaron et al., 2018
【文献】Trankle CR et al., 2018
【文献】Ridker PM., 2018
【文献】Ridker PM., 2017
【文献】Montovani et al, 2019
【文献】Yeh M et al., 2007
【文献】Marchesini G et al., 2003
【文献】Gressner A et al., 2009, World J Gastroenterol; 15: 2433-2440
【文献】Vuppalanchi R and Chalasani N, 2009, Hepatology; 49: 306-317
【文献】Dowman J. K et al., 2009, Q J Med; 103: 71-83
【文献】Schulien et al, 2019, Cell Death & Differentiation; 26; 1688-1699
【文献】Kodama et al., 2009, Gastroenterology; 137(4); 1467-1477
【文献】Hansen H et al., 2017, Drug Discovery Today, 22: 1707-1718
【文献】Shaney et al., 2018
【文献】Barlo et al., 2011
【文献】Kolb M., 2001
【文献】Gasse P et al., 2011
【文献】Hoshino et al., 2009
【文献】Burgy et al., 2016
【文献】Yoshida et al., 2002
【文献】Van del Velden JL et al., 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
肝臓障害及び他の線維性障害、特に肝線維症及び肺線維症を伴う障害の管理のための新規の治療選択肢の必要性が依然として明らかであり、緊急である。
【課題を解決するための手段】
【0017】
本発明は、式Ｉ及び／又は式Ｉａを有する新規クラスの化合物を提供する。該化合物には、その薬学的に許容可能な塩が含まれる。本発明の化合物は、ＩＬ－１βの阻害に反応性の疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療を対象とする。
【0018】
本発明の化合物は、式Ｉ：
（式中、
Ｒ１はＣ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、フルオロ等のハロで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロで置換されたＣ１～４アルキル、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択される１つ又は２つの置換基で任意に置換された芳香環系又は複素芳香環系であり、
Ｙ１はＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｏ（ＣＯ）及びＮＨＣ（Ｏ）からなる群より選択され、
Ｘ１はＮＨ、Ｏ又はＣＨ２であり、
ｎ１は０又は１であり、
Ｘ３は存在しないか、又はＮＲｙであり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立してＣ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル、Ｃ２～４アルキニル又はＨ、例えばＣＨ３又はＨであり、
ＬはＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）又はＣＨ２であり、
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、独立してＮ及びＣＨから選択され、
Ｒ３はＨ、ハロ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ａＲ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ａ、ＯＲ２ａ、ＮＲ２ａＲ２ｂ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ａ、ＮＲ２ａＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、１つ以上のハロで任意に置換されたＣ１～４アルキル、１つ以上のハロで任意に置換されたＣ２～４アルケニル、及び１つ以上のハロで任意に置換されたＣ２～４アルキニルからなる群より選択され、ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、独立してＨ、Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル及びＣ２～４アルキニルからなる群より選択される）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩である。
【化1】
Ｒ１はＣ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、フルオロ等のハロで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロで置換されたＣ１～４アルキル、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択される１つ又は２つの置換基で任意に置換された芳香環系又は複素芳香環系であり、
Ｙ１はＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｏ（ＣＯ）及びＮＨＣ（Ｏ）からなる群より選択され、
Ｘ１はＮＨ、Ｏ又はＣＨ２であり、
ｎ１は０又は１であり、
Ｘ３は存在しないか、又はＮＲｙであり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立してＣ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル、Ｃ２～４アルキニル又はＨ、例えばＣＨ３又はＨであり、
ＬはＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）又はＣＨ２であり、
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、独立してＮ及びＣＨから選択され、
Ｒ３はＨ、ハロ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ａＲ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ａ、ＯＲ２ａ、ＮＲ２ａＲ２ｂ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ａ、ＮＲ２ａＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、１つ以上のハロで任意に置換されたＣ１～４アルキル、１つ以上のハロで任意に置換されたＣ２～４アルケニル、及び１つ以上のハロで任意に置換されたＣ２～４アルキニルからなる群より選択され、ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、独立してＨ、Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル及びＣ２～４アルキニルからなる群より選択される）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩である。
【0019】
更なる態様では、本発明は、本発明による化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む医薬組成物に関する。
【0020】
他の態様では、本発明は、医薬品として使用される、本発明による化合物又は本発明による組成物に関する。
【0021】
更に他の態様では、本発明は、ＩＬ－１βの阻害に反応性の疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療に使用される本発明による化合物又は本発明による組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）に対する化合物５及び化合物７の効果を示す図である。
【図2】２８日間の処理後の血清ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）レベルを示す図である。
【図3】肝臓対体重比に対する化合物５及び７の効果を示す図である。
【図4】ブレオマイシン誘導性ＩＰＦの治療における肺ヒドロキシプロリンレベルに対する化合物７の効果を示す図である。
【図5A】ＢＡＬＦ中の総細胞数を示す図である。
【図5B】ＢＡＬＦ中の各種白血球数（Differential Leukocyte Counts）を示す図である。
【図6A】Ｈ＆Ｅアシュクロフト（Ashcroft）スコアを示す図である。
【図6B】％コラーゲン比例面積（Collagen Proportion Area）（ＣＰＡ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
定義
本文脈において、「Ｃ１～４アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、及びｔｅｒｔ－ブチル等の、炭素数１～４の直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を意味することを意図している。
本文脈において、「Ｃ１～４アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、及びｔｅｒｔ－ブチル等の、炭素数１～４の直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を意味することを意図している。
【0024】
同様に、「Ｃ２～４アルケニル」という用語は、炭素数２～４であり、二重結合を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を網羅することを意図している。アルケニル基の例は、ビニル、アリル、及びブテニルである。アルケニルの好ましい例は、ビニル及びアリル、特にアリルである。
【0025】
本文脈において、「Ｃ２～４アルキニル」という用語は、炭素数２～４であり、三重結合を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を意味することを意図している。Ｃ２～４アルキニル基の例示的な例としては、アセチレン、プロピニル、ブチニルと並んで、これらの分岐形態が挙げられる。不飽和（三重結合）の位置は、炭素鎖に沿った任意の位置であり得る。当業者に知られているように、「Ｃ２～４アルキニル」がジインとなるように、２つ以上の結合が不飽和であってもよい。
【0026】
本明細書では、「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード、より詳しくは、フルオロ、クロロ、及びブロモを含む。
【0027】
本文脈において、「芳香環又は芳香環系」という用語は、フェニル、ナフチル、１，２，３，４－テトラヒドロナフチル、アントラシル、フェナントラシル（phenanthracyl）、ピレニル、ベンゾピレニル、フルオレニル及びキサンテニル等の完全に又は部分的に芳香族の炭素環又は炭素環系を意味することを意図している。
【0028】
「複素芳香環又は複素芳香環系」という用語は、１つ以上の炭素原子がヘテロ原子、例えば窒素（＝Ｎ－又は－ＮＨ－）、硫黄及び／又は酸素の原子で置き換えられている完全又は部分的に芳香族の炭素環又は炭素環系を意味することを意図している。かかる複素芳香環又は複素芳香環系の基の例は、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、クマリル、フリル、チエニル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フタラジニル、フタラニル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリル、アクリジニル、カルバゾリル、ジベンゾアゼピニル、インドリル、ベンゾピラゾリル、フェノキサゾニル、ベンゾフラニル、ジヒドロベンゾフラニル、及びベンゾジオキソリルである。
【0029】
本文脈において、「複素環又は複素環系」という用語は、炭素原子の１つ以上がヘテロ原子、例えば窒素（＝Ｎ－又は－ＮＨ－）、硫黄、及び／又は酸素の原子で置き換えられている非芳香族の炭素環又は炭素環系を意味することを意図している。かかる複素環基の例は、イミダゾリジン、ピペラジン、ヘキサヒドロピリダジン、ヘキサヒドロピリミジン、ジアゼパン、ジアゾカン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、アゾカン、アジリジン、アジリン、アゼチジン、ピロリン、トロパン、オキサジナン（モルホリン）、アゼピン、ジヒドロアゼピン、テトラヒドロアゼピン、ヘキサヒドロアゼピン、オキサゾラン、オキサゼパン、オキサゾカン、チアゾラン、チアジナン、チアゼパン、チアゾカン、オキサゼタン、ジアゼタン、チアゼタン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、オキセパン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン、チエパン、ジチアン、ジチエパン、ジオキサン、ジオキセパン、オキサチアン及びオキサチエパンである。
【0030】
本文脈において、「任意に置換された」という用語は、問題の基が１回以上、好ましくは１回又は２回置換され得ることを意味することを意図している。さらに、「任意に置換された」という用語は、問題の基が非置換であることも意味する場合がある。
【0031】
本発明の化合物は、遊離形態又は薬学的に許容可能な塩の形態であり得る。本発明の文脈において、「薬学的に許容可能な塩」という用語は塩基又は酸のいずれかと共に形成される塩として理解され、得られる対イオンは本発明の化合物の毒性を大きく増大させない。
【0032】
薬学的に許容可能な塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩又は臭化水素酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩又はマレイン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、化合物がカルボキシル基等の置換基を有する場合、塩基との塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩等、又はカルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等）が言及され得る。
【0033】
化合物
本発明の化合物は、式Ｉ：
（式中、
Ｒ１はＣ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、フルオロ等のハロで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロで置換されたＣ１～４アルキル、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択される１つ又は２つの置換基で任意に置換された芳香環系又は複素芳香環系であり、
Ｙ１はＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｏ（ＣＯ）及びＮＨＣ（Ｏ）からなる群より選択され、
Ｘ１はＮＨ、Ｏ又はＣＨ２であり、
ｎ１は０又は１であり、
Ｘ３は存在しないか、又はＮＲｙであり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立してＣ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル、Ｃ２～４アルキニル又はＨ、例えばＣＨ３又はＨであり、
ＬはＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）又はＣＨ２であり、
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、独立してＮ及びＣＨから選択され、
Ｒ３はＨ、ハロ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ａＲ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ａ、ＯＲ２ａ、ＮＲ２ａＲ２ｂ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ａ、ＮＲ２ａＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、１つ以上のハロで任意に置換されたＣ１～４アルキル、１つ以上のハロで任意に置換されたＣ２～４アルケニル、及び１つ以上のハロで任意に置換されたＣ２～４アルキニルからなる群より選択され、ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、独立してＨ、Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル及びＣ２～４アルキニルからなる群より選択される）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩である。
本発明の化合物は、式Ｉ：
【化2】
Ｒ１はＣ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、フルオロ等のハロで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロで置換されたＣ１～４アルキル、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択される１つ又は２つの置換基で任意に置換された芳香環系又は複素芳香環系であり、
Ｙ１はＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｏ（ＣＯ）及びＮＨＣ（Ｏ）からなる群より選択され、
Ｘ１はＮＨ、Ｏ又はＣＨ２であり、
ｎ１は０又は１であり、
Ｘ３は存在しないか、又はＮＲｙであり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立してＣ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル、Ｃ２～４アルキニル又はＨ、例えばＣＨ３又はＨであり、
ＬはＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）又はＣＨ２であり、
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、独立してＮ及びＣＨから選択され、
Ｒ３はＨ、ハロ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ａＲ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ａ、ＯＲ２ａ、ＮＲ２ａＲ２ｂ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ａ、ＮＲ２ａＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、１つ以上のハロで任意に置換されたＣ１～４アルキル、１つ以上のハロで任意に置換されたＣ２～４アルケニル、及び１つ以上のハロで任意に置換されたＣ２～４アルキニルからなる群より選択され、ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、独立してＨ、Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル及びＣ２～４アルキニルからなる群より選択される）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩である。
【0034】
一実施形態では、式Ｉの化合物は、式Ｉａ：
（式中、
Ｒ１がＣ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、フルオロ等のハロで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロで置換されたＣ１～４アルキル、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択され、
Ｒ２が水素であるか、又は、
Ｒ１がＲ２と共に、Ｃ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、フルオロ等のハロで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロで置換されたＣ１～４アルキル、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択される１つ若しくは２つの置換基で任意に置換された５員若しくは６員の芳香環、複素芳香環、環若しくは複素環を形成し、
Ｘ１、ｎ１、Ｙ１、Ｘ３、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｌ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｒ３は、式Ｉの化合物について定義されるとおりである）を有する化合物である。
【化3】
Ｒ１がＣ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、フルオロ等のハロで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－Ｙ１－、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロで置換されたＣ１～４アルキル、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択され、
Ｒ２が水素であるか、又は、
Ｒ１がＲ２と共に、Ｃ１～４アルキル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルケニル－Ｙ１－、Ｃ２～４アルキニル－Ｙ１－、フルオロ等のハロで置換されたＣ１～４アルキル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－Ｙ１－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－Ｙ１、ＨＯ－Ｃ１～４アルカンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルケンジイル－、ＨＯ－Ｃ２～４アルキンジイル－、Ｃ１～４アルキル－Ｃ２～４アルケニル－、Ｃ２～４アルキニル－、ハロで置換されたＣ１～４アルキル、ハロで置換されたＣ２～４アルケニル－、ハロで置換されたＣ２～４アルキニル－、及びハロゲンからなる群より選択される１つ若しくは２つの置換基で任意に置換された５員若しくは６員の芳香環、複素芳香環、環若しくは複素環を形成し、
Ｘ１、ｎ１、Ｙ１、Ｘ３、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｌ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｒ３は、式Ｉの化合物について定義されるとおりである）を有する化合物である。
【0035】
更なる実施形態では、式Ｉ及び式Ｉａの化合物において、Ｘ３がＮＲｙであり、式ＩＩ及び式ＩＩａ：
（Ｘ１、ｎ１、Ｙ１、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｌ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、式Ｉ及び式Ｉａの化合物について定義されるとおりである）の化合物が得られる。
【化4】
【0036】
更に他の実施形態では、式ＩＩ及び式ＩＩａの化合物において、Ｒ３がパラ位にあり、式ＩＩＩ及び式ＩＩＩａ：
（Ｘ１、ｎ１、Ｙ１、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｌ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、式Ｉ及び式Ｉａの化合物について定義されるとおりである）の化合物が得られる。
【化5】
【0037】
その他の実施形態では、式ＩＩＩ及び式ＩＩＩａの化合物において、Ｚ２がＣＨであり、式ＩＶ及び式ＩＶａ：
（Ｘ１、ｎ１、Ｙ１、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｌ、Ｚ１、Ｚ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、式Ｉ及び式Ｉａの化合物について定義されるとおりである）の化合物が得られる。
【化6】
【0038】
本発明による化合物の一実施形態では、Ｙ１はＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）及びＣ（Ｏ）ＮＨからなる群より選択される。更なる実施形態では、Ｙ１はＯ、Ｓ及びＮＨからなる群より選択される。その他の実施形態では、Ｙ１はＯである。
【0039】
本発明による化合物の別の実施形態では、Ｘ１はＮＨ又はＯである。また別の実施形態では、Ｘ１はＮＨ又はＯであり、ｎ１は１である。
【0040】
本発明による化合物の更なる実施形態では、Ｒｘ及びＲｙは、独立してＣ１～４アルキルである。その他の実施形態では、Ｒｘ及びＲｙはメチルである。
【0041】
本発明による化合物の一実施形態では、ＬはＯ、Ｓ及びＣＨ２からなる群より選択される。別の実施形態では、ＬはＯ及びＣＨ２からなる群より選択される。更に別の実施形態では、ＬはＯである。
【0042】
本発明による化合物の更なる実施形態では、Ｚ１はＣＨである。更に他の実施形態では、Ｚ１はＣＨであり、ＬはＯである。その他の実施形態では、Ｚ１はＣＨであり、Ｚ２はＣＨであり、ＬはＯである。
【0043】
本発明による化合物の別の実施形態では、Ｒ３はＨ、ハロ及びＣ（Ｏ）ＮＨ２からなる群より選択される。更に別の実施形態では、Ｒ３はハロ及びＣ（Ｏ）ＮＨ２からなる群より選択される。また別の実施形態では、Ｒ３はＣｌ及びＣ（Ｏ）ＮＨ２からなる群より選択される。更なる実施形態では、Ｒ３はＣｌである。
【0044】
式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ又は式ＩＶａを有する本発明による化合物の一実施形態では、Ｒ２はＨである。
【0045】
別の実施形態では、式ＩＶａの化合物は、以下の式Ｖ：
（Ｘ１、Ｙ１、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒ１及びＲ３は、式Ｉ及び式Ｉａの化合物について定義されるとおりである）を有する。式Ｖの化合物の更なる実施形態では、Ｘ１はＯであり、Ｒ１はＣ１～４アルキル－Ｏ－であり、Ｒ３はハロ又はＣ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒｘ及びＲｙは独立してＣ１～４アルキルである。
【化7】
【0046】
現在好ましい実施形態では、本発明による化合物は、
からなる群より選択される。
【化8】
【0047】
医薬製剤
本発明の化合物は、医薬品としての使用を意図している。本発明の化合物は、原則として、それら自体で適用され得るが、好ましくは薬学的に受容可能な担体と共に製剤化される。薬学的に許容可能な担体は、各投与方法に適した不活性担体であり、従来の薬学的な調製物（錠剤、顆粒、カプセル剤、粉末、溶液、懸濁液、エマルジョン、注射剤、輸液剤等）に製剤化することができる。かかる担体として、例えば、薬学的に許容可能な結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤等が言及され得る。注射液又は輸液として使用する場合、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液を用いて製剤化することができる。
本発明の化合物は、医薬品としての使用を意図している。本発明の化合物は、原則として、それら自体で適用され得るが、好ましくは薬学的に受容可能な担体と共に製剤化される。薬学的に許容可能な担体は、各投与方法に適した不活性担体であり、従来の薬学的な調製物（錠剤、顆粒、カプセル剤、粉末、溶液、懸濁液、エマルジョン、注射剤、輸液剤等）に製剤化することができる。かかる担体として、例えば、薬学的に許容可能な結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤等が言及され得る。注射液又は輸液として使用する場合、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液を用いて製剤化することができる。
【0048】
本発明の化合物の投与方法は特に限定されず、通常の経口又は非経口（静脈内、筋肉内、皮下、経皮、鼻腔内、経粘膜、経腸等）の投与方法を適用することができる。
【0049】
本発明のテトラヒドロイソキノリン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の投与量は、有効成分として用いられる化合物の効力又は特性に応じて、薬理学的効果を発揮するのに十分な有効量の範囲で任意に設定され得る。投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、又は状態に応じて変動する場合がある。
【0050】
薬学的有用性
本発明の化合物は、ＩＬ－１βの阻害に反応性の疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療を意図している。したがって、一態様では、本発明は、医薬品として使用される本発明による化合物又は組成物に関する。更なる態様では、本発明は、ＩＬ－１βの阻害に反応性の疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療に使用される本発明による化合物又は組成物に関する。一実施形態では、ＩＬ－１βの阻害に反応性の疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、自己炎症性疾患、心血管疾患、変形性関節症、肺癌及び痛風からなる群より選択される。更なる実施形態では、疾患はＮＡＳＨである。更に他の実施形態では、疾患はＩＰＦである。
本発明の化合物は、ＩＬ－１βの阻害に反応性の疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療を意図している。したがって、一態様では、本発明は、医薬品として使用される本発明による化合物又は組成物に関する。更なる態様では、本発明は、ＩＬ－１βの阻害に反応性の疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療に使用される本発明による化合物又は組成物に関する。一実施形態では、ＩＬ－１βの阻害に反応性の疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、自己炎症性疾患、心血管疾患、変形性関節症、肺癌及び痛風からなる群より選択される。更なる実施形態では、疾患はＮＡＳＨである。更に他の実施形態では、疾患はＩＰＦである。
【0051】
Ｘ１がＮＲｙである化合物の調製
本発明の式ＩＩ及び式ＩＩａの置換ピリジン－スルホンアミドは概して、スキーム１に概説されているように調製される中間体Ｃを介して調製される。
本発明の式ＩＩ及び式ＩＩａの置換ピリジン－スルホンアミドは概して、スキーム１に概説されているように調製される中間体Ｃを介して調製される。
【化9】
【0052】
第１の工程では、５，６－ジクロロピリジン－３－スルホンアミドＡをアルキル化して中間化合物Ｂを得て、これを次いでマイクロ波照射下で対応する二環式アミンを用いたバックワルド型（Buchwald-type）反応により化合物Ｃに変換する。
【化10】
【0053】
Ｒｘ、Ｒｙ及びＲ３の同一性に応じて、中間体Ｃの調製は、スキーム１に記載されているものからの保護／脱保護反応等の追加の合成変換を必要とする場合がある。
【0054】
Ｘ１の存在及び／又は同一性に応じて、本発明による化合物はスキーム２ｂ、２ｃ又は２ｄに従って調製され得る。
【0055】
【化11】
マイクロ波照射下にて１５０℃での対応するボロン酸を用いた中間化合物ＣのＰｄ触媒鈴木型反応は、ＩＩｂ型の化合物をもたらす（化合物１等；Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21(10), 3152-3158と同様の合成手順）。
【0056】
【化12】
強塩基の存在下での４０℃での置換アニリンを用いた中間化合物ＣのＰｄ触媒バックワルド反応により、ＩＩｃ型の化合物が得られる（化合物２、３、４、６等；Org. Lett. 2011, 13(8), 1984-1987と同様の合成手順）。
【0057】
【化13】
ＩＩｄ型の化合物（化合物５、７、８、９、１０、１２等）は、マイクロ波照射下にて１５０℃で水素化ナトリウム及び炭酸セシウムの存在下において対応するフェノールを用いた中間体Ｃのウルマン型反応によって得られる（J. Am. Chem. Soc. 2013, 135(24), 9213-9219と同様の合成手順）。
【0058】
Ｘ３が存在しない化合物の調製
Ｘ３が存在しない、本発明の式Ｉ及び式Ｉａの置換ピリジン－スルホンアミドは概して、スキーム３に概説されているように調製される中間体Ｅを介して調製される。
Ｘ３が存在しない、本発明の式Ｉ及び式Ｉａの置換ピリジン－スルホンアミドは概して、スキーム３に概説されているように調製される中間体Ｅを介して調製される。
【0059】
【化14】
中間化合物Ｃの調製と同様であるが、Ｄ型化合物、例えば最終化合物１１の合成の場合の２，３－ジクロロ－５－（メチルスルホニル）ピリジンを出発物質として用いた手順。
【実施例】
【0060】
実施例１－Ｒｘ及びＲｙがメチルである中間体Ｂ：Ｎ，Ｎ－ジメチル－５，６－ジクロロピリジン－３－スルホンアミドの合成
無水ＤＭＦ（１ｍｌ／当量）中の市販の５，６－ジクロロピリジン－３－スルホンアミドＡ（１当量）及びＫ２ＣＯ３（２当量）の懸濁液に、ＤＭＦ（５ｍｌ／ｍｍｏｌ）中のヨードメタン（２当量）を添加し、得られた混合物を反応が完了するまで室温で撹拌した（一晩、ＴＬＣ対照）。次いで、溶媒を蒸発させ、酢酸エチルを添加した。有機混合物を水で２回洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒の蒸発後に得られた粗生成物は、精製することなく実施例２に使用するのに十分なほど純粋であった（黄色の固体、収率９５％）。
無水ＤＭＦ（１ｍｌ／当量）中の市販の５，６－ジクロロピリジン－３－スルホンアミドＡ（１当量）及びＫ２ＣＯ３（２当量）の懸濁液に、ＤＭＦ（５ｍｌ／ｍｍｏｌ）中のヨードメタン（２当量）を添加し、得られた混合物を反応が完了するまで室温で撹拌した（一晩、ＴＬＣ対照）。次いで、溶媒を蒸発させ、酢酸エチルを添加した。有機混合物を水で２回洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒の蒸発後に得られた粗生成物は、精製することなく実施例２に使用するのに十分なほど純粋であった（黄色の固体、収率９５％）。
【0061】
実施例２－Ｒｘ及びＲｙがメチルであり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３がＣＨであり、ＬがＯであり、Ｒ３がパラ位のＣｌである中間体Ｃ：Ｎ，Ｎ－ジメチル－５－クロロ－６－（４－（４－クロロフェノキシ）－Ｎ－ピペリジニル）－ピリジン－３－スルホンアミドの合成
ＥｔＯＨ（４．８ｍｌ／ｍｍｏｌ）中の実施例１で得られた化合物（１当量）、市販の４－（４－クロロフェノキシ）ピペリジン塩酸塩（１．２当量）及びＴＥＡ（２．２当量）の混合物を、初めに８０℃で５分間、続いて１２０℃で３０分間、マイクロ波照射（２００Ｗ）下で加熱した（ＨＰＬＣ対照）。次いで、溶媒を蒸発させ、酢酸エチルを添加した。有機混合物を水で２回洗浄し、合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させた後に得られた粗生成物は、精製することなくその後の実施例に使用するのに十分なほど純粋であった（透明な褐色の固体、収率９１％）。
ＥｔＯＨ（４．８ｍｌ／ｍｍｏｌ）中の実施例１で得られた化合物（１当量）、市販の４－（４－クロロフェノキシ）ピペリジン塩酸塩（１．２当量）及びＴＥＡ（２．２当量）の混合物を、初めに８０℃で５分間、続いて１２０℃で３０分間、マイクロ波照射（２００Ｗ）下で加熱した（ＨＰＬＣ対照）。次いで、溶媒を蒸発させ、酢酸エチルを添加した。有機混合物を水で２回洗浄し、合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させた後に得られた粗生成物は、精製することなくその後の実施例に使用するのに十分なほど純粋であった（透明な褐色の固体、収率９１％）。
【0062】
実施例３－Ｒｘ及びＲｙがメチルであり、Ｚ１、Ｚ３がＣＨであり、Ｚ２がＮであり、ＬがＯであり、Ｒ３がパラ位のＣ（Ｏ）ＮＨ２である中間体Ｃ：Ｎ，Ｎ－ジメチル－５－クロロ－６－［４－（５－［２－カルボキサミド－ピリジン］イルオキシ）－Ｎ’－ピペリジニル］－ピリジン－３－スルホンアミドの合成
ＥｔＯＨ（４．８ｍｌ／ｍｍｏｌ）中の実施例１で得られた化合物（１当量）、市販の４－（ピペリジン－４－イルオキシ）ピリジン－２－カルボキサミド（１．２当量）及びＴＥＡ（２．２当量）の混合物を、初めに８０℃で５分間、続いて１２０℃で３０分間、マイクロ波照射（２００Ｗ）下で加熱した（ＨＰＬＣ対照）。次いで、溶媒を蒸発させ、酢酸エチルを添加した。有機混合物を水で２回洗浄し、合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させた後に得られた粗生成物は、精製することなく次の工程に使用するのに十分なほど純粋であった（透明な白色の固体、収率９３％）。
ＥｔＯＨ（４．８ｍｌ／ｍｍｏｌ）中の実施例１で得られた化合物（１当量）、市販の４－（ピペリジン－４－イルオキシ）ピリジン－２－カルボキサミド（１．２当量）及びＴＥＡ（２．２当量）の混合物を、初めに８０℃で５分間、続いて１２０℃で３０分間、マイクロ波照射（２００Ｗ）下で加熱した（ＨＰＬＣ対照）。次いで、溶媒を蒸発させ、酢酸エチルを添加した。有機混合物を水で２回洗浄し、合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させた後に得られた粗生成物は、精製することなく次の工程に使用するのに十分なほど純粋であった（透明な白色の固体、収率９３％）。
【0063】
実施例４－化合物１の合成
ＤＭＥ（５ｍｌ／ｍｍｏｌ）中の実施例２で得られた中間体（１当量）、ベンゾ［ｂ］フラン－５－ボロン酸（１．１当量）、炭酸カリウム（１．４当量）及びＰｄ（ＰｈＰｈ３）４（０．１当量）の溶液を、１５０℃でマイクロ波照射（２００Ｗ）下にて１時間（又は１５０℃で一晩）加熱した。次いで、粗混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、セライトプラグに通して濾過し、ＥｔＯＡｃ及びＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル／水）によって精製して、純粋な生成物を得た。白色の泡状物質、全収率４５％、ＨＰＬＣ純度９８％。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.51 (d, 1H), 7.68 (d, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.22 (d, 2H), 6.86-6.81 (m, 3H), 4.64 (t, 2H), 4.42-4.38 (m, 2H), 3.61-3.55 (m, 2H), 3.27 (t, 2H), 3.19-3.18 (m, 2H), 2.76 (s, 6H),1.94-1.89 (m, 2H), 1.76-1.70 (m, 2H). C26H29ClN3O4S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 514.1583 (M+1).
ＤＭＥ（５ｍｌ／ｍｍｏｌ）中の実施例２で得られた中間体（１当量）、ベンゾ［ｂ］フラン－５－ボロン酸（１．１当量）、炭酸カリウム（１．４当量）及びＰｄ（ＰｈＰｈ３）４（０．１当量）の溶液を、１５０℃でマイクロ波照射（２００Ｗ）下にて１時間（又は１５０℃で一晩）加熱した。次いで、粗混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、セライトプラグに通して濾過し、ＥｔＯＡｃ及びＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル／水）によって精製して、純粋な生成物を得た。白色の泡状物質、全収率４５％、ＨＰＬＣ純度９８％。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.51 (d, 1H), 7.68 (d, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.22 (d, 2H), 6.86-6.81 (m, 3H), 4.64 (t, 2H), 4.42-4.38 (m, 2H), 3.61-3.55 (m, 2H), 3.27 (t, 2H), 3.19-3.18 (m, 2H), 2.76 (s, 6H),1.94-1.89 (m, 2H), 1.76-1.70 (m, 2H). C26H29ClN3O4S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 514.1583 (M+1).
【0064】
実施例５－化合物２の合成
磁気撹拌子を備えるスクリューキャップ付試験管に、ＢｒｅｔｔＰｈｏｓプレ触媒（４ｍｏｌ％）、２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］フラン－５－アミン（１当量）及び実施例２で得られた中間化合物（１当量）を投入した。バイアルをテフロンスクリューキャップで密閉し、排気し、窒素を再充填した。この手順を更に２回繰り返した。次いで、ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１Ｍ、２．５当量）を添加した。反応混合物を反応が完了するまで４０℃で撹拌した（２．５時間）。溶液を室温まで冷却し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５ｍＬ）の添加によってクエンチした後、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機相を分離し、水相を再度ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、粗物質（crude）をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル／水）によって精製して、不純な生成物（１１５．７ｍｇ）を得て、これを同じシステムによって再び精製した。褐色の固体、全収率６％、ＨＰＬＣ純度９６％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.34 (s, 1H), 7,96 (bs, 1H), 7.24 (dd, 2H), 7.03 (s,1H), 6.96 (dd, 1H), 6.85-6.79 (m, 3H), 5.88 (s, 1H), 4.63 (t, 2H), 4.48 (m, 1H), 3.76-3.73 (m, 2H), 3.45 (m, 2H), 3.23 (t, 2H), 2.80 (s, 6H),1.99-1.94 (m, 2H), 1.82 (m, 2H). C26H30ClN4O4S,
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 529.1677 (M+1).
磁気撹拌子を備えるスクリューキャップ付試験管に、ＢｒｅｔｔＰｈｏｓプレ触媒（４ｍｏｌ％）、２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］フラン－５－アミン（１当量）及び実施例２で得られた中間化合物（１当量）を投入した。バイアルをテフロンスクリューキャップで密閉し、排気し、窒素を再充填した。この手順を更に２回繰り返した。次いで、ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１Ｍ、２．５当量）を添加した。反応混合物を反応が完了するまで４０℃で撹拌した（２．５時間）。溶液を室温まで冷却し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５ｍＬ）の添加によってクエンチした後、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機相を分離し、水相を再度ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、粗物質（crude）をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル／水）によって精製して、不純な生成物（１１５．７ｍｇ）を得て、これを同じシステムによって再び精製した。褐色の固体、全収率６％、ＨＰＬＣ純度９６％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.34 (s, 1H), 7,96 (bs, 1H), 7.24 (dd, 2H), 7.03 (s,1H), 6.96 (dd, 1H), 6.85-6.79 (m, 3H), 5.88 (s, 1H), 4.63 (t, 2H), 4.48 (m, 1H), 3.76-3.73 (m, 2H), 3.45 (m, 2H), 3.23 (t, 2H), 2.80 (s, 6H),1.99-1.94 (m, 2H), 1.82 (m, 2H). C26H30ClN4O4S,
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 529.1677 (M+1).
【0065】
実施例６－化合物５の合成
２，３－ジヒドロ－５－ヒドロキシベンゾ［ｂ］フラン（１．１当量）及び炭酸セシウム（１．２当量）を無水ＤＭＦ（１．２ｍｌ／ｍｍｏｌ）に取り、無溶媒の（neat）水素化ナトリウム（１．１当量）で処理した。水素発生が停止した後に、実施例２で得られた中間化合物（１当量）を添加し、反応物を、反応が更に生じなくなるまで密閉圧力管内（一晩）又はマイクロ波照射（２００Ｗ）下（２時間）にて１５０℃で撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を酢酸エチル（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）及び水（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）で希釈した。水層を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を２Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、乾燥させ、真空下で濃縮した。粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル－水勾配）によって精製して不純な生成物を得て、これを分取クロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン／酢酸エチル ４：１）によって精製した。透明な油、全収率１２％、ＨＰＬＣ純度１００％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.30 (dd, 1H), 7.247-7.22 (m, 3H), 6.86-6.81 (m, 3H), 6.75-6.70 (m, 2H), 4.61 (t, 2H), 4.50-4.47 (m, 1H), 4.00-3.97 (m, 2H), 3.66-3.63 (m, 2H), 3.21 (t, 2H), 2.67 (s, 6H), 2-06-1.99 (m, 2H), 1.90-1.84 (m, 2H). C26H28ClN3O5S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 530.1550 (M+1).
２，３－ジヒドロ－５－ヒドロキシベンゾ［ｂ］フラン（１．１当量）及び炭酸セシウム（１．２当量）を無水ＤＭＦ（１．２ｍｌ／ｍｍｏｌ）に取り、無溶媒の（neat）水素化ナトリウム（１．１当量）で処理した。水素発生が停止した後に、実施例２で得られた中間化合物（１当量）を添加し、反応物を、反応が更に生じなくなるまで密閉圧力管内（一晩）又はマイクロ波照射（２００Ｗ）下（２時間）にて１５０℃で撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を酢酸エチル（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）及び水（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）で希釈した。水層を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を２Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、乾燥させ、真空下で濃縮した。粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル－水勾配）によって精製して不純な生成物を得て、これを分取クロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン／酢酸エチル ４：１）によって精製した。透明な油、全収率１２％、ＨＰＬＣ純度１００％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.30 (dd, 1H), 7.247-7.22 (m, 3H), 6.86-6.81 (m, 3H), 6.75-6.70 (m, 2H), 4.61 (t, 2H), 4.50-4.47 (m, 1H), 4.00-3.97 (m, 2H), 3.66-3.63 (m, 2H), 3.21 (t, 2H), 2.67 (s, 6H), 2-06-1.99 (m, 2H), 1.90-1.84 (m, 2H). C26H28ClN3O5S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 530.1550 (M+1).
【0066】
実施例７－化合物７の合成
４－エトキシフェノール（１．１当量）及び炭酸セシウム（１．２当量）を無水ＤＭＦ（１．２ｍｌ／ｍｍｏｌ）に取り、無溶媒の水素化ナトリウム（１．１当量）で処理した。水素発生が停止した後に、実施例２で得られた中間体（１当量）を添加し、反応物を、反応が更に生じなくなるまで密閉圧力管内（一晩）又はマイクロ波照射（２００Ｗ）下（２時間）にて１５０℃で撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を酢酸エチル（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）及び水（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）で希釈した。水層を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を２Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、乾燥させ、真空下で濃縮した。粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル－水勾配）によって精製して、未反応の出発物質及び純粋な生成物を回収した。透明な褐色の固体、収率４１％、ＨＰＬＣ純度１００％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.31 (d, 1H), 7.26-7.23 (m, 4H), 6.88-6.84 (m, 5H), 4.51-4.46 (1H, m), 4.05-4.00 (m, 4H), 3.66-3.59 (m, 2H), 2.67 (s, 6H), 2.00-1.86 (m, 2H), 1.86-1.83 (m, 2H), .43 (t, 3H). C26H30ClO5S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 532.1680 (M+1).
４－エトキシフェノール（１．１当量）及び炭酸セシウム（１．２当量）を無水ＤＭＦ（１．２ｍｌ／ｍｍｏｌ）に取り、無溶媒の水素化ナトリウム（１．１当量）で処理した。水素発生が停止した後に、実施例２で得られた中間体（１当量）を添加し、反応物を、反応が更に生じなくなるまで密閉圧力管内（一晩）又はマイクロ波照射（２００Ｗ）下（２時間）にて１５０℃で撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を酢酸エチル（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）及び水（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）で希釈した。水層を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を２Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、乾燥させ、真空下で濃縮した。粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル－水勾配）によって精製して、未反応の出発物質及び純粋な生成物を回収した。透明な褐色の固体、収率４１％、ＨＰＬＣ純度１００％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.31 (d, 1H), 7.26-7.23 (m, 4H), 6.88-6.84 (m, 5H), 4.51-4.46 (1H, m), 4.05-4.00 (m, 4H), 3.66-3.59 (m, 2H), 2.67 (s, 6H), 2.00-1.86 (m, 2H), 1.86-1.83 (m, 2H), .43 (t, 3H). C26H30ClO5S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 532.1680 (M+1).
【0067】
実施例８－化合物８の合成
４－エトキシフェノール（１．１当量）及び炭酸セシウム（１．２当量）を無水ＤＭＦ（１．２ｍｌ／ｍｍｏｌ）に取り、無溶媒の水素化ナトリウム（１．１当量）で処理した。水素発生が停止した後に、実施例３で得られた中間体（１当量）を添加し、反応物を、反応が更に生じなくなるまで密閉圧力管内（一晩）又はマイクロ波照射（２００Ｗ）下（３時間）にて１５０℃で撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を酢酸エチル（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）及び水（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）で希釈した。水層を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を２Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、乾燥させ、真空下で濃縮した。粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル－水勾配）によって精製して、未反応の出発物質及び純粋な生成物を回収した。透明な褐色の固体、収率１６％、ＨＰＬＣ純度１００％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.38 (d, 1H), 8.34 (s, 1H), 6.98-6.97 (m, 1H), 6.89 (s, 1H), 5.59 (bs, 1H), 4.79-4.75 (m, 1H), 4.06-3.63 (m, 4H), 3.69-3.63 (m, 2H), 2.68 (s, 6H), 2-10-2.06 (m, 2H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.44 (t, 3H). C26H31N5O6S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 542.2084 (M+1).
４－エトキシフェノール（１．１当量）及び炭酸セシウム（１．２当量）を無水ＤＭＦ（１．２ｍｌ／ｍｍｏｌ）に取り、無溶媒の水素化ナトリウム（１．１当量）で処理した。水素発生が停止した後に、実施例３で得られた中間体（１当量）を添加し、反応物を、反応が更に生じなくなるまで密閉圧力管内（一晩）又はマイクロ波照射（２００Ｗ）下（３時間）にて１５０℃で撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を酢酸エチル（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）及び水（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）で希釈した。水層を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を２Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、乾燥させ、真空下で濃縮した。粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル－水勾配）によって精製して、未反応の出発物質及び純粋な生成物を回収した。透明な褐色の固体、収率１６％、ＨＰＬＣ純度１００％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.38 (d, 1H), 8.34 (s, 1H), 6.98-6.97 (m, 1H), 6.89 (s, 1H), 5.59 (bs, 1H), 4.79-4.75 (m, 1H), 4.06-3.63 (m, 4H), 3.69-3.63 (m, 2H), 2.68 (s, 6H), 2-10-2.06 (m, 2H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.44 (t, 3H). C26H31N5O6S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 542.2084 (M+1).
【0068】
実施例９－化合物１２の合成
２，３－ジヒドロ－５－ヒドロキシベンゾ［ｂ］フラン（１．１当量）及び炭酸セシウム（１．２当量）を無水ＤＭＦ（１．２ｍｌ／ｍｍｏｌ）に取り、無溶媒の水素化ナトリウム（１．１当量）で処理した。水素発生が停止した後に、実施例３で得られた中間体（１当量）を添加し、反応物を、反応が更に生じなくなるまで密閉圧力管内（一晩）又はマイクロ波照射（２００Ｗ）下（２．５時間）にて１５０℃で撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を酢酸エチル（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）及び水（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）で希釈した。水層を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を２Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、乾燥させ、真空下で濃縮した。粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル－水勾配）によって精製して、未反応の出発物質及び純粋な生成物を回収した。白色の泡状物質、収率１３％、ＨＰＬＣ純度９８％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.38 (d, 1H), 8.31 (d, 1H), 7.24 (d, 1H), 6.97-6.96 (m, 1H), 6.82 (d, 1H), 6.76-6.69 (m, 2H), 5.63 (bs, 1H), 4.79-4.76 (m, 2H), 4.62 (t, 2H), 4.02-4.00 (m, 2H), 3.68-3.63 (m, 2H), 3.22 (t, 2H), 2.68 (s, 6H), 2.12-2.08 (m, 2H), 1.93-1.89 (m, 2H). C26H29N5O6S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 540.1944 (M+1).
２，３－ジヒドロ－５－ヒドロキシベンゾ［ｂ］フラン（１．１当量）及び炭酸セシウム（１．２当量）を無水ＤＭＦ（１．２ｍｌ／ｍｍｏｌ）に取り、無溶媒の水素化ナトリウム（１．１当量）で処理した。水素発生が停止した後に、実施例３で得られた中間体（１当量）を添加し、反応物を、反応が更に生じなくなるまで密閉圧力管内（一晩）又はマイクロ波照射（２００Ｗ）下（２．５時間）にて１５０℃で撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を酢酸エチル（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）及び水（６ｍｌ／ｍｍｏｌ）で希釈した。水層を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を２Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、乾燥させ、真空下で濃縮した。粗生成物をＩｓｏｌｅｒａ Ｂｉｏｔａｇｅシステム（Ｃ１８、アセトニトリル－水勾配）によって精製して、未反応の出発物質及び純粋な生成物を回収した。白色の泡状物質、収率１３％、ＨＰＬＣ純度９８％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.38 (d, 1H), 8.31 (d, 1H), 7.24 (d, 1H), 6.97-6.96 (m, 1H), 6.82 (d, 1H), 6.76-6.69 (m, 2H), 5.63 (bs, 1H), 4.79-4.76 (m, 2H), 4.62 (t, 2H), 4.02-4.00 (m, 2H), 3.68-3.63 (m, 2H), 3.22 (t, 2H), 2.68 (s, 6H), 2.12-2.08 (m, 2H), 1.93-1.89 (m, 2H). C26H29N5O6S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 540.1944 (M+1).
【0069】
実施例１０－Ｒｘがメチルであり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３がＣＨであり、ＬがＯであり、Ｒ３がパラ位のＣｌである中間体Ｅ：３－クロロ－２－［４－（４－クロロフェノキシ）－Ｎ－ピペリジニル］－５－メチルスルホニル－ピリジンの合成
実施例２による中間化合物の合成と同様であるが、市販の２，３－ジクロロ－５－（メチルスルホニル）ピリジンを出発物質として用いた手順。白色の固体、全収率９６％。
実施例２による中間化合物の合成と同様であるが、市販の２，３－ジクロロ－５－（メチルスルホニル）ピリジンを出発物質として用いた手順。白色の固体、全収率９６％。
【0070】
実施例１１－化合物１１の合成
実施例６～９における化合物５、７、８及び１２の合成と同様であるが、実施例１０で得られた中間化合物を出発物質として用いた手順。６時間。透明な油、全収率１６％、ＨＰＬＣ純度９５％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.45 (s, 1H), 7.35 (d, 1H),7.26 (dd, 2H), 6.85 (d, 2H), 4.52-4.48 (m, 1H), 4.04-4.00 (m, 4H), 3.72-3.66 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 2.05-1.99 (m, 2H), 1.90-1.84 (m, 2H), 1.43 (t, 3H). C25H28ClN2O5S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 503.1398 (M+1).
実施例６～９における化合物５、７、８及び１２の合成と同様であるが、実施例１０で得られた中間化合物を出発物質として用いた手順。６時間。透明な油、全収率１６％、ＨＰＬＣ純度９５％（２５４ｎｍ）。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) = 8.45 (s, 1H), 7.35 (d, 1H),7.26 (dd, 2H), 6.85 (d, 2H), 4.52-4.48 (m, 1H), 4.04-4.00 (m, 4H), 3.72-3.66 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 2.05-1.99 (m, 2H), 1.90-1.84 (m, 2H), 1.43 (t, 3H). C25H28ClN2O5S
ＭＳ（エレクトロスプレー）：m/z= 503.1398 (M+1).
【0071】
実施例１２－ＬＰＳでチャレンジしたヒト初代マクロファージにおけるＩＬ－１βのｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
材料
材料
【0072】
【表1】
【0073】
ＲＰＭＩ １６４０成長培地の調製
ＲＰＭＩ １６４０基礎培地をデータシート上の製造業者の指示に従って調製した。５ｍＬの培地を用いて、５％ＣＯ２を連続供給する３７℃のインキュベーターで４８時間滅菌確認を行った。滅菌確認後に、基礎培地をＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質の添加によって完全にした。培地を更に使用するまで４℃で保管した。
ＲＰＭＩ １６４０基礎培地をデータシート上の製造業者の指示に従って調製した。５ｍＬの培地を用いて、５％ＣＯ２を連続供給する３７℃のインキュベーターで４８時間滅菌確認を行った。滅菌確認後に、基礎培地をＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質の添加によって完全にした。培地を更に使用するまで４℃で保管した。
【0074】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の調製
１袋のＰＢＳを１ＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解した。ＰＢＳを０．２２μｍ濾過膜に通して濾過し、更に使用するまで４℃で保管した。
１袋のＰＢＳを１ＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解した。ＰＢＳを０．２２μｍ濾過膜に通して濾過し、更に使用するまで４℃で保管した。
【0075】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製
血清を含まない５ｍＬのＲＰＭＩ培地（１：１）を、ＥＤＴＡ又はクエン酸ナトリウム中の５ｍＬのヒト全血のサンプルに添加し、逆さにすることによって十分に混合した。３ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を１５ｍＬ容コニカル遠心分離管に添加し、室温にした。トランスファーピペットを用いて、１０ｍＬの血液－ＲＰＭＩ混合物をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７上に慎重に重層し、４００×ｇにて室温で正確に３０分間遠心分離した。
血清を含まない５ｍＬのＲＰＭＩ培地（１：１）を、ＥＤＴＡ又はクエン酸ナトリウム中の５ｍＬのヒト全血のサンプルに添加し、逆さにすることによって十分に混合した。３ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を１５ｍＬ容コニカル遠心分離管に添加し、室温にした。トランスファーピペットを用いて、１０ｍＬの血液－ＲＰＭＩ混合物をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７上に慎重に重層し、４００×ｇにて室温で正確に３０分間遠心分離した。
【0076】
遠心分離後に、パスツールピペットを用いて単核細胞を含有する不透明な界面から０．５ｃｍまでの上層を吸引した。上層を捨てた。パスツールピペットを用いて、不透明な界面を清浄なコニカル遠心分離管に慎重に移した。５ｍＬのＲＰＭＩを管に添加し、逆さにすることによって混合し、続いて２５０×ｇで正確に１０分間遠心分離した。上清を吸引し、捨てた。
【0077】
白血球ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩで再懸濁し、パスツールピペットで静かに混合し、続いて２５０×ｇで正確に１０分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳで３回洗浄し、ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。
【0078】
１ｍＬ当たりの生存ＰＢＭＣの数を計数した。
【0079】
ＰＢＭＣの計数
１０μＬのＰＢＭＣ懸濁液を９０μＬのＰＢＳ培地で希釈した（１０倍希釈）。２０μＬの細胞懸濁液を２０μＬのトリパンブルー溶液に添加し（１：１比）、エアロゾル形成を回避するために慎重に混合した。血球計にカバーガラス下の領域が十分に満たされるまで細胞培養混合物をロードした。懸濁液を計数前に血球計内で少なくとも１０秒間沈降させた。
１０μＬのＰＢＭＣ懸濁液を９０μＬのＰＢＳ培地で希釈した（１０倍希釈）。２０μＬの細胞懸濁液を２０μＬのトリパンブルー溶液に添加し（１：１比）、エアロゾル形成を回避するために慎重に混合した。血球計にカバーガラス下の領域が十分に満たされるまで細胞培養混合物をロードした。懸濁液を計数前に血球計内で少なくとも１０秒間沈降させた。
【0080】
生存細胞及び死細胞の数を１つのチャンバーの４隅の１ｍｍの正方形において計数した。生存ＰＢＭＣは透明であり、非生存ＰＢＭＣは青色である。任意の隅の正方形の上のライン又は垂直外周ラインのいずれかに触れている細胞は含めた。任意の隅の正方形の下のライン又は右の垂直外周ラインのいずれかに触れている細胞は計数しなかった。
【0081】
細胞数の算出
１ｍＬ当たりの生存ＰＢＭＣの数の算出：
ＰＢＭＣ／ｍＬ＝４つ全ての正方形中のＰＢＭＣ×１０×２×１０４／４
１０４＝１ｍＬへの体積換算係数；
１０＝細胞懸濁液の希釈係数；
２＝トリパンブルーによる希釈係数
全細胞数＝ＰＢＭＣ／ｍＬ×ＰＢＭＣ懸濁液の全体積（ｍＬ）
％細胞生存性＝（計数された生存細胞の数／計数された細胞の総数（生存＋死））×１００
１ｍＬ当たりの生存ＰＢＭＣの数の算出：
ＰＢＭＣ／ｍＬ＝４つ全ての正方形中のＰＢＭＣ×１０×２×１０４／４
１０４＝１ｍＬへの体積換算係数；
１０＝細胞懸濁液の希釈係数；
２＝トリパンブルーによる希釈係数
全細胞数＝ＰＢＭＣ／ｍＬ×ＰＢＭＣ懸濁液の全体積（ｍＬ）
％細胞生存性＝（計数された生存細胞の数／計数された細胞の総数（生存＋死））×１００
【0082】
細胞の播種、分化及び処理
全体積２００μＬ／ウェルの２×１０５個のＰＢＭＣを９６ウェルプレートにプレーティングし、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で４時間インキュベートして、単球を沈降させ、リンパ球を懸濁したままにした。インキュベーション後に１００μＬを各ウェルから吸引して、リンパ球集団を確実に除去した。
全体積２００μＬ／ウェルの２×１０５個のＰＢＭＣを９６ウェルプレートにプレーティングし、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で４時間インキュベートして、単球を沈降させ、リンパ球を懸濁したままにした。インキュベーション後に１００μＬを各ウェルから吸引して、リンパ球集団を確実に除去した。
【0083】
単球を２００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（４ｍｇ／ｍＬストック）の添加によってマクロファージに分化させ、３７℃／５％ＣＯ２で６日間インキュベートした。ウェル内の培地の体積の半分を除去し、新鮮ＲＰＭＩ完全培地及び組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを再補充することによって培地を２日に１回交換した。
【0084】
分化後に、細胞を全体積５０μＬで、０．５％の最終ＤＭＳＯパーセンタイルを維持しながら本発明による化合物により二連で処理した。プレートを、３７℃／５％ＣＯ２に維持したインキュベーターに２時間移した。細胞を全体積５０μＬで１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（４回）（１ｍｇ／ｍＬストック）によって刺激した。
【0085】
プレートを、３７℃／５％ＣＯ２に維持したインキュベーターに１６時間移した。
【0086】
ＥＬＩＳＡによるサイトカイン推定
１． プレコートＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを吸引し、各ウェルを洗浄バッファー（３００μＬ）で満たすことによって洗浄バッファー（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０；ｐＨ７．２～７．４）で洗浄した。プロセスを２回繰り返し、計３回洗浄した。各工程で液体を完全に除去した。最後の洗浄の後に、残りの洗浄バッファーを全て除去した。
２． ３００μＬのブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）を各ウェルに添加することによってプレートをブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。
３． 工程１と同様の吸引／洗浄を繰り返した。
４． 試薬希釈液（ＰＢＳ（ｐＨ７．２～７．４）中の０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中で調製した１００μＬのサンプル又は標準を添加した。ウェルを接着ストリップで覆い、室温で２時間インキュベートした。
５． 工程１と同様の吸引／洗浄を繰り返した。
６． 試薬希釈液で希釈した１００μＬの検出抗体を各ウェルに添加した。ウェルを新たな接着ストリップで覆い、室温で２時間インキュベートした。
７． 工程１と同様の吸引／洗浄を繰り返した。
８． １００μＬの希釈標準溶液（working dilution）（ストックの２００倍）及びストレプトアビジン－ＨＲＰを各ウェルに添加した。プレートを覆い、室温で２０分間インキュベートした。
９． １００μＬの基質溶液（Ｈ２Ｏ２及びテトラメチルベンジジンの１：１混合物）を各ウェルに添加し、室温で２０分間インキュベートした。
１０． ５０μＬの停止液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を各ウェルに添加した。プレートを静かにタッピングし、完全な混合を確実にした。
１１． 各ウェルの光学密度を、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ）を用いて即座に決定した。
１． プレコートＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを吸引し、各ウェルを洗浄バッファー（３００μＬ）で満たすことによって洗浄バッファー（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０；ｐＨ７．２～７．４）で洗浄した。プロセスを２回繰り返し、計３回洗浄した。各工程で液体を完全に除去した。最後の洗浄の後に、残りの洗浄バッファーを全て除去した。
２． ３００μＬのブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）を各ウェルに添加することによってプレートをブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。
３． 工程１と同様の吸引／洗浄を繰り返した。
４． 試薬希釈液（ＰＢＳ（ｐＨ７．２～７．４）中の０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中で調製した１００μＬのサンプル又は標準を添加した。ウェルを接着ストリップで覆い、室温で２時間インキュベートした。
５． 工程１と同様の吸引／洗浄を繰り返した。
６． 試薬希釈液で希釈した１００μＬの検出抗体を各ウェルに添加した。ウェルを新たな接着ストリップで覆い、室温で２時間インキュベートした。
７． 工程１と同様の吸引／洗浄を繰り返した。
８． １００μＬの希釈標準溶液（working dilution）（ストックの２００倍）及びストレプトアビジン－ＨＲＰを各ウェルに添加した。プレートを覆い、室温で２０分間インキュベートした。
９． １００μＬの基質溶液（Ｈ２Ｏ２及びテトラメチルベンジジンの１：１混合物）を各ウェルに添加し、室温で２０分間インキュベートした。
１０． ５０μＬの停止液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を各ウェルに添加した。プレートを静かにタッピングし、完全な混合を確実にした。
１１． 各ウェルの光学密度を、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ）を用いて即座に決定した。
【0087】
サイトカイン生存性評定
１００μｌ／ウェル容量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）発光試薬をアッセイプレートに添加し、プレートシェーカー上にて室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロプレートリーダー（Perkin ElmerのＥＮＶＩＳＩＯＮ ２１０４）を用いて各ウェルの発光シグナルを決定した。
１００μｌ／ウェル容量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）発光試薬をアッセイプレートに添加し、プレートシェーカー上にて室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロプレートリーダー（Perkin ElmerのＥＮＶＩＳＩＯＮ ２１０４）を用いて各ウェルの発光シグナルを決定した。
【0088】
データ分析
試験化合物の％阻害を、以下の式を用いて決定した：
％阻害＝１００－（１００×（平均試験化合物カウント－平均陰性対照カウント）/（平均陽性対照カウント－平均陰性対照カウント））
試験化合物の％阻害を、以下の式を用いて決定した：
％阻害＝１００－（１００×（平均試験化合物カウント－平均陰性対照カウント）/（平均陽性対照カウント－平均陰性対照カウント））
【0089】
この式で述べられる「カウント」は全て、マイクロプレートリーダーを用いて上記のように決定された「光学密度値」から得られる（工程１１）。
【0090】
試験化合物の細胞毒性を、以下の式を用いて決定した：
％細胞毒性＝１００－（１００×（平均試験化合物カウント－平均陰性対照カウント）/（平均陽性対照カウント－平均陰性対照カウント））
％細胞毒性＝１００－（１００×（平均試験化合物カウント－平均陰性対照カウント）/（平均陽性対照カウント－平均陰性対照カウント））
【0091】
この式で述べられる「カウント」は全て、サイトカイン生存性評定について記載のように決定された「発光シグナル」から得られる。
【0092】
結果
【0093】
【表2】
【0094】
実施例１３－ＪＮＫ１（ＭＡＰＫ８）のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合
水に溶解した様々な濃度の組換えヒトＭＡＰＫ８を、湿度４０％でベア（bare）金コーティングした（厚さ４７ｎｍ）ＰｌｅｘＡｒｒａｙナノキャプチャセンサーチップ（米国ワシントン州シアトルのPlexera Bioscience）上に手作業で印刷した。各濃度を繰り返し印刷したところ、各スポットには０．２μＬのタンパク質溶液が含まれていた。チップを湿度８０％で４℃にて一晩インキュベートし、１０×ＰＢＳＴで１０分間、１×ＰＢＳＴで１０分間、及び脱イオン水で２回、１０分間の濯ぎを行った。次いで、チップを水中の５％（重量／体積）脱脂乳で一晩ブロッキングし、１０×ＰＢＳＴで１０分間、１×ＰＢＳＴで１０分間、及び脱イオン水で２回、１０分間の洗浄を行った後、窒素流のもとで使用前に乾燥させた。
水に溶解した様々な濃度の組換えヒトＭＡＰＫ８を、湿度４０％でベア（bare）金コーティングした（厚さ４７ｎｍ）ＰｌｅｘＡｒｒａｙナノキャプチャセンサーチップ（米国ワシントン州シアトルのPlexera Bioscience）上に手作業で印刷した。各濃度を繰り返し印刷したところ、各スポットには０．２μＬのタンパク質溶液が含まれていた。チップを湿度８０％で４℃にて一晩インキュベートし、１０×ＰＢＳＴで１０分間、１×ＰＢＳＴで１０分間、及び脱イオン水で２回、１０分間の濯ぎを行った。次いで、チップを水中の５％（重量／体積）脱脂乳で一晩ブロッキングし、１０×ＰＢＳＴで１０分間、１×ＰＢＳＴで１０分間、及び脱イオン水で２回、１０分間の洗浄を行った後、窒素流のもとで使用前に乾燥させた。
【0095】
表面プラズモン共鳴イメージング（ＳＰＲｉ）測定を、ＰｌｅｘＡｒａｙ ＨＴ（米国ワシントン州シアトルのPlexera Bioscience）を用いて行った。コリメート光（６６０ｎｍ）は結合プリズムを通過し、ＳＰＲ活性金表面に反射して、ＣＣＤカメラで受信される。バッファー及びサンプルを、非拍動ピストンポンプによって結合プリズムに取り付けられた３０μＬフローセルに注入した。各測定サイクルには４つの工程、すなわち、ＰＢＳＴ泳動バッファーを用いて２μＬ／秒の一定速度で洗浄して安定したベースラインを得る工程、結合のためサンプルを５μＬ／秒で注入する工程、ＰＢＳＴを用いる２μＬ／秒で３００秒間の表面洗浄工程、及び０．５％（体積／体積）Ｈ３ＰＯ４を用いる２μＬ／秒で３００秒間の再生工程を含んだ。全ての測定を４℃で行った。
【0096】
結合及び洗浄後のシグナル変化（ＡＵ単位）をアッセイ値として記録した。ＳＰＲ画像で選択したタンパク質グラフト領域を分析し、選択した領域の平均反射率変動を時間の関数としてプロットした。リアルタイムの結合シグナルを記録し、データ分析モジュール（ＤＡＭ、米国ワシントン州シアトルのPlexera Bioscience）によって分析した。動態分析を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア（Biacore, Inc.）を用いて行った。
【0097】
化合物７について決定された平衡解離定数（ＫＤ値）は、３．４１×１０－８Ｍであった（Ｋａ＝２．２９×１０４Ｍ－１・ｓ－１、Ｋｄ＝７．８２×１０－４ｓ－１）。
【0098】
実施例１４－ｐ３８ＭＡＰＫのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合
水に溶解した様々な濃度のｐ３８ＭＡＰＫを、湿度４０％でベア（bare）金コーティングした（厚さ４７ｎｍ）ＰｌｅｘＡｒｒａｙナノキャプチャセンサーチップ（米国ワシントン州シアトルのPlexera Bioscience）に手作業で印刷した。各濃度を繰り返し印刷したところ、各スポットには０．２μＬのタンパク質溶液が含まれていた。チップを湿度８０％で４℃にて一晩インキュベートし、１０×ＰＢＳＴで１０分間、１×ＰＢＳＴで１０分間、及び脱イオン水で２回、１０分間の濯ぎを行った。次いで、チップを水中の５％（重量／体積）脱脂乳で一晩ブロッキングし、１０×ＰＢＳＴで１０分間、１×ＰＢＳＴで１０分間、及び脱イオン水で２回、１０分間の洗浄を行った後、窒素流のもとで使用前に乾燥させた。
水に溶解した様々な濃度のｐ３８ＭＡＰＫを、湿度４０％でベア（bare）金コーティングした（厚さ４７ｎｍ）ＰｌｅｘＡｒｒａｙナノキャプチャセンサーチップ（米国ワシントン州シアトルのPlexera Bioscience）に手作業で印刷した。各濃度を繰り返し印刷したところ、各スポットには０．２μＬのタンパク質溶液が含まれていた。チップを湿度８０％で４℃にて一晩インキュベートし、１０×ＰＢＳＴで１０分間、１×ＰＢＳＴで１０分間、及び脱イオン水で２回、１０分間の濯ぎを行った。次いで、チップを水中の５％（重量／体積）脱脂乳で一晩ブロッキングし、１０×ＰＢＳＴで１０分間、１×ＰＢＳＴで１０分間、及び脱イオン水で２回、１０分間の洗浄を行った後、窒素流のもとで使用前に乾燥させた。
【0099】
表面プラズモン共鳴イメージング（ＳＰＲｉ）測定を、ＰｌｅｘＡｒａｙ ＨＴ（米国ワシントン州シアトルのPlexera Bioscience）で行った。コリメート光（６６０ｎｍ）は結合プリズムを通過し、ＳＰＲ活性金表面に反射して、ＣＣＤカメラで受信される。バッファー及びサンプルを、非拍動ピストンポンプによって結合プリズムに取り付けられた３０μＬフローセルに注入した。各測定サイクルには４つの工程、すなわち、ＰＢＳＴ泳動バッファーを用いて２μＬ／秒の一定速度で洗浄して安定したベースラインを得る工程、結合のためサンプルを５μＬ／秒で注入する工程、ＰＢＳＴを用いる２μＬ／秒で３００秒間の表面洗浄工程、及び０．５％（体積／体積）Ｈ３ＰＯ４を用いる２μＬ／秒で３００秒間の再生工程を含んだ。全ての測定を４℃で行った。
【0100】
結合及び洗浄後のシグナル変化（ＡＵ単位）をアッセイ値として記録した。ＳＰＲ画像で選択したタンパク質グラフト領域を分析し、選択した領域の平均反射率変動を時間の関数としてプロットした。リアルタイムの結合シグナルを記録し、データ分析モジュール（ＤＡＭ、米国ワシントン州シアトルのPlexera Bioscience）によって分析した。動態分析を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア（Biacore, Inc.）を用いて行った。
【0101】
化合物７について決定された平衡解離定数（ＫＤ値）は、１．１９×１０－８Ｍであった（Ｋａ＝２．０８×１０４Ｍ－１・ｓ－１、Ｋｄ＝２．４８×１０－４ｓ－１）。
【0102】
実施例１５：雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療における化合物５及び７の効果
ＮＡＳＨ誘導
時限妊娠マウス（ｎ＝３０）を研究に選択した。出生仔に、生後２日目（ＰＮＤ－２）に２００μｇのストレプトゾトシンを皮下注射し、離乳期に達するまで母親の元に置いた。離乳後に雄性仔を選択し、その後２週間にわたって６０％ｋｃａｌ脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ－Ｄ１２４９２）を与えた。全ての動物を臨床兆候について１日２回観察した。
ＮＡＳＨ誘導
時限妊娠マウス（ｎ＝３０）を研究に選択した。出生仔に、生後２日目（ＰＮＤ－２）に２００μｇのストレプトゾトシンを皮下注射し、離乳期に達するまで母親の元に置いた。離乳後に雄性仔を選択し、その後２週間にわたって６０％ｋｃａｌ脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ－Ｄ１２４９２）を与えた。全ての動物を臨床兆候について１日２回観察した。
【0103】
研究手順
マウスにビヒクル、試験化合物及び参照化合物（ｅｌａｆｉｂｒａｎｏｒ）を、０日目から２８日目まで朝（９：００ＡＭ）及び暗期の開始前の晩（６：００ＰＭ）の１日２回投与した。
マウスにビヒクル、試験化合物及び参照化合物（ｅｌａｆｉｂｒａｎｏｒ）を、０日目から２８日目まで朝（９：００ＡＭ）及び暗期の開始前の晩（６：００ＰＭ）の１日２回投与した。
【0104】
動物の体重測定を実験の全期間にわたって毎日行った。
【0105】
動物に２８日間（６週目から１０週目）にわたって試験化合物及び参照化合物を投与した。
【0106】
血中グルコースを処理開始前及び終了時の２８日目に推定した。血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルを処理開始前及び２８日目の血漿から測定した。
【0107】
Ｈ＆Ｅ染色、マッソントリクローム染色及びオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色を含む病理組織学的分析を肝組織について行った。
【0108】
サンプル分析
ＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪性肝疾患）スコアリング：Ｈ＆Ｅ染色
全てのＨ＆Ｅ染色組織切片を光学顕微鏡法によって検査した。２００倍対物レンズでの下記の評点方式（Kleiner et al., 2005）に従い、ＮＡＦＬＤスコアリングを脂肪症、小葉炎症及び肝臓の風船様腫大（ballooning）について行った。
ＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪性肝疾患）スコアリング：Ｈ＆Ｅ染色
全てのＨ＆Ｅ染色組織切片を光学顕微鏡法によって検査した。２００倍対物レンズでの下記の評点方式（Kleiner et al., 2005）に従い、ＮＡＦＬＤスコアリングを脂肪症、小葉炎症及び肝臓の風船様腫大（ballooning）について行った。
【0109】
コラーゲン比例面積（％ＣＰＡ）測定：マッソントリクローム染色
全てのマッソントリクローム染色組織切片を１００倍対物レンズで光学顕微鏡法によって検査した。各肝臓から無作為に選択した５つの視野（１視野当たりおよそ６８４．８５μｍ×９１７．１１ｍ）を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ ９．１ソフトウェアを用いたコラーゲン比例面積測定に供した。コラーゲン比例面積のパーセンテージを、コラーゲン組織面積を全組織面積で除算することによって算出した。
全てのマッソントリクローム染色組織切片を１００倍対物レンズで光学顕微鏡法によって検査した。各肝臓から無作為に選択した５つの視野（１視野当たりおよそ６８４．８５μｍ×９１７．１１ｍ）を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ ９．１ソフトウェアを用いたコラーゲン比例面積測定に供した。コラーゲン比例面積のパーセンテージを、コラーゲン組織面積を全組織面積で除算することによって算出した。
【0110】
％染色面積測定：オイルレッドＯ染色
全てのオイルレッドＯ染色組織切片を１００倍対物レンズで光学顕微鏡法によって検査した。各肝臓から無作為に選択した５つの視野（１視野当たりおよそ６８８．３３μｍ×９２２．４５μｍ）を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ ９．１ソフトウェアを用いた染色面積の測定に供した。染色面積のパーセンテージを、脂質染色組織面積を全組織面積で除算することによって算出した。
全てのオイルレッドＯ染色組織切片を１００倍対物レンズで光学顕微鏡法によって検査した。各肝臓から無作為に選択した５つの視野（１視野当たりおよそ６８８．３３μｍ×９２２．４５μｍ）を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ ９．１ソフトウェアを用いた染色面積の測定に供した。染色面積のパーセンテージを、脂質染色組織面積を全組織面積で除算することによって算出した。
【0111】
ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）に対する化合物５及び化合物７の効果を図１に示す。
【0112】
研究により、３ｍｇ／ｋｇ用量の化合物７が肝臓における脂肪症及び小葉炎症を有意に軽減し、Ｅｌａｆｉｂｒａｎｏｒよりも良好なＮＡＳスコアを示すことが明らかに実証された。
【0113】
３ｍｇ／ｋｇ用量の化合物５は、小葉炎症を有意に軽減し、脂肪症及び肝臓の風船様腫大の減少傾向を示し、疾患対照よりも有意なＮＡＳスコアの低下が得られた。
【0114】
化合物５及び７は、図２に示されるように２８日間の処理後にＡＳＴレベルの有意な低下を示した。
【0115】
図３に示されるように、両方の試験化合物（化合物５及び７）が、参照化合物（Ｅｌａｆｉｂｒａｎｏｒ）とは異なり、いかなる肝腫大及び肝臓対体重比の増加も示さなかった。
【0116】
結論として、試験した化合物は、ＮＡＳＨの肝臓化学及び組織学的活動性の有意な改善をもたらす。化合物５及び７の治療プロファイルは、それらがヒトＮＡＳＨを治療する可能性を有することを示唆する。処理した全ての動物が体重増加を示し、毒性又は副作用の臨床兆候を有しなかった。
【0117】
実施例１６：ブレオマイシン誘導性ＩＰＦの治療における化合物７の効果
ＩＰＦ誘導
時限妊娠マウス（ｎ＝３０）を研究に選択した。出生仔に、生後２日目（ＰＮＤ－２）に１．５Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（気管内）を皮下注射し、離乳期に達するまで母親の元に置いた。離乳後に雄性仔を選択し、その後１週間にわたって６０％ｋｃａｌ脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ－Ｄ１２４９２）を与えた。全ての動物を臨床兆候について１日２回観察した。
ＩＰＦ誘導
時限妊娠マウス（ｎ＝３０）を研究に選択した。出生仔に、生後２日目（ＰＮＤ－２）に１．５Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（気管内）を皮下注射し、離乳期に達するまで母親の元に置いた。離乳後に雄性仔を選択し、その後１週間にわたって６０％ｋｃａｌ脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ－Ｄ１２４９２）を与えた。全ての動物を臨床兆候について１日２回観察した。
【0118】
研究手順
マウスにビヒクル、試験化合物及び参照化合物（ピルフェニドン）を、０日目から１４日目まで朝（９：００ＡＭ）及び暗期の開始前の晩（６：００ＰＭ）の１日２回経口投与した。
マウスにビヒクル、試験化合物及び参照化合物（ピルフェニドン）を、０日目から１４日目まで朝（９：００ＡＭ）及び暗期の開始前の晩（６：００ＰＭ）の１日２回経口投与した。
【0119】
動物の体重測定を実験の全期間にわたって毎日行った。
【0120】
動物に１４日間にわたって試験化合物及び参照化合物を投与した。
【0121】
肺ヒドロキシプロリンレベルを処理開始前及び終了時の１４日目に推定した。ＢＡＬＦ中の総細胞数及び各種白血球数を処理開始前及び２８日目に測定した。
【0122】
Ｈ＆Ｅアシュクロフトスコアの形態での病理組織学的分析を肺組織について行った。
【0123】
サンプル分析
ＩＰＦスコアリング：Ｈ＆Ｅ染色
全てのＨ＆Ｅ染色組織切片を光学顕微鏡法によって検査した。２００倍対物レンズでの下記の評点方式（Kleiner et al., 2005）に従い、ＩＰＦスコアリングを行った。
ＩＰＦスコアリング：Ｈ＆Ｅ染色
全てのＨ＆Ｅ染色組織切片を光学顕微鏡法によって検査した。２００倍対物レンズでの下記の評点方式（Kleiner et al., 2005）に従い、ＩＰＦスコアリングを行った。
【0124】
コラーゲン比例面積（％ＣＰＡ）測定：マッソントリクローム染色
全てのマッソントリクローム染色組織切片を１００倍対物レンズで光学顕微鏡法によって検査した。各肺から無作為に選択した５つの視野（１視野当たりおよそ６８４．８５μｍ×９１７．１１ｍ）を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ ９．１ソフトウェアを用いたコラーゲン比例面積測定に供した。コラーゲン比例面積のパーセンテージを、コラーゲン組織面積を全組織面積で除算することによって算出した。
全てのマッソントリクローム染色組織切片を１００倍対物レンズで光学顕微鏡法によって検査した。各肺から無作為に選択した５つの視野（１視野当たりおよそ６８４．８５μｍ×９１７．１１ｍ）を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ ９．１ソフトウェアを用いたコラーゲン比例面積測定に供した。コラーゲン比例面積のパーセンテージを、コラーゲン組織面積を全組織面積で除算することによって算出した。
【0125】
肺ヒドロキシプロリンレベルに対する化合物７の効果を図４に示す。
【0126】
肺ヒドロキシプロリンレベルは、ナイーブ対照と比較してブレオマイシン対照において有意に上昇した。研究により、１５ｍｇ／ｋｇ用量の化合物７が肺ヒドロキシプロリンレベルを有意に低下させ、１００ｍｇ／ｋｇのピルフェニドンよりも低下が大きいことが明らかに実証された。
【0127】
ＢＡＬＦ中の総白血球数及び各種白血球数（マクロファージ及びリンパ球）は、ブレオマイシン対照群において有意に増加した。図５Ａ及び図５Ｂに示されるように、ＢＡＬＦマクロファージ数は、化合物７（ｐ＞０．０５）及びピルフェニドン（ｐ＜０．０５）処理によってブレオマイシン対照と比較して減少した。
【0128】
線維症スコア及び％ＣＰＡは、ブレオマイシン対照肺においてナイーブ対照と比較して有意に上昇した。図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、化合物７（ｐ＜０．０５）及びピルフェニドン（ｐ＜０．０５）で処理した肺サンプルは、ブレオマイシン対照と比較して線維症スコア及び％ＣＰＡの両方の有意な低下を示した。データは、ヒドロキシプロリンの結果と一致する。
【0129】
結論として、試験した化合物は、ＩＰＦの肺化学及び組織学的活動性の有意な改善をもたらす。化合物７の治療プロファイルは、それがヒトＩＰＦを治療する可能性を有することを示唆する。処理した全ての動物がブレオマイシン対照と比較して体重増加を示し、毒性又は副作用の臨床兆候を有しなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】