特許 7395579 イリノテカンリポソーム製剤とその製造及び応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-01

(45)【発行日】2023-12-11

(54)【発明の名称】イリノテカンリポソーム製剤とその製造及び応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4745 20060101AFI20231204BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20231204BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231204BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4745

A61K9/127

A61K47/20

A61P35/00

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2021522421

(86)(22)【出願日】2019-10-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-14

(86)【国際出願番号】 CN2019110542

(87)【国際公開番号】W WO2020093836

(87)【国際公開日】2020-05-14

【審査請求日】2021-06-23

(31)【優先権主張番号】201811305299.6

(32)【優先日】2018-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】519053739

【氏名又は名称】杭州高田生物医薬有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110001999

【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】魏 暁慧

(72)【発明者】

【氏名】姜 炳奇

【審査官】篭島 福太郎

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１３－５０８３１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０００４２１９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５１８３４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／０３８５２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Journal of Controlled Release，2006年，Vol.110，pp.378-386

【文献】International Journal of Pharmaceutics，2016年，Vol.512，pp.75-86

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／４７４５

Ａ６１Ｋ ９／１２７

Ａ６１Ｋ ４７／２０

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イリノテカンリポソームを含むイリノテカンリポソーム製剤であって、イリノテカンとリポソーム担体、及びリポソーム膜内に位置する内水相とリポソーム膜外に位置する外水相を含み、前記イリノテカンは前記内水相中に封入されており、前記リポソーム膜内の内水相と膜外の外水相の間にはスルホン酸塩勾配が存在し、
前記リポソーム膜内の内水相のスルホン酸塩濃度が外水相よりも高く、
前記スルホン酸塩はジスルホン酸塩であり、前記ジスルホン酸塩は、エタンジスルホン酸アンモニウム、プロパンジスルホン酸アンモニウム、エタンジスルホン酸トリエチルアミン、及びプロパンジスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択され、前記内水相はスルホン酸塩水溶液を含み、前記外水相は生理的等張液であり、
前記内水相中のイリノテカンのカチオンとスルホン酸塩のアニオンにより不溶性塩が形成される、ことを特徴とするイリノテカンリポソーム製剤。

【請求項2】

ａ．前記リポソームの内水相のｐＨ値は４．０～９．０であり、
ｂ．前記イリノテカンリポソーム製剤におけるイリノテカンの濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ以上である、
との特徴のうちの１又は複数を更に含むことを特徴とする請求項１に記載のイリノテカンリポソーム製剤。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のイリノテカンリポソーム製剤の製造方法であって、
前記方法は能動的薬物担持法であり、前記能動的薬物担持法は、
（１）内水相と外水相がいずれもスルホン酸塩水溶液を含有するブランクリポソームを調製し、
前記スルホン酸塩は、ジスルホン酸塩を含み、
前記ジスルホン酸塩は、エタンジスルホン酸アンモニウム、プロパンジスルホン酸アンモニウム、エタンジスルホン酸トリエチルアミン、及びプロパンジスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択される、
（２）内水相がスルホン酸塩水溶液を含有し、外水相が生理的等張液を含有するブランクリポソームを調製することで、ブランクリポソームの内外水相にスルホン酸塩濃度勾配を
形成し、前記リポソーム膜内の内水相のスルホン酸塩濃度が外水相よりも高く、
（３）ステップ（２）で得たブランクリポソームとイリノテカン可溶性塩水溶液を混合し、インキュベートしたあと、遊離イリノテカン可溶性塩を除去することで、イリノテカンリポソームを取得する、
とのステップを含むことを特徴とする製造方法。

【請求項4】

ａ．ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液中のスルホン酸塩の濃度は１００～８００ｍＭであり、
ｂ．ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液のｐＨ値は４．０～９．０であり、
ｃ．ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液中のスルホン酸基イオンの濃度は５０～８００ｍＭであり、
ｄ．ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液中のカチオンの濃度は５０～８００ｍＭであり、
ｅ．ステップ（２）において、前記生理的等張液は、５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖水溶液、又は０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液から選択可能であり、
ｆ．ステップ（２）において、前記外水相のｐＨは４．０～９．０であり、
ｇ．ステップ（３）において、ブランクリポソームとイリノテカン可溶性塩水溶液を混合時、薬物／リポソームモル比は０．１以上であり、
ｈ．ステップ（３）において、前記イリノテカン可溶性塩は塩酸イリノテカンから選択する、
との特徴のうちの１又は複数を更に含むことを特徴とする請求項３に記載のイリノテカンリポソーム製剤の製造方法。

【請求項5】

直腸癌、肺癌、乳癌又は膵臓癌の腫瘍治療薬の製造における請求項１又は２に記載のイリノテカンリポソーム製剤の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナノ薬物送達の技術分野に属し、具体的には、イリノテカンリポソーム製剤とその製造及び応用に関する。

【背景技術】

【0002】

イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ，ＣＰＴ－１１）は、カンプトテシンの半合成誘導体であり、転移性結腸癌治療のための有効薬物である。カンプトテシンはトポイソメラーゼＩと特異的に結合可能である。トポイソメラーゼＩは可逆的な１本鎖切断を誘発することで、ＤＮＡの２本鎖構造を分離させるが、イリノテカン及びその活性代謝物ＳＮ－３８は、トポイソメラーゼＩ－ＤＮＡ複合体と結合することで、切断された１本鎖の再接続を阻止し得る。これまでの研究によれば、イリノテカンの細胞毒性作用は、ＤＮＡの合成過程において、複製酵素とトポイソメラーゼＩ－ＤＮＡ－イリノテカン（或いは、ＳＮ－３８）の三者複合体が相互に作用して、ＤＮＡの２本鎖が切断されることに起因する。

【0003】

現在すでに上市しているイリノテカン製品には、塩酸イリノテカン注射液、凍結乾燥粉末注射剤及びリポソーム注射剤がある。このうち、塩酸イリノテカンはイリノテカンの塩酸塩であり、良好な水溶性を有している。塩酸イリノテカン注射液を静脈投与すると、アルカリ性に傾いた生理的環境において、遊離イリノテカンのラクトン環が容易に開くことでカルボン酸塩形式が形成される。これにより、活性が失われる結果、薬物の治療効果が低下する。また、塩酸イリノテカンの粉末注射剤は毒性及び副作用が大きく、主には、好中球の減少や遅延性下痢として現れる。

【0004】

２０１５年１０月、ＦＤＡは、イリノテカンリポソーム薬物であるオニバイド（Ｏｎｉｖｙｄｅ）の末期膵臓癌治療への適用を承認した。オニバイドは、ショ糖オクタ硫酸エステル（図１ａ）のトリエチルアミン塩を内水相とし、リポソームの内外水相間におけるトリエチルアミン勾配を利用してイリノテカンをリポソームの内水相に内包している。これにより、イリノテカン－ショ糖オクタ硫酸エステル塩を形成し、体内での徐放効果を達成している（非特許文献１）。しかし、オニバイドの場合、リポソームによる薬物担持に必要な重要補助剤であるショ糖オクタ硫酸エステルトリエチルアミンは原料が高価なだけでなく、調製が複雑である。まず、イオン交換樹脂を用いてスクロースオクタ硫酸ＮＡをショ糖オクタ硫酸エステルに変換してから、トリエチルアミンで滴定して、ショ糖オクタ硫酸エステルトリエチルアミン塩に調製する必要がある。このほか、ショ糖オクタ硫酸エステルが成長因子に類似した活性を持つ可能性があるとの報告もされている（非特許文献２）。

【0005】

現在、中国国内で開示されている塩酸イリノテカン又はイリノテカンリポソームの特許では、使用される薬物担持勾配が、硫酸アンモニウム勾配（例えば、特許文献１「イリノテカン又は塩酸イリノテカンリポソーム及びその調製方法」）と、プロトン濃度勾配法（例えば、特許文献２「イリノテカン製剤」）に集中している。しかし、硫酸アンモニウム勾配とプロトン濃度勾配を利用して調製されるイリノテカン又は塩酸イリノテカンリポソームは、効果的に徐放を実現することが不可能である。例えば、硫酸アンモニウム勾配法を用いて調製されるイリノテカンリポソーム（特許文献３）は、ラット体内における薬物半減期が８．９０時間である。

【0006】

従って、より容易に得られるその他のタイプのアンモニウム塩又はトリエチルアミン塩に基づく能動的薬物担持勾配を発展させて、イリノテカンリポソームの調製に適用するとともに、良好な体内徐放効果を達成することが求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】中国特許第１０３１２０６４５Ｂ号明細書

【文献】中国特許第１９６０７２９Ｂ号明細書

【文献】中国特許第１０５７９６４９５Ａ号明細書

【非特許文献】

【0008】

【文献】Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｄ．Ｃ．等，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｒａｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，６６（６），３２７１－３２７７．

【文献】邱永峰等、ショ糖オクタ硫酸エステルの応用総括、「医薬衛生（引用版）」、２０１７年第５巻、２８６頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

従来技術に存在する課題を解消するために、本発明は、イリノテカンリポソーム製剤とその製造及び応用を提供し、従来技術の課題を解決することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第一の局面において、イリノテカンリポソームを含有するイリノテカンリポソーム製剤を提供する。前記イリノテカンリポソームは、イリノテカンとリポソーム担体、及びリポソーム膜内に位置する内水相とリポソーム膜外に位置する外水相を含む。前記イリノテカンは前記内水相中に封入されており、前記リポソーム膜内の内水相と膜外の外水相の間にはスルホン酸塩勾配が存在する。

【0011】

本発明の一実施例において、前記リポソームは単層リポソームである。

【0012】

本発明の一実施例において、前記リポソームの粒径の範囲は３０～２００ｎｍである。

【0013】

本発明の一実施例において、前記リポソームの粒径の範囲は５０～１２０ｎｍである。

【0014】

本発明の一実施例において、前記リポソームの粒径の範囲は９０～１１０ｎｍである。

【0015】

本発明の一実施例において、前記リポソームのＤ９５は２００ｎｍ以下である。Ｄ９５とは、前記リポソームを小さいものから大きいものへと累積した場合の分布パーセンテージが９５％に達したときに対応する粒径値である。即ち、前記リポソームのうち、粒径がＤ９５よりも小さいリポソームの粒子数は前記リポソームの総粒子数の９５％を占めている。

【0016】

本発明の一実施例において、前記リポソームのＤ９５は１２０ｎｍ以下である。Ｄ９５とは、前記リポソームを小さいものから大きいものへと累積した場合の分布パーセンテージが９５％に達したときに対応する粒径値である。即ち、前記リポソームのうち、粒径がＤ９５よりも小さいリポソームの粒子数は前記リポソームの総粒子数の９５％を占めている。

【0017】

本発明の一実施例において、前記リポソームのＤ９５は１１０ｎｍ以下である。Ｄ９５
とは、前記リポソームを小さいものから大きいものへと累積した場合の分布パーセンテージが９５％に達したときに対応する粒径値である。即ち、前記リポソームのうち、粒径がＤ９５よりも小さいリポソームの粒子数は前記リポソームの総粒子数の９５％を占めている。

【0018】

本発明の一実施例において、前記内水相はスルホン酸塩水溶液を含み、前記外水相は生理的等張液である。

【0019】

本発明の一実施例において、前記内水相中のイリノテカンのカチオンとスルホン酸塩のアニオンにより不溶性塩が形成される。

【0020】

本発明の一実施例において、前記スルホン酸塩は、モノスルホン酸塩及び／又はジスルホン酸塩から選択する。

【0021】

本発明の一実施例において、モノスルホン酸塩は、メタンスルホン酸アンモニウム、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム、メタンスルホン酸トリエチルアミン、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択可能である。

【0022】

本発明の一実施例において、ジスルホン酸塩は、エタンジスルホン酸アンモニウム、プロパンジスルホン酸アンモニウム、エタンジスルホン酸トリエチルアミン、プロパンジスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択可能である。

【0023】

本発明の一実施例において、前記リポソームの内水相中のモノスルホン酸基イオンの濃度は１００～８００ｍＭである。

【0024】

本発明の一実施例において、前記リポソームの内水相中のモノスルホン酸基イオンの濃度は２００～７００ｍＭである。

【0025】

本発明の一実施例において、前記リポソームの内水相中のジスルホン酸基イオンの濃度は５０～５００ｍＭである。

【0026】

本発明の一実施例において、前記リポソームの内水相中のジスルホン酸基イオンの濃度は１００～４００ｍＭである。

【0027】

本発明の一実施例において、前記生理的等張液は、５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖水溶液、又は０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液から選択される。

【0028】

本発明の一実施例において、前記リポソームの内水相のｐＨ値は４．０～９．０である。

【0029】

本発明の一実施例において、前記リポソームの内水相のｐＨ値は４．５～８．０である。

【0030】

本発明の一実施例では、前記イリノテカンリポソーム製剤における前記イリノテカンの濃度は０．８６ｍｇ／ｍｌ以上である。

【0031】

本発明の一実施例において、前記イリノテカンと前記リポソームとの薬物／リポソームモル比は０．１以上である。

【0032】

本発明の一実施例において、前記リポソームの成分には、リン脂質、コレステロール及びポリエチレングリコール化リン脂質が含まれる。

【0033】

本発明の一実施例において、前記ポリエチレングリコール化リン脂質におけるポリエチレングリコールの分子量は５０～１００００である。

【0034】

本発明の一実施例において、前記ポリエチレングリコール化リン脂質におけるポリエチレングリコールの分子量は２０００である。

【0035】

本発明の一実施例において、前記リン脂質、前記コレステロール及び前記ポリエチレングリコール化リン脂質のモル比は、（３０～８０）：（０．１～４０）：（０．１～３０）である。

【0036】

本発明の一実施例において、前記リン脂質、前記コレステロール及び前記ポリエチレングリコール化リン脂質のモル比は５５：４０：５である。

【0037】

本発明の一実施例において、前記リポソームの外水相は質量濃度１０％のショ糖溶液である。

【0038】

本発明は、第２の局面において、イリノテカンリポソーム製剤の製造方法を提供する。前記方法は能動的薬物担持法である。前記能動的薬物担持法は、以下のステップを含む。

【0039】

（１）内水相と外水相がいずれもスルホン酸塩水溶液を含有するブランクリポソームを調製する。

【0040】

（２）内水相がスルホン酸塩水溶液を含有し、外水相が生理的等張液を含有するブランクリポソームを調製することで、ブランクリポソームの内外水相にスルホン酸塩濃度勾配を形成する。

【0041】

（３）ステップ（２）で得たブランクリポソームとイリノテカン可溶性塩水溶液を混合し、インキュベートしたあと、遊離イリノテカン可溶性塩を除去することで、イリノテカンリポソームを取得する。

【0042】

本発明の一実施例において、前記スルホン酸塩は、モノスルホン酸塩及び／又はジスルホン酸塩から選択する。

【0043】

本発明の一実施例において、モノスルホン酸塩は、メタンスルホン酸アンモニウム、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム、メタンスルホン酸トリエチルアミン、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択可能である。

【0044】

本発明の一実施例において、ジスルホン酸塩は、エタンジスルホン酸アンモニウム、プロパンジスルホン酸アンモニウム、エタンジスルホン酸トリエチルアミン、プロパンジスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択可能である。

【0045】

本発明の一実施例では、ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液中のスルホン酸塩の濃度は５０～８００ｍＭである。

【0046】

ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液中のカチオンの
濃度は５０～８００ｍＭである。

【0047】

本発明の一実施例では、ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液のｐＨ値は４．０～９．０である。

【0048】

本発明の一実施例では、ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液のｐＨ値は４．５～８．０である。

【0049】

本発明の一実施例では、ステップ（１）及びステップ（２）において、モノスルホン酸塩を選択する場合には、前記スルホン酸塩水溶液中のスルホン酸基イオンの濃度を１００～８００ｍＭとする。

【0050】

更に、ステップ（１）及びステップ（２）において、モノスルホン酸塩を選択する場合には、前記スルホン酸塩水溶液中のスルホン酸基イオンの濃度を２００～７００ｍＭとする。

【0051】

本発明の一実施例において、ジスルホン酸塩を選択する場合には、ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液中のカチオンの濃度を５０～５００ｍＭとする。

【0052】

更に、二価のスルホン酸塩を選択する場合には、ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液中のカチオンの濃度を１００～４００ｍＭとする。

【0053】

本発明の一実施例では、ステップ（２）において、前記生理的等張液は、５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖水溶液、又は０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液から選択可能である。

【0054】

本発明の一実施例では、ステップ（２）において、前記リポソームの内水相のｐＨ値は４．０～９．０である。

【0055】

更に、ステップ（２）において、前記リポソームの内水相のｐＨ値は４．５～８．０である。

【0056】

本発明の一実施例では、ステップ（３）において、薬物／リポソームモル比は０．１以上である。

【0057】

本発明の一実施例では、ステップ（３）において、前記イリノテカン可溶性塩は塩酸イリノテカンから選択する。

【0058】

本発明は、直腸癌、肺癌、乳癌又は膵臓癌の腫瘍治療薬の製造における上記イリノテカンリポソームの用途を提供する。

【0059】

本発明の一実施例では、前記用途において、イリノテカンリポソーム製剤は、より多くのイリノテカンを活性ラクトン環形式で血液循環に存在させ、腫瘍部位に到達させてＳＮ－３８に転換することが可能なため、抗腫瘍効果が更に改善される。

【発明の効果】

【0060】

本発明は、以下の有益な効果を有する。

【0061】

本発明で提供するイリノテカンリポソーム製剤は、原料の入手しやすさを改善し、製剤
コストを低減するとともに、より容易にイリノテカンの安定的な搭載を実現しており、封入率が高く、保持安定性に優れるとの利点を有する。且つ、当該製剤は明らかな徐放性を有しており、塩酸イリノテカンの体内における安定性及び有効性を保証するのに有利なため、薬物の治療効果が向上する。本発明で記載するイリノテカンリポソームは体内半減期が長く、バイオアベイラビリティが高い。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1A】図１Ａは、モノスルホン酸（左：メタンスルホン酸、右：４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸）の化学構造である。

【図1B】図１Ｂは、ジスルホン酸（左：エタンジスルホン酸、右：プロパンジスルホン酸）の化学構造である。

【図2】図２は、塩酸イリノテカン水溶液のＵＶ標準曲線である。

【図3】図３は、３つの異なる投入薬物／リポソーム比（それぞれ、０．１、０．３、０．５）の場合に、異なる勾配で調製したイリノテカンリポソームの封入率を表す。

【図4】図４は、異なるスルホン酸塩溶液を内水相とするイリノテカンリポソームの疑似血漿内における累積放出速度を示す図である（ＴＥＡ：トリエチルアミン、ＭＳ：メタンスルホン酸、ＨＢＳ：４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸、ＥＤＳ：エタンジスルホン酸、ＰＤＳ：プロパンジスルホン酸）。

【図5】図５は、異なるスルホン酸塩勾配、トリエチルアミンスルファチド勾配、及び硫酸アンモニウム勾配で調製したイリノテカンリポソームの示差走査熱量を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0063】

本発明の発明者は、膨大な探求及び実験の結果、リポソームの内水相中におけるスルホン酸塩のアニオンは、イリノテカンのカチオンと不溶性塩を形成することで、イリノテカンをリポソームの内水相中に安定的に封入可能であることを見出し、これに基づき本発明を完成させた。

【0064】

本発明のイリノテカンリポソーム製剤はイリノテカンリポソームを含み、前記イリノテカンリポソームはイリノテカン及びリポソーム担体を含む。

【0065】

前記リポソームは、二分子層構造をなすリポソーム膜を有している。前記リポソーム膜は生体膜に類似している。

【0066】

前記リポソームの担体材料にはリン脂質とコレステロールが含まれている。本発明では、リポソームの担体材料及び含有量については特に制限せず、安定的で漏れのない二分子層構造をなすリポソーム膜を形成可能であればよい。これらはいずれも当業者が知り得る知識の範囲内である。

【0067】

本発明の実施例では、前記リン脂質として水素添加大豆リン脂質（ＨＳＰＣ）及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）を選択する場合を列挙しているが、これに限らない。

【0068】

前記ＤＳＰＥ－ＰＥＧのうち、ＰＥＧの分子量の範囲は５０～１００００とすればよい。例えば、前記ＤＳＰＥ－ＰＥＧのうち、ＰＥＧの分子量は２０００である。

【0069】

ＨＳＰＣ、ＣＨＯＬ（コレステロール）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧのモル比の範囲は、（３０～８０）：（０．１～４０）：（０．１～３０）とすればよい。例えば、ＨＳＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧのモル比の範囲は５５：４０：５とすればよい。

【0070】

前記イリノテカンリポソーム製剤は、更に、リポソーム膜内に位置する内水相と、リポソーム膜外に位置する外水相を含む。前記イリノテカンは前記内水相中に封入される。

【0071】

前記リポソーム膜内の内水相と膜外の外水相の間にはスルホン酸塩勾配が存在する。

【0072】

前記アンモニウム塩勾配とは、アンモニウム塩の濃度勾配及びｐＨの差が存在することを言う。

【0073】

前記トリエチルアミン塩勾配とは、トリエチルアミン塩の濃度勾配及びｐＨの差が存在することを言う。

【0074】

前記内水相はスルホン酸塩水溶液であり、前記イリノテカンのカチオンと前記スルホン酸基が不溶性塩を形成することで、イリノテカンが前記内水相中に封入される。また、前記外水相は生理的等張液である。

【0075】

前記生理的等張液は、５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖水溶液、又は０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液から選択される。

【0076】

％（ｗ／ｗ）は質量パーセント濃度を意味する。つまり、溶液１００ｇ中に含有される溶質の質量を意味する。

【0077】

％（ｗ／ｖ）は質量／体積パーセント濃度を意味する。つまり、溶液１００ｍｌ中に含有される溶質の質量を意味する。

【0078】

前記イリノテカンリポソーム製剤は、注射投与製剤としてもよい。

【0079】

前記注射投与製剤は、皮下注射剤形、静脈注射剤形、筋肉注射剤形、又は骨盤注射剤形から選択可能である。

【0080】

前記スルホン酸塩のカチオンは、アンモニウムイオン、トリエチルアミンイオンから選択可能である。

【0081】

前記スルホン酸塩は、モノスルホン酸塩及び／又はジスルホン酸塩から選択可能である。このうち、モノスルホン酸塩は、メタンスルホン酸アンモニウム、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム、メタンスルホン酸トリエチルアミン、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択可能である。また、ジスルホン酸塩は、エタンジスルホン酸アンモニウム、プロパンジスルホン酸アンモニウム、エタンジスルホン酸トリエチルアミン、プロパンジスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択可能である。

【0082】

前記内水相のｐＨは４．０～９．０とすればよく、更には、４．５～８．０とすればよい。

【0083】

モノスルホン酸塩を選択する場合には、前記内水相中のスルホン酸基イオンの濃度を１００～８００ｍＭとすればく、更には、２００～７００ｍＭとすればよい。

【0084】

ジスルホン酸塩を選択する場合には、前記内水相中のスルホン酸基イオンの濃度を５０～５００ｍＭとすればよく、更には、１００～４００ｍＭとすればよい。

【0085】

前記内水相中のイリノテカンの濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ以上とすればよい。

【0086】

本発明で記載するイリノテカンリポソーム製剤の製造方法は、以下のステップを含む。

【0087】

（１）内水相と外水相がいずれもスルホン酸塩水溶液を含有するブランクリポソームを調製する。

【0088】

（２）内水相がスルホン酸塩水溶液を含有し、外水相が生理的等張液を含有するブランクリポソームを調製することで、ブランクリポソームの内外水相にスルホン酸塩濃度勾配を形成する。

【0089】

（３）ステップ（２）で得たブランクリポソームとイリノテカン可溶性塩水溶液を混合し、インキュベートしたあと、遊離イリノテカン可溶性塩を除去することで、イリノテカンリポソームを取得する。

【0090】

前記スルホン酸塩は、モノスルホン酸塩及び／又はジスルホン酸塩から選択する。

【0091】

モノスルホン酸塩は、メタンスルホン酸アンモニウム、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム、メタンスルホン酸トリエチルアミン、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択可能である。

【0092】

ジスルホン酸塩は、エタンジスルホン酸アンモニウム、プロパンジスルホン酸アンモニウム、エタンジスルホン酸トリエチルアミン、プロパンジスルホン酸トリエチルアミンのうちの１種又は複数種から選択可能である。

【0093】

ステップ（１）及びステップ（２）において、モノスルホン酸塩を選択する場合には、前記スルホン酸塩水溶液中のスルホン酸基イオンの濃度を１００～８００ｍＭとする。

【0094】

更に、ステップ（１）及びステップ（２）において、モノスルホン酸塩を選択する場合には、前記スルホン酸塩水溶液中のスルホン酸基イオンの濃度を２００～７００ｍＭとする。

【0095】

ジスルホン酸塩を選択する場合には、ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液中のカチオンの濃度を５０～５００ｍＭとする。

【0096】

更に、二価のスルホン酸塩を選択する場合には、ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液中のカチオンの濃度を１００～４００ｍＭとする。

【0097】

ステップ（１）及びステップ（２）において、前記スルホン酸塩水溶液のｐＨ値は４．０～９．０とすればよく、更には、４．５～８．０とすればよい。

【0098】

ステップ（２）において、前記生理的等張液は、５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖水溶液、又は０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液から選択可能である。

【0099】

本発明の一実施例では、ステップ（２）において、前記外水相のｐＨを４．０～９．０とし、更には、５．０～８．０とすればよい。

【0100】

本発明の一実施例では、ステップ（３）において、薬物／リポソーム比（即ち、イリノテカンとリポソームのモル比）は０．１以上とすればよい。更に、薬物／リポソーム比は０．１５以上とすればよい。更に、薬物／リポソーム比は０．２０以上とすればよい。更
に、薬物／リポソーム比は０．２５以上とすればよい。更に、薬物／リポソーム比は０．３以上とすればよい。更に、薬物／リポソーム比は０．５以上とすればよい。更に、０．１～０．１５としてもよく、０．１～０．２としてもよく、０．１～０．２５としてもよく、０．１～０．３としてもよく、０．１５～０．３としてもよく、０．３～０．５としてもよく、０．２～０．５としてもよい。

【0101】

本発明の一実施例では、ステップ（３）において、前記イリノテカン可溶性塩は塩酸イリノテカンから選択する。

【0102】

前記イリノテカン可溶性塩水溶液中のイリノテカンの濃度は１０ｍｇ／ｍｌ以上とすればよい。また、イリノテカンの濃度は１２ｍｇ／ｍｌ以上とすればよい。また、イリノテカンの濃度は１５ｍｇ／ｍｌ以上とすればよい。例えば、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌとすればよい。また、１０～１２ｍｇ／ｍｌとしてもよく、１２～１５ｍｇ／ｍｌとしてもよく、１０～１５ｍｇ／ｍｌとしてもよい。

【0103】

本発明では、能動的薬物担持の原理を利用する。即ち、リポソームの内外水相間にはスルホン酸塩イオン勾配が存在している。外水相中の塩酸イリノテカンには部分的な電離が発生するが、非解離形式のイリノテカンは受動的に拡散するようにしてリポソームの内水相中に進入し、内水相中のアンモニウムイオン又はトリエチルアミンイオンの電離により発生した水素イオンと結合することで、イリノテカンイオンを形成する。これがスルホン酸基とともに結晶又は無定形の不溶性塩を形成することで、イリノテカンがリポソームの内水相中に封入される。また、リポソームの内水相中におけるアンモニウムイオンの電離により発生したアンモニアガス、或いは、トリエチルアミンイオンの電離により発生したトリエチルアミンが絶えずリポソームの内水相から逃げることで、リポソームの内水相中の水素イオンの濃度が維持される。これにより、外水相中のほぼ全てのイリノテカンがリポソームの内水相に封入されるまで、リポソームの内水相中のイリノテカン分子は絶えず水素イオンと結合を続けてイリノテカンカチオンを形成し、スルホン酸基とともに沈殿物を形成する。当該リポソームは薬物担持量が多く、安定性に優れ、且つ際立った徐放効果を有している。

【0104】

イリノテカンリポソーム製剤の用途

【0105】

イリノテカンは、水溶性カンプトテシンの半合成誘導体であり、直腸癌、肺癌、乳癌及び膵臓癌を含む腫瘍の治療に適用可能である。

【0106】

本発明で記載するイリノテカンリポソーム製剤は、より多くのイリノテカンを活性ラクトン環形式で血液循環に存在させ、腫瘍部位に到達させてＳＮ－３８に転換することが可能なため、抗腫瘍効果が更に改善される。また、本発明で記載するイリノテカンリポソームは体内半減期が長く、バイオアベイラビリティに優れている。

【0107】

本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らないと解釈すべきである。更に、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。また、本発明の明細書及び特許請求の範囲では、別途明示しない限り、「１つ」、「一の」及び「この」といった単数形には複数形も含まれる。

【0108】

実施例で数値範囲を提示している場合には、本発明において別途説明がない限り、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義しない限り、本発明で使用するあらゆる技術・科学用語は、当
業者により一般的に理解される意味と等しい。また、実施例で使用される具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例における上記の方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。

【0109】

別途説明がない限り、本発明で開示する実験方法、検出方法、調製方法には、当該分野において一般的な薬剤学、薬物分析学、薬物化学、分析化学、分子生物学、生化学、及び関連分野における一般技術を用いる。これらの技術については、従来の文献で十分に説明されている。

【実施例1】

【0110】

塩酸イリノテカンの測定方法
本実施例では、塩酸イリノテカンの標準曲線を作成した。具体的には、下記の通りであった。

【0111】

紫外線（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ，ＵＶ）測定分析法を用いた。測定器をＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯとし、測定波長を３６９ｎｍ、測定温度を２４℃とした。また、測定用のマイクロプレートをＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）
９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ，ＵＶ－ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔとし、測定体積を２００μｌとした。

【0112】

２．５００１ｍｇの塩酸イリノテカンを精密に計量し、２５ｍｌのメスフラスコで溶解して濃度０．１０００ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液を取得した。次に、塩酸イリノテカン水溶液を超純水と混合し、段階的に希釈することで、濃度５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ及び２５μｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン標準溶液を取得した。ＵＶ法で上記濃度の塩酸イリノテカン標準溶液を測定したところ、測定結果は表１に示す通りとなった。

【表1】

【0113】

表１に示した結果に基づき標準曲線を作成し、回収率について考察した。検量線（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）は図２に示す通りとなった。塩酸イリノテカン水溶液のＵＶ標
準曲線は、Ｙ＝０．０２６２Ｘ＋０．０１０５（ｎ＝８）、Ｒ^２＝０．９９９１、回収率は９５～１０５％であり、標準曲線のあてはめが良好であった。

【実施例2】

【0114】

メタンスルホン酸アンモニウムを内水相とするイリノテカンリポソームの調製及びキャラクタリゼーション
本実施例で使用したリン脂質は、いずれもドイツのリポイド（Ｌｉｐｏｉｄ）社から購入した。具体的には、水素添加大豆リン脂質（ＨＳＰＣ、分子量７８３．８）、ポリエチレングリコール化リン脂質（具体的には、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００））、コレステロール（ＣＨＯＬ、分子量３８６．７）を購入した。また、使用した塩酸イリノテカンはアラジン（Ａｌａｄｄｉｎ）社から購入し、使用したメタンスルホン酸はシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社から購入した。また、使用したアンモニア水はアラジン社から購入した。

【0115】

説明すべき点として、後述の実施例で使用したリン脂質はいずれもリポイド社から購入した水素添加大豆リン脂質であり、使用したポリエチレングリコール化リン脂質は、いずれもリポイド社から購入したジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコールであり、使用したコレステロールはいずれもリポイド社のコレステロールであり、使用した塩酸イリノテカンはいずれもアラジン社から購入したものであった。

【0116】

２．１ イリノテカンリポソームの調製
具体的な調製過程は下記の通りであった。

【0117】

ステップ（１）：４７９．９ｍｇの水素添加大豆リン脂質、１６０．９ｍｇのコレステロール、及び１６０．８ｍｇのジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール２０００を精密に計量し、適量のエタノールを加えて十分に溶解及び混合することで、脂質のエタノール混合溶液を取得した。

【0118】

ステップ（２）：２．１３１ｍｌのメタンスルホン酸溶液を精密に計量し、ｐＨ４．０～６．０となるまでアンモニア水で滴定してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、ｐＨが４．０～６．０である６５０ｍＭのメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を取得した。

【0119】

ステップ（３）：ステップ（１）で取得した脂質のエタノール混合溶液にｐＨが４．０～６．０である６５０ｍＭのメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を１０ｍｌ添加し、７０℃のウォーターバスに入れて３０分間攪拌した。これにより、リポソームを十分に水和させて、比較的均一なリポソーム懸濁液を取得した。

【0120】

ステップ（４）：リポソーム押出機（ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を用い、ステップ（３）で取得したリポソーム懸濁液を孔径の異なるポリカーボネートフィルムから順に１０回ずつ押し出すことで、最終的に粒径１００ｎｍ且つ粒径分布が均一なブランクリポソームを取得した。

【0121】

ステップ（５）：ステップ（４）で調製したリポソームを分画分子量が１００００の透析袋に投入し、１０％ショ糖水溶液を透析液として、４℃で一晩透析した。サンプルと透析液の体積比は１：１０００とした。透析期間中は透析液を３回交換し、リポソームの外水相中のメタンスルホン酸アンモニウムを完全に除去することで、１０％のショ糖からな
る外水相、メタンスルホン酸アンモニウム溶液からなる内水相、及びリン脂質二分子層で構成されるブランクリポソームを取得した。リポソームの内外水相は、一定のｐＨ及びメタンスルホン酸アンモニウム濃度勾配を有していた。具体的に、ブランクリポソームの内水相は６５０ｍＭのメタンスルホン酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．０～６．０）、ブランクリポソームの外水相は質量分率１０％のショ糖水溶液であった。

【0122】

ステップ（６）：ステップ（５）で取得した内水相がメタンスルホン酸アンモニウム溶液であるブランクリポソーム懸濁液と、濃度１０ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液を体積比１：１で混合し、５０～６０℃で１０～３０分間インキュベートすることで、内水相にイリノテカンを含有するリポソームを取得した。

【0123】

２．２ イリノテカンリポソームのキャラクタリゼーション
２．２．１ イリノテカンリポソームの粒径測定
本実施例で調製したイリノテカンリポソームをｄｄＨ_２Ｏで５０倍希釈し、ゼータサイザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）ＺＳ９０（マルバーン社、イギリス）を利用して粒径を分析した。具体的な結果は表３に示す通りとなった。表３から明らかなように、薬物担持後のリポソームの粒径はいずれも１００ｎｍ程度、粒度分布（ＰＤＩ）はいずれも０．１未満であった。また、薬物担持前のブランクリポソームについても、粒径はいずれも１００ｎｍ程度、粒度分布（ＰＤＩ）はいずれも０．１未満であった。

【0124】

２．２．２ イリノテカンリポソームの封入率の測定
調製したイリノテカンリポソームに適量のダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）樹脂（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社）を添加し、十分に振蕩して未封入のイリノテカンを吸着した。そして、これを静置したあとに上清を２００ｕｌ採取し、ＵＶ測定分析法（実施例１）を用いて、樹脂添加前後におけるリポソーム中のイリノテカン含有量を測定した。

【0125】

イリノテカンリポソームの封入率（ＥＥ）は、下記式により算出した。

【数1】

【0126】

式中のＭ_{ｉｎｔｅｒ}は、遊離薬物を樹脂で吸着したあとのリポソーム製剤中のイリノテカン含有量である。即ち、リポソームに封入されたイリノテカンの含有量である。Ｍ_{ｔｏｔａｌ}は、樹脂で吸着する前のイリノテカンリポソーム製剤中のイリノテカンの含有量である。即ち、イリノテカンの投入量である。結果は表２に示す通りであった。表２から明らかなように、本方法で調製したイリノテカンリポソームの封入率は良好であり、高い薬物／リポソーム比で薬物担持を実現可能であった。

【表2】

【実施例3】

【0127】

メタンスルホン酸トリエチルアミン溶液を内水相とするイリノテカンリポソームの調製及びキャラクタリゼーション
本実施例で使用したメタンスルホン酸はシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社から購入した。また、使用したトリエチルアミンはシノファーム（ＳＩＮＯＰＨＡＲＭ）から購入した。

【0128】

２．１３１ｍｌのメタンスルホン酸溶液を精密に計量し、ｐＨ４．０～６．０となるまでトリエチルアミンで滴定してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、ｐＨが４．０～６．０である６５０ｍＭのメタンスルホン酸トリエチルアミン緩衝液を取得した。

【0129】

次に、イリノテカンリポソームを調製した。具体的な調製過程については実施例２を参照する。ただし、実施例２との違いとして、ステップ（３）では、ステップ（１）で取得した脂質のエタノール溶液にメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を添加するのではなく、ｐＨが４．０～６．０である６５０ｍＭのメタンスルホン酸トリエチルアミン緩衝液を１０ｍｌ添加した。

【0130】

イリノテカンリポソームのキャリブレーション方法については実施例２を参照する。結果は表３に示す通りであった。表３から明らかなように、実施例３で調製したイリノテカンリポソームの封入率は約７０％程度であった。実施例２の結果と比較すると、メタンスルホン酸トリエチルアミンをリポソームの内水相とした場合には、封入率がやや低下した。このことは、能動的薬物担持におけるアンモニウム塩イオン濃度勾配の寄与がトリエチルアミンイオン濃度勾配よりも優れていることを意味する。

【表3】

【実施例4】

【0131】

４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム溶液を内水相とするイリノテカンリポ
ソームの調製及びキャラクタリゼーション
本実施例で使用した４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸はマックリン（Ｍａｃｋｌｉｎ）社から購入した。また、使用したアンモニア水はアラジン社から購入した。

【0132】

６．５１３ｍｌの４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸溶液を精密に計量し、ｐＨ４．０～６．０となるまでアンモニア水で滴定してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、ｐＨが４．０～６．０である６５０ｍＭの４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム緩衝液を取得した。

【0133】

次に、イリノテカンリポソームを調製した。具体的な調製過程については実施例２を参照する。ただし、実施例２との違いとして、ステップ（３）では、ステップ（１）で取得した脂質のエタノール溶液にメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を添加するのではなく、濃度が６５０ｍＭの４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０～６．０）を１０ｍｌ添加した。

【0134】

イリノテカンリポソームのキャリブレーション方法については実施例２を参照する。結果は表４に示す通りであった。表４から明らかなように、実施例４で調製したイリノテカンリポソームの封入率は良好であった。

【表4】

【実施例5】

【0135】

４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミン溶液を内水相とするイリノテカンリポソームの調製及びキャラクタリゼーション
本実施例で使用した４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミンはマックリン（Ｍａｃｋｌｉｎ）社から購入した。また、使用したトリエチルアミンはシノファームから購入した。

【0136】

６．５１３ｍｌの４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸溶液を精密に計量し、ｐＨ４．０～６．０となるまでトリエチルアミンで滴定してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、ｐＨが４．０～６．０である６５０ｍＭの４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミン緩衝液を取得した。

【0137】

次に、イリノテカンリポソームを調製した。具体的な調製過程については実施例２を参照する。ただし、実施例２との違いとして、ステップ（２）では、ステップ（１）で取得した脂質のエタノール溶液にメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を添加するのではなく、ｐＨが４．０～６．０である６５０ｍＭの４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミン緩衝液を１０ｍｌ添加した。

【0138】

イリノテカンリポソームのキャリブレーション方法については実施例２を参照する。結果は表５に示す通りであった。表５から明らかなように、実施例５で調製したイリノテカ
ンリポソームの封入率は良好であった。

【表5】

【0139】

実施例２、３、４、５における４種類の内水相の成分がイリノテカンリポソームの薬物担持能力に及ぼす影響は図３に示す通りであった。

【実施例6】

【0140】

エタンジスルホン酸アンモニウム溶液を内水相とするイリノテカンリポソームの調製及びキャラクタリゼーション
本実施例で使用したエタンジスルホン酸は、アルファ・エイサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）社から購入した。また、使用したアンモニア水はアラジン社から購入した。

【0141】

３．１５３８ｍｇのエタンジスルホン酸水和物を精密に計量し、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）に溶解してから、アンモニア水でｐＨ４．０～６．０となるまで滴定した。そして、再蒸留水で５０ｍｌまで定容することで、ｐＨが４．０～６．０である３２５ｍＭのエタンジスルホン酸アンモニウム緩衝液を取得した。
次に、イリノテカンリポソームを調製した。具体的な調製過程については実施例２を参照する。ただし、実施例２との違いとして、ステップ（２）では、ステップ（１）で取得した脂質のエタノール溶液にメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を添加するのではなく、ｐＨが４．０～６．０である３２５ｍＭのエタンジスルホン酸アンモニウム緩衝液を１０ｍｌ添加した。

【0142】

イリノテカンリポソームのキャリブレーション方法については実施例２を参照する。結果は表６に示す通りであった。表６から明らかなように、実施例６で調製したイリノテカンリポソームの封入率は良好であった。

【表6】

【実施例7】

【0143】

エタンジスルホン酸トリエチルアミン溶液を内水相とするイリノテカンリポソームの調
製及びキャラクタリゼーション
本実施例で使用したエタンジスルホン酸は、アルファ・エイサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）社から購入した。また、使用したトリエチルアミンはシノファームから購入した。

【0144】

３．１５３５ｍｇのエタンジスルホン酸水和物を精密に計量し、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）に溶解してから、トリエチルアミンでｐＨ４．０～６．０となるまで滴定した。そして、再蒸留水で５０ｍｌまで定容することで、ｐＨが４．０～６．０である３２５ｍＭのエタンジスルホン酸トリエチルアミン緩衝液を取得した。

【0145】

次に、イリノテカンリポソームを調製した。具体的な調製過程については実施例２を参照する。ただし、実施例２との違いとして、ステップ（２）では、ステップ（１）で取得した脂質のエタノール溶液にメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を添加するのではなく、ｐＨが４．０～６．０である３２５ｍＭのエタンジスルホン酸トリエチルアミン緩衝液を１０ｍｌ添加した。

【0146】

イリノテカンリポソームのキャリブレーション方法については実施例２を参照する。結果は表７に示す通りであった。表７から明らかなように、実施例７で調製したイリノテカンリポソームの封入率は良好であった。

【表7】

【実施例8】

【0147】

プロパンジスルホン酸アンモニウム溶液を内水相とするイリノテカンリポソームの調製及びキャラクタリゼーション
本実施例で使用したプロパンジスルホン酸は、アルファ・エイサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）社から購入した。また、使用したアンモニア水はアラジン社から購入した。

【0148】

４．７４１ｍｌのプロパンジスルホン酸溶液を精密に計量し、ｐＨ４．０～６．０となるまでアンモニア水で滴定してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、ｐＨが４．０～６．０である３２５ｍＭのプロパンジスルホン酸アンモニウム緩衝液を取得した。

【0149】

次に、イリノテカンリポソームを調製した。具体的な調製過程については実施例２を参照する。ただし、実施例２との違いとして、ステップ（２）では、ステップ（１）で取得した脂質のエタノール溶液にメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を添加するのではなく、ｐＨが４．０～６．０である３２５ｍＭのプロパンジスルホン酸アンモニウム緩衝液を１０ｍｌ添加した。

【0150】

イリノテカンリポソームのキャリブレーション方法については実施例２を参照する。結果は表８に示す通りであった。表８から明らかなように、実施例８で調製したイリノテカンリポソームの封入率は良好であった。

【表8】

【実施例9】

【0151】

プロパンジスルホン酸トリエチルアミン溶液を内水相とするイリノテカンリポソームの調製及びキャラクタリゼーション
本実施例で使用したプロパンジスルホン酸は、アルファ・エイサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）社から購入した。また、使用したトリエチルアミンはシノファームから購入した。

【0152】

４．７３５ｍｌの４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸溶液を精密に計量し、ｐＨ４．０～６．０となるまでトリエチルアミンで滴定してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、ｐＨが４．０～６．０である３２５ｍＭのプロパンジスルホン酸トリエチルアミン緩衝液を取得した。

【0153】

次に、イリノテカンリポソームを調製した。具体的な調製過程については実施例２を参照する。ただし、実施例２との違いとして、ステップ（２）では、ステップ（１）で取得した脂質のエタノール溶液にメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を添加するのではなく、ｐＨが４．０～６．０である３２５ｍＭのプロパンジスルホン酸トリエチルアミン緩衝液を１０ｍｌ添加した。

【0154】

また、イリノテカンリポソームのキャリブレーション方法については実施例２を参照する。結果は表９に示す通りであった。表９から明らかなように、実施例９で調製したイリノテカンリポソームの封入率は良好であった。

【表9】

【0155】

実施例２～９における８種類のスルホン酸塩勾配がイリノテカンリポソームの封入率に及ぼす影響は図３に示す通りであった。

【実施例10】

【0156】

異なるスルホン酸塩を内水相とするイリノテカンリポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏ放出研
究
薬物／リポソーム比が異なると、リポソームの内水相中の薬物濃度が異なることから、薬物とスルホン酸基イオンにより形成される不溶性塩が異なる構造を有する可能性が高くなり、これにより異なる薬物放出速度を有する可能性が生じる。そこで、異なるスルホン酸塩（アンモニウム塩及びトリエチルアミン塩を含む）を内水相として調製したイリノテカンリポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏ放出速度を比較するために、本実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出研究を行うイリノテカンリポソームはいずれも同じ薬物／リポソーム比（０．３）を有していた。また、薬物担持濃度はいずれも２．５８ｍｇ／ｍｌ、脂質濃度はいずれも８．９１ｍｇ／ｍｌとした。

【0157】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出研究に用いたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、生工生物工程（上海）股▲分▼有限公司から購入した。また、ダウエックス樹脂はシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社から購入した。

【0158】

イリノテカンリポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏ放出実験の具体的な過程は次の通りであった。

【0159】

ステップ（１）：４．０１５２ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）粉末を精密に計量し、１００ｍｌのアルブミン生理食塩水に溶解することで、４０ｍｇ／ｍｌのアルブミン生理食塩水溶液を配合した（タンパク質濃度は５０％血漿中のタンパク質濃度に相当した）。

【0160】

ステップ（２）：実施例２～９における異なるモノスルホン酸塩溶液又はジスルホン酸塩（ｐＨ４．０～６．０）溶液を内水相として調製したイリノテカンリポソームを取得した。なお、脂質濃度は８．９１ｍｇ／ｍｌ、薬物／リポソーム比（薬物と脂質のモル比）はいずれも０．３であった。

【0161】

ステップ（３）：４０ｍｇ／ｍｌのアルブミン生理食塩水溶液でリポソームを８０倍希釈した。次に、十分な量のダウエックス樹脂を添加して遊離薬物を吸着し、シンク条件を形成してから、３７℃、１００ｒｐｍの振蕩器（ＴＨＺ－Ｃ恒温振蕩器、中国）で振蕩した。続いて、異なるタイミング（０時間、１時間、３時間、６時間、９時間及び２４時間）でサンプリングし、静置したあとに上清を採取した。そして、リポソームに封入されたイリノテカンの含有量をＵＶ法で測定し、タイミング別にイリノテカンの累積放出速度を算出した。

【0162】

また、比較として、本発明では、市販のオニバイドの説明書に基づき、ショ糖オクタ硫酸エステルトリエチルアミンを内水相とするイリノテカンリポソームを自作した。当該イリノテカンリポソームは、脂質濃度が８．９１ｍｇ／ｍｌ、薬物／リポソーム比が０．３であった。また、ｐＨが４．０～６．０である３２５ｍＭの硫酸アンモニウムを内水相とするイリノテカンリポソームを自作した。当該イリノテカンリポソームは、脂質濃度が８．９１ｍｇ／ｍｌ、薬物／リポソーム比が０．３であった。そして、上記の方法に基づき、ショ糖オクタ硫酸エステルトリエチルアミン及び硫酸アンモニウムを内水相とするイリノテカンリポソームについて、アルブミン生理食塩水中におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ放出速度を並行して測定するとともに、本発明で提案するイリノテカンリポソーム製剤の放出速度と比較した。

【0163】

各群のイリノテカンリポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏ累積放出曲線は図４に示す通りであった。図４から明らかなように、メタンスルホン酸アンモニウム、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミン、エタンジスルホン酸アンモニウム、エタンジスルホン酸トリエチルアミン、プロパンジスルホ
ン酸アンモニウム、及びプロパンジスルホン酸トリエチルアミン溶液を内水相とするリポソームのイリノテカンは、アルブミン生理食塩水溶液中においていずれも良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ徐放効果を有していた。また、２４時間累積放出パーセンテージで見ると、メタンスルホン酸アンモニウム群は１０．０３％、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム群は１１．３５％、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミン群は１０．３２％、エタンジスルホン酸アンモニウム群は１．０３％、エタンジスルホン酸トリエチルアミン群は３．４９％、プロパンジスルホン酸アンモニウム群は２．３１％、プロパンジスルホン酸トリエチルアミン群は１．９６％であった。且つ、並行して測定したショ糖オクタ硫酸エステルトリエチルアミン群の２４時間累積放出パーセンテージは８．９１％、硫酸アンモニウム群については１５．３４％に達していた。当該ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出研究の結果より、モノスルホン酸塩及びジスルホン酸塩を内水相としたイリノテカンリポソームの放出速度は、硫酸アンモニウムを内水相としたリポソームの放出速度よりも明らかに遅くなることがわかった。

【実施例11】

【0164】

イリノテカンスルホン酸塩の融点測定
本実施例で使用したメタンスルホン酸及びヒドロキシベンゼンスルホン酸は、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社から購入した。

【0165】

融点は化合物の内部構造の規則性を反映し得る。塩の融点が高いほど、その分子配列は規則的である可能性が高い。例えば、結晶の融点は無定形のものよりも高いことが多い。リポソームの内水相中で異なるスルホン酸塩とイリノテカンにより形成される可能性のある構造について考察するために、本実施例では、塩酸イリノテカンとスルホン酸塩溶液を直接混合する方式でイリノテカンスルホン酸塩を形成し、各塩の融点を測定した。

【0166】

具体的な過程は下記の通りであった。

【0167】

（１）２．１３１ｍｌのメタンスルホン酸溶液を精密に計量し、２．４３１ｍｌのアンモニア水を添加してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、濃度６５０ｍＭのメタンスルホン酸アンモニウム水溶液を取得した。次に、５０．６ｍｇの塩酸イリノテカンを精密に計量し、６５０ｍＭのメタンスルホン酸アンモニウム水溶液１ｍｌ中に添加して均等に振蕩した。

【0168】

（２）２．１３１ｍｌのメタンスルホン酸溶液を精密に計量し、４．５７２ｍｌのトリエチルアミンを添加してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、濃度６５０ｍＭのメタンスルホン酸トリエチルアミン水溶液を取得した。次に、５０．６ｍｇの塩酸イリノテカンを精密に計量し、６５０ｍＭのメタンスルホン酸トリエチルアミン水溶液１ｍｌ中に添加して均等に振蕩した。

【0169】

（３）６．５１３ｍｌの４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸溶液を精密に計量し、２．４３２ｍｌのアンモニア水を添加してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、濃度６５０ｍＭのヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム水溶液を取得した。次に、５０．６ｍｇの塩酸イリノテカンを精密に計量し、６５０ｍＭのヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム水溶液１ｍｌ中に添加して均等に振蕩した。

【0170】

（４）６．５１３ｍｌの４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸溶液を精密に計量し、５．８６６ｍｌのトリエチルアミンを添加してから、再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で５０ｍｌまで定容することで、濃度６５０ｍＭのヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミン水溶液を取得した。次に、５０．６ｍｇの塩酸イリノテカンを精密に計量し、６５０ｍＭのヒ
ドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミン水溶液１ｍｌ中に添加して均等に振蕩した。

【0171】

上記の塩酸イリノテカンとスルホン酸塩溶液の懸濁液をオイルバスで加熱し、融点を測定した。結果は表１０に示す通りであった。

【表10】

【0172】

表１０から明らかなように、各イリノテカンスルホン酸塩の融点温度は８６～９９℃の間であった。融点の実験結果を後述するＤＳＣ実験の結果と組み合わせて分析したところ、これらのスルホン酸塩溶液をリポソームの内水相とした場合には、リポソームの内水相中のイリノテカンイオンとともに結晶形又は無定形構造の不溶性塩が形成されることで、イリノテカンの安定的な封入が達成されるとともに、イリノテカンリポソームの保持安定性が向上することがわかった。

【実施例12】

【0173】

イリノテカンリポソームの高分解能ＤＳＣによるキャラクタリゼーション
研究の結果、リポソームの内水相中にナノ結晶が形成されることで、リポソーム製剤の保持安定性の向上に有利となり、薬物放出速度を緩和できることがわかっている（Ｗｅｉ，Ｘ．等，Ｃａｒｄｉｎａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｒａｌｉｐｏｓｏｍｅ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ－ｓｕｌｆａｔｅ ｎａｎｏｒｏｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｉｎ ｄｏｘｉｌ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ［Ｊ］．ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ
２０１８，３（３），２５０８－２５１７）。

【0174】

モノスルホン酸塩及びジスルホン酸塩がリポソームの内水相中でイリノテカンとともに形成する塩の微細構造について考察するために、実施例１１の融点測定をベースに、実施例２～９で調製したイリノテカンリポソームの熱力学挙動を高分解能ＤＳＣにより検討した。また、自作したショ糖オクタ硫酸エステルトリエチルアミン及び硫酸アンモニウムを内水相とするイリノテカンリポソームと比較した。ＤＳＣキャラクタリゼーションを行う全てのイリノテカンリポソームのサンプルは、いずれも投入薬物／リポソーム比を０．３、脂質濃度を８．９ｍｇ／ｍｌ、平均粒径を１００ｎｍとした。且つ、ＰＤＩは０．１よりも小さかった。

【0175】

本実施例で使用した示差走査熱量測定計（ＤＳＣ）は、米国ＧＥ社のキャピラリーＤＳＣ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ）であった。また、走査温度は１０～１２０℃、走査速度は１度／分であった。

【0176】

具体的な過程は下記の通りであった。

【0177】

実施例２～９における異なるスルホン酸塩溶液を内水相として調製したイリノテカンリ
ポソームを取得し、０．２２ｕｍの濾過膜で濾過したあと、手動でキャピラリーＤＳＣのサンプルセルに投入した（約２００ｕｌ）。また、１０％ショ糖溶液を対照とした。これらを加熱及び走査して、熱力学チャートを記録した。取得した熱力学チャートは、文献の方法（Ｗｅｉ，Ｘ．等，Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｄｏｘｉｌ（登録商標）ｇａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ “ｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ” ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ２０１６，１０４，２６０－２７０）に基づき処理し、各リポソームに封入されたイリノテカンのモル濃度に基づいて熱力学パラメータを算出した。結果は図５に示す通りであった。各群の塩酸イリノテカンリポソームの主な熱力学パラメータは表１１に示す通りとなった。

【表11】

【0178】

ＤＳＣ実験の結果より、イリノテカンリポソームの内水相中のスルホン酸塩は薬物とともに比較的規則的な構造を形成し、比較的高い融点を有することがわかった。このような形態は、薬物の安定的な封入や製剤の徐放にとって有利である。実施例１０におけるｉｎ
ｖｉｔｒｏ放出結果と組み合わせると、メタンスルホン酸アンモニウム、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸アンモニウム、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸トリエチルアミン溶液及び４群のジスルホン酸塩溶液を内水相とするイリノテカンリポソームは、比較的
良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ徐放効果を有していた。

実施例１２

【0179】

本発明では、更に、実施例２及び実施例６を参照して、その他の種類のイリノテカンリポソームを調製するとともに、キャラクタリゼーションを行った。

【0180】

タイプ１：実施例２のイリノテカンリポソームの調製方法とは、以下の点において異なっていた。即ち、ステップ（２）では、メタンスルホン酸アンモニウム溶液を取得してｐＨを調整し、ｐＨが９．０である８００ｍＭのメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を調製した。また、ステップ（４）では、粒径サイズが２００ｎｍのブランクリポソームを取得し、ステップ（５）では、濃度１５ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液と混合した。そのほかの点については同様であった。

【0181】

タイプ２：実施例２のイリノテカンリポソームの調製方法とは、以下の点において異なっていた。即ち、ステップ（２）では、メタンスルホン酸アンモニウム溶液を取得してｐＨを調整し、ｐＨが４．５である１００ｍＭのメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を調製した。また、ステップ（４）では、粒径サイズが３０ｎｍのブランクリポソームを取得し、ステップ（５）では、濃度１０ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液と混合した。そのほかの点については同様であった。

【0182】

タイプ３：実施例２のイリノテカンリポソームの調製方法とは、以下の点において異なっていた。即ち、ステップ（２）では、メタンスルホン酸アンモニウム溶液を取得してｐＨを調整し、ｐＨが５．０である２００ｍＭのメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を調製した。また、ステップ（４）では、粒径サイズが５０ｎｍのブランクリポソームを取得し、ステップ（５）では、濃度１３ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液と混合した。そのほかの点については同様であった。

【0183】

タイプ４：実施例２のイリノテカンリポソームの調製方法とは、以下の点において異なっていた。即ち、ステップ（２）では、メタンスルホン酸アンモニウム溶液を取得してｐＨを調整し、ｐＨが８．０である７００ｍＭのメタンスルホン酸アンモニウム緩衝液を調製した。また、ステップ（４）では、粒径サイズが１２０ｎｍのブランクリポソームを取得し、ステップ（５）では、濃度１４ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液と混合した。そのほかの点については同様であった。

【0184】

タイプ５：実施例６のイリノテカンリポソームの調製方法とは、以下の点において異なっていた。即ち、ステップ（２）では、エタンジスルホン酸水和物溶液を取得してｐＨを調整し、ｐＨが６．０である５００ｍＭのエタンジスルホン酸アンモニウム緩衝液を調製した。また、ステップ（４）では、粒径サイズが９０ｎｍのブランクリポソームを取得し、ステップ（５）では、濃度１４ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液と混合した。そのほかの点については同様であった。

【0185】

タイプ６：実施例６のイリノテカンリポソームの調製方法とは、以下の点において異なっていた。即ち、ステップ（２）では、エタンジスルホン酸水和物溶液を取得してｐＨを調整し、ｐＨが４．０である５０ｍＭのエタンジスルホン酸アンモニウム緩衝液を調製した。また、ステップ（４）では、粒径サイズが１１０ｎｍのブランクリポソームを取得し、ステップ（５）では、濃度１２ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液と混合した。そのほかの点については同様であった。

【0186】

タイプ７：実施例６のイリノテカンリポソームの調製方法とは、以下の点において異な
っていた。即ち、ステップ（２）では、エタンジスルホン酸水和物溶液を取得してｐＨを調整し、ｐＨが４．５である１００ｍＭのエタンジスルホン酸アンモニウム緩衝液を調製した。また、ステップ（４）では、粒径サイズが８０ｎｍのブランクリポソームを取得し、ステップ（５）では、濃度１３ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液と混合した。そのほかの点については同様であった。

【0187】

タイプ８：実施例６のイリノテカンリポソームの調製方法とは、以下の点において異なっていた。即ち、ステップ（２）では、エタンジスルホン酸水和物溶液を取得してｐＨを調整し、ｐＨが７．５である４００ｍＭのエタンジスルホン酸アンモニウム緩衝液を調製した。また、ステップ（４）では、粒径サイズが１５０ｎｍのブランクリポソームを取得し、ステップ（５）では、濃度１３ｍｇ／ｍｌの塩酸イリノテカン水溶液と混合した。そのほかの点については同様であった。

【0188】

上記の実施例は本発明の原理と効果を例示的に説明したものにすぎず、本発明を制限するものではない。本技術を熟知する者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱しないことを前提に、上記の実施例を補足又は変形することが可能である。従って、当業者が本発明に開示される精神及び技術的思想から逸脱することなく遂行するあらゆる等価の補足又は変形もまた本発明の特許請求の範囲に含まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】