特許 7397079 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン、トランスフェリン受容体及びそれらの抗体の応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-04

(45)【発行日】2023-12-12

(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン、トランスフェリン受容体及びそれらの抗体の応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/40 20060101AFI20231205BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20231205BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231205BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20231205BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20231205BHJP

【ＦＩ】

A61K38/40

A61K38/17

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P31/14

C12N15/09 Z ZNA

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2021530290

(86)(22)【出願日】2020-06-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-16

(86)【国際出願番号】 CN2020098861

(87)【国際公開番号】W WO2022000167

(87)【国際公開日】2022-01-06

【審査請求日】2021-05-26

(73)【特許権者】

【識別番号】510030331

【氏名又は名称】中国科学院昆明▲動▼物研究所

【氏名又は名称原語表記】ＫＵＮＭＩＮＧ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＺＯＯＬＯＧＹ ．ＣＡＳ（ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ）

【住所又は居所原語表記】ＮＯ．３２ Ｊｉａｏｃｈａｎｇ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ Ｋｕｎｍｉｎｇ， Ｙｕｎｎａｎ ６５０２２３ （ＣＮ）

(73)【特許権者】

【識別番号】521228569

【氏名又は名称】中国医学科学院医学生物学研究所

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

【住所又は居所原語表記】９３５ Ｊｉａｏｌｉｎｇ Ｒｏａｄ， Ｗｕｈｕａ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｋｕｎｍｉｎｇ， Ｙｕｎｎａｎ ６５００３１， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】▲頼▼▲仭▼

(72)【発明者】

【氏名】彭小忠

(72)【発明者】

【氏名】唐小▲梵▼

(72)【発明者】

【氏名】廖祉亦

(72)【発明者】

【氏名】▲魯▼▲帥▼▲堯▼

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼▲紅▼旗

【審査官】井上 能宏

(56)【参考文献】

【文献】Zhang, S. et al.，Ttansferrin receptor 1 is a supplementary receptor that assists transmissible gastroenteritis virus entry into porcine intestinal epithelium，Cell Communication and Signaling，2018年10月20日，Vol. 16, No. 1，DOI:10.1186/s12964-018-0283-5

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ、Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリンの使用。

【請求項2】

前記トランスフェリンの濃度が２５０ｎｍｏｌ／Ｌ以上であることを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項3】

トランスフェリンを含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬。

【請求項4】

抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン受容体の使用。

【請求項5】

前記トランスフェリン受容体の濃度が、１００ｎｍｏｌ／Ｌ以上であることを特徴とする請求項４に記載の使用。

【請求項6】

トランスフェリン受容体を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬。

【請求項7】

抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン受容体抗体の使用。

【請求項8】

前記トランスフェリン受容体抗体の濃度が、７０ｎｍｏｌ／Ｌ以上であることを特徴とする請求項７に記載の使用。

【請求項9】

トランスフェリン受容体抗体を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬。

【請求項10】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質のトランスフェリン受容体への結合を阻害する生物学的製品の調製におけるトランスフェリン及び／又はトランスフェリン受容体抗体の使用。

【請求項11】

トランスフェリン及び／又はトランスフェリン受容体抗体を含むことを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質のトランスフェリン受容体への結合を阻害するための生物学的製品。

【請求項12】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質に結合する生物学的製品の調製におけるトランスフェリン受容体の使用。

【請求項13】

トランスフェリン及びトランスフェリン受容体抗体を含み；前記トランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体のモル比が、１：１以上であることを特徴とする抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの組成物。

【請求項14】

抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製における請求項１３に記載の組成物の使用。

【請求項15】

有効成分及び添加剤を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬であって、
前記有効成分には、トランスフェリン及びトランスフェリン受容体抗体が含まれ；
前記トランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体のモル比が１：１以上であることを特長とする抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ウイルス薬の技術分野に属し、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン、トランスフェリン受容体及びそれらの抗体の応用に関する。

【背景技術】

【0002】

２１世紀以来、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、及び新規コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、種の壁を越え、動物を介して人間に広がり、人間に重度の肺炎を患わせる。症例の早期発見や隔離などの公衆衛生介入措置を通じて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶの流行は首尾よく封じ込められた。２０１９年１２月に、新しいコロナウイルスが発見され、２０２０年１月にシーケンス及び分離された。２０２０年１月３０日、世界保健機関は、国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の流行を発表した（非特許文献１～３）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスは、ＲＮＡゲノムが陽性のエンベロープウイルスであり、コロナウイルス亜科に属している。それらは４つの属（α、β、γ、及びδ）に分類され、β－ＣｏＶはさらに４つの種（Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）に分類される。

【0003】

トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）は血漿中の主要な鉄含有タンパク質であり、トランスフェリンの分子量は約７７，０００であり、一本鎖糖タンパク質であり、消化管によって吸収された鉄と、赤血球分解によって放出された鉄を運ぶ役割を果たす。現時点の研究により、トランスフェリンの生理学的機能は、鉄イオンを輸送する機能に加えて、抗菌性や細胞の成長と分化への関与などの重要な機能も持っていることを示している（非特許文献４）。トランスフェリンは、また、トランスフェリン受容体のエンドサイトーシス経路を介して鉄を細胞に移動させるため、トランスフェリン受容体は細胞の鉄ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしている（非特許文献５）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Ａ． Ｃ． Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｅｌｌ １８１， ２８１－２９２ ｅ２８６（２０２０）．

【文献】Ｒ． Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｕｎｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ （ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６８， ４８９－４９３ （２０２０）．

【文献】Ｗ． Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ． ＪＡＭＡ， （２０２０）．

【文献】Ｐ． Ｔ． Ｇｏｍｍｅ， Ｋ．Ｂ．ＭｃＣａｎｎ，Ｊ．Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １０， ２６７－２７３ （２００５）．

【文献】Ｈ． Ｆｕｃｈｓ， Ｕ． Ｌｕｃｋｅｎ， Ｒ． Ｔａｕｂｅｒ， Ａ． Ｅｎｇｅｌ， Ｒ． Ｇｅｓｓｎｅｒ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ－ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ６，１２３５－１２４３（１９９８）．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

これを考慮して、本発明の目的は、トランスフェリンの新しい用途、即ちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリンの応用を提供することである。

【0006】

本発明の目的はまた、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン受容体又はトランスフェリン受容体抗体の応用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリンの応用を提供する。

【0008】

好ましくは、前記トランスフェリンの濃度は、２５０ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。

【0009】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスにおけるトランスフェリンの応用を提供する。

【0010】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン受容体の応用を提供する。

【0011】

好ましくは、前記トランスフェリン受容体の濃度は、１００ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。

【0012】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスにおけるトランスフェリン受容体の応用を提供する。

【0013】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン受容体抗体の応用を提供する。

【0014】

好ましくは、前記トランスフェリン受容体抗体の濃度は、７０ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。

【0015】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスにおけるトランスフェリン受容体抗体の応用を提供する。

【0016】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質に結合する生物学的製品の調製におけるトランスフェリン及び／又はトランスフェリン受容体抗体の応用を提供する。

【0017】

本発明は、トランスフェリン及び／又はトランスフェリン受容体抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに結合するスパイクタンパク質の生物学的製品を提供する。

【0018】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質に結合する生物学的製品の調製におけるトランスフェリン受容体の応用を提供する。

【0019】

本発明は、トランスフェリン及びトランスフェリン受容体抗体を含み；前記トランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体のモル比が、１：１以上である抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの組成物を提供する。

【0020】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製における前記組成物の応用を提供する。

【0021】

本発明は、有効成分及び添加剤を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの薬を提供し、前記有効成分には、トランスフェリン及びトランスフェリン受容体抗体が含まれる；
前記トランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体のモル比は１：１以上である。

【0022】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリンの応用を提供する。本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び免疫蛍光の２つの方法を使用して、細胞レベルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ）を介してトランスフェリン受容体に結合することを証明する。したがって、トランスフェリンは生体のトランスフェリン受容体に競合的結合に使用されて、トランスフェリン受容体の活性サイトをブロックし、トランスフェリン受容体へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合を阻害することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが細胞を感染する経路をブロックして、生体の抗ウイルス効果を達成する。実験では、レムデシビルが陽性対照薬として使用され、トランスフェリンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染された細胞の治療に使用され、結果では、トランスフェリンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を効果的に阻害でき、且つ阻害の強さは用量依存的であることが証明された。

【0023】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン受容体の応用を提供する。本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び免疫蛍光の２つの方法を使用して、細胞レベルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ）を介してトランスフェリン受容体に結合することが証明されたので、トランスフェリン受容体を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに競合的結合させて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの結合サイトをブロックし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と生体のトランスフェリン受容体の結合を阻害することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが細胞を感染する経路をブロックして、生体の抗ウイルス効果を達成する。実験では、レムデシビルが陽性対照薬として使用され、トランスフェリン受容体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染された細胞の治療に使用され、結果では、トランスフェリン受容体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を効果的に阻害でき、且つ阻害の強さは用量依存的であることが証明された。

【発明の効果】

【0024】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン受容体抗体の応用を提供する。本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び免疫蛍光の２つの方法を使用して、細胞レベルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ）を介してトランスフェリン受容体に結合することが証明されたので、トランスフェリン受容体抗体はトランスフェリン受容体に競合的結合して、トランスフェリン受容体の結合サイトをブロックし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と生体のトランスフェリン受容体の結合を阻害することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが細胞を感染する経路をブロックして、生体の抗ウイルス効果を達成する。実験では、レムデシビルが陽性対照薬として使用され、トランスフェリン受容体のモノクローナル抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染された細胞の治療に使用され、結果では、トランスフェリン受容体抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を効果的に阻害でき、且つ阻害の強さは用量依存的であることが証明された。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】実施例１と実施例２における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）と免疫蛍光により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｓｐｉｋｅ（スパイクタンパク質）のトランスフェリン受容体への結合が証明された；その中で、上から下への曲線は、それぞれ２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、１５．６２５ｎＭ、７．８１２５ｎＭ、及び３．９０６２５ｎＭを表し；Ｂは免疫蛍光によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク（スパイクタンパク質）がトランスフェリン受容体に結合することが検証された結果を示す図であり；

【図2】比較例１における陽性対照薬レムデシビルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染されたＶｅｒｏＥ６細胞を治療した形態図であり；

【図3】実施例３におけるさまざまな濃度の（３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ及び１０００ｎＭ）トランスフェリンにより、治療されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏＥ６細胞の比較図；

【図4】実施例３におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染された細胞に対するトランスフェリンの阻害率に関するＣＰＥ及びｑＰＣＲによる統計結果であり、その中で、Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染された細胞に対するトランスフェリンの阻害率のＣＰＥ分析による統計結果であり；Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染された細胞に対するトランスフェリンの阻害率のｑＰＣＲ分析による統計結果であり；

【図5】実施例４におけるさまざまな濃度の（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ及び８００ｎＭ）トランスフェリン受容体に治療された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染されたＶｅｒｏＥ６細胞の比較図；

【図6】実施例４におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染された細胞に対するトランスフェリン受容体の阻害率に関するＣＰＥ及びｑＰＣＲによる統計結果であり、その中で、Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染された細胞に対するトランスフェリンの阻害率のＣＰＥ分析による統計結果であり；Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染された細胞に対するトランスフェリンの阻害率のｑＰＣＲ分析による統計結果であり；

【図7】実施例５におけるさまざまな濃度の（（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ及び４００ｎＭ）トランスフェリン受容体のモノクローナル抗体に治療された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染されたＶｅｒｏＥ６細胞の比較図；

【図8】実施例５におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染された細胞に対するトランスフェリン受容体のモノクローナル抗体の阻害率に関するＣＰＥ及びｑＰＣＲによる統計結果であり、その中で、Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染された細胞に対するトランスフェリンの阻害率のＣＰＥ分析による統計結果であり；Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染された細胞に対するトランスフェリンの阻害率のｑＰＣＲ分析による統計結果である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリンの応用を提供する。

【0027】

本発明は、前記トランスフェリンの供給源を特に限定せず、当技術分野でよく知られているトランスフェリンを使用することができる。本発明の実施形態では、前記トランスフェリンはＳｉｇｍａから購入され、製品番号はＴ４３８２である。一連の連続した濃度勾配のトランスフェリンを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染された細胞を治療した結果により、トランスフェリンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を効果的に阻害でき、且つ阻害の強さは用量依存的であることが証明された。細胞変性効果（ＣＰＥ）分析の結果では、前記トランスフェリンのＥＣ_５０が１２５ｎＭｏｌ／Ｌであることが示され；逆転写リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の定量分析では、前記トランスフェリンのＥＣ_５０が１６０ｎＭｏｌ／Ｌであることが示された。前記トランスフェリンの濃度は、好ましくは２５０ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。

【0028】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン受容体の応用を提供する。

【0029】

本発明は、前記トランスフェリン受容体供給源を特に限定せず、当技術分野でよく知られているトランスフェリン受容体を使用することができる。本発明の実施形態において、前記トランスフェリン受容体は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入され、製品番号は、１１０２０－Ｈ０７Ｈである。一連の濃度勾配のトランスフェリン受容体を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染された細胞を治療した結果により、トランスフェリン受容体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を効果的に阻害でき、且つ阻害の強さは用量依存的であることが証明された。細胞変性効果（ＣＰＥ）分析の結果では、前記トランスフェリン受容体のＥＣ_５０が８０ｎｍｏｌ／Ｌであることが示され；逆転写リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の定量分析では、前記トランスフェリン受容体のＥＣ_５０が９３ｎｍｏｌ／Ｌであることが示された。前記トランスフェリン受容体の濃度は、１００ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。

【0030】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン受容体抗体の応用を提供する。

【0031】

本発明は、前記トランスフェリン受容体抗体の種類を特に限定せず、当技術分野でよく知られているポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することができる。本発明は、前記抗体の供給源を特に限定せず、当技術分野でよく知られているトランスフェリン受容体抗体を使用することができる。本発明の実施例において、前記トランスフェリン受容体モノクローナル抗体は、Ａｂｃａｍから購入され、製品番号はａｂ１０８６である。一連の濃度勾配のトランスフェリン受容体モノクローナル抗体を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染された細胞を治療した結果により、トランスフェリン受容体モノクローナル抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を効果的に阻害でき、且つ阻害の強さは用量依存的であることが証明された。細胞変性効果（ＣＰＥ）分析の結果では、前記トランスフェリン受容体モノクローナル抗体のＥＣ５_０が８０ｎｍｏｌ／Ｌであることが示され；逆転写リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の定量分析では、前記トランスフェリン受容体モノクローナル抗体のＥＣ_５０が５０ｎｍｏｌ／Ｌであることが示された。前記トランスフェリン受容体の濃度は、１６．６ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。前記トランスフェリン受容体抗体の濃度は、７０ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。

【0032】

実験により、トランスフェリン又はトランスフェリン受容体抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の生体のトランスフェリン受容体への結合をブロックすることによって、抗ウイルス効果を発揮し、そして、前記結合は、前記ウイルスがスパイクタンパク質を介して生体のトランスフェリン受容体に結合することによって達成されることが証明された。したがって、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質に結合する生物学的製品の調製におけるトランスフェリン及び／又はトランスフェリン受容体抗体の応用を提供する。同時に、本発明はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質に結合する生物学的製品の調製におけるトランスフェリン受容体の応用を提供する。本発明は、前記生物学的製品の種類を特に限定せず、当技術分野でよく知られている生物学的製品を製造すればよい。

【0033】

本発明は、トランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの組成物を提供し；前記トランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体のモル比は、１：１以上である。

【0034】

本発明は、前記トランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体の供給源を特に限定せず、当技術分野でよく知られているトランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体を使用することができる。前記トランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体のモル比は、好ましくは２～５：１、より好ましくは３～４：１である。

【0035】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製における前記組成物の応用を提供する。

【0036】

本発明において、前記薬物の剤形を特に限定せず、当技術分野でよく知られている薬物の剤形を使用することができる。前記薬物には、さまざまな剤形に応じてさまざまな種類の添加剤が含まれる。本発明は、前記添加剤の種類を特に限定せず、当技術分野でよく知られている添加剤を使用することができる。

【0037】

本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスにおけるトランスフェリン、トランスフェリン受容体、又はトランスフェリン受容体抗体の応用を提供する。本発明は、前記トランスフェリン、トランスフェリン受容体、又はトランスフェリン受容体抗体の供給源を特に限定せず、当技術分野でよく知られているトランスフェリン、トランスフェリン受容体、又はトランスフェリン受容体抗体を使用することができる。

【0038】

本発明は、有効成分及び添加剤を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬を提供し、前記有効成分にはトランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体を含む；前記トランスフェリンとトランスフェリン受容体抗体のモル比が１：１以上であり、好ましくは２～５：１であり、より好ましくは３～４：１である。本発明は、前記添加剤の種類及び含有量を特に限定せず、当技術分野でよく知られている薬物の添加剤を使用することができる。本発明は、前記薬物の調製方法を特に限定せず、当技術分野でよく知られている薬物の調製方法を使用することができる。

【0039】

以下では、実施例を組み合わせて本発明によって提供される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン、トランスフェリン受容体及びその抗体の応用に対して詳細に説明を行うが、それらは、本発明の保護の範囲を制限するものとして理解すべきではない。
実施例１

【0040】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－スパイク（ｓｐｉｋｅ）とトランスフェリン受容体の結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による検証
ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を使用して、トランスフェリン受容体とスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ）との間の相互作用を分析した。まず、トランスフェリン受容体（製品番号１１０２０－Ｈ０７Ｈ）を２００μｌの酢酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ５）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、ＣＭ５センサーチップ（ＢＲ１０００１２、ＧＥ）を５μｌ／ｍｉｎ流量で通過させ、共振ユニット（ＲＵ）は２０００に達し；チップ上の残りの活性化サイトは、７５μｌのエタノールアミン溶液（１Ｍ、ｐＨ８．５）でブロックされる。スパイクタンパク質（３．９０６２５ｎＭ、７．８１２５ｎＭ、１５．６２５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ；製品番号Ｚ０３４８１）の連続濃度を、１０μｌ／ｍｉｎの流速で、それらと固定化トランスフェリン受容体との相互作用について分析した。ＢＩＡソフトウェア（ＧＥ、ＵＳＡ）を使用して、結合のＫＤ及びＫａとＫｄの速度定数を決定した。

【0041】

結果を図１Ａに示す。図１Ａから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質がトランスフェリン受容体に結合し、強い結合能力を持っていることがわかる。
実施例２

【0042】

細胞レベルでのトランスフェリン受容体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質の結合の免疫蛍光による検証
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞の膜表面にあるトランスフェリン受容体とスパイクタンパク質の複合体を検出するために、細胞（ＭＯＣＫ）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ＝０．２）に２時間感染させ、感染していないＭＯＣＫを対照とした。ＰＢＳで洗浄した後、ＭＯＣＫ細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、１％ＢＳＡ溶液を用いて室温で１時間ブロックし、次に抗トランスフェリン受容体抗体（１：２００で希釈；１１０２０－ＭＭ０４ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）と抗スパイクタンパク質（１：２００で希釈；４０１５０－Ｒ００７、Ｓｉｎｏ ｂｉｏｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）の抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄して過剰な一次抗体を除去した後、切片を蛍光標識した二次抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄して過剰な二次抗体を除去した後、細胞をＤＡＰＩ（Ｐ３６９４１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）で染色し、共焦点顕微鏡（ＦｌｕｏＶｉｅｗ^TM１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＳＡ）で画像化した。

【0043】

結果を図１のＢに示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体は、細胞レベルで結合した。
比較例１

【0044】

レムデシビルを陽性対照薬とし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染されたアフリカミドリザル胎児腎臓細胞（ＶｅｒｏＥ６）に対するその影響を研究した。

【0045】

具体的な手順は次のとおりである。ＶｅｒｏＥ６細胞をレムデシビル（４μＭ）で１時間前処理し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを追加して１時間感染させた。次に、ウイルス－タンパク質混合物を除去し、新鮮な４μＭのレムデシビルを含む培地で細胞をさらに培養した。４８時間処理した後、細胞上清を回収し、溶解バッファー（１５５９６０１８、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）で溶解し、顕微鏡で処理前及び処理後の細胞の形態を観察し、写真を撮った。

【0046】

結果を図２に示す。処理前後の細胞形態の比較により、レムデシビルは、細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を阻害することが分かった。
実施例３

【0047】

さまざまな濃度のトランスフェリンによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染されたＶｅｒｏ－Ｅ６細胞の治療
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞をさまざまな濃度（３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、及び１０００ｎＭ）のトランスフェリンで１時間前処理した後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを加えて１時間感染させた。次に、ウイルス－タンパク質混合物を除去し、新鮮なさまざまな濃度（３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、及び１０００ｎＭ）のトランスフェリン含有培地で、細胞をさらに培養した。４８時間培養した後、細胞上清液を回収し、溶解バッファー（１５５９６０１８、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）で溶解し、顕微鏡で処理前と処理後の細胞の形態を観察し、写真を撮った。

【0048】

次に、細胞変性効果（ＣＰＥ）（Ｍ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｅｍｅｒｇｅｄ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ （２０１９－ｎＣｏＶ） ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３０， ２６９－２７１ （２０２０）を参照）とリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用して定量分析した。その中で、ＲＴ－ｑＰＣＲは明細書に従って操作され、それぞれＲＮＡ抽出キット（ＤＰ４１９）と逆転写キット（Ａ５０００）を使用して、ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ逆転写プロセスを実行した。ＲＴ－ｑＰＣＲの検出方法は次のとおりである。
ＮＰ遺伝子プライマー及びプローブのヌクレオチド配列は次のとおりである。

【0049】

Ｔａｒｇｅｔ－２－Ｆ：５’－ｇｇｇｇａａｃｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔａｇａａｔ－３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）；
Ｔａｒｇｅｔ－２－Ｒ：５’－ｃａｇａｃａｔｔｔｔｇｃｔｃｔｃａａｇｃｔｇ－３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）；
Ｔａｒｇｅｔ－２－Ｐ： ５’－ＦＡＭ－ｔｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇａｃａｇａｔｔ－ＴＡＭＲＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）。

【0050】

ＰＣＲ増幅手順は次のとおりである。２５℃２分；５０℃２分；９５℃２分；９５℃５秒、５８℃３１秒で、４０サイクルを実行する。ＰＣＲ増幅システムは次のとおりである。フォワードプライマーＦ、リバースプライマーと蛍光プローブＰはそれぞれ０．５μｌであり；４×ｑＰＣＲ反応ＭＩＸ２．５μｌ、ｄｄＨ_２Ｏで１０μｌになるまで添加した。

【0051】

結果は、図３及び図４に示される。前記の結果から分かるように、ＣＰＥによって計算されたトランスフェリンのＥＣ_５０は１２５ｎＭであり、ＲＴ－ｑＰＣＲの結果によって計算されたトランスフェリンのＥＣ_５０は１６０ｎＭである。トランスフェリンの濃度が高くなるにつれて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する阻害効果が強くなる。トランスフェリンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害できる。
実施例４

【0052】

さまざまな濃度（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、及び８００ｎＭ）のトランスフェリン受容体でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染されたＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を治療した。特定のステップは、実施例３の説明を参照する。

【0053】

結果は、図５及び図６に示される。前記の結果から分かるように、ＣＰＥによって計算されたトランスフェリンのＥＣ_５０は８０ｎＭであり、ＲＴ－ｑＰＣＲの結果によって計算されたトランスフェリンのＥＣ_５０は９３ｎＭである。トランスフェリンの濃度が高くなるにつれて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する阻害効果が強くなる。トランスフェリン受容体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害できる。
実施例５

【0054】

さまざまな濃度のトランスフェリン受容体モノクローナル抗体で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染されたＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を治療した。特定の手順については、実施例３の説明を参照する。

【0055】

結果は、図７及び図８に示される。前記の結果から分かるように、ＣＰＥによって計算されたトランスフェリンのＥＣ_５０は５０ｎＭであり、ＲＴ－ｑＰＣＲの結果によって計算されたトランスフェリンのＥＣ_５０は１６．６ｎＭである。トランスフェリンの濃度が高くなるにつれて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する阻害効果が強くなる。トランスフェリン受容体モノクローナル抗体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害できる。

【0056】

以上の記載は、ただ本発明の好ましい実施形態にすぎず、当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改善及び補正を行うことができ、これらの改善及び補正は、また、本発明の保護範囲と見なされるべきであることに留意されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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