特許 7397445 Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ３に結合する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-05

(45)【発行日】2023-12-13

(54)【発明の名称】Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ３に結合する抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20231206BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231206BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20231206BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231206BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231206BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231206BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231206BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231206BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231206BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 51/00 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C07K16/46

C07K19/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/62 Z

C12P21/08

A61K39/395 L

A61K39/395 N

A61K51/00 100

A61K51/00 200

A61P25/00

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2020527593

(86)(22)【出願日】2019-06-26

(86)【国際出願番号】 JP2019025454

(87)【国際公開番号】W WO2020004492

(87)【国際公開日】2020-01-02

【審査請求日】2022-06-24

(31)【優先権主張番号】P 2018120477

(32)【優先日】2018-06-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的バイオ医薬品創出基盤技術開発事業「ヒトＩｇＧ特異的修飾技術による多様な機能性抗体医薬の創出」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】000001029

【氏名又は名称】協和キリン株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504258527

【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所

(72)【発明者】

【氏名】高橋 信明

(72)【発明者】

【氏名】中野 了輔

(72)【発明者】

【氏名】前田 さやか

(72)【発明者】

【氏名】山田 武直

(72)【発明者】

【氏名】伊東 祐二

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１５－１１９６３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０３４７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】KAKUNAGA S. et al.，Nectin-like molecule-1/TSLL1/SynCAM3: a neural tissue-specific immunoglobulin-like cell-cell adhesion molecule localizing at non-junctional contact sites of presynaptic nerve terminals, axons and glia cell processes，J Cell Sci, 2005, vol.118, p.1267-1277

【文献】HUNTER PR. et al.，Localization of Cadm2a and Cadm3 Proteins During Development of the Zebrafish Nervous System，J Comp Neurol, 2011, vol.519, no.11, p.2252-2270

【文献】ATLAS ANTIBODIES, Product No. HPA002981, Anti-CADM3，2012

【文献】R&D systems, Catalog No. MAB3678, Human IGSF4B/SynCAM3 Antibody，2/7/2018

【文献】宮本結花 ほか，血液能関門の通過を目指したトランスフェリンレセプター特異的VHH抗体の単離，第89回日本生化学会大会, 2016, p.542-543 [3P-350]

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ３（ＣＡＤＭ３）に結合する、下記（ａ）～（ｔ）からなる群より選ばれる１である、抗体または該抗体断片;
（ａ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３、２４および２５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２８、２９および３０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３４、３５および３６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３８、３９および４０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｄ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｅ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３、１４および１５に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｆ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１８、１９および２０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｇ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８９、９０および９１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号９４、９５および９６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｈ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号９９、１００および１０１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｉ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０４、１０５および１０６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｊ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０９、１１０および１１１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｋ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１４、１１５および１１６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｌ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１９、１２０および１２１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｍ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２４、１２５および１２６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｎ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２９、１３０および１３１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（о）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３９、１４０および１４１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｐ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１４４、１４５および１４６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｑ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１４９、１５０および１５１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｒ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５４、１５５および１５６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｓ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５９、１６０および１６１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｔ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６９、１７０および１７１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７４、１７５および１７６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。

【請求項2】

抗体が脳滞留性を有する請求項１に記載の抗体または該抗体断片。

【請求項3】

抗体が神経細胞および／または神経組織結合性を有する請求項１または２に記載の抗体または該抗体断片。

【請求項4】

抗体または該抗体断片が下記（１）～（３０）からなる群より選ばれる１である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片；
（１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２に記載されるアミノ酸配列含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（３）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（４）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（５）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、（６）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、（７）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号６８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、（８）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、（９）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、（１０）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１１）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１２）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１３）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１４）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１５）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１６）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号８８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号９３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（１８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号９８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（１９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１０３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１０８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１１８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２３）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１２３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２４）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１２８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２５）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１３８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２６）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１４３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１４８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（３０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１６８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１７３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。

【請求項5】

抗体または該抗体断片がバイスペシフィック抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。

【請求項6】

バイスペシフィック抗体がＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原に結合する、請求項５に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項7】

バイスペシフィック抗体がＣＡＤＭ３に結合する抗原結合部位および脳に存在する抗原に結合する抗原結合部位を含む、請求項５または６に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項8】

抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、ＶＨＨからなる群より選ばれる１である、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体断片。

【請求項9】

抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。

【請求項10】

抗体がマウス抗体、ラット抗体、ラビット抗体、アルパカ抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群より選ばれる１である、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＡＤＭ３に結合する抗体または該抗体断片に、下記（i）～（iii）からなる群より選ばれる少なくとも１つを結合させた融合抗体または該融合抗体断片；
（i）親水性高分子、
（ii）両親媒性高分子、および
（iii）機能性分子。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を産生する細胞。

【請求項13】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸。

【請求項14】

請求項１３に記載の核酸を含むベクターを含む形質転換細胞。

【請求項15】

請求項１２に記載の細胞または請求項１４に記載の形質転換細胞を培養し、培養液から請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を採取することを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。

【請求項16】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を含む、組成物。

【請求項17】

脳に存在する抗原の検出または測定用の組成物である、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

脳疾患の診断または治療するための組成物である、請求項１６に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば、Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ３（ＣＡＤＭ３）に結合する抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸、該核酸を含むベクターを含む形質転換細胞、該抗体または該抗体断片の製造方法、該抗体または該抗体断片を含む組成物、該抗体または該抗体断片を用いた脳に存在する抗原を検出または測定する方法、脳疾患を診断または治療する方法、抗体の脳滞留性を向上させる方法、脳内の抗体量を増加させる方法などに関する。

【背景技術】

【0002】

１９８６年にマウス抗ＣＤ３抗体、ｍｕｒｏｍｏｎａｂ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）が最初の抗体医薬品としてＦＤＡから承認を受けて以来、数多くの抗体医薬品が開発されている。１９９４年には、マウス抗体のもつ抗原性を低減するために、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を連結したキメラ抗体ａｂｃｉｘｉｍａｂが承認を受けている。

【0003】

さらに抗原性を低減するために、マウス抗体の可変領域の抗原結合に重要な働きをもつ相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）をヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）に移植するヒト化抗体技術が開発され、１９９７年にヒト化抗ＣＤ２０抗体ｄａｃｉｚｕｍａｂが承認を受けている。

【0004】

また、ヒトの抗体配列ライブラリを用いたファージディスプレイ技術が用いられるようになり、ファージディスプレイ技術で取得した最初の抗体として、完全ヒト抗ＴＮＦα抗体ａｄａｌｉｍｕｍａｂが２００２年に承認されている。ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＴＮＦα、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲなどを標的抗原とした抗体医薬品が、既に６０品目以上が承認されている（非特許文献１）。

【0005】

このように、抗体は幅広く認知された医薬品フォーマットとなっている。これまでに承認された抗体医薬品のうち大部分はがんや免疫疾患を対象とするものであり、全体の約７５％以上を占めている。

【0006】

中枢神経疾患の治療においても、抗体などのバイオロジクスの重要性が高まっており、アミロイドβに対するモノクローナル抗体がアルツハイマー病において研究されていることや、神経保護作用を有する各種神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ、ｇｌｉａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＧＤＮＦ）が中枢神経疾患において神経保護作用を示すことが動物モデルで報告されている（非特許文献２）。

【0007】

しかしながら、中枢神経系では、抗体を末梢に投与した場合に他の臓器と比べて送達量が低く、抗体移行率[脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ；ＣＳＦ）中濃度と血清濃度の比]は０．１－０．３％と報告されている（非特許文献３－５）。

【0008】

脳および脊髄を含む中枢神経系において薬剤送達量が低下する理由として、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）と呼ばれる血液と脳との組織液間での物質輸送を制限する機構が挙げられる。血液脳関門は、血管内皮細胞の細胞間接合による物理的・非特異的な制御機構および排出トランスポーターによる基質特異的な排出機構を有しており、異物または薬物から中枢神経系を保護し、恒常性の維持に重要な役割を果たしている。

【0009】

しかしながら、血液脳関門の存在により、中枢神経系では薬剤投与時の有効濃度が得られにくく、薬剤開発が困難になっている。例えば、ハーラー症候群（ムコ多糖症Ｉ型）に対するα－Ｌ－イズロニダーゼや、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）に対するイズロン酸２－スルファターゼの静脈内投与による酵素補充療法が行われているが、酵素の分子量が大きく血液脳関門を通過しないため、中枢神経症状に対する有効性は認められていない（非特許文献６－９）。また、一定量の組換え酵素を定期的に継続投与するため、中和抗体の産生などの副作用が現れることが報告されている（非特許文献１０）。

【0010】

また、脳内濃度を高めるために、バイオロジクスを髄腔内または脳内に直接投与する試みも行われている。例えば、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）の患者の脳障害の進行を防止するために、イズロン酸２－スルファターゼを患者の脳内に投与する方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、髄腔内または脳内への直接投与は侵襲性が高い（非特許文献１１）。

【0011】

そのため、バイオロジクスのような高分子物質の脳内濃度を高めるために、様々な送達技術が研究されている。例えば、脳血管内皮細胞に発現している膜蛋白質に結合し、高分子物質および膜蛋白質の複合体を形成させてエンドサイトーシスにより血液脳関門を通過させる方法が複数報告されている。

【0012】

報告されている技術のほとんどは、受容体介在性トランスサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ；ＲＭＴ）を利用したものであり、標的となる脳血管内皮発現受容体としては、例えばトランスフェリン受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、低比重リポ蛋白質受容体ファミリー（ＬＤＬＲｆ）などがある。

【0013】

抗トランスフェリン受容体抗体および神経成長因子の融合蛋白質を作製することにより、トランスフェリン受容体を介した血液脳関門通過技術が報告されている。抗トランスフェリン受容体抗体を用いた技術としては、抗トランスフェリン受容体抗体および抗ベーターセクレターゼ（ＢＡＣＥ１）抗体のバイスペシフィック抗体（特許文献２および３、ならびに非特許文献１２および１３）、および抗アミロイドβ抗体のカルボキシル末端側に抗トランスフェリン受容体の一価抗体を融合させた融合抗体（特許文献４および非特許文献１４）が報告されている。

【0014】

抗トランスフェリン受容体抗体および抗ＢＡＣＥ１抗体のバイスペシフィック抗体による脳送達は、マウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇ体重で抗体を投与した際に脳での抗体取り込み量がコントロールの約４倍に増加することが報告されている（非特許文献１３）。

【0015】

また、抗トランスフェリン受容体抗体を表面に有するリポソームに薬剤を内包させることで、薬剤を血液脳関門において通過させる技術が報告されている。抗ラットトランスフェリン受容体抗体とイムノミセル融合体により、ラットにおける脳での取り込み量が約２～５倍に増加することが報告されている（非特許文献１５）。

【0016】

また、抗インスリン受容体抗体のカルボキシル末端側に、神経栄養因子、酵素または抗アミロイド抗体を融合した融合蛋白質を作製することにより、インスリン受容体を介した血液脳関門通過技術が報告されている（非特許文献１６－１９）。

【0017】

アカゲザルにおいて、標識抗ヒトインスリン受容体抗体およびＧＤＮＦの融合抗体を投与した２時間後の脳での取り込み量が、ＧＤＮＦと比較して約１５倍となることが報告されている（非特許文献１７）。

【0018】

しかしながら、トランスフェリン受容体およびインスリン受容体は脳血管内皮細胞だけでなく、肝臓など全身で発現しているため、これらの技術では中枢神経系への薬剤送達量の増大とともに肝臓などにも薬剤送達が起こる（非特許文献２０）。さらに、全身で抗原が発現しているため、抗体の血中半減期が短い（非特許文献１２）。

【0019】

また、脳血管内皮膜発現抗原であるＴＭＥＭ３０Ａに対する抗体（Ｆｃ５）が、ＲＭＴ様の活性を示すことが報告されている（特許文献５、ならびに非特許文献２１および２２）。Ｆｃ５はラマ由来のシングルドメインの重鎖抗体の重鎖可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＶＨＨ）抗体であり、Ｆｃ５およびヒトＦｃの融合体がコントロールＩｇＧと比較して脳送達が増加することが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルおよびラットｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて示されている。

【0020】

Ｆｃ５由来の単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｓｃＦｖ）および代謝型グルタミン酸受容体１型（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ｉ；ｍＧｌｕＲＩ）抗体の融合体が、コントロール単鎖抗体およびｍＧｌｕＲＩ抗体の融合体と比較して、ラットモデルでのＣＳＦ曝露が高まることが報告されているが、増加量としては５倍程度である（非特許文献２３）。

【0021】

また、ＩｇＧ抗体は胎児性Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦｃＲｎ）によって脳内から循環血液方向へ速やかに排出されることが報告されており（非特許文献２４および２５）、例えばラットにおけるＩｇＧの脳内投与後の脳内半減期は４８分間と短い（非特許文献２４）。

【0022】

ＣＡＤＭ３は、カルシウムイオン非依存性免疫グロブリン様細胞接着分子である（非特許文献２６－３１）。ＣＡＤＭ３は、細胞外領域の３つの免疫グロブリン様ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および１つの細胞質ドメインといった構造に分けられる（非特許文献２９）。

【0023】

ＲＮＡ ｂｌｏｔとｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの解析から、ＣＡＤＭ３は小脳、大脳皮質、海馬、扁桃体、嗅球および延髄を含む様々な中枢神経と末梢神経の両方の神経組織特異的に発現している（非特許文献２６、２７および３２）。ＣＡＤＭ３は２つの軸索末端間、軸索末端および軸索シャフトの間、ならびに軸索末端および軸索末端のグリア細胞プロセスの間の接触部位に局在化する（非特許文献２６）。

【0024】

ＣＡＤＭ３は、カルシウムイオン非依存性のホモフィリック結合での細胞間の接着活性を示す。また、ＣＡＤＭ３は、Ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｔｉｎ－１およびｎｅｃｔｉｎ－３とカルシウムイオン非依存性のヘテロフィリック結合での細胞間の接着活性を示すが、Ｎｅｃｌ－５およびｎｅｃｔｉｎ－２とは接着活性を示さない。ｎｅｃｔｉｎ－１およびｎｅｃｔｉｎ－３と相互作用するＣＡＤＭ３は、小脳形態形成時と同様に神経活動依存性のシナプスの再構築プロセスに関与する（非特許文献３２および３３）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合解析から、アクチン細胞骨格の再編成に関与するｐｒｏｔｅｉｎ ４．１ＮとＣＡＤＭ３が結合することが示されている（非特許文献２７）。

【0025】

ＣＡＤＭ３を欠損させたマウスでは、生後早期に視神経および脊髄における有髄軸索数が減少する。しかし、成熟後で正常個体と変異体の間で、有髄軸索数やミエリン鞘の厚さに差はない（非特許文献３０）。また、ＣＡＤＭ３に結合するポリクローナル抗体が報告されている（非特許文献２７）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0026】

【文献】国際公開第２０１２／０２３６２３号

【文献】国際公開第２０１６／０８１６４０号

【文献】国際公開第２０１６／０８１６４３号

【文献】国際公開第２０１４／０３３０７４号

【文献】カナダ国特許第２６２３８４１号明細書

【非特許文献】

【0027】

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【文献】アウドラザイム（登録商標）点滴静注液2.9mg添付文書(2016年7月第8版)

【文献】エラプレース（登録商標）点滴静注液6mg 添付文書(2016年7月第6版)

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【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0028】

本発明は、例えば、ＣＡＤＭ３に結合するＣＡＤＭ３結合分子及び該分子を用いた方法などに関する。具体的には、ＣＡＤＭ３に結合する抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸、該核酸を含むベクターを含む形質転換細胞、該抗体または該抗体断片の製造方法、該抗体または該抗体断片を含む組成物、該抗体または該抗体断片を用いた脳に存在する抗原を検出または測定する方法、脳疾患を診断または治療する方法、抗体の脳滞留性を向上させる方法、脳内の抗体量を増加させる方法などを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0029】

上記課題を解決するための手段として、本発明はＣＡＤＭ３に結合するＣＡＤＭ３結合分子および該分子を用いた方法、具体的にはＣＡＤＭ３に結合する抗体または該抗体断片を提供する。

【0030】

すなわち、本発明は以下の〈１〉～〈２２〉に関する。

【0031】

〈１〉Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ３（ＣＡＤＭ３）に結合する抗体または該抗体断片。
〈２〉抗体が脳滞留性を有する〈１〉に記載の抗体または該抗体断片。
〈３〉抗体が神経細胞および／または神経組織結合性を有する〈１〉または〈２〉に記載の抗体または該抗体断片。
〈４〉抗体または該抗体断片が下記（ａ）～（ｘ）からなる群より選ばれる１である、〈１〉～〈３〉のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片;
（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３、２４および２５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２８、２９および３０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３４、３５および３６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３８、３９および４０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｃ）重鎖抗体の重鎖可変領域（ＶＨＨ）のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｄ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｅ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３、１４および１５に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｆ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１８、１９および２０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｇ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８９、９０および９１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号９４、９５および９６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｈ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号９９、１００および１０１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｉ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０４、１０５および１０６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｊ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０９、１１０および１１１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｋ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１４、１１５および１１６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｌ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１９、１２０および１２１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｍ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２４、１２５および１２６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｎ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２９、１３０および１３１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（о）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３９、１４０および１４１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｐ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１４４、１４５および１４６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｑ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１４９、１５０および１５１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｒ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５４、１５５および１５６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｓ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５９、１６０および１６１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｔ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６９、１７０および１７１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７４、１７５および１７６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｕ）前記（ａ）～（ｔ）に記載の少なくとも１つの抗体または抗体断片と、ＣＡＤＭ３への結合について競合する抗体、
（ｖ）前記（ａ）～（ｔ）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体、
（ｗ）前記（ａ）～（ｔ）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体、
（ｘ）前記（ａ）～（ｔ）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体。
〈５〉抗体または該抗体断片が下記（１）～（３１）からなる群より選ばれる１である、〈１〉～〈４〉のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片；
（１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２に記載されるアミノ酸配列含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（３）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（４）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（５）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（６）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（７）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号６８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（８）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（９）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１０）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１１）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１２）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１３）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１４）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１５）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１６）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号８８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号９３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（１８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号９８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（１９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１０３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１０８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１１８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２３）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１２３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２４）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１２８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２５）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１３８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２６）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１４３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１４８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（３０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１６８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１７３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（３１）前記（１）～（３０）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体。
〈６〉抗体または該抗体断片がバイスペシフィック抗体である、〈１〉～〈５〉のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
〈７〉バイスペシフィック抗体がＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原に結合する、〈６〉に記載のバイスペシフィック抗体。
〈８〉バイスペシフィック抗体がＣＡＤＭ３に結合する抗原結合部位および脳に存在する抗原に結合する抗原結合部位を含む、〈６〉または〈７〉に記載のバイスペシフィック抗体。
〈９〉抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、ＶＨＨおよびＣＤＲを含むペプチドからなる群より選ばれる１である、〈１〉～〈８〉のいずれか１に記載の抗体断片。
〈１０〉抗体が遺伝子組換え抗体である、〈１〉～〈９〉のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
〈１１〉抗体がマウス抗体、ラット抗体、ラビット抗体、アルパカ抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群より選ばれる１である、〈１〉～〈１０〉のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
〈１２〉〈１〉～〈１１〉のいずれか１に記載のＣＡＤＭ３に結合する抗体または該抗体断片に、下記（i）～（iii）からなる群より選ばれる少なくとも１つを結合させた融合抗体または該融合抗体断片；
（i）親水性高分子、
（ii）両親媒性高分子、および
（iii）機能性分子。
〈１３〉〈１〉～〈１２〉のいずれか１に記載の抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片を産生するハイブリドーマ。
〈１４〉〈１〉～〈１２〉のいずれか１に記載の抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸。
〈１５〉〈１４〉に記載の核酸を含むベクターを含む形質転換細胞。
〈１６〉〈１３〉に記載のハイブリドーマまたは〈１５〉に記載の形質転換細胞を培養し、培養液から〈１〉～〈１２〉のいずれか１に記載の抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片を採取することを含む、〈１〉～〈１２〉のいずれか１に記載の抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片の製造方法。
〈１７〉〈１〉～〈１２〉のいずれか１に記載の抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片を含む、組成物。
〈１８〉脳に存在する抗原の検出または測定用の組成物である、〈１７〉に記載の組成物。
〈１９〉脳疾患の診断または治療するための組成物である、〈１７〉に記載の組成物。
〈２０〉〈１〉～〈１２〉のいずれか１に記載の抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片、または〈１７〉に記載の組成物を用いて、脳に存在する抗原を検出または測定する方法。
〈２１〉〈１〉～〈１２〉のいずれか１に記載の抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片、または〈１７〉に記載の組成物を用いて、脳疾患を診断または治療する方法。
〈２２〉〈１〉～〈１２〉のいずれか１に記載の抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片、または〈１７〉に記載の組成物を用いて、抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片の脳滞留性を向上させる方法。
〈２３〉〈１〉～〈１２〉のいずれか１に記載の抗体、該抗体断片、融合抗体若しくは該融合抗体断片、または〈１７〉に記載の組成物を用いて、脳内の抗体量、該抗体断片量、融合抗体量若しくは該融合抗体断片量を増加させる方法。

【発明の効果】

【0032】

本発明のＣＡＤＭ３結合分子は、ＣＡＤＭ３に特異的に結合することで結合分子自体の脳滞留性を増加させるだけでなく、その他の目的分子をＣＡＤＭ３結合分子に修飾することで、目的分子を脳内への輸送、滞留させることで、脳疾患の治療に応用することができる。本発明の具体的なＣＡＤＭ３結合分子としては、抗体または該抗体断片が挙げられる。本発明の抗体または該抗体断片は、脳内のＣＡＤＭ３に結合することにより、脳滞留性を有する抗体または該抗体断片である。それゆえ、本発明の抗体または該抗体断片は、脳に存在する抗原（ＣＡＤＭ３、またはＣＡＤＭ３および脳に存在するその他の抗原）の検出または測定用の組成物、脳疾患の診断用の組成物、および脳疾患を治療するための医薬組成物として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１（Ａ）および（Ｂ）は、組織中における各抗体の濃度を測定した結果である。図１（Ａ）は抗体投与３日後の血清中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は投与した抗体を示す。図１（Ｂ）は抗体投与３日後の脳組織中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｇ脳）、横軸は投与した抗体を示す。

【図2】図２（Ａ）および（Ｂ）は、組織中における各抗体の濃度を測定した結果である。図２（Ａ）は抗体投与７日後の血清中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は投与した抗体を示す。図２（Ｂ）は抗体投与７日後の脳組織中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体溶出量（ｎｇ／ｇ脳）、横軸は投与した抗体を示す。

【図3】図３（Ａ）および（Ｂ）は、組織中における各抗体の濃度を測定した結果である。図３（Ａ）は、抗体投与７日後の血清中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は投与した抗体を示す。図３（Ｂ）は投与７日後の脳組織中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体溶出量（ｎｇ／ｇ脳）、横軸は投与した抗体を示す。抗体濃度はモル濃度から、モノクローナル抗体の分子量（１５０ｋＤａ）で換算した値で示す。

【図4】図４（Ａ）および（Ｂ）は、各抗体のマウス脳移行性イメージング評価の結果である。図４（Ａ）は抗体投与９日後の脳のイメージング像を示す。図４（Ｂ）は脳中蛍光量を投与抗体の蛍光強度で補正した値の対抗ＡＶＭ抗体比を示す。縦軸は対抗ＡＶＭ抗体比、横軸は投与した抗体を示す。

【図5】図５は、各抗体のマウス脳移行性イメージング評価の結果であり、抗体投与７日後の脳のイメージング像を示す。

【図6】図６は、各抗体のマウス脳移行性イメージング評価の結果であり、脳中蛍光量を投与抗体の蛍光強度で補正した値の対抗ＡＶＭ抗体比を示す。縦軸は対抗ＡＶＭ抗体比、横軸は投与した抗体を示す。

【図7】図７（Ａ）および（Ｂ）は、組織中における各抗体の濃度を測定した結果である。図７（Ａ）は、抗体投与７日後の血清中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は投与した抗体を示す。図７（Ｂ）は投与７日後の脳組織中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体溶出量（ｎｇ／ｇ脳）、横軸は投与した抗体を示す。

【図8】図８（Ａ）および（Ｂ）は、各抗体のマウス脳移行性イメージング評価の結果である。図８（Ａ）は抗体投与７日後の脳のイメージング像を示す。図８（Ｂ）は脳中蛍光量を投与抗体の蛍光強度で補正した値の対抗ＡＶＭ抗体比を示す。縦軸は対抗ＡＶＭ抗体比、横軸は投与した抗体を示す。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本発明は、ＣＡＤＭ３に結合する抗原結合分子に関する。より具体的には、本発明はＣＡＤＭ３に結合する抗体または該抗体断片に関するものである。

【0035】

本発明のＣＡＤＭ３結合分子としては、ＣＡＤＭ３に特異的に結合し当該分子が脳内に滞留する分子であればいずれの分子形態でもよく、タンパク質、核酸、有機合成された低分子化合物／高分子化合物などいずれの分子であってもよい。具体的には組換えタンパク質、抗体、アプタマー、低分子スクリーニングで得られる低分子化合物などいずれのものでもよいが、好ましくは抗体および該抗体断片が挙げられる。ＣＡＤＭ３結合分子は、ＣＡＤＭ３の細胞外領域に結合する分子であることが好ましい。

【0036】

ＣＡＤＭ３は、カルシウムイオン非依存性免疫グロブリン様細胞接着分子であり、カルシウム非依存性のホモフィリック結合での細胞間の接着活性を示す。例えば、シグナル配列を含むヒトＣＡＤＭ３の全長は３９８アミノ酸からなり、中枢神経系および末梢神経系において２つの軸索末端間、軸索末端および軸索シャフトの間、ならびに軸索末端および軸索末端のグリア細胞プロセスの間の接触部位で発現しており、細胞接着作用において役割を果たしている。

【0037】

本発明のＣＡＤＭ３結合分子が結合するＣＡＤＭ３の動物種は、マウス、ラット、カニクイザルおよび／またはヒトなどが挙げられるが、特にこれらの種に限定されるものではなく、抗体の用途に応じて、適切な動物種を選択することができる。例えば、本発明の抗体をヒトの医薬用途で用いる場合、該抗体は少なくともヒトのＣＡＤＭ３に結合する抗体であることが好ましい。

【0038】

本発明において、ヒトＣＡＤＭ３としては、配列番号５２に記載のアミノ酸配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ３３８１９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５２に記載のアミノ酸配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ３３８１９のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトＣＡＤＭ３の機能を有するポリペプチド、あるいは配列番号５２に記載のアミノ酸配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ３３８１９のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつヒトＣＡＤＭ３の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。

【0039】

配列番号５２に記載のアミノ酸配列またはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ３３８１９で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などを用いて、例えば配列番号５２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。

【0040】

欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。

【0041】

マウスＣＡＤＭ３のアミノ酸配列［配列番号５４またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿４４４４２９．１］、ラットＣＡＤＭ３のアミノ酸配列［ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＩ６１８１１．１］およびカニクイザルＣＡＤＭ３のアミノ酸配列［配列番号５６またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２７０６１８．１］についても同様のことがいえる。

【0042】

本発明において、ヒトＣＡＤＭ３をコードする遺伝子としては、配列番号５１に記載の塩基配列またはＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０３３８１９．１の塩基配列が挙げられる。配列番号５１に記載の塩基配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０３３８１９．１の塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列から成り、かつＣＡＤＭ３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号５１に記載の塩基配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０３３８１９．１の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列から成り、かつＣＡＤＭ３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、または配列番号５１に記載の塩基配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０３３８１９．１の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡから成り、かつＣＡＤＭ３の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子なども本発明においてＣＡＤＭ３をコードする遺伝子に含まれる。

【0043】

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号５１に記載の塩基配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０３３８１９．１の塩基配列を含むＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡのことをいう。

【0044】

具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルター若しくはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)］を行った後、０．１～２倍濃度のＳａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムおよび１５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドガラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。

【0045】

ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては配列番号５１に記載の塩基配列またはＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０３３８１９．１の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。

【0046】

マウスＣＡＤＭ３の塩基配列［配列番号５３またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０５３１９９．３］、ラットＣＡＤＭ３の塩基配列［ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０４７１０３．１］およびカニクイザルＣＡＤＭ３の塩基配列［配列番号５５またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２８３６８９．１］についても同様のことがいえる。

【0047】

ＣＡＤＭ３の機能としては、上記したように、中枢神経系および末梢神経系における軸索末端間などにおける細胞接着などへの関与が挙げられる。

【0048】

真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も本発明におけるＣＡＤＭ３をコードする遺伝子に包含される。

【0049】

本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Res.,25, 3389 (1997)、Genome Res., 7, 649 (1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。

【0050】

デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）は－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍａｔｃｈ）は１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ）は１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１、アミノ酸配列の場合は３、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ ｂｌａｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムの場合は７、－Ｘ（Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）は１５、および－Ｚ（ｆｉｎａｌ Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムの場合は２５である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL/blastcgihelp.htmL)。

【0051】

上記の各種ＣＡＤＭ３のアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができる。具体的には、上記の各種ＣＡＤＭ３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、上記と同様の方法により、各種ＣＡＤＭ３のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。

【0052】

さらに、各種ＣＡＤＭ３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または各種ＣＡＤＭ３のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。

【0053】

本発明において、ヒトＣＡＤＭ３の細胞外領域は、配列番号５２またはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ３３８１９に記載のアミノ酸配列において、２５番目から３３０番目のアミノ酸配列をいう。

【0054】

マウスＣＡＤＭ３の細胞外領域は、配列番号５４またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿４４４４２９．１に記載のアミノ酸配列において、２３番目から３２８番目のアミノ酸配列をいう。ラットＣＡＤＭ３の細胞外領域は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＩ６１８１１．１に記載のアミノ酸配列において、２３番目から３２８番目のアミノ酸配列をいう。

【0055】

カニクイザルＣＡＤＭ３の細胞外領域は、配列番号５６またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２７０６１８．１に記載のアミノ酸配列において、２３番目から３２８番目のアミノ酸配列をいう。

【0056】

本発明のＣＡＤＭ３結合分子がＣＡＤＭ３の細胞外領域に結合することは、ＣＡＤＭ３発現細胞または組換えＣＡＤＭ３タンパク質に対する本発明のＣＡＤＭ３結合分子の結合性を、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴法などを用いて測定することにより確認することができる。また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などを組み合わせて確認することもできる。

【0057】

本発明のＣＡＤＭ３結合分子は脳内のＣＡＤＭ３に特異的に結合することで脳滞留性を有する分子であり、例えば本発明の抗体は、脳内のＣＡＤＭ３に結合することにより、脳滞留性を有する抗体である。また、本発明の抗体は、動物の末梢に投与したときに、末梢から脳の血液脳関門を透過して脳内に移行し、脳内のＣＡＤＭ３に結合することにより、脳滞留性を有する抗体である。本発明の抗体は、脳滞留性に優れた抗体、または脳滞留性が向上した抗体であることが好ましい。

【0058】

本発明において、脳滞留性とは、被験動物に対象物を投与したときに、該対象物が脳内に留まる性質をいう。即ち、脳内への移行の増加、脳内への蓄積の増加、脳内から脳外への移行の低下、脳内から脳外への排出の低下、および脳内分解の低下から選らばれる少なくともいずれか１つによって該対象物の脳内濃度（または脳内量）が増加すること、または検出可能な程度に一定濃度存在することを意味する。

【0059】

本発明において、脳滞留性が優れる、脳滞留性が高い、または脳滞留性が向上していることとは、対象物を被験動物に投与した際に、コントロールと比べて、投与から同日経過後の該対象物の脳内濃度（または脳内量）が増加すること、または、当該対象物が脳内で長期間検出可能な程度に一定濃度（量）存在することを意味する。

【0060】

これらの現象は、コントロールと比べて、該対象物の脳内への移行の増加、脳内への蓄積の増加、脳内から脳外への移行の低下、脳内から脳外への排出の低下、および脳内分解の低下のうち、少なくともいずれか１つによって生じる。

【0061】

本発明において、脳滞留性が優れる、脳滞留性が高い、または脳滞留性が向上していることとは、例えば、被験動物に該対象物を投与したときに、コントロールと比べて投与後１～１０日、好ましくは投与後２～１０日、３～１０日、より好ましくは４～１０日の該対象物の脳内濃度（量）が高いこと、または当該対象物の脳内濃度（または脳内量）のピークが投与後４日目以降、好ましくは投与後５日目以降、６日目以降、７日目以降、８日目以降、９日目以降、より好ましくは１０日目以降であることなどが挙げられる。

【0062】

脳滞留性に優れた抗体、脳滞留性が高い抗体または脳滞留性が向上した抗体は、コントロール抗体と比べて、脳内での抗体濃度（抗体量）が高い抗体、または脳内に長期間存在し得る特徴を備えた抗体であればいずれの抗体であってもよい。

【0063】

例えば、コントロール抗体と比べて、脳内への移行性および／または脳内蓄積性が高い特徴、脳内から脳外への移行性、排出性および／または脳内分解性が低い特徴、ならびに脳内から脳外への移行性、排出性および／または脳内分解性に比べて、脳内への移行性および／または脳内蓄積性が高い特徴などを備えた抗体が挙げられる。

【0064】

したがって、本発明の抗体または該抗体断片としては、抗体または該抗体断片を動物に投与した場合、コントロール抗体と比べて、投与から同日経過後の脳内の抗体濃度（または抗体量）が高い抗体若しくは該抗体断片、または、脳内に長期間存在することができる抗体若しくは該抗体断片などが挙げられる。

【0065】

脳内での抗体濃度（または抗体量）の変化はいかなるものでもよく、例えば、測定期間中に脳内の抗体濃度が一度ピークに達した後、徐々に抗体濃度が低下する場合、脳内の抗体濃度がピークに達した後、その抗体濃度を維持し続けている場合、または抗体投与後に脳内での抗体濃度が増加し続けている場合などが挙げられる。

【0066】

本発明の抗体または該抗体断片としては、例えば、ラットへの投与後４日目若しくは１０日目にコントロール抗体よりも脳内の抗体濃度または抗体量が高い抗体、ラットへの投与後４日目から１０日目の間に、脳内の抗体濃度若しくは抗体量が維持されている、若しくは増加する抗体、またはラットへの投与後１０日目以降にも脳内での存在が明確に確認できる抗体などをいうが、これらに限定されない。

【0067】

コントロール抗体としては、被験抗体と同じ種またはサブクラスの抗体であればいずれの抗体でもよいが、例えば、抗アベルメクチン（ＡＶＭ）抗体などを用いることができる。

【0068】

本発明において、脳内としては、例えば、脳実質、脳室内、脳脊髄液中などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0069】

免疫電子顕微鏡法により、ＣＡＤＭ３の染色は、例えば顆粒細胞の平行線維末端、平行線維末端および平行線維軸索の接触部位、ならびに平行線維末端およびグリア細胞プロセスの接触部位に確認される（非特許文献２６）。したがって、本発明のＣＡＤＭ３結合分子の一態様として、神経細胞および/または神経組織内のＣＡＤＭ３に特異的に結合することにより神経細胞結合性を有し、これにより脳滞留性を有する分子が挙げられる。本発明の抗体の一態様として、例えば神経細胞および/または神経組織内のＣＡＤＭ３に結合することにより神経細胞結合性を有し、これにより脳滞留性を有する抗体が挙げられる。

【0070】

本発明において、動物に抗体を投与する方法としては、例えば、静脈投与、脳室内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、経鼻投与、脊髄腔内投与などが挙げられるが、これらの方法に限定されない。

【0071】

本発明において抗体の脳滞留性を測定する方法としては、例えば、動物に抗体を投与して数日経過後に脳組織を回収し、ホモジナイズして遠心分離後の上清中の抗体濃度を測定し、単位脳重量あたりの抗体量を算出する方法、回収した脳組織を用いて公知の免疫学的手法を用いて抗体の存在を検出する方法、標識を施した抗体を動物に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムで経時的に当該抗体の存在を検出する方法などが挙げられる。

【0072】

本発明の抗体または該抗体断片としては、下記（ａ）～（ｘ）からなる群より選ばれる１の抗体または抗体断片が挙げられる。これらの中でも、抗体の脳滞留性および脳内抗体量の点から、（ｄ）、（ｊ）、（о）または（ｔ）が好ましい。
（ａ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３、２４および２５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２８、２９および３０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３４、３５および３６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３８、３９および４０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｄ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｅ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３、１４および１５に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｆ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１８、１９および２０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｇ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８９、９０および９１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号９４、９５および９６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｈ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号９９、１００および１０１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｉ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０４、１０５および１０６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｊ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０９、１１０および１１１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｋ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１４、１１５および１１６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｌ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１９、１２０および１２１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｍ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２４、１２５および１２６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｎ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２９、１３０および１３１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３４、１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（о）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１３９、１４０および１４１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｐ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１４４、１４５および１４６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｑ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１４９、１５０および１５１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｒ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５４、１５５および１５６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｓ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５９、１６０および１６１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６４、１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｔ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６９、１７０および１７１に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７４、１７５および１７６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｕ）前記（ａ）～（ｔ）に記載の少なくとも１つの抗体または抗体断片と、ＣＡＤＭ３への結合について競合する抗体、
（ｖ）前記（ａ）～（ｔ）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体、
（ｗ）前記（ａ）～（ｔ）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体、
（ｘ）前記（ａ）～（ｔ）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体。

【0073】

本発明の抗体としては、上記（ａ）～（ｔ）に記載されるいずれか１つの抗体または抗体断片のＶＨのＣＤＲ１～３およびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列と、それぞれ８５％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示す抗体のＶＨのＣＤＲ１～３およびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を有する抗体を含む。９０％以上の相同性としてより好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の相同性などが挙げられる。

【0074】

本発明において、上記（ａ）～（ｔ）に記載される抗体または抗体断片の一態様としては、それぞれヒト抗ＣＡＤＭ３モノクローナル抗体として、ＣＡＤＭ３０１抗体、ＣＡＤＭ３１０２抗体、ＣＡＤＭ３２１９抗体、ＣＡＤＭ３３０１抗体、ＣＡＤＭ３３０９抗体、ＣＡＤＭ３３１２抗体、ＣＡＤＭ３３１４抗体、ＣＡＤＭ３３１６抗体、ＣＡＤＭ３３４９抗体、ＣＡＤＭ３３５１抗体、ＣＡＤＭ３４０２抗体、ＣＡＤＭ３４０４抗体、ＣＡＤＭ３４３２抗体、ＣＡＤＭ３４４８抗体、ＣＡＤＭ３４５８抗体およびＣＡＤＭ３５０１抗体ならびにアルパカ抗ＣＡＤＭ３モノクローナルＶＨＨ抗体として、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ５抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１０抗体およびｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１抗体が挙げられる。これらの中でも、抗体の脳滞留性および脳内抗体量の点から、ＣＡＤＭ３３１２抗体、ＣＡＤＭ３４０２抗体、ＣＡＤＭ３５０２抗体またはｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８抗体が好ましい。

【0075】

他には、上述のモノクローナル抗体から遺伝子組換え技術により作製されたヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられる。具体的には、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８＿０１ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８＿０２ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８＿０３ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８＿０４ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０１ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０２ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０３ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０４ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０５ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０６ヒト化抗体なども挙げられる。

【0076】

本発明において上記（ｕ）の抗体とは、上記（ａ）～（ｔ）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片を第１抗体とした時に、該第１抗体とＣＡＤＭ３との結合を阻害する第２抗体をいう。

【0077】

本発明において上記（ｗ）の抗体とは、上記（ａ）～（ｔ）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片を第１抗体、および第１抗体が結合するエピトープを第１エピトープとした場合、当該第１エピトープを含む、第２エピトープに結合する第２抗体をいう。

【0078】

また、本発明の上記（ｘ）の抗体とは、上記（ａ）～（ｔ）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片を第１抗体、および第１抗体が結合するエピトープを第１エピトープとした場合に、当該第１エピトープに結合する第２抗体をいう。

【0079】

また、本発明の抗体または該抗体断片として、具体的には、下記（１）～（３１）からなる群より選ばれる１の抗体または抗体断片も挙げられる。これらの中でも、抗体の脳滞留性および脳内抗体量の点から、（４）、（２０）、（２５）または（３０）が好ましい。
（１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２に記載されるアミノ酸配列含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（３）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（４）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（５）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（６）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（７）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号６８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（８）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（９）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１０）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１１）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１２）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号７８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１３）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１４）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１５）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１６）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号８６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（１７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号８８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号９３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（１８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号９８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（１９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１０３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１０８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１１８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２３）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１２３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２４）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１２８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２５）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１３８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２６）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１４３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１４８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（２９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（３０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１６８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１７３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（３１）前記（１）～（３０）に記載のいずれか１つの抗体または抗体断片のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体。

【0080】

本発明の抗体としては、上記（１）～（３０）に記載されるいずれか１つの抗体または抗体断片のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列と、それぞれ８５％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示す抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を有する抗体を含む。９０％以上の相同性としてより好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の相同性などが挙げられる。

【0081】

本発明において、上記（１）～（３１）に記載される抗体または抗体断片の一態様としては、それぞれヒト抗ＣＡＤＭ３モノクローナル抗体として、ＣＡＤＭ３０１抗体、ＣＡＤＭ３１０２抗体、ＣＡＤＭ３２１９抗体、ＣＡＤＭ３３０１抗体、ＣＡＤＭ３３０９抗体、ＣＡＤＭ３３１２抗体、ＣＡＤＭ３３１４抗体、ＣＡＤＭ３３１６抗体、ＣＡＤＭ３３４９抗体、ＣＡＤＭ３３５１抗体、ＣＡＤＭ３４０２抗体、ＣＡＤＭ３４０４抗体、ＣＡＤＭ３４３２抗体、ＣＡＤＭ３４４８抗体、ＣＡＤＭ３４５８抗体およびＣＡＤＭ３５０１抗体、ならびにアルパカ抗ＣＡＤＭ３モノクローナルＶＨＨ抗体として、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ５抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１０抗体およびｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１抗体が挙げられる。これらの中でも、抗体の脳滞留性および脳内抗体量の点から、ＣＡＤＭ３３１２抗体、ＣＡＤＭ３４０２抗体、ＣＡＤＭ３５０２抗体またはｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８抗体が好ましい。

【0082】

他には、上述のモノクローナル抗体から遺伝子組換え技術により作製されたヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられる。具体的には、配列番号１７７のアミノ酸配列の６番目、２７番目の、３７番目、４４番目、４５番目、４７番目、４９番目、７９番目および９８番目から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されたヒト化抗体、配列番号１７８番目のアミノ酸配列の１番目、１２番目、１４番目、２７番目、２８番目、２９番目、３７番目、４４番目、４５番目、４６番目、４７番目、４９番目、７８番目、９６番目および９７番目から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されたヒト化抗体、配列番号１７７のアミノ酸配列の６番目のアミノ酸残基をＧｌｕへ、２７番目のアミノ酸残基をＡｒｇへ、３７番目のアミノ酸残基をＰｈｅへ、４４番目のアミノ酸残基をＧｌｕへ、４５番目のアミノ酸残基をＡｒｇへ、４７番目のアミノ酸残基をＰｈｅへ、４９番目のアミノ酸残基をＡｌａへ、７９番目のアミノ酸残基をＶａｌへ、および９８番目のアミノ酸残基をＡｌａへ置換するアミノ酸残基置換のうち、少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含むヒト化抗体、配列番号１７８番目のアミノ酸配列の１番目のアミノ酸残基をＧｌｎへ、１２番目のアミノ酸残基をＶａｌへ、１４番目のアミノ酸残基をＡｌａへ、２７番目のアミノ酸残基をＳｅｒへ、２８番目のアミノ酸残基をＩｌｅへ、２９番目のアミノ酸残基をＰｈｅへ、３７番目のアミノ酸残基をＴｙｒへ、４４番目のアミノ酸残基をＧｌｎへ、４５番目のアミノ酸残基をＡｒｇへ、４６番目のアミノ酸残基をＧｌｙへ、４７番目のアミノ酸残基をＬｅｕへ、４９番目のアミノ酸残基をＡｌａへ、７８番目のアミノ酸残基をＶａｌへ、９６番目のアミノ酸残基をＡｓｎ、および９７番目のアミノ酸残基をＡｌａへ置換するアミノ酸残基置換のうち、少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含むヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８＿０１ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８＿０２ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８＿０３ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ８＿０４ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０１ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０２ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０３ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０４ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０５ヒト化抗体、ｉＣＡＤＭ３－３Ｒ１－Ｌ１１＿０６ヒト化抗体なども挙げられる。

【0083】

本発明においてＥＵインデックスとは、シーケンス・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト第５版（１９９１）に示されるアミノ酸残基の位置をいう。以下に示すアミノ酸残基の位置は、特に記載の無い場合は全てＥＵインデックスに記載されるアミノ酸残基の位置を示す。

【0084】

抗体分子はイムノグロブリン（Ｉｇ）とも称され、その基本的な構造は重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ；Ｌ鎖）と呼ばれるポリペプチドをそれぞれ二つずつ有する四量体である。

【0085】

また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＨ鎖可変領域（ＶＨとも表記される）、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＬ鎖可変領域（ＶＬとも表記される）、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。

【0086】

ＣＨは各サブクラスごとに、α、δ、ε、γおよびμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。

【0087】

ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを併せてＦｃ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域または単にＦｃという。ＣＬは、Ｃ_λ鎖およびＣ_κ鎖が知られている。

【0088】

ＣＨがα、δ、ε、γおよびμ鎖である抗体のサブクラスは、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭという。各抗体のサブクラスには動物によってアイソタイプが存在するものがあり、ヒトではＩｇＡにはＩｇＡ１およびＩｇＡ２、ＩｇＧにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアイソタイプが存在する。

【0089】

本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＦｃ領域は、ＥＵインデックスにより、Ｎ末端からのアミノ酸残基の番号で特定することができる。

【0090】

具体的には、ＣＨ１はＥＵインデックス１１８～２１５番のアミノ酸配列、ヒンジはＥＵインデックス２１６～２３０番のアミノ酸配列、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１～３４０番のアミノ酸配列、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１～４４７番のアミノ酸配列、およびＦｃ領域はＥＵインデックス２３１～４４７番のアミノ酸配列とそれぞれ特定される。

【0091】

本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびオリゴクローナル抗体のいずれの抗体をも包含する。ポリクローナル抗体とは、異なるクローンの抗体産生細胞が分泌する抗体分子の集団をいう。モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（一次配列）が均一である抗体をいう。オリゴクローナル抗体とは、複数の異なるモノクローナル抗体を混合した抗体分子の集団をいう。

【0092】

本発明におけるモノクロ－ナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体が挙げられる。

【0093】

エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し結合する、単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、翻訳後修飾されたアミノ酸配列および翻訳後修飾されたアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。

【0094】

翻訳後修飾されたアミノ酸配列としては、糖鎖がＯＨ置換基を有するＴｙｒおよびＳｅｒに結合したＯ結合型糖鎖、糖鎖がＮＨ_２置換基を有するＧｌｎおよびＡｓｎに結合したＮ結合型糖鎖、ならびに硫酸分子がＯＨ置換基を有するＴｙｒに結合し、チロシン硫酸化されたアミノ酸配列が挙げられる。

【0095】

本発明の抗体が結合するＣＡＤＭ３のエピトープは、ＣＡＤＭ３の一部のドメインを欠失させた欠損体、ＣＡＤＭ３の一部のドメインを他のタンパク質由来のドメインと置換させた変異体、ＣＡＤＭ３の部分ペプチド断片などを用いて抗体の結合実験を行うことにより決定することができる。また、上記欠損体または変異体の発現細胞を用いて抗体の結合実験を行うこともできる。

【0096】

または、本発明の抗体が結合するＣＡＤＭ３のエピトープは、タンパク質分解酵素にて消化したＣＡＤＭ３のペプチド断片に本発明の抗体を添加し、既知の質量分析法を用いてエピトープマッピングを行うことによっても決定することができる。

【0097】

本発明の抗体としては、遺伝子組換え技術によって作製されるマウス抗体、ラット抗体、ハムスター抗体、ラビット抗体、ラマ抗体、ラクダ抗体、アルパカ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（「ＣＤＲ移植抗体」ともいう）、ヒト抗体などの遺伝子組換え抗体も含まれる。

【0098】

本発明において、キメラ抗体とは、ＶＨおよびＶＬと、ＣＨおよびＣＬとが異なる動物種に由来する抗体をいう。ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体は、ヒト型キメラ抗体、マウス以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬと、マウス抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体は、マウス型キメラ抗体といい、その他のキメラ抗体も同様の方法で命名される。

【0099】

非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ラマ、ラクダ、アルパカなど、ハイブリドーマを作製する、または抗体ファージライブラリを作製することが可能な動物であれば、いかなるものも用いることができる。

【0100】

ハイブリドーマとは、非ヒト動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウスなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。

【0101】

抗体ファージライブラリは免疫グロブリン可変領域の遺伝子をファージにクローニングして、その表面に抗原結合分子を発現させて作製したライブラリをいう。使用されるファージはＭ１３ファージなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。

【0102】

ファージに提示される抗原結合分子は、いかなる形態でもよいが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨなどの抗体断片であることが好ましい。

【0103】

本発明において、抗体ファージライブラリは、免疫ライブラリ、ナイーブライブラリおよび合成ライブラリのうちいずれのライブラリでもよい。

【0104】

免疫ライブラリは、抗原で免疫された動物または患者のリンパ球由来の抗体遺伝子をもとに構築された抗体ファージライブラリをいう。ナイーブライブラリは、正常の動物または健常人のリンパ球由来の抗体遺伝子をもとに構築された抗体ファージライブラリをいう。合成ライブラリは、ゲノムＤＮＡにおけるＶ遺伝子または再構築された機能的なＶ遺伝子のＣＤＲを、適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドで置換したライブラリをいう。

【0105】

キメラ抗体の作製方法として、以下にヒト型キメラ抗体の作製方法を記載する。その他のキメラ抗体についても同様の方法で作製することができる。

【0106】

ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物細胞由来のハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0107】

また、非ヒト動物由来の抗体ファージライブラリよりＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子をクローニングし、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することもできる。

【0108】

ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体をいう。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はＦＲと称される。

【0109】

ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列および任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡならびに非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列および任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0110】

ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、ヒト抗体ファージライブラリまたはヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。

【0111】

ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保持するマウス（Tomizuka K. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 722-7, 2000.)に所望の抗原を免疫することにより、取得することができる。また、ヒト由来のＢ細胞から抗体遺伝子を増幅したファージディスプレイライブラリを用いて所望の結合活性を有するヒト抗体を選択することにより、免疫を行わずにヒト抗体を取得することができる（Winter G. et al., Annu Rev Immunol.12:433-55. 1994）。

【0112】

さらに、ＥＢウイルスを用いてヒトＢ細胞を不死化することにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を生産する細胞を作製し、ヒト抗体を取得することができる（Rosen A. et al., Nature 267, 52-54.1977）。

【0113】

ヒト抗体ファージライブラリは、ヒト（健常人または患者）のリンパ球から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ、およびＶＨＨなどの抗体断片を表面に発現させたファージのライブラリである。該ライブラリより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。

【0114】

ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物の染色体内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。

【0115】

ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法により得たヒト抗体産生ハイブリドーマを培養して培養物中にヒト抗体を産生蓄積させ、該培養物から抗体を精製することにより行うことができる。

【0116】

本発明の抗体は、重鎖のみで構成される重鎖抗体を包含する。重鎖抗体は、ラマ、ラクダ、アルパカなどのラクダ科の動物から取得される抗体、または該抗体をもとに作製した遺伝子組換え抗体をいう。

【0117】

本発明において抗体断片は、抗体の断片であって、かつ抗原結合活性を有するものをいう。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、複数のＣＤＲを含むペプチド、およびＶＨＨなどが挙げられる。また、本発明の抗体断片には、該抗体断片に抗体の定常領域またはＦｃの全長若しくは一部を融合させた抗体断片、定常領域またはＦｃを含む抗体断片など、抗体の部分断片を含みかつＣＡＤＭ３結合活性を有するものであればいずれの抗体断片も含まれる。

【0118】

Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0119】

Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0120】

Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0121】

ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを４個のＧｌｙおよび１個のＳｅｒ残基からなるリンカー（Ｇ４Ｓ）を任意の個数つなげたリンカーペプチドなどの適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬまたはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0122】

Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0123】

ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ－Ｓ結合を介して結合させたものであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0124】

ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成されるものであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明のＣＤＲを含むペプチドとしては、本発明の抗体由来の６個のＣＤＲを含むペプチドがあげられる。

【0125】

該ＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、該ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。

【0126】

ＶＨＨは、重鎖抗体の可変領域であり、ｎａｎｏｂｏｄｙともいう。本発明の抗体断片は、上述したいずれかの抗体断片または該部分断片を含みかつＣＡＤＭ３結合活性を有する抗体断片であればいずれのものも含む。

【0127】

本発明において、一つの抗原結合部位を有する抗体または該抗体断片を一価抗体という。一価抗体のフォーマットとしては、国際公開第２０１４／０５４８０４号、国際公開第２０１１／０９０７５４号、国際公開第２００７／０４８０３７号、および国際公開第２０１２／１１６９２７号などに記載される、抗原結合部位を一つ有する抗体または該抗体断片のフォーマットなどが挙げられる。

【0128】

本発明において、３つ以上の異なる抗原またはエピトープに結合する１分子の抗体または該抗体断片をマルチスペシフィック抗体という。また、本発明において、２つの異なる抗原またはエピトープに結合する１分子の抗体または該抗体断片をバイスペシフィック抗体という。

【0129】

マルチスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体のフォーマットとしては、国際公開第２００９／１３１２３９号、国際公開第２０１４／０５４８０４号、国際公開第０１／０７７３４２号、米国特許出願公開２００７／００７１６７５号明細書、国際公開２００７／０２４７１５号、Wu et al.,［Nature Biotechnology，2007，25(11)，p.1290-1297］、Labrijn et al., ［PNAS 2013, vol.110, no.13, p5145-5150］、Jong et al., ［http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002344］、Kontermann et al., ［mAbs 2012, vol.4, issue2, p182-197］、Spiess et al., ［Molecular Immunology 67 (2015) 95-106］、 Ridgway et al., ［Protein engineering, 1996 vol.9 no.7 pp617-621、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１０／１５１７９２号および国際公開第２０１４／０３３０７４号などに記載されるフォーマットなどが挙げられる。

【0130】

バイスペシフィック抗体として具体的には、以下に記載するバイスペシフィック抗体などが挙げられる。
（１）抗体の二つの重鎖のうち、一方の重鎖（重鎖Ａ）のＣＨ３にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、もう一方の重鎖（重鎖Ｂ）のＣＨ３にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖのアミノ酸改変を加えたバイスペシフィック抗体。
（２）抗体のＣ末端に抗体断片を融合させたバイスペシフィック抗体。
（３）抗体のＮ末端に抗体断片を融合させたバイスペシフィック抗体。

【0131】

上記（１）に記載するバイスペシフィック抗体は、重鎖ＡのＶＨを含む抗原結合部位がＣＡＤＭ３に結合し、重鎖ＢのＶＨを含む抗原結合部位が脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体でもよいし、その逆でもよい。

【0132】

上記（２）に記載するバイスペシフィック抗体としては、例えば、抗体を構成する二つの重鎖の一方のＣ末端に抗体断片が結合しているバイスペシフィック抗体、抗体を構成する二つの重鎖の両方のＣ末端に抗体断片が結合しているバイスペシフィック抗体、抗体を構成する二つの軽鎖の一方のＣ末端に抗体断片が結合しているバイスペシフィック抗体、抗体を構成する二つの軽鎖の両方のＣ末端に抗体断片が結合しているバイスペシフィック抗体、抗体を構成する二つの軽鎖のＣ末端および二つの重鎖のＣ末端のいずれにも抗体断片が結合しているバイスペシフィック抗体などが挙げられる。なお、抗体のＣ末端および抗体断片の間には適当なリンカーが存在していてもよい。

【0133】

上記（２）に記載するバイスペシフィック抗体が有する抗体断片は、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＶＨＨなどが好ましいが、特にこれらに限定されない。

【0134】

上記（２）に記載するバイスペシフィック抗体は、Ｎ末端の抗原結合部位がＣＡＤＭ３に結合し、Ｃ末端の抗原結合部位が脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体でもよいし、その逆でもよい。

【0135】

上記（３）に記載するバイスペシフィック抗体は、抗体を構成する二つの重鎖または軽鎖の少なくともいずれか１つのＮ末端に抗体断片が結合しているバイスペシフィック抗体をいう。また、抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ末端と抗体断片との間に適当なリンカーが存在していてもよい。上記（３）に記載するバイスペシフィック抗体が有する抗体断片は、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＶＨＨなどが好ましいが、特にこれらに限定されない。

【0136】

また、上記（３）に記載するバイスペシフィック抗体としては、重鎖のＮ末端からＶＨ_１－ＣＨ１－ＶＨ_２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３という構造を有するバイスペシフィック抗体、および上記重鎖構造を有し、かつＶＨ_１とＶＨ_２がそれぞれＶＬと抗原結合部位を形成しているバイスペシフィック抗体などが挙げられる。ＶＨ_１およびＶＨ_２が抗原結合部位を形成するＶＬは、同じアミノ酸配列であってもよいし、異なるアミノ酸配列であってもよい。

【0137】

本発明において、マルチスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体は、ＣＡＤＭ３に結合するマルチスペシフィック抗体およびバイスペシフィック抗体であればいかなる抗体でもよい。なかでも、ＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原に結合するマルチスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体が好ましく、ＣＡＤＭ３に結合する抗原結合部位および脳に存在する抗原に結合する抗原結合部位を含むマルチスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体がより好ましい。

【0138】

本発明において、脳に存在する抗原とは、タンパク質、糖鎖、および脂質などが挙げられ、なかでもタンパク質であることが好ましい。

【0139】

脳に存在するタンパク質としては、例えば、Ｐｒｉｏｎ、５Ｔ４、ＡＦＰ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＢＣＡＭ、ＢＳＧ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ、ＣＡ９、ＣＡ７２－４、ＣＡＤＭ３、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＤ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５ＳＣ１、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｅ、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１３７、ＣＤ１４７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６８、ＣＤ２００、ＣＤ２４８、ＣＤ２５４、ＣＤ２５７、ＣＤＨ２、ＣＤＨ３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、Ｃｌａｕｄｉｎ３、Ｃｌａｕｄｉｎ４、ＣＳＦ－１、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＰＧ－４、ＣＳＰＧ５、ＣＴＬＡ４、ＣＲＦ－１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＤＪ－１、ＤＬＬ４、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＤ－Ｂ、ＥＦＮＡ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＴＢＲ、ＥＮＰＰ３、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥＰＯＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＡＰα、ＦＡＳ、ＦｃγＲＩ、ＦＣＥＲ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＯＬＨ１、ＦＯＬＲ１、ＧＤＦ２、ＧＦＲ、ＧＬＰ１Ｒ、ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＰＮＭＢ、ＧＲＰ７８、ＨＡＰＬＮ４、ＨＢ－ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＨＬＡ－ＤＲβ、ＨＭＧＢ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ５、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＢ、ＩｇＥ、ＩｇＥ－Ｆｃ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ９、ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＮＳＲ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ２、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ２、ＫＤＲ、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＧ３、ＬＲＰ３、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＡＧ、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＯＧ、ＭＳＴ１Ｒ、ＭＳＴＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ５ＡＣ、ｍｙｏｓｔａｔｉｎ、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＣＡＮ、ＮＧＦ、ＮＭＤＡＲ、ＮＯＴＣＨ、ＮＲＧ１、ＮＲＰ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、Ｐ２Ｙ６、ＰＡＲ１、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＬＰ１、ＰＳＣＡ、ＰＴＰＲＺ、ＲＥＴ、ＲＧＭＡ、ＳＬＡＭ７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＴＡＧ－７２、ＴＣＲ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ、ＴＩＭＰ２、ＴＬＲ９、ＴＮＦ、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ７、ＴＲＥＭ２、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＬＡ－４、ＣＧＲＰ、ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＴＤＰ－４３、Ｔａｕ、ＦＵＳ、Ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ（Ａβ）、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ、ＬＩＮＧＯ－１、Ｎｏｇｏ、Ｔｒｏｙ、ｐｏｌｙＱ、ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、ａｔａｘｉｎ １、ａｔａｘｉｎ ２、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔａｕ、またはＰｈｏｓｐｈｏ－ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎなどが挙げられるが、これらのタンパク質に限定されるものではない。

【0140】

脳に存在する糖鎖としては、例えば、Ｌｅｗｉｓ－ｘ、Ｌｅｗｉｓ－ｙ、またはＣＤ１５などが挙げられるが、これらの糖鎖に限定されるものではない。

【0141】

脳に存在する脂質としては、例えば、ＧＤ１ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３またはＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅなどが挙げられるが、これらの脂質に限定されるものではない。

【0142】

本発明の抗体または該抗体断片は、翻訳後修飾されたいかなるアミノ酸を含む抗体をも包含する。翻訳後修飾としては、例えば、Ｈ鎖のＣ末端におけるリジン残基の欠失［リジン・クリッピング（ｌｙｓｉｎｅ ｃｌｉｐｐｉｎｇ）］、およびポリペプチドのＮ末端におけるグルタミン残基のピログルタミン（ｐｙｒｏＧｌｕ）への変換などが挙げられる［Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736(2013)］。

【0143】

本発明の抗体または該抗体断片は、Ｆｃ領域のアミノ酸改変を行っていてもよい。Ｆｃ領域のアミノ酸改変としては、例えば、抗体を安定化させるため、または血中半減期を制御するためのアミノ酸改変などが挙げられる。Ｆｃ領域のアミノ酸改変としては、具体的には例えば、国際公開第２００６／０３３３８６号、国際公開第２００６／０７５６６８号、国際公開第２０１１／１２２０１１号、および国際公開第２００９／１２５８２５号などが挙げられる。

【0144】

本発明の抗体または該抗体断片は、抗体または該抗体断片に所望の分子を結合させることで修飾された融合抗体または該融合抗体断片も包含する。抗体を修飾する方法は特に限定されず、所望のアミノ酸残基および糖鎖を修飾できるものであればいずれの方法も用いることができる。

【0145】

例えば、化学反応を利用した化学修飾［抗体工学入門、地人書館（１９９４）；Kolb et al., Angew Chem Int Ed Engl. 40. 2004-21, 2001］や、遺伝子組換え技術を利用し、組換えタンパク質発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入して発現させる遺伝子工学的手法での修飾などが挙げられる。

【0146】

本発明において、抗体または該抗体断片を修飾する分子としては、例えば、親水性高分子、両親媒性高分子、および機能性分子などが挙げられる。前記親水性高分子、両親媒性高分子としては、例えば、ポリオキシアルキレン、ポリオールまたは多糖を含む分子などが挙げられる。

【0147】

本発明において、抗体または該抗体断片に化学修飾によって他の分子を修飾する場合、その修飾部位としては、抗体または抗体断片の定常領域が挙げられ、特にＣ末端またはＳ－Ｓ結合部位のＣｙｓ残基が好ましい。遺伝子工学的手法により、後から化学修飾可能な残基を、予め抗体または抗体断片の任意の位置に導入することも可能である。

【0148】

また、遺伝子工学的手法により、直接他の分子を修飾する場合、その修飾部位としては、抗体または抗体断片の軽鎖または重鎖のＮ末端またはＣ末端が挙げられる。

【0149】

ポリオキシアルキレンとしては、例えば、直鎖または分岐鎖からなるポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンエチレングリコールなどが挙げられる。

【0150】

ポリオールまたは多糖を含む分子としては、例えば、アミロース、デキストラン、プルラン、グリコーゲンなどのグルコースが重合した直鎖または分岐状の多糖などが挙げられる。また、ホモ多糖類に限らず、ヘテロ多糖類であってもよい。

【0151】

親水性高分子または両親媒性高分子を含む分子の分子量は特に限定されないが、１００Ｄａ以上であることが好ましく、例えば、１００Ｄａ～１００ｋＤａであることが好ましい。

【0152】

機能性分子としては、例えば、抗原結合分子、抗体結合分子の断片、薬物、生理活性ペプチド、生理活性タンパク質、核酸、放射性標識化合物、糖鎖、脂質、蛍光化合物などが挙げられる。抗原結合分子などの機能性分子で修飾された結果、二重特異性を有する分子は、バイスペシフィック抗体である。

【0153】

抗原結合分子としては、例えば、抗体、受容体、リガンドなどが挙げられる。

【0154】

抗原結合分子の断片としては、前記抗原結合分子の断片であって、抗原結合活性を有するものであれば、いかなるものでもよい。

【0155】

薬物としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗ウイルス剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン重合阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学、癌と化学療法社（１９９６）］、ステロイド剤、非ステロイド剤、免疫調節剤、免疫抑制剤、または抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。

【0156】

より具体的には、例えば、メルタンシン、エムタンシン、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、メイタンシノイドなどが挙げられ、これらの誘導体であってもよい。

【0157】

薬物および抗体または該抗体断片を結合させる方法としては、上述の方法の他、グルタールアルデヒドを介して薬物および抗体のアミノ基を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬物のアミノ基および抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。

【0158】

生理活性ペプチドまたは生理活性タンパク質としては、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）など、ＮＫ細胞、マクロファージ、または好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子、ヒドラーゼ、リアーゼおよびイソメラーゼなどのタンパク質分解酵素、酸性スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼなどの酵素、リシン、ジフテリアトキシン、またはＯＮＴＡＫなどの細菌毒素および植物毒素などの毒素、細胞膜傷害活性を有する抗菌ペプチド、細胞膜結合性または細胞膜透過性を有するペプチド、およびそれらの誘導体などが挙げられる。

【0159】

核酸としては、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ/ＤＮＡ、ＤＮＡアプタマーなどが挙げられる。

【0160】

放射性標識化合物としては、診断用または治療用用途に使用される核種であればよく、例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^５１Ｃｒ、^５７ＣＯ、^１８Ｆ、^１５３Ｇｄ、^１５９Ｇｄ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇｅ、^１６６Ｈｏ、^１１５Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１７７Ｌｕ、^５４Ｍｎ、^９９Ｍｏ、^１０３Ｐｄ、^１４２Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^２１１Ａｔ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ、^１５３Ｓｍ、^４７Ｓｃ、^７５Ｓｅ、^８５Ｓｒ、^９９Ｔｃ、^２０１Ｔｉ、^１１３Ｓｎ、^１１７Ｓｎ、^１３３Ｘｅ、^１６９Ｙｂ、^１７５Ｙｂ、^９０Ｙおよび^６５Ｚｎなど、または上述の核種を含む化合物が挙げられる。

【0161】

放射性標識化合物は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性標識化合物をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、１－［２－（４－アミノフェニル）エチル］－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＰＡ－ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン四酢酸（ＴＲＩＴＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）などが挙げられ、キレート剤によって修飾された抗体、およびキレート剤を介して放射性標識化合物が標識された修飾化抗体も本発明の抗体に含まれる。

【0162】

糖鎖としては、例えば、単糖、二糖類またはオリゴ糖などが挙げられ、より具体的には、例えば、フコース、マンノース、グルコース、アロース、アルトース、ギュロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、エリトース、エリトロース、トレオース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、リポアラビノマンナン、ルイスＸ型三糖、シアリルルイスＸ型四糖などが挙げられる。また、イムノアジュバントとして知られる糖鎖を含む天然物でもよく、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、またはαガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。

【0163】

脂質としては、例えば、脂肪酸と各種アルコールとのエステルおよびその類似体である単純脂質（中性脂質）が挙げられる。例えば、油脂（例えば、トリアシルグリセロール）、ろう（例えば、高級アルコールの脂肪酸エステル）、ステロールエステル、コレステロールエステル、ビタミンの脂肪酸エステルなど、脂肪酸とアルコールのほかにリン酸、糖、硫酸、アミンなど極性基をもつ複合脂質、例えば、リン脂質（例えば、グリセロリン脂質およびスフィンゴリン脂質など）および糖脂質（例えば、グリセロ糖脂質およびスフィンゴ糖脂質など）、単純脂質および複合脂質の加水分解によって生成する化合物のうち脂溶性のものをさす誘導脂質、例えば、脂肪酸、高級アルコール、脂溶性ビタミン、ステロイド、炭化水素などが挙げられる。

【0164】

蛍光化合物としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などのフルオレセイン系列、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などのローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、アレクサフルオロ系列およびＮＢＤ系列などの蛍光色素、アクリジニウムエステル、またはロフィンなどの発光物質ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光性タンパク質などが挙げられる。

【0165】

本発明の抗体または該抗体断片は、上述の親水性高分子、両親媒性高分子または機能性分子を直接または適当なリンカーを介して結合させることができる。リンカーとしては、例えば、エステル、ジスルフィド、ヒドラゾンおよびジペプチドなどが挙げられる。

【0166】

本発明の抗体または該抗体断片を遺伝子工学的な手法によって修飾し、融合抗体または融合抗体断片を作製する場合には、抗体をコードするｃＤＮＡにタンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体または融合抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して融合抗体または融合抗体断片を発現させることにより、融合抗体または融合抗体断片を作製することができる。

【0167】

本発明の組成物は、本発明の抗体または該抗体断片を含有する組成物であればいかなるものでもよい。かかる組成物は、抗体または該抗体断片の他に、適当なキャリア、安定化剤などの添加剤を含んでいてもよい。

【0168】

本発明の組成物としては、例えば、本発明の抗体または該抗体断片を含む検出用または測定用の組成物などが挙げられる。本発明の組成物としては、例えば、本発明の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬組成物（治療剤）などが挙げられ、薬理学的に許容しうる担体とともに所望の剤型に製剤化される。

【0169】

本発明において、検出用または測定用の組成物とは、本発明の抗体または該抗体断片を含んでおり、本発明の抗体または該抗体断片が特異的に結合する抗原を検出または測定できるものであればいかなる組成物でもよい。本発明の抗体または該抗体断片が特異的に結合する抗原としては、ＣＡＤＭ３、またはＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原などが挙げられる。

【0170】

本発明の抗体または該抗体断片は動物に投与すると脳内のＣＡＤＭ３に結合し、脳に滞留する性質を有する。したがって、当該抗体または該抗体断片を含む検出用または測定用の組成物を用いることにより、当該抗体の脳内における維持、または脳内における抗体濃度の向上が可能となり、長期間にわたってＣＡＤＭ３、またはＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原を検出または測定すること、および／またはＣＡＤＭ３、またはＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原を高感度に検出または測定することもできる。

【0171】

例えば、検出用または測定用の組成物がＣＡＤＭ３と脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体を含む組成物であるときには、当該バイスペシフィック抗体が結合するＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原を長期間検出または測定すること、ならびに／またはＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原を高感度に検出または測定することができる。

【0172】

また、例えば、検出用または測定用の組成物が、放射性標識化合物または蛍光色素で標識されたＣＡＤＭ３に結合する融合抗体または該融合抗体断片を含む組成物であるときには、ＣＡＤＭ３を長期間検出または測定すること、および／またはＣＡＤＭ３を高感度に検出または測定することができる。

【0173】

本発明の抗体または該抗体断片を含有する医薬組成物（治療剤）は、本発明の抗体または該抗体断片が特異的に結合する抗原が発現している疾患であればいずれの疾患の治療剤でもよいが、脳疾患の治療剤が好ましい。

【0174】

脳疾患としては、例えば、アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳変性症、脳血管障害、てんかん、片頭痛、多動性障害、クロイツフェルトヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、ライソゾーム病、うつ病、およびジストニアなどが挙げられる。

【0175】

本発明の抗体または該抗体断片は、動物に投与すると脳内のＣＡＤＭ３に結合し、脳に滞留する性質を有する。したがって、当該抗体または該抗体断片を含有する治療剤を用いることで、脳内における該抗体または該抗体断片の長期間にわたる維持、脳内における抗体濃度の向上が可能となり、上記の疾患に対して治療効果を示すことができる。

【0176】

例えば、治療剤が本発明の抗ＣＡＤＭ３抗体の融合抗体を含む治療剤であるときには、融合させた分子を脳内へ送達させることで、当該分子による治療効果を発揮することができる。具体的には、薬物や酵素などを抗ＣＡＤＭ３抗体に融合させた融合抗体を含む治療剤であるときは、薬物や酵素により治療効果を示すことができるし、ＣＡＤＭ３と脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体を含む治療剤であるときには、当該バイスペシフィック抗体が結合する、脳に存在する抗原に関連する脳疾患に対して治療効果を示すことができる。

【0177】

また、例えば、治療剤が低分子薬剤で修飾されたＣＡＤＭ３に結合する融合抗体または融合抗体断片であるときには、当該低分子薬剤が標的とする脳疾患に対して治療効果を示すことができる。このとき、該低分子薬剤を単体で用いるときよりも、本発明の治療剤を用いたときのほうが、治療効果が高いことが好ましい。

【0178】

本発明の抗体または該抗体断片を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体または該抗体断片のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。

【0179】

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、皮内、筋肉内、脳室内、脊髄腔内、鼻腔内、腹腔内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、特に好ましくは静脈内または脳室内投与などが挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、またはテープ剤などが挙げられる。

【0180】

投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇである。

【0181】

また、本発明は、本発明の抗体または該抗体断片を用いて抗体を脳内に滞留させる方法、抗体の脳滞留性を向上させる方法、および脳内の抗体濃度（または抗体量）を高める方法をも包含する。

【0182】

また、本発明は、ＣＡＤＭ３に結合するペプチド、該ペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、該核酸を含むベクターを含む形質転換細胞、該形質転換細胞を培養し、培養液から前記ペプチドを採取することを含む、前記ペプチドの製造方法、前記ペプチドを含む組成物、または前記ペプチドまたは前記組成物を用いて、脳に存在する抗原を検出または測定する方法、脳疾患を診断若しくは治療する方法、ペプチドの脳滞留性を向上させる方法、または脳内のペプチド量を増加させる方法に関する。

【0183】

本発明のペプチドは、ペプチドが修飾された融合ペプチドを含む。

【0184】

ＣＡＤＭ３に結合するペプチドに関する各種用語の定義などは、特に記載がない限り、上述したＣＡＤＭ３に結合する抗体について記載した用語の定義などと同じものを用いる。

【0185】

以下に、本発明の抗体または該抗体断片の製造方法、疾患の治療方法、および疾患の診断方法などについて、具体的に説明する。

【0186】

１．抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるＣＡＤＭ３またはＣＡＤＭ３発現細胞は、ＣＡＤＭ３全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞または動物細胞などに導入することで得ることができる。また、ＣＡＤＭ３は、ＣＡＤＭ３を多量に発現している各種動物細胞株、動物細胞および動物組織などからＣＡＤＭ３を精製することによっても得ることができる。

【0187】

また、これら動物細胞株、動物細胞および動物組織などをそのまま抗原として使用することもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＣＡＤＭ３の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。

【0188】

ＣＡＤＭ３またはＣＡＤＭ３の部分配列を有する合成ペプチドには、Ｃ末端またはＮ末端にＦＬＡＧまたはＨｉｓなどの公知のタグが付加されていてもよい。

【0189】

本発明で用いられるＣＡＤＭ３は、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)やCurrent Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載された方法などを用い、例えば、以下の方法により、ＣＡＤＭ３をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。

【0190】

まず、ＣＡＤＭ３をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。

【0191】

発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。

【0192】

大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ヒトＣＡＤＭ３をコードする部分を含むＤＮＡ、および転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該発現ベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。

【0193】

該発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）および開始コドンの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。

【0194】

また、ＣＡＤＭ３をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＣＡＤＭ３の生産率を向上させることができる。

【0195】

発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３―２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)］、pLSA1［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４，６８６，１９１号明細書、米国特許第４，９３９，０９４号明細書、米国特許第１６０，７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）またはｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。

【0196】

プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターまたはＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターまたはｌｅｔ Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなどが挙げられる。

【0197】

宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９または大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。

【0198】

宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)、Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)］が挙げられる。

【0199】

動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature, 329, 840 (1987)］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社製）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）およびトランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などが挙げられる。

【0200】

プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターまたはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。

【0201】

宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900)］；ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)］、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫまたはＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。

【0202】

宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などが挙げられる。

【0203】

以上のようにして得られるＣＡＤＭ３をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを保有する微生物または動物細胞などの由来の形質転換体を培地中で培養し、培養液中に該ＣＡＤＭ３を生成蓄積させ、該培養液から採取することにより、ＣＡＤＭ３を製造することができる。該形質転換体を培地中で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

【0204】

真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＣＡＤＭ３を得ることができる。

【0205】

誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。

【0206】

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science, 122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology, 8, 396 (1959)］、１９９培地［Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)］若しくはＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ_２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中に必要に応じて、カナマイシンまたはペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。

【0207】

ＣＡＤＭ３をコードする遺伝子の発現方法としては、例えば、直接発現以外に、分泌生産または融合タンパク質発現などの方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］が挙げられる。

【0208】

ＣＡＤＭ３の生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法が挙げられ、使用する宿主細胞または生産させるＣＡＤＭ３の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。

【0209】

ＣＡＤＭ３が宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＣＡＤＭ３を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してＣＡＤＭ３の生産量を上昇させることもできる。

【0210】

得られたＣＡＤＭ３は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。ＣＡＤＭ３が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザーまたはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。

【0211】

ＣＡＤＭ３が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＣＡＤＭ３の不溶体を回収する。回収した該ＣＡＤＭ３の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ＣＡＤＭ３を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。

【0212】

ＣＡＤＭ３またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＣＡＤＭ３またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

【0213】

また、本発明において用いられるＣＡＤＭ３は、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。

【0214】

（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３～２０週令のマウス、ラット、ラビットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また被免疫動物としてラマ、アルパカ、ラクダなどの動物を用いることもできる。

【0215】

免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。

【0216】

マウスやラットに免疫する際、抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。

【0217】

抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。

【0218】

その他の被免疫動物についても同様の方法で免疫を行い、抗体産生細胞を取得することができる。免疫間隔や最後の免疫から組織の摘出までの期間は、被免疫動物の動物種に合わせて適切な条件を選択することができる。

【0219】

（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J. Immunology, 6, 511 (1976)］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Nature, 276, 269 (1978)］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548 (1979)］またはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495 (1975)］などが用いられる。

【0220】

該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、および８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０^７個以上の細胞数を確保する。

【0221】

（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。

【0222】

沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。

【0223】

遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、ＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃にて７～１４日間培養する。

【0224】

培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＣＡＤＭ３に反応し、ＣＡＤＭ３ではない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを行い、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。

【0225】

（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。

【0226】

このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラムまたはゲルろ過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。

【0227】

また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。

【0228】

得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ－カラムまたはプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。

【0229】

抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。タンパク質量の定量は、ローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出する。

【0230】

（６）抗体の選択
抗体の選択は以下に示すように、フローサイトメトリーを用いて、ＣＡＤＭ３発現細胞への抗体の結合性を測定することなどにより行う。ＣＡＤＭ３発現細胞は、細胞表面上にＣＡＤＭ３が発現していればいずれの細胞でもよく、例えば、動物細胞、動物細胞株および（１）で得られるＣＡＤＭ３強制発現細胞株などが挙げられる。

【0231】

ＣＡＤＭ３発現細胞を９６ウェルプレートなどのプレートに分注した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清または精製抗体などの被験物質を分注し、反応させる。反応後の細胞を１～１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと記す）などで、よく洗浄した後、第２抗体として蛍光試薬などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＢＳＡ－ＰＢＳなどでよく洗浄した後、フローサイトメーターを用いて標識化抗体の蛍光量を測定することにより、ＣＡＤＭ３発現細胞に対して特異的に反応する抗体を選択する。

【0232】

また、抗体の選択は、以下に記載するＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴を用いて、モノクローナル抗体のＣＡＤＭ３発現細胞またはＣＡＤＭ３タンパク質などへの結合性を測定することにより行うこともできる。ＣＡＤＭ３タンパク質は、ＣＡＤＭ３の一部のドメインからなるタンパク質であっても、ＧＳＴなどのタグが付加しているタンパク質であってもよい。

【0233】

ＥＬＩＳＡは、ＣＡＤＭ３発現細胞またはＣＡＤＭ３タンパク質を９６ウェルプレートなどのプレートに分注した後、ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングし、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清または精製抗体などの被験物質を分注し、反応させる。次に、ＰＢＳなどでよく洗浄した後、第２抗体として蛍光試薬などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。

【0234】

その後ＰＢＳなどでよく洗浄した後、発色試薬を添加する。最後に反応停止液で発色反応を止めて、マイクロプレートリーダーで各ウェルにおける吸光度を測定することにより、ＣＡＤＭ３発現細胞またはＣＡＤＭ３タンパク質に対して特異的に反応する抗体を選択する。

【0235】

表面プラズモン共鳴は、公知のプロトコールを用いて、適切なセンサーチップに抗体を固相化し、ＣＡＤＭ３タンパク質をアナライトとすることでＣＡＤＭ３に結合する抗体のアフィニティーを測定することができる。

【0236】

得られた抗体のアフィニティーより、ＣＡＤＭ３タンパク質に対して所望のアフィニティーを有する抗体を選択することができる。また、センサーチップにＣＡＤＭ３タンパク質を固相化し、抗体をアナライトとして、ＣＡＤＭ３に結合する抗体のアフィニティーを測定することもできる。

【0237】

また、本発明の抗体と競合してＣＡＤＭ３に結合する抗体は、上述のフローサイトメトリーやＥＬＩＳＡを用いた測定系に、被験抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被験抗体を加えた時に本発明の抗体およびＣＡＤＭ３の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＣＡＤＭ３のアミノ酸配列、またはその立体構造への結合について、本発明の抗体と競合する抗体を取得することができる。

【0238】

また、本発明の抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体は、上述のスクリーニング方法で取得された抗体のエピトープを公知の方法で同定し、同定したエピトープを含む合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチドなどを作製し、免疫することで取得することができる。

【0239】

更に、本発明の抗体が結合するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のスクリーニング方法で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの部分的な合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチドなどを作製し、免疫することで、取得することができる。

【0240】

（７）ファージディスプレイ法による抗体の取得
（７－１）抗体ファージライブラリの作製方法
本発明において、抗体ファージライブラリは免疫ライブラリ、ナイーブライブラリおよび合成ライブラリを用いることができる。各ライブラリの作製方法を以下に記載する。

【0241】

免疫ライブラリは、上記（１）と同様の方法で免疫した動物、または患者由来のリンパ球を、ナイーブライブラリは正常な動物または健常人由来のリンパ球を採取し、ＲＮＡを抽出して逆転写反応反応によりｃＤＮＡを合成する。

【0242】

このｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲで増幅した抗体遺伝子断片をファージミドベクターに挿入し、該ファージミドベクターで大腸菌を形質転換する。得られた形質転換体にヘルパーファージを感染させると、抗体遺伝子がライブラリ化された抗体ファージライブラリを得ることができる。

【0243】

また、合成ライブラリはゲノムＤＮＡにおけるＶ遺伝子や再構築された機能的なＶ遺伝子のＣＤＲを、適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドで置換し、当該Ｖ遺伝子を挿入したファージミドベクターで大腸菌を形質転換する。得られた形質転換体にヘルパーファージを感染させると、抗体ファージライブラリを得ることができる。

【0244】

リンパ球由来のｃＤＮＡ、抗体ファージライブラリは市販のものを用いることもできる。

【0245】

ファージミドベクターはｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＵＣ１１８／ｐＵＣ１１９ベクター（ＴａＫａＲａ社）、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｐｈａｇｅｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびｐＫＳＴＶ－０２［Miyazaki N., et al., J. Biochem., 158(3), 205-215, 2015］などを用いることができる。

【0246】

ヘルパーファージはＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＶＣＳＭ１３ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｐｈａｇｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｒ４０８ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｐｈａｇｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などを用いることができる。

【0247】

ファージディスプレイには、ファージベクターも用いることができる。繊維状ファージのｇ３ｐを提示分子とするペプチドファージライブラリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製など）およびｇ７ｐ、ｇ８ｐ、ｇ９ｐを提示分子とする方法などがある。

【0248】

また、Ｔ７ファージを用いたファージディスプレイ用をいることもできる。Ｔ７ファージへのディスプレイシステムにはＴ７Ｓｅｌｅｃｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などがある。

【0249】

（７－２）抗体ファージクローンの選択
（７－１）で作製した抗体ファージライブラリからの抗体ファージクローンの選択は、以下に示すＥＬＩＳＡ法を用いて行うことができる。

【0250】

イムノチューブにＣＡＤＭ３を固相化し、ブロッキングバッファーでチューブをブロッキングする。チューブの各ウェルに上記（７－１）で作製した抗体ファージライブラリを加えて反応させる。次に、ウェルを洗浄し、蛍光標識された抗ファージ抗体を加えて反応させた後、再びウェルを洗浄して発色液を添加する。その後反応停止液で発色反応を止めて、マイクロプレートリーダーで各ウェルにおける吸光度を測定する。これにより、ＣＡＤＭ３に結合する抗体ファージクローンを選択する。

【0251】

２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製方法を示す。遺伝子組換えのマウス抗体、ラット抗体、ラビット抗体、ハムスター抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、アルパカ抗体、およびヒト抗体、各種キメラ抗体、ならびに重鎖抗体なども同様の方法で作製することができる。

【0252】

（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。

【0253】

ヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。

【0254】

動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol., 3, 133 (1990)］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223 (1984)］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Cytotechnol., 4, 173 (1990)］またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Cytotechnol., 13, 79 (1993)］などを用いる。

【0255】

動物細胞用発現ベクターのうち、プロモーターおよびエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)］または免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Cell, 41, 479 (1985)］およびエンハンサー［Cell, 33, 717 (1983)］などが挙げられる。

【0256】

遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［J．Immunol． Methods， 167， 271（1994）］を用いるが、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559 (1998)］などを用いる。

【0257】

（２）ヒト以外の動物由来の抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。

【0258】

（２－１）ハイブリドーマ法で抗体を取得した場合
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリを作製する。

【0259】

前記ライブラリより、非ヒト抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ若しくはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とする非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。

【0260】

非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ラマ、ラクダ、またはアルパカなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。

【0261】

ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)］、またはＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。

【0262】

全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］、またはＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。

【0263】

ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリの作製には、公知の方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)］、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）若しくはＺＡＰ－ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（登録商標）Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。

【0264】

ｃＤＮＡライブラリの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［Strategies, 5, 58 (1992)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49 (1985)］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐＣＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)］またはｐＵＣ１８［Gene, 33, 103 (1985)］などを用いる。

【0265】

ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［Strategies, 5, 81 (1992)］、Ｃ６００［Genetics, 39, 440 (1954)］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Science, 222, 778 (1983)］、ＮＭ５２２［J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)］、Ｋ８０２［J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)］またはＪＭ１０５［Gene, 38, 275 (1985)］などを用いる。

【0266】

ｃＤＮＡライブラリからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ若しくは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］などを用いる。

【0267】

また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)］を行うことよりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。

【0268】

選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)］などの反応を行った後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）またはＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。

【0269】

（２－２）ファージディスプレイ法により抗体を取得した場合
選択したファージクローンのプラスミドベクターから、ベクター部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定することができる。

【0270】

ハイブリドーマ法またはファージディスプレイ法のいずれの手法においても、決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。

【0271】

分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。

【0272】

また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することによって見出すことができる。

【0273】

また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴまたはＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］などの相同性検索を行い、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。

【0274】

（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。

【0275】

非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。

【0276】

作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。

【0277】

また、非ヒト抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。

【0278】

（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。

【0279】

非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するための、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。

【0280】

例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。

【0281】

次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。

【0282】

設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＶＨ、ＶＬ各々について各６本の合成ＤＮＡを設計する。

【0283】

さらに、両端に位置する合成ＤＮＡの５’または３’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。

【0284】

ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。

【0285】

または、設計したＤＮＡ配列に基づき、ＶＨ全長およびＶＬ全長を各々１本の長鎖ＤＮＡとして合成したものを、上記ＰＣＲ増幅産物に代えて用いることもできる。さらに、合成長鎖ＤＮＡの両端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。

【0286】

（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)］。

【0287】

ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。

【0288】

抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)］またはコンピューターモデリング［Protein Engineering, 7, 1501 (1994）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有するヒト化抗体を取得できる。

【0289】

ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。

【0290】

（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。

【0291】

例えば、（４）および（５）で得られるヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’または３’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。

【0292】

（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）および（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。

【0293】

発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えば、ＣＯＳ－７細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１］を用いる［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)］。

【0294】

ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press (1991)］、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などを用いる。

【0295】

発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などを用いて測定する。

【0296】

（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）および（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Cytotechnology, 3, 133 (1990)］などを用いる。

【0297】

遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Life Technologies、Cat#11619）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２、またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ｄｈｆｒが欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)］などを用いる。

【0298】

また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などのタンパク質、Ｎ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などのタンパク質若しくは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与するタンパク質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、例えば、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)］などを用いることもできる。

【0299】

発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。

【0300】

動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）若しくはＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。

【0301】

得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株の産生する遺伝子組換え抗体の発現量を向上させることができる。

【0302】

遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］。また、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外ろ過などのタンパク質の精製で用いられる方法を組み合わせることもできる。

【0303】

精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖若しくは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature, 227, 680 (1970)］、またはウェスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)］など用いて測定することができる。

【0304】

（９）抗体断片の作製方法
本発明の抗体断片は、公知の方法に従い作製することができる。本発明の抗体断片は、上記（１）～（８）にて記載した方法に従い作製した抗体を、酵素などで切断することにより作製してもよいし、所望の抗体断片をコードする塩基配列を調製し、遺伝子工学的な手法で作製してもよい。

【0305】

（１０）一価抗体の作製方法
本発明において、一価抗体は、国際公開第２０１４／０５４８０４号、国際公開第２０１１／０９０７５４号、国際公開第２００７／０４８０３７号、および国際公開第２０１２／１１６９２７号などに記載する方法などで作製することができる。

【0306】

（１１）バイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体の製造方法
本発明のバイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体は、上述した抗体の製造方法に準じて作製することができる。例えば、国際公開第２００９／１３１２３９号、国際公開第２０１４／０５４８０４号、国際公開第０１／０７７３４２号、米国特許出願公開第２００７／００７１６７５号明細書、国際公開第２００７／０２４７１５、Wu et al.,[Nature Biotechnology，2007，25(11)，p.1290-1297］、Labrijn et al.,［PNAS 2013, vol.110, no.13, p5145-5150］、Jong et al., ［http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002344］、Kontermann et al., ［mAbs 2012, vol.4, issue2, p182-197］、Spiess et al., ［Molecular Immunology 67 (2015) 95-106］、Ridgway et al., ［Protein engineering, 1996 vol.9 no.7 pp617-621］、国際公開第２００９／０８０２５１、国際公開第２０１０／１５１７９２および国際公開第２０１４／０３３０７４などに記載される方法を用いて作製することができる。

【0307】

例えば脳に存在する抗原に結合するＩｇＧ抗体のＣ末端に、ＣＡＤＭ３に結合するｓｃＦｖを融合させたバイスペシフィック抗体の発現ベクターは、以下に記載する方法で作製することができ、上述した抗体の発現方法および抗体の精製方法に準じて当該バイスペシフィック抗体を作製することができる。また、その他には、抗体のＣ末端に抗体断片を融合させたバイスペシフィック抗体も同様の方法で作製することができる。

【0308】

脳に存在する抗原に結合するＩｇＧ抗体の重鎖定常領域の合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ法によりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片を増幅する。次に、ＣＡＤＭ３に結合する抗体の塩基配列を鋳型として、当該抗体のＶＨおよびＶＬ適切なリンカーで結合させたｓｃＦｖ領域の塩基配列を、ＰＣＲ法などを用いて調製する。上記二つの領域をＰＣＲ法などで結合させ、得られた遺伝子断片をｐＣＩベクターなどの適切なベクターに挿入する。

【0309】

また、脳に存在する抗原に結合するＩｇＧ抗体の軽鎖領域（ＶＬおよびＣＬ）の遺伝子断片、および当該抗体のＶＨの遺伝子断片を、それぞれ適切な鋳型を用いたＰＣＲ法により増幅し、上記ベクターの適切な位置に挿入する。

【0310】

また、本発明のバイスペシフィック抗体は、化学的手法により、ＩｇＧ抗体に抗体断片を含む抗原結合部位を結合させて作製することもできる。

【0311】

３．抗体または該抗体断片の活性評価
本発明において、抗体または該抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。

【0312】

（１）ＣＡＤＭ３に対する結合活性
本発明の抗体または該抗体断片のＣＡＤＭ３に対する結合活性は、前述の１－（６）に記載のフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、および表面プラズモン共鳴検出などを用いて測定する。また、蛍光抗体法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)］を用いて測定することもできる。

【0313】

本発明の抗体または該抗体断片がＣＡＤＭ３に結合する一価抗体である場合にも、同様の方法で当該一価抗体のＣＡＤＭ３への結合活性を測定することができる。本発明の抗体または該抗体断片がＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体である場合にも、同様の方法で当該バイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体のＣＡＤＭ３または脳に存在する抗原への結合活性を測定することができる。

【0314】

（２）脳滞留性の測定方法
本発明の抗体または該抗体断片の脳滞留性は以下に記載する方法で測定することができる。

【0315】

動物に抗体または該抗体断片を投与して数日経過後に脳組織を回収し、ホモジナイズして遠心分離後の上清中の抗体または該抗体断片の濃度を測定し、単位脳重量あたりの抗体または該抗体断片の量を算出する方法、または回収した脳組織を用いて公知の免疫学的手法により抗体または該抗体断片の存在を検出する方法などが挙げられる。また、薬理学的に許容される標識を施した抗体または該抗体断片を動物に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムで経時的に当該抗体または該抗体断片の存在を検出する方法などが挙げられる。

【0316】

脳滞留性の評価に用いる動物は、本発明の抗体または該抗体断片の用途に応じた適切な動物を選択することができる。

【0317】

（３）抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）の測定方法
ヒトＣＡＤＭ３発現細胞またはＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原が発現している細胞に対する本発明の抗体または該抗体断片のＣＤＣ、またはＡＤＣＣは公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993); Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons,Inc.,(1993)］により測定することができる。

【0318】

４．抗体また抗体断片のエフェクター活性を制御する方法
本発明の抗体または該抗体断片のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体またはＦｃを含む該抗体断片のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、または抗体若しくは該抗体断片のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明の抗体または該抗体断片にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。

【0319】

エフェクター活性とは、抗体または該抗体断片のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ；ＡＤＰ）などが知られている。

【0320】

エフェクター活性の測定法として、例えば、標的細胞、エフェクターとしてヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、そして標的細胞特異的な抗体または該抗体断片を混合し、４時間程度インキュベーションした後、細胞傷害の指標として遊離してきた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することができる。他には、遊離^５１Ｃｒ法またはフローサイトメトリー法などによってエフェクター活性を測定することもできる。

【0321】

抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体またはＦｃを含む抗体断片のエフェクター活性を増加または低下させることができる。抗体または該抗体断片のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体または該抗体断片を発現することで、フコースが結合していない抗体または該抗体断片を取得することができる。フコースが結合していない抗体または該抗体断片は高いＡＤＣＣを有する。

【0322】

一方、抗体または該抗体断片のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体または該抗体断片を発現させることで、フコースが結合している抗体または該抗体断片を取得できる。フコースが結合している抗体または該抗体断片は、フコースが結合していない抗体または該抗体断片よりも低いＡＤＣＣを有する。

【0323】

また、抗体または該抗体断片のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣまたはＣＤＣを増加または低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体または該抗体断片のＣＤＣを増加させることができる。

【0324】

また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書または米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを、増加させることも低下させることもできる。

【0325】

また本発明の抗体または該抗体断片には、上述の抗体または該抗体断片が含む定常領域におけるアミノ酸改変または糖鎖改変に合わせて、例えば、日本国特開第２０１３－１６５７１６号公報または日本国特開第２０１２－０２１００４号公報などに記載のアミノ酸改変を行うことにより、Ｆｃ受容体への反応性を制御することで血中半減期を制御した抗体または該抗体断片も含まれる。

【0326】

さらに、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体または該抗体断片に使用することにより、エフェクター活性や血中半減期が制御された抗体または該抗体断片を取得することができる。

【0327】

５．本発明の抗体または該抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明の抗体または該抗体断片は、脳内にＣＡＤＭ３が発現している動物の脳疾患の治療に用いることができる。

【0328】

脳疾患としては、例えば、アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳変性症、脳血管障害、てんかん、片頭痛、多動性障害、クロイツフェルトヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、ライソゾーム病、うつ病、ジストニアなどが挙げられる。

【0329】

本発明の抗体または該抗体断片が治療できる脳疾患は、本発明の抗体または該抗体断片が結合する抗原、および本発明の融合抗体または融合抗体断片において抗体または該抗体断片を修飾する分子の種類などによって異なる。

【0330】

本発明の抗体または該抗体断片を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体または該抗体断片のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。

【0331】

投与経路としては、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、脳室内、腹腔内投与、皮内投与、経鼻投与、脊髄腔内投与若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。

【0332】

経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などが挙げられる。

【0333】

乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤またはストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。

【0334】

カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。

【0335】

非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤または噴霧剤などである。注射剤は、塩溶液若しくはブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造する。

【0336】

噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明の抗体または該抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖またはグリセリンなどを用いる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

【0337】

６．本発明の抗体または該抗体断片を用いた脳に存在する抗原の検出若しくは測定方法、または疾患の診断方法
本発明の抗体または該抗体断片を用いて、ＣＡＤＭ３、またはＣＡＤＭ３と脳に存在する抗原とを検出または測定することができる。また、ＣＡＤＭ３、またはＣＡＤＭ３と脳に存在する抗原とを検出または測定することにより、脳内にＣＡＤＭ３が発現している動物の脳疾患を診断することができる。

【0338】

脳疾患としては、例えば、アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳変性症、脳血管障害、てんかん、片頭痛、多動性障害、クロイツフェルトヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、ライソゾーム病、うつ病、ジストニアなどが挙げられるが、本発明の抗体または該抗体断片が診断できる脳疾患は、本発明の抗体または該抗体断片が結合する抗原、および本発明の融合抗体または融合抗体断片において抗体または該抗体断片を修飾する分子の種類などによって異なる。

【0339】

脳内にＣＡＤＭ３が発現している動物の脳疾患の診断は、例えば、患者または罹患動物の脳内に存在するＣＡＤＭ３を免疫学的手法により検出または測定して行うことができる。また、患者または罹患動物の脳内の細胞に発現または存在しているＣＡＤＭ３をフローサイトメトリーなどの免疫学的手法を用いて検出することにより診断を行うことができる。

【0340】

本発明の抗体または該抗体断片として、ＣＡＤＭ３に結合する一価抗体を用いるときには、上記と同様の方法で脳内のＣＡＤＭ３を測定することができる。本発明の抗体または該抗体断片としてＣＡＤＭ３および脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体を用いるときには、上記と同様の方法で脳内のＣＡＤＭ３または脳に存在する抗原を検出または測定することができる。

【0341】

免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体などを用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法または物理化学的手法などを用いる。

【0342】

放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または該抗体断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。

【0343】

酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに酵素などで標識を施した抗イムノグロブリン抗体または該抗体断片を反応させた後、基質を添加して反応液の吸光度を吸光光度計で測定する。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。

【0344】

例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識またはビオチン標識などを用いる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。

【0345】

前記ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素またはビオチンなどで標識しておく。

【0346】

上記の第１の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水または眼液などを反応させた後、第２の抗体を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作成した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。

【0347】

サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよい。また、抗体の代わりにＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）_２などの抗体断片を用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または該抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片との組み合わせでもよい。

【0348】

蛍光免疫測定法は、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック (1987)］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（1983）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどを用いる。

【0349】

発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光 臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステルまたはロフィンなどを用いる。

【0350】

ウエスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル）［Antibodies - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または該抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。

【0351】

ＣＡＤＭ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし、ＢＳＡ－ＰＢＳに室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。

【0352】

ここで本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、０．０５～０．１％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ－２０）を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。

【0353】

Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いて本発明の抗体または該抗体断片が結合したバンドを検出することにより、ＣＡＤＭ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。

【0354】

ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体または該抗体断片としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体または該抗体断片が用いられる。

【0355】

物理化学的手法は、例えば、抗原であるＣＡＤＭ３と本発明の抗体または該抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などを用いることもできる。

【0356】

ラテックス免疫比濁法は、抗体または抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。

【0357】

ＣＡＤＭ３が発現している細胞の検出または測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、なかでも、免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いることが好ましい。

【0358】

免疫沈降法は、ＣＡＤＭ３を発現した細胞などを本発明の抗体または該抗体断片と反応させた後、プロテインＧ－セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。または以下のような方法によっても行うことができる。

【0359】

ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明の抗体または該抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ－ＰＢＳによりブロッキングする。抗体が、例えば、ハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン－Ａまたはプロテイン－ＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。

【0360】

次に、ＢＳＡ－ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ヒトＣＡＤＭ３を発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。

【0361】

免疫細胞染色法または免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明の抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。

【0362】

また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ－サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック (1987)］により検出を行うことができる。特に、本発明の抗体または該抗体断片は、蛍光抗体染色法により天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出ができる。

【0363】

また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。

【0364】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0365】

［実施例１］抗ＣＡＤＭ３抗体の取得
（１）アルパカ抗体ライブラリでの抗体の取得
後述する実施例４で作製したｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿ＦｃおよびｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃを免疫原として、初回はＴｉｔｅｒＭａｘ（ＴｉｔｅｒＭａｘ社製）、２～５回目は不完全コンプリートアジュバント（ＢＤ社製）とのエマルジョンを作製し、アルパカに免疫した。

【0366】

免疫されたアルパカの血液（５０ｍＬ）からリンパ球（２×１０^７細胞）を採取し、得られた細胞からＲＮＡ ＩｓｏＰｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてＲＮＡを抽出した。さらに、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使った逆転写反応によりｃＤＮＡを合成後、アルパカＩｇＧ２（Ｓｈｏｒｔ ｈｉｎｇｅ－ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＩｇＧ３（Ｌｏｎｇ ｈｉｎｇｅ－ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に特異的なプライマーを使用して、ＶＨＨ遺伝子の増幅を行った。ＶＨＨ遺伝子断片をファージミドベクターｐＫＳＴＶ－０２（Miyazaki N., et al., J. Biochem., 158(3), 205-215, 2015）に挿入し、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ エレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ社製）を使ったエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＧ１を形質転換した。

【0367】

得られた形質転換体にＭ１３ＫＯ７ Ｈｅｌｐｅｒ Ｐｈａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を感染させることで、ＶＨＨ遺伝子がライブラリ化されたアルパカ抗体Ｍ１３ファージライブラリを得た。

【0368】

このアルパカ抗体Ｍ１３ファージライブラリを用いて、下記のバイオパニングの手法を用いて、抗ＣＡＤＭ３抗体を取得した。イムノチューブに後述する実施例４のｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴを固相化し、０．５％ＢＳＡを用いてブロッキングした。該チューブにアルパカ抗体Ｍ１３ファージライブラリを室温下で１時間反応させ、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後に０．１ｍｏｌ／Ｌのグリシン－塩酸緩衝液（Ｇｌｙ－ＨＣｌ）（ｐＨ２．７）でファージを溶出した。溶出液はトリスヒドロキシメチルアミノメタン－塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ９．１）を加えて中和した。溶出したファージは、大腸菌ＴＧ１に感染後、ファージを増幅した。

【0369】

その後、イムノチューブに固相化したｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴと反応させて、洗浄および溶出を実施した。さらに、イムノチューブに固相化したｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴと反応させて、洗浄および溶出を実施し、ｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴおよびｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴに特異的に結合するＶＨＨを提示したファージを濃縮した。濃縮されたファージを単クローン化し、ＥＬＩＳＡにてｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴおよびｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴへの結合性を有するクローンを選択した。

【0370】

ＥＬＩＳＡでは、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＮＵＮＣ社製）にｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴおよびｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴを固相化（５０ｎｇ／５０μＬ）し、０．５％ＢＳＡを用いてブロッキングした。各ウェルに各々のファージクローンを加え、室温下で１時間反応させた後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。次いで、ビオチン化抗Ｍ１３ファージ抗体（Ａｂｃａｍ社製）と西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を各ウェルに５０μＬ加え、室温下１時間インキュベートした。

【0371】

マイクロプレートを、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色基質液（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を各ウェルに加え、室温下でインキュベートした。各ウェルに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加えて発色反応を止め、波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。

【0372】

ｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴおよびｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴに結合したクローンについて配列解析を行い、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ抗体ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０およびｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１を取得した。各種抗ＣＡＤＭ３抗体のＶＨＨをコードする塩基配列、および該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を表１に示す。

【0373】

【表1】

【0374】

（２）ヒト抗体ファージライブラリでの抗体の取得
ヒトＰＢＭＣ由来のｃＤＮＡから、ＰＣＲにてＶＨ遺伝子断片およびＶＬ遺伝子断片を増幅させた。ＶＨ遺伝子断片およびＶＬ遺伝子断片をファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にそれぞれ挿入し、大腸菌ＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）を形質転換してプラスミドを得た。得られたプラスミドをＭ１３ＫＯ７ Ｈｅｌｐｅｒ Ｐｈａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に感染させることで、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子がライブラリ化されたヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリを得た。

【0375】

このヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリを用いて、下記のファージディスプレイ法を用いて、抗ＣＡＤＭ３モノクローナル抗体を取得した。ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＳＴＡＲＴＵＢＥ（ＮＵＮＣ社製）に、後述する実施例４のｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ、ｒＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿ＦｃまたはｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃを固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いてブロッキングした。

【0376】

該チューブにヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリを室温下で１時間反応させ、ＰＢＳまたはＰＢＳ－Ｔで洗浄後に０．１ｍｏｌ／ＬのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）でファージを溶出した。溶出液はＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を加えて中和した。溶出したファージは、ＴＧ１コンピテントセルに感染させ、ファージを増幅した。

【0377】

その後、再度ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＳＴＡＲＴＵＢＥに固相化したｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ、ｒＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿ＦｃまたはｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃと反応させて、洗浄および溶出を実施した。この操作を繰り返し、ｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ、ｒＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿ＦｃおよびｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃに特異的に結合するｓｃＦｖを提示したファージを濃縮した。濃縮されたファージを単クローン化し、ＥＬＩＳＡにてＣＡＤＭ３への結合性を有するクローンを選択した。

【0378】

ＥＬＩＳＡは、ｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ、ｒＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃおよび ｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿ＦｃをＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＮＵＮＣ社製）に各々固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いてブロッキングした。ネガティブコントロールとして、Ｆｃを固相化したプレートも用意した。

【0379】

各ウェルに各々のファージクローンを加え、室温下で３０分間反応させた後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗Ｍ１３抗体（ＧＥヘルスケア社製）を１０％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有ＰＢＳ－Ｔで希釈した溶液を、各ウェルに加え、室温下３０分間インキュベートした。

【0380】

マイクロプレートを、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、ＴＭＢ発色基質液（ＤＡＫＯ社製）を加え、室温下でインキュベートした。各ウェルに０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸を加えて発色反応を止め、波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。

【0381】

ＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃを用いたパニングから得られたクローンについて配列解析を行い、ＣＡＤＭ３０１、ＣＡＤＭ３１０２、ＣＡＤＭ３２１９、ＣＡＤＭ３３０１、ＣＡＤＭ３３０９、ＣＡＤＭ３３１２、ＣＡＤＭ３３１４、ＣＡＤＭ３３１６、ＣＡＤＭ３３４９、ＣＡＤＭ３３５１、ＣＡＤＭ３４０２、ＣＡＤＭ３４０４、ＣＡＤＭ３４３２、ＣＡＤＭ３４４８、ＣＡＤＭ３４５８またはＣＡＤＭ３５０１をコードするファージミドベクターをそれぞれ取得した。

【0382】

各種抗ＣＡＤＭ３抗体のＶＨまたはＶＬをコードする塩基配列、および該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を表２Ａおよび表２Ｂに示す。

【0383】

【表2A】

【0384】

【表2B】

【0385】

［実施例２］抗体作製
（１）ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）発現ベクターの構築
ＥＵナンバリングＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥおよびＲ４０９Ｋのアミノ酸残基置換を含むヒトＩｇＧ４抗体（以下、ＩｇＧ４改変体と略記する場合もある）のＦｃ領域に、各抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ抗体を結合させたＶＨＨ－Ｆｃ抗体を作製するために発現ベクターを構築した。
ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０およびｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１のＶＨＨの合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＶＨＨ領域の遺伝子断片を増幅した。重鎖定常領域の合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＨｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３領域の遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターを作製した。

【0386】

同様の方法で、表１に記載した各種抗ＣＡＤＭ３抗体のＶＨＨ領域の遺伝子断片を挿入した抗体発現ベクターを作製し、それぞれｐＣＩ＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクター、ｐＣＩ＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターおよびｐＣＩ＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターと命名した。

【0387】

（２）ＣＡＤＭ３ ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）発現ベクターの構築
抗ＣＡＤＭ３抗体の抗体可変領域をヒトＩｇＧ４改変体のＦｃ領域に結合させたｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体を作製するために発現ベクターを構築した。実施例１の（２）で得られたＣＡＤＭ３０１をコードするファージミドベクターを鋳型として、ＰＣＲによりｓｃＦｖ領域の遺伝子断片を増幅した。重鎖定常領域の合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＨｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３領域の遺伝子断片を増幅した。

【0388】

得られた遺伝子断片をＮ５ベクター（ＩＤＥＣ社製）に挿入し、Ｎ５＿ＣＡＤＭ３０１ ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥベクターを作製した。同様の方法で、実施例１の（２）で得られたＣＡＤＭ３１０２をコードするファージミドベクターを鋳型として、Ｎ５＿ＣＡＤＭ３１０２ ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥベクターを作製した。

【0389】

（３）ＣＡＤＭ３ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）発現ベクターの構築
実施例１の（２）で得られたＣＡＤＭ３２１９、ＣＡＤＭ３３０１、ＣＡＤＭ３３０９、ＣＡＤＭ３３１２、ＣＡＤＭ３３１４、ＣＡＤＭ３３１６、ＣＡＤＭ３３４９、ＣＡＤＭ３３５１、ＣＡＤＭ３４０２、ＣＡＤＭ３４０４、ＣＡＤＭ３４３２、ＣＡＤＭ３４４８、ＣＡＤＭ３４５８またはＣＡＤＭ３５０１をコードするファージミドベクターをそれぞれ鋳型として、ＰＣＲにより可変領域の各遺伝子断片を増幅した。得られた各遺伝子断片をｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３２１９、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３３０１、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３３０９、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３３１２、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３３１４、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３３１６、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３３４９、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３３５１、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３４０２、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３４０４、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３４３２、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３４４８、ｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３４５８、およびｐＣＩ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＣＡＤＭ３５０１をそれぞれ作製した。

【0390】

（４）ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＣＡＤＭ３ ＶＨＨベクターの構築
抗ＡＶＭ-ＩｇＧ４抗体のＣ末端側に２つの抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ抗体を結合させた抗ＡＶＭ－ＩｇＧ４－ＣＡＤＭ３ ＶＨＨバイスペシフィック抗体を作製するために発現ベクターを構築した。抗ＡＶＭ抗体の可変領域を鋳型としてＶＬおよびＶＨ領域の遺伝子断片を、合成遺伝子を鋳型としてＣＬおよびＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅した。また、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０およびｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１のＶＨＨの合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＶＨＨ領域の遺伝子断片を増幅した。

【0391】

得られた遺伝子断片をｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ＶＨＨベクター、ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨベクター、ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ＶＨＨベクターおよびｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ ＶＨＨベクターを作製した。

【0392】

抗体発現ベクターの名称と抗体の重鎖または軽鎖をコードする塩基配列、および該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を表３に示す。

【0393】

【表3】

【0394】

（５）抗Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ抗体の発現ベクターおよびｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖ５ベクターの構築
ネガティブコントロール抗体として、キメラ抗Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ（ＡＶＭ）抗体を作製した。ＳＤラットにＡＶＭを免疫し、通常の方法で抗ＡＶＭ抗体産生ハイブリドーマを樹立した。該ハイブリドーマ由来の可変領域を鋳型として、ＰＣＲによりＶＬおよびＶＨの遺伝子断片を増幅した。合成したヒトＩｇＧのラムダ鎖定常領域をコードする塩基配列および増幅した可変領域をＮ５ＫＧ４ＰＥベクター（国際公開第２００２／０８８１８６号に記載）に挿入し、発現ベクターＮ５ＬＧ４ＰＥ＿ＡＶＭを作製した。

【0395】

合成遺伝子を鋳型として、ＣＬおよびＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅した。また、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＡＶＭを鋳型として、ＰＣＲによりＡＶＭのＶＨ、ＶＬの遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＶＭｓｃＦｖ５ベクターを作製した。

【0396】

（６）抗体の調製
抗体発現プラスミドベクターをＥｘｐｉ２９３（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に導入して培養し、一過性発現系で抗体を発現させた。ベクター導入３～４日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（メルクミリポア社製）でろ過した。この培養上清中の抗体タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてアフィニティー精製した。

【0397】

洗浄液としてリン酸緩衝液を用いた。プロテインＡに吸着させたタンパク質を、２０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムおよび５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３．４）により溶出し、１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含むチューブに回収した。次に、アミコンウルトラ（メルクミリポア社製）を用いた限外ろ過とＮＡＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により溶出液の溶媒をＰＢＳに置換後、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（メルクミリポア社製）でろ過滅菌を行った。抗体溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、精製抗体の濃度を算出した。

【0398】

実施例２（１）で作製したベクターを発現させて得た抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体を、それぞれｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）およびｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）と命名した。

【0399】

実施例２（２）で作製したベクターを発現させて得た抗ＣＡＤＭ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体を、それぞれＣＡＤＭ３０１ ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥおよびＣＡＤＭ３１０２ ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥと命名した。

【0400】

実施例２（３）で作製したベクターを発現させて得た抗ＣＡＤＭ３抗体を、ＣＡＤＭ３２１９－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３３０１－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３３０９－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３３１２－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３３１４－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３３１６－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３３４９－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３３５１－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３４０２－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３４０４－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３４３２－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３４４８－ｈＧ４ＰＥ、ＣＡＤＭ３４５８－ｈＧ４ＰＥ、およびＣＡＤＭ３５０１－ｈＧ４ＰＥとそれぞれ命名した。

【0401】

実施例２（４）で作製したｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ＶＨＨベクター、ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨベクター、ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ＶＨＨベクターおよびｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ ＶＨＨベクターを発現させて得た抗ＡＶＭ－ＩｇＧ４－ＣＡＤＭ３ ＶＨＨバイスペシフィック抗体を、それぞれＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ｄＶＨＨ、ＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ｄＶＨＨ、ＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ｄＶＨＨおよびＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ ｄＶＨＨと命名した。

【0402】

また、実施例２（５）で作製したＮ５ＬＧ４ＰＥ＿ＡＶＭを発現させて得た抗ＡＶＭ－ＩｇＧ４抗体と実施例２（４）で作製したｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＶＭｓｃＦｖ５ベクターを発現させて得た抗ＡＶＭ－ＩｇＧ４－ＡＶＭ ｄｓｃＦｖバイスペシフィック抗体を、それぞれ抗ＡＶＭ抗体、ＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ ｄｓｃＦｖ５と命名した。

【0403】

［実施例３］ＣＡＤＭ３発現細胞への反応性解析
ヒトＣＡＤＭ３をコードする塩基配列を配列番号５１に、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号５２に、マウスＣＡＤＭ３をコードする塩基配列を配列番号５３に、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号５４に、サルＣＡＤＭ３をコードする塩基配列を配列番号５５に、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号５６に示す。

【0404】

ヒトＣＡＤＭ３、マウスＣＡＤＭ３およびサルＣＡＤＭ３の全長遺伝子配列を合成し、それぞれの遺伝子配列をｐＥＦ６／Ｖ５－Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）ベクターのＢａｍＨＩ－ＮｏｔＩサイトに挿入することにより、各種ＣＡＤＭ３の膜発現用プラスミドベクターｐＥＦ６＿ｈｕｍａｎ ＣＡＤＭ３、ｐＥＦ６＿ｍｏｕｓｅ ＣＡＤＭ３およびｐＥＦ６＿ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ＣＡＤＭ３を作製した。

【0405】

各種膜型ＣＡＤＭ３抗原発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に導入して培養し、一過性発現系で膜型抗原を発現させた。上記の細胞を用いて、以下の手順に従いｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法により、実施例２で作製した抗体のＣＡＤＭ３発現細胞への反応性を解析した。

【0406】

Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ヒトＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、マウスＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、およびサルＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をそれぞれ０．１％ＮａＮ_３、１％ ＦＢＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に懸濁し、９６穴丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。

【0407】

遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットへ実施例２で得た１０μｇ／ｍＬの各抗体を加えて懸濁した後、氷温下で３０分間静置した。さらに遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）して上清を除去し、ペレットをＳＢで洗浄後に、１μｇ／ｍＬのＲＰＥ蛍光標識ヤギ抗ヒト抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を加え、氷温下３０分間インキュベートした。

【0408】

ＳＢで洗浄後、ＳＢに懸濁し、フローサイトメーターＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩ（ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。なお、ネガティブコントロールとして、１０μｇ／ｍＬの抗ＡＶＭ抗体を用いた。

【0409】

検出結果を解析し、幾何平均（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｎ）を利用して平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）を算出した。さらに、各抗体１０μｇ／ｍＬの濃度のときのＭＦＩについて、ヒトＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞とＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（親株）の比率（平均蛍光強度比）を算出した。

【0410】

同様の手順でサルＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞およびマウスＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞についてもＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（親株）に対する平均蛍光強度比を算出し、結果を表４に示す。

【0411】

【表4】

【0412】

表４に示すように、全ての抗ＣＡＤＭ３抗体で、平均蛍光強度比はネガティブコントロールである抗ＡＶＭ抗体に対して増加しており、ヒトＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、マウスＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞およびサルＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に反応性を示した（ただし、一部の抗ＣＡＤＭ３抗体については、サルＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞への反応性は未評価）。よって、抗ＣＡＤＭ３抗体はヒトＣＡＤＭ３、マウスＣＡＤＭ３、またはサルＣＡＤＭ３を認識して、結合することが明らかになった。

【0413】

また、ＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ｄＶＨＨ、ＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ｄＶＨＨ、ＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ｄＶＨＨおよびＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ ｄＶＨＨについても、同様の手順でＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ヒトＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞およびマウスＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対して反応性を解析した結果を表５に示す。

【0414】

【表5】

【0415】

表５に示すように、全ての抗体で平均蛍光強度比はネガティブコントロールである抗ＡＶＭ抗体に対して増加しており、ヒトＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞およびマウスＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に反応することが明らかとなった。

【0416】

［実施例４］可溶型ＣＡＤＭ３抗原の作製
（１）ＦＬＡＧ＿Ｆｃが結合したＣＡＤＭ３の細胞外ドメインタンパク質の作製
ヒトＣＡＤＭ３、マウスＣＡＤＭ３およびラットＣＡＤＭ３の可溶性抗原として、Ｃ末端にＦＬＡＧ＿Ｆｃが付加されたＣＡＤＭ３の細胞外ドメインタンパク質を以下に記載する方法で作製した。

【0417】

ヒトＣＡＤＭ３の細胞外ドメインの合成遺伝子およびＦＬＡＧ＿Ｆｃの合成遺伝子をＩＮＰＥＰ４（ＩＤＥＣ社製）ベクターに挿入することにより、Ｃ末端側にＦＬＡＧ＿Ｆｃが付加されたヒトＣＡＤＭ３の細胞外ドメインを発現するプラスミドベクターＩＮＰＥＰ４－ｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃを作製した。ｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃをコードする塩基配列を配列番号５７に、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号５８に示す。

【0418】

マウスＣＡＤＭ３およびラットＣＡＤＭ３についても、同様の方法でプラスミドベクターＩＮＰＥＰ４－ｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿ＦｃおよびＩＮＰＥＰ４－ｒＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃを作製した。ｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃをコードする塩基配列を配列番号５９に、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号６０に、ｒＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃをコードする塩基配列を配列番号６１に、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号６２に示す。

【0419】

ＩＮＰＥＰ４－ｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ、ＩＮＰＥＰ４－ｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿ＦｃおよびＩＮＰＥＰ４－ｒＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿ＦｃをＥｘｐｉ２９３（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に導入して培養し、一過性発現系でタンパク質を発現させ、実施例２と同様の方法で精製した。溶液中の精製したヒト、マウスおよびラットＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃタンパク質の濃度は２８０ｎｍの吸光度により測定した。

【0420】

（２）ＧＳＴが結合したＣＡＤＭ３の細胞外ドメインタンパク質の作製
ヒトＣＡＤＭ３およびマウスＣＡＤＭ３の可溶性抗原として、Ｃ末端にＧＳＴが付加されたＣＡＤＭ３の細胞外ドメインタンパク質を以下に記載する方法で作製した。

【0421】

ヒトおよびマウスＣＡＤＭ３の細胞外ドメインの合成遺伝子およびＧＳＴの合成遺伝子をＮ５ベクター（ＩＤＥＣ社製）に挿入することにより、Ｃ末端側にＧＳＴが付加されたヒトおよびマウスＣＡＤＭ３の細胞外ドメインを発現するプラスミドベクターＮ５－ｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴおよびＮ５－ｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴを作製した。

【0422】

ｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴをコードする塩基配列を配列番号６３に、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号６４に示し、ｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴをコードする塩基配列を配列番号６５に、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号６６に示す。

【0423】

Ｎ５－ｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴおよびＮ５－ｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴをＥｘｐｉ２９３（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に導入して培養し、一過性発現系でタンパク質を発現させた。ベクター導入３～４日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（メルクミリポア社製）でろ過した。

【0424】

この培養上清中のタンパク質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてアフィニティー精製した。洗浄液としてリン酸緩衝液を用いた。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに吸着させたタンパク質を、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌおよび１０ｍｍｏｌ／Ｌのｒｅｄｕｃｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ｐＨ８．０）により溶出した。

【0425】

次に、アミコンウルトラ（メルクミリポア社製）を用いた限外ろ過とＮＡＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により、溶液中の溶媒をＰＢＳに置換した。得られた溶液を孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（メルクミリポア社製）でろ過滅菌した。溶液中の精製したヒトおよびマウスＣＡＤＭ３－ＧＳＴタンパク質の濃度は２８０ｎｍの吸光度により測定した。

【0426】

［実施例５］表面プラズモン共鳴検出によるＣＡＤＭ３に対する結合性の評価
実施例２で作製した抗ＣＡＤＭ３抗体のヒトＣＡＤＭ３およびマウスＣＡＤＭ３へのアフィニティーをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。ＣＭ５センサーチップ上にＨｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅキットを用いて各抗体を固定化し、実施例４で作製したｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴおよびｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴをアナライトとして結合能を評価した。

【0427】

得られたセンサグラムについてＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅにより解析を行うことで解離定数（ＫＤ値）を算出した。その結果、実施例２で作製した全ての抗ＣＡＤＭ３抗体がヒトＣＡＤＭ３およびマウスＣＡＤＭ３に親和性を示した。

【0428】

［実施例６］マウス脳移行性評価
（１）抗体量測定
マウスに各抗体を９ｍｇ／ｋｇ体重で尾静脈（ｉ．ｖ．）投与し、３日後に採血を行った。採血と同じ日に麻酔下にて全身灌流後、脳組織を回収してその重さを測定した。また、回収した脳組織にバッファー溶液を加えホモジナイズし、遠心分離後、上清に溶出された抗体溶液を回収した。その容量を測定するとともに抗体濃度をＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により測定し、単位脳重量あたりの抗体量を算出した。なお、標準曲線はキット付属の抗体を用いて作成した。

【0429】

抗体投与３日後の血清中抗体濃度を図１（Ａ）、単位脳重量あたりの脳組織中の抗体量を図１（Ｂ）に示す。図１（Ａ）に示すように、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体は、ネガティブコントロール（抗ＡＶＭ抗体）と比較して、抗体投与３日後の血清中濃度に差はなかった。一方で、図１（Ｂ）のように、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体；ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）およびｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）では脳内の抗体量が、ネガティブコントロールと比較して、約１０倍に高まることが示された。

【0430】

また、上記とは異なる条件で実施した試験の方法とその結果を示す。

【0431】

ネガティブコントロール抗体（抗ＡＶＭ抗体）、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体；ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８、抗ＣＡＤＭ３抗体；ＣＡＤＭ３３１２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＣＡＤＭ３４０２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＣＡＤＭ３５０１ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）について、５ ｍｇ／ｋｇで尾静脈（ｉ．ｖ．）投与し、７日後に採血を行った。採血後に麻酔下にて全身灌流後、脳組織を回収してその重さを測定した。回収した脳組織にバッファー溶液を加えホモジナイズし、遠心分離後、上清に溶出された抗体溶液を回収した。その容量を測定するとともに抗体濃度をＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により測定し、単位脳重量あたりの抗体量を算出した。なお、標準曲線は各抗体を用いて作成した。

【0432】

抗体投与７日後の血清中抗体濃度を図２（Ａ）、単位脳重量あたりの脳組織中の抗体量を図２（Ｂ）に示す。図２（Ａ）に示すように、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体；ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８、抗ＣＡＤＭ３抗体；ＣＡＤＭ３３１２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＣＡＤＭ３４０２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、およびＣＡＤＭ３５０１ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体は、ネガティブコントロール（抗ＡＶＭ抗体）と比較して、抗体投与７日後の血清中濃度に顕著な差はなかった。一方で、図２（Ｂ）に示すように、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体；ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８、ならびに抗ＣＡＤＭ３抗体；ＣＡＤＭ３３１２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＣＡＤＭ３４０２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、およびＣＡＤＭ３５０１ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）では抗ＡＶＭ抗体に比べて、脳内抗体量が増加した。従って脳内抗体量を高められる効果が確認された。

【0433】

次に、上記とは異なる条件で実施した試験の方法とその結果を示す。
マウスに各抗体を３５ｎｍｏｌ／ｋｇ体重で尾静脈（ｉ．ｖ．）投与し、７日後に採血を行った。採血と同じ日に麻酔下にて全身灌流後、脳組織を回収してその重さを測定した。また、回収した脳組織にバッファー溶液を加えホモジナイズし、遠心分離後、上清に溶出された抗体溶液を回収した。その容量を測定するとともに抗体濃度をＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により測定し、単位脳重量あたりの抗体量を算出した。抗体濃度はモル濃度から、モノクローナル抗体の分子量（１５０ｋＤａ）で換算した値で示した。なお、標準曲線は各抗体を用いて作成した。

【0434】

ＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ ｄｓｃＦｖ５とＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ｄＶＨＨの血清中抗体濃度を図３（Ａ）、脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量を図３（Ｂ）に示す。

【0435】

図３（Ｂ）に示すように、バイスペシフィック抗体のネガティブコントロールである抗ＡＶＭ－ＩｇＧ４－ＡＶＭ ｄｓｃＦｖバイスペシフィック抗体；ＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ ｄｓｃＦｖ５と比較して、抗ＡＶＭ－ＩｇＧ４－ＣＡＤＭ３ ＶＨＨバイスペシフィック抗体；ＡＶＭ ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ｄＶＨＨでは脳内の抗体量が増加することが示された。以上より、ＣＡＤＭ３に結合するバイスペシフィック抗体は、ＣＡＤＭ３に結合しないバイスペシフィック抗体よりも、脳内の抗体量を高めることができることが示された。

【0436】

（２）イメージング解析
抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体およびネガティブコントロール（抗ＡＶＭ抗体）について、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＲ ４８８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）にて標識を行った。標識後の各抗体を９ｍｇ／ｋｇ体重でマウスに尾静脈（ｉ．ｖ．）投与し、９日後に採血を行った。採血後に麻酔下にて全身灌流後、脳組織を回収し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（パーキンエルマー社製）にて蛍光強度を測定した。

【0437】

抗体投与９日後の脳イメージング像を図４（Ａ）に示す。脳中蛍光量を投与抗体の蛍光強度で補正した値の対ネガティブコントロール比を図４（Ｂ）に示す。図４（Ａ）および（Ｂ）に示すように、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体；ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）およびｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ではネガティブコントロールと比較して、脳内抗体量は数倍に高まっており、抗体の分布は脳内全域に亘っていることが示された。

【0438】

また、上記とは異なる条件で実施した試験の方法とその結果を示す。

【0439】

ネガティブコントロール抗体（抗ＡＶＭ抗体）、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体；ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８、ならびに抗ＣＡＤＭ３抗体；ＣＡＤＭ３３１２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＣＡＤＭ３４０２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＣＡＤＭ３５０１ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）について、ＳＡＩＶＩ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｍｇ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて蛍光標識した抗体を５ ｍｇ／ｋｇで尾静脈（ｉ．ｖ．）投与し、７日後に採血を行った。採血後に麻酔下にて全身灌流後、脳組織を回収し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（パーキンエルマー社製）にて蛍光強度を測定した。

【0440】

抗体投与７日後の脳イメージング像を図５に示す。ネガティブコントロールの投与抗体が脳の中心部にごくわずかに認められる（脳の中心部のみ発色している）のに対して、いずれのＣＡＤＭ３抗体においてもその分布は脳内全域に亘っている（脳内全体が発色している）ことが示された。なお、白黒画像では、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体；ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８は発色が強すぎて、全体的に白く見えているが、これはネガティブコントロールの図の発色せずに白く見えていることとは異なる。

【0441】

次に、抗体投与７日後の脳中蛍光量を投与抗体の蛍光強度で補正した値の対ネガティブコントロール比を図６に示す。ネガティブコントロールと比較して、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体；ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８、ならびに抗ＣＡＤＭ３抗体；ＣＡＤＭ３３１２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＣＡＤＭ３４０２ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、およびＣＡＤＭ３５０１ ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）では、いずれも脳内抗体量は数倍に高まっていた。

【0442】

［実施例７］ヒト化抗ＣＡＤＭ３抗体の作製
（１）ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ヒト化抗体の各種ＶＨＨのアミノ酸配列の設計
以下に記載する方法で、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ヒト化抗体の各種ＶＨＨのアミノ酸配列を設計した。ＶＨＨについて、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８抗体のＦＲのアミノ酸配列と、Ｋａｂａｔら［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ, ＵＳ Ｄｅｐｔ. Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］で報告されているヒトＦＲコンセンサス配列との相同性を比較した。その結果、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＣＲ１６１０９．１が、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８抗体のＶＨＨのＦＲのアミノ酸配列と最も相同性が高かった。よって、ＡＣＲ１６１０９．１のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、それぞれ配列番号８、９および１０で表されるｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８抗体のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を移植したアミノ酸配列を含むｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿００抗体を設計した（配列番号１７７）。ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿００抗体は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に、アルパカ抗体ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８抗体由来のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列のみを移植したアミノ酸配列を含むヒト化抗体である。

【0443】

しかし、一般的に、ヒト化抗体を作製する場合には、単にげっ歯類、ウサギやアルパカ等の動物由来抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列へ移植するのみでは、ヒト化抗体の結合活性が低下してしまうことが多い。このような結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とアルパカ抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を改変することが行われている。

【0444】

そこで、本実施例においても、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定し、改変した。ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿００抗体の可変領域の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。

【0445】

三次元構造座標作製および三次元構造の表示には、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（ＢＩＯＶＩＡ社）を用いた。また、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８抗体の可変領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿００抗体のＶＨＨのＦＲのアミノ酸配列の中で、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８抗体と異なっているアミノ酸残基を、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８抗体の同じ部位に存在するアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。

【0446】

これら作製したｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８抗体、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿００抗体および改変体の可変領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。

【0447】

同定したｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿００抗体のアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸残基を、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８抗体の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ置換し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨＨを設計した。

【0448】

具体的には、同定したアミノ酸残基のうち、配列番号１７７で表わされるアミノ酸配列の６番目のＧｌｎからＧｌｕ、２７番目のＰｈｅからＡｒｇ、３７番目のＶａｌからＰｈｅ、４４番目のＧｌｙからＧｌｕ、４５番目のＬｅｕからＡｒｇ、４７番目のＴｒｐからＰｈｅ、４９番目のＳｅｒからＡｌａ、７９番目のＬｅｕからＶａｌ、および９８番目のＬｙｓからＡｌａへのアミノ酸残基置換から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含むヒト化抗体のアミノ酸配列を作製し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨＨを設計した。

【0449】

具体的には、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ヒト化抗体のＶＨＨとして、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０１（配列番号６８）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０２（配列番号７０）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０３（配列番号７２）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０４（配列番号７４）を設計した。各種ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ヒト化抗体のＶＨＨをコードするアミノ酸配列を表６に示す。

【0450】

（２）ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ヒト化抗体の各種ＶＨＨのアミノ酸配列の設計
ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ヒト化抗体のＶＨＨのアミノ酸配列についても、実施例７（１）と同様の方法で設計した。アミノ酸配列の相同性が最も高いヒトＦＲはＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＡＱ０５７３４．１であったが、抗原性が高いことが予想された。よってＧｅｒｍｌｉｎｅ配列ＶＨ３－５３を使用することとした。

【0451】

ＶＨ３－５３のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１抗体のＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１８、１９および２０）を移植したアミノ酸配列を含むｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿００抗体を設計した（配列番号１７８）。ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿００抗体の結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基についても、実施例７（１）と同様の手法で選択した。

【0452】

選択したアミノ酸残基のうち、配列番号１７８で表わされるアミノ酸配列の１番目のＧｌｕからＧｌｎ、１２番目のＩｌｅからＶａｌ、１４番目のＰｒｏからＡｌａ、２７番目のＰｈｅからＳｅｒ、２８番目のＴｈｅからＩｌｅ、２９番目のＶａｌからＰｈｅ、３７番目のＶａｌからＴｙｒ、４４番目のＧｌｙからＧｌｎ、４５番目のＬｙｓからＡｒｇ、４６番目のＧｌｕからＧｌｙ、４７番目のＴｒｐからＬｅｕ、４９番目のＳｅｒからＡｌａ、７８番目のＬｅｕからＶａｌおよび９６番目のＡｌａからＡｓｎ、９７番目のＡｒｇからＡｌａのアミノ酸残基置換から選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含むヒト化抗体のアミノ酸配列を作製し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨＨを設計した。

【0453】

具体的には、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ヒト化抗体のＶＨＨとして、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０１（配列番号７６）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０２（配列番号７８）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０３（配列番号８０）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０４（配列番号８２）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０５（配列番号８４）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０６（配列番号８６）を設計した。各種ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ヒト化抗体のＶＨＨをコードするアミノ酸配列を表６に示す。

【0454】

表６に示すヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、動物細胞で高頻度に使用されるコドンを用いて設計し、表６に示す。

【0455】

【表6】

【0456】

（３）ＣＡＤＭ３ヒト化抗体の調製
実施例２（１）と同様の方法で、表６に記載した各種ヒト化抗ＣＡＤＭ３抗体のＶＨＨ領域の遺伝子断片を挿入した抗体発現ベクターを作製した。実施例２（５）と同様の方法で作製したベクターを発現させて抗体を得た。

【0457】

作製したヒト化抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体を、それぞれｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０１ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０２ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０３ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０４ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０１ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０２ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０３ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０４ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０５ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）およびｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０６ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）と命名した。

【0458】

（４）ＣＡＤＭ３ヒト化抗体のＣＡＤＭ３発現細胞への反応性解析
作製したヒト化抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体について、実施例３と同様の手順でＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ヒトＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞およびマウスＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対して反応性を解析した。結果を表７および表８に示す。

【0459】

【表7】

【0460】

【表8】

【0461】

表７および表８に示すように、全ての抗体で平均蛍光強度比はコントロールである抗ＡＶＭ抗体に対して増加しており、ヒト化抗ＣＡＤＭ３抗体はヒトＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞およびマウスＣＡＤＭ３／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に反応することが明らかとなった。

【0462】

作製したヒト化抗ＣＡＤＭ３抗体について、実施例６と同様の手順で表面プラズモン共鳴検出によるＣＡＤＭ３に対する結合性を評価した。その結果、表９および表１０に示す通り、全ての抗体がヒトＣＡＤＭ３およびマウスＣＡＤＭ３に親和性を示した。

【0463】

【表9】

【0464】

【表10】

【0465】

［実施例８］ヒト化抗ＣＡＤＭ３抗体のマウス脳移行性評価
ネガティブコントロール抗体（抗ＡＶＭ抗体）、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体（ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ））、ヒト化抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体（ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０４ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ））について、ＳＡＩＶＩ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｐｒｏｔｅｉｎ １ｍｇ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔにて標識を行った。標識後の各抗体を５ｍｇ／ｋｇ体重で尾静脈（ｉ．ｖ．）投与し、７日後に採血を行った。

【0466】

採血後に麻酔下にて全身灌流後、脳組織を回収してその重さを測定した。回収した脳組織にバッファー溶液を加えホモジナイズし、遠心分離後、上清に溶出された抗体溶液を回収した。その容量を測定するとともに抗体濃度をＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により測定し、単位脳重量あたりの抗体量を算出した。なお、標準曲線は各抗体を用いて作成した。また、同条件で回収した脳組織について、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（パーキンエルマー社製）にて蛍光強度を測定した。

【0467】

抗体投与７日後の血清中抗体濃度を図７（Ａ）、脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量を図７（Ｂ）に示す。図７（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）およびｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０４ ＶＨＨ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）では、血清中の抗体濃度および脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量ともに差はなく、ヒト化後も脳内抗体量を高められる効果が維持されていることが示された。

【0468】

抗体投与7日後の脳イメージング像を図８（Ａ）に示す。脳中蛍光量を投与抗体の蛍光強度で補正した値の対ネガティブコントロール比を図８（Ｂ）に示す。図８（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ネガティブコントロールと比較して、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体およびヒト化抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ－Ｆｃ抗体はいずれも脳内抗体量が数倍に高まっており、抗体の分布が脳内全域に亘っていることが示された。以上の結果から、抗ＣＡＤＭ３ ＶＨＨ抗体と同等の活性を維持したヒト化ＶＨＨが作製された。

【0469】

本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１８年６月２６日付けで出願された日本特許出願（特願２０１８－１２０４７７）に基づいており、その全体が引用により援用される。

【配列表フリーテキスト】

【0470】

配列番号１－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号７－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号８－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号９－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１－人工配列の説明： ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１２－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１３－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１４－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１５－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１６－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１７－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１８－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１９－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２０－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３０１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３１０２のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４１－人工配列の説明： 抗ＡＶＭ抗体の軽鎖（シグナル配列除く）をコードする塩基配列
列番号４２－人工配列の説明：抗ＡＶＭ抗体の軽鎖（シグナル配列除く）のアミノ酸配列
配列番号４３－人工配列の説明：ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ＶＨＨの重鎖（シグナル配列除く）をコードする塩基配列
配列番号４４－人工配列の説明：ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ５ ＶＨＨの重鎖（シグナル配列除く）のアミノ酸配列
配列番号４５－人工配列の説明：ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨの重鎖（シグナル配列除く）をコードする塩基配列
配列番号４６－人工配列の説明：ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８ ＶＨＨの重鎖（シグナル配列除く）のアミノ酸配列
配列番号４７－人工配列の説明：ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ＶＨＨの重鎖（シグナル配列除く）をコードする塩基配列
配列番号４８－人工配列の説明：ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１０ ＶＨＨの重鎖（シグナル配列除く）のアミノ酸配列
配列番号４９－人工配列の説明：ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ ＶＨＨの重鎖（シグナル配列除く）をコードする塩基配列
配列番号５０－人工配列の説明：ｐＣＩ＿ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１ ＶＨＨの重鎖（シグナル配列除く）のアミノ酸配列
配列番号５１－人工配列の説明：シグナル配列を含むヒトＣＡＤＭ３（シグナル配列を含む）をコードする塩基配列
配列番号５２－人工配列の説明：シグナル配列を含むヒトＣＡＤＭ３（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列
配列番号５３－人工配列の説明：シグナル配列を含むマウスＣＡＤＭ３（シグナル配列を含む）をコードする塩基配列
配列番号５４－人工配列の説明：シグナル配列を含むマウスＣＡＤＭ３（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列
配列番号５５－人工配列の説明：シグナル配列を含むサルＣＡＤＭ３（シグナル配列を含む）をコードする塩基配列
配列番号５６－人工配列の説明：シグナル配列を含むサルＣＡＤＭ３（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列
配列番号５７－人工配列の説明：ｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ（シグナル配列を含む）をコードする塩基配列
配列番号５８－人工配列の説明：ｈＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列
配列番号５９－人工配列の説明：ｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ（シグナル配列を含む）をコードする塩基配列
配列番号６０－人工配列の説明：ｍＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列
配列番号６１－人工配列の説明：ｒＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ（シグナル配列を含む）をコードする塩基配列
配列番号６２－人工配列の説明：ｒＣＡＤＭ３－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列
配列番号６３－人工配列の説明：ｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴ（シグナル配列を含む）をコードする塩基配列
配列番号６４－人工配列の説明：ｈＣＡＤＭ３－ＧＳＴ（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列
配列番号６５－人工配列の説明：ｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴ（シグナル配列を含む）をコードする塩基配列
配列番号６６－人工配列の説明：ｍＣＡＤＭ３－ＧＳＴ（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列
配列番号６７－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０１のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号６８－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０１のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号６９－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０２のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号７０－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０２のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号７１－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０３のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号７２－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０３のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号７３－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０４のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号７４－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿０４のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号７５－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０１のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号７６－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０１のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号７７－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０２のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号７８－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０２のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号７９－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０３のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号８０－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０３のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号８１－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０４のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号８２－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０４のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号８３－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０５のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号８４－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０５のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号８５－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０６のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号８６－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿０６のＶＨＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号８７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号８８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号８９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号９０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号９１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号９２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号９３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号９４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号９５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号９６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３２１９のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号９７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号９８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号９９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１００－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１０２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０９のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１０３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０９のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１０４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０９のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１０５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０９のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０９のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１０７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１２のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１０８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１２のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１０９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１２のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１１０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１２のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１１１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１２のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１４のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１１３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１４のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１１４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１４のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１１５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１４のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１１６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１４のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１６のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１１８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１６のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１１９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１６のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１２０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１６のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１２１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３１６のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１２２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３４９のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１２３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３４９のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１２４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３４９のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１２５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３４９のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１２６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３４９のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１２７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３５１のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１２８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３５１のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１２９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３５１のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１３０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３５１のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１３１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３５１のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１３２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１、ＣＡＤＭ３３０９、ＣＡＤＭ３３１２、ＣＡＤＭ３３１４、ＣＡＤＭ３３１６、ＣＡＤＭ３３４９およびＣＡＤＭ３３５１のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１３３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１、ＣＡＤＭ３３０９、ＣＡＤＭ３３１２、ＣＡＤＭ３３１４、ＣＡＤＭ３３１６、ＣＡＤＭ３３４９およびＣＡＤＭ３３５１のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１３４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１、ＣＡＤＭ３３０９、ＣＡＤＭ３３１２、ＣＡＤＭ３３１４、ＣＡＤＭ３３１６、ＣＡＤＭ３３４９およびＣＡＤＭ３３５１のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１３５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１、ＣＡＤＭ３３０９、ＣＡＤＭ３３１２、ＣＡＤＭ３３１４、ＣＡＤＭ３３１６、ＣＡＤＭ３３４９およびＣＡＤＭ３３５１のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１３６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３３０１、ＣＡＤＭ３３０９、ＣＡＤＭ３３１２、ＣＡＤＭ３３１４、ＣＡＤＭ３３１６、ＣＡＤＭ３３４９およびＣＡＤＭ３３５１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１３７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１３８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１３９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１４０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１４１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１４２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０４のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１４３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０４のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１４４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０４のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１４５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０４のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１４６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０４のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１４７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４３２のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１４８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４３２のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１４９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４３２のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１５０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４３２のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１５１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４３２のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１５２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４４８のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１５３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４４８のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１５４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４４８のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１５５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４４８のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１５６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４４８のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１５７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４５８のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１５８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４５８のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１５９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４５８のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１６０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４５８のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１６１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４５８のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１６２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２、ＣＡＤＭ３４０４、ＣＡＤＭ３４３２、ＣＡＤＭ３４４８およびＣＡＤＭ３４５８のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１６３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２、ＣＡＤＭ３４０４、ＣＡＤＭ３４３２、ＣＡＤＭ３４４８およびＣＡＤＭ３４５８のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１６４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２、ＣＡＤＭ３４０４、ＣＡＤＭ３４３２、ＣＡＤＭ３４４８およびＣＡＤＭ３４５８のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１６５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２、ＣＡＤＭ３４０４、ＣＡＤＭ３４３２、ＣＡＤＭ３４４８およびＣＡＤＭ３４５８のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１６６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３４０２、ＣＡＤＭ３４０４、ＣＡＤＭ３４３２、ＣＡＤＭ３４４８およびＣＡＤＭ３４５８のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１６７－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１６８－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１６９－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１７０－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１７１－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１７２－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１７３－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１７４－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１７５－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１７６－人工配列の説明：ＣＡＤＭ３５０１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１７７－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ８＿００のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をアミノ酸配列
配列番号１７８－人工配列の説明：ｉＣＡＤＭ３＿３Ｒ１－Ｌ１１＿００のＶＨＨ（シグナル配列を除く）をアミノ酸配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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