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特許7397488ＳＯＤ１二重発現ベクターおよびその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-05

(45)【発行日】2023-12-13

(54)【発明の名称】ＳＯＤ１二重発現ベクターおよびその使用

(51)【国際特許分類】

C12N 15/113 20100101AFI20231206BHJP

C12N 15/53 20060101ALI20231206BHJP

C12N 15/35 20060101ALI20231206BHJP

C12N 7/01 20060101ALI20231206BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20231206BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20231206BHJP

A61P 21/00 20060101ALI20231206BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20231206BHJP

A61K 31/7105 20060101ALI20231206BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20231206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/53

C12N15/35

C12N7/01

A61P43/00 111

A61P25/00

A61P21/00

A61K48/00

A61K31/7105

A61K35/76

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2020516885

(86)(22)【出願日】2018-09-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-12-10

(86)【国際出願番号】 US2018052173

(87)【国際公開番号】W WO2019060686

(87)【国際公開日】2019-03-28

【審査請求日】2021-09-21

(31)【優先権主張番号】62/561,932

(32)【優先日】2017-09-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507088266

【氏名又は名称】ユニバーシティオブマサチューセッツ

【住所又は居所原語表記】ＯｎｅＢｅａｃｏｎＳｔｒｅｅｔ，３１ｓｔＦｌｏｏｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ０２１０８

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和清司

(72)【発明者】

【氏名】ミュラー，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，ロバート，エイチ．，ジュニア

【審査官】斉藤貴子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５１０２９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００９／００４２８２８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】KUBODERA, T. et al.，In vivo application of an RNAi strategy for the selective suppression of a mutant allele.，Human gene therapy，2011年，Vol. 22，P. 27-34

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｐ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下:
(ａ)対象の内因性ｍＲＮＡにハイブリダイズし、および前記内因性ｍＲＮＡの発現を阻害する、前記内因性ｍＲＮＡに相補的な充分な配列を有する核酸を含む１以上の第１ｍｉＲＮＡをコードする第１領域（ここで、１以上の第１ｍｉＲＮＡが、配列番号３および/または配列番号４の配列を含み、ここで、前記内因性ｍＲＮＡはＳＯＤ１タンパク質をコードする）;および
(ｂ)野生型ＳＯＤ１タンパク質をコードする外因性ｍＲＮＡをコードする第２領域（ここで外因性ｍＲＮＡが、配列番号７の配列を含む）
を含む、単離された核酸であって、１以上の第１ｍｉＲＮＡは、前記外因性ｍＲＮＡにハイブリダイズしてその発現を阻害するのに充分な配列相補性を有する核酸を含まない、前記単離された核酸。

【請求項2】

(ｉ)外因性ｍＲＮＡが、５'非翻訳領域(５'ＵＴＲ)を欠く、３'非翻訳領域(３'ＵＴＲ)を欠く、または５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲの両方を欠く;および/または
(ii)ＳＯＤ１タンパク質をコードする外因性ｍＲＮＡが、内因性ｍＲＮＡに対する１以上のサイレント塩基対突然変異を有し、任意にここで、外因性ｍＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡと少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、
請求項１に記載の単離された核酸。

【請求項3】

１以上の第１ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ-１５５またはｍｉＲ-３０の隣接領域をさらに含む、請求項１または２に記載の単離された核酸。

【請求項4】

第１領域に作動可能に連結されている第１プロモーターをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された核酸であって、任意にここで、第１プロモーターは、
(ａ)ＲＮＡポリメラーゼIII(ｐｏｌ III)プロモーターであり、任意にここで、ｐｏｌ IIIプロモーターは、Ｈ１プロモーターまたはＵ６プロモーターである;
または
(ｂ)ＲＮＡポリメラーゼII(ｐｏｌ II)プロモーターであり、任意にここで、ｐｏｌ IIプロモーターは、ニワトリベータアクチン(ＣＢＡ)プロモーターまたは内因性ＳＯＤ１プロモーター(例として、配列番号１６)である、前記単離された核酸。

【請求項5】

第２領域に作動可能に連結されている第２プロモーターを含む、請求項４に記載の単離された核酸であって、任意にここで、第２プロモーターは、ｐｏｌ IIプロモーターであり、任意にここで、ｐｏｌ IIプロモーターは、ニワトリベータアクチン(ＣＢＡ)プロモーターまたは内因性ＳＯＤ１プロモーターである、前記単離された核酸。

【請求項6】

エンハンサー配列をさらに含み、任意にここで、エンハンサーはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)エンハンサーである、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項7】

第１領域が、第２領域の非翻訳領域(例として、ＵＴＲ)内に配置され、任意にここで第１領域は、単離された核酸のイントロン内に配置されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項8】

第１領域が、第２領域に対して５'に配置されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項9】

少なくとも１のアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)逆位末端配列(ＩＴＲ)をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された核酸であって、任意にここで、前記単離された核酸は、全長ＩＴＲおよび変異型ＩＴＲを含み、ここで、ＩＴＲは、第１および第２領域に隣接する、前記単離された核酸。

【請求項10】

以下:
(ｉ)請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された核酸;および
(ii)ＡＡＶカプシドタンパク質
を含む、組み換えアデノ随伴ウイルス(ｒＡＡＶ)。

【請求項11】

請求項１０に記載のｒＡＡＶであって、
(ａ)前記ｒＡＡＶはＣＮＳ組織を標的とし、任意にここで、前記ｒＡＡＶはニューロンを標的とする;および/または
(ｂ)カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、前記ｒＡＡＶ。

【請求項12】

請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項１０または１１記載のｒＡＡＶ、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む、組成物。

【請求項13】

細胞においてＳＯＤ１発現を阻害するための方法における使用のための単離された核酸であって、前記方法は、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項１０または１１に記載のｒＡＡＶを細胞へ送達することを含み、任意にここで、細胞は、変異型ＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸配列を含む、前記単離された核酸。

【請求項14】

ＡＬＳを有するか、または有すると疑われる対象を処置する方法における使用のための単離された核酸であって、前記方法は、有効量の請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された核酸、または有効量の請求項１０または１１に記載のｒＡＡＶを対象へ投与することを含み、任意にここで、対象は哺乳動物であり、任意にここで、哺乳動物はヒトである、前記単離された核酸。

【請求項15】

対象が、変異型ＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、任意にここで、対象は哺乳動物であり、任意にここで、哺乳動物はヒトである、請求項１４に記載の単離された核酸。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、「ＳＯＤ１二重発現ベクターおよびその使用」と題された２０１７年９月２２日に出願された米国仮出願第６２／５６１，９３２号の出願日の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）下の利益を主張し、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

背景
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、時として前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）と同時に進行する進行性の一般に致命的な運動ニューロン障害である。ＡＬＳは散発性（ＳＡＬＳ）および家族性（ＦＡＬＳ）の両方の形式で発生する。症例の約１０％は常染色体優性形質として伝わる。ＦＤＡが承認したＡＬＳの治療は、生存率を約１０％延長する化合物であるリルゾールである。
一般に、ＡＬＳ細胞およびトランスジェニック動物におけるＳＯＤ１サイレンシングの利益を示す研究は、突然変異アレルのみのサイレンシングについて記載していない。むしろ、ほとんどの研究では、サイレンシングが変異型毒性ＳＯＤ１タンパク質および野生型ＳＯＤ１タンパク質の両方のレベルを低減する。しかしながら、変異型および野生型の両方のアレルからのＳＯＤ１の過剰なサイレンシングは、野生型ＳＯＤ１タンパク質の活性または機能の低下の結果として、望ましくない生物学的結果に関連し得る。

【発明の概要】

【0003】

概要
本開示の側面は、細胞におけるサイトゾルＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）発現を調節するための組成物および方法に関する。したがって、いくつかの態様において、ＡＬＳを処置するのに有用な方法が提供される。いくつかの態様において、本開示は、細胞または対象における内因性ＳＯＤ１の発現を阻害するように操作された合成核酸（例として、合成マイクロＲＮＡ）を提供する。いくつかの態様において、本開示は、細胞または対象において外因性ＳＯＤ１を発現するように操作された核酸を提供する。いくつかの態様において、かかる外因性ＳＯＤ１は、内因性ＳＯＤ１を標的とする合成核酸（例として、合成マイクロＲＮＡ）による標的化に耐性がある。したがって、いくつかの態様において、本開示は、（１）内因性サイトゾルＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）活性の発現を抑制する合成マイクロＲＮＡの送達を、（２）合成マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に耐性がある外因性ＳＯＤ１を発現する第２構築物に連結するための組成物および方法を提供する。

【0004】

本開示は、抗ＳＯＤ１ｍｉＲＮＡ、抗ＳＯＤ１ｍｉＲＮＡに耐性があるように操作されたＲＮＡから発現したＳＯＤ１のｃＤＮＡを連続して含めることにより、ＳＯＤ１不均化による神経保護活性の喪失の課題に取り組む、本明細書に記載される組成物および方法に部分的に基づく。いくつかの態様において、本開示によって記載される構築物は、ＷＴおよび変異型内因性ＳＯＤ１アレルの両方の完全なサイレンシングを伴う場合でも、（例として、構築物が投与された細胞または対象における）正常なレベルのＳＯＤ１不均化活性を可能にする。

【0005】

したがって、いくつかの側面において、本開示は、以下を含む単離された核酸を提供する：対象の内因性ｍＲＮＡにハイブリダイズし、前記内因性ｍＲＮＡの発現を阻害する、前記内因性ｍＲＮＡに相補的な充分な配列を有する核酸を含む１以上の第１ｍｉＲＮＡをコードする第１領域、ここで、内因性ｍＲＮＡはＳＯＤ１タンパク質をコードする；および、野生型ＳＯＤ１タンパク質をコードする外因性ｍＲＮＡをコードする第２領域、ここで、１以上の第１ｍｉＲＮＡは、前記外因性ｍＲＮＡにハイブリダイズし、前記外因性ｍＲＮＡの発現を阻害するための相補的な充分な配列を有する核酸を含まない。
いくつかの態様において、外因性ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を欠く、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を欠く、または５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を欠く。
いくつかの態様において、ＳＯＤ１タンパク質をコードする外因性ｍＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡに対する１以上のサイレント塩基対突然変異を有する。いくつかの態様において、外因性ｍＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡと少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。

【0006】

いくつかの態様において、野生型ＳＯＤ１は、配列番号７に記載の核酸配列によってコードされている（強化ＳＯＤ１配列）。
いくつかの態様において、１以上の第１ｍｉＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡをコードする核酸の非翻訳領域（例として、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）を標的とする。いくつかの態様において、１以上の第１ｍｉＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡをコードする核酸のコード配列を標的とする。
いくつかの態様において、１以上の第１ｍｉＲＮＡは、配列番号３に記載の配列によってコードされているＲＮＡの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１の連続したヌクレオチドを含む核酸にハイブリダイズする。いくつかの態様において、１以上の第１ｍｉＲＮＡは、配列番号２に記載の配列によってコードされているＲＮＡの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１の連続したヌクレオチドを含む核酸にハイブリダイズする。

【0007】

いくつかの態様において、１以上の第１ｍｉＲＮＡは、配列番号４に記載の配列の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１の連続したヌクレオチドを含むか、またはこれによってコードされる。いくつかの態様において、１以上の第１ｍｉＲＮＡは、配列番号３に記載の配列の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１の連続したヌクレオチドを含むか、またはこれによってコードされる。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ-１５５の隣接領域またはｍｉＲ-３０の隣接領域をさらに含む。
いくつかの態様において、単離された核酸は第１プロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、第１プロモーターは、本開示によって記載される単離された核酸の第１領域に作動可能に連結されている。
いくつかの態様において、第１プロモーターは、Ｈ１プロモーターまたはＵ６プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）プロモーターである。

【0008】

いくつかの態様において、第１プロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたは内因性ＳＯＤ１プロモーター（例として、配列番号１６）などのＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーターである。
いくつかの態様において、単離された核酸は、第２プロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、第２プロモーターは、本開示によって記載される単離された核酸の第２領域に作動可能に連結されている。
いくつかの態様において、第２プロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたは内因性ＳＯＤ１プロモーターなどのｐｏｌＩＩプロモーターである。
いくつかの態様において、単離された核酸は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーなどのエンハンサー配列をさらに含む。

【0009】

いくつかの態様において、第１領域は、第２領域の非翻訳領域（例として、ＵＴＲ）内に配置される。いくつかの態様において、第１領域は、単離された核酸のイントロン内に配置される。いくつかの態様において、第１領域は、第２領域に対して５’に配置される。
いくつかの態様において、単離された核酸は、少なくとも１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）をさらに含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、全長ＩＴＲおよび変異型ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ＩＴＲは、本開示によって記載される単離された核酸の第１および第２領域に隣接する。
いくつかの態様において、本開示は、本開示によって記載される単離された核酸およびＡＡＶカプシドタンパク質を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。

【0010】

いくつかの態様において、ｒＡＡＶはＣＮＳ組織を標的とする。いくつかの態様において、ｒＡＡＶはニューロンを標的とする。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である。
いくつかの側面において、本開示は、本開示によって記載される単離された核酸または本開示によって記載されるｒＡＡＶ、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む組成物を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、本開示によって記載される単離された核酸または本開示によって記載されるｒＡＡＶを細胞へ送達することを含む、細胞においてＳＯＤ１発現を阻害するための方法を提供する。

【0011】

いくつかの態様において、細胞は、変異型ＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸配列を含む。
いくつかの側面において、本開示は、有効量の本開示によって記載される単離された核酸、または有効量の本開示によって記載されるｒＡＡＶを対象へ投与することを含む、ＡＬＳを有するか、または有すると疑われる対象を処置するための方法を提供する。
いくつかの態様において、対象は、変異型ＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象などの哺乳動物対象である。
図面の簡潔な説明

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、２シストロン性二重機能ベクターの構築物設計の概略図を示す。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲＮＡはＨ１プロモーターによって発現され、ｍｉＲＮＡ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡはニワトリベータアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー（例として、ＣＡＧプロモーター）によって発現される。

【図2】図２は、単一プロモーター二重機能ベクターの構築物設計の概略図を示す。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡは両方とも、ニワトリベータアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー（例として、ＣＡＧプロモーター）によって発現される。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲはイントロンに位置する。

【図3】図３は、２シストロン性二重機能ベクターの構築物設計の概略図を示す。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲＮＡはＨ１プロモーターによって発現され、ｍｉＲＮＡ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡはニワトリベータアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー（例として、ＣＡＧプロモーター）によって発現される。野生型ＳＯＤ１に対するサイレント突然変異を含むＳＯＤ１ｃＤＮＡの遺伝子座が示されている（「ｍｉＲ-ＳＯＤ耐性標的」）。

【0013】

【図4】図４は、単一プロモーター二重機能ベクターの構築物設計の概略図を示す。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡは両方とも、ニワトリベータアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー（例として、ＣＡＧプロモーター）によって発現される。野生型ＳＯＤ１に対するサイレント突然変異を含むＳＯＤ１ｃＤＮＡの遺伝子座が示されている（「ｍｉＲ-ＳＯＤ耐性標的」）。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲはイントロンに位置する。

【図5】図５は、２シストロン性二重機能自己相補的ＡＡＶベクターの構築物設計の概略図を示す。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲＮＡはＨ１プロモーターによって発現され、ｍｉＲＮＡ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡはニワトリベータアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー（例として、ＣＡＧプロモーター）によって発現される。野生型ＳＯＤ１に対するサイレント突然変異を含むＳＯＤ１ｃＤＮＡの遺伝子座が示されている（「ｍｉＲ-ＳＯＤ耐性標的」）。変異型ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）は、構築物の５'末端に存在し、全長ＡＡＶＩＴＲは３'末端に位置する。

【0014】

【図6】図６は、２シストロン性二重機能自己相補的ＡＡＶベクターの構築物設計の概略図を示す。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲＮＡはＨ１プロモーターによって発現され、ｍｉＲＮＡ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡはニワトリベータアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー（例として、ＣＡＧプロモーター）によって発現される。野生型ＳＯＤ１に対するサイレント突然変異を含むＳＯＤ１ｃＤＮＡの遺伝子座が示されている（「ｍｉＲ-ＳＯＤ耐性標的」）。ＳＯＤ１発現構築物は３’ＵＴＲを欠く。変異型ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）は、構築物の５'末端に存在し、全長ＡＡＶＩＴＲは３'末端に位置する。

【図7】図７は、単一プロモーター二重機能ＡＡＶベクターの構築物設計の概略図を示す。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡは両方とも、ニワトリベータアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー（例として、ＣＡＧプロモーター）によって発現される。野生型ＳＯＤ１に対するサイレント突然変異を含むＳＯＤ１ｃＤＮＡの遺伝子座が示されている（「ｍｉＲ-ＳＯＤ耐性標的」）。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲはイントロンに位置する。ＡＡＶＩＴＲは構築物の５'および３'末端に位置する。

【0015】

【図8】図８は、単一プロモーター二重機能ＡＡＶベクターの構築物設計の概略図を示す。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡは両方とも、ニワトリベータアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー（例として、ＣＡＧプロモーター）によって発現される。野生型ＳＯＤ１に対するサイレント突然変異を含むＳＯＤ１ｃＤＮＡの遺伝子座が示されている（「ｍｉＲ-ＳＯＤ耐性標的」）。ＳＯＤ１発現構築物は３’ＵＴＲを欠く。抗Ｓｏｄ１ｍｉＲはイントロンに位置する。ＡＡＶＩＴＲは構築物の５'および３'末端に位置する。

【図9】図９は、野生型ＳＯＤ１コード配列（配列番号１）の「強化」ＳＯＤ１コード配列（配列番号７）の例との核酸配列アラインメントを示す。

【0016】

詳細な記載
いくつかの側面において、本開示は、細胞（例として、対象の細胞）における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する遺伝子の発現および／または活性を調節するための組成物および方法に関する。例えば、いくつかの側面において、本開示は、細胞または対象において、（ｉ）ＡＬＳに関連する遺伝子を阻害する１以上の合成核酸（例として、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ）および（ｉｉ）合成核酸に耐性があるタンパク質をコードするＡＬＳに関連する外因性遺伝子を同時に発現する組成物（例として、二重機能ベクター）を提供する。ＡＬＳに関連する遺伝子の例は、Ｃ９Ｏｒｆ７２、ＳＯＤ１、ＦＵＳ、ＴＡＲＤＢＰ、ＳＱＳＴＭ１、ＶＣＰ、ＯＰＴＮ、ＰＦＮ１、ＵＢＱＬＮ２、ＤＣＴＮ１、ＡＬＳ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＦＩＧ４、ＨＮＲＮＡＰ１、ＡＴＸＮ２、ＡＮＧ、ＳＰＧ１１、ＶＡＰＢ、ＮＥＦＨ、ＣＨＣＨＤ１０、ＥＲＢＢ４、ＰＲＰＨ、ＭＡＴＲ３、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＴＢＫ１、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＡＮＸＡ１１、ＮＥＫ１、ＳＡＲＭ１、ＵＮ１３Ａ、ＭＯＢＰ、ＳＣＦＤ１、Ｃ２１Ｏｒｆ２、および他の記載されるもの（例えば、Renton et al. (2014) Nature Neuroscience 17(1):17-23）を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ＡＬＳに関連する遺伝子は、ＡＬＳに関連するドミナントネガティブ遺伝子（例として、ＡＬＳに関連するタンパク質などのドミナントネガティブ遺伝子産物をコードする遺伝子）である。

【0017】

本開示の側面は、細胞におけるサイトゾルＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）発現を調節するための組成物および方法に関する。したがって、いくつかの態様において、ＡＬＳを処置するのに有用な方法が提供される。いくつかの態様において、本開示は、細胞または対象における内因性ＳＯＤ１の発現を阻害するように操作された合成核酸（例として、合成マイクロＲＮＡ）を提供する。いくつかの態様において、本開示は、細胞または対象において外因性ＳＯＤ１を発現するように操作された核酸を提供する。いくつかの態様において、かかる外因性ＳＯＤ１は、内因性ＳＯＤ１を標的とする合成核酸（例として、合成マイクロＲＮＡ）による標的化に耐性がある。

【0018】

本開示の側面は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを使用してＡＬＳを処置するための改善された遺伝子治療組成物および関連する方法に関する。特に、ＡＬＳに関連するＳＯＤ１などの遺伝子を抑制する阻害性核酸を発現するように操作された核酸を内包するｒＡＡＶが提供される。いくつかの態様において、本開示は、組み換えＡＡＶ（例として、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０など）を利用して、マイクロＲＮＡをＣＮＳに送達し、それにより、ＳＯＤ１などのＡＬＳ遺伝子を抑制する。いくつかの側面において、本開示は、野生型ＳＯＤ１を発現しながら、対象における内因性ＳＯＤ１発現（例として、野生型ＳＯＤ１および変異型ＳＯＤ１発現）をノックダウンすることができる二重機能ベクターの発見に関する。したがって、本開示によって記載される構築物は、いくつかの態様において、ＷＴおよび変異型の内因性ＳＯＤ１アレルの両方の完全なサイレンシングを伴う場合でさえ、（例として、構築物が投与された細胞または対象における）正常なレベルのＳＯＤ１不均化活性を可能にする。

【0019】

いくつかの側面において、本開示は、以下を含む単離された核酸を提供する：対象の内因性ｍＲＮＡにハイブリダイズし、前記内因性ｍＲＮＡの発現を阻害する、前記内因性ｍＲＮＡに相補的な充分な配列を有する核酸を含む１以上の第１ｍｉＲＮＡをコードする第１領域、ここで、内因性ｍＲＮＡはＳＯＤ１タンパク質をコードする；および、野生型ＳＯＤ１タンパク質をコードする外因性ｍＲＮＡをコードする第２領域、ここで、１以上の第１ｍｉＲＮＡは、前記外因性ｍＲＮＡにハイブリダイズし、前記外因性ｍＲＮＡの発現を阻害するための相補的な充分な配列を有する核酸を含まない。

【0020】

ＳＯＤ１
本明細書中で使用されるとき、「ＳＯＤ１」は、ＳＯＤ１遺伝子によってヒトにおいてコードされる酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）を指す。典型的には、ＳＯＤ１はスーパーオキシドの過酸化水素および二酸素への不均一化を触媒し、体内のフリーラジカルを除去するように機能する。「野生型ＳＯＤ１」は、細胞または対象において機能毒性の獲得を引き起こさない（例として、ＡＬＳの発症をもたらさない、またはもたらさないであろう）ＳＯＤ１遺伝子によってコードされる遺伝子産物（例として、タンパク質）を指す。いくつかの態様において、野生型ＳＯＤ１遺伝子は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００４５４．４に記載の配列を有するｍＲＮＡ転写産物（例として、成熟ｍＲＮＡ転写産物）をコードする。
「変異型ＳＯＤ１」は、機能の毒性獲得などの変化した機能を有する遺伝子産物（例として、タンパク質）をもたらす１以上の突然変異（例として、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、欠失など）を含む遺伝子産物（例として、タンパク質）を指す。一般に、変異型ＳＯＤ１遺伝子産物をコードする核酸は、野生型ＳＯＤ１遺伝子産物をコードする核酸に対するサイレント突然変異を含まない。

【0021】

２１番染色体上に位置するスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子の突然変異は、家族性筋萎縮性側索硬化症につながっている。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）は、ＳＯＤ１遺伝子によってコードされる酵素である。ＳＯＤ１は銅イオンおよび亜鉛イオンに結合し、体内のフリースーパーオキシドラジカルを破壊する原因となる３つのスーパーオキシドジスムターゼの１つである。コード化されたアイソザイムは、可溶性の細胞質およびミトコンドリアの膜間腔タンパク質であり、ホモダイマーとして機能して、天然に存在するが有害なスーパーオキシドラジカルを分子状酸素および過酸化水素に変換する。ＡＬＳを生じさせ、ＡＬＳを引き起こす頻繁なＳＯＤ１突然変異は、Ａ４Ｖ、Ｈ４６ＲおよびＧ９３Ａを含む。追加のＳＯＤ１突然変異は、例えばBanci et al. (2008) PLoS ONE 3(2): e1677によって記載されている。

【0022】

本開示は、非アレル特異的な様式で内因性ＳＯＤ１発現を同時に阻害し（例として、内因性野生型および内因性変異型ＳＯＤ１を抑制し）、外因性ＳＯＤ１タンパク質（例として、外因性野生型ＳＯＤ１または外因性強化ＳＯＤ１タンパク質）を発現する核酸構築物が、ＷＴおよび変異型の内因性ＳＯＤ１アレルの両方を完全にサイレンシングしても、ＳＯＤ１不均化活性の正常なレベルを可能にする発見に部分的に基づく。本明細書に使用されるとき、「内因性」は、細胞の天然のＤＮＡによってコードされる遺伝子（例として、ＳＯＤ１遺伝子）または遺伝子産物（例として、ＳＯＤ１タンパク質）を指す。「外因性」は、（例として、非天然に細胞に導入された）細胞の天然のＤＮＡ以外の起源に由来する遺伝子（例として、ＳＯＤ１ｃＤＮＡなどのＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸）または遺伝子産物（例として、強化ＳＯＤ１タンパク質などのＳＯＤ１タンパク質）を指す。

【0023】

いくつかの態様において、外因性ＳＯＤ１核酸配列は、強化ＳＯＤ１タンパク質をコードする。本明細書に使用されるとき、「強化ＳＯＤ１」は、内因性野生型ＳＯＤ１タンパク質と同じタンパク質をコードするが、異なる一次核酸（例として、ＤＮＡ）配列を有するように、１以上のサイレント突然変異を含むＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸配列を指す。いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、「強化ＳＯＤ１」ｍＲＮＡ転写産物は、内因性ＳＯＤ１ＲＮＡ転写産物（例として、野生型ＳＯＤ１および変異型ＳＯＤ１転写産物）を標的とするある阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）によって阻害されない。

【0024】

強化ＳＯＤ１核酸配列のサイレント突然変異の数は変わり得る。いくつかの態様において、強化ＳＯＤ１をコードする核酸配列は、野生型ＳＯＤ１核酸配列（例として、配列番号１；ＳＯＤ１コード配列）に対する約１と約５０との間（例として、両端を含む１と５０との間の任意の整数）のサイレント突然変異を含む。いくつかの態様において、強化ＳＯＤ１をコードする核酸配列は、野生型ＳＯＤ１核酸配列（例として、配列番号１；ＳＯＤ１コード配列）に対する少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５のサイレント突然変異を含む。いくつかの態様において、強化ＳＯＤ１をコードする核酸配列の１以上のサイレント突然変異は、阻害性核酸によって標的化されるシード領域に位置する。いくつかの態様において、シード領域は、約３～約２５の連続ヌクレオチド長の範囲に及ぶ（例として、両端を含む３と２５との間の任意の整数）。

【0025】

外因性（例として、強化）ＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸と内因性野生型ＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸との間の核酸（例として、ＤＮＡ）配列同一性は変わり得る。いくつかの態様において、外因性ＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸配列は、内因性野生型ＳＯＤ１核酸配列（例として、配列番号１；ＳＯＤ１ＤＮＡコード配列）と約９９．９％と約８５％との間で同一である。いくつかの態様において、外因性ＳＯＤ１タンパク質をコードする核酸配列は、内因性野生型ＳＯＤ１核酸配列（例として、配列番号１；ＳＯＤ１ＤＮＡコード配列）と約９９．９％、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、または約８５％同一である。いくつかの態様において、核酸配列は、内因性野生型ＳＯＤ１アミノ酸配列（例として、配列番号１７）と約９９．９％と約９０％との間（例として、約９９．９％、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、または約９０％）で同一であるアミノ酸配列を有する外因性ＳＯＤ１タンパク質をコードする。

【0026】

阻害性核酸
本開示の側面は、ＳＯＤ１（例として、内因性ＳＯＤ１）を標的とする阻害性核酸に関する。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＲＮＡ、ｐｒｅ-ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、その機能または発現を阻害する核酸である。いくつかの態様において、阻害性核酸は一本鎖または二本鎖である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号４：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ｍｉＲ-ＳＯＤ-１２７）に記載の配列を含むか、またはこれによってコードされる。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号３：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ｍｉＲ-ＳＯＤ-１２７）に記載の配列を含むか、またはこれによってコードされる。いくつかの態様において、阻害性核酸は配列番号３および配列番号４を含む成熟したｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、配列番号３は、成熟したｍｉＲＮＡのガイド鎖であり、配列番号４は、成熟したｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖（例として、ｍｉＲＮＡ^＊）である。

【0027】

いくつかの態様において、阻害性核酸は、５～３０塩基長（例として、１０～３０、１５～２５、１９～２２）である。阻害性核酸は、１０～５０、または５～５０塩基長でもあり得る。例えば、阻害性核酸は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基長のいずれか１つであり得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、例として、標的核酸の少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０塩基、または３０または４０塩基までと少なくとも８０％または９０％相補的な塩基の配列を含むか、またはこれからなるか、または標的核酸の１０、１５、２０、２５または３０塩基にわたって６までのミスマッチを有する塩基の配列を含む。

【0028】

いくつかの態様において、本明細書で提供される配列内の任意の１以上のチミジン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウリジン（Ｕ）ヌクレオチドは、アデノシンヌクレオチドとの塩基対合（例として、ワトソンクリック塩基対を介する）に好適な任意の他のヌクレオチドで置き換えられ得る。例えば、ＴはＵで置き換えられ得、ＵはＴで置き換えられ得る。いくつかの態様において、中枢神経系の細胞における遺伝子の発現を阻害する阻害性核酸が提供される。いくつかの態様において、細胞は、ニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞である。

【0029】

いくつかの態様において、阻害性核酸はｍｉＲＮＡである。「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、転写または翻訳後の遺伝子サイレンシングを媒介することができる小さな非コードＲＮＡ分子である。典型的には、ｍｉＲＮＡはヘアピンまたはステムループ（例として、自己相補性、一本鎖バックボーンを有する）二重鎖構造として転写され、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ-ｍｉＲＮＡ）と称され、（例として、Ｄｒｏｓｈａ、ＤＧＣＲ８、Ｐａｓｈａなどによって）ｐｒｅ-ｍｉＲＮＡへと酵素的に処理される。ｐｒｉ-ｍｉＲＮＡの長さは変わり得る。いくつかの態様において、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、約１００～約５０００塩基対（例として、約１００、約２００、約５００、約１０００、約１２００、約１５００、約１８００、または約２０００塩基対）長の範囲に及ぶ。いくつかの態様において、ｐｒｉ-ｍｉＲＮＡは、２００塩基対長よりも大きい（例として、２５００、５０００、７０００、または９０００以上の塩基対長）。

【0030】

ヘアピンまたはステムループ二重鎖構造によっても特徴付けられるｐｒｅ-ｍｉＲＮＡもまた長さが変わり得る。いくつかの態様において、ｐｒｅ-ｍｉＲＮＡは、約４０塩基対長～約５００塩基対長のサイズの範囲に及ぶ。いくつかの態様において、ｐｒｅ-ｍｉＲＮＡは、約５０～１００塩基対長のサイズの範囲に及ぶ。いくつかの態様において、ｐｒｅ-ｍｉＲＮＡは、約５０～約９０塩基対長（例として、約５０、約５２、約５４、約５６、約５８、約６０、約６２、約６４、約６６、約６８、約７０、約７２、約７４、約７６、約７８、約８０、約８２、約８４、約８６、約８８、または約９０塩基対長）のサイズの範囲に及ぶ。

【0031】

一般に、ｐｒｅ-ｍｉＲＮＡは細胞質にエクスポートされ、ダイサーによって酵素処理されて最初に不完全なｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖を生成し、次いで一本鎖の成熟ｍｉＲＮＡ分子を生成し、続いてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる。典型的には、成熟ｍｉＲＮＡ分子は約１９～約３０塩基対長のサイズの範囲に及ぶ。いくつかの態様において、成熟ｍｉＲＮＡ分子は、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または３０塩基対長である。いくつかの態様において、本開示の単離された核酸は、配列番号４（ｍｉＲ-ＳＯＤ-１２７）および／または配列番号３に記載の配列を含むか、またはこれによってコードされる、ｐｒｉ-ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ-ｍｉＲＮＡ、または成熟ｍｉＲＮＡをコードする配列を含む。

【0032】

いくつかの側面において、本開示は、１以上の人工ｍｉＲＮＡをコードする単離された核酸およびベクター（例として、ｒＡＡＶベクター）を提供する。本明細書に使用されるとき、「人工ｍｉＲＮＡ」または「ａｍｉＲＮＡ」は、内因性ｐｒｉ-ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ-ｍｉＲＮＡ（例として、機能的な成熟ｍｉＲＮＡを生成できる前駆体ｍｉＲＮＡであるｍｉＲＮＡバックボーン）を指し、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^＊（例として、ｍｉＲＮＡ二重鎖のパッセンジャー鎖）配列は、例えばEamens et al. (2014), Methods Mol. Biol. 1062:211-224に記載されているように、標的とされた遺伝子の高度に効率的なＲＮＡサイレンシングを指示する対応するａｍｉＲＮＡ／ａｍｉＲＮＡ^＊配列に置き換えられている。例えば、いくつかの態様において、人工ｍｉＲＮＡは、成熟ＳＯＤ１特異的ｍｉＲＮＡ（例として、配列番号３および／または４；ｍｉＲ-ＳＯＤ-１２７）をコードする配列が内因性ｍｉＲ-１５５成熟ｍｉＲＮＡをコードする配列の代わりに挿入されているｍｉＲ-１５５ｐｒｉ-ｍｉＲＮＡバックボーンを含む。いくつかの態様において、本開示によって記載されるｍｉＲＮＡ（例として、人工ｍｉＲＮＡ）は、ｍｉＲ－１５５バックボーン配列、ｍｉＲ－３０バックボーン配列、ｍｉｒ－６４バックボーン配列、ｍｉＲ－１０６バックボーン、ｍｉＲ－２１バックボーン、ｍｉＲ-１バックボーン、ｍｉＲ-４５１バックボーン、ｍｉＲ-１２６バックボーン、またはｍｉＲ-１２２バックボーン配列を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｍｉＲ－１５５またはｍｉＲ－３０の隣接領域を有する標的化配列を含むマイクロＲＮＡである。

【0033】

いくつかの態様において、単離された核酸またはベクター（例として、ｒＡＡＶベクター）は、１より多く（例として、２、３、４、５、または１０以上などの複数）のｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むことを理解されたい。いくつかの態様において、１より多くのｍｉＲＮＡの各々は、同じ標的遺伝子（例として、各ｍｉＲＮＡがＳＯＤ１遺伝子を標的とする３の固有のｍｉＲＮＡをコードする単離された核酸）を標的とする（例として、ハイブリダイズまたは特異的に結合する）。いくつかの態様において、１より多くのｍｉＲＮＡの各々は、異なる標的遺伝子を標的とする（例として、ハイブリダイズまたは特異的に結合する）。

【0034】

単離された核酸
いくつかの側面において、本開示は、内因性ＳＯＤ１の発現を阻害するための合成マイクロＲＮＡをコードする第１発現構築物および合成マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に耐性がある外因性ＳＯＤ１を発現する第２発現構築物を含む単離された核酸に関する。

【0035】

「核酸」配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を指す。いくつかの態様において、本開示のタンパク質および核酸は、単離されたものである。本明細書に使用されるとき、用語「単離された（isolated）」は、人工的に産生されたことを意味する。核酸に関し本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、以下を意味する：（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、in vitroで増幅された；（ｉｉ）クローニングによって、組み換えで産生された；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離などによって（as by cleavage and gel separation）、精製された；または（ｉｖ）例えば化学合成によって、合成された。単離された核酸は、当該技術分野において周知の組み換えＤＮＡ技法による容易な取扱が可能なものである。よって、５'および３'制限部位が既知であるか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されているベクターに含まれるヌクレオチド配列は、単離されたとものと考えられるが、その天然の状態でその自然宿主において存在する核酸配列はそうではない。単離された核酸は実質的に精製されたものであり得るが、そうである必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内で単離された核酸は、それが存在する細胞においてごくわずかなパーセンテージの材料しか含まないものであり得るという点で純粋ではない。しかしながら、かかる核酸は、当業者に知られている標準的な技法によって容易に操作できるため、この用語が本明細書で使用されるように、単離される。タンパク質またはペプチドに対して本明細書に使用されるとき、「単離された」という用語は、その自然環境から単離された、または人工的に生成された（例として、化学合成、組み換えＤＮＡ技術などにより）タンパク質またはペプチドを指す。

【0036】

本開示の単離された核酸は、典型的には、対象の内因性ｍＲＮＡ（例として、内因性野生型ＳＯＤ１および／または内因性変異型ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡ）を標的とする１以上の阻害性ＲＮＡをコードする１以上の領域を含む。単離された核酸はまた、典型的には、１以上の外因性ｍＲＮＡをコードする１以上の領域を含む。１以上の外因性ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（単数または複数）は、１以上の内因性ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（単数または複数）と配列組成が異なっていても異なっていなくてもよい。例えば、１以上の内因性ｍＲＮＡは、対象が特定の突然変異についてヘテロ接合性であり、外因性ｍＲＮＡが同じ特定のタンパク質の野生型ｍＲＮＡをコードし得る場合など、特定のタンパク質の野生型および変異型をコードし得る。この場合において、典型的には、外因性ｍＲＮＡおよび野生型タンパク質をコードする内因性ｍＲＮＡの配列は、外因性ｍＲＮＡが１以上の阻害性ＲＮＡによって標的にされないように充分に異なる。これは、例えば、内因性ｍＲＮＡと同じタンパク質をコードするが異なる核酸配列を有するように、外因性ｍＲＮＡに１以上のサイレント突然変異を導入することによって達成され得る。この場合、外来性ｍＲＮＡは「強化」されたものと称され得る。代わりに、阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）は、内因性ｍＲＮＡの５'および／または３'非翻訳領域を標的とし得る。これらの５’および／または３’領域は、次いで外因性ｍＲＮＡが１以上の阻害性ＲＮＡによって標的にされないように、外因性ｍＲＮＡにおいて除去または置換され得る。

【0037】

別の例において、対象が特定の突然変異についてホモ接合性である場合など、１以上の内因性ｍＲＮＡは特定のタンパク質の変異型バージョンのみをコードし得、外因性ｍＲＮＡは同じ特定のタンパク質の野生型ｍＲＮＡをコードし得る。この場合において、外因性ｍＲＮＡの配列は上記のように強化され得るか、または１以上の阻害性ＲＮＡは外因性ｍＲＮＡからの変異した内因性ｍＲＮＡを区別するように設計され得る。
いくつかの態様において、単離された核酸は、典型的には、対象の内因性ｍＲＮＡにハイブリダイズし、前記内因性ｍＲＮＡ（例として、内因性ＳＯＤ１ｍＲＮＡ）の発現を阻害する、前記内因性ｍＲＮＡに相補的な充分な配列を有する核酸を含む１以上の第１阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）をコードする第１領域を含む。単離された核酸はまた、典型的には、外因性ｍＲＮＡ（例として、外因性ＳＯＤ１）をコードする第２領域を含み、外因性ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、第１タンパク質と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、１以上の第１阻害性ＲＮＡは、前記外因性ｍＲＮＡにハイブリダイズし、前記外因性ｍＲＮＡの発現を阻害するための相補的な充分な配列を有する核酸を含まない。例えば、第１領域は、任意の好適な場所に配置され得る。第１領域は、第２領域の非翻訳部分内に配置され得る。第１領域は、例えば、イントロン、５’または３’非翻訳領域などを含む、核酸の任意の非翻訳部分に配置され得る。

【0038】

阻害性核酸を含む領域（例として、第１領域）は、単離された核酸の任意の好適な場所に配置され得る。前記領域は、例えば、イントロン、５'または３'非翻訳領域などを含む、核酸の任意の非翻訳部分に配置され得る。
いくつかのケースにおいて、タンパク質をコードする核酸配列（外因性ＳＯＤ１タンパク質コード配列をコードする第２領域など）の第１コドンの上流に領域（例として、第１領域）を配置することが所望され得る。例えば、前記領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの上流の２０００ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの上流の１０００ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの上流の５００ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの上流の２５０ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの上流の１５０ヌクレオチドとの間に配置され得る。

【0039】

いくつかのケースにおいて、外因性ＳＯＤ１タンパク質をコードする領域のポリＡテールの上流に領域（例として、第１領域などの阻害性核酸をコードする領域）を配置することが所望され得る。例えば、前記領域は、ポリＡテールの第１塩基と第１塩基の上流の２０００ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、ポリＡテールの第１塩基と第１塩基の上流の１０００ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、ポリＡテールの第１塩基と第１塩基の上流の５００ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、ポリＡテールの第１塩基と第１塩基の上流の２５０ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、ポリＡテールの第１塩基と第１塩基の上流の１５０ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、ポリＡテールの第１塩基と第１塩基の上流の１００ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、ポリＡテールの第１塩基と第１塩基の上流の５０ヌクレオチドとの間に配置され得る。前記領域は、ポリＡテールの第１塩基と第１塩基の上流の２０ヌクレオチドとの間に配置され得る。いくつかの態様において、前記領域は、プロモーター配列の最後のヌクレオチド塩基とポリＡテール配列の第１ヌクレオチド塩基との間に配置される。

【0040】

いくつかのケースにおいて、阻害性核酸をコードする領域（例として、第１領域）は、外因性ＳＯＤ１タンパク質をコードする領域のポリＡテールの最後の塩基の下流に配置され得る。前記領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の下流の２０００ヌクレオチドの位置との間にあり得る。前記領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の下流の１０００ヌクレオチドの位置との間にあり得る。前記領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の下流の５００ヌクレオチドの位置との間にあり得る。前記領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の下流の２５０ヌクレオチドの位置との間にあり得る。前記領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の下流の１５０ヌクレオチドの位置との間にあり得る。
単離された核酸が１より多くのｍｉＲＮＡをコードする場合において、各ｍｉＲＮＡは、構築物内の任意の好適な場所に配置され得ることを理解されたい。例えば、第１ｍｉＲＮＡをコードする核酸は外因性ＳＯＤ１タンパク質をコードする領域のイントロンに配置され得、第２ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列は別の領域（例として、タンパク質コード配列と導入遺伝子のポリＡテールの第１塩基との間）に配置され得る。

【0041】

いくつかの態様において、単離された核酸は、１以上の発現制御配列（例として、プロモーターなど）をコードする核酸配列をさらに含む。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および、所望の場合、コードされた産物の分泌を増強する配列を包含する。天然の、構成的な、誘導性の、および／または組織特異的のプロモーターを包含する、大多数の発現制御配列は、当該技術分野において知られており、かつ利用されてもよい。
「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成機械、または導入された合成機械によって認識されるＤＮＡ配列を指す。「作動可能に配置された」、「制御下」または「転写制御下」という句は、プロモーターが核酸に対して正しい場所および配向にあり、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御することを意味する。

【0042】

タンパク質をコードする核酸について、ポリアデニル化配列は一般に、導入遺伝子配列の後、かつ３’ＡＡＶＩＴＲ配列の前に挿入される。本開示において有用なｒＡＡＶ構築物はまた、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に望ましく位置付けられるイントロンを含有していてもよい。あり得るイントロン配列の１つはＳＶ－４０に由来し、ＳＶ－４０Ｔイントロン配列と称される。使用されてもよい別のベクター要素は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写産物からの１より多くのポリペプチドを産生するために使用される。ＩＲＥＳ配列は、１より多くのポリペプチド鎖を含有するタンパク質を産生するために使用されるであろう。これらのおよび他の共通のベクター要素の選択は従来のものであり、多くのかかる配列は入手可能である［例として、Sambrookら、および例えばその3.18 3.26頁および16.17 16.27頁に引用された参考文献、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York、1989を参照］。いくつかの態様において、口蹄疫ウイルス２Ａ配列は、ポリタンパク質に包含される；これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示された小ペプチド（およそ１８アミノ酸長）である（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459）。２Ａ配列の切断活性はこれまでに、プラスミドおよび遺伝子治療ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を包含する人工系において実証されていた（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459；de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208；de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.；およびKlump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817）。

【0043】

構成的プロモーターの例は、限定せずに、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーをもつ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーをもつ）［例として、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター（例として、ＣＢＡプロモーター）、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Invitrogen］を包含する。いくつかの態様において、プロモーターは、増強されたニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧプロモーター）である。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｈ１プロモーターまたはＵ６プロモーターである。

【0044】

誘導プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にさせ、外因的に供給される（exogenously supplied）化合物、温度などの環境因子、もしくは特定の生理学的状態の存在、例として急性期、細胞の具体的な分化状態によって、または複製細胞のみにおいて、調節され得る。誘導プロモーターおよび誘導系は、限定せずに、Invitrogen、Clontech、およびAriadを包含する、様々な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系も記載され、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導プロモーターの例は、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（WO 98/10088）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリン抑制系（Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導系（Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995)、またHarvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)も参照）、ＲＵ４８６誘導系（Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)およびWang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)）およびラパマイシン誘導系（Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）を包含する。これに関連して有用であり得る誘導プロモーターの更なる他の型は、特定の生理学的状態、例として温度、急性期、細胞の具体的な分化状態によって、または複製細胞のみにおいて、調節されるものである。

【0045】

別の態様において、ＳＯＤ１（例として、配列番号１６）のための天然のプロモーターが使用されるであろう。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきであることが所望されるとき、天然のプロモーターが好ましいこともある。導入遺伝子の発現が、時間的にもしくは発生的に、または組織特異的な様式で、または特定の転写刺激に応答して、調節されなければならないとき、天然のプロモーターが使用されてもよい。さらなる態様において、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの、他の天然の発現制御要素はまた、天然の発現を模倣するために使用されてもよい。

【0046】

いくつかの態様において、調節配列は、組織特異的な遺伝子発現能を授ける。いくつかのケースにおいて、組織特異的な調節配列は、組織特異的な様式で転写を誘導する組織特異的な転写因子に結合する。かかる組織特異的な調節配列（例として、プロモーター、エンハンサーなど）は、当該技術分野において周知である。例示の組織特異的な調節配列は、これらに限定されないが、以下の組織特異的なプロモーター：肝臓特異的なチオレキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモーター、または心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターを包含する。他の例示のプロモーターは、ベータ－アクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、Arbuthnot et al., Hum.Gene Ther., 7:1503-14 (1996))、骨オステオカルシンプロモーター（Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シアロタンパク質プロモーター（Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、ＣＤ２プロモーター（Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)）；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体α鎖プロモーター、ニューロンの、たとえばニューロン特異的な、エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、およびニューロン特異的なｖｇｆ遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)）を包含し、数ある中でも当業者にとって明らかであろうものも包含する。

【0047】

本開示の態様は、１より多くのプロモーター（例として、２、３、４、または５以上のプロモーター）を含む単離された核酸に関する。例えば、阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）をコードする第１領域および外因性ＳＯＤ１タンパク質をコードする第２領域を含む導入遺伝子を有する構築物の文脈において、阻害性ＲＮＡコード領域の発現を第１プロモーター配列（例として、阻害性核酸コード領域に作動可能に連結された第１プロモーター配列）を使用して駆動すること、および、外因性ＳＯＤ１コード領域の発現を第２プロモーター配列（例として、外因性ＳＯＤ１コード領域に作動可能に連結された第２プロモーター配列）で駆動することが所望され得る。一般に、第１プロモーター配列および第２プロモーター配列は、同じプロモーター配列または異なるプロモーター配列であり得る。いくつかの態様において、第１プロモーター配列（例として、タンパク質コード領域の発現を駆動するプロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列の非限定例は、Ｕ６およびＨ１プロモーター配列を含む。いくつかの態様において、第２プロモーター配列（例として、外因性ＳＯＤ１ＲＮＡの発現を駆動するプロモーター配列）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌＩＩプロモーター配列の非限定例は、ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、ＲＳＶ、およびサイトメガロウイルスプロモーター配列を含む。いくつかの態様において、ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列は、阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）コード領域の発現を駆動する。いくつかの態様において、ｐｏｌＩＩプロモーター配列は、タンパク質コード領域の発現を駆動する。
以下にさらに記載されるように、単離された核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびそのバリアントからなる群から選択されるＡＡＶ血清型の逆位末端配列（ＩＴＲ）を含み得る。

【0048】

マルチシストロン性構築物
本発明のいくつかの側面は、様々な立体配置の２以上の発現カセットを含むマルチシストロン性（例として、２シストロン性）発現構築物を提供する。
異なる態様において、発現カセットが異なる方法で配置されるマルチシストロン性（例として、２シストロン性）発現構築物が提供される。例えば、いくつかの態様において、第１発現カセットが第２発現カセットに隣接して配置されるマルチシストロン性発現構築物が提供される。いくつかの態様において、第１発現カセットがイントロンを含み、第２発現カセットが第１発現カセットのイントロン内に配置されているマルチシストロン性発現構築物が提供される。いくつかの態様において、第１発現カセットのイントロン内に配置された第２発現カセットは、プロモーターおよびプロモーターに作動的に連結された遺伝子産物をコードする核酸配列を含む。

【0049】

異なる態様において、発現カセットが異なる方法で配向されるマルチシストロン性（例として、２シストロン性）発現構築物が提供される。例えば、いくつかの態様において、第１発現カセットが第２発現カセットと同じ配向であるマルチシストロン性発現構築物が提供される。いくつかの態様において、反対の配向の第１および第２発現カセットを含むマルチシストロン性発現構築物が提供される。
発現カセットに関連して本明細書に使用される「配向」という用語は、所与のカセットまたは構造の方向的な特徴を指す。いくつかの態様において、発現カセットは、コード核酸配列の５'プロモーターを内包し、コード核酸配列の転写は、センス鎖の５'末端から３'末端へと進み、これを方向性カセットとする（例として、５'-プロモーター／（イントロン）／コード配列-３'）。この意味で事実上すべての発現カセットは方向性があるため、当業者は、第２核酸構造、例えば第２発現カセット、ウイルスゲノムに関連して、または、カセットがＡＡＶ構造に含まれている場合にはＡＡＶＩＴＲに関連して、所与の発現カセットの配向を容易に決定し得る。

【0050】

例えば、所与の核酸構築物が、立体配置５’-プロモーター１／コード配列１---プロモーター２／コード配列２-３’において２の発現カセットを含む場合、

【化1】

発現カセットは同じ配向であり、矢印はカセットの各々の転写の方向を示す。別の例について、所与の核酸構築物が、立体配置５’-プロモーター１／コード配列１---コード配列２／プロモーター２-３’において２の発現カセットを含むセンス鎖を含む場合、

【化2】

発現カセットは、互いに反対の配向であり、矢印によって示されるように、発現カセットの転写の方向は反対である。この例において、示される鎖は、プロモーター２およびコード配列２のアンチセンス鎖を含む。

【0051】

別の例では、発現カセットがＡＡＶ構築物に含まれる場合、カセットは、ＡＡＶＩＴＲと同じ配向（例として、図５に示される構造など）、または反対の配向のいずれかであり得る。ＡＡＶＩＴＲは方向性がある。例えば、図５に例示される変異５’ＩＴＲは、Ｈ１プロモーター／阻害性ＲＮＡをコードする発現カセットと同じ配向であるが、ＩＴＲおよび発現カセットの両方が同じ核酸鎖上にある場合は、３’ＩＴＲとは反対の配向になるであろう。

【0052】

ｒＡＡＶベクター
本発明の単離された核酸は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ｒＡＡＶベクター）であり得る。いくつかの態様において、本開示によって記載される単離された核酸は、第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）またはそのバリアントを含む領域（例として、第１領域）を含む。単離された核酸（例として、組み換えＡＡＶベクター）は、カプシドタンパク質にパッケージされ、対象に投与され、および／または選択された標的細胞へ送達され得る。「組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、少なくとも、導入遺伝子およびその調節配列、および５'および３'ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）から構成される。導入遺伝子は、本明細書の他の場所で開示されるように、対象の内因性ｍＲＮＡを標的とする核酸を含む１以上の阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）をコードする１以上の領域を含み得る。導入遺伝子はまた、本開示の他の場所で記載されるように、例えば、タンパク質および／または発現制御配列（例として、ポリＡテール）をコードする領域を含み得る。

【0053】

一般に、ＩＴＲ配列は約１４５塩基対（ｂｐ）長である。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする配列全体が分子において使用されるが、これらの配列のある程度の小さな改変は許容される。これらのＩＴＲ配列を改変する能力は、当該技術分野の技術の範囲内である。（例として、Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)などのテキストを参照）。本発明で用いられるかかる分子の例は、選択された導入遺伝子配列および関連する調節要素が５'および３'ＡＡＶＩＴＲ配列に隣接している導入遺伝子を含む「シス作用」プラスミドである。ＡＡＶＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物のＡＡＶ種類を含む、任意の既知のＡＡＶから得ることができる。いくつかの態様において、単離された核酸（例として、ｒＡＡＶベクター）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびそのバリアントから選択される血清型を有する少なくとも１のＩＴＲを含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、ＡＡＶ２ＩＴＲをコードする領域（例として、第１領域）を含む。

【0054】

いくつかの態様において、単離された核酸は、第２ＡＡＶＩＴＲを含む領域（例として、第２領域、第３領域、第４領域など）をさらに含む。いくつかの態様において、第２ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびそのバリアントから選択される血清型を有する。いくつかの態様において、第２ＩＴＲは、機能的な末端分解部位（ＴＲＳ）を欠く変異型ＩＴＲである。「末端分解部位を欠く」という用語は、ＩＴＲの末端分解部位（ＴＲＳ）の機能を無効にする突然変異（例として、非同義突然変異またはミスセンス突然変異などのセンス突然変異）を含むＡＡＶＩＴＲ、または機能的ＴＲＳをコードする核酸配列を欠く短縮型ＡＡＶＩＴＲ（例として、ΔＴＲＳＩＴＲ）を指し得る。いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、機能的なＴＲＳを欠くＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターは、例えば、McCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656に記載されているように、自己相補的なｒＡＡＶベクターを生成する。

【0055】

組み換えＡＡＶベクターについて上記で特定された主要な要素に加えて、ベクターはまた、ベクターでトランスフェクトされた細胞、または本発明により生成されたウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳および／または発現を可能にする様式で導入遺伝子の要素と作動可能に連結される従来の制御要素を含む。本明細書に使用されるとき、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に連続する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；そして、所望されるとき、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。天然、構成的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターを含む多くの発現制御配列は、当該技術分野において知られており、利用することができる。

【0056】

本明細書に使用されるとき、核酸配列（例として、コード配列）および調節配列は、調節配列の影響または制御下で核酸配列の発現または転写を配置するような方法でそれらが共有結合されるとき、作動可能に連結されると言われる。核酸配列を機能性タンパク質に翻訳することが所望される場合、５'調節配列におけるプロモーターの導入がコード配列の転写をもたらし、２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさない、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指示する能力を妨害しない、または（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写産物の能力を妨害しない場合、２つのＤＮＡ配列は作動可能に連結されると言われる。よって、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができ、その結果得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、プロモーター領域は核酸配列に作動可能に連結されるであろう。同様に、２以上のコード領域は、それらが共通のプロモーターからのそれらの転写がインフレームで翻訳された２以上のタンパク質の発現をもたらすような方法で連結されるとき、作動可能に連結される。いくつかの態様において、作動可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質を生じる。

【0057】

組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
いくつかの側面において、本開示は、単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＶに関し本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、人工的に産生されたかまたは得られたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組み換え方法を使用して産生されてもよい。かかるＡＡＶは本明細書中、「組み換えＡＡＶ」と称される。組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、好ましくは、ｒＡＡＶのヌクレアーゼおよび／または導入遺伝子が１以上の所定の組織（単数または複数）へ特異的に送達されるように、組織特異的な標的能を有する。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的な標的能を決定する際の重要な要素である。よって、標的にされる組織に適切なカプシドを有するｒＡＡＶが選択され得る。

【0058】

所望されるカプシドタンパク質を有する組み換えＡＡＶを得るための方法は、当該技術分野において周知である。（例えば、ＵＳ２００３／０１３８７７２を参照、それらの内容は、それら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる）。典型的には、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能性ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）と導入遺伝子とから構成される組み換えＡＡＶベクター；およびＡＡＶカプシドタンパク質中への組み換えＡＡＶベクターパッケージングを許容するのに充分なヘルパー機能、を含有する宿主細胞を培養することを伴う。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によってコードされる構造タンパク質である。ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質であるビリオンタンパク質１～３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と名付けられる）を含むが、それらのすべては、選択的スプライシングを介して単一ｃａｐ遺伝子から転写される。いくつかの態様において、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の分子量は夫々、約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａ、および約６２ｋＤａである。いくつかの態様において、翻訳の際、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムの周りに６０マー（60-mer）の球状タンパク質シェルを形成する。いくつかの態様において、カプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護すること、ゲノムを送達すること、および宿主と相互作用することである。いくつかの側面において、カプシドタンパク質は、組織特異的な様式でウイルスゲノムを宿主へ送達する。

【0059】

いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶＡＡＶ．ＰＨＢ、および上記の任意のバリアントからなる群から選択されるＡＡＶ血清型のものである。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、非ヒト霊長目の動物に由来する血清型、例えばＡＡＶｒｈ１０血清型のものである。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型のものである。

【0060】

ｒＡＡＶベクターをＡＡＶカプシド中にパッケージングするための宿主細胞において培養されるべき構成要素は、トランスで宿主細胞へ提供され得る。代わりに、要求される構成要素（例として、組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のいずれか１以上は、当業者に知られている方法を使用して、要求される構成要素の１以上を含有するよう操作されている安定した宿主細胞によって提供され得る。最も好適には、かかる安定した宿主細胞は、誘導プロモーターの制御下で、要求される構成要素（単数または複数）を含有するであろう。しかしながら、要求される構成要素（単数または複数）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。好適な誘導性および構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に好適な調節要素の考察において、本明細書に提供される。もう１つの他の選択肢において、選択された安定した宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下の選択された構成要素（単数または複数）および１以上の誘導プロモーターの制御下の他の選択された構成要素（単数または複数）を含有してもよい。例えば、２９３細胞（これは構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、しかし誘導プロモーターの制御下でｒｅｐタンパク質および／またはｃａｐタンパク質を含有する安定した宿主細胞が生成され得る。更なる他の安定した宿主細胞が、当業者によって生成され得る。

【0061】

いくつかの態様において、本開示は、内因性ＳＯＤ１を標的とする阻害性核酸をコードする配列および外因性タンパク質（例として、外因性ＳＯＤ１タンパク質、任意に「強化」外因性ＳＯＤ１タンパク質）をコードする配列を含む核酸を含む宿主細胞に関する。いくつかの態様において、本開示は、上に記載の宿主細胞を含む組成物に関する。いくつかの態様において、上の宿主細胞を含む組成物はさらに、凍結保存剤（cryopreservative）を含む。

【0062】

本開示のｒＡＡＶを産生するのに要求される組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、いずれか適切な遺伝学的要素（ベクター）を使用して、パッケージング宿主細胞へ送達され得る。選択される遺伝学的要素は、本明細書に記載の方法を包含する、いずれの好適な方法によっても送達され得る。本開示のいずれの態様を構築するために使用される方法は、核酸操作の技能をもつ者らに知られており、遺伝子工学（genetic engineering）、組み換え操作（recombinant engineering）、および合成技法を包含する。例として、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、好適な方法の選択は、本開示へ限定を課すものではない。例として、K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第５，４７８，７４５号を参照。

【0063】

いくつかの態様において、組み換えＡＡＶは、トリプルトランスフェクション方法（米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載される）を使用して産生され得る。典型的には、組み換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子中へパッケージングされるべき組み換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、および補助機能ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって産生される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、より結果をもたらす（productive）ＡＡＶ複製およびカプシド形成のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能ないずれの野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能性のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）も生成せずに、効率的なＡＡＶベクター産生を後押しする。本開示との使用に好適なベクターの非限定例は、米国特許第６，００１，６５０号に記載のｐＨＬＰ１９、および米国特許第６，１５６，３０３号に記載のｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクター（これらはともにその全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる）を包含する。補助機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する非ＡＡＶ由来ウイルス機能および／または細胞機能（すなわち、「補助機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。補助機能は、ＡＡＶ複製に要求されるそれら機能（those functions）を包含するが、これらは限定せずに、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的なＡＡＶｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシド集合に関与するそれら機能（those moieties）を包含する。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（１型単純ヘルペスウイルス以外の）、およびワクシニアウイルスなどの、知られているヘルパーウイルスのいずれにも由来し得る。

【0064】

いくつかの側面において、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、細胞は、外来性のＤＮＡが細胞膜内部に導入されたとき「トランスフェクトされた」。数多のトランスフェクション技法は一般に、当該技術分野において知られている。例として、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChu et al. (1981) Gene 13:197を参照。かかる技法は、ヌクレオチド組込み型（integration）ベクターおよび他の核酸分子などの１以上の外来性の核酸を好適な宿主細胞中へ導入するために使用され得る。

【0065】

「宿主細胞」は、関心のある物質を内包するかまたはこれを内包することが可能ないずれの細胞をも指す。しばしば宿主細胞は、哺乳動物の細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクター、または組み換えＡＡＶの産生に関連する他のトランスファー（transfer）ＤＮＡのレシピエントとして使用されてもよい。前記用語は、トランスフェクトされた起源細胞（original cell）の子孫（progeny）を包含する。よって、「宿主細胞」は、本明細書に使用されるとき、外来性のＤＮＡ配列がトランスフェクトされた細胞を指すこともある。単一の親細胞の子孫が、自然の、偶然の、または意図的な突然変異に起因して、形態学において、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において、当初の親(original parent)と完全に同一である必要はなくてもよいことは、理解される。
本明細書に使用されるとき、用語「細胞株」は、in vitroでの継続的または持続的な成長および分裂が可能な細胞の集団を指す。しばしば、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。自発的変化または誘導された変化が、かかるクローン集団の保管または移送の間に核型に生じることは、当該技術分野においてさらに知られている。したがって、言及された細胞株に由来する細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同一でなくてもよく、言及された細胞株は、かかるバリアントを包含する。
本明細書に使用されるとき、用語「組み換え細胞」は、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはＲＮＡなどの生物学的に活性な核酸の産生に繋がるＤＮＡセグメントなどの外因性ＤＮＡセグメントが導入された細胞を指す。

【0066】

本明細書に使用されるとき、用語「ベクター」は、適正な制御要素と結び付けられたとき複製することが可能でありかつ細胞間で遺伝子配列を移送し得るいずれの遺伝学的要素、たとえば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどを包含する。よって、前記用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。いくつかの態様において、有用なベクターは、転写されるべき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に配置された（positioned）それらベクターであることが企図される。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するのに要求される細胞の合成機械または導入された合成機械によって認識されるＤＮＡ配列を指す。句「制御下」または「転写制御下」で、「作動可能に（operatively）配置された」は、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御する核酸に関して、プロモーターが正しい場所および配向にあることを意味する。用語「発現ベクターまたは構築物」は、配列をコードする核酸の一部または全部が転写されることが可能である核酸を含有するいずれの型の遺伝学的構築物をも意味する。いくつかの態様において、発現は、核酸、例えば転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または機能性ＲＮＡ（例として、ガイドＲＮＡ）を生成するための核酸の転写を包含する。本開示のｒＡＡＶを産生するために所望されるＡＡＶカプシドに組み換えベクターをパッケージングするための上記の方法は、限定することを意図されておらず、他の好適な方法も当業者には明らかであろう。

【0067】

投与の様式
本開示の単離された核酸およびｒＡＡＶは、当該技術分野において知られている任意の適切な方法に従って、組成物において細胞または対象へ送達され得る。例えば、好ましくは生理学的に適合性のある担体（すなわち、組成物）に懸濁されたｒＡＡＶは、対象、すなわちヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長目の動物（例として、マカク）などの宿主動物に投与され得る。いくつかの態様において、宿主動物はヒトを含まない。

【0068】

哺乳動物対象へのｒＡＡＶの送達は、例えば、筋肉内注射によるか、または哺乳動物対象の血流への投与によるものであり得る。血流への投与は、静脈、動脈、または任意の他の血管導管への注射によるものであり得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、外科分野で周知の技法である分離式肢灌流によって血流に投与され、この方法は、ｒＡＡＶビリオンの投与前に、当業者が体循環から肢を分離することを本質的に可能にする。米国特許第６，１７７，４０３号に記載されている分離式肢灌流技法のバリアントはまた、分離された肢の脈管構造にビリオンを投与して筋細胞または組織への形質導入を潜在的に増強するために当業者によって用いられ得る。さらに、特定の例では、ビリオンを対象のＣＮＳに送達することが望ましい場合がある。「ＣＮＳ」は、脊椎動物の脳および脊髄のすべての細胞および組織を意味する。よって、この用語は、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔、骨、軟骨などを含むが、これらに限定されない。組み換えＡＡＶは、定位注射などの当該技術分野において知られている神経外科技法を使用して、針、カテーテルまたは関連デバイスを用いて、例として、心室領域、ならびに線条体（例として、尾状核または線条体の被殻）、脊髄および神経筋接合部、または小脳小葉への注射により、ＣＮＳまたは脳に直接送達され得る（例えば、Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999；Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000；Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993；およびAlisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000を参照）。いくつかの態様において、本開示に記載されるｒＡＡＶは、静脈内注射によって投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、脳内注射によって投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、髄腔内注射によって投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、線条体内注射によって投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは頭蓋内注射によって送達される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは大槽注射によって送達される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、脳側脳室注射によって送達される。

【0069】

本開示の側面は、カプシドタンパク質および導入遺伝子をコードする核酸を含む組み換えＡＡＶを含む組成物に関し、ここで、導入遺伝子は、１以上のｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、各ｍｉＲＮＡは、配列番号３および／または４に記載の配列（ｍｉＲ－ＳＯＤ－１２７）を含むか、またはそれによってコードされる。いくつかの態様において、各ｍｉＲＮＡは、配列番号５および／または６に記載の配列を含むか、またはそれによってコードされる。いくつかの態様において、核酸は、ＡＡＶＩＴＲをさらに含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、配列番号８～１５のいずれか１に記載の配列（ＡＡＶベクター配列）によって表されるｒＡＡＶベクター、またはその一部を含む。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
いくつかの態様において、本開示の組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１以上の他のウイルス（例として、１以上の異なる導入遺伝子を有するコードする第２ｒＡＡＶ）と組み合わせて、含んでいてもよい。いくつかの態様において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なるｒＡＡＶ（各々が、１以上の異なる導入遺伝子を有する）を含む。

【0070】

好適な担体は、ｒＡＡＶが向けられる適応症を考慮し当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、様々な緩衝溶液（例として、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化されてもよい生理食塩水を包含する。他の例示の担体は、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油、および水を包含する。担体の選択は、本開示の限定ではない。
任意に、本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（単数または複数）に加えて、防腐剤または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含有していてもよい。好適な例示の防腐剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールを包含する。好適な化学安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを包含する。

【0071】

ｒＡＡＶは、過度の悪影響なしに、所望される組織の細胞にトランスフェクトし、遺伝子のトランスファーおよび発現の充分なレベルを提供するのに充分な量で投与される。従来のおよび薬学的に許容し得る投与ルートは、これらに限定されないが、選択された器官への直接送達（例として、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（経鼻および気管内送達を包含する）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、および他の非経口投与ルートを包含する。投与ルートは、所望されるなら、組み合わされてもよい。
具体的な「治療的効果」を達成するのに要求されるｒＡＡＶビリオンの用量、例として、ゲノムコピー／キログラム体重あたり（ＧＣ／ｋｇ）での用量の単位は、以下を包含するがこれらに限定されない複数の因子に基づき変動するであろう：ｒＡＡＶビリオンの投与ルート、治療的効果を達成するのに要求される遺伝子またはＲＮＡの発現レベル、処置される特定の疾患または障害、および遺伝子またはＲＮＡの産物安定性。当業者は、具体的な疾患または障害を有する患者を処置するためのｒＡＡＶビリオン用量範囲を、前述の因子ならびに当該技術分野において周知である他の因子に基づき容易に決定し得る。

【0072】

ｒＡＡＶの有効量は、動物を標的感染させ、所望の組織を標的にするのに充分な量である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの有効量は、安定した体細胞遺伝子導入動物モデルを産生するのに充分な量である。有効量は、対象の種、年齢（age）、重量、健康状態、および標的にされるべき組織などの因子に主に依存し、よって動物および組織の間で変動し得る。例えば、ｒＡＡＶの有効量は、一般に、約１０^９～１０^１６ゲノムコピーを含有する溶液の約１ｍｌから約１００ｍｌまでの範囲にある。いくつかのケースにおいて、約１０^１１～１０^１３ｒＡＡＶゲノムコピーの間の投薬量が適切である。ある態様において、１０^１２または１０^１３ｒＡＡＶゲノムコピーが、ＣＮＳ組織を標的にするのに有効である。いくつかのケースにおいて、安定したトランスジェニック動物は、ｒＡＡＶの複数回用量によって産生される。

【0073】

いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、暦日（例えば、２４時間）に１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、暦週（例えば、７暦日）に１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、隔週（例えば、暦２週間に１回）以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、暦月あたり１回以下（例えば、３０暦日に１回）対象に投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、６暦月に１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、暦年に１回以下（例えば、３６５日または閏年で３６６日）対象に投与される。

【0074】

いくつかの態様において、ｒＡＡＶ組成物は、その組成物において、具体的にはｒＡＡＶが高濃度（例として、～１０^１３ＧＣ／ｍｌ以上）で存在する組成物において、ＡＡＶ粒子の凝集を低減させるように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を低減させるための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整などを包含し得る。（例として、Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。）
薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の製剤化は、様々な処置レジメンにおいて本明細書に記載の具体的な組成物を使用するための好適な投薬および処置レジメンの開発がそうであるように、当業者に周知である。

【0075】

典型的には、これらの製剤は、活性化合物の少なくとも約０．１％以上を含有してもよいが、活性成分（単数または複数）のパーセンテージはもちろん変動してもよく、便宜的に、総製剤の重量または体積の約１または２％と約７０％または８０％以上との間であってもよい。当然のことながら、治療的に有用な各組成物中の活性化合物の量は、好適な投薬量が化合物のいかなる単位用量でも得られるように、調製されてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、製品有効期間、ならびに他の薬理学的な検討事項などの因子が、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。これを踏まえて、様々な投薬量および処置レジメンが所望され得る。
特定の状況では、ｒＡＡＶベースの治療用構築物を、本明細書に開示される好適に製剤された医薬組成物として、皮下、膵内、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、または経口、腹腔内、または吸入により送達することが望ましいであろう。いくつかの態様において、米国特許第５，５４３，１５８号；第５，６４１，５１５号および第５，３９９，３６３号（各々、具体的に全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような投与様式を使用して、ｒＡＡＶを送達し得る。いくつかの態様において、好ましい投与の様式は門脈注射によるものである。

【0076】

注射可能な使用に好適な医薬形態は、滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製のための、滅菌された水性溶液または分散液および滅菌された粉末を包含する。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中でも、ならびに油中でも、調製されてもよい。保管および使用の通常の条件下、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。多くのケースにおいて、その形態は滅菌されており、注射針が楽に通過する程度に（to the extent that easy syringability exists）流動性がある。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散媒のケースにおいては要求される粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持されてもよい。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くのケースにおいて、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期的な吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノアステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの、組成物における使用によってもたらされ得る。

【0077】

注射可能な水性溶液の投与のために、例えば、溶液は、必要ならば、好適に緩衝化されてもよく、液体の希釈剤は、充分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張にされる。これらの具体的な水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の投与にとくに好適である。これに関連して、用いられ得る滅菌水性媒体は当業者に知られているであろう。例えば、１投薬量が、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解されて、１０００ｍｌの皮下注入用流体へ加えられるかまたは提案の注入部位にて注射されるかのいずれかであってもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035～1038および1570～1580頁を参照）。投薬量のいくつかのバリエーションは、宿主の状態に応じて、必然的に生じるであろう。投与に対して責任を持つ者は、いずれにしても、個々の宿主にとって適切な用量を決定するであろう。

【0078】

滅菌された注射可能な溶液は、要求される量の活性ｒＡＡＶを、本明細書に列挙された様々な他の成分とともに（そう要求されるとき）、適切な溶媒に組み込むこと、その後に濾過滅菌が続くことによって調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒および上に列挙されたものからの要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクル中へ、様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末のケースにおいて、好ましい調製の方法は、真空乾燥技法および凍結乾燥技法であるが、これらは、先に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分の粉末を、いずれか所望の追加成分を加えて産み出す。

【0079】

本明細書に開示のｒＡＡＶ組成物はまた、中性または塩の形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成された）、ならびに、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成された酸付加塩を包含する。遊離カルボキシル基とともに形成された塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基にも由来し得る。製剤化されると、溶液は、投薬製剤に適合性のある様式で、かつ治療的に有効であるような量で、投与されるであろう。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形（dosage forms）で楽に投与される。

【0080】

本明細書に使用されるとき、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および剤の使用は、当該技術分野において周知である。補助的な活性成分もまた、組成物中へ組み込まれ得る。句「薬学的に許容し得る」は、宿主へ投与されたとき、アレルギーまたは同様の有害反応を生み出さない分子実体（molecular entities）および組成物を指す。
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどの送達ビヒクルは、好適な宿主細胞中への本開示の組成物の導入のために使用されてもよい。とりわけ、ｒＡＡＶベクターによって送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、もしくはナノ粒子、または同種のもののいずれかにカプセル化されて送達されるために製剤化されてもよい。

【0081】

かかる製剤は、本明細書に開示の核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容し得る製剤の導入のために、好ましいこともある。リポソームの形成および使用は一般に、当業者に知られている。近年、改善された血清安定性および循環半減時間をもつリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号；第５，５５２，１５７号；第５，５６５，２１３号；第５，７３８，８６８号および第５，７９５，５８７号）。
リポソームは、通常、他の手順によるトランスフェクションに耐性がある数々の細胞型とともに、首尾よく使用されている。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長に制約がない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを様々な培養細胞株および動物中へ導入するのに効果的に使用されている。加えて、リポソーム媒介薬物送達の有効性を検査する数件の成功した臨床試験が完了している。

【0082】

リポソームは、水性媒体に分散されたリン脂質から形成され、自然に多重膜同心二層ベシクル（また多重膜ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍから４μｍまでの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水性溶液を含有する、２００～５００オングストロームの範囲の直径をもつ小さな一枚膜ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
代わりに、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤が使用されてもよい。ナノカプセルは一般に、物質を安定かつ再現性のあるように封入し得る。細胞内ポリマー過負荷（intracellular polymeric overloading）に起因する副作用を避けるために、かかる超微細粒子（ほぼ０．１μｍのサイズである）が、in vivoで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリラートナノ粒子が、使用を企図される。

【0083】

上記の送達方法に加えて、以下の技法もまた、ｒＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替の方法として企図される。ソノフォレーシス（すなわち、超音波）は、循環系内および循環系を通じて薬物浸透の速度および有効性を高めるためのデバイスとして米国特許第５，６５６，０１６号に使用され、記載されている。企図される他の薬物送達の選択肢は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼科用製剤（Bourlais et al., 1998）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号および第５，７８３，２０８号）およびフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。

【0084】

使用の方法
本明細書では、ＦＴＤおよび／またはＡＬＳに関連するＳＯＤ１などの遺伝子の発現を阻害するための方法が提供される。いくつかの態様において、本開示によって記載される方法は、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤを有するか、または有すると疑われる対象を処置するために有用である。本明細書に使用されるとき、「処置する」または「処置すること」は、（ａ）神経変性疾患（例として、ＡＬＳ／ＦＴＤなど）の発症を予防または遅延させること；（ｂ）ＡＬＳ／ＦＴＤの重症度を軽減すること；（ｃ）ＡＬＳ／ＦＴＤに特徴的な症状の発症を軽減または予防すること；および／または（ｄ）ＡＬＳ／ＦＴＤに特徴的な症状の悪化を予防することを指す。

【0085】

いくつかの態様において、対象（例として、対象の中枢神経系（ＣＮＳ））における内因性ＳＯＤ１タンパク質発現を阻害するための方法が提供される。いくつかの態様において、前記方法は、内因性ＳＯＤ１ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸および阻害性核酸に耐性がある外因性ＳＯＤ１ｍＲＮＡ転写産物を発現するように操作された単離された核酸またはｒＡＡＶを対象へ投与する（例として、対象のＣＮＳへ投与する）ことを含む。いくつかの態様において、対象は、ＦＴＤまたはＡＬＳを有するか、または有すると疑われる（例として、例えば診断ＤＮＡ検査によって、機能の有毒な獲得をもたらす１以上の突然変異を有するＳＯＤ１遺伝子を有すると同定された、および／またはＡＬＳの１以上の兆候または症状を示す）。いくつかの態様において、前記方法は、対象の細胞において内因性ＳＯＤ１ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸を発現するように操作された核酸を内包する有効量の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号３（ＧＡＣＧＴＡＣＣＴＡＡＧＧＴＡＣＡＡＧＴＡ）および／または４に記載の配列を含むか、またはそれによってコードされる（ｍｉＲ－ＳＯＤ－１２７）。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号５および／または６に記載の配列を含むか、またはそれによってコードされる。

【0086】

いくつかの態様において、細胞におけるＳＯＤ１発現を阻害するための方法が提供される。いくつかの態様において、前記方法は、本開示により記載される単離された核酸またはｒＡＡＶを細胞へ送達することを含み、ここで、阻害性ＲＮＡは、配列番号３（ＧＡＣＧＴＡＣＣＴＡＡＧＧＴＡＣＡＡＧＴＡ）および／または４（ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ）に記載の配列またはその配列の相補的な配列の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれによってコードされるｍｉＲＮＡである。

【0087】

上記に従って、本明細書で提供される特定の方法は、本明細書で開示される組み換え核酸のいずれかを内包する有効量の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含む。一般に、ｒＡＡＶの「有効量」は、所望の生物学的応答を誘発するのに充分な量を指す。いくつかの態様において、有効量は、ex vivoで細胞または組織を形質導入するのに有効なｒＡＡＶの量を指す。他の態様において、有効量は、対象へのｒＡＡＶの直接投与に有効な量を指す。当業者によって理解されるように、本発明の組み換えＡＡＶの有効量は、所望の生物学的エンドポイント、発現産物の薬物動態、処置される状態、投与様式、および対象などの因子に依存して変わる。典型的には、ｒＡＡＶは、本開示の他の場所に記載されているように、薬学的に許容し得る担体と共に投与される。

【0088】

いくつかの例では、ｒＡＡＶの投与後、ＦＴＤまたはＡＬＳに関連する少なくとも１の臨床成績パラメーターまたはバイオマーカー（例として、核内Ｇ_４Ｃ_２ＲＮＡ病巣、ＲＡＮタンパク質発現など）が対象で評価される。典型的には、ｒＡＡＶの投与後に評価された臨床成績パラメーターまたはバイオマーカーは、ｒＡＡＶの有効性を決定するために、ｒＡＡＶの投与前の時点で決定された臨床成績パラメーターまたはバイオマーカーと比較される。多くの場合、ｒＡＡＶ投与後の臨床成績パラメーターまたはバイオマーカーの改善は、ｒＡＡＶの有効性を示す。任意の適切な臨床成績パラメーターまたはバイオマーカーが使用され得る。典型的には、臨床成績パラメーターまたはバイオマーカーは、ＦＴＤまたはＡＬＳの１以上の兆候を示す。例えば、いくつかの態様において、臨床成績パラメーターまたはバイオマーカーは、内因性ＳＯＤ１発現、記憶喪失、または、不安定性、硬直、遅滞、痙攣、筋力低下または嚥下困難性、発語および言語困難性、筋肉の痙攣（束縛）およびこむら返り（手足のものを含む）などの運動障害の有無であり得る。

【0089】

キットおよび関連する組成物
本明細書に記載の組み換え核酸、組成物、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶなどは、いくつかの態様において、治療、診断または研究用途でのそれらの使用を容易にするために医薬または診断または研究キットに組み立てられ得る。キットは、本発明の構成要素を収容する１以上の容器および使用説明書を含み得る。具体的には、かかるキットは、本明細書に記載される１以上の薬剤、ならびに意図される用途およびこれらの薬剤の適切な使用を説明する説明書を含み得る。ある態様において、キット中の薬剤は、特定の用途および薬剤の投与方法に好適な医薬製剤および投薬量であり得る。研究目的のキットは、様々な実験を実行するための適切な濃度または量の構成要素を含み得る。

【0090】

キットは、研究者による本明細書に記載の方法の使用を容易にするように設計され得、多くの形態をとり得る。キットの各組成物は、適用可能な場合、液体の形態（例として、溶液）または固体の形態（例として、乾燥粉末）で提供され得る。あるケースにおいて、組成物のいくつかは、例えば、好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加により、構成可能またはそうでなければ（例として、活性形態に）加工可能であり得、これはキットとともに提供され得るか、またはキットとともに提供され得ない。本明細書に使用されるとき、「説明書」は、説明および／または宣伝の構成要素を定義し得、典型的には、本発明のパッケージング上またはそれに関連する書面による説明を含む。説明書はまた、説明書がキットに関連付けられるべきであることをユーザーが明確に認識するような任意の様式で、例えば、オーディオビジュアル（例として、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはウェブベースのコミュニケーションなどで提供される任意の口頭または電子的説明を含み得る。書面による説明書は、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式であり得、その指示は、動物投与の製造、使用、または販売の機関による承認を反映することもできる。

【0091】

キットは、１以上の容器に、本明細書に記載の任意の１以上の構成要素を含み得る。一例として、一態様において、キットは、キットの１以上の構成要素を混合するための、および／または試料を単離および混合し、対象に適用するための説明書を含み得る。キットは、本明細書に記載の薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態であり得る。薬剤は、無菌で調製され、シリンジに包装され、冷蔵輸送されてもよい。代わりに、保管のためにバイアルまたは他の容器に収容されてもよい。第２容器は、無菌で調製された他の薬剤を有し得る。代わりに、キットは、事前に混合され、シリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器中で輸送される活性剤を含み得る。キットは、シリンジ、局所適用デバイス、またはＩＶ針チューブおよびバッグなどの、対象に薬剤を投与するために必要とされる１以上またはすべての構成要素を有し得る。
本発明の例示的な態様は、以下の例によってより詳細に記載されるであろう。これらの態様は、本発明の例示であり、当業者は、例示の態様に限定されないことを認識するであろう。

【0092】

例
例1
この例は、（１）内因性サイトゾルＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）活性の発現を抑制する合成マイクロＲＮＡを発現するように操作された第１構築物の送達を、（２）前記合成マイクロＲＮＡに耐性がある野生型ＳＯＤ１を発現するように操作された第２構築物と連結する二重発現遺伝子治療ベクターを記載する。

【0093】

ＡＡＶｒｈ１０-抗ＳＯＤ１-ｍｉＲＮＡを介したＳＯＤ１サイレンシングを、合成マイクロＲＮＡに耐性があるＷＴＳＯＤ１の発現と連結することの根拠は、２つの因子に基づく。第１に、ＳＯＤ１タンパク質の不均化活性は神経保護特性を有する。第２に、ＳＯＤ１が抑制されているＡＬＳ症例の組織（具体的に言うと、運動ニューロン）は、野生型（ＷＴ）および変異型ＳＯＤ１の両方を発現しているため、正常ではない。実に、ＳＯＤ１サイレンシング研究が発症後に開始されたとき、運動ニューロン（およびいくつかの非神経細胞）は明らかに病的であることがすでに観察されている。この状況では、ＷＴＳＯＤ１分子によって付与されるＳＯＤ１不均化活性を（およびいくつかの変異型ＳＯＤ１タンパク質から生じ得る不均化活性をも）排除することは、その活性によって付与される潜在的な神経保護作用を排除することでもある。したがって、細胞に対する正味の効果は、２つの相反する因子のバランスを反映する：（ａ）変異型タンパク質およびその神経毒性のサイレンシング対（ｂ）ＳＯＤ１不均化活性の神経保護作用の排除。病気の運動ニューロンでは、変異型タンパク質のレベルが同時に低下しているにもかかわらず、正味の効果は標的細胞の生存率をさらに損ない得ると考えられる。この所見と一致して、固有のＳＯＤ１活性のないマウスは正常な発達中に劇症のＡＬＳを発症しないが、それらの運動ニューロンは重なった損傷に高度に敏感であることに留意されたい。これらのＳＯＤ１陰性マウスの顔面神経傷害は、ＷＴマウスよりもはるかに広範囲の顔面神経の喪失をもたらす。その上、晩年には、これらのＳＯＤ１陰性マウスは、ゆっくり進行する遅発性運動神経障害を発症することが観察されている。

【0094】

本開示により記載される二重発現遺伝子構築物は、ＳＯＤ１不均化からの神経保護活性の喪失の課題に取り組む。本開示の構築物における遺伝子発現カセットの配置は、ＷＴおよび変異型の内因性ＳＯＤ１アレルの両方の完全なサイレンシングを伴う場合でさえ、正常なレベルのＳＯＤ１不均化活性（例として、ＷＴＳＯＤ１の発現）を可能にする。よって、本明細書に記載の構築物の正味の効果は、変異型ＳＯＤ１タンパク質（ただし、ＷＴＳＯＤ１タンパク質ではない）のレベルの低下であり、これはＳＯＤ１媒介ＡＬＳに有益である。

【0095】

本開示の二重発現構築物は、以下のように構築される：ＳＯＤ１を標的とする人工ｍｉＲＮＡおよび人工ｍｉＲＮＡに対して耐性にするサイレント塩基対改変を有するＳＯＤ１ｃＤＮＡの両方を発現するＡＡＶ構築物が作製される。この構築物は、変異型ＳＯＤ１のサイレンシングおよび単一のＡＡＶベクターからの野生型ＳＯＤ１の増強した発現を同時に可能にする。いくつかの態様において、構築物は、図１に示されるように２シストロン性であり、ここで、構築物は２つのプロモーターを有し、例えば、抗ＳＯＤ１発現はＨ１プロモーターによって駆動され、ＳＯＤ１ｃＤＮＡ発現はＣＢＡプロモーターによって駆動される。抗ＳＯＤ１-ｍｉＲ発現は、Ｕ６プロモーターなどの別のＰｏｌＩＩＩプロモーター、または特定の細胞または器官の種類へのｍｉＲＮＡの発現を制限するＰｏｌＩＩプロモーターによって駆動することもできる。構築物の第２部分は、典型的には、ｍｉＲＮＡ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡを発現するＰｏｌＩＩプロモーター（例として、図１のＣＢＡ）を有する。この第２プロモーターは、内因性ＳＯＤ１プロモーター、またはＳＯＤ１ｃＤＮＡの特定の細胞集団への制限された発現が望まれる場合は、シナプシンプロモーターなどの別のプロモーターでもあり得る。

【0096】

いくつかの態様において、二重機能ベクターは、図２に示されるように、人工ｍｉＲおよびｍｉＲ耐性ｃＤＮＡの両方を発現する単一のｐｏｌＩＩプロモーター（例として、ＣＢＡ）である。この態様において、抗ＳＯＤ１-ｍｉＲは、ＳＯＤ１ｃＤＮＡ発現カセット内のイントロンから、または代わりに、ｍＩＲ耐性ＳＯＤ１ｃＤＮＡ発現カセットの３’ＵＴＲ（または５’ＵＴＲ）の一部として発現され得る。二重機能ベクター構築物の追加の非限定例は、図３～８に示され、配列番号８～１５に記載されている。図９は、野生型ＳＯＤ１コード配列（配列番号１）の「強化」ＳＯＤ１コード配列（配列番号７）の例との核酸配列アラインメントを示す。

【0097】

配列
＞ヒトＳＯＤ１コード配列（ＮＣＢＩ参照ＮＭ＿０００４５４．４）（配列番号１）

【化3】