特許 7398007 ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-05

(45)【発行日】2023-12-13

(54)【発明の名称】ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20231206BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20231206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/712

A61K31/7125

A61K31/713

A61P1/16

A61P3/04

A61P3/06

A61P3/10

A61P9/00

A61P9/10 101

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2022556016

(86)(22)【出願日】2021-03-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-01

(86)【国際出願番号】 US2021022967

(87)【国際公開番号】W WO2021188795

(87)【国際公開日】2021-09-23

【審査請求日】2023-09-07

(31)【優先権主張番号】62/991,335

(32)【優先日】2020-03-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】521359667

【氏名又は名称】ディセルナ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100218578

【弁理士】

【氏名又は名称】河井 愛美

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン ボブ ディー

(72)【発明者】

【氏名】デュデック ヘンリク ティー

(72)【発明者】

【氏名】サクセナ ユトサフ

(72)【発明者】

【氏名】エイブラムス マーク

(72)【発明者】

【氏名】トゥラノフ アントン

【審査官】井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１２／１７７７８４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１５／１６８５８９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１９／０５５６３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１５４３８７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ａ６１Ｐ ３／０４

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ ３／１０

Ａ６１Ｐ １／１６

Ａ６１Ｐ ３／０６

Ａ６１Ｋ ３１／７１２

Ａ６１Ｋ ３１／７１２５

Ａ６１Ｋ ３１／７１３

Ａ６１Ｐ ９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

センス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドであって、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、
前記センス鎖が、
5’ [mUs][mC][mA][mA][mA][mA][mU][fG][fG][fA][fA][mG][mG][mU][mU][mA][mU][mA][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]（配列番号２３０）
であり、
前記アンチセンス鎖が、
5’ [Meホスホネート-4O-mUs][fGs][fUs][fA][fU][mA][fA][mC][mC][fU][mU][mC][mC][fA][mU][mU][mU][mU][mG][mAs][mGs][mG]（配列番号２３１）
であり、
mUsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－ＯＭｅ修飾ウリジンを表し、
mCは、２’－ＯＭｅ修飾シトシンを表し、
mAは、２’－ＯＭｅ修飾アデノシンを表し、
mUは、２’－ＯＭｅ修飾ウリジンを表し、
fGは、２’－Ｆ修飾グアノシンを表し、
fAは、２’－Ｆ修飾アデノシンを表し、
mGは、２’－ＯＭｅ修飾グアノシンを表し、
ademA-GalNAcは、２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃを表し、
Meホスホネート-4O-mUsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する５’－ホスホネート－４’－オキシ－２’－ＯＭｅウリジンを表し、
fGsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－Ｆ修飾グアノシンを表し、
fUsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－Ｆ修飾ウリジンを表し、
fUは、２’－Ｆ修飾ウリジンを表し、
mAsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－ＯＭｅ修飾アデノシンを表し、
mGsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－ＯＭｅ修飾グアノシンを表す、
オリゴヌクレオチド。

【請求項2】

オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記オリゴヌクレオチドがセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、
前記センス鎖が、
5’ [mUs][mC][mA][mA][mA][mA][mU][fG][fG][fA][fA][mG][mG][mU][mU][mA][mU][mA][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]（配列番号２３０）
であり、
前記アンチセンス鎖が、
5’ [Meホスホネート-4O-mUs][fGs][fUs][fA][fU][mA][fA][mC][mC][fU][mU][mC][mC][fA][mU][mU][mU][mU][mG][mAs][mGs][mG]（配列番号２３１）
であり、
mUsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－ＯＭｅ修飾ウリジンを表し、
mCは、２’－ＯＭｅ修飾シトシンを表し、
mAは、２’－ＯＭｅ修飾アデノシンを表し、
mUは、２’－ＯＭｅ修飾ウリジンを表し、
fGは、２’－Ｆ修飾グアノシンを表し、
fAは、２’－Ｆ修飾アデノシンを表し、
mGは、２’－ＯＭｅ修飾グアノシンを表し、
ademA-GalNAcは、２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃを表し、
Meホスホネート-4O-mUsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する５’－ホスホネート－４’－オキシ－２’－ＯＭｅウリジンを表し、
fGsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－Ｆ修飾グアノシンを表し、
fUsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－Ｆ修飾ウリジンを表し、
fUは、２’－Ｆ修飾ウリジンを表し、
mAsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－ＯＭｅ修飾アデノシンを表し、
mGsは、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－ＯＭｅ修飾グアノシンを表す、
医薬組成物。

【請求項3】

静脈内投与に適した担体を更に含む、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記担体が水を含む、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記担体がリン酸緩衝生理食塩水を含む、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項6】

細胞、細胞集団、または対象においてＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させることにおける使用のための、請求項２～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させることは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量またはレベル、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量またはレベル、もしくはその両方を低減させることを含む、請求項６に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項8】

対象においてトリグリセリド（ＴＧ）の量またはレベルを低減させることにおける使用のための、請求項２～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

対象においてコレステロールの量またはレベルを低減させることにおける使用のための、請求項２～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記対象がＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する、請求項６～９のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項11】

ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療することにおける使用のための、請求項２～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

ＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する前記疾患、障害、または状態は、高トリグリセリド血症、肥満、高脂血症、脂質異常及び／またはコレステロール代謝障害、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、冠動脈疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、ホモ接合体及びヘテロ接合体の家族性高コレステロール血症、及びスタチン耐性高コレステロール血症からなる群より選択される、請求項１０又は１１に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項13】

ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する前記疾患、障害、または状態は、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病、高トリグリセリド血症、ＮＡＳＨ、肥満、またはそれらの組み合わせである、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項14】

第２の組成物または治療剤と組み合わせて投与される、請求項６～１３のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下、２０２０年３月１８日出願の米国特許仮出願第６２／９９１，３３５号の利益を主張するものであり、当該出願の全内容は、参照により本明細書に援用する。

【0002】

本開示は、アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害するオリゴヌクレオチド及びその使用、特にＡＮＧＰＴＬ３の発現に伴う疾患、障害及び／または状態の治療に関連する使用に関する。

【0003】

配列表の参照
本開示は、配列表と共に電子形式で出願される。配列表は、ファイル名が「４００９３０＿１８２３５９＿ＳＬ．ｔｘｔ」であり、作成日は２０２１年３月１８日、サイズは３７１キロバイトであるファイルとして提供される。この電子形式の配列表の情報を、本明細書に参照によりその全内容にわたって援用する。

【背景技術】

【0004】

脂質代謝障害は、トリグリセリド及び／またはコレステロールなどの血清脂質レベルの上昇をもたらす可能性がある。血清脂質の上昇は、高血圧、心血管疾患、糖尿病、及び他の病理学的状態と強く関連付けられている。治療の進歩にも関わらず、心血管疾患及び代謝性疾患を治療するための治療法に対する非常に高いかつ満たされていない医学的ニーズが依然として存在している。

【0005】

高トリグリセリド血症は、血液中のトリグリセリド濃度が異常に上昇することを特徴とする脂質代謝障害である（例えば、＞１５０ｍｇ／ｄＬ）。高トリグリセリド血症は、心血管疾患（例えば、動脈硬化症）の発症と関連している。重度の高トリグリセリド血症（例えば、＞５００ｍｇ／ｄＬ）は、膵炎、発疹性黄色腫、または網膜脂血症を引き起こし得る。場合によっては、非常に高レベルのカイロミクロンがカイロミクロン血症症候群を引き起こす可能性があり、この症候群は、繰り返す腹痛、吐き気、嘔吐、及び膵炎を特徴とする（Ｐｅｊｉｃ＆Ｌｅｅ（２００６）Ｊ． Ａｍ． Ｂｏａｒｄ． Ｆａｍ． Ｍｅｄ．１９：３１０－３１６）。高脂血症は、血液中のいずれか１つまたは全ての脂質及び／またはリポタンパク質のレベル上昇を特徴とする別の脂質代謝障害である。

【0006】

ＡＮＧＰＴＬ３は、脂質代謝を調節し、主に肝臓で発現される分泌タンパク質のアンジオポエチン様ファミリーのメンバーである（Ｋｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．３０：１５１－１５７）。ＡＮＧＰＴＬ３は、トリグリセリドの加水分解を触媒するリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）を阻害し、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）リン脂質を加水分解する内皮リパーゼ（ＥＬ）を阻害する。

【発明の概要】

【0007】

本開示の態様は、疾患、障害、及び／またはＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する状態を治療するための組成物及び方法に関する。本開示は、部分的に、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を選択的に阻害及び／または低減させるオリゴヌクレオチドの発見及び開発に基づいている。

【0008】

いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、及び１１６のいずれか１つに記載される配列を含むアンチセンス鎖を含む、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるためのオリゴヌクレオチドを提供する。

【0009】

いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載される配列を含むセンス鎖を含む、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるためのオリゴヌクレオチドを提供する。

【0010】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、長さが１５個～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖及び長さが１５個～４０個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、当該アンチセンス鎖は、配列番号１２５、１２６、１２７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、及び１１７のいずれか１つに記載される、ＡＮＧＰＴＬ３の標的配列に対する相補的な領域を有し、当該相補的な領域は、長さが少なくとも１５個の連続ヌクレオチドである。

【0011】

いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、長さが１９個～２７個のヌクレオチドまたは長さが２１個～２７個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、長さが２２個のヌクレオチドである。

【0012】

いくつかの実施形態において、センス鎖は、長さが１９個～４０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖は、長さが３６個のヌクレオチドである。

【0013】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１９個のヌクレオチドまたは少なくとも２１個のヌクレオチドの二重鎖領域を有する。いくつかの実施形態において、二重鎖領域は、長さが２０個のヌクレオチドである。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３に対する相補的な領域は、長さが少なくとも１９個の連続ヌクレオチド、または長さが少なくとも２１個の連続ヌクレオチドである。

【0015】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’末端に、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含み、Ｓ１は、Ｓ２と相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３個～５個のヌクレオチドのループを形成する。

【0016】

いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、長さが２１個～２７個のヌクレオチドであり、かつＡＮＧＰＴＬ３に対する相補的な領域を有し、センス鎖は、その３’末端に、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含み、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２中のＳ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３個～５個のヌクレオチドのループを形成し、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、長さが少なくとも１９個のヌクレオチドの二重鎖構造を形成するが、それらは共有結合で連結されていない。

【0017】

いくつかの実施形態において、当該ループＬは、テトラループである。いくつかの実施形態において、Ｌは、長さが４個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｌは、ＧＡＡＡ配列を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、長さが２７個のヌクレオチドのアンチセンス鎖及び長さが２５個のヌクレオチドのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが２２個のヌクレオチドのアンチセンス鎖及び長さが３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、二重鎖領域を有するオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖に、３’オーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’オーバーハング配列は、長さが２個のヌクレオチドである。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＡＮＧＴＰＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、各々長さが２１個～２３個のヌクレオチドの範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１９個～２１個のヌクレオチドの範囲である二重鎖構造を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１個以上のヌクレオチドの３’オーバーハング配列を含み、３’オーバーハング配列は、アンチセンス鎖、センス鎖、またはアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。いくつかの実施形態では、長さが２個のヌクレオチドの３’オーバーハング配列であって、３’オーバーハング配列は、アンチセンス鎖に存在し、センス鎖は、長さが２１個のヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、長さが２３個のヌクレオチドであり、センス鎖及びアンチセンス鎖は、長さが２１個のヌクレオチドの二重鎖を形成する。

【0021】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＴＰＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは２’修飾を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが、例えば、２’修飾で修飾される。

【0022】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含み、好ましくは、ホスホロチオエート結合を含む。

【0023】

いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの糖の４’炭素は、リン酸アナログを含み、例えば、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートを含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチドまたは脂質などの１つ以上の標的指向性リガンドに結合される。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮａｃ部分は、一価のＧａｌＮＡｃ部分、二価のＧａｌＮＡｃ部分、三価のＧａｌＮＡｃ部分、または四価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。

【0025】

いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、ステムループのＬの１個以上のヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、ステムループのＬの最大４個のヌクレオチドが、それぞれ一価のＧａｌＮＡｃ部分に結合される。

【0026】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。

【0027】

他の態様において、本開示は、本明細書中のオリゴヌクレオチドを投与することによって、細胞、細胞集団、または対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞、細胞集団、または対象におけるＡＮＧＰＴＬ３発現を低減させる方法は、本明細書に記載の有効量のオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を細胞または細胞集団に接触させるか、または対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３発現を減少させる方法は、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量またはレベル、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量またはレベル、もしくはその両方を減少させることを含む。

【0028】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書の有効量のオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を対象に投与することによって、対象のトリグリセリド（ＴＧ）の量またはレベルを低減させる方法を提供する。

【0029】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書の有効量のオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を対象に投与することによって、対象のコレステロールの量またはレベルを低減させる方法を提供する。

【0030】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドで治療する対象は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法は、本明細書のオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を治療有効量でそれを必要とする対象に投与することで、対象を治療することを含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、投与のための本明細書のオリゴヌクレオチドは、長さが１５個～５０個のヌクレオチドのセンス鎖、及び長さが１５個～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載される配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、及び１１６から選択される相補的配列、またはその医薬組成物を含むことで、対象を治療することを含む。

【0032】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法は、表５に示される表の行から選択される一対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を治療有効量でそれを必要とする対象に投与することで、対象を治療することを含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する疾患、障害、または状態は、高トリグリセリド血症、肥満、高脂血症、脂質異常及び／またはコレステロール代謝障害、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、冠動脈疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、ホモ接合体及びヘテロ接合体の家族性高コレステロール血症、及びスタチン耐性高コレステロール血症からなる群より選択される。

【0034】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態は、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病、高トリグリセリド血症、ＮＡＳＨ、肥満、またはそれらの組み合わせである。

【0035】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物は、第２の治療剤またはその組成物と組み合わせて投与される。

【0036】

さらなる態様において、本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態の治療のための薬物の製造における、本開示のオリゴヌクレオチドのいずれか、またはその医薬組成物の使用を提供する。

【0037】

いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドまたは本開示の医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態の治療に使用するためのものであるか、または使用に適合するものである。

【0038】

さらなる態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を治療するためのキットの形態で提供される。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書のオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容可能な担体とを含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象への投与のための説明書を含む添付文書をさらに含む。

【0039】

キットまたは使用のいくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する疾患、障害、または状態は、高トリグリセリド血症、肥満、高脂血症、脂質異常及び／またはコレステロール代謝障害、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、冠動脈疾患、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、ホモ接合体及びヘテロ接合体の家族性高コレステロール血症、及びスタチン耐性高コレステロール血症からなる群より選択される。

【0040】

キットまたは使用のいくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態は、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病、高トリグリセリド血症、ＮＡＳＨ、肥満、またはそれらの組み合わせである。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ対照偽処理細胞のパーセント（％）に対する、示したＤｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｕＨ－７細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのパーセントを示すグラフを提供する。

【図2】ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ対照偽処理細胞のパーセント（％）に対する、示したＤｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｕＨ－７細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのパーセントを示すグラフを提供する。

【図3】ジェネリックＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドの構造及び化学修飾パターンを示す概略図を提供する。

【図4】リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処理したマウスから得た肝臓試料中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する、示したＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドで処理したマウスから得た肝臓試料中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。

【図5A】ＰＢＳで処理した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に対する、示したＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドで処理したＮＨＰからの肝臓試料中の処理後２８日目のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を表すグラフを提供する。

【図5B】ＰＢＳで処理した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に対する、示したＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドで処理したＮＨＰからの肝臓試料中の処理後５６日目のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を表すグラフを提供する。

【図5C】ＰＢＳで処理した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に対する、示したＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドで処理したＮＨＰからの肝臓試料中の処理後８４日目のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を表すグラフを提供する。

【図6】経時的にＰＢＳで処理したＮＨＰからの肝臓試料中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する、示したＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドで処理したＮＨＰからの肝臓試料中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの平均パーセント（％）を示すグラフを提供する。

【図7】経時的にＰＢＳで処理したＮＨＰからの血清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に対する、示したＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドで処理したＮＨＰから得た血清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の平均パーセント（％）を示すグラフを提供する。

【発明を実施するための形態】

【0042】

Ｉ．定義

【0043】

本明細書で使用される場合、１つ以上の目的の値に適用される「約」は、記載されている参照値と同様の値を指す。特定の実施形態において、「約」は、別途記載のない限りまたは別途内容から明らかでない限り（かかる数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）、述べられた基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に含まれる値の範囲を指す。

【0044】

本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与すること」、「投与」などは、薬理学的に有用な形で（例えば、対象の状態を治療するために）対象に物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を与えることを意味する。

【0045】

本明細書で使用される場合、「ＡＮＧＰＴＬ３」は、分泌ポリペプチドのアンジオポエチン様ファミリーのメンバーであるアンジオポエチン様タンパク質３を指す。ＡＮＧＰＴＬ３は、哺乳類の肝臓で主に発現し、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、シグナルペプチド、Ｎ末端コイルドコイルドメイン、Ｃ末端フィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインを含む、アンジオポエチンの特徴的な構造を有する。本開示の目的において、「ＡＮＧＰＴＬ３」は、ヒト、マウス、霊長類、サル、ウシ、ニワトリ、げっ歯類、ラット、ブタ、ヒツジ、及びモルモットを含むがこれらに限定されない任意の脊椎動物または哺乳動物由来のＡＮＧＰＴＬ３を指す。ＡＮＧＰＴＬ３は、ネイティブＡＮＧＰＴＬ３の少なくとも１つのインビボまたはインビトロで活性を維持するネイティブＡＮＧＰＴＬ３の断片及び変異体を指す。ＡＮＧＰＴＬ３は、ＡＮＧＰＴＬ３の完全長で未処理の前駆体型、並びにシグナルペプチドの翻訳後切断から生じる成熟型、及びＦＢＮ様ドメインのタンパク質分解処理から生じる型を網羅する。ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ転写物の例示的な配列は、一般に入手でき（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：４１３２７７５０（ＮＭ＿０１４４９５．２））、本明細書に開示されている（配列番号１２８）。カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの例示的な配列は、一般に入手でき（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：１０２１３６２６４（ＸＭ＿００５５４３１８５．２））、本明細書に開示されている（配列番号１２９）。マウスＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの例示的な配列は、一般に入手でき（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：１４２３８８３５４（ＮＭ＿０１３９１３．３））、本明細書に開示されている（配列番号１３０）。ラットＡＮＧＰＴＬ３の例示的な配列は、一般に入手でき（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：６８１６３５６８（ＮＭ＿００１０２５０６５．１））、本明細書に開示されている（配列番号１３１）。

【0046】

本明細書で使用される場合、「アシアロ糖タンパク質受容体」または「ＡＳＧＰＲ」は、主要４８ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ－１）及び非主要４０ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ－２）により形成される二分性Ｃ型レクチンを指す。ＡＳＧＰＲは、主として肝実質細胞の類洞表面で発現され、末端ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ残基（アシアロ糖タンパク質）を含む循環糖タンパク質との結合、内在化、及びその後の排出に主要な役割を果たす。

【0047】

本明細書で使用される場合、「減弱する」、「減弱すること」、「減弱」などは、減少または効果的に停止することを指す。非限定的な例として、本明細書における治療の１つ以上は、対象における脂質異常症、高トリグリセリド血症、及び高脂血症の発症または進行を低減または効果的に停止させることができる。この減弱は、例えば、脂質異常症、高トリグリセリド血症、及び高脂血症の１つ以上の態様（例えば、症状、組織特徴、及び細胞の炎症活性または免疫活性など）の減少、存在することが予想される場合には、対象の脂質異常症、高トリグリセリド血症、及び高脂血症の１つ以上の態様の進行（悪化）が検出不能もしくは対象の脂質異常症、高トリグリセリド血症、及び高脂血症の態様が検出不能であることにより例示され得る。

【0048】

本明細書で使用される場合、「相補的」は、２つのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にする２つのヌクレオチド間の（例えば、２つの反対側の核酸の、または単一核酸鎖の反対側の領域での）構造的関係性を指す。例えば、対向する核酸のピリミジンヌクレオチドに相補的である１つの核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより共に塩基対合し得る。いくつかの実施形態において、相補的なヌクレオチドは、ワトソン・クリック型、または、安定した二重鎖の形成を可能にする他の任意の形で塩基対を形成していてもよい。いくつかの実施形態において、２つの核酸は、本明細書に記載のように、相補的な領域を形成するように互いに相補的な複数のヌクレオチドの領域を有していてもよい。

【0049】

デ本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の２’位に、ヒドロキシルの代わりに水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、リン酸基、もしくは塩基にまたは糖、リン酸基、もしくは塩基の修飾または置換を含む、２’位以外の原子の１つ以上の修飾または置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。

【0050】

本明細書で使用される場合、「二本鎖オリゴヌクレオチド」または「ｄｓオリゴヌクレオチド」は、実質的に二重鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的塩基対合は、共有結合的に個別の核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的塩基対合は、共有結合で連結されている核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的塩基対合は、互いに塩基対合するヌクレオチドの相補的逆平行配列を提供するように（例えば、ヘアピンにより）フォールディングされている単一核酸鎖で形成される。いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重鎖である２つの共有結合的に個別の核酸鎖を含む。しかしながら、いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドは、部分的に二重鎖である、（例えば、一方のまたは両方の末端にオーバーハングを有する）２つの共有結合的に個別の核酸鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であり、したがって、内部ミスマッチまたは末端ミスマッチを含んでいてもよい１つ以上のミスマッチを有していてもよいヌクレオチドの逆平行配列を含む。

【0051】

本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関する「二重鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合により形成される構造を指す。

【0052】

本明細書で使用される場合、「賦形剤」は、例えば、所望の稠度または安定効果を提供または寄与するように組成物に含まれていてもよい非治療剤を指す。

【0053】

本明細書で使用される場合、「肝実質細胞」または「（複数の）肝実質細胞」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。こうした細胞は、肝臓質量の約７０％～８５％を占め、血清アルブミン、ＦＢＮ、及びプロトロンビン群の凝固因子（第３因子及び第４因子を除く）を製造する。肝実質細胞系細胞のマーカーとしては、限定されないが、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミンシンテターゼ（Ｇｌｕｌ）、肝実質細胞核内因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝実質細胞核内因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）を挙げることができる。成熟肝実質細胞のマーカーとしては、限定されないが、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ（Ｆａｈ）、グルコース６－ホスフェート（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２－２Ｆ８を挙げることができる。例えば、Ｈｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ．４９４：２４７－２５０を参照すること。

【0054】

本明細書で使用される場合、「肝毒性剤」は、肝臓に対してそれ自体が毒性であるか、またはプロセシングされて、肝臓に対して毒性である代謝物質を形成し得る化学化合物、ウイルス、または他の物質を指す。肝毒性剤としては、限定されないが、四塩化炭素（ＣＣｌ₄）、アセトアミノフェン（パラセタモール）、塩化ビニル、ヒ素、クロロホルム、非ステロイド系抗炎症薬（アスピリン及びフェニルブタゾン等）を挙げることができる。

【0055】

本明細書で使用される場合、「不安定リンカー」は、（例えば、酸性ｐＨによって）切断され得るリンカーを指す。「かなり安定なリンカー」とは、切断できないリンカーを指す。

【0056】

本明細書で使用される場合、「肝臓炎症」または「肝炎」は、肝臓が、特に、傷害または感染の結果として、肝毒性剤への露出により引き起こされ得るように、腫大し、機能障害を起こし、及び／または苦痛を起こす身体状態を指す。症状としては、黄疸（皮膚または目が黄色になること）、疲労、虚弱、悪心、嘔吐、食欲減退、及び体重減少を挙げることができる。肝臓炎症は、治療せずにおくと、線維症、肝硬変、肝不全、または肝臓がんへと進行する場合がある。

【0057】

本明細書で使用される場合、「肝線維症」または「肝臓の線維症」は、炎症及び肝臓細胞死に起因するコラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、及びＩＶ）、ＦＢＮ、ウンズリン、エラスチン、ラミニン、ヒアルロナン、及びプロテオグリカンを含んでいてもよい細胞外マトリックスタンパク質の肝臓における過剰蓄積を指す。肝線維症は、治療せずにおくと、肝硬変、肝不全、または肝臓がんへと進行する場合がある。

【0058】

本明細書で使用される場合、「ループ」は、適切なハイブリダイゼーション条件下で（例えば、リン酸緩衝液中で、細胞中で）、非対合領域に隣接する２つの逆平行領域がハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成するように、互いに十分に相補的である核酸の２つの逆平行領域が隣接している核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の非対合領域を指す。

【0059】

本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド間結合」という用語は、ホスホジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間結合と比較すると、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、非天然結合である。典型的には、修飾ヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低減などを向上させることができる。

【0060】

本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較すると、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／またはリン酸基に１つ以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドに結合された１つ以上の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低減などを向上させることができる。

【0061】

本明細書で使用される場合、「ニック化テトラループ構造」は、個別のセンス（パッセンジャー）鎖及びアンチセンス（ガイド）鎖により特徴付けられるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造を指しており、センス鎖は、アンチセンス鎖と相補的な領域を有し、鎖の少なくとも一方が、一般にセンス鎖が、この少なくとも一方の鎖内に形成される隣接ステム領域を安定させるように構成されているテトラループを有する。

【0062】

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、（例えば、長さが約１００個未満のオリゴヌクレオチドの）短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、一本鎖（ｓｓ）であってもよくまたはｄｓであってもよい。オリゴヌクレオチドは、二重鎖領域を有していてもよくまたは有していなくともよい。一組の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、またはｓｓ ｓｉＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。

【0063】

本明細書で使用される場合、「オーバーハング」は、一方の鎖または領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて、その一方の鎖または領域が伸長することに起因する末端非塩基対合ヌクレオチド（複数可）を指す。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、ｄｓオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端の二重鎖領域から伸長する１つ以上の非対合ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、オーバーハングは、ｄｓオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。

【0064】

本明細書で使用される場合、「リン酸アナログ」は、リン酸基の静電特性及び／または立体特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態において、リン酸アナログは、しばしば酵素的除去を受けやすい５’－リン酸の代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに配置される。いくつかの実施形態において、５’リン酸アナログは、ホスファターゼ耐性結合を含む。リン酸アナログとしては、限定されないが、５’メチレンホスホネート（５’－ＭＰ）及び５’－（Ｅ）－ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）などの５’ホスホネートが挙げられる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’－末端ヌクレオチドの糖の４’位の炭素にリン酸アナログを有する（「４’－リン酸アナログ」と呼ばれる）。４’－リン酸アナログとしては、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’炭素）に結合したオキシメチルホスホネートまたはそのアナログが挙げられる。例えば、米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号（２０１６年９月２日出願）及び米国特許仮出願第６２／３９３，４０１号（２０１６年９月１２日出願）を参照すること。オリゴヌクレオチドの５’末端に対する他の修飾が開発されている（例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１１／１３３８７１号、米国特許第８，９２７，５１３号、及びＰｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４３：２９９３－３０１１を参照すること）。

【0065】

本明細書で使用される場合、ある遺伝子（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３）の「発現の低減」は、適切な参照（例えば、参照細胞、細胞集団、試料、または対象）と比較すると、その遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写産物（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ）またはタンパク質の量もしくはレベルの減少、及び／または細胞、細胞集団、試料、または対象におけるその遺伝子の活性量もしくはレベルの減少を指す。例えば、細胞を本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド）と接触させる行為は、ｄｓオリゴヌクレオチドで処理されていない細胞と比較すると、（例えば、ＲＮＡｉ経路によるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの分解を介して）ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ、タンパク質、及び／または活性の量またはレベルの減少をもたらし得る。同様に、本明細書で使用される場合、「発現の低減」は、遺伝子（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３）の発現の低減をもたらす行為を指す。本明細書で使用される場合、「ＡＮＧＰＴＬ３発現の低減」は、適切な参照（例えば、参照細胞、細胞集団、試料、または対象）と比較すると、細胞、細胞集団、試料、または対象におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、及び／またはＡＮＧＰＴＬ３活性の量もしくはレベルの減少を指す。

【0066】

本明細書で使用される場合、「相補的な領域」は、ヌクレオチドの逆平行配列と十分に相補的であることにより、（例えば、リン酸緩衝液中、細胞内など）適当なハイブリダイゼーション条件下で２つのヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションを可能にするような、核酸のヌクレオチド配列（例えば、ｄｓオリゴヌクレオチド）を指す。いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的配列に相補的な領域を有する標的配列を含む。

【0067】

本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、そのペントース糖として、２’位にヒドロキシル基を有するリボースを有するヌクレオチドを指す。修飾されたリボヌクレオチドとは、リボース、リン酸基、もしくは塩基にまたはリボース、リン酸基、もしくは塩基の修飾または置換を含む、２’位以外の原子の１つ以上の修飾または置換を有するリボヌクレオチドである。

【0068】

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）とアンチセンス鎖（ガイド）とを有するｄｓオリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖またはアンチセンス鎖の一部がアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡの切断に使用されるｄｓオリゴヌクレオチド、または（ｂ）一本のアンチセンス鎖を有するｓｓオリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンス鎖（またはそのアンチセンス鎖の一部）が、Ａｇｏ２エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡの切断に使用される一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。

【0069】

本明細書で使用される場合、「鎖」は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合、またはホスホロチオエート結合）を介して互いに連結されたヌクレオチドの一本の連続した配列を指す。いくつかの実施形態において、鎖は、２つの遊離末端（例えば、５’末端及び３’末端）を有する。

【0070】

本明細書で使用される場合、「対象」は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒトまたはＮＨＰである。さらに、「個人」または「患者」は、「対象」と互換的に用いられる場合がある。

【0071】

本明細書で使用される場合、「合成」は、人工的に合成された（例えば、機械（例えば、固体核酸合成装置）を使用して）、またはそれ以外でその分子を通常生成する天然のソース（例えば、細胞または生物）に由来していない核酸または他の分子を指す。

【0072】

本明細書で使用される場合、「標的指向性リガンド」は、目的の組織または細胞の同種分子（例えば、受容体）に選択的に結合し、別の物質を目的の組織または細胞に対して標的化するためにその別の物質に結合することができる分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、または脂質）を指す。例えば、いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドを目的の特定の組織または細胞に標的化するためにそのオリゴヌクレオチドに結合されていてもよい。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、細胞表面受容体に選択的に結合する。したがって、いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドに結合されている場合、細胞の表面に発現されている受容体に選択的に結合し、オリゴヌクレオチド、標的指向性リガンド、及び受容体を含む複合体が細胞によりエンドソーム内部移行されることにより、特定の細胞内へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドが、細胞内で標的指向性リガンドから放出されるように、細胞内部移行後にまたは細胞内部移行中に切断されるリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合されている。

【0073】

本明細書で使用される場合、「テトラループ」は、ヌクレオチドのフランキング配列のハイブリダイゼーションにより形成される隣接二重鎖の安定性を増加させるループを指す。安定性の増加は、無作為に選択されたヌクレオチドの配列からなる同等の長さの一組のループから平均的に予想される隣接ステム二重鎖のＴ_mよりも高い隣接ステム二重鎖の融解温度（Ｔ_m）の上昇として検出可能である。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対（ｂｐ）の長さの二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａＨＰＯ₄中で、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５８℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７５℃のＴ_mをもたらし得る。いくつかの実施形態において、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接したステム二重鎖のｂｐを安定化させることができる。加えて、テトラループのヌクレオチド間の相互作用としては、限定ではないが、非ワトソン・クリック型塩基対、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が挙げられる（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６：６８０－６８２；Ｈｅｕｓ＆Ｐａｒｄｉ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５３：１９１－１９４）。いくつかの実施形態において、テトラループは、ヌクレオチド３個～６個を含むか、またはそれからなり、典型的にはヌクレオチド４～５個である。特定の実施形態において、テトラループは、ヌクレオチド３個、４個、５個、または６個を含むかまたはそれからなり、修飾されていてもよく、または修飾されていなくともよい（例えば、標的指向性部分に結合されていてもよく、または結合されていなくともよい）。一実施形態において、テトラループは、ヌクレオチド４個からなる。テトラループでは任意のヌクレオチドを使用することができ、Ｃｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３０２１－３０３０に記載されるようにそのようなヌクレオチドの標準的なＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ記号を使用することができる。例えば、文字「Ｎ」は、任意の塩基がその位置にあり得ることを意味するために使用することができ、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）またはＧ（グアニン）がその位置にあり得ることを示すために使用することができ、「Ｂ」は、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、またはＴ（チミン）がその位置にあり得ることを示すために使用できる。テトラループの例としては、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：８４６７－８４７１、Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５９０１－５９０５）。ＤＮＡテトラループの例としては、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ）ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、及びテトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。例えば、Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：４２８１－１４２９２；Ｓｈｉｎｊｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｇａｋｋａｉ Ｋｏｅｎ Ｙｏｋｏｓｈｕ ７８：７３１を参照すること。いくつかの実施形態において、テトラループは、ニック化テトラループ構造内に含まれる。

【0074】

本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」は、例えば、既存の状態（例えば、疾患、障害）に関して対象の健康及び／または福祉を向上させるために、または状態が発生する可能性を予防または減少させるために、治療剤（例えば、本明細書のオリゴヌクレオチド）を対象に投与することにより、ケアの提供を必要とする対象にそれを行う行為を指す。いくつかの実施形態において、治療は、対象が経験する状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、または寄与要因の頻度または重症度を低減することを含む。

【0075】

ＩＩ．ＡＮＧＰＴＬ３発現のオリゴヌクレオチド阻害剤

【0076】

本開示は、とりわけ、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書におけるＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するオリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを標的とする。

【0077】

ｉ．ＡＮＧＰＴＬ３標的配列

【0078】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを含む標的配列を標的とする。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの一部、断片、もしくは鎖（例えば、ｄｓオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）は、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを含む標的配列に結合またはアニーリングすることで、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、インビボでＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するためにＡＮＧＰＴＬ３標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３標的配列を標的とするオリゴヌクレオチドによるＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害量または程度は、オリゴヌクレオチドの効力と相関する。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３標的配列を標的とするオリゴヌクレオチドによるＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害量または程度は、オリゴヌクレオチドを処理したＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象または患者における治療効果の量または程度と相関する。

【0079】

複数の異なる種（例えば、ヒト、カニクイザル、マウス、及びラット、例えば、実施例１を参照すること）のｍＲＮＡを含む、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列を検査し、インビトロ及びインビボ試験を行った結果（例えば、実施例２及び実施例３を参照すること）、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの特定のヌクレオチド配列は、他のヌクレオチド配列よりもオリゴヌクレオチドに基づく阻害を受けやすく、したがって本明細書のオリゴヌクレオチドの標的配列として有用であることを発見した。いくつかの実施形態において、本明細書（例えば、表５）に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓオリゴヌクレオチド）のセンス鎖は、ＡＮＧＰＴＬ３標的配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書（例えば、表５）に記載のｄｓオリゴヌクレオチドの上記センス鎖の一部または領域は、ＡＮＧＰＴＬ３標的配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３標的配列は、配列番号１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、及び１２７のいずれか１つの配列を含むかまたはそれからなる。

【0080】

ｉｉ．ＡＮＧＰＴＬ３－標的指向性配列

【0081】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、細胞内のｍＲＮＡを標的とし、その発現を阻害するために、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに相補的な領域を（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの標的配列内に）有する。いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、相補的（ワトソン・クリック）塩基対合によってＡＮＧＰＴＬ３標的配列に結合またはアニーリングする相補的な領域を有するＡＮＧＰＴＬ３標的指向性配列（例えば、ｄｓオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）を含む。標的指向性配列または相補的な領域は、一般に、オリゴヌクレオチド（またはその鎖）のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する結合またはアニーリングを、その発現を阻害するために、可能にするのに好適な長さ及び塩基構成である。いくつかの実施形態では、例えば、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、または少なくとも約３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、約１２個～約３０個（例えば、１２個～３０個、１２個～２２個、１５個～２５個、１７個～２１個、１８個～２７個、１９個～２７個、または１５個～３０個）のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、または約３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、１８個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、１９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、２１個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、２２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、２３個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、長さが、２４個のヌクレオチドである。

【0082】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３標的配列と完全に相補的である標的指向性配列または相補的な領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）を含む。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、ＡＮＧＰＴＬ３標的配列に対して完全に相補的である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つの配列と完全に相補的な標的指向性配列または相補的な領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つの配列と部分的に相補的な標的指向性配列または相補的な領域を含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続配列と相補的な標的指向性配列または相補的な領域を含み、ヌクレオチドの連続配列は、長さが約１２個～約３０個のヌクレオチド（例えば、長さが１２個～３０個、１２個～２８個、１２個～２６個、１２個～２４個、１２個～２０個、１２個～１８個、１２個～１６個、１４個～２２個、１６個～２０個、１８個～２０個、または１８個～１９個のヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続配列と相補的な標的指向性配列または相補的な領域を含み、ヌクレオチドの連続配列は、長さが１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続配列と相補的な標的指向性配列または相補的な領域を含み、ヌクレオチドの連続配列は、長さが１９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つのヌクレオチドの連続配列と相補的な標的指向性配列または相補的な領域を含み、任意に、ヌクレオチドの連続配列は、長さが１９個のヌクレオチドである。

【0084】

いくつかの実施形態において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載される配列の連続ヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドの標的指向性配列または相補的な領域は、アンチセンス鎖の全長にわたる。いくつかの実施形態において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載される配列の連続ヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドの相補的な領域は、アンチセンス鎖の全長の一部にわたる。いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載される配列の１個～２０個のヌクレオチドにわたるヌクレオチドの連続伸長に対して少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的な領域（例えば、ｄｓオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上）を含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、対応するＡＮＧＰＴＬ３標的配列と１つ以上のｂｐミスマッチを有する標的指向性配列または相補的な領域を含む。いくつかの実施形態において、標的指向性配列または相補的な領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに結合またはアニーリングする標的指向性配列または相補的な領域の能力、及び／またはＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力が維持されると、対応するＡＮＧＰＴＬ３標的配列との最大約１つ、最大約２つ、最大約３つ、最大約４つ、または最大約５つなどのミスマッチを有し得る。あるいは、標的指向性配列または相補的な領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに結合またはアニーリングする標的指向性配列または相補的な領域の能力、及び／またはＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力が維持されると、対応するＡＮＧＰＴＬ３標的配列との１以下、２以下、３以下、４以下、または５以下のミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と１つのミスマッチを有する標的指向性配列または相補的な領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と２つのミスマッチを有する標的指向性配列または相補的な領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と３つのミスマッチを有する標的指向性配列または相補的な領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と４つのミスマッチを有する標的指向性配列または相補的な領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と５つのミスマッチを有する標的指向性配列または相補的な領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列との複数のミスマッチ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のミスマッチ）を有する標的配列または相補的な領域を含み、少なくとも２つ（例えば、全て）のミスマッチは、連続して配置されるか（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の連続ミスマッチ）、またはミスマッチが標的指向性配列または相補的な領域全体に散在する。

【0086】

ｉｉｉ．オリゴヌクレオチドの種類

【0087】

様々なオリゴヌクレオチドの種類及び／または構造は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡなどを含むがこれらに限定されない本明細書の方法においてＡＮＧＰＴＬ３を標的とすることに有用である。本明細書またはその他に記載のオリゴヌクレオチドの種類のいずれも、本明細書のＡＮＧＰＴＬ３標的指向性配列を組み込むフレームワークとして使用することが企図される。

【0088】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ダイサー介入の上流または下流のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与することで、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する。例えば、各鎖が、１～５個のヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを有し、１９個～２５個のヌクレオチドのサイズを有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号を参照すること）。ダイサーによりプロセシングされて、活性ＲＮＡｉ産物を生成する、より長鎖のオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照すること）。さらなる研究により、一方の鎖が熱力学的に安定したテトラループ構造を有する構造を含む、少なくとも一方の鎖の少なくとも一方の端部が二重鎖の標的指向性領域を越えて伸長されている伸長ｄｓオリゴヌクレオチドが作製されている（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号及び米国特許第８，９２７，７０５号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０３３２２５号を参照すること）。そのような構造は、（分子の一方の側または両側に）ｓｓ伸長並びにｄｓ伸長を含んでいてもよい。

【0089】

いくつかの実施形態において、本明細書でのオリゴヌクレオチドは、ダイサーの介入（例えば、ダイサー切断）の下流のＲＮＡｉ干渉経路に関与する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’末端に（例えば、長さが１個、２個、または３個のヌクレオチドの）オーバーハングを有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡに対してアンチセンスであるヌクレオチド２１個のガイド鎖と、相補的なパッセンジャー鎖とを含むことができ、両方の鎖はアニールして１９ｂｐの二重鎖と一方または両方の３’末端にヌクレオチド２個のオーバーハングを形成する。長さが２３個のヌクレオチドのガイド鎖及び長さが２１個のヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有するオリゴヌクレオチドを含み、分子の右側に平滑末端（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）及び分子の左側に２ヌクレオチドの３’ガイド鎖オーバーハング（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）を有するより長鎖のオリゴヌクレオチド設計も可能である。このような分子には、２１ｂｐの二重鎖領域が存在する。例えば、米国特許第９，０１２，１３８号、米国特許第９，０１２，６２１号、及び米国特許第９，１９３，７５３号を参照すること。

【0090】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、両方とも長さが約１７個～２６個（例えば、１７個～２６個、２０個～２５個、または２１個～２３個）のヌクレオチドの範囲である。いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、両方とも長さが１９個～２２個のヌクレオチドの範囲である。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は長さが等しい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれかにまたはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に３’オーバーハングが存在する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドがセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、両方とも長さが２１個～２３個のヌクレオチドの範囲である場合、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方にある３’オーバーハングは、長さが１個または２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、分子の右側（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）に平滑末端が存在し、分子の左側（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）に２ヌクレオチドの３’ガイド鎖オーバーハングが存在する、２２個ヌクレオチドのガイド鎖及び２０個ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有する。このような分子には、２０ｂｐの二重鎖領域が存在する。

【0091】

本明細書の組成物及び方法で使用される他のオリゴヌクレオチド設計としては、以下のものが挙げられる。１６量体ｓｉＲＮＡ（例えば、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＩＮ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ． Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（ｅｄ．），Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６を参照すること）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐまたはより短いステムを有するもの。例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．６２９：１４１－１５８を参照すること）、平滑末端ｓｉＲＮＡ（例えば、長さが１９ｂｐのもの。例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ＆Ｂａｋｅｒ（２００６）ＲＮＡ １２：１６３－１７６を参照すること）、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ。例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１３７９－１３８２を参照すること）、非対称短鎖二重鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１７：７２５－７３２を参照すること）、フォーク型ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ（２００４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５５７：１９３－１９８を参照すること）、ｓｓ ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ（２０１２）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：１０６３）、ダンベル型環状ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１２９：１５１０８－１５１０９を参照すること）、及び低分子内部セグメント干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：５８８６－５８９７を参照すること）。いくつかの実施形態で使用されて、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減または阻害することができるオリゴヌクレオチド構造のさらなる非限定的な例として、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短鎖ｓｉＲＮＡが挙げられる（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＥＭＢＯ Ｊ．２１：４６７１－４６７９を参照すること。また、米国特許出願公開第２００９／００９９１１５号を参照すること）。

【0092】

さらに、いくつかの実施形態において、本明細書のＡＮＧＰＴＬ３発現を低減または阻害するオリゴヌクレオチドは、ｓｓである。そのような構造としては、これに限定されないが、ｓｓ ＲＮＡｉ分子が挙げられる。最近の努力により、ｓｓ ＲＮＡｉ分子の活性が示されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．２４：９４６－９５５を参照すること）。しかしながら、いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に記載して、特定の核酸の標的セグメントの逆相補体を含み、細胞でのその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介性切断を誘導するように（例えば、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）として）、または細胞での標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように（例えば、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）として）適切に修飾されている核酸塩基配列を有するｓｓオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用するＡＳＯは、例えば、米国特許第９，５６７，５８７号（例えば、長さ、核酸塩基の糖部分（ピリミジン、プリン）、及び核酸塩基の複素環部分の改変を含む）に示されるものを含む、当該技術分野では周知の任意の適切な方法で修飾されてもよい。さらに、ＡＳＯは、特定の標的遺伝子の発現を低減させるために数十年間使用されてきた（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：８１－１０５を参照すること）。

【0093】

ｉｖ．二本鎖オリゴヌクレオチド

【0094】

本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを標的とし、かつ（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するｄｓオリゴヌクレオチドであって、センス鎖（本明細書ではパッセンジャー鎖とも呼ばれる）及びアンチセンス鎖（本明細書ではガイド鎖とも呼ばれる）を含むｄｓオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、個別の鎖であり、共有結合で連結されていない。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されている。

【0095】

いくつかの実施形態において、センス鎖は、第１の領域（Ｒ１）及び第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｒ２は、第１のサブ領域（Ｓ１）、テトラループ（Ｌ）、またはトリループ（ｔｒｉＬ）、及び第２のサブ領域（Ｓ２）を含む。ＬまたはｔｒｉＬは、Ｓ１及びＳ２の間に位置し、Ｓ１及びＳ２は第２の二重鎖（Ｄ２）を形成する。Ｄ２の長さは様々であり得る。いくつかの実施形態において、Ｄ２は、長さが約１個～６個のｂｐである。いくつかの実施形態において、Ｄ２は、長さが２個～６個、３個～６個、４個～６個、５個～６個、１個～５個、２個～５個、３個～５個、または４個～５個のｂｐである。いくつかの実施形態において、Ｄ２は、長さが１個、２個、３個、４個、５個、または６個のｂｐである。いくつかの実施形態において、Ｄ２は長さが６個のｂｐである。

【0096】

いくつかの実施形態において、センス鎖のＲ１及びアンチセンス鎖は、第１の二重鎖（Ｄ１）を形成する。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが、約１５個（例えば、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、または少なくとも２１個）のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが約１２個～３０個のヌクレオチドの範囲である（例えば、長さが１２個～３０個、１２個～２７個、１５個～２２個、１８個～２２個、１８個～２５個、１８個～２７個、１８個～３０個、または２１個～３０個のヌクレオチド）。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが、約１２個（例えば、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または少なくとも３０個）のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の全長にわたっていない。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖またはアンチセンス鎖の一方の全長及び／またはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の全長にわたる。特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の全長にわたる。

【0097】

いくつかの実施形態において、本明細書のｄｓオリゴヌクレオチドは、表３に配置するように、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つの配列を有するセンス鎖、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、及び１１６から選択される相補的配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、配列番号９９の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１００の配列を含む。

【0098】

いくつかの実施形態において、本明細書のｄｓオリゴヌクレオチドは、表４に配置するように、配列番号１９、２５、４９、７１、７３、７５、７９、９９、１０１、１０３、及び１１３のいずれか１つの配列を含むセンス鎖、及び配列番号２０、２６、５０、７２、７４、７６、８０、１００、１０２、１０４、及び１１４から選択される相補的配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、配列番号９９の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１００の配列を含む。

【0099】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の構造を記述する際に、配列表に示された配列を参照している場合がある点は理解されたい。このような実施形態において、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、特定の配列と本質的に同じまたは同様の相補的特性を保持しながら、特定の配列と比較して１つ以上の代替的ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ対応物またはＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ対応物）及び／または１つ以上の修飾ヌクレオチド及び／または１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合及び／または１つ以上の他の修飾を有し得る。

【0100】

いくつかの実施形態において、本明細書のｄｓオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド２５個のセンス鎖と、ダイサー酵素が作用すると、成熟ＲＩＳＣに組み込まれるアンチセンス鎖を生じるヌクレオチド２７個のアンチセンス鎖とを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２７個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のヌクレオチド）。いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２５個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個のヌクレオチド）。

【0101】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドの一方の５’末端は、他方の５’末端と比較して熱力学的に不安定である。いくつかの実施形態において、センス鎖の３’末端に平滑末端を有し、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する非対称オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’オーバーハングは、長さが約１個～８個のヌクレオチド（例えば、長さが１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個のヌクレオチド）である。通常、ＲＮＡｉのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に２個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。しかしながら、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、１個～６個のヌクレオチド、場合によっては、１個～５個、１個～４個、１個～３個、１個～２個、２個～６個、２個～５個、２個～４個、２個～３個、３個～６個、３個～５個、３個～４個、４個～６個、４個～５個、５個～６個のヌクレオチド、または１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヌクレオチドの長さを含む３’オーバーハングである。しかしながら、いくつかの実施形態において、オーバーハングは、１個～６個のヌクレオチド、場合によっては、１個～５個、１個～４個、１個～３個、１個～２個、２個～６個、２個～５個、２個～４個、２個～３個、３個～６個、３個～５個、３個～４個、４個～６個、４個～５個、５個～６個のヌクレオチド、または１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヌクレオチドの長さを含む５’オーバーハングである。

【0102】

いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の２つの末端ヌクレオチドは、修飾されている。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の２つの末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の２つの末端ヌクレオチドは、標的と相補的ではない。いくつかの実施形態において、ニック化テトラループ構造中のオリゴヌクレオチドの各３’末端の２つの末端ヌクレオチドは、ＧＧである。典型的には、オリゴヌクレオチドの各３’末端の２つの末端ＧＧヌクレオチドの一方または両方は、標的と相補的ではない。

【0103】

いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間には、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）のミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に複数のミスマッチが存在する場合、それらは、連続して位置していてもよく（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上が連続してもよく）、または相補的な領域の全体にわたって散在していてもよい。いくつかの実施形態において、センス鎖の３’末端は、１つ以上のミスマッチを含む。一実施形態において、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端のセグメントの塩基ミスマッチまたは不安定化は、恐らくはダイサーによるプロセシングを促進することにより、ＲＮＡｉの合成二重鎖の効力を向上させた。

【0104】

ａ．アンチセンス鎖

【0105】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＡＮＧＰＴＬ３を標的とするオリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、及び１１６のいずれか１つに記載される配列を含むかまたはそれからなるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、及び１１６のいずれか１つに記載される配列の、少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、または少なくとも２３個）の連続ヌクレオチドを含むまたはそれからなるアンチセンス鎖を含む。

【0106】

いくつかの実施形態において、ｄｓオリゴヌクレオチドは、長さがヌクレオチド最大４０個（例えば、長さがヌクレオチド最大４０個、最大３５個、最大３０個、最大２７個、最大２５個、最大２１個、最大１９個、最大１７個、または最大１２個）のアンチセンス鎖を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくともヌクレオチド約１２個（例えば、長さが少なくともヌクレオチド１２個、少なくとも１５個、少なくとも１９個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２５個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、または少なくとも３８個）のアンチセンス鎖を有してもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが約１２個～約４０個（例えば、１２個～４０個、１２個～３６個、１２個～３２個、１２個～２８個、１５個～４０個、１５個～３６個、１５個～３２個、１５個～２８個、１７個～２２個、１７個～２５個、１９個～２７個、１９個～３０個、２０個～４０個、２２個～４０個、２５個～４０個、または３２個～４０個）のヌクレオチドの範囲のアンチセンス鎖を有してもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を有してもよい。

【0107】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる場合がある。例えば、アンチセンス鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、アルゴノートタンパク質、例えばＡｇｏ２に結合できる場合、または１つ以上の同様の因子に組み込まれ、または結合して標的遺伝子をサイレンシングを誘導することができる場合、アンチセンス鎖はガイド鎖と呼ぶことができる。いくつかの実施形態において、ガイド鎖に相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ぶことができる。

【0108】

ｂ．センス鎖

【0109】

いくつかの実施形態において、本明細書のＡＮＧＰＴＬ３を標的とするオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載されるセンス鎖配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載される配列の、少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、または少なくとも２３個）の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれからなるセンス鎖を有する。

【0110】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが最大約４０個のヌクレオチド（例えば、長さが最大４０個、最大３６個、最大３０個、最大２７個、最大２５個、最大２１個、最大１９個、最大１７個、または最大１２個のヌクレオチド）のセンス鎖（または、パッセンジャー鎖）を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが、少なくとも約１２個のヌクレオチド（例えば、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１９個、少なくとも２１個、少なくとも２５個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３６個、または少なくとも３８個のヌクレオチド）のセンス鎖を有してもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが約１２個～約４０個（例えば、１２個～４０個、１２個～３６個、１２個～３２個、１２個～２８個、１５個～４０個、１５個～３６個、１５個～３２個、１５個～２８個、１７個～２１個、１７個～２５個、１９個～２７個、１９個～３０個、２０個～４０個、２２個～４０個、２５個～４０個、または３２個～４０個）のヌクレオチドの範囲のセンス鎖を有してもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のヌクレオチドのセンス鎖を有してもよい。

【0111】

いくつかの実施形態において、センス鎖は、その３’末端にステムループ構造を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、その５’末端にステムループ構造を含む。いくつかの実施形態において、ステムは、長さが２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個のｂｐの二重鎖である。いくつかの実施形態において、ステムループは、分子を分解（例えば、酵素分解）から保護し、標的細胞に送達するための標的化特性を促進する。例えば、いくつかの実施形態において、ループは、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性に大きく影響することなく修飾を行うことができるさらなるヌクレオチドを提供する。特定の実施形態において、本明細書では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖が、（例えば、その３’末端に）Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含むものである。ここで、Ｓ１は、Ｓ２と相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に、長さが最大約１０個のヌクレオチド（例えば、長さが３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のヌクレオチド）のループを形成する。図３は、このようなオリゴヌクレオチドの非限定的な例示を示す。

【0112】

いくつかの実施形態において、ステムループのループ（Ｆ）は、テトラループ（例えば、ニック化テトラループ構造内）である。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含むことができる。通常、テトラループは４～５個のヌクレオチドを有する。

【0113】

ｖ．オリゴヌクレオチドの修飾

【0114】

ａ．糖の修飾

【0115】

いくつかの実施形態において、修飾糖（本明細書では糖アナログとも呼ばれる）は、例えば、１つ以上の修飾が糖の２’、３’、４’、及び／または５’位の炭素に生じるような、修飾されたデオキシリボースまたはリボース部分を含む。いくつかの実施形態において、修飾された糖は、ロック核酸（「ＬＮＡ」、例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｎ ５４：３６０７－３６３０を参照すること）、アンロック核酸（「ＵＮＡ」、例えば、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ－Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ ２：ｅ１０３を参照すること）、及び架橋型核酸（「ＢＮＡ」、例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ＆Ｏｂｉｋａ（２００２）Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ）２１：１６５３－１６５９を参照すること）に提示されているものなどの非天然代替炭素構造も含んでもよい。

【0116】

いくつかの実施形態において、糖のヌクレオチド修飾は、２’－修飾を含む。いくつかの実施形態において、２’－修飾は、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキシエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、または２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）であってもよい。いくつかの実施形態において、修飾は、２’－Ｆ、２’－ＯＭｅ、または２’－ＭＯＥである。いくつかの実施形態において、糖の修飾は、糖環の１つ以上の炭素の修飾を含んでいてもよい糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の１’－炭素または４’－炭素に連結されている糖の２’－酸素、またはエチレンもしくはメチレン架橋を介して１’－炭素もしくは４’－炭素に連結されている２’－酸素を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２’－炭素から３’－炭素の結合を欠如する非環式糖を有する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。

【0117】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１個（例えば、少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、またはそれら以上）の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、少なくとも約１個（例えば、少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、またはそれら以上）の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、少なくとも約１個（例えば、少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、またはそれら以上）の修飾ヌクレオチドを含む。

【0118】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖のヌクレオチドは、全て修飾されている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖のヌクレオチドは、全て修飾されている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド（すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方）は、全て修飾されている。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾（例えば、２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅ、２’－ＭＯＥ、及び２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは２’修飾（例えば、２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅ）を含む。

【0119】

本開示は、異なる修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、表３及び４（並びに図３）のいずれか１つに記載するように、修飾パターンを有するセンス鎖配列、及び表３及び４（並びに図３）のいずれか１つに記載するように、修飾パターンを有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、これらのオリゴヌクレオチドの場合、センス鎖の８、９、１０、または１１位の１つ以上が２’－Ｆ基で修飾される。他の実施形態において、これらのオリゴヌクレオチドの場合、センス鎖の１～７位及び１２～２０位のヌクレオチドのそれぞれの糖部分が２’－ＯＭｅで修飾される。

【0120】

いくつかの実施形態において、本発明は、表Ａに記載されたものから選択される修飾または非修飾センス鎖であるか、またはそれらを含むオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、表Ａに記載されたものから選択される修飾または非修飾アンチセンス鎖であるか、またはそれらを含むオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、表Ａに記載されたものから選択される修飾または非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、表Ａに記載されたものから選択されるセンス鎖修飾パターンを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、表Ａに記載されたものから選択されるアンチセンス鎖修飾パターンを提供する。

【0121】

いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、糖部分の２’位で２’－Ｆで修飾された３個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の２、５、及び１４位の糖部分、及び場合によっては、１、３、７、及び１０位の最大３個のヌクレオチドが、２’－Ｆで修飾される。他の実施形態において、アンチセンス鎖の２、５、及び１４位の位置のそれぞれの糖部分は、２’－Ｆで修飾される。他の実施形態において、アンチセンス鎖の１、２、５、及び１４位の位置のそれぞれの糖部分は、２’－Ｆで修飾される。さらに他の実施形態において、アンチセンス鎖の１、２、３、５、７、及び１４位の位置のそれぞれの糖部分は、２’－Ｆで修飾される。さらに別の実施形態において、アンチセンス鎖の１、２、３、５、１０、及び１４位の位置のそれぞれの糖部分は、２’－Ｆで修飾される。別の実施形態において、アンチセンス鎖の２、３、５、７、１０、及び１４位の位置のそれぞれの糖部分は、２’－Ｆで修飾される。

【0122】

ｂ．５’末端リン酸

【0123】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’－末端リン酸基は、Ａｇｏ２との相互作用を促進する。しかしながら、５’－リン酸基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼまたは他の酵素による分解を受けやすく、インビボでのバイオアベイラビリティを制限する可能性がある。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、こうした分解に耐性のある５’リン酸のアナログを有する。いくつかの実施形態において、リン酸アナログは、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートであってもよい。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖の１’末端は、天然の５’リン酸基の静電特性及び立体特性を模倣する化学部分（「リン酸模倣物」）に結合される。

【0124】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、糖の４’－炭素位置にリン酸アナログを有する（「４’－リン酸アナログ」と呼ばれる）。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０４５３１７号を参照すること。いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’－リン酸アナログを含む。いくつかの実施形態において、リン酸アナログは、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’炭素）に結合したオキシメチルホスホネートまたはそのアナログである。他の実施形態において、４’－リン酸アナログは、チオメチルホスホネートまたはアミノメチルホスホネートであり、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子は、糖部分またはそのアナログの４’－炭素に結合している。特定の実施形態において、４’－リン酸アナログは、オキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態において、オキシメチルホスホネートは、式－Ｏ－ＣＨ₂－ＰＯ（ＯＨ）₂または－Ｏ－ＣＨ₂－ＰＯ（ＯＲ）₂で表され、Ｒは、独立に、Ｈ、ＣＨ₃、アルキル基、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＯＣＯＣ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｓｉ（ＣＨ₃）₃、または保護基から選択される。特定の実施形態において、アルキル基は、ＣＨ₂ＣＨ₃である。より典型的には、Ｒは、独立に、Ｈ、ＣＨ₃、またはＣＨ₂ＣＨ₃から選択される。

【0125】

ｃ．修飾されたヌクレオシド間結合

【0126】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態において、リン酸の修飾または置換は、少なくとも１個（例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも５個）の修飾ヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを生じ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、約１～１０個（例えば、１個～１０個、２個～８個、４個～６個、３個～１０個、５個～１０個、１個～５個、１個～３個、または１個～２個）の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。

【0127】

修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオアート結合、ホスホロチオアート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオンアルキルホスホトリエステル結合、ホスホラミダイト結合、ホスホネート結合、またはボラノホスフェート結合であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

【0128】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及び／またはアンチセンス鎖の２１位と２２位のうちの１つ以上の間にホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を含む。

【0129】

ｄ．塩基修飾

【0130】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾された核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基（本明細書では塩基アナログとも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に連結される。特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、窒素塩基である。特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２７４４６２号を参照すること。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかしながら、特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（無塩基）。

【0131】

いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基は、二重鎖中に存在する場合に二重鎖の構造を大きく変えることなく、複数の種類の塩基と対合させて配置することができる修飾ヌクレオチドのヌクレオチド糖部分の１’位、またはヌクレオチド糖部分置換の同等の位置に配置された複素環部分である。いくつかの実施形態において、標的核酸と完全に相補的である参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的な核酸と形成される二重鎖よりも低いＴ_mを有する標的核酸と二重鎖を形成する。しかしながら、いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基が塩基に置き換えられて１つのミスマッチを生じている参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸と形成される二重鎖よりも高いＴ_mを有する標的核酸と二重鎖を形成する。

【0132】

ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、限定されないが、イノシン、１－β－Ｄ－リボフラノシル－５－ニトロインドール及び／または１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－ニトロピロール（米国特許出願公開第２００７／０２５４３６２号、Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４３６３－４３７０、Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２３６１－２３６６、Ｌｏａｋｅｓ＆Ｂｒｏｗｎ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４０３９－４０４３を参照すること）が挙げられる。

【0133】

ｅ．可逆的修飾

【0134】

標的細胞に到達する前にオリゴヌクレオチドをインビボ環境から保護するための特定の修飾を行うことができるが、これらの修飾は、標的細胞の細胞質ゾルに到達するとオリゴヌクレオチドの効力または活性を低減させる場合がある。分子が細胞の外部で所望の特性を保持するような可逆的修飾であって、その後細胞のサイトゾル環境に進入すると除去される可逆的修飾をなすことができる。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用により、または細胞内部の化学的条件（例えば、細胞内グルタチオンによる還元）により除去することができる。

【0135】

いくつかの実施形態において、可逆的に修飾されたヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド間ジホスフェート連結により生成される負電荷を遮蔽し、細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を向上させるように、環式ジスルフィド部分で化学的に修飾されている。米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６９号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０８８９２０号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１８８１９７号、及びＭｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：１２５６－１２６３を参照すること。ヌクレオチド間ジホスフェート連結のこの可逆的修飾は、サイトゾルの還元環境（例えば、グルタチオン）により細胞内で切断されるように設計されている。より初期の例としては、細胞内部で切断可能であることが報告されていた中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１２５：９４０－９５０を参照すること）。

【0136】

いくつかの実施形態において、そのような可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ及び他の過酷な環境条件（例えば、ｐＨ）に曝されることになるインビボ投与中（例えば、血液及び／または細胞のリソソーム／エンドソーム区画の通過中）の保護を可能にする。グルタチオンのレベルが細胞外空間と比較してより高い細胞のサイトゾルへと放出されると、修飾が元に戻り、結果としてオリゴヌクレオチドが切断される。可逆的なグルタチオン感受性部分を使用すると、不可逆な化学的修飾を使用して利用可能な選択肢と比較して、立体的により大きな化学基を目的のオリゴヌクレオチドに導入することが可能である。これは、そうしたより大きな化学基がサイトゾルで除去されることになり、したがって、細胞のサイトゾル内部でオリゴヌクレオチドの生物学的活性に干渉するはずがないからである。結果として、そうしたより大きな化学基を操作して、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び免疫原性低減などの種々の利点を、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに付与することができる。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分の構造を操作して、その放出の動力学を修飾することができる。

【0137】

いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分は、ヌクレオチドの糖に結合される。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分は、修飾ヌクレオチドの糖の２’炭素に結合される。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’－末端ヌクレオチドである場合、糖の５’－炭素に位置する。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’－末端ヌクレオチドである場合、糖の３’－炭素に位置する。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分は、スルホニル基を含む。例えば、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ（可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む組成物及びその用途）」と題される２０１６年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３７８，６３５号を参照すること。

【0138】

ｖｉ．標的指向性リガンド

【0139】

いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドを、１つ以上の細胞または１つ以上の臓器に対して標的化することが望ましい。そのような戦略を通して、他の臓器における望ましくない影響を回避すること、またはオリゴヌクレオチドが有益ではない細胞、組織、もしくは臓器へのオリゴヌクレオチドの過度の損失を回避することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞、または臓器の標的化及び／または送達を促進するように（例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を促進するように）修飾される。特定の実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進するように修飾される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的指向性リガンド（複数可）に結合されている少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のヌクレオチド）を含む。

【0140】

いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質の一部（例えば、抗体または抗体断片）、または脂質を含む。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、アプタマーである。例えば、標的指向性リガンドは、腫瘍脈管構造もしくは神経膠腫細胞を標的とするために使用されるＲＧＤペプチド、腫瘍脈管構造もしくは小孔（ｓｔｏｍａ）を標的とするためのＣＲＥＫＡペプチド、ＣＮＳ脈管構造上に発現されるトランスフェリン受容体を標的とするためのトランスフェリング（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、ラクトフェリン、もしくはアプタマー、または神経膠腫細胞上のＥＧＦＲを標的とするための抗ＥＧＦＲ抗体であってもよい。特定の実施形態において、標的指向性リガンドは、１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分である。

【0141】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）のヌクレオチドが各々、個別の標的指向性リガンドに結合される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの２個～４個のヌクレオチドが各々、個別の標的指向性リガンドに結合される。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、標的指向性リガンドが歯ブラシの毛の部分に似ており、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに似た格好となるように、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの端部の２～４個のヌクレオチドに結合される（例えば、標的指向性リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’末端のヌクレオチド２個～４個のオーバーハングまたは伸長部分に結合される）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端または３’末端のいずれかにステムループを含んでいてもよく、ステムループの１、２、３、または４個のヌクレオチドは、標的指向性リガンドに個々に結合されていてもよい。いくつかの実施形態において、本開示が提供するオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の３’末端にステムループを含み、ステムループのループは、トリループまたはテトラループを含み、トリループまたはテトラループをそれぞれ構成する３個または４個のヌクレオチドは、個別に標的指向性リガンドに結合される。

【0142】

ＧａｌＮＡｃは、ＡＳＧＰＲの高親和性リガンドであり、ＡＳＧＰＲは、主として肝実質細胞の類洞表面で発現され、末端ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ残基（アシアロ糖タンパク質）を含む循環糖タンパク質との結合、内在化、及びその後の排出に主要な役割を果たす。本開示のオリゴヌクレオチドにＧａｌＮＡｃ部分を結合（間接的または直接的）させて、これらのオリゴヌクレオチドを細胞で発現されるＡＳＧＰＲに標的化することができる。いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分に結合され、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドをヒト肝細胞（例えば、ヒト肝実質細胞）で発現するＡＳＧＰＲに標的化する。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドを肝臓に標的化する。

【0143】

いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは、一価ＧａｌＮＡｃに直接的にまたは間接的に結合される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、複数の一価のＧａｌＮＡｃに直接的または間接的に結合される（すなわち、２、３、または４個の一価のＧａｌＮＡｃ部分に結合され、典型的には３個または４個の一価のＧａｌＮＡｃ部分に結合される）。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の二価のＧａｌＮＡｃ、三価のＧａｌＮＡｃ、または四価のＧａｌＮＡｃ部分に結合される。

【0144】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個）のヌクレオチドが、それぞれＧａｌＮＡｃ部分に結合される。いくつかの実施形態において、テトラループの２～４個のヌクレオチドが、それぞれ個別のＧａｌＮＡｃに結合される。いくつかの実施形態において、トリループの１～３個のヌクレオチドが、それぞれ個別のＧａｌＮＡｃに結合される。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛の部分に似ており、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに似た格好となるように、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの端部の２～４個のヌクレオチドに結合される（例えば、リガンドはセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’末端のヌクレオチド２～４個のオーバーハングまたは伸長部分に結合される）。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドに結合される。例えば、４個のＧａｌＮＡｃ部分をセンス鎖のテトラループ内のヌクレオチドに結合させることができ、その場合、各ＧａｌＮＡｃ部分は１個のヌクレオチドに結合される。

【0145】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、下記に示されるような［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－グアニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、グアニンヌクレオチドに結合された一価のＧａｌＮＡｃを含む。

【化1】

【0146】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、下記に示されるような［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、アデニンヌクレオチドに結合された一価のＧａｌＮＡｃを含む。

【化2】

【0147】

そのような結合の例を、５’から３’方向にヌクレオチド配列ＧＡＡＡを含むループについて下記に示す（Ｌ＝リンカー、Ｘ＝ヘテロ原子）。ステム結合点が示されている。このようなループは、例えば、表５に記載され、かつ図３に示されるセンス鎖の２７～３０位に存在し得る。化学式中、

【化3】

が、オリゴヌクレオチド鎖への結合点を表すために用いられている。

【化4】

【0148】

適当な方法または化学的手法（例えば、クリックケミストリー）を用いて標的指向性リガンドをヌクレオチドに連結することができる。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、アセタールベースのリンカーを用いて標的指向性リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドに結合する。アセタールベースのリンカーは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／１００４０１号に開示される。いくつかの実施形態において、リンカーは、不安定なリンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは安定している。ＧａｌＮＡｃ部分がアセタールリンカーを使用してループのヌクレオチドに結合されている、５’から３’方向にヌクレオチドＧＡＡＡを含むループの例を下記に示す。このようなループは、例えば、表５に記載され、かつ図３に示されるセンス鎖のいずれか１つの２７～３０位に存在し得る。化学式中、

【化5】

は、オリゴヌクレオチド鎖への結合点である。

【化6】

【0149】

上記のように、様々な適当な方法または化学的合成技術（例えば、クリックケミストリー）を用いて標的指向性リガンドをヌクレオチドに連結することができる。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、アセタールベースのリンカーを用いて標的指向性リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドに結合する。アセタールベースのリンカーは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／１００４０１号に開示される。いくつかの実施形態において、リンカーは、不安定なリンカーである。しかしながら、他の実施形態において、リンカーは安定したリンカーである。

【0150】

いくつかの実施形態において、二重鎖伸長部分（例えば、長さが最大ｂｐ３個、４個、５個、または６個）が、標的指向性リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）とｄｓオリゴヌクレオチドとの間に配置される。いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、それに結合されたＧａｌＮＡｃを有さない。

【0151】

ＩＩＩ．製剤

【0152】

オリゴヌクレオチドの使用を促進するための種々の製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限に抑え、送達及び／または取り込みを促進し、または製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を与える製剤を使用して対象または細胞環境に送達することができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシド中に配合される。

【0153】

カチオン性脂質を含むオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、細胞内へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを促進することができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン）などのカチオン性脂質を使用することができる。好適な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられ、これらはいずれも製造元の指示に従って使用することができる。

【0154】

したがって、いくつかの実施形態において、製剤は脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を含むか、または投与を要する対象の細胞、組織、臓器、もしくは身体に投与するための他の形で配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１３を参照すること）。

【0155】

いくつかの実施形態において、本明細書の製剤は、賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、賦形剤は、活性成分の改善された安定性、改善された吸収性、改善された溶解性及び／または治療増強効果を組成物に付与する。いくつかの実施形態において、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、または水酸化ナトリウム）、または溶媒（例えば、緩衝液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、または鉱油）である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その貯蔵寿命を延ばすために凍結乾燥された後、使用（例えば、対象への投与）に先立って溶液とされる。したがって、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つを含む組成物中の賦形剤は、凍結乾燥保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、またはポリビニルピロリドン）、または崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）、またはゼラチン）とすることができる。

【0156】

本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように配合される。投与経路としては、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜、及び直腸内投与が挙げられる。

【0157】

注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与用では、適当な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または散媒であり得る。多くの場合、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に加えることが好ましい。必要な量のオリゴヌクレオチドを選択された溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに加えた後、滅菌濾過を行うことによって滅菌注射液を調製することができる。

【0158】

いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも約０．１％以上の治療剤を含み得るが、活性成分（複数可）のパーセンテージは、全組成物の重量または体積の約１％～約８０％とすることができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間、及び他の薬理学的考慮事項などの要因は、かかる医薬製剤の調製の分野における当業者によって企図されるものであり、したがって、様々な投与量及び治療レジメンが望ましい場合がある。

【0159】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドのいずれかの肝臓標的送達を対象としているが、他の組織の標的化も企図される。

【0160】

ＩＶ．使用方法

【0161】

ｉ．細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３発現の低減

【0162】

本開示により、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるために、有効量の本明細書のオリゴヌクレオチドのいずれか１つを細胞または細胞集団に接触または送達するための方法が提供される。これらの方法は、本明細書に記載のステップを含むことができ、これらは、記載された順序で実行されてもよいが、必ずしもそうである必要はない。しかしながら、他の順序もあり得る。さらに、個別または複数のステップは並行して実行してもよく、及び／または時間的に重なり合って実行してもよく、及び／または個別または複数回繰り返されるステップであってもよい。さらに、これらの方法は、追加の不特定のステップを含んでもよい。

【0163】

本明細書の方法は、任意の適当な細胞タイプで有用である。いくつかの実施形態において、細胞は、ｍＲＮＡを発現するあらゆる細胞である（例えば、肝実質細胞、マクロファージ、単球由来細胞、前立腺癌細胞、脳細胞、内分泌組織、骨髄、リンパ節、肺、胆嚢、肝臓、十二指腸、小腸、膵臓、腎臓、胃腸管、膀胱、脂肪及び軟組織及び皮膚）。いくつかの実施形態において、細胞は、対象から得られた初代細胞である。いくつかの実施形態において、初代細胞は、限られた数の継代を行っており、それにより、細胞は天然の表現型特性を実質的に維持している。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、エクスビボまたはインビトロである（すなわち、培養中の細胞または細胞が存在する生物に送達され得る）。

【0164】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドは、限定されないが、オリゴヌクレオチドを含む溶液の注入、オリゴヌクレオチドで被覆した粒子によるボンバードメント、オリゴヌクレオチドを含む溶液への細胞または細胞集団の露出、またはオリゴヌクレオチドの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む適当な核酸送達方法を使用して送達する。例えば、脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、及びリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどの、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための他の適当な方法を使用することもできる。

【0165】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低減は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する細胞または細胞集団の１つ以上の特性または特徴を評価するための適切なアッセイまたは技術によって（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の発現バイオマーカーを使用して）、またはＡＮＧＰＴＬ３の発現を直接的に示す分子（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡまたはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質）を評価するアッセイまたは技術によって判定され得る。いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドがＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させる程度は、オリゴヌクレオチドと接触した細胞または細胞集団におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現と、適当な対照（例えば、オリゴヌクレオチドと接触していない適切な細胞または細胞集団、または対照オリゴヌクレオチドと接触した適当な細胞または細胞集団）とを比較することによって評価される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ分子の送達後、タンパク質におけるｍＲＮＡ発現の適当な対照レベルを所定のレベルまたは値とすることで、対照レベルを毎回測定する必要がなくなる。所定のレベルまたは値は、様々な形態のものとすることができる。いくつかの実施形態において、所定のレベルまたは値は、中央値または平均などの単一のカットオフ値とすることができる。

【0166】

いくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチドの投与は、細胞内または細胞集団内のＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させる。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低減は、ｍＲＮＡの適当な対照レベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。適当な対照レベルは、本明細書のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞または細胞集団におけるｍＲＮＡの発現及び／またはタンパク質翻訳のレベルとすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書の方法による細胞へのオリゴヌクレオチドの送達の効果は、一定期間の後に評価される。例えば、細胞内のｍＲＮＡのレベルは、細胞内へのオリゴヌクレオチドの導入の少なくとも約８時間、約１２時間、約１８時間、または約２４時間後、または、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、もしくは最長１４日後にも分析することができる。

【0167】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、細胞内でオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（例えば、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖）を含む鎖を発現させるように操作された導入遺伝子の形態で送達される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本明細書で開示される任意のオリゴヌクレオチドを発現するように操作されている導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルス）または非ウイルスベクター（例えば、プラスミドまたは合成ｍＲＮＡ）を使用して送達することができる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子を対象に直接注射することができる。

【0168】

ｉｉ．医療的使用

【0169】

本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させることから利益を受けると思われる対象（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有するヒト）を治療するために使用する、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドも提供する。いくつかの点において、本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害または状態を有する対象を治療するために使用する、または使用に適合するオリゴヌクレオチドを提供する。本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を治療するための薬物または医薬組成物の製造における使用、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドは、（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを標的とし、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させる。いくつかの実施形態において、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを標的とし、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、及び／またはＡＮＧＰＴＬ３活性の量もしくはレベルを低減させるための使用、または使用に適合可能である。

【0170】

さらに、以下の方法は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有するか、またはこれらの素因がある対象を選択することを含み得る。場合によっては、この方法は、ＴＧまたはコレステロールの上昇（または変化したＬＰＬ及び／またはＥＬ活性）などのＡＮＧＰＴＬ３の発現のマーカーを有するか、またはこれらの素因がある個体を選択することを含み得る。

【0171】

また、このようにして、以下に詳述するように、この方法は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現のマーカーのベースライン値を測定または取得するなどのステップと、その後、そのように取得した値を１つ以上の他のベースライン値またはオリゴヌクレオチドを投与した後に得られる値と比較し、治療の有効性を評価するステップとを含み得る。

【0172】

ｉｉｉ．治療方法

【0173】

本開示は、本明細書のオリゴヌクレオチドを用いて、疾患、障害、または状態を有するか、有することが疑われるか、または発症する危険性がある対象を治療する方法も提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書のオリゴヌクレオチドを用いて、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態の発症または進行を治療または軽減する方法を提供する。他の態様において、本開示は、本明細書のオリゴヌクレオチドを用いて、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象において１つ以上の治療効果を達成する方法を提供する。本明細書の方法のいくつかの実施形態において、対象は、本明細書のオリゴヌクレオチドのいずれか１つ以上を治療有効量で投与することによって治療される。いくつかの実施形態において、治療は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させることを含む。いくつかの実施形態において、対象は治療的に処置を受ける。いくつかの実施形態において、対象は予防的に処置を受ける。

【0174】

この方法のいくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減することで、対象が治療されるように、対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量またはレベルが対象において低減する。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量またはレベルが対象において低減する。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の活性の量またはレベルが対象において低減する。いくつかの実施形態において、トリグリセリド（ＴＧ）の量またはレベル（例えば、１つ以上のＴＧまたは総合ＴＧ）が対象において低減する。いくつかの実施形態において、対象におけるコレステロール（例えば、総合コレステロール、ＬＤＬコレステロール、及び／またはＨＤＬコレステロール）の量またはレベルが低減する。いくつかの実施形態において、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの量またはレベルが対象において低減する。いくつかの実施形態において、ＬＰＬの量または活性は、対象において変化する。いくつかの実施形態において、ＥＬの量または活性が対象において変化する。いくつかの実施形態において、以下の任意の組み合わせが対象において低減または変化する：ＡＮＧＰＴＬ３の発現、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量またはレベル、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量またはレベル、ＡＮＧＰＴＬ３活性の量またはレベル、ＴＧの量またはレベル、コレステロールの量またはレベル、及び／またはＬＰＬ及び／またはＥＬの量または活性。

【0175】

本明細書の方法のいくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現が、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＡＮＧＰＴＬ３の発現と比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減するように、対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現は、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受ける対象（例えば、参照対象または対照対象）におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現と比較すると、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減する。

【0176】

本明細書の方法のいくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減するように、対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受ける対象（例えば、参照対象または対照対象）におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量またはレベルと比較すると、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減する。

【0177】

本明細書の方法のいくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量またはレベルと比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減するように、対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量またはレベルは、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受ける対象（例えば、参照対象または対照対象）におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量またはレベルと比較すると、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減する。

【0178】

本明細書の方法のいくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の活性または発現が、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＡＮＧＰＴＬ３の活性の量またはレベルと比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減するように、対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の活性の量またはレベルは、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受ける対象（例えば、参照対象または対照対象）におけるＡＮＧＰＴＬ３の活性の量またはレベルと比較すると、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減する。

【0179】

本明細書の方法のいくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるＴＧ（例えば、１つ以上のＴＧまたは総合ＴＧ）の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＴＧの量またはレベルと比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減するように、対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＴＧの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受ける対象（例えば、参照対象または対照対象）におけるＴＧの量またはレベルと比較すると、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減する。

【0180】

一般に、ヒト対象の正常または望ましいＴＧ範囲は、＜１００ｍｇ／ｄＬが理想的である場合、血液の＜１５０ｍｇ／ｄＬである。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象は、≧１５０ｍｇ／ｄＬのＴＧの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象は、高いＴＧレベルの境界線であると見なされる１５０ｍｇ／ｄＬ～１９９ｍｇ／ｄＬの範囲のＴＧの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象は、高いＴＧレベルと見なされる２００ｍｇ／ｄＬ～４９９ｍｇ／ｄＬの範囲のＴＧの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象は、非常に高いＴＧレベルと見なされる５００ｍｇ／ｄＬ以上（すなわち、≧５００ｍｇ／ｄＬ）の範囲のＴＧの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象は、≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧２００ｍｇ／ｄＬ、または≧５００ｍｇ／ｄＬのＴＧの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象は、２００ｍｇ／ｄＬ～４９９ｍｇ／ｄＬ、または５００ｍｇ／ｄＬ以上のＴＧの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される患者または治療される患者は、≧２００ｍｇ／ｄＬのＴＧの量またはレベルを有することが特定または判定される。

【0181】

本明細書の方法のいくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるコレステロール（例えば、総合コレステロール、ＬＤＬコレステロール、及び／またはＨＤＬコレステロール）の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のコレステロールの量またはレベルと比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減するように、対象に投与される。いくつかの実施形態において、コレステロールの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受ける対象（例えば、参照対象または対照対象）におけるコレステロールの量またはレベルと比較すると、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減する。

【0182】

一般に、成人のヒト患者の正常または望ましいコレステロールの範囲（総合コレステロール）は、血液中に＜２００ｍｇ／ｄＬである。いくつかの実施形態において、治療のために選択される患者または治療される患者としては、≧２００ｍｇ／ｄＬのコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される患者または治療される患者としては、高コレステロールレベルの境界線であると見なされる２００ｍｇ／ｄＬ～２３９ｍｇ／ｄＬの範囲のコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される患者または治療される患者としては、高コレステロールレベルと見なされる２４０ｍｇ／ｄＬ以上（すなわち、≧２４０ｍｇ／ｄＬ）の範囲のコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される患者または治療される患者としては、２００ｍｇ／ｄＬ～２３９ｍｇ／ｄＬ、または２４０ｍｇ／ｄＬ以上のコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される患者または治療される患者としては、≧２００ｍｇ／ｄＬまたは≧２４０ｍｇ／ｄＬ以上のコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。

【0183】

本明細書の方法のいくつかの実施形態において、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるＬＤＬコレステロールの量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＬＤＬコレステロールの量またはレベルと比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減するように、対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＬＤＬコレステロールの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象（例えば、参照対象または対照対象）、または対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受ける対象におけるＬＤＬコレステロールの量またはレベルと比較すると、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減する。

【0184】

一般に、成人のヒト対象の正常または望ましいＬＤＬコレステロールの範囲は、血液中に＜１００ｍｇ／ｄＬである。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象としては、≧１００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象としては、最適を上回ると見なされる１００ｍｇ／ｄＬ～１２９ｍｇ／ｄＬの範囲のＬＤＬコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象としては、高レベルの境界線であると見なされる１３０ｍｇ／ｄＬ～１５９ｍｇ／ｄＬの範囲のＬＤＬコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象としては、高ＬＤＬコレステロールレベルと見なされる１６０ｍｇ／ｄＬ～１８９ｍｇ／ｄＬの範囲のＬＤＬコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象としては、非常に高いＬＤＬコレステロールレベルと見なされる１９０ｍｇ／ｄＬ以上（すなわち、≧１９０ｍｇ／ｄＬ）の範囲のＬＤＬコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象としては、≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、または≧１９０ｍｇ／ｄＬ以上、好ましくは、≧１６０ｍｇ／ｄＬまたは≧１９０ｍｇ／ｄＬ以上のＬＤＬコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。いくつかの実施形態において、治療のために選択される対象または治療される対象としては、１００ｍｇ／ｄＬ～１２９ｍｇ／ｄＬ、１３０ｍｇ／ｄＬ～１５９ｍｇ／ｄＬ、１６０ｍｇ／ｄＬ～１８９ｍｇ／ｄＬ、または１９０ｍｇ／ｄＬ以上のＬＤＬコレステロールの量またはレベルを有することが特定または判定される。

【0185】

対象または対象から得られる試料におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、ＡＮＧＰＴＬ３活性、ＴＧ、及び／またはＬＤＬコレステロールの量またはレベル、ＬＰＬ及び／またはＥＬの量または活性を判定する好適な方法は、当該技術分野で知られている。さらに、本明細書に記載の実施例は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を判定する方法を例示する。

【0186】

いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、ＡＮＧＰＴＬ３活性、ＴＧ、ＬＤＬコレステロール、ＬＰＬタンパク質、ＬＰＬ活性、ＥＬタンパク質、ＥＬ活性、またはそれらの任意の組み合わせの量またはレベルが、細胞（例えば、肝実質細胞）で低減し、細胞集団またはグループ（例えば、オルガノイド）で低減し、臓器（例えば、肝臓）で低減し、血液またはその画分（例えば、血漿）で低減し、組織（例えば、肝臓組織）で低減し、試料（例えば、肝生検試料）、または対象から取得または分離されるその他の適切な生物学的材料で低減する。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、ＡＮＧＰＴＬ３活性、ＴＧ、ＬＤＬコレステロール、ＬＰＬタンパク質、ＬＰＬ活性、ＥＬタンパク質、ＥＬ活性、またはそれらの任意の組み合わせの量またはレベルが、２種以上の細胞（例えば、肝実質細胞及び１つ以上の他の種の細胞）で低減し、複数の細胞グループで低減し、複数の臓器（例えば、肝臓及び１つ以上の他の臓器）で低減し、血液の複数の画分（例えば、血漿及び１つ以上の他の血液画分）で低減し、複数種の組織（例えば、肝臓組織及び１つ以上の他の種の組織）で低減し、複数種の分離された試料（例えば、肝生検試料及び１つ以上の他の種の生検試料）などで低減する。

【0187】

ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態の例としては、限定されないが、高トリグリセリド血症、肥満、高脂血症、脂質異常症及び／またはコレステロール代謝障害、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、心血管疾患、慢性腎臓病、冠動脈疾患、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、ホモ接合体及びヘテロ接合体の家族性高コレステロール血症、スタチン耐性高コレステロール血症、及びその他のＡＮＧＰＴＬ３関連の代謝関連障害及び疾患が挙げられる。本明細書における特に興味深い点は、心血管疾患、Ｔ２Ｄ、高トリグリセリド血症、ＮＡＳＨ、肥満、またはそれらの組み合わせである。

【0188】

それらの高い特異性のために、本明細書のオリゴヌクレオチドは、疾患細胞及び組織の標的遺伝子のｍＲＮＡを特異的に標的とする。疾患の予防において、標的遺伝子は、疾患の発症または維持に必要なもの、または疾患に罹患するより高いリスクに関連することが確認されているものであり得る。疾患の治療において、オリゴヌクレオチドを疾患を示す細胞または組織と接触させることができる。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する障害または状態に関連する野生型（すなわち、ネイティブ）または変異遺伝子の全部または一部と実質的に同一のオリゴヌクレオチドを、肝実質細胞やその他の肝細胞などの目的の細胞または組織型と接触させるか、またはそれらに導入してもよい。

【0189】

いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ヒトなどの任意の哺乳動物由来の標的遺伝子であり得る。本明細書に記載の方法によって、任意の遺伝子をサイレンシングすることができる。

【0190】

本明細書に記載される方法は、典型的には、オリゴヌクレオチドを有効量、すなわち、望ましい治療結果を生じることができる量で対象に投与することを含む。治療上許容される量は、疾患または障害を治療することが可能な量であり得る。任意の１人の対象に対する適当な投与量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の活性成分（複数可）、投与の時間及び経路、一般的な健康状態、及び同時に投与されている他の薬剤を含む特定の因子に応じて決められる。

【0191】

いくつかの実施形態において、本明細書中の組成物のいずれか１つを、経腸的に（例えば、経口、胃栄養チューブによって、十二指腸栄養チューブによって、胃瘻を介して、または直腸に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射または注入、動脈内注射または注入、骨内注入、筋肉内注射、脳内注射、脳室内注射、髄腔内注射）、局所的に（例えば、経皮、吸入、点眼、または粘膜を介して）、または標的臓器への直接注射（例えば、対象の肝臓）することによって、対象に投与する。典型的には、本明細書のオリゴヌクレオチドは、静脈内にまたは皮下に投与される。

【0192】

非限定的の一組の例として、本開示のオリゴヌクレオチドは、通常、四半期ごと（３ヶ月に１回）、隔月（２ヶ月に１回）、毎月、または毎週投与される。例えば、オリゴヌクレオチドは、毎週、または２週または３週ごとに１回に投与されてもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドを毎日投与されてもよい。いくつかの実施形態において、対象には、オリゴヌクレオチドの１回以上の負荷用量で、それに続く、オリゴヌクレオチドの１回以上の維持用量で投与される。

【0193】

いくつかの実施形態において、治療される対象は、ヒトまたは非ヒト霊長類または他の哺乳動物の対象である。他の例示的な対象としては、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜、並びにマウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの動物が挙げられる。

【0194】

Ｖ．キット

【0195】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書のオリゴヌクレオチドを含むキット及び使用説明書を提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書のオリゴヌクレオチドと、キットの使用説明書を含む添付文書と、及び／またはその任意の構成要素を含む。いくつかの実施形態において、キットは、好適な容器内に、本明細書のオリゴヌクレオチド、１つ以上の対照物、並びに様々な緩衝剤、試薬、酵素、及び当該技術分野で周知の他の標準的な構成要素を含む。いくつかの実施形態において、上記容器は、オリゴヌクレオチドを投入し、場合によっては、適切に分注する、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはその他の容器手段を含む。追加の構成要素を提供するいくつかの実施形態においては、キットは、この構成要素が配置される追加の容器を含む。また、キットは、オリゴヌクレオチド及び任意の他の試薬を商業販売のために厳重に封じ込めるための手段を含む。このような容器は、所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形のプラスチック容器を含み得る。容器及び／またはキットは、使用説明及び／または警告を載せたラベルを含み得る。

【0196】

いくつかの実施形態においては、キットは、本明細書のオリゴヌクレオチド及び医薬的に許容可能な担体、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、及びＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する疾患、障害、または状態の治療またはその進行の遅延を必要とする対象においてそれを行うための説明書を含む。

【実施例】

【0197】

本開示は、以下の実施例に示される特定の実施形態を参照して説明してきたが、当業者は、本開示の真の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われてもよく、均等物が置き換えられてもよいことを理解されたい。さらに、以下の実施例は、例証目的で提示されることにすぎず、決して本開示の範囲を限定するように意図されていない。また、特定の状態、材料、物質の組成、プロセス、単数または複数のプロセスステップを、本開示の目的、主旨、及び範囲に適応させるために、変形させてもよい。全てのそのような変形は、本開示の範囲内であることを意図する。当該技術分野で周知の標準的な技術、または以下に具体的に説明する技術を利用する。

【0198】

実施例１：二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの調製

【0199】

オリゴヌクレオチド合成及び精製

【0200】

前述の実施例に記載のｄｓ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の方法を使用して化学合成される。一般に、ｄｓ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１９ｍｅｒ～２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡについて説明した固相オリゴヌクレオチド合成法を使用して合成される（例えば、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５４３３－５４４１、及びＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０９：７８４５－７８４５を参照すること。また、米国特許第５，８０４，６８３号、米国特許第５，８３１，０７１号、米国特許第５，９９８，２０３号、米国特許第６，００８，４００号、米国特許第６，１１１，０８６号、米国特許第６，１１７，６５７号、米国特許第６，３５３，０９８号、米国特許第６，３６２，３２３号、米国特許第６，４３７，１１７号、及び米国特許第６，４６９，１５８号を参照すること）。

【0201】

標準方法（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に従って、個々のＲＮＡ鎖を合成してＨＰＬＣ精製する。例えば、固相ホスホラミダイト化学反応を使用してＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護し、標準技法（Ｄａｍｈａ＆Ｏｌｇｉｖｉｅ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２０：８１－１１４、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７－２６８４）を使用してＮＡＰ－５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で脱塩する。１５分間の段階的線形勾配を使用したＡｍｅｒｓｈａｍ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上でイオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＩＥ－ＨＰＬＣ）を使用して、オリゴマーを精製する。勾配を９０：１０緩衝剤Ａ：Ｂから５２：４８緩衝剤Ａ：Ｂに変化させる。ここで、緩衝剤Ａは、ｐＨ８．５の１００ｍＭ Ｔｒｉｓであり、緩衝剤Ｂは、ｐＨ８．５の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＮａＣｌである。試料を２６０ｎｍで監視し、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを収集し、プールし、ＮＡＰ－５カラム上で脱塩し、凍結乾燥させる。

【0202】

Ｂｅｃｋｍａｎ ＰＡＣＥ ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）上のキャピラリ電気泳動（ＣＥ）によって、各オリゴマーの純度を判定する。ＣＥキャピラリは、１００μｍ内径を有し、ｓｓＤＮＡ １００Ｒ Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含有する。典型的には、約０．６ｎｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドが、キャピラリに注入され、４４４Ｖ／ｃｍの電場で流され、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって検出される。変性Ｔｒｉｓ－ホウ酸塩－７Ｍ－尿素流動緩衝剤をＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒから購入する。以下で説明される実験で使用するためにＣＥによって評価されるように、少なくとも９０％純粋であるオリゴリボヌクレオチドが得られる。化合物同一性は、製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ（商標）Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分光法によって検証される。しばしば期待分子量の０．２％以内で、全てのオリゴマーの相対分子量が得られる。

【0203】

二重鎖の調製

【0204】

例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５からなる二重緩衝剤中で（例えば、１００μＭ濃度において）ｓｓＲＮＡオリゴマーを再懸濁させる。相補的なセンス及びアンチセンス鎖を等モル量で混合して、例えば、５０μＭ二重鎖の最終溶液を得る。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中で５分間１００℃まで加熱し、使用前に室温まで冷却する。ｄｓ ＲＮＡ オリゴヌクレオチドは、－２０℃で保存される。ｓｓ ＲＮＡオリゴマーは、凍結乾燥またはヌクレアーゼを含まない水中で、－８０℃で保存される。

【0205】

実施例２：ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによるインビトロでのＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害

【0206】

ＡＮＧＰＴＬ３標的配列の同定

【0207】

ＡＮＧＰＴＬ３の発現のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害剤を同定するために、コンピュータベースのアルゴリズムを使用して、ＲＮＡｉ経路によるＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害をアッセイするのに適したＡＮＧＰＴＬ３標的配列をコンピュータで生成する。アルゴリズムは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの好適なＡＮＧＰＴＬ３標的配列（例えば、配列番号１２８、表１）に相補的なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドガイド鎖配列を提供する。ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの例示的な標的配列を表２に示す。アルゴリズムによって同定されたガイド鎖配列の一部は、対応するサルのＡＮＧＰＴＬ３標的配列及び／またはマウスＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ（それぞれ配列番号１２９及び１３０、表１）にも相補的である。それぞれがアルゴリズムによって同定されたＡＮＧＰＴＬ３標的配列に相補的な領域を有する固有のガイド鎖を有する（ＤｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしてフォーマットされた）３８４種のｄｓ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを生成する。

【0208】

【表1】

【0209】

【表2】

【0210】

インビトロ細胞ベースのアッセイ

【0211】

上記の３８４種ＤｓｉＲＮＡのそれぞれがＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する能力は、インビトロ細胞ベースのアッセイを使用して決定される。簡単に言えば、ＡＮＧＰＴＬ３ を安定して発現するＨｕＨ－７ヒト肝細胞を、マルチウェル細胞培養プレートの別々のウェルで各ＤｓｉＲＮＡ（０．５ｎＭ）でトランスフェクトする。細胞は、トランスフェクトした後に２４時間維持された後、トランスフェクトされた細胞からの残りのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのレベルは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ベースのｑＰＣＲアッセイを使用して判定される。２つのｑＰＣＲアッセイ、３’アッセイ及び５’アッセイを使用し、それぞれＨＥＸ及びＦＡＭプローブによって測定されるｍＲＮＡレベルを判定する。

【0212】

３８４種のＤｓｉＲＮＡを用いたＨｕＨ－７細胞ベースのアッセイの結果を図１及び図２に示す。図１は、ヒト、サル及びマウスのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ（「三種共通」）に相補的なガイド鎖を有する１０９種のＤｓｉＲＮＡを用いたＨｕＨ－７細胞ベースのアッセイの結果を示す。陰性対照と比較して、細胞内に３５％以下のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが残存する三種共通ＤｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、ＡＮＧＰＴＬ３の発現阻害剤（本明細書では「ヒット」と呼ぶ）の候補と見なされる。図２は、ヒト及びサルのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ（「ヒト－サル」）に相補的なガイド鎖を有する２７５種のＤｓｉＲＮＡを用いたＨｕＨ－７細胞ベースのアッセイの結果を示す。陰性対照と比較して、残りのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが３０％以下になるヒト－サルＤｓｉＲＮＡもヒットと見なされる。図１及び図２に、残存するｍＲＮＡのパーセントをそれぞれ３’アッセイ（円形状）及び５’アッセイ（ダイヤモンド形状）で示す。

【0213】

これらの結果は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを標的とするように設計されたＤｓｉＲＮＡが細胞内のＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害すること（ＤｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量の減少によって判定される）、及びＤｓｉＲＮＡヒットを含むヌクレオチド配列がＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの生成に有用であることを示す。さらに、これらの結果は、複数のＡＮＧＰＴＬ３標的配列がＡＮＧＰＴＬ３の発現のＲＮＡｉ媒介阻害に好適であることを示す。

【0214】

実施例３：ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによるインビボでのＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害

【0215】

実施例２に記載のＨｕＨ－７細胞ベースのアッセイでスクリーニングされた３８４種のＤｓｉＲＮＡのうち、５５種のＤｓｉＲＮＡヒットのヌクレオチド配列（表３）がインビボでのさらなる評価のために選択される。簡単に言えば、５５種の選択されたＤｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を使用して、３６－ｍｅｒパッセンジャー鎖及び２２－ｍｅｒガイド鎖を有するニック化テトラループＧａｌＮＡｃ結合構造（本明細書では「ＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチド」と呼ぶ）を含む５５種の対応する二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを生成する。さらに、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドのパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含むヌクレオチド配列は、修飾ヌクレオチド及びホスホロチオエート結合の明確なパターンを有する（例えば、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドの一般構造及び化学修飾パターンの概略図である図３を参照すること）。テトラループを含む３つのアデノシンヌクレオチドは、それぞれＧａｌＮＡｃ部分に結合する。（ＣＡＳ番号：１４１３１－６０－３）。

【0216】

【表3-1】

【表3-2】

【0217】

マウス研究

【0218】

表３に示すＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドは、肝実質細胞でヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを一時的に発現するように操作されたマウスで評価される。３つのＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチド（ＡＮＧＰＴＬ３－０２０４－Ｍ２、ＡＮＧＰＴＬ３－０３２７－Ｍ２、及びＡＮＧＰＴＬ３－１３２７－Ｍ２）は、ベンチマーク対照として使用される。簡単に言えば、６～８週齢のメスのＣＤ－１マウスを、用量レベルが１ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドで皮下処置する。３日後（７２時間）、ユビキタスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列の制御下で完全なヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドをマウスに流体力学的に注入する。プラスミド導入の１日後、肝臓試料を採取する。これらのマウスに由来する全ＲＮＡを、同量のＰＢＳのみで処理したマウスと比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行う。値は、プラスミドに含まれるＮｅｏＲ遺伝子を使用し、トランスフェクション効率に対して正規化する。

【0219】

図４に示すように、ＰＢＳで処理したマウスと比較してオリゴヌクレオチド処理マウスから得た肝臓試料中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量が減少することによって判定されるように、試験した全てのＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドはＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する。ＰＢＳで処理したマウスに対するベンチマークＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドＡＮＧＰＴＬ３－０３２７で処理したマウスの肝臓試料中の残りのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの平均％を黒棒で示す。図４は、試験した５５種のＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドのうちの２６種が、ベンチマークＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドＡＮＧＰＴＬ３－０３２７よりも大幅にＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害することを示す。これらの結果に基づいて、図４に矢印で示し、表４に記載した５５種のＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドのうちの１０種がＮＨＰにおけるＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する能力を評価するために選択される。表４に示す１０種のＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドは、図３に記載されたパターンＭ１またはＭ２のいずれかを有する化学修飾ヌクレオチドを含む。

【0220】

【表4】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【表5-6】

【表5-7】

【表5-8】

【表5-9】

【表5-10】

【表5-11】

【表5-12】

【表5-13】

【表5-14】

【表5-15】

【表5-16】

【表5-17】

【表5-18】

【表5-19】

【表5-20】

表Ａの修飾パターンにおいて、
「Ｍ」は、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを指す。
「Ｆ」は、２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを指す。
「Ｓ」は、３’－ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを指す。
「｛ＭＳ｝」は、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを指す。
「｛ＦＳ｝」は、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを指す。
「［ａｄｅｍ－ＧａｌＮＡｃ］」は、２’－ＧａｌＮＡｃ結合を有するヌクレオチドを指す。

【化7】

「｛Ｐｘ－ＭＳ｝」は、３’－ホスホロチオエート結合及び５’ホスホネートを有する２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを指す。
表Ａの修飾配列において、
「ｍＮ」は、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを指す。
「［ｆＮ］」は、２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを指す。
「［ｍＮｓ］」は、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを指す。
「［ｆＮｓ］」は、３’－ホスホロチオエート結合を有する２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを指す。
「［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］」は、２’－ＧａｌＮＡｃ結合を有するＧヌクレオチドを指す。

【化8】

「［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］」は、２’－ＧａｌＮＡｃ結合を有するＡヌクレオチドを指す。

【化9】

「［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ］」は、３’－ホスホロチオエート結合を有する５’－ホスホネート－４’－オキシ－２’－ＯＭｅウリジンを指す。

【化10】

【0221】

非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究

【0222】

表４に示すＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で評価する。この研究では、平均体重（約５．４ｋｇ）が対照群と実験群の間で同等であるように、ＮＨＰをグループ化する。各コホートには、２人の男性対象と３人の女性対象が含まれる。ＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドを試験０日目に皮下投与する。試験－８日目、－５日目、及び０日目、並びに投与後毎週、血液試料を採取する。超音波ガイド下コアニードル肝生検は、試験２８日目、５６日目、及び８４日目に収集される。各時点で、肝生検試料に由来する全ＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲ分析し、同等の量のＰＢＳで処理したＮＨＰと比較して、オリゴヌクレオチド処理したＮＨＰのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを測定する。データを正規化するために、測定値は、２つの参照遺伝子、ＰＰＩＢ、及び１８Ｓ ｒＲＮＡの幾何平均に対して行われる。図５Ａ（２８日目）、図５Ｂ（５６日目）、及び図５Ｃ（８４日目）に示すように、ＰＢＳで処理したＮＨＰと比較してオリゴヌクレオチド処理ＮＨＰから得た肝臓試料中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量が減少することによって判定されたように、表４に示したＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドでＮＨＰを処理すると、肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する。処理されたＮＨＰの肝臓試料におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの平均パーセント減少は、各処理群のデータポイントのセットの上に示され、経時的な平均値のプロットを図６に示す。評価した全ての時点で、ＡＮＧＰＴＬ３－１４１２は、ベンチマークのＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドＡＮＧＰＴＬ３－０３２７よりも大幅にＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する。また、同ＮＨＰ研究から、ＥＬＩＳＡにより、投与前及び毎週の血液試料から調製した血清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を測定することでＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害を判定する。図７に示すように、ＰＢＳで処理したＮＨＰと比較して、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドで処理したＮＨＰでは、血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の有意な減少が観察される。投与前の３つの試料の値を平均して１００％に設定し、投与前の平均と比較した相対値としてデータを報告する。まとめると、これらの結果は、ＮＨＰをＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドで処理すると、肝臓内のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量が低減し、同時に血清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量が低減することを示す。

【0223】

まとめると、これらの結果は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを標的とするように設計されたＧａｌＮＡｃ結合ＡＮＧＰＴＬ３オリゴヌクレオチドは、インビボでＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害することを示す（処理された動物におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ及びＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量の低減によって判定される）。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、及び１１６のいずれか１つに記載される配列を含むアンチセンス鎖を含む、前記オリゴヌクレオチド。
〔２〕配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載される配列を含むセンス鎖を含む、前記〔１〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３〕前記アンチセンス鎖が、配列番号１００、１０２、１０４、２０、２６、５０、７２、７４、７６、８０、及び１１４のいずれか１つに記載される配列を含む、前記〔１〕または〔２〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔４〕前記センス鎖が、配列番号９９、１０１、１０３、１９、２５、４９、７１、７３、７５、７９、及び１１３のいずれか１つに記載される配列を含む、前記〔２〕または〔３〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔５〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、長さが１５～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖及び長さが１５～４０個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１２５、１２６、１２７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、及び１１７のいずれか１つに記載される、ＡＮＧＰＴＬ３の標的配列に対する相補的な領域を有し、前記相補的な領域は、長さが少なくとも１５個の連続ヌクレオチドである、前記オリゴヌクレオチド。
〔６〕前記相補的な領域が、前記ＡＮＧＰＴＬ３の標的配列に対して完全に相補的である、前記〔５〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔７〕前記アンチセンス鎖は、長さが１９～２７個のヌクレオチドである、前記〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔８〕前記アンチセンス鎖は、長さが２１～２７個のヌクレオチドであり、場合によって、前記アンチセンス鎖は、長さが２２個のヌクレオチドである、前記〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔９〕前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する、前記〔２〕～〔８〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１０〕前記センス鎖は、長さが１９～４０個のヌクレオチドであり、場合によって、前記センス鎖は、長さが３６個のヌクレオチドである、前記〔９〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１１〕前記二重鎖領域は、長さが少なくとも１９個のヌクレオチドである、前記〔９〕または〔１０〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１２〕前記二重鎖領域は、長さが少なくとも２１個のヌクレオチドであり、場合によって、前記二重鎖領域は、長さが２０個のヌクレオチドである、前記〔９〕～〔１１〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１３〕前記ＡＮＧＰＴＬ３に対する相補的な領域は、長さが少なくとも１９個の連続ヌクレオチドである、前記〔５〕～〔１２〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１４〕前記ＡＮＧＰＴＬ３に対する相補的な領域は、長さが少なくとも２１個の連続ヌクレオチドである、前記〔５〕～〔１３〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１５〕前記アンチセンス鎖が、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、及び１１６のいずれか１つに記載される配列を含む、前記〔５〕～〔１４〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１６〕前記センス鎖が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載される配列を含む、前記〔５〕～〔１５〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１７〕前記アンチセンス鎖が、配列番号１００、１０２、１０４、２０、２６、５０、７２、７４、７６、８０、及び１１４のいずれか１つに記載される配列を含む、前記〔５〕～〔１６〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１８〕前記センス鎖が、配列番号９９、１０１、１０３、１９、２５、４９、７１、７３、７５、７９、及び１１３のいずれか１つに記載される配列を含む、前記〔５〕～〔１７〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔１９〕前記センス鎖は、３’末端にＳ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含み、Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３個～５個のヌクレオチドのループを形成する、前記〔２〕～〔１８〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔２０〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖は、長さが２１個～２７個のヌクレオチドであり、かつＡＮＧＰＴＬ３に対する相補的な領域を有し、前記センス鎖は、３’末端にＳ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含み、Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３個～５個ヌクレオチドのループを形成し、
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、長さが少なくとも１９個のヌクレオチドの二重鎖構造を形成するが、それらは共有結合で連結されていない、前記オリゴヌクレオチド。
〔２１〕前記相補的な領域が、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの少なくとも１９個の連続ヌクレオチドに対して完全に相補的である、前記〔２０〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔２２〕Ｌはテトラループである、前記〔１９〕～〔２１〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔２３〕Ｌは、長さが４個のヌクレオチドである、前記〔１９〕～〔２２〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔２４〕Ｌは、ＧＡＡＡとして記載される配列を含む、前記〔１９〕～〔２３〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔２５〕前記アンチセンス鎖は、長さが２７個のヌクレオチドであり、前記センス鎖は、長さが２５個のヌクレオチドであり、場合によって、前記アンチセンス鎖は、長さが２２個のヌクレオチドであり、前記センス鎖は、長さが３６個のヌクレオチドである、前記〔５〕～〔２４〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔２６〕前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、長さが２５個のヌクレオチドである二重鎖領域、場合によって、前記二重鎖は、長さが２０個のヌクレオチドである、前記〔２５〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔２７〕長さが２個のヌクレオチドの前記アンチセンス鎖に、３’オーバーハング配列を含む、前記〔２０〕～〔２４〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔２８〕前記オリゴヌクレオチドは、長さがそれぞれ２１個～２３個のヌクレオチドの範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、前記〔９〕～〔１８〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔２９〕前記オリゴヌクレオチドは、長さが１９個～２１個のヌクレオチドの範囲である二重鎖構造を有する、前記〔２８〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３０〕前記オリゴヌクレオチドは、長さが１個以上のヌクレオチドの３’オーバーハング配列を含み、前記３’オーバーハング配列は、前記アンチセンス鎖、前記センス鎖、または前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖に存在する、前記〔２８〕または〔２９〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３１〕前記オリゴヌクレオチドは、長さが２個のヌクレオチドの３’オーバーハング配列を含み、前記３’オーバーハング配列は、前記アンチセンス鎖に存在し、前記センス鎖は、長さが２１個のヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は、長さが２３個のヌクレオチドであり、その結果前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、長さが２１個のヌクレオチドの二重鎖を形成する、前記〔２８〕または〔２９〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３２〕前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、先行態様のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３３〕前記修飾ヌクレオチドが、２’修飾を含む、前記〔３２〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３４〕前記２’－修飾は、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、及び２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾である、前記〔３３〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３５〕前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドは、全て修飾されている、前記〔３２〕～〔３４〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３６〕前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を含む、先行態様のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３７〕前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオアート結合である、前記〔３６〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３８〕前記アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの糖の４’－炭素は、リン酸アナログを含む、先行態様のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔３９〕前記リン酸アナログは、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートである、前記〔３８〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔４０〕前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ以上の標的指向性リガンドに結合されている、先行態様のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔４１〕各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、または脂質を含む、前記〔４０〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔４２〕各標的指向性リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む、前記〔４０〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔４３〕前記ＧａｌＮａｃ部分は、一価のＧａｌＮＡｃ部分、二価のＧａｌＮＡｃ部分、三価のＧａｌＮＡｃ部分、または四価のＧａｌＮＡｃ部分である、前記〔４２〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔４４〕前記ステムループのＬの最大４個のヌクレオチドが、それぞれ一価のＧａｌＮＡｃ部分に結合される、前記〔１９〕～〔２４〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔４５〕前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである、先行態様のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔４６〕先行態様のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体、送達剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
〔４７〕オリゴヌクレオチドを対象に送達する方法であって、前記〔４６〕に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
〔４８〕細胞、細胞集団、または対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させる方法であって、
ｉ．前記細胞または前記細胞集団を、前記〔１〕～〔４５〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは前記〔４６〕に記載の医薬組成物と接触させるステップと、
ｉｉ．前記〔１〕～〔４５〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは前記〔４６〕に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップと、を含む前記方法。
〔４９〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減させることは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量またはレベル、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量またはレベル、もしくはその両方を低減させることを含む、前記〔４８〕に記載の方法。
〔５０〕対象におけるトリグリセリド（ＴＧ）の量またはレベルを低減させる方法であって、前記〔１〕～〔４５〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは前記〔４６〕に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
〔５１〕対象におけるコレステロールの量またはレベルを低減させる方法であって、前記〔１〕～〔４５〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは前記〔４６〕に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
〔５２〕前記対象がＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する、前記〔４８〕～〔５１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５３〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の前記〔１〕～〔４５〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは前記〔４６〕に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することで、前記対象を治療することを含む、前記方法。
〔５４〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法であって、長さが１５個～５０個のヌクレオチドのセンス鎖及び長さが１５個～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む治療有効量のオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、前記センス鎖が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、及び１１５のいずれか１つに記載される配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、及び１１６から選択される相補的配列を含むことで前記対象を治療する、前記方法。
〔５５〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法であって、表５に示される行から選択される一対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を治療有効量で前記対象に投与することで、前記対象を治療することを含む、前記方法。
〔５６〕ＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する前記疾患、障害、または状態は、高トリグリセリド血症、肥満、高脂血症、脂質異常及び／またはコレステロール代謝障害、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、冠動脈疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、ホモ接合体及びヘテロ接合体の家族性高コレステロール血症、及びスタチン耐性高コレステロール血症からなる群より選択される、前記〔５２〕～〔５５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５７〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する前記疾患、障害、または状態は、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病、高トリグリセリド血症、ＮＡＳＨ、肥満、またはそれらの組み合わせである、前記〔５６〕に記載の方法。
〔５８〕前記オリゴヌクレオチドまたは前記医薬組成物は、第２の組成物または治療剤と組み合わせて投与される、前記〔５３〕～〔５７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５９〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態の治療のための薬物の製造における、前記〔１〕～〔４５〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは前記〔４６〕に記載の医薬組成物の使用。
〔６０〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する疾患、障害、または状態の治療に使用するためのまたは使用に適合する、前記〔１〕～〔４５〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは前記〔４６〕に記載の医薬組成物。
〔６１〕前記〔１〕～〔４５〕のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド及び任意の医薬的に許容可能な担体、及びＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象への投与のための説明を含む添付文書を含む、キット。
〔６２〕ＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する前記疾患、障害、または状態は、高トリグリセリド血症、肥満、高脂血症、脂質異常及び／またはコレステロール代謝障害、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、冠動脈疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、ホモ接合体及びヘテロ接合体の家族性高コレステロール血症、及びスタチン耐性高コレステロール血症からなる群より選択される、前記〔５９〕に記載の使用、前記〔６０〕に記載の使用のためのオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物、または前記〔６１〕に記載のキット。
〔６３〕ＡＮＧＰＴＬ３の発現に関連する前記疾患、障害、または状態は、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病、高トリグリセリド血症、ＮＡＳＨ、肥満、またはそれらの組み合わせである、前記〔５９〕に記載の使用、前記〔６０〕に記載の使用のためのオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物、または前記〔６１〕に記載のキット。

【0224】

配列表
以下の核酸及び／またはアミノ酸配列は、上記の開示に述べられているものであり、参照として以下に提供する。

【0225】

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【配列表】

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