特許 7398485 試料中の非結合Ｃ５の定量化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-06

(45)【発行日】2023-12-14

(54)【発明の名称】試料中の非結合Ｃ５の定量化方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20231207BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20231207BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20231207BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231207BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231207BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 R

G01N33/543 501A

G01N33/543 575

C12Q1/02

C12N15/13

C12N15/12

【請求項の数】 10

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022010933

(22)【出願日】2022-01-27

(62)【分割の表示】P 2019520719の分割

【原出願日】2017-10-19

(65)【公開番号】P2022058778

(43)【公開日】2022-04-12

【審査請求日】2022-01-27

(31)【優先権主張番号】62/410,009

(32)【優先日】2016-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503102674

【氏名又は名称】アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】マーク ダイシンガー

(72)【発明者】

【氏名】マーク マ

(72)【発明者】

【氏名】ブルース アンドリアン

【審査官】海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１０－１５１７３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭５９－００５９５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５２０５４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／１５１５５８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗Ｃ５抗体での治療前および治療後のヒト患者から得た試料中で、非結合のヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、前記方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、該ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、該ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００コンパクトディスク（ＣＤ）に毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、該カラム中の該ストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｂ．該試料中の非結合Ｃ５を捕捉することであって、該試料が毛細管作用によって該ＣＤに付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該試料が、該カラム中の該ストレプトアビジン被覆粒子に結合した該ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、
ｃ．捕捉されたＣ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によって該ＣＤに付着し、該抗Ｃ５検出抗体が、該捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該検出抗体が、該カラム中の該ストレプトアビジン被覆粒子に結合された該捕捉抗体に結合されたＣ５へと動かされることと、
ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、捕捉されたＣ５を定量化することと、
を含み、該治療前の試料が少なくとも１：２０で希釈され、該治療後の試料が約１：２で希釈される、方法。

【請求項2】

工程ｄから得たデータを、Ｃ５枯渇試料に添加した既知の量のＣ５から作成した標準曲線と比較することによって、Ｃ５抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

試料の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液が使用され、前記検出抗体の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液が使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記機器を、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０および０．０２％のアジ化ナトリウムと共にＰＢＳを含む洗浄緩衝液ならびにｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記Ｇｙｒｏｓ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ ＣＤが、前記抗Ｃ５抗体について０．０１５μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを持つ、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記治療後の試料が約１：３０希釈で希釈される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記試料が、ヒト患者から得た血清試料または血漿試料である、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記患者が抗Ｃ５抗体での治療を受けている、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記患者が、
（ａ）配列番号９、１０、１１の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３ドメインと、配列番号１２、１３および１４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン；または
（ｂ）配列番号２８、２９、１１の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３ドメインと、配列番号１２、１３および１４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン
を含む抗体での治療を受けている、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記抗Ｃ５検出抗体が、Ｎ１９－８（マウス抗ヒトＣ５抗体）である、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表の組み込み
本出願は配列表を含んでおり、該配列表はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されたものであり、かつその全体が参照により本明細書に援用される。このＡＳＣＩＩコピーは２０１７年１０月１８日に作成され、１９００－４２６ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは５４，３３１バイトである。

【0002】

本発明は、免疫関連疾患および遊離（非結合）薬剤標的の定量化アッセイの分野に関する。

【背景技術】

【0003】

補体タンパク質Ｃ５は、補体カスケードの重要な成分であり、エクリズマブおよびＡＬＸＮ１２１０などの薬物の標的である。この標的が適切に定量化されることは、疾患状態のモニタリング、モデリング、投薬量選択、ラベル・クレームなどのために不可欠である。遊離標的の捕捉試薬として薬剤を使用した多くのリガンド結合アッセイフォーマットは、試料のインキュベーション中に、捕捉試薬が既にマトリックス中の薬剤に結合した標的との動的平衡を作ることがあるという点で、本質的に不備がある。この平衡により、アッセイは、マトリックス中の遊離標的の量を過大評価することが可能であり、これによって潜在的に不正確なモデリング、投薬選択、データファイリング、およびラベル・クレームにつながる。

【0004】

リガンド結合アッセイにおけるこの過大評価を克服するための共通戦略は、試料のインキュベーション時間を短縮することであり、これによって捕捉試薬がマトリックス中の薬剤から結合した標的を引き出す機会が減少する。これを達成するためには、被覆試薬の濃度を５倍ほど増加させる必要性がしばしばあるが、これは短縮された試料インキュベーションの効果を本質的に最小化することがある。また、治療前の試料は、治療後の試料よりもずっと高いレベルで遊離標的を持つ傾向があり、しばしば状況毎に異なる試料の希釈を必要とする。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示は、試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法を提供するものであって、該方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ ＣＤに毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｂ．試料中の遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することであって、該試料が毛細管作用によってＣＤに付着して、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、試料が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子に結合した前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、
ｃ．捕捉された遊離Ｃ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によってＣＤに付着して、該抗Ｃ５検出抗体が、捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該検出抗体が、前記カラム中のストレプトアビジン被覆粒子に結合された捕捉抗体に結合された遊離Ｃ５へと動かされることと、
ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含む。

【0006】

本開示を制限することなく、本開示の多数の実施形態を説明の目的で以下に記載する。

【0007】

項１ 試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、該方法が、ａ．ストレプトアビジン被覆されたメソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標））（ＭＳＤ（登録商標））９６ウェルアッセイプレートに対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることと、ｂ．試料を該プレートに添加することによって、試料中の遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することと、ｃ．ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ標識した抗Ｃ５検出抗体をプレートに添加することにより捕捉された遊離Ｃ５を検出することと、ｄ．電気化学発光を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含むものであって、試料が約１：２で希釈され、試料が氷上に保持され、工程ｂ～ｃは約１５～３０分であり、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体は、約５μｇ／ｍＬの濃度で添加される、方法。

【0008】

項２ 試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、該方法が、ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、前記ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ ＣＤに毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、前記カラム中のストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、ｂ．前記試料中の前記遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することであって、前記試料が毛細管作用によって前記ＣＤに付着して、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記試料が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子に結合した前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、ｃ．捕捉された遊離Ｃ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によって前記ＣＤに付着して、該抗Ｃ５検出抗体が、捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、検出抗体が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子に結合された捕捉抗体に結合された前記遊離Ｃ５へと動かされることと、ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含む方法。

【0009】

項３ 工程ｄから得たデータを、項１の方法を使用してＣ５枯渇試料に添加した既知の量のＣ５から作成した標準曲線と比較することによって、遊離Ｃ５抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、項１に記載の方法。

【0010】

項４ 工程ｄから得たデータを、項２の方法を使用してＣ５枯渇試料に添加した既知の量のＣ５から作成した標準曲線と比較することによって、遊離Ｃ５抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、項２に記載の方法。

【0011】

項５ Ｇｙｒｏｓ Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを用いて遊離Ｃ５抗体の濃度を計算することをさらに含む、項３に記載の方法。

【0012】

項６ 前記試料がヒト患者から獲得される、先行する項のいずれか一つに記載の方法。

【0013】

項７ 前記試料が血清試料または血漿試料である、項６に記載の方法。

【0014】

項８ 患者を抗Ｃ５抗体で治療している、先行する項のいずれか一つに記載の方法。

【0015】

項９ 前記患者をエクリズマブで治療している、項８に記載の方法。

【0016】

項１０ 前記患者をＡＬＸＮ１２１０で治療している、項８に記載の方法。

【0017】

項１１ 前記ビオチン化捕捉抗体がエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０である、先行する項のいずれか一つに記載の方法。

【0018】

項１２ 抗Ｃ５検出抗体がＮ１９－８（マウス抗ヒトＣ５抗体）である、先行する項のいずれか一つに記載の方法。

【0019】

項１３ 試料の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液が使用され、検出抗体の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液が使用される、項２の方法。

【0020】

項１４ Ｇｙｒｏｓ機器を、Ｂｉｏａｆｆｙ ｗａｓｈ １およびｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングすることをさらに含む、項２の方法。

【0021】

項１５ 試料が患者からのヒト血清試料であり、抗Ｃ５抗体で治療する前および治療した後の患者の血清試料の遊離Ｃ５が定量化され、治療前および治療後の試料の両方が同じ希釈で希釈される、項２の方法。

【0022】

項１６ 治療前および治療後の試料の両方が１：２０～１：３０の希釈で希釈される、項１５に記載の方法。

【0023】

特定の態様では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、前記方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆されたメソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（（登録商標）））（ＭＳＤ（登録商標））９６ウェルアッセイプレートに対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることと、
ｂ．前記試料を前記プレートに添加することによって、前記試料中の前記遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することと、
ｃ．ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ標識した抗Ｃ５検出抗体を前記プレートに添加することにより前記捕捉された遊離Ｃ５を検出することと、
ｄ．電気化学発光を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含むものであって、
前記試料が約１：２で希釈され、前記試料が氷上に保持され、工程ｂ～ｃは約１５～３０分であり、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体は、約５μｇ／ｍＬの濃度で添加される、方法。
（項目２）
試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、前記方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ ＣＤに毛細管作用によって添加されて、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｂ．前記試料中の前記遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することであって、前記試料が毛細管作用によって前記ＣＤに添加されて、前記ＣＤが前記Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記試料が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子に結合した前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、
ｃ．捕捉された遊離Ｃ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によって前記ＣＤに添加されて、前記抗Ｃ５検出抗体が、前記捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、
前記ＣＤが前記Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記検出抗体が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子に結合された前記捕捉抗体に結合された前記遊離Ｃ５へと動かされることと、
ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、前記捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含む方法。
（項目３）
工程ｄから得たデータを、項目１記載の方法を使用してＣ５枯渇試料に添加した既知の量のＣ５から作成した標準曲線と比較することによって、遊離Ｃ５抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、項目１記載の方法。
（項目４）
工程ｄから得たデータを、項目２記載の方法を使用してＣ５枯渇試料に添加した既知の量のＣ５から作成した標準曲線と比較することによって、遊離Ｃ５抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、項目２記載の方法。
（項目５）
Ｇｙｒｏｓ Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを用いて遊離Ｃ５抗体の濃度を計算することをさらに含む、項目３記載の方法。
（項目６）
前記試料がヒト患者から得られる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記試料が血清試料または血漿試料である、項目６記載の方法。
（項目８）
患者が抗Ｃ５抗体で治療されている、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記患者がエクリズマブで治療されている、項目８記載の方法。
（項目１０）
前記患者がＡＬＸＮ１２１０で治療されている、項目８記載の方法。
（項目１１）
前記ビオチン化捕捉抗体がエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
検出抗Ｃ５抗体がＮ１９－８（マウス抗ヒトＣ５抗体）である、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
試料の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液が使用され、前記検出抗体の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液が使用される、項目２記載の方法。
（項目１４）
前記Ｇｙｒｏｓ機器を、Ｂｉｏａｆｆｙ ｗａｓｈ １およびｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングすることをさらに含む、項目２記載の方法。
（項目１５）
前記試料が患者からのヒト血清試料であり、抗Ｃ５抗体を用いた前記患者の治療前および治療後の血清試料の前記遊離Ｃ５が定量化され、前記治療前および治療後の試料の両方が同じ希釈で希釈される、項目２記載の方法。
（項目１６）
前記治療前および治療後の試料の両方が１：２０～１：３０の希釈で希釈される、項目１５記載の方法。
本発明のこれらおよびその他の態様に従って、多数のその他の態様が提供される。本発明のその他の特徴および態様は、以下の発明を実施するための形態および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】図１は平行性を示すグラフである。

【0025】

【図2】図２は、７個体のドナーの血清の平行性を示すグラフである。

【0026】

【図3】図３は、７個体のドナー血清の平行性を示す。

【0027】

【図4-1】図４Ａおよび図４Ｂは、早期の医薬品開発業務受託機関（ＣＲＯ）へのアッセイの移管の結果を示す。

【図4-2】図４Ｃは、早期ＣＲＯ移管結果における選択性を示す。

【0028】

【図5】図５は、ＭＲＤ（ｍｉｎｉｍｕｍ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ（最小必要希釈率））は３０が最適であることを示す。

【0029】

【図6】図６は、キャリーオーバー評価でキャリーオーバーがないことを示す。

【0030】

【図7】図７は、要約比較を示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本明細書で使用される場合、名詞の前の「ａ」または「複数の」という語は、特定の名詞のうちの一つ以上を表す。例えば、「哺乳動物細胞」という語句は、「一つ以上の哺乳動物細胞」を表す。

【0032】

「哺乳動物細胞」という語は当技術分野で公知であり、例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、ハムスター、またはウサギを含む、任意の哺乳動物からのまたは由来の任意の細胞を指すことができる。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、不死化細胞、分化細胞、未分化細胞、幹細胞などであり得る。

【0033】

本明細書で使用される場合、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者」という語は区別せずに使用される。患者または対象は、ヒト患者またはヒト対象でありうる。

【0034】

「組換えタンパク質」という語は当技術分野で公知である。簡潔に述べると、「組換えタンパク質」という語は、細胞培養系を使用して製造することができるタンパク質を指すことができる。細胞培養系の細胞は、例えば、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または細菌細胞に由来することができる。一般的に、細胞培養中の細胞は、関心の組換えタンパク質をコードする導入核酸を含有する（この核酸は、プラスミドベクターなどのベクター上で生じ得る）。組換えタンパク質をコードする核酸は、タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結された異種プロモーターを含むこともできる。

【0035】

「免疫グロブリン」という語は当技術分野で公知である。簡潔に述べると、「免疫グロブリン」という語は、免疫グロブリンタンパク（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列、または定常ドメイン配列）の少なくとも１５個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアミノ酸、または１００個以上のアミノ酸）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指すことができる。例えば、免疫グロブリンは、例えば、軽鎖免疫グロブリンの少なくとも１５個のアミノ酸、例えば、ＣＤＲ Ｈ３などの重鎖免疫グロブリンの少なくとも１５個のアミノ酸を含むことができる。免疫グロブリンは、単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）であってもよい。免疫グロブリンは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のサブクラスであってもよい。免疫グロブリンは、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはｓｃＦｖとすることができる。免疫グロブリンはまた、少なくとも一つの免疫グロブリンドメインを含む改変タンパク質とすることができる（例えば、融合タンパク質）。改変タンパク質または免疫グロブリン様タンパク質はまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体、三量体もしくは多量体の抗体、またはダイアボディ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＤＶ－Ｉｇ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）とすることができる。免疫グロブリンの非限定的な例が本明細書に記載されており、免疫グロブリンのさらなる例は当技術分野で公知である。

【0036】

「改変タンパク質（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」という語は当技術分野で公知である。簡潔に述べると、「改変タンパク質」という語は、生物体（例えば、哺乳動物）内に存在する内因性核酸によって自然にコードされるのではないポリペプチドを指すことができる。改変タンパク質の例には、改変酵素であって、該改変酵素の安定性および／もしくは触媒活性の増加をもたらす一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を伴う改変酵素、融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二価抗体、三価抗体、四結合ドメイン抗体、ダイアボディ、ならびに、少なくとも一つの組換えｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含有する抗体結合タンパク質が挙げられる。

【0037】

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という語は区別なく使用され、当技術分野で公知であり、長さまたは翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合連結鎖を意味することができる。

【0038】

「抗体」という語は当技術分野で公知である。「抗体」という語は、「免疫グロブリン」という語と区別なく使用されうる。簡潔に述べると、それは、二つの軽鎖ポリペプチドと二つの重鎖ポリペプチドとを含む全抗体を指すことができる。全抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプが含まれる。「抗体」という語は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化抗体またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、脱免疫化抗体、および完全ヒト抗体を含む。抗体は、例えば、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、ハムスター、ラット、およびマウスなどの種々の種のいずれかにおいて作られるか、またはそれらに由来しうる。抗体は、精製抗体または組換え抗体とすることができる。抗体はまた、少なくとも一つの免疫グロブリンドメインを含む改変タンパク質または抗体様タンパク質とすることができる（例えば、融合タンパク質）。改変タンパク質または抗体様タンパク質はまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体、三量体もしくは多量体の抗体、またはダイアボディ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＤＶ－Ｉｇ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）とすることができる。

【0039】

「抗体断片」、「抗原結合断片」という語、または類似の語は、当技術分野で公知であり、例えば、標的抗原（例えば、ヒトＣ５）に結合して該標的抗原の活性を阻害する能力を保持する抗体の断片を指す。かかる断片としては、例えば、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖの由来となる抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との両方を含む一本鎖ポリペプチドである。さらに、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、およびダイアボディもまた、抗体の定義内に含まれ、本明細書に記載の方法での使用に適合する。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１）：４７－６６；Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｋｏｒｔｔ（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１）：１７７－１８９；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２（１２）：１１２１－１１２３；Ｒｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｍａｒａｓｃｏ（１９９７）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５１：２５７－２８３を参照されたい。抗原結合断片は、重鎖ポリペプチドの可変領域、および軽鎖ポリペプチドの可変領域も含みうる。従って、抗原結合断片は、抗体の軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドのＣＤＲを含むことができる。

【0040】

「抗体断片」という語はまた、例えば、ラクダ化された（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体等である単一ドメイン抗体を含み得る。例えば、，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２６：２３０－２３５；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ １：２５３－２６３；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２３１：２５－３８；ＰＣＴ出願国際公開第９４／０４６７８号および第９４／２５５９１号、ならびに米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい。「抗体断片」という語はまた、単一ドメイン抗体が形成されるように修飾を有する二つのＶ_Ｈドメインを含む単一ドメイン抗体を含む。

【0041】

「抗体」という語はまた、「抗原結合断片」および「抗体断片」を含む。

【0042】

「例えば」および「（例えば）～など（等）の」という語およびそれらと文法的に同等なものに関して、「限定されない」という語句は、別段の明示がない限り、以下に従うことが理解される。本明細書で使用される場合、「約」という語は、実験誤差による変動を考慮することを意味する。本明細書に報告されるすべての測定値は、別段の明示がない限り、「約」という語が明文で用いられていても用いられていなくても、「約」という語によって変形されるものと理解される。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。

【0043】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本発明で使用するための方法および材料が本明細書に記載されており、当技術分野で公知のその他の適切な方法および材料も使用できる。材料、方法、および実施例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が考慮される。

【0044】

補体系

【0045】

周知のように、補体系は、体の他の免疫系と共に作用することで、細胞病原体およびウイルス病原体の侵入に対して防御する。少なくとも２５個の補体タンパク質がある。補体成分は、複雑だが正確な一連の酵素的切断および膜結合イベントにおいて相互作用することにより、それらの免疫防御機能を達成する。その結果である補体カスケードが、オプソニン作用、免疫調節作用および溶解作用を有する産物の産生を導く。

【0046】

補体カスケードは、古典経路（「ＣＰ」）、レクチン経路（「ＬＰ」）、または副経路（「ＡＰ」）を経て進行することができる。レクチン経路は典型的には、高マンノースである基質にマンノース結合レクチン（「ＭＢＬ」）が結合することにより開始される。ＡＰは抗体と独立であることができ、病原体表面上の特定の分子によって開始されうる。ＣＰは、典型的には、標的細胞上の抗原部位の抗体認識および該抗原部位への結合によって開始される。これらの経路は、Ｃ３転換酵素に収束するが、これは補体成分Ｃ３が活性プロテアーゼによって切断されてＣ３ａおよびＣ３ｂが得られる点である。

【0047】

ＡＰのＣ３転換酵素は、補体成分Ｃ３の自発的な加水分解によって始動されるが、これは血液中の血漿内に豊富である。このプロセスはまた、「ｔｉｃｋｏｖｅｒ」としても知られており、Ｃ３におけるチオエステル結合の自発的な開裂を経て生じ、Ｃ３ｉまたはＣ３（Ｈ_２Ｏ）を形成する。ｔｉｃｋｏｖｅｒは、活性化されたＣ３の結合をサポートする、および／または中性もしくは陽性の電荷特性を持つ表面（例えば、細菌細胞表面）の存在によって促進される。このＣ３（Ｈ_２Ｏ）の形成が、血漿タンパク質因子Ｂの結合を可能にし、これは次に因子Ｄにより因子ＢがＢａおよびＢｂに切断される。Ｂｂ断片はＣ３に結合したままであり、Ｃ３（Ｈ_２Ｏ）Ｂｂ－「液相（ｆｌｕｉｄ－ｐｈａｓｅ）」または「開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）」のＣ３転換酵素、を含有する複合体を形成する。少量で生成されるのみであるが、液相Ｃ３転換酵素は、複数のＣ３タンパク質をＣ３ａおよびＣ３ｂに切断することができ、Ｃ３ｂの生成とその後のある表面（例えば、細菌表面）へのＣ３ｂの共有結合とが結果として生じる。表面結合性Ｃ３ｂに結合した因子Ｂは、因子Ｄによって切断されて、それによってＣ３ｂ、Ｂｂを含有する表面結合性ＡＰ Ｃ３転換酵素複合体を形成する。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８８）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５７：３２１－３４７を参照されたい。

【0048】

ＡＰのＣ５転換酵素－（Ｃ３ｂ）_２，Ｂｂ－は、第二のＣ３ｂモノマーがＡＰ Ｃ３転換酵素に付加すると形成される。例えば、Ｍｅｄｉｃｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １４４：１０７６－１０９３およびＦｅａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １４２：８５６－８６３を参照されたい。第二のＣ３ｂ分子の役割は、Ｃ５に結合させて、Ｂｂでの切断のためにそれを提示することである。例えば、Ｉｓｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２４：３２６－３３１を参照されたい。ＡＰのＣ３転換酵素およびＣ５転換酵素は、例えば、上記したＭｅｄｉｃｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９７６）に記載されるような、三量体タンパク質プロパージンの付加によって安定化される。しかしながら、プロパージンの結合は、機能的な副経路のＣ３転換酵素またはＣ５転換酵素の形成には不用である。例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７５：３９４８－３９５２、およびＳｉｓｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：５５９－５６２を参照されたい。

【0049】

ＣＰのＣ３転換酵素は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、およびＣ１ｓの複合体である補体成分Ｃ１が、標的抗原（例えば、微生物抗原）に結合している抗体と相互作用することによって形成される。Ｃ１のＣ１ｑ部分が抗体抗原複合体に結合することで、Ｃｌｒを活性化させるものであるＣ１の構造変化が生じる。活性Ｃ１ｒは次に、Ｃ１に会合したＣ１ｓを切断し、それによって活性型セリンプロテアーゼが生成する。活性Ｃ１ｓは、補体成分Ｃ４をＣ４ｂおよびＣ４ａに切断する。Ｃ３ｂと同様に、新たに生成されたＣ４ｂ断片は、標的表面（例えば、微生物細胞表面）上の適切な分子とのアミド結合またはエステル結合を容易に形成する非常に反応性の高いチオールを含有する。Ｃ１ｓはまた、補体成分Ｃ２をＣ２ｂおよびＣ２ａに切断する。Ｃ４ｂおよびＣ２ａによって形成される複合体は、ＣＰのＣ３転換酵素であり、これはＣ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに処理する能力を有する。ＣＰのＣ５転換酵素－Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ３ｂ－は、Ｃ３ｂモノマーがＣＰのＣ３転換酵素に付加すると形成される。例えば、上記したＭｕｌｌｅｒ－Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８８）、およびＣｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：７７５－７９３を参照されたい。

【0050】

Ｃ３ｂはまた、Ｃ３転換酵素およびＣ５転換酵素におけるその役割に加えて、マクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上に存在する補体受容体とのその相互作用を通してオプソニンとして機能する。Ｃ３ｂのオプソニン作用は、概して、補体系の最も重要な抗感染機能の一つであると考えられている。Ｃ３ｂの作用を阻害する遺伝子病変を有する患者は、多種多様な病原性生物体に感染しやすく、一方、補体カスケードシーケンス下流の病変を有する患者、すなわち、Ｃ５の作用を阻害する病変を有する患者は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）感染のみに対してより感染しやすいため、いくらか感染しやすいのみであることが判明している。

【0051】

ＡＰおよびＣＰのＣ５転換酵素は、Ｃ５を切断するが、これは正常なヒト血清中において約７５μｇ／ｍｌ（０．４μＭ）で見られる１９０ｋＤａのベータグロブリンである。Ｃ５はグリコシル化されており、その質量の約１．５～３パーセントが炭水化物に起因する。成熟Ｃ５は、６５５アミノ酸の７５ｋＤａのベータ鎖にジスルフィド結合している、９９９アミノ酸の１１５ｋＤａのアルファ鎖のヘテロ二量体である。Ｃ５は、単一コピー遺伝子の一本鎖前駆体タンパク質産物として合成される（Ｈａｖｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３６２－３６８）。このヒト遺伝子の転写物のｃＤＮＡ配列が、１８アミノ酸リーダー配列に加えて１６５８個のアミノ酸のうちの分泌されたプロＣ５前駆体を予測する。例えば、米国特許第６，３５５，２４５号を参照されたい。

【0052】

プロＣ５前駆体は、６５５アミノ酸および６５９アミノ酸の後で切断されて、アミノ末端断片（上記配列のアミノ酸残基＋１～６５５）としてのベータ鎖と、カルボキシル末端断片（上記配列のアミノ酸残基６６０～１６５８）としてのアルファ鎖とが得られ、この二つの間にある四個のアミノ酸（上記配列のアミノ酸残基６５６～６５９）は欠失している。

【0053】

Ｃ５ａは、アルファ鎖のうちの最初の７４個のアミノ酸（すなわち、上記配列のアミノ酸残基６６０～７３３）を含むアミノ末端断片として、副経路または古典経路のいずれかのＣ５転換酵素によってＣ５のアルファ鎖から切断される。１１ｋＤａ質量のＣ５ａの約２０パーセントは、炭水化物に起因する。転換酵素作用（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ａｃｔｉｏｎ）の切断部位は、アミノ酸残基７３３においてであるかまたはそれに直接隣接している。この切断部位にまたは隣接して結合することとなる化合物は、Ｃ５コンバターゼ酵素が切断部位に接近するのを阻害し、それによって補体阻害剤として作用する可能性がある。切断部位の遠位部位でＣ５に結合する化合物は、例えば、Ｃ５とＣ５転換酵素との相互作用の立体障害介在性阻害によってＣ５切断を阻害する可能性もある。化合物はまた、マダニ唾液（ｔｉｃｋ ｓａｌｉｖａ）の補体阻害剤であるＯｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ Ｃ阻害剤（ＯｍＣＩ）の作用機序と一致する作用機序において、Ｃ５転換酵素のＣ５切断部位への接近を減少させる、Ｃ５のアルファ鎖のＣ３４５Ｃドメインの柔軟性を低下させることによってＣ５切断を防止しうる。例えば、Ｆｒｅｄｓｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（７）：７５３－７６０を参照されたい。

【0054】

Ｃ５はＣ５転換酵素活性以外の手段によって活性化することもできる。制限されたトリプシン消化（例えば、Ｍｉｎｔａ ａｎｄ Ｍａｎ（１９９７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１９：１５９７－１６０２およびＷｅｔｓｅｌ ａｎｄ Ｋｏｌｂ（１９８２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２８：２２０９－２２１６）および酸処理（Ｙａｍａｍｏｔｏ ａｎｄ Ｇｅｗｕｒｚ（１９７８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２０：２００８およびＤａｍｅｒａｕ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６：１１３３－１１４２）により、Ｃ５を切断して活性Ｃ５ｂを産生することもできる。

【0055】

Ｃ５の切断により、強力なアナフィラトキシンおよび走化性因子であるＣ５ａが放出され、溶解性終末補体複合体Ｃ５ｂ－９の形成がもたらされる。Ｃ５ａおよびＣ５ｂ－９はまた、加水分解酵素、活性酸素種、アラキドン酸代謝産物、および様々なサイトカインなどの下流炎症因子の放出を増幅することによって、多面発現的な細胞活性化特性も有する。

【0056】

終末補体複合体の形成の第一工程は、Ｃ５ｂをＣ６、Ｃ７、およびＣ８と組み合わせることを含み、Ｃ５ｂ－８複合体を標的細胞表面で形成する。Ｃ５ｂ－８複合体がいくつかのＣ９分子と結合すると、膜傷害複合体（「ＭＡＣ」、終末補体複合体「ＴＣＣ」であるＣ５ｂ－９）が形成される。標的細胞膜に十分な数のＭＡＣを挿入すると、それらが作り出す開口（ＭＡＣポア）が、赤血球などの標的細胞の急速な浸透圧溶解に介在する。非溶解（ｎｏｎ－ｌｙｔｉｃ）性の濃度の低いＭＡＣは、その他の影響を生じうる。特に、内皮細胞および血小板への少数のＣ５ｂ－９複合体の膜内挿入は、有害な細胞活性化を引き起こす可能性がある。一部の事例では、活性化が細胞溶解に先行しうる。

【0057】

Ｃ３ａおよびＣ５ａはアナフィラトキシンである。これら活性化された補体成分は、好塩基球および肥満細胞からのヒスタミン、ならびに、平滑筋収縮、血管透過性亢進、白血球活性化、および、細胞過形成をもたらす細胞増殖を含めた他の炎症性の現象をもたらす他の炎症の介在物質が放出される、肥満細胞の脱顆粒を誘発することがある。Ｃ５ａはまた、炎症促進性顆粒球を補体活性化部位に引き付ける働きをする走化性ペプチドとして機能する。

【0058】

Ｃ５ａ受容体は、気管支および肺胞の上皮細胞ならびに気管支の平滑筋細胞の表面上で発見される。Ｃ５ａ受容体は、好酸球、肥満細胞、単球、好中球、および活性化リンパ球上でも発見されている。

【0059】

補体系が適切に機能することで、微生物に感染することに対して頑強な防御がもたらされる一方、補体の不適切な制御または活性化が、例えば、関節リウマチ；ループス腎炎；喘息；虚血再灌流障害；非典型溶血性尿毒症症候群（「ａＨＵＳ」）；デンスデポジット病；発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）；黄斑変性症（例えば、加齢性黄斑変性；溶血、肝酵素上昇および血小板低下の症候群（ＨＥＬＬＰ症候群）；血小板減少性血栓性紫斑病（ＴＴＰ）；自然死産；Ｐａｕｃｉ－ｉｍｍｕｎｅ型血管炎；表皮水疱症；習慣性流産；多発性硬化症（ＭＳ）；外傷性脳損傷；ならびに、心筋梗塞、心肺バイパスおよび血液透析から生じた損傷を含む、様々な障害の発症に関与してきた。例えば、Ｈｏｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２３：３００－３１６を参照されたい。

【0060】

抗Ｃ５抗体

【0061】

患者を治療するための本開示の方法で使用するため、捕捉抗体として使用するため、および／または、検出抗体として使用するための抗Ｃ５抗体は、任意の抗ヒトＣ５抗体である。

【0062】

特定の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、エクリズマブ、その抗原結合断片、エクリズマブの抗原結合断片を含むポリペプチド、エクリズマブの抗原結合断片を含む融合タンパク質、またはエクリズマブの一本鎖抗体バージョンである。

【0063】

一部の実施形態では、補体Ｃ５タンパク質はヒト補体Ｃ５タンパク質である（ヒト前駆タンパク質は配列番号４で示す）。

【0064】

抗Ｃ５抗体は、補体Ｃ５タンパク質に結合する抗体であり、それはまたＣ５ａの生成を阻害する能力を有する。抗Ｃ５抗体はまた、例えばＣ５が断片Ｃ５ａおよびＣ５ｂに切断されること等を阻害する能力を有することができるため、終末補体複合体の形成を防止することができる。

【0065】

例えば、抗Ｃ５抗体は、Ｃ５タンパク質（例えば、ヒトＣ５タンパク質）のＣ５ａ活性断片の生成または活性を阻害する。この阻害作用を通じて、この抗体は、例えばＣ５ａの炎症促進作用等を阻害する。抗Ｃ５抗体は、Ｃ５ｂの生成または活性を阻害するための活性をさらに持つことができる。この阻害作用を通じて、この抗体は、例えば細胞の表面におけるＣ５ｂ－９膜傷害複合体の生成等をさらに阻害することができる。

【0066】

一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体はエクリズマブである。配列番号５は、エクリズマブの重鎖全体を示す。配列番号６は、エクリズマブの軽鎖全体を示す。配列番号９～１１はそれぞれ、エクリズマブの重鎖のＣＤＲ１～３を示す。配列番号１２～１４はそれぞれ、エクリズマブの軽鎖のＣＤＲ１～３を示す。配列番号１５は、エクリズマブの重鎖の可変領域を示す。また配列番号１６は、エクリズマブの軽鎖の可変領域を示す。

【0067】

エクリズマブは、炎症促進性の反応を引き出す可能性を低減するように、ヒトＩｇＧ_２／ＩｇＧ_４ハイブリッド定常領域をもつ、ヒト化抗ヒトＣ５モノクローナル抗体（アレクシオンファーマ社（Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．））である。エクリズマブは商品名ソリリス（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）））を有し、現在、発作性夜間血色素尿症（「ＰＮＨ」）および非典型溶血性尿毒症症候群（「ａＨＵＳ」）の治療用に承認されている。発作性夜間血色素尿症は、溶血性貧血の一種であるが、血管内溶血は補体調節タンパク質ＣＤ５９およびＣＤ５５の欠損に起因する顕著な特徴である。ＣＤ５９は、例えば、終末補体複合体の形成を阻害する機能がある。ａＨＵＳは、とりわけ、スロンボリティック（ｔｈｒｏｍｂｏｌｉｔｉｃ）な微小血管障害症の阻害、身体全体の微小血管内での凝血の形成、および急性腎不全をもたらす、慢性的な無制御な補体活性化を伴う。エクリズマブはヒトＣ５タンパク質に特異的に結合し、強力な炎症促進性タンパク質Ｃ５ａの生成の形成を阻害する。エクリズマブさらに、終末補体複合体の形成を阻害する。エクリズマブによる治療は、ＰＮＨ患者の血管内溶血を減少させ、ａＨＵＳでは補体価を減少させる。例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：５５２－９；Ｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７；２５（１１）：１２５６－１２６４；Ｈｉｌｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６，３５５；１２，１２３３－１２４３；Ｚｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ８，６４３－６５７（２０１２）｜ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎｅｐｈ．２０１２．２１４；米国特許出願公開第２０１２／０２３７５１５号、および米国特許第６，３５５，２４５号を参照されたい。

【0068】

さらに他の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、パキセリズマブ（ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）（配列番号１）を含むエクリズマブの一本鎖バージョンである、全抗体エクリズマブの特異的一本鎖バージョンである。例えば、Ｗｈｉｓｓ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ３（６）：８７０－７；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ）４１（３）：１６５－７０；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３（１７－１８）：１３８９－４０１；および米国特許第 ６，３５５，２４５号を参照されたい。さらに他の実施形態では、本発明の方法で使用するための阻害剤は、パキセリズマブの一本鎖変異体であるが、パキセリズマブ抗体アミノ酸配列の軽鎖の３８位にあるアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔ番号および配列番号２で示したアミノ酸配列番号に従う）がグルタミン（Ｑ）に変更されている。配列番号２で示すアミノ酸配列を有する一本鎖抗体は、一本鎖抗体パキセリズマブ（配列番号１）の変異体であって、３８位におけるアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）で置換されている。変異パキセリズマブ抗体（ｖａｒｉａｎｔ ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ）中に存在する例示的なリンカーのアミノ酸配列を、配列番号３で示している。

【0069】

特定の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、エクリズマブ由来の変異体であり、エクリズマブと比べて一つ以上の改善された特性（例えば、薬物動態特性の改善）を有する。変異エクリズマブ抗体（ｖａｒｉａｎｔ ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（本明細書ではエクリズマブ変異体、変異エクリズマブ等とも称する）またはそのＣ５結合断片は、以下のものである：（ａ）補体成分Ｃ５に結合し；（ｂ）Ｃ５ａの生成を阻害し；Ｃ５の断片Ｃ５ａおよびＣ５ｂへの切断をさらに阻害することができる。変異エクリズマブ抗体は、ヒトにおいて、１０日を超えるか、または、少なくとも１０日（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４日を超えるか、または、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４日）の、血清半減期を有することができる。かかる変異エクリズマブ抗体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２２５及び米国特許第９，０７９，９４９号に記載されている。

【0070】

特定の実施形態では、エクリズマブ変異抗体は、配列番号７（重鎖）および配列番号８（軽鎖）で示す配列によって規定される抗体、またはその抗原結合断片である。この抗体はＡＬＸＮ１２１０としても知られている。この抗体は、ヒトＣ５に結合して、またＣ５ａの形成のみならずＣ５の断片Ｃ５ａおよびＣ５ｂへの切断を阻害するため、終末補体複合体の形成が防止される。

【0071】

特定の実施形態では、エクリズマブ変異体は、ＢＮＪ４４１（配列番号２４、配列番号２５、および配列番号１６で示す配列を含む抗体。配列番号６～８で示す配列も参照のこと）である。特定の実施形態では、エクリズマブ変異体は、配列番号２４、配列番号２５および配列番号８で示す配列によって規定される。

【0072】

特定の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、結果として得られるポリペプチドが補体タンパク質Ｃ５（「Ｃ５」）に結合するように、配列番号１～３、５～１６、および２３～２９、および３３で示す一つ以上の配列を含むか、またはそれらからなるポリペプチドＣ５阻害剤である。

【0073】

一部の実施形態では、本開示の方法で使用するための抗Ｃ５抗体は、全抗体ではない。一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、一本鎖抗体である。一部の実施形態では、本開示の方法で使用するための抗Ｃ５抗体は、二重特異性抗体である。一部の実施形態では、本開示の方法で使用するための抗Ｃ５抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、またはヒトモノクローナル抗体、またはそれらのいずれかの抗原結合断片である。

【0074】

本開示の方法で使用するための抗Ｃ５抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、および配列番号６、もしくは配列番号７および配列番号８で示すアミノ酸配列、もしくは上記のいずれかの抗原結合断片を含むことができ、またはそれらからなることができる。ポリペプチドは、配列番号９～１６で示すアミノ酸配列のうちの一つ以上を含むことができる。

【0075】

さらに他の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、ＬＦＧ３１６（スイス、バーゼルのノバルティス社とドイツ、プラネックのモルフォシス社）または米国特許第８，２４１，６２８号および米国特許第８，８８３，１５８号の表１の配列によって規定される別の抗体、Ｍｕｂｏｄｉｎａ（登録商標）（イタリアバ、ベルガモのＡｄｉｅｎｎｅ Ｐｈａｒｍａ＆Ｂｉｏｔｅｃｈ社）（例えば、米国特許第７，９９９，０８１号を参照のこと）、ｒＥＶ５７６（Ｃｏｖｅｒｓｉｎ）（スイス、ジュネーブのＶｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ－ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）（例えば、Ｐｅｎａｂａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ，２０１４ Ｏｃｔ；２３（１２）：１３２４－６．ｄｏｉ：１０．１１７７／０９６１２０３３１４５４６０２２．を参照のこと）、ＡＲＣ１００５（デンマーク、バウスベアのノボノルディクス社）、ＳＯＭＡｍｅｒ（コロラド州、ボルダーのＳｏｍＡｌｏｇｉｃ社）、ＳＯＢ１００２（スウェーデン、ストックホルムのＳｗｅｄｉｓｈ Ｏｒｐｈａｎ Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍ社）、ＲＡ１０１３４８（マサチューセッツ州ケンブリッジのラ・ファーマシューティカルズ社（Ｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））である。

【0076】

一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。他の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、モノクローナル抗体などの抗体の可変領域、またはその断片を含む。他の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、Ｃ５補体タンパク質に特異的に結合する免疫グロブリンである。他の実施形態では、抗Ｃ５抗体は改変タンパク質または組換えタンパク質である。一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は全抗体ではないが、抗体の部分を含む。一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、一本鎖抗体である。一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、二重特異性抗体である。一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、またはヒトモノクローナル抗体、またはそれらのいずれかの抗原結合断片である。抗Ｃ５抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。

【0077】

上述のように、抗Ｃ５抗体は、補体成分Ｃ５タンパク質を阻害する。特に、抗Ｃ５抗体は、Ｃ５ａアナフィラキシンの生成、または補体成分Ｃ５タンパク質（例えば、ヒトＣ５タンパク質）のｃ５ａおよびＣ５ｂ活性断片の生成を阻害する。したがって、抗Ｃ５抗体は、例えばＣ５ａの炎症促進作用等を阻害し、また、細胞表面におけるＣ５ｂ－９膜傷害複合体（「ＭＡＣ」）の生成およびその後の細胞溶解を阻害しうる。例えば、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６２：３９７およびＭｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６５：３２３を参照されたい。

【0078】

一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、欠失変異体、挿入変異体、および／または置換変異体を含む、抗原に結合したままの抗Ｃ５抗体（エクリズマブなど）の変異抗体である。例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号７および配列番号８で示すポリペプチドを参照されたい。例えば組換えＤＮＡ技術による、こうした変異体を作製する方法は、当技術分野で周知である。

【0079】

一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、融合タンパク質である。融合タンパク質は、融合タンパク質が融合タンパク質をコードする核酸から発現されるように、組換えによって構築されうる。融合タンパク質は、一つ以上のＣ５結合ポリペプチドのセグメント（例えば、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号５および／もしくは配列番号６、配列番号７および／もしくは配列番号８、または配列番号９～１６のうちのいずれか一つ以上で示すＣ５結合セグメント）と、該Ｃ５結合セグメントに対して異種である一つ以上のセグメントとを含むことができる。異種配列は、例えば、抗原性タグ（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、赤血球凝集素（「ＨＡ」）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）、またはマルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）などの任意の好適な配列とすることができる。異種配列はまた、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）である、診断マーカーまたは検出可能なマーカーとして有用なタンパク質とすることもできる。一部の実施形態では、異種配列は、Ｃ５結合セグメントを関心の細胞、組織、または微小環境に向かわせるターゲティング部分とすることができる。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ヒト補体受容体（例えば、ヒト補体受容体２）の可溶形態、またはＣ３ｂもしくはＣ３ｄに結合する抗体（例えば、一本鎖抗体）である。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、腎臓特異的抗原などの組織特異的抗原に結合する抗体である。組換えＤＮＡ技術による等、こうした融合タンパク質を構築する方法は、当技術分野で周知である。

【0080】

一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、ターゲティング部分と融合する。例えば、構築物は、Ｃ５結合ポリペプチドと、ポリペプチドを補体活性化部位に向かわせるターゲティング部分とを含むことができる。かかるターゲティング部分には、例えば、補体受容体１（ＣＲ１）の可溶形態、補体受容体２（ＣＲ２）の可溶形態、またはＣ３ｂおよび／もしくはＣ３ｄに結合する抗体（またはその抗原結合断片）が含まれ得る。

【0081】

組換えＤＮＡ技術を含めて、融合タンパク質（例えば、Ｃ５結合ポリペプチドと、ヒトＣＲ１またはヒトＣＲ２の可溶形態とを含有する融合タンパク質）を生成する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，８９７，２９０号；米国特許出願公開第２００５２６５９９５号、およびＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１（１２）：１８７５－１８８５に記載されている。

【0082】

特定の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体（例えば、抗Ｃ５抗体と、Ｃ３ｂおよび／またはＣ３ｄに結合する抗体とを含む二重特異性抗体）を製造する方法も当技術分野で公知である。Ｃ５結合抗体およびその他の抗体を含む二重特異性抗体を意図している。

【0083】

多種多様な二重特異性抗体の形態は、抗体工学分野で公知であり、二重特異性抗体（例えば、抗Ｃ５抗体［すなわち、Ｃ５結合抗体］と、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、または組織特異的抗原に結合する抗体とを含む二重特異性抗体）の製造方法は、当業者の範囲において周知である。例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０；ＰＣＴ出願国際公開第９６／２７０１１号；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１；Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７５：２１７－２２５；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８（５）：１５４７－１５５３；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８；Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：５３６８、およびＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：６０を参照されたい。

【0084】

二重特異性抗体はまた、架橋されたまたは異種結合（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の抗体も含む。異種結合抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製されうる。好適な架橋剤は当技術分野で周知であり、米国特許 第４，６７６，９８０号に、多数の架橋技術と共に開示されている。米国特許第５，５３４，２５４号には、例えば、ペプチドカプラー（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｐｌｅｒ）、キレート剤、または化学的結合もしくはジスルフィド結合によって共に連結された一本鎖Ｆｖ断片を含む、いくつかの異なるタイプの二重特異性抗体が記載されている。別の例では、Ｓｅｇａｌ ａｎｄ Ｂａｓｔ［（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｓｕｐｐｌ．１４：２．１３．１－２．１３．１６］には、二つの単一特異性抗体を化学的に架橋結合して、それにより二重特異性抗体を形成する方法が記載されている。二重特異性抗体は、例えば、Ｃ５結合抗体、および、例えばＣ３ｂ、Ｃ３ｄ、または肺特異的抗原、眼特異的抗原、腎特異的抗原などに結合する抗体から選択される二つの一本鎖抗体を複合化することによって形成することができる。

【0085】

二重特異性抗体は、リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）によって共有結合した二つの異なるｓｃＦｖ断片を含有する、タンデム一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ断片とすることができる。例えば、Ｒｅｎ－Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ １００：１０９５－１１０３およびＫｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ６：６４２－６５１を参照されたい。リンカーの例には、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２［ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１７］、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３［ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１８］、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４［ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号１９］、（Ｇ_３Ｓ）［ＧＧＧＳ、配列番号２０］、ＳｅｒＧｌｙ_４［ＳＧＧＧＧ、配列番号２１］および ＳｅｒＧｌｙ_４ＳｅｒＧｌｙ_４［ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ、配列番号２２］を挙げることができるが、これに限定されない。

【0086】

一部の実施形態では、リンカーは、例えば、Ｇｒｏｓｓｅ－Ｈｏｖｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：６８５８－６８６３に記載されているように、ＣＨ１ドメイン等の重鎖ポリペプチド定常領域の全てもしくは一部を含有することができるか、または、該全てもしくは一部とすることができる。一部の実施形態では、二つの抗体断片は、例えば、米国特許第７，１１２，３２４号および第５，５２５，４９１号にそれぞれ記載される、ポリグリシン－セリンまたはポリセリン－グリシンのリンカーによって共有結合させることができる。米国特許第５，２５８，４９８も参照されたい。二重特異性のタンデムｓｃＦｖ抗体を生成するための方法は、例えば、Ｍａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９３：４０９－４１６；Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １：３－１５、およびＨｏｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １８：６３６－６４４に記載されている。あるいは、抗体は、例えば、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２に記載されている、「直鎖状抗体」とすることができる。簡潔に述べると、これら抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１）を含む。

【0087】

二重特異性抗体はダイアボディとすることもできる。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８に記載のダイアボディ技術では、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構が提供されている。この断片は、短すぎて同じ鎖上では二つのドメイン間を結合することができないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続されている重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。従って、一つの断片のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、別の断片の相補的なＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインと強制的に結合されて、それによって二つの抗原結合部位を形成する。Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１９２－１９６およびＨｅｌｆｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７６：２３２－２３９もまた参照されたい。二重特異性一本鎖ダイアボディ（「ｓｃＤｂ」）と共に、ｓｃＤｂを生成するための方法とが、例えば、Ｂｒｕｓｓｅｌｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ４：１１５－１２３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：４１－５６、およびＮｅｔｔｌｅｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３：８８２－８９１に記載されている。

【0088】

Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５（１１）：１２９０－１２９７に記載の四価（ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ）の二重可変領域免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ）分子等である二重特異性抗体の異型も本発明の方法で使用することができる。ＤＶＤ－Ｉｇ分子は、二つの異なる親抗体からの二つの異なる軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）が、直接に、または組換えＤＮＡ技術による短鎖のリンカーを介して、それに続いて短鎖定常ドメインが、タンデム型に連結されるように設計されている。二つの親抗体からＤＶＤ－Ｉｇ分子を生成するための方法は、例えば、ＰＣＴ国際公開第０８／０２４１８８号および第０７／０２４７１５号にさらに記載されている。また、例えば、米国特許出願公開第２００７０００４９０９号に記載されている二重特異性の形態も包含される。使用できる別の二重特異性の形態は、国際公開第２０１２／１３５３４５号に記載された四つのドメイン抗体様分子を改変した形態である、交差二重Ｖ領域（Ｃｒｏｓｓ－Ｏｖｅｒ Ｄｕａｌ Ｖ Ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＯＤＶ－Ｉｇ）である。ＣＯＤＶ－Ｉｇは、改変二重特異性抗体様分子に有用であることが証明されており、Ｃ末端Ｖドメイン（内部）での立体障害がＤＶＤ－Ｉｇの構築を防止できるものである。

【0089】

二重特異性抗体分子を形成するために使用されるＣ５結合抗体および／またはターゲティング部分は、例えば、キメラ、ヒト化、再ヒト化、脱免疫化、または完全ヒトとすることができ、その全てが当技術分野で周知である。

【0090】

抗Ｃ５抗体は、組換えＤＮＡ技術によって産生されてもよい。例えば、Ｃ５結合ポリペプチド（例えば、配列番号２で示すアミノ酸配列を含む、または配列番号２で示すアミノ酸配列からなる、Ｃ５結合ポリペプチド）をコードする核酸は、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終止配列、翻訳開始配列および翻訳終止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサー配列または活性化因子配列を含む、転写調節配列ならびに翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができる。調節配列は、プロモーターならびに転写開始および終止配列を含む。さらに、発現ベクターは、例えば、発現のための哺乳動物または昆虫細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核宿主において、二つの異なる生物体中で維持され得るように、二つ以上の複製系を含むことができる。

【0091】

哺乳動物細胞中を含む、多くの細胞中の核酸からの抗Ｃ５抗体の発現に関して、当技術分野で周知のいくつかの可能性のあるベクター系（プラスミドベクター系など）が利用可能である。

【0092】

発現ベクターは、核酸のその後の発現に適した方法で、当技術分野で周知の方法によって細胞内に導入され得る。

【0093】

抗Ｃ５抗体は、任意の適切な宿主細胞中で発現してもよい。適切な宿主細胞としては、例えば酵母、細菌、昆虫、植物体、及び哺乳動物の細胞が挙げられ、これには、大腸菌などの細菌、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピシア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト細胞株）、初代細胞株（例えば、初代哺乳動物細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ならびにＮＳＯなどの適切な骨髄腫細胞株が含まれる。

【0094】

一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）内で発現され、それらから精製されてもよい。例えば、抗Ｃ５抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類、ヒツジまたはヤギ）内で産生され、例えばＨｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３（６）：６２５－６２９；ｖａｎ Ｋｕｉｋ－Ｒｏｍｅｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ９（２）：１５５－１５９、およびＰｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１－２）：１４７－１５７に記載されるように乳から単離してもよい。

【0095】

抗Ｃ５抗体は、タンパク質を発現させるのに十分な条件下および時間の間、ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することによって細胞から産生してもよい。タンパク質発現のためのこのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変動し、またルーチンな実験を通して当業者によって容易に確認されることとなる。例えば、組換えＤＮＡ技術の包括的開示を有する、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ －－３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）を参照されたい。

【0096】

発現後、抗Ｃ５抗体は、当業者に公知の様々な方法で単離または精製されてもよい。

【0097】

一部の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む：

【0098】

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＨＩＦＳＮＹＷＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＧＨＴＥＹＴＥＮＦＫＤＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＦＦＧＳＳＰＮＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２４）。

【0099】

一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＧＡＳＥＮＩＹＧＡＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＬＮＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１６）。

【0100】

一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、変異ヒトＦｃ定常領域の由来となる天然のヒトＦｃ定常領域の親和性よりも高い親和性を有するヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する変異ヒトＦｃ定常領域を含むことができる。例えば、Ｆｃ定常領域は、変異ヒトＦｃ定常領域の由来となる天然のヒトＦｃ定常領域と比べて、一つ以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含むことができる。置換により、相互作用のｐＨ依存性を維持しながら、ｐＨ６．０における変異Ｆｃ定常領域を含有するＩｇＧ抗体のＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させることができる。例えば、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３－６２１６およびＤａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３５：１－９を参照されたい。抗体のＦｃ定常領域内の一つ以上の置換が、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対するＦｃ定常領域の親和性を増加させる（相互作用のｐＨ依存性を維持しながら）か否かを試験する方法は、当技術分野で公知であり、実施例に例証する。例えば、Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（３）：１７０９－１７１７；国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第９７／３４６３１号、および米国特許第６，２７７，３７５号を参照されたい。

【0101】

ＦｃＲｎに対する抗体Ｆｃ定常領域の結合親和性を高める置換は、当技術分野で公知であり、例えば、（１）Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４－２３５２４に記載のＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅの三つの置換、（２）Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３－６２１６およびＨｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３４６－３５６に記載のＭ４２８ＬまたはＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌの置換、および（３）Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８（１２）：１７５９－６９に記載のＮ４３４ＡまたはＴ３０７／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａの置換を含む。代替的な置換の組み合わせとしては、例えばＤａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（３）：１７０９－１７１７に記載されている、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４ＨおよびＤ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈがある。

【0102】

一部の実施形態では、変異定常領域（ｖａｒｉａｎｔ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）は、ＥＵアミノ酸残基２５５における、バリンに対する置換を有する。一部の実施形態では、変異定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３０９における、アスパラギンに対する置換を有する。一部の実施形態では、変異定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３１２における、イソロイシンに対する置換を有する。一部の実施形態では、変異定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３８６における置換を有する。

【0103】

一部の実施形態では、変異Ｆｃ定常領域は、それの由来であるネイティブ定常領域と比べて、３０以下（例えば、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個）のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。一部の実施形態では、変異Ｆｃ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、およびＶ３０８Ｆからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異ヒトＦｃ定常領域は、それぞれＥＵナンバリングで、４２８位にメチオニンと４３４位にアスパラギンを含む。一部の実施形態では、変異Ｆｃ定常領域は、例えば、米国特許第８，０８８，３７６号に記載される４２８Ｌ／４３４Ｓの二つの置換を含む。

【0104】

一部の実施形態では、変異定常領域は、ネイティブヒトＦｃ定常領域と比べて、アミノ酸位置２３７、２３８、２３９、２４８、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６５、２７０、２８６、２８９、２９７、２９８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３１５、３１７、３２５、３３２、３３４、３６０、３７６、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、４２４、４２８、４３３、４３４、または４３６（ＥＵナンバリング）における置換を含む。一部の実施形態では、置換は、２３７位におけるグリシンに対するメチオニン；２３８位におけるプロリンに対するアラニン；２３９位におけるセリンに対するリシン；２４８位におけるリシンに対するイソロイシン；位２５０位におけるトレオニンに対する、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン；２５２位におけるメチオニンに対する、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン；２５４位におけるセリンに対するトレオニン；２５５位におけるアルギニンに対するグルタミン酸；２５６位におけるとレオニンに対する、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグルタミン；２５７位におけるプロリンに対する、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、またはバリン；２５８位におけるグルタミン酸に対するヒスチジン；２６５位におけるアスパラギン酸に対するアラニン；２７０位におけるアスパラギン酸に対するフェニルアラニン；２８６位におけるアスパラギンに対する、アラニンまたはグルタミン酸；２８９位におけるトレオニンに対するヒスチジン；２９７位におけるアスパラギンに対するアラニン；２９８位におけるセリンに対するグリシン；３０３位におけるバリンに対するアラニン；３０５位におけるバリンに対するアラニン；３０７位におけるトレオニンに対する、アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン、３０８位におけるバリンに対する、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、またはトレオニン；３０９位におけるロイシンまたはバリンに対する、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、もしくはアルギニン；３１１位におけるグルタミンに対する、アラニン、ヒスチジン、またはイソロイシン；３１２位におけるアスパラギン酸に対する、アラニンまたはヒスチジン；３１４位におけるロイシンに対する、リシンまたはアルギニン；３１５位におけるアスパラギンに対する、アラニンまたはヒスチジン；３１７位におけるリシンに対するアラニン；３２５位におけるアスパラギンに対するグリシン；３３２位におけるイソロイシンに対するバリン；３３４位におけるリシンに対するロイシン；３６０位におけるリシンに対するヒスチジン；３７６位におけるアスパラギン酸に対するアラニン；３８０位におけるグルタミン酸に対するアラニン；３８２位におけるグルタミン酸に対するアラニン；３８４位におけるアスパラギンまたはセリンに対するアラニン；３８５位におけるグリシンに対するアスパラギン酸またはヒスチジン；３８６位におけるグルタミンに対するプロリン；３８７位におけるプロリンに対するグルタミン酸；３８９位におけるアスパラギンに対する、アラニンまたはセリン；４２４位におけるセリンに対するアラニン；４２８位におけるメチオニンに対する、アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンの；４３３位におけるヒスチジンに対するリシン；４３４位におけるアスパラギンに対するアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリン、トリプトファン、またはチロシン；および、４３６位におけるチロシンまたはフェニルアラニンに対するヒスチジン、からなる群からのために選択され、すべてＥＵナンバリングによる。

【0105】

抗Ｃ５抗体は治療剤として使用されてもよく、任意の適切な剤形／組成物として、また任意の適切な経路によって（例えば、ＩＶ注射によって）、それを必要とする患者に投与される。抗Ｃ５抗体はまた、本明細書に開示される方法において捕捉抗体または検出抗体としても使用されうる。

【0106】

逆分離（Ｂａｃｋ Ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）ＥＬＳＩＡアッセイモデリング

【0107】

標的バイオマーカー／有効性バイオマーカーを定量化する場合、従来のプレートベースのリガンド結合アッセイでは、遊離分析物を過大評価する可能性がある。このような状況での遊離分析物の過大評価は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での真のものよりも有効性の欠如がより低く示唆される。エクリズマブは、２つの極めて稀な疾患の適応症に認可されたｍＡｂ治療薬であり、補体因子Ｃ５（１９０ｋＤ）を標的とする。薬剤の存在下での遊離Ｃ５の適切な定量化が重要である。

【0108】

Ｂｉａｃｏｒｅの結果に基づくと、従来のプレートベースのリガンド結合アッセイでは、エクリズマブ－Ｃ５複合体の約１５％が、２５℃でｋ_ａ＝約１．１ｅ^６（１／Ｍ ｓ）およびｋ_ｄ＝４．６ｅ^－５（１／ｓ）で６０分で解離する。

【0109】

表１に、その抗原に対して結合したままの抗体の量（％で）を、時間の関数（Ｋｄ－１秒当たりの解離の割合）として示している。

【0110】

表１

【表1】

【0111】

実験的証拠は、ＥＬＳＩＡプレートに結合している抗原が、溶液およびプレートに対して平衡に到達するのに少なくとも３０時間が必要であることを示す。

【0112】

臨界パラメータは、インキュベーション時間、希釈時間、希釈温度、および試料対アッセイ範囲である。プレートインキュベーション時間が短いと、解離が減少する場合がある。二つの希釈工程中に冷却することで、速度ｋ_ｄを遅くし、抗原－ｍＡｂおよび抗原－ｍＡｂ－抗原が解離しないようにさせることができる。希釈時間を短くすると、解離が減少する場合がある。希釈の不足が解離を減少させうる。可能であれば、純粋な試料を測定する。

【0113】

抗原濃度及びｍＡｂ濃度（ＰＫ）のデータの不一致は、以下に原因がある：アッセイの希釈および時間が異なること；測定された抗原濃度が、遊離抗原の過大評価であること；および測定されたｍＡｂ（ＰＫ）が、希釈による解離に起因した真の遊離ｍＡｂの過大評価であること、および溶液抗原（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）に起因した総ｍＡｂの過小評価であること。

【0114】

溶血モデリング（Ｃ５を含有するヒト血清試料についての溶血アッセイを使用する）が、抗原、ＰＫ、および溶血（ＰＤ）データの不一致は以下に原因があるということを示唆している：アッセイの希釈および時間が異なること；測定された抗原濃度が、溶血アッセイにおける遊離抗原の過大評価であること；および測定されたｍＡｂ－エクリズマブ－（ＰＫ）が、希釈による解離に起因した真の遊離ｍＡｂの過大評価であること、および溶液抗原に起因した総ｍＡｂの過小評価であること；ならびに、測定された溶血が、希釈による解離に起因した真の遊離抗原の過大評価であること。

【0115】

平衡方程式

【0116】

【数1】

【0117】

ｍＡｂ＋Ｌ＝ｍＡｂ＊Ｌ

【0118】

【数2】

【0119】

Ｋ_ｄ＝１／ｋ_ａ＝［Ｍａｂ］_遊離ｘ［Ｌ］_遊離／［Ｍａｂ＊Ｌ］_結合

【0120】

【数3】

【0121】

Ｋ_ｄ＝解離定数、Ｋ_ａ＝会合定数

【0122】

Ｋ_オフ＝解離速度、ｋ_オン＝会合速度

【0123】

投与後は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の可溶性Ｌ（リガンド）に対するｍＡｂの結合は、質量作用の法則に従うものと仮定した。試料採取、保存などの生体外での条件は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）とは異なる条件に平衡が移行しうる。

【0124】

ｋ_オフの値は多くの場合、温度と緩衝液への感度が高い。平衡時間は、３０℃の場合と比較して、０℃で約３０倍増加する。解離速度定数は、常にアッセイの条件下で決定する必要がある。

【0125】

Ｌ_遊離の測定

【0126】

薬物開発において決定を下すために次第に使用されてきており、用量とスケジュールの選択に有用である。Ｌの動態を理解することが、有効なｍＡｂ_遊離レベルの規定の助けとなり得る。

【0127】

遊離Ｃ５標的リガンドの測定アッセイ

【0128】

変形されたＥＬＩＳＡアッセイフォーマット

【0129】

ＥＬＩＳＡを実施する前に結合フォームを除去する。ＢｉａｃｏｒｅまたはＥＬＩＳＡを使用して解離量を測定し、測定されているものから減算する。ＬＣ／ＭＳまたはその他の方法を使用して総エクリズマブ濃度を測定し、総Ｃ５を決定する。平衡方程式を使用して遊離Ｃ５を計算する。計算は平衡方程式に基づくが、それには生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のＫ_ｄを正しく推定する必要がある。

【0130】

変形されたＭＳＤ遊離Ｃ５アッセイ

【0131】

試料のインキュベーションは、６０分から、提案される１５分間のインキュベーションに減少させた。試料希釈は１：１０００から１：２（５０％血清）に減少させた。室温の代わりに氷上で試料をインキュベートして、おそらく解離が減少された。

【0132】

ＥＬＩＳＡの前に、以下の結合フォームを除去する：

【0133】

分子ふるい

【0134】

固相抽出

【0135】

アフィニティ分離、すなわちプロテインＧ、プロテインＡまたは抗ヒトＦＣカラム

【0136】

カラムまたはフィルタへの吸着により、追加のプロセスが誤差を発生させる場合がある

【0137】

解離も発生し得、またプロセスは労働集約型である

【0138】

遊離Ｃ５を定量化する方法の特定の実施形態

【0139】

本明細書に開示される方法において、Ｇｙｒｏｓシステム（スウェーデン、ウプサラのＧｙｒｏｓ ＡＢ社；ｗｗｗ．ｇｙｒｏｓ．ｃｏｍ）を使用する。Ｇｙｒｏｓアッセイは、秒単位で微細構造に沿って試料を通過させるため、逆向きである解離が生じる機会はあり得ない。Ｇｙｒｏｓシステムは、アフィニティ流動フォーマットを使用し、インキュベーションを省き、実行時間が短縮される。Ｇｙｒｏｓプラットフォームは、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォームに統合される高再現性のナノリットルマイクロ流体工学により設計されたＧｙｒｏｓ専有ＣＤ技術を使用するが、それがレーザー誘導蛍光検出を使用した平行性プロセッシングを伴う免疫アッセイを自動化する。このことは、ＣＤ内に含まれるナノリットルスケールのマイクロ流体構造を通る液体の流れを導く、遠心力および毛細管力の正確で自動化された制御を通して可能となる。

【0140】

円形のＢｉｏａｆｆｙコンパクトディスク（ＣＤ）を使用する。ＰＣＲプレートは、試料および試薬のために使用しうる。多くの利用可能なＰＣＲプレートを使用してよい。プレートは箔で封止され、蒸発を防止する。捕捉試薬（ビオチン化抗Ｃ５抗体など）は、毛細管作用によってＣＤに入る。疎水性部が液体の流れを停止させる。このＣＤは、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰなどのアッセイ専用の機器の内部で遠心力を受ける。この遠心力により、試薬が、ＣＤ内部のカラムの中へと動かされる。捕捉試薬は、カラム内のストレプトアビジン被覆粒子に結合する。その後試料が、毛細管作用によってＣＤに入り、活性化されたカラムに試料が付着する。その後検出試薬（例えば、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５抗体、捕捉試薬として使用される抗Ｃ５抗体とは異なるエピトープに結合するもの）が、毛細管作用によってカラムに入り、カラムに付着する。その後、カラムをレーザーでスキャンする（９０秒以内に１１２カラム）。Ｒｅｘｘｉｐ Ａは、標準試料、ＱＣ、試料に用いられ得、またＲｅｘｘｉｐ Ｆは、検出Ａｂに用いられ得る。次いで、レーザー誘導蛍光を使用して、試料（例えば、Ｃ５）の濃度または量を測定する。

【0141】

Ｇｙｒｏｓアッセイは、使用するサンプル量が非常に少なく（４μｌなど）、所要時間が非常に短い（１．５時間など）。較正範囲は０．７８ｐＭ～３００ｐＭである。

【0142】

本開示は、試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法を提供するものであって、該方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ ＣＤに毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｂ．試料中の遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することであって、試料が毛細管作用によってＣＤに付着して、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該試料が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子上に結合したビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、
ｃ．捕捉された遊離Ｃ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によってＣＤに付着して、該抗Ｃ５検出抗体が、捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該検出抗体が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子上に結合された捕捉抗体に結合された遊離Ｃ５へと動かされることと、
ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含む。

【0143】

Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ ＸＰなどのＧｙｒｏアッセイを使用するために適切な任意の機器を使用してもよい。

【0144】

特定の実施形態では、Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液が試料に使用され、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液が、検出抗体を希釈するのに使用される。任意の適切な緩衝液を使用してもよい。

【0145】

特定の実施形態では、Ｇｙｒｏｓ機器が、Ｂｉｏａｆｆｙ ｗａｓｈ １およびｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングされる。任意の適切な緩衝液を使用してもよく、プライミングは省いてもよく、また任意の適切な回数でなされてもよい。

【0146】

他の態様では、試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法を提供するものであって、該方法が、ａ．ストレプトアビジン被覆されたメソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標））（ＭＳＤ（登録商標））（メリーランド州ロックビルのＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｓｏｓｃａｌｅ．ｃｏｍ／ｅｎ）９６ウェルアッセイプレートに対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることと、ｂ．試料を該プレートに添加することによって、試料中の遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することと、ｃ．ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ標識した抗Ｃ５（特定の実施形態では、ルテニル化（ｒｕｔｈｅｎｙｌｅｄ）されたｓｕｌｆｏ－ｔａｇ標識した抗Ｃ５）検出抗体をプレートに添加することにより捕捉された遊離Ｃ５を検出することと、ｄ．電気化学発光を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含むものであって、試料が約１：２で希釈され、試料が氷上に保持され、工程ｂ～ｃは約１５～３０分であり、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体は、約５μｇ／ｍＬの濃度で添加される。

【0147】

エクリズマブで治療された患者からの血清試料などである試料中のＣ５は、遊離（非結合）していてもよく、またはエクリズマブに結合していてもよい。

【0148】

特定の実施形態では、この方法が、工程ｄから得たデータをＣ５枯渇試料に添加した既知の量のＣ５から作成した標準曲線と比較することによって、試料中の遊離Ｃ５抗体の濃度または量を計算することをさらに含む。コントロールを含む試料は、患者の試料と同じ方法で処理される。

【0149】

特定の実施形態では、この方法は、Ｇｙｒｏｓ Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアまたは他の好適なソフトウェアを用いて遊離Ｃ５抗体の濃度を計算することをさらに含む。

【0150】

特定の実施形態では、試料はヒト患者から獲得される。特定のさらなる実施形態では、試料は血清試料である。さらに他の実施形態では、試料は、エクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０などの抗Ｃ５抗体で治療を受けている患者からのものである。特定の実施形態では、試料はエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０での治療前に採取される。他の実施形態では、試料はエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０での治療後に採取される。試料は、Ｃ５を含みうる任意の適切な試料であってもよく、血清、血漿、血液、尿、固体試料などであってもよい。試料は、当技術分野で公知の方法に従って、使用のために取得されて調製されてもよい。

【0151】

特定の実施形態では、ビオチン化捕捉抗体はエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０である。ビオチン化捕捉抗体は、任意の抗Ｃ５抗体であってもよい。

【0152】

特定の実施形態では、抗Ｃ５検出抗体はＮ１９－８（マウス抗ヒトＣ５抗体）である。抗Ｃ５検出抗体は、任意の抗Ｃ５抗体であってもよい。任意の所与のアッセイにおける抗Ｃ５検出抗体は、そのアッセイで使用される捕捉抗体と比較してＣ５上の異なるエピトープを認識するものであり；そのため、Ｃ５への結合は、捕捉抗体と競合しない。

【0153】

抗体をビオチンまたはアレクサフルオールと複合化する方法は当技術分野で公知である。

【0154】

特定の実施形態では、試料が患者からのヒト血清試料であり、抗Ｃ５抗体で治療する前および治療した後の患者の血清試料の遊離Ｃ５が定量化され、治療前および治療後の試料はいずれも同じ希釈で希釈される。さらなる実施形態では、使用される希釈は１：３０である。

【0155】

例示的な使用

【0156】

本明細書に開示される方法は、試料中の遊離（非結合）Ｃ５の濃度または量を定量化する必要がある任意の目的に使用されうる。この方法は、例えば、エクリズマブ療法によって治療されている患者からのヒト血清試料中の遊離（非結合）Ｃ５の濃度または量を検出するために使用することができる。こうした試料の遊離（非結合）Ｃ５の濃度または量は、患者の疾患状態のモニタリングを可能にする。このアッセイは、治療法として使用されるエクリズマブに結合したＣ５分子ではなく、遊離（非結合）Ｃ５を定量化するような例において有利である。

【0157】

遊離Ｃ５が適切に定量化されることは、疾患状態のモニタリング、モデリング、投薬量選択、ラベル・クレームなどの複数の理由にとって不可欠である。

【実施例】

【0158】

実施例

【0159】

本発明についてよりよく理解するために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は、説明のみを目的としており、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。

【0160】

実施例１ 遊離Ｃ５を定量化するＧｙｒｏｌａｂプラットフォーム

【0161】

補体タンパク質Ｃ５は、補体カスケードの重要な成分であり、アレクシオン社の薬物、エクリズマブおよびＡＬＸＮ１２１０の標的である。この標的を適切に定量化することは、モデリングおよびラベル・クレームの両方にとって不可欠である。遊離標的のための捕捉試薬として薬剤を使用する多くのリガンド結合アッセイフォーマットは、試料インキュベーション中に、捕捉試薬が既にマトリックス中の薬剤に結合した標的との動的平衡を作ることがあるという点で、本質的に不備がある。この平衡により、アッセイは、マトリックス中の遊離標的の量の過大評価が可能であり、これによって潜在的に不正確なモデリング、投薬選択、データファイリング、およびラベル・クレームにつながる。

【0162】

リガンド結合アッセイにおけるこの過大評価を克服するための共通戦略は、試料のインキュベーション時間を短縮することであり、これによって捕捉試薬がマトリックス中の薬剤から結合した標的を引き出す機会が減少する。これを達成するためには、被覆試薬の濃度を５倍ほど増加させる必要性がしばしばあるが、これは短縮された試料インキュベーションの効果を本質的に最小化することがある。また、治療前の試料は、治療後の試料よりもずっと高いレベルで遊離標的を持つ傾向があり、しばしば状況毎に異なる試料希釈を必要とする。

【0163】

Ｇｙｒｏｌａｂ技術は、アッセイ洗浄液、試薬、およびプロスクライブド（ｐｒｏｓｃｒｉｂｅｄ）間隔でディスク上の微細構造の全体にわたってスピンされる試料に基づく。捕捉試薬が固定化された微細構造の全体にわたって、試料がスピンされるのに必要な時間は、約６秒であるため、理論的には、マトリックス中の結合されたどの標的にとっても、解離して、また捕捉抗体として使用される薬剤に結合される時間はほとんどない。さらに、Ｇｙｒｏｓアッセイの広いダイナミックレンジでは、治療前の試料に対してはある希釈、治療後の試料に対しては別の希釈とするのではなく、試験試料の範囲の全体にわたって普遍的な一つの試料希釈を持つことがより適切である。

【0164】

材料および方法

【0165】

材料：

【0166】

Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ディスク、Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液、ｐＨ１１緩衝液、プレート箔（ニュージャージー州ウォレンのＧｙｒｏｓ ＵＳ社）

【0167】

精製したヒトＣ５、Ｃ５枯渇血清（テキサス州タイラーのＣｏｍｐＴｅｃｈ社）

【0168】

ビオチン化エクリズマブ、ビオチン化ＡＬＸＮ１２１０、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識Ｎ１９／８抗体（コネチカット州ニューヘイブン、Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）

【0169】

９６ウェルＰＣＲプレート、Ｂｉｏａｆｆｙ ｗａｓｈ １（０．１％のＴｗｅｅｎ ２０、０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）（すべてマサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー社製の洗浄液成分）

【0170】

機器：

【0171】

Ｇｙｒｏｓ ｘＰｌｏｒｅまたはＸＰワークステーション機器（ニュージャージー州ウォレンのＧｙｒｏｓ ＵＳ社）

【0172】

方法：

【0173】

Ｇｙｒｏｓ機器は、各緩衝液自身のステーションをもつ、Ｂｉｏａｆｆｙ ｗａｓｈ １およびｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングされる。これらのプライミングサイクル中（それぞれ約２０分間）に、アッセイ試薬、洗浄液および試料を以下に記載するとおり調製する。実行に必要な数のＢｉｏａｆｆｙ ２００ディスク（Ｇｙｒｏｓ ｘＰｌｏｒｅの場合一枚、Ｇｙｒｏｓ ＸＰワークステーションの場合最大五枚）を、冷蔵庫から取り出して、周囲室温にさせる。

【0174】

アッセイの標準曲線は、精製したヒトＣ５タンパク質から作成し、該精製したヒトＣ５タンパク質は、３００μｇ／ｍＬでＣ５枯渇ヒト血清中にスパイク（添加）され、その後３００（初回スパイク）、１００、３３．３、１１．１、３．７０、１．２３、０．４１、０．１４、０．０４５、０．０１５、および０．００５μｇ／ｍＬのとおりに３倍希釈される。０．００５μｇ／ｍＬ標準試料がアンカーポイントである。Ｃ５枯渇血清中で作成する場合、曲線は、Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液中で１：５で希釈され、混合され、次いで最終希釈を１：３０として混合しながら、Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液中で１：６でもう一回希釈される。希釈した標準試料を、それぞれの位置にそれぞれの必要量でＰＣＲプレートに移す。

【0175】

品質管理（ＱＣ）試料は、標準試料と同じ方法で調製される。精製したヒトＣ５は、２４０、１０．０、および０．０４５μｇ／ｍＬでＣ５枯渇ヒト血清中にスパイクされる。次いで、これら試料は、最終希釈１：３０の標準曲線試料について説明した通り、二回（Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液中で１：５で、その後１：６で）希釈される。必要に応じて、検出限界における試料（検出上限（ＵＬＯＱ）は３００μｇ／ｍＬ、また検出下限（ＬＬＯＱ）は０．０１５μｇ／ｍＬ）を、同様に調製する。希釈されたＱＣを、それぞれの位置にそれぞれの必要量でＰＣＲプレートに移す。

【0176】

未知のヒト血清試料は、最終希釈１：３０として、二回（Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液中で１：５で、その後１：６で）希釈される。希釈された未知の血清試料を、それぞれの位置にそれぞれの必要量でＰＣＲプレートに移す。

【0177】

ビオチン化捕捉試薬（エクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０）は、Ｂｉｏａｆｆｙ ｗａｓｈ １中で作用濃度１００μｇ／ｍＬに調製されて、アレクサフルオール標識されたＮ１９／８は、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ中で作用濃度１μｇ／ｍＬに調製される。これら試薬の両方を、必要な量でＰＣＲプレート上のそれぞれの所定位置に移す。Ｂｉｏａｆｆｙ ｗａｓｈ １はアッセイ緩衝液として使用され、ＰＣＲプレート上のそれぞれの所定位置に搭載される。

【0178】

標準試料、ＱＣ、任意の未知の血清試料、アッセイ試薬、およびアッセイ洗浄液を搭載したＰＣＲプレートを、箔で封止し、その後Ｇｙｒｏｓ機器に搭載する。必要数のＢｉｏａｆｆｙ ２００ディスクもまた当該機器に搭載する。

【0179】

Ｇｙｒｏｓクライアントソフトウェアを使用して、Ｇｙｒｏｓシステムでアッセイを行う。これは三工程のアッセイ（捕捉、分析物、検出）であり、捕捉抗体、試料、および検出抗体がプログラムされた間隔で、間欠的な洗浄工程の合間に添加される。アッセイ実行時間は一ディスク当たり約一時間である。データはＧｙｒｏｓ Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアによって処理されるか、またはＷａｔｓｏｎなどのラボ情報システム（ＬＩＭＳ（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ））へのインポートのためにエクスポート可能である。このアッセイでは、応答の重み付けを伴う５ＰＬの曲線フィッティングを使用する。

【0180】

結果

【0181】

ヒト血清中の遊離Ｃ５の定量化のためのＧｙｒｏｓアッセイは、使用される捕捉試薬（エクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０）に関わらず、０．０３９～１８．７５μｇ／ｍＬまたは０．０１５～３００μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを持つ。このダイナミックレンジおよび試料希釈（特定の実施形態では、初回の治療前の試料については１：２０～１：３０、その後、初回治療後のすべての試料について２倍）は、２４０μｇ／ｍＬ程度の高さの遊離レベルを有するであろう治療前か（しかしながら２００μｇ／ｍＬを超えるのは稀である）、または０．５μｇ／ｍＬより低い良好なレベルを持つであろう治療後のいずれかの、全ての予想される濃度の試料をカバーする。捕捉試薬としてＡＬＸＮ１２１０を用いた、この範囲にわたるアッセイ性能についての詳細は、表２を参照されたい。

【0182】

表２ ヒト血清中の遊離Ｃ５測定のダイナミックレンジにわたるＧｙｒｏｓ ＱＣ性能（２日間、４回の別個の実行）

【表2】

【0183】

標的バイオマーカーアッセイの選択性は、重要なアッセイパラメータである。表３は、それぞれの試料中に既にある内因性Ｃ５のレベルの測定において相加効果を有する、５０μｇ／ｍＬの精製されたＣ５の参照物質でスパイクされた１０人のドナーの血清に関するデータを示す。Ｇｙｒｏｓアッセイは、この内因性の結合相手を含む試料中にスパイクさせた精製されたＣ５を正確に測定した。

【0184】

表３ ヒト血清中の遊離Ｃ５に対する１０人のドナー試料のＧｙｒｏｓ選択性（ＡＬＸＮ１２１０捕捉）

【表3】

【0185】

平行性は、それが代替マトリックス（ここでは、Ｃ５枯渇ヒト血清）の標準曲線とその精製された参照物質（ここでは、精製されたヒトＣ５）との適合度を決定しうるものとなるため、バイオマーカーアッセイで決定される重要な要素である。プロスクライブド（ｐｒｏｓｃｒｉｂｅｄ）希釈１：３０の前に追加希釈でマトリックス試料を事前処理することによって、平行性が、代替の曲線とそれから測定された未知試料との間におけるアッセイ応答についての相違を表すことができる。図１は、上述のＱＣ試料と同様に調製される三個体のドナーの血清および三つのＱＣ試料についての両方の濃度についての平行性の結果を示す。これらデータは、アッセイが平行性を持ち、代替の曲線が適切であることを示唆する。図１ Ｃ５枯渇血清中でスパイクされた個体血清試料およびＱＣ試料は、その後、平行性試験パスするＭＲＤの前に、同じ血清中で希釈した。

【0186】

ヒト血清プールに、様々な濃度のエクリズマブでスパイクした。これを、様々な濃度のＡＬＸＮ１２１０を用いて、同一プールの別のアリコートで繰り返された。スパイクされた試料の両セットを、プレートベースの遊離Ｃ５アッセイおよびＧｙｒｏｓ遊離Ｃ５アッセイの両方でアッセイした。エクリズマブをスパイクした試料を、両方のアッセイプラットフォーム上で捕捉試薬としてエクリズマブを用いてアッセイし、いずれにおいても、ＡＬＸＮ１２１０を捕捉として用いてＡＬＸＮ１２１０試料をアッセイした。表４および５は、それぞれ、プレートベースアッセイ、Ｇｙｒｏｓアッセイの結果を示す。スパイクした試料の各セットについてのＧｙｒｏｓアッセイの結果の方が低く、プレートベースのアッセイとは異なることを示しており、血清中の薬剤から引き出されて捕捉試薬に結合している結合Ｃ５はほとんどない。

【0187】

表４ ＡＬＸＮ１２１０およびエクリズマブをスパイクした、ヒト血清中の遊離Ｃ５に関するプレートベースアッセイ結果

【表4】

表６ ＡＬＸＮ１２１０およびエクリズマブをスパイクした、ヒト血清中の遊離Ｃ５に関するＧｙｒｏｓアッセイ結果

【0188】

【表6-1】

【0189】

考察

【0190】

ヒト血清中の遊離Ｃ５の定量化のためのＧｙｒｏｓアッセイは、広いダイナミックレンジ（エクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０の捕捉試薬いずれかで、０．０１５～３００μｇ／ｍＬ）を持つ。試料希釈１：３０でのこのダイナミックレンジにより、治療前の試料および治療後の試料の両方の測定が可能になり、それによってそれぞれのシナリオ毎に異なる希釈にする必要性がなくなる。このように共通の希釈により、試料が誤った希釈でアッセイされる可能性があるような試料処理の誤差も除去される。

【0191】

アッセイの選択性および平行性が、代替マトリックスおよび参照物質が、ヒト血清中で測定される内因性の結合相手に適切であるということを示している。

【0192】

いずれも捕捉試薬を治療薬として使用することによる、Ｇｙｒｏｓアッセイおよびプレートベースアッセイの両方で実行されたスパイクした試料からのデータによれば、Ｇｙｒｏｓアッセイが、血清試料中の薬剤に既に結合しているＣ５との何らかの平衡に達するように薬物が捕捉試薬として使用されることの可能性を大幅に減少させていることが示唆される。この平衡およびそれに関連する真に遊離であるＣ５を過剰に定量化する可能性におけるこうした減少は、共通の試料希釈を許容する拡大されたダイナミックレンジに加えて、エンドユーザーに対してより正確な測定を可能にさせる。

【0193】

実施例２ 遊離Ｃ５のＧｙｒｏアッセイ

【0194】

アッセイパラメータ

【0195】

１００μｇ／ｍＬの捕捉Ａｂ

【0196】

１μｇ／ｍＬの検出Ａｂ

【0197】

参照物質としての精製されたヒトＣ５

【0198】

標準試料およびＱＣの調製用Ｃ５枯渇血清

【0199】

Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ｎＬ ディスク

【0200】

標準試料、ＱＣ、試料（試料希釈３０）のためのＲｅｘｘｉｐ Ａ

【0201】

検出ＡｂのためのＲｅｘｘｉｐ Ｆ

【0202】

洗浄液１：Ｂｉｏａｆｆｙ ｗａｓｈ １

【0203】

洗浄液２：ｐＨ１１緩衝液

【0204】

３工程アッセイ（Ｃ－Ａ－Ｄ）

【0205】

ＰＭＴ １％

【0206】

通例のプレートベースのＥＣＬアッセイフォーマットは、０．０２７４～２０．０ μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを持つ。

【0207】

試料希釈スキーム：前治療用を２０、治療用を２

【0208】

典型的な内因性の遊離Ｃ５濃度は５０．０～１５０．０μｇ／ｍＬの範囲である。

【0209】

提案される曲線範囲は０．００５～３００．０μｇ／ｍＬであり、すべての試料について共通の希釈であることが好ましい。

【0210】

図２および図３は、７個体のドナー血清の平行性を示す。これは従来のＥＣＬアッセイに対する改良であり、ＭＲＤを超える希釈ではリターンの減少をもたらした。

【0211】

早期ＣＲＯアッセイの移管の結果を、図４Ａおよび図４Ｂ（２日間の要約データ；ＱＣレベル毎にＮ＝６（二回実行、それぞれＮ＝３）（ＭＲＤ（３０）の確認））に示している。定量限界が所望のアッセイ範囲をカバーし；一つの希釈率で、予想されるすべての事象がカバーされる。図４Ｃは、早期ＣＲＯの移管の結果における選択性を示す。

【0212】

図５は、ＭＲＤ（ｍｉｎｉｍｕｍ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ（最小必要希釈率））は３０が最適であることを示す。２５～３０になると、低い最終感度が幾分失われ（５ｎｇ／ｍＬ対１５ｎｇ／ｍＬ）；１５ｎｇ／ｍＬでもＥＣＬ（電気化学発光）アッセイよりも２倍感度が高い。

【0213】

図６は、キャリーオーバー評価でキャリーオーバーがないことを示し、試薬の濃度およびパラメータが確認される。

【0214】

図７は、要約比較を示す。

【0215】

実施例３ メソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標））の電気化学発光技術を使用した従来技術の遊離Ｃ５アッセイ

【0216】

従来技術の遊離Ｃ５アッセイには、制約があることが証明されている。以下に一例を示す。

【0217】

この従来技術の遊離Ｃ５アッセイは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）電気化学発光技術を使用したヒト血清試料中の遊離Ｃ５補体タンパク質を定量化するよう設計されている。エクリズマブをビオチンと複合化し、ストレプトアビジン被覆されたＭＳＤ（登録商標）９６ウェルアッセイプレート上に固定される。アッセイ標準曲線試料は、Ｃ５枯渇血清中の精製されたヒトＣ５の段階希釈によって調製され、試験および品質管理試料と共にプレートに添加される。固定したエクリズマブに対して捕捉されたＣ５は、エクリズマブにより結合されたエピトープとは異なるＣ５上のエピトープと結合するＭＳＤ（登録商標）ＳｕｌｆｏＴａｇと複合化したＮ１９－８を使用して検出される。Ｎ１９－８－タグは、アッセイプレートの電極表面で電気化学刺激が開始されると、ＥＣＬ信号として光を放射する。信号の強度は、捕捉されたＣ５の量に比例する。捕捉された複合体のＥＣＬ信号は、ＭＳＤ（登録商標）Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００を使用して測定する。重み付けされた４パラメータの曲線フィッティングの標準曲線は、ｙ軸に標準試料のＥＣＬ信号を、ｘ軸上の対応するＣ５濃度に対してプロットすることによって作成する。各血清試料中のＣ５の濃度は、既知のＣ５濃度の標準曲線に対して、標準曲線の直線領域にある値を用いて試料のＥＣＬ信号を補間することによって求めることができる。標準曲線の希釈、ＱＣ試料、および患者試料のそれぞれについて、三つ組のウェルの平均を計算し、報告している。

【0218】

このアッセイは、エクリズマブの存在下で遊離Ｃ５を測定するための特定の制約を有することが分かっている。エクリズマブと結合するＣ５とのモル比（１：２．５３）に基づく理論的計算と比較して、測定された遊離Ｃ５濃度の間にある一貫したバイアスを記録した。このバイアスは、エクリズマブが高濃度（３５～２０００μｇ／ｍＬ）であってさえも遊離Ｃ５の過大評価を導く。したがって、様々なＣ５濃度に対して３５μｇ／ｍＬのエクリズマブをスパイクすることによってアッセイの制約を評価するためにある実験が実施された。この結果は、測定された遊離Ｃ５濃度と理論的な遊離Ｃ５濃度との間のバイアスをはっきりと示した。このバイアスは、アッセイ手順の間に、試験試料中のエクリズマブとＣ５とが解離することによって生じ得る。特定のアッセイ条件は、ル・シャトリエの法則に基づいて解離の方へ結合平衡をシフトするように決定される。

【0219】

アッセイの変形および根拠

【0220】

同じアッセイプラットフォームを使用して、以下の表に要約されているとおり新しいＣ５アッセイに四つの主要な変形を実施した。

【0221】

表６：これまでの遊離Ｃ５アッセイに対する変形

【表6-2】

【0222】

結果

【0223】

この四つの変形により、アッセイの真度（ａｃｃｕｒａｃｙ）の点に関してこれまでの遊離Ｃ５アッセイと新しい遊離Ｃ５アッセイとを比較するために追加の実験を実施した。人体で確認されることが予測される目標濃度を説明するために、理論的に計算された遊離Ｃ５濃度を生成した。様々な濃度のエクリズマブを、プールした正常ヒト血清中にスパイクし、これまでの遊離Ｃ５アッセイと新しい遊離Ｃ５アッセイとの両方で測定した。この結果は、新しい遊離Ｃ５アッセイが、理論上の値と比較してはるかに正確な結果をもたらしたということを強く示唆する。さらに、この結果は、複数の異なるアナリストによって確認され、アッセイの真度、精度および堅牢性が実証された。すべての結果は、アッセイの範囲内（０．００１６～２０μｇ／ｍＬ）にあり、精度が≦２５％のＣＶである。

【0224】

表７：これまでのＣ５アッセイ対 新しいＣ５アッセイの結果の比較

【表7】

＊生理緩衝液中で７０μｇ／ｍＬの平均ヒトＣ５濃度を使用した結合化学量論に基づいて算出された理論濃度。

【0225】

結論

【0226】

これまでの遊離Ｃ５アッセイに対する変形が、エクリズマブ－Ｃ５間の解離の影響を最小化することによってアッセイの真度の改善をもたらした。バイアス％は、濃度≧２５０μｇ／ｍＬで、遊離Ｃ５の理論的な％と比較して、エクリズマブ濃度が増加するに伴って増加する。血清遊離Ｃ５は、新しいアッセイでは、結果的にエクリズマブ濃度が≧２５０μｇ／ｍＬとなり、したがって注意深く解釈されるべきである。しかしながら、これらの非常に低いレベルである遊離Ｃ５濃度では、臨床試料中で溶血が開始されることが予想されない。

【0227】

これまでのアッセイと比較して新しい血清遊離Ｃ５アッセイが改善された性能であるため、エクリズマブ被覆プレートからＡＬＸＮ１２１０被覆プレートへの切り替えは、ＡＬＸＮ１２１０血清試料中での遊離Ｃ５の測定値がより反映されることを確実にするように適合される。

【0228】

実施例４ ＧｙｒｏＬａｂプラットフォームを使用したヒト血漿中のＣ５ａの定量化アッセイ

【0229】

この試験は、ヒト血漿中の遊離Ｃ５ａを測定するためのＧｙｒｏｓアッセイを検証した。このアッセイでは、ＧｙｒｏＬａｂプラットフォームを用いて、遊離Ｃ５ａおよびＡｌｅｘａ ６４７標識抗Ｃ５ａ抗体を捕捉し、ヒト血漿中のＣ５ａを検出するためにビオチン化抗体（ＡＬＸＮ１００７）を使用した。この試験により、この方法がヒト血漿中のＣ５ａの定量化のその意図された目的に適切であるということが示された。

【0230】

略語：
ＢＰＭ：バイオ分析プロジェクトマネージャー（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｍａｎａｇｅｒ）
ＣＶ：変動係数
Ｃ５ａ：補体因子５ａ
低ＶＳ：低検証試料
中ＶＳ：中検証試料
高ＶＳ：高検証試料
ＬＬＯＱ：定量下限
ＵＬＯＱ：定量上限
ＢＬＱ：定量限界より下
ＡＬＱ：定量限界より上
ＭＲＤ：Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ（最小必要希釈率）
ＰＢＳＴ：リン酸緩衝生理食塩水、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ

【0231】

Ｃ５ａ ＤｅｓＡｒｇ精製ヒト補体タンパク質を０．５１ｍｇ／ｍＬで参照標準として使用する。

【0232】

１１個のゼロでない標準からなる新たに作成された定量化標準曲線を、Ｃ５ａでスパイクし、Ｒｅｘｘｉｐ ＡＮ緩衝液に希釈し、試験されるすべてのＣＤ上に含有させた。ブランクも試験され、すべてのＣＤに含まれた。Ｃ５ａの濃度は、６０、３０、１５、７．５、３．７５、１．８８、０．９３８、０．４６９、０．２３４、０．１１７、及び０．０５９ｎｇ／ｍＬであった。０．０５９ｎｇ／ｍＬおよび０．１１７ｎｇ／ｍＬのデータポイントをアンカーポイントとして評価した。すべての検量線用標準試料を試験前にアッセイ希釈液で２倍に希釈し、試験される各ＣＤにおいてデュプリケートで試験した。Ｇｙｒｏｌａｂ ＸＰでは、同じウェルから試料を二回添加することによってデュプリケートで実施した。このデータを、Ｇｙｒｏｓデータ解析ソフトウェア内の五パラメータのロジスティック曲線回帰モデルにあてはめた。

【0233】

バイオマーカーＣ５ａの上限（ＵＬＯＱ）、高（高ＶＳ）、中（中ＶＳ）、低（低ＶＳ）および二つの下限（ＬＬＯＱ－１およびＬＬＯＱ－２）の各濃度を表す検証コントロール試料を、それぞれのレベルでＲｅｘｘｉｐ ＡＮ中にＣ５ａをスパイクすることによって調製し、定量化範囲を評価した。Ｒｅｘｘｉｐ ＡＮからなるブランクをすべてのアッセイに使用した。検証中の各ＣＤには、各々のＵＬＯＱ、高ＶＳ、中ＶＳ、低ＶＳ、ＬＬＯＱ－１およびＬＬＯＱ－２、ならびにブランクの一式が含まれた。全てのコントロールを新しく調製し、かつ、アッセイ希釈液で２倍に希釈した。Ｃ５ａは以下の濃度でスパイクした。
・ ＵＬＯＱ＝４０ｎｇ／ｍＬ
・ 高ＶＳ＝２０ｎｇ／ｍＬ
・ 中ＶＳ＝２．５ｎｇ／ｍＬ
・ 低ＶＳ＝０．６２５ｎｇ／ｍＬ
・ ＬＬＯＱ－１＝０．２００ｎｇ／ｍＬ
・ ＬＬＯＱ－２＝０．１５６ｎｇ／ｍＬ

【0234】

Ｃ５を除去するために、内因性の試料（個体２および１１）がＤｙｎａｂｅａｄ処理に供され、すべてのＣＤに含ませ、トレンド処理（ｔｒｅｎｄｉｎｇ）用の試料を使用することの有用性を得るためにデュプリケートで試験した。

【0235】

概略的アッセイ手順

【0236】

Ｃ５ａの定量化曲線用試料および検証コントロール用試料を調製し、Ｒｅｘｘｉｐ ＡＮ緩衝液を含むＰＣＲプレート中で希釈し、その後続いてアッセイ希釈液（１Ｍ ＮａＣｌ ＋０．５％ Ｔｗｅｅｎ）でＭＲＤを２として希釈した。

【0237】

検証評価に使用される試料は、Ｃ５を除去するために急速振とうしながら少なくとも１時間、磁気ビーズに結合された抗Ｃ５抗体とインキュベーションを行うことができる。それら試料については、１０ｕＬの試料を２０ｕＬの抗Ｃ５結合ビーズに添加し、強力に振とうしながら１時間インキュベートした。振とうインキュベーション後、ビーズを溶液から分離するために、プレートをプレートベースの磁石に少なくとも２分間晒した。１０ｕＬの試料を、ビーズペレットを撹乱することなく注意深く取り出し、Ｇｙｒｏｓ搭載リスト（ｌｏａｄｉｎｇ ｌｉｓｔ）に従ってＰＣＲプレートに添加した。試料の最終ＭＲＤは３であるが、Ｇｙｒｏｓ搭載リストにおける希釈係数は１．５である。

【0238】

ビオチン化ＡＬＸＮ１００７（捕捉抗体）を、ＰＢＳＴ中で１００ｕｇ／ｍＬに調製し、Ｇｙｒｏ Ｌａｂ搭載リストに従ってＰＣＲプレートに添加した。Ａｌｅｘａ ６４７標識抗Ｃ５ａ抗体（検出抗体）を、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液中で４ｕｇ／ｍＬに調製し、Ｇｙｒｏ Ｌａｂ搭載リストに従ってＰＣＲプレートに添加した。

【0239】

Ａｌｅｘａ ６４７標識抗Ｃ５ａ／Ｃ５ａ ｄｅｓ－Ａｒｇ精製ヒト補体タンパク質は、モル抗体当たり４．２モルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７染料で標識した、マウスＩｇＧ_２ａｍＡｂである。

【0240】

方法検証

【0241】

アッセイの方法検証には、アッセイ内およびアッセイ間の精度および真度、検量線の応答および範囲、希釈直線性、選択性、平行性、短期間安定性、長期間安定性、凍結解凍安定性、ならびにプロセス安定性が含まれた。検証中は、検量線に対して記載された許容基準に基づいて実行が許容された。検証中に実施されたすべての実行の要約を表８に示す。

【0242】

表８ 実行要約

【表8】

【0243】

検量線範囲

【0244】

標準曲線の精度および真度を評価するために、検証のための各実行に、セクション１５で定義された九つのゼロでない標準および二つのアンカーポイントからなる標準曲線を含めた。アンカーポイントを含ませるかまたは除外するかは、曲線の定量化可能な範囲内での曲線フィッティングを基にした。各アッセイにゼロ（分析物なし）のブランクを含めたが、曲線フィッティングには含めなかった。すべての点は、二アナリストによって七回の別個の実行でデュプリケートで試験され、Ｇｙｒｏ Ｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェア内の５パラメータのロジスティック曲線フィッティングを使用して標準曲線を計算した。

【0245】

精度は、パーセントで表した変動係数（ＣＶ）によって表され、以下の式を使用して計算した：

【0246】

【数4】

【0247】

％相対誤差（％ＲＥ）は、以下の式を使用して計算したが、式中、公称濃度はマトリックスにスパイクされる参照標準の濃度と等しい：

【0248】

【数5】

【0249】

アッセイの総合誤差（ｔｏｔａｌ ｅｒｒｏｒ）は、以下の式を使用して評価した：

【0250】

％ＴＥ＝絶対値％ＲＥ＋％ＣＶ

【0251】

目標の許容基準：ゼロでない標準の最低７５％は、最低標準および最高標準においては平均の逆算濃度（ＢＣＣ（ｂａｃｋ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））が公称値の±２５％と等しいかそれ以内でありうるが、それ以外は公称値の±２０％と等しいかそれ以内の平均ＢＣＣである必要がある。各標準のＣＶは、最低標準および最高標準においてはＣＶが２５％以下でありうるが、それ以外は２０％以下である必要がある。

【0252】

９９．２～１０９．２％の範囲の回収率と、１．５～１３．１％のＣＶの範囲の精度とを伴って、試験された全てのレベルで、九つのゼロでない検量線用標準が許容基準を満たした。相対誤差（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｒｒｏｒ）は０．４～９．２％のＲＥであり、２．１～２２．３％のＴＥの範囲の総合誤差を伴った。０．１１７ｎｇ／ｍＬおよび０．０５９ｎｇ／ｍＬの二つの最低較正濃度が、試料分析の間アンカーポイントとして使用され、曲線フィッティングに基づいて分析に含まれるか除外されることとなる。アッセイの検量線範囲は０．２３４～６０ｎｇ／ｍＬであった。データを表９に示す。

【0253】

表９ 検量線範囲

【表9-1】

【表9-2】

【0254】

定量化可能な範囲（アッセイ範囲）、真度および精度

【0255】

定量化可能な範囲ならびにアッセイの真度および精度を評価するために、各実行にはコントロールを含有させた。

【0256】

アッセイ内の精度については、各コントロールを、１回の実行に対して一アナリストで六つの複製を一度に試験した。アッセイ内の精度の実行は、試験されたすべてのコントロールに対する許容基準を満たした。回収率は、９６．３～１１１．７％の範囲であり、２．３～２０．２％ＣＶの範囲であった精度を伴った。相対誤差は０．０～１０．５％の範囲であり、総合誤差は６．６～２５．３％の範囲であった。データを表１０に示す。

【0257】

表１０ アッセイ内精度

【表10-1】

【表10-2】

【0258】

目標の許容基準：真度に関しては、コントロール毎の平均計算濃度は、ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱにおいては平均計算濃度が公称値の±３０％と等しいかそれ以内でありうるが、それ以外は公称値の±２５％と等しいかそれ以内である必要がある。精度に関しては、コントロール毎のＣＶは、ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱにおいてはＣＶが３０％以下であるが、それ以外は２５％以下である必要がある。アッセイのＬＬＯＱは、許容可能な精度および真度を伴う最低コントロールであり、アッセイのＵＬＯＱは許容可能な精度および真度を伴う最高コントロールである。総合誤差は４０％以下である必要がある。

【0259】

アッセイ間の精度については、各コントロールは、二アナリストによってデュプリケートで、七回の実行にわたって試験された。アッセイ内の評価（実行７）の最初の二つの複製を、一つのアッセイ間の評価として含めた。試験したすべてのコントロールについて、アッセイ内の精度の基準が満たされた。回収率は、９６．４～１１６．６％の範囲であり、２．０から２０．５％ＣＶの範囲であった精度を伴った。相対誤差は１．４～１６．６％の範囲であり、総合誤差は３．４から３４．０％の範囲であった。データを表１１に示す。

【0260】

表１１ アッセイ間の精度

【表11-1-1】

【表11-1-2】

【0261】

目標の許容基準：真度に関しては、コントロール毎の平均計算濃度は、ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱにおいては平均計算濃度が公称値の±３０％と等しいかそれ以内でありうるが、それ以外は公称値の±２５％と等しいかそれ以内である必要がある。精度に関しては、コントロール毎のＣＶは、ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱにおいてはＣＶが３０％以下であるが、それ以外は２５％以下である必要がある。アッセイのＬＬＯＱは、許容可能な精度および真度を伴う最低コントロールであり、アッセイのＵＬＯＱは許容可能な精度および真度を伴う最高コントロールである。総合誤差は４０％以下である必要がある。

【0262】

希釈直線性およびｍｉｎｉｍｕｍ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ（最小必要希釈率）（ＭＲＤ）は、マトリックスの四個体のロットで評価された。マトリックスに、ＵＬＯＱより上の１００ｎｇ／ｍＬで参照標準をスパイクし、アッセイ希釈液で４倍に３回希釈し、その後抗Ｃ５結合磁気ビーズで処理してあらゆる混入Ｃ５を除去した。希釈直線性用試料を二回の実行にわたって一度に評価し、一アナリストによってデュプリケートで試験した。実行５からの個体１３は、６４倍希釈に関連した高ＣＶであることから、実行９で再評価した。このアッセイにより、希釈直線性が実証され、すべてのロットに対してすべての希釈でスパイクされたマトリックスの四つのロットで、許容基準を満たしている。最大希釈は６４倍である。希釈毎の回収率は、希釈についてを補正すると、９４．０～１１７％の範囲であり、０．８～１１．１％の範囲であったＣＶを伴った。ビーズ処理で必要とされる血漿試料に対するＭＲＤは三である。標準のビーズ処理のＭＲＤを伴うＡＬＱである試料は、アッセイの定量化可能な範囲内にある結果を得るために、６４倍まで希釈できる。データを表１１に示す。

【0263】

目標の許容基準：希釈直線性については、定量化可能な範囲内に収まる希釈の平均濃度は、希釈について補正すると、公称値の２５％と等しいかそれ以内であるか、または２５％以下のＣＶを有する必要がある。許容基準を満たす試料のいずれかにおける最大希釈は、最大許容試料希釈である。

【0264】

表１１ 希釈直線性

【表11-2-1】

【表11-2-2】

【0265】

５００ｎｇ／ｍＬでスパイクしたマトリックス中で、プロゾーン（ホック効果（Ｈｏｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ））を評価した。プロゾーンは、一アナリストによってデュプリケートで一度に評価した。試料を抗Ｃ５結合磁気ビーズで処理した。計算された応答は、アッセイの定量化可能な範囲よりも大きく、プロゾーン（フック効果）が観察されなかったことを実証した。データを表１２に示す。

【0266】

表１２ プロゾーン（フック効果）

【表12】

【0267】

プロゾーン効果は、観察された応答が、公称濃度がＵＬＯＱのより上である試料のアッセイの定量化可能な範囲の範囲内またはそれ未満である場合に明らかにされる。

【0268】

アッセイ選択性は、５、１および０．３ｎｇ／ｍＬでＣ５ａをマトリックスの１０個体のロットにスパイクし、続いて抗Ｃ５抗体結合磁気ビーズで処理することによって評価した。各個体のスパイクされていない試料も評価した。事前定量化中に低いレベルのＣ５ａを含むことを示したロットを選択した。選択性用試料は、一アナリストによって２回の実行にわたってデュプリケートで一度に評価した。このアッセイは、選択性の目標の許容基準を満たした。スパイクされた十個体のうち八個体が、内因性のＣ５ａについて補正すると、公称値の２５％以内で回収された。データを表１３に示す。

【0269】

目標の許容基準：スパイクされたマトリックスの最低８０％は、公称値の±２５％以内である必要がある。

【0270】

表１３ 選択性
ＩＮＤ ＝ 個体

【表13-1-1】

【表13-1-2】

【表13-2】

【0271】

平行性

【0272】

事前定量化中に内因性のＣ５ａ検出可能レベルを有することが示された六個体（男性３名および女性３名）を選択して、平行性を評価した。試料は、アッセイ希釈液で二倍連続希釈を３回行い、次いで抗Ｃ５結合磁気ビーズでビーズ処理を行った。平行性用試料を２アナリストによる２回の実行にわたって評価した。実行４で試験された六個体のうち四個体が、高い試料ＣＶのために実行９で繰り返された。このアッセイでは、平行性の欠如が示さ、アッセイの相対定量性が強調されたが、使用を妨げるものではない。試料ＣＶの範囲は０．１％～２７．１％であった。データを表１４に示す。

【0273】

表１４ 平行性

【表14】

【0274】

安定性

【0275】

約４℃および室温での短期間保存、意図される保存温度での長期間保存、ならびに数回の凍結解凍サイクルに供される試料の安定性を調査した。安定性評価のために、高濃度（５ｎｇ／ｍＬ）および低濃度（１ｎｇ／ｍＬ）のＣ５ａでスパイクされたマトリックスを使用した。安定性試料の複数のアリコートを、意図された保存温度（－８０°Ｃ）、室温、約４℃での保存、および凍結／解凍実験のために調製した。各レベルにつき一つのアリコートを、新鮮なコントロール試料（参照条件）として直ちに分析した。残りの試料は、特定の保存期間および条件の後で試験した。すべての安定性評価には、アッセイ許容性を評価するために新たに調製された標準曲線用試料および検証用試料が含まれた。すべての安定性用試料を、抗Ｃ５抗体結合磁気ビーズで処理した。プロセス安定性も評価された。

【0276】

短期間安定性

【0277】

低安定性用および高安定性用の試料のアリコートを解凍し、室温で２時間２０分保存し、また約４℃で、最大２３時間２９分保存した。すべての短期間安定性用試料を六つの複製で実行した。安定性用試料は、短期間安定性の許容基準を満たした。各条件の試料は、参照標準の３０％以内であり、ＣＶは４．６～１１．６％の範囲であった。データを表１５に示す。

【0278】

表１５ 短期間安定性

【表15】

【0279】

目標の許容基準：短期間安定性用試料毎の平均計算濃度は、新鮮なコントロール試料の値の±３０％以内であり、≦３０％のＣＶを有する必要がある。

【0280】

長期間安定性は、１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４か月で評価される。低濃度および高濃度の安定性用試料のアリコートを調製し、適切な温度（－８０℃）で保存した。すべての長期間安定性用試料は、少なくとも六つの複製で実行されることとなる。検証レポートは、長期間安定性データを含むように修正されることとなる。

【0281】

目標の許容基準：長期間安定性用試料毎の平均計算濃度は、新鮮なコントロール試料の値の±３０％以内であり、≦３０％のＣＶを有する必要がある。

【0282】

凍結および解凍の安定性

【0283】

低濃度および高濃度の安定性間試料のアリコートを、約－８０℃での６回の凍結解凍サイクルに供した。安定性用試料を室温で少なくとも一時間解凍し、その後新規サイクルを受ける前に最低１２時間再凍結させた。凍結および解凍の安定性の評価は、三回および六回の凍結／解凍サイクルを完了した試料に対して行われた。すべての凍結および解凍の安定性用試料を六つの複製で試験した。安定性用試料は、凍結および回答の安定性の許容基準を満たした。各条件の試料は、参照標準の３０％以内であり、ＣＶは１．４～８．１％の範囲であった。データを表１６に示す。

【0284】

表１６ 凍結解凍安定性

【表16-1】

【表16-2】

【0285】

プロセス安定性（げっ歯類）

【0286】

標準曲線、ＱＣならびに、その後二つのアッセイ準備ＰＣＲプレートに分離される捕捉試薬および検出試薬を調製することによってプロセス安定性を評価した。内因性の試料もまた各時点毎に含まれた。プレートを封止し、Ｇｙｒｏｓ機器のデッキ上に配置した。各プレートは、一プレート当たり一ディスクを用いて、時間を０時間および２時間で評価した。標準曲線は、試験された両方の時点で許容基準を満たした。九つのゼロの標準についての総平均の回収率％は、９６．８～１０４．４％の範囲であり、０．４～８．３％の範囲であるＣＶを伴った。ＱＣについての総平均の回収率は、９８．３～１１８．３％の範囲であり、１．５～１８％の範囲であるＣＶを伴った。各時点について試験された標準曲線およびＱＣのデータを表１７に示す。内因性試料のデータを表１８に示す。アッセイは、最大２時間のプロセス安定性を実証している。

【0287】

表１７ プロセス安定性の標準試料およびＱＣ

【表17-1】

【表17-2】

【0288】

表１８ 内因性試料のプロセス安定性

【表18】

【0289】

アッセイプレートをＧｙｒｏｌａｂ ＸＰワークステーション上でリードし、ＧｙｒｏＬａｂ ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを使用して解析し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００７以降のバージョンにインポートした。算術手段、標準偏差、精度（ＣＶ％）などの記述統計は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００７以降のバージョンを使用して決定した。

【0290】

ＣＶが２５％より大きい場合、九つのゼロでない標準点のうち最大二つのマスキングを許容する一つの計画補正があった。

【0291】

試験中に二つの偏差が記録された。

【0292】

偏差＃２２６

【0293】

実行１から８について補完的バイオ分析ワークシート上に、時計および温度計が記載されていなかった。すべての実行が予測されるとおりに実行されて、実験室内の較正された時計および温度計を使用して時間および温度が記録されるので、この偏差による試験データへの影響はなかった。

【0294】

偏差＃２３７

【0295】

・要件：ビオチンＡＬＸＮ１００７（捕捉抗体）は、ＰＢＳＴ中で１００ｕｇ／ｍＬに調製し、Ｇｙｒｏ Ｌａｂ搭載リストに従ってＰＣＲプレートに添加する。

【0296】

・偏差：ビオチンＡＬＸＮ１００７（捕捉抗体）を、ＰＢＳＴ中で８９ｕｇ／ｍＬに調製し、Ｇｙｒｏ Ｌａｂ搭載リストに従ってＰＣＲプレートに添加した。

【0297】

この偏差は実行１で発生した。この偏差は、ビオチンＡＬＸＮが、概略的アッセイ手順のセクションで特定したとおりの１００ｕｇ／ｍＬではなく、８９ｕｇ／ｍｌで調製されたというものである。実行１の分析中にアナリストによって追加のワークシート上で誤字が発見されて、ＡＬＸＮ１００７の以前の保存濃度がワークシート上に記録され、計算に使用された。該アナリストがワークシートを修正し、当該修正を記載した。実行の検証を行ったところ、この修正の計算が不正確であることが発見されて記載された。

【0298】

この偏差は、実行は失敗であったと記録され、データが試験の分析に使用されなかったため、試験への影響はなかった。標準曲線に関連して高いＣＶであったことから、この実行は目標の基準を満たさなかったのである。

【0299】

表１９ アッセイ手順

【表19-1】

【表19-2】

【0300】

表２０ アッセイ手順（ビーズ調製）

【表20-1-1】

【表20-1-2】

【表20-1-3】

【表20-2-1】

【表20-2-2】

【0301】

表２１ 重要な試薬
以下の試薬は、特定の提供者とロットから使用される。

【表21】

【0302】

表２２ 追加的試薬

【表22-1】

【表22-2】

【0303】

その他の実施形態

【0304】

前述の説明は、本発明の例示的な実施形態のみを開示している。

【0305】

本発明についてその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は説明を意図しているものであって、添付の特許請求の範囲によって規定されている本発明の範囲を限定するものではないということを理解されたい。その他の態様、利点、および変形は、添付の請求項の範囲内にあるものである。したがって、本発明の特定の特徴のみが図示され、記述されているが、当業者にとっては多くの変形および変更が生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨内に収まるものとしてこうした変形および変更のすべてを網羅することが意図されているということを理解されたい。

【0306】

表２３：一部の核酸およびアミノ酸配列

【表23-1】

【表23-2】

【表23-3】

【表23-4】

【表23-5】

【表23-6】

【表23-7】

【表23-8】

【表23-9】

【表23-10】

【表23-11】

【表23-12】

【表23-13】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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