▶ 学校法人同志社の特許一覧 ▶ 千寿製薬株式会社の特許一覧
特許7398729（Ｔ）ＥＷ－７１９７を含む角膜内皮疾患を治療または予防するための組成物または方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-07
(45)【発行日】2023-12-15
(54)【発明の名称】（Ｔ）ＥＷ－７１９７を含む角膜内皮疾患を治療または予防するための組成物または方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/444 20060101AFI20231208BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20231208BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231208BHJP
【ＦＩ】
A61K31/444
A61P27/02
A61P43/00 111
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2019559203
(86)(22)【出願日】2018-12-13
(86)【国際出願番号】 JP2018045919
(87)【国際公開番号】W WO2019117254
(87)【国際公開日】2019-06-20
【審査請求日】2021-12-02
(31)【優先権主張番号】P 2017239049
(32)【優先日】2017-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2018184783
(32)【優先日】2018-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】503027931
【氏名又は名称】学校法人同志社
(73)【特許権者】
【識別番号】000199175
【氏名又は名称】千寿製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100118371
【弁理士】
【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志
(72)【発明者】
【氏名】小泉 範子
(72)【発明者】
【氏名】奥村 直毅
(72)【発明者】
【氏名】山本 真弓
【審査官】金子 亜希
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５３３２５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／０６４７６８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】J. Med. Chem.，2002年，45，999-1001
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／４４４
Ａ６１Ｐ ２７／０２
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための組成物であって、 前記組成物は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制するためのものである、組成物。
【請求項2】
（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための組成物であって、 前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、滴状角膜、後部多形性角膜ジストロフィ、虹彩角膜内皮症候群、先天性遺伝子角膜内皮ジストロフィ、ウイルス性疾患（サイトメガロウイルス角膜内皮炎、単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎）、落屑症候群、角膜移植後拒否反応、水疱性角膜症、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、および加齢からなる群から選択される、
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、ならびに
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、角膜内皮における細胞障害である、
からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、組成物。
【請求項3】
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものであり、前記細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度で前記組成物中に存在する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で前記組成物中に存在する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
点眼剤である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮における細胞障害を治療または予防するための組成物。
【請求項10】
前記角膜内皮における細胞障害が、フックス角膜内皮ジストロフィ、滴状角膜、後部多形性角膜ジストロフィ、虹彩角膜内皮症候群、先天性遺伝子角膜内皮ジストロフィ、ウイルス性疾患（サイトメガロウイルス角膜内皮炎、単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎）、落屑症候群、角膜移植後拒否反応、水疱性角膜症、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、または加齢における細胞障害である、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記角膜内皮における細胞障害が、フックス角膜内皮ジストロフィにおける細胞障害である、請求項９または１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、（Ｔ）ＥＷ－７１９７の新規用途に関する。より詳細には、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための技術、方法、ならびにそのための薬剤、ならびにこの技術を応用した角膜内皮細胞の保存技術に関する。
【背景技術】
【0002】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。
【0003】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力は極めて限定的である。角膜内皮障害の１つであるフックス角膜内皮ジストロフィは、角膜の内側の内皮細胞が異常を来して角膜の浮腫を生じたりする疾患であり、その原因は不明である。フックス角膜内皮ジストロフィでは、コラーゲン等の細胞外マトリクスが角膜の後部にあるデスメ膜の後面の一部分に沈着しグッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚を生じる。グッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚はフックス角膜内皮ジストロフィ患者における羞明、霧視の原因であり患者のQOLを著しく損なう。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明者らは、以下の構造：
を有する（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）が、角膜内皮障害モデルの細胞において、非常に優れた細胞障害抑制効果を示すことを見出した。また、（Ｔ）ＥＷ－７１９７による細胞障害抑制効果は、非常に低い濃度でも確認された。加えて、本発明者らは、（Ｔ）ＥＷ－７１９７が、角膜内皮障害モデルの細胞において、フィブロネクチンなどの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の発現を抑制し、角膜内皮障害におけるＥＣＭ異常を治療可能であることも見出した。
【化1】
を有する（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）が、角膜内皮障害モデルの細胞において、非常に優れた細胞障害抑制効果を示すことを見出した。また、（Ｔ）ＥＷ－７１９７による細胞障害抑制効果は、非常に低い濃度でも確認された。加えて、本発明者らは、（Ｔ）ＥＷ－７１９７が、角膜内皮障害モデルの細胞において、フィブロネクチンなどの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の発現を抑制し、角膜内皮障害におけるＥＣＭ異常を治療可能であることも見出した。
【0005】
したがって、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための組成物。
（項目２）
前記組成物は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制するためのものである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目４または５に記載の組成物。
（項目７）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目８）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度で前記組成物中に存在する、項目１～７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で前記組成物中に存在する、項目１～８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
点眼剤である、項目１～９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１）
被験体における角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防する方法であって、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の有効量を該被験体に投与することを含む方法。
（項目Ａ２）
前記方法は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制する、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ３）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である、項目Ａ１またはＡ２に記載の方法。
（項目Ａ４）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ５）
前記細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、項目Ａ４に記載の方法。
（項目Ａ６）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目Ａ４またはＡ５に記載の方法。
（項目Ａ７）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目Ａ１～Ａ６のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ８）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度で投与される、項目Ａ１～Ａ７のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ９）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で投与される、項目Ａ１～Ａ８のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１０）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、点眼剤として投与される、項目Ａ１～Ａ９のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１）
角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬の製造における、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の使用。
（項目Ｂ２）
前記医薬は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制するためのものである、項目Ｂ１に記載の使用。
（項目Ｂ３）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である、項目Ｂ１またはＢ２に記載の使用。
（項目Ｂ４）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目Ｂ１に記載の使用。
（項目Ｂ５）
前記細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、項目Ｂ４に記載の使用。
（項目Ｂ６）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目Ｂ４またはＢ５に記載の使用。
（項目Ｂ７）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目Ｂ１～Ｂ６のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ８）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度で前記組成物中に存在する、項目Ｂ１～Ｂ７のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ９）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で前記医薬中に存在する、項目Ｂ１～Ｂ８のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ１０）
前記医薬は点眼剤である、項目Ｂ１～Ｂ９のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｃ１）
角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防における使用のための化合物であって、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物である化合物。
（項目Ｃ２）
前記化合物は、角膜内皮細胞密度の減少の抑制において使用するためのものである、項目Ｃ１に記載の化合物。
（項目Ｃ３）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である、項目Ｃ１またはＣ２に記載の化合物。
（項目Ｃ４）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目Ｃ１に記載の化合物。
（項目Ｃ５）
前記細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、項目Ｃ４に記載の化合物。
（項目Ｃ６）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目Ｃ４またはＣ５に記載の化合物。
（項目Ｃ７）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目Ｃ１～Ｃ６のいずれか一項に記載の化合物。
（項目Ｃ８）
前記化合物は、約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度で投与されることを特徴とする、項目Ｃ１～Ｃ７のいずれか一項に記載の化合物。
（項目Ｃ９）
前記化合物は、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で投与されることを特徴とする、項目Ｃ１～Ｃ８のいずれか一項に記載の化合物。
（項目Ｃ１０）
前記化合物は、点眼剤として投与されることを特徴とする、項目Ｃ１～Ｃ９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１）
（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための組成物。
（項目２）
前記組成物は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制するためのものである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目４または５に記載の組成物。
（項目７）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目８）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度で前記組成物中に存在する、項目１～７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で前記組成物中に存在する、項目１～８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
点眼剤である、項目１～９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１）
被験体における角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防する方法であって、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の有効量を該被験体に投与することを含む方法。
（項目Ａ２）
前記方法は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制する、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ３）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である、項目Ａ１またはＡ２に記載の方法。
（項目Ａ４）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ５）
前記細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、項目Ａ４に記載の方法。
（項目Ａ６）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目Ａ４またはＡ５に記載の方法。
（項目Ａ７）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目Ａ１～Ａ６のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ８）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度で投与される、項目Ａ１～Ａ７のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ９）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で投与される、項目Ａ１～Ａ８のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１０）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、点眼剤として投与される、項目Ａ１～Ａ９のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１）
角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬の製造における、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の使用。
（項目Ｂ２）
前記医薬は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制するためのものである、項目Ｂ１に記載の使用。
（項目Ｂ３）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である、項目Ｂ１またはＢ２に記載の使用。
（項目Ｂ４）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目Ｂ１に記載の使用。
（項目Ｂ５）
前記細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、項目Ｂ４に記載の使用。
（項目Ｂ６）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目Ｂ４またはＢ５に記載の使用。
（項目Ｂ７）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目Ｂ１～Ｂ６のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ８）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度で前記組成物中に存在する、項目Ｂ１～Ｂ７のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ９）
前記（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で前記医薬中に存在する、項目Ｂ１～Ｂ８のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ１０）
前記医薬は点眼剤である、項目Ｂ１～Ｂ９のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｃ１）
角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防における使用のための化合物であって、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物である化合物。
（項目Ｃ２）
前記化合物は、角膜内皮細胞密度の減少の抑制において使用するためのものである、項目Ｃ１に記載の化合物。
（項目Ｃ３）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である、項目Ｃ１またはＣ２に記載の化合物。
（項目Ｃ４）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目Ｃ１に記載の化合物。
（項目Ｃ５）
前記細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、項目Ｃ４に記載の化合物。
（項目Ｃ６）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目Ｃ４またはＣ５に記載の化合物。
（項目Ｃ７）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目Ｃ１～Ｃ６のいずれか一項に記載の化合物。
（項目Ｃ８）
前記化合物は、約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度で投与されることを特徴とする、項目Ｃ１～Ｃ７のいずれか一項に記載の化合物。
（項目Ｃ９）
前記化合物は、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で投与されることを特徴とする、項目Ｃ１～Ｃ８のいずれか一項に記載の化合物。
（項目Ｃ１０）
前記化合物は、点眼剤として投与されることを特徴とする、項目Ｃ１～Ｃ９のいずれか一項に記載の化合物。
【0006】
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【0007】
本発明は、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防し得る医薬を提供する。さらに、本発明は、（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮細胞の保存のための組成物または角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0010】
（定義）
本明細書において、「約」とは、特に断らない限り、後に続く数値の±１０％を意味する。
本明細書において、「約」とは、特に断らない限り、後に続く数値の±１０％を意味する。
【0011】
本明細書において「被験体」とは、本発明の治療および予防するための医薬または方法の投与(移植)対象を指し、被験体としては、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。
【0012】
本明細書において、「ＥＷ－７１９７」と「ＴＥＷ－７１９７」は互換可能に使用され、Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリンを指す。また、本明細書において、「ＥＷ－７１９７」と「ＴＥＷ－７１９７」をまとめて、「（Ｔ）ＥＷ－７１９７」と表記する場合もある。
【0013】
本明細書において、「細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因する」角膜内皮の症状、障害または疾患とは、主に細胞外マトリクスに起因する濁りや沈着、肥厚等に関連する角膜内皮の症状、障害または疾患であり、角膜内皮面の疣贅（グッタータ）や、デスメ膜の混濁グッテー等の、デスメ膜の肥厚等が生じ、視力低下の原因となる症状に関連するものである。フックス角膜ジストロフィなどの角膜内皮障害においては、角膜内皮細胞の細胞死（特にアポトーシス）が原因による症状悪化とは異なり、この細胞外マトリクスの過剰産生は細胞数の減少が起こらなかったとしても視力、視感覚を悪化させるものであり、細胞死を抑制できたとしても対処しなければならない点である。
【0014】
本明細書において「誘導体」とは、そのコア構造が親化合物のそれと同じかまたはよく似ているが、異なる官能基または付加的な官能基などの化学的または物理的修飾を有するような化合物を指す。誘導体は、親化合物と同一または類似の生物学的活性を有する。
【0015】
本明細書において、「薬学的に許容され得る塩」とは、比較的非毒性の、本発明の化合物の無機または有機の酸付加塩をいう。これらの塩は、化合物の最終的な単離および精製の間に一時的に、またはその遊離塩基型で精製された化合物を適切な有機もしくは無機の酸と別々に反応させること、およびそのように形成された塩を単離することによって調製することができる。
【0016】
本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩基性塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩、メグルミン塩、ジエタノールアミン塩またはエチレンジアミン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン、ベネタミン塩等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のヘテロ環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【0017】
本発明の化合物の薬学的に許容され得る酸性塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。
【0018】
本明細書において、「溶媒和物」とは、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を意味し、例えば有機溶媒との溶媒和物（例えば、アルコール（エタノールなど）和物）、水和物等を包含する。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位していてもよい。水和物としては、１水和物、２水和物等を挙げることができる。
【0019】
本明細書において「ｉＦＥＣＤ」（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｕｃｈｓ’ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｒｎｅａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。
【0020】
本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。「ｉＨＣＥＣ」は、不死化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ヒト角膜内皮細胞の略称である。
【0021】
本明細書において「被験体」とは、本発明の治療および予防するための医薬または方法の投与(移植)対象を指し、被験体としては、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。
【0022】
本明細書において「角膜内皮の症状、障害または疾患」とは、角膜内皮に関連する任意の症状、障害または疾患をいい、代表的には、フックス角膜内皮ジストロフィ、滴状角膜、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎を挙げることができるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、角膜内皮の症状、障害または疾患はフックス角膜内皮ジストロフィを含む。別の実施形態では、角膜内皮の症状、障害または疾患は細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものであり、例えば、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよびフィブロネクチンの過剰発現に起因するものである。
【0023】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、角膜内皮においてＥＣＭの過剰発現を観察される任意の症状、障害、疾患が含まれ、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【0024】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M. A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis ,M.A. et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J.et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、Gait, M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991).Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R.L. et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T.(I996).Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy Joyceらの報告｛Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M. A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis ,M.A. et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J.et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、Gait, M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991).Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R.L. et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T.(I996).Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy Joyceらの報告｛Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【0025】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
【0026】
＜組成物＞
１つの局面において、本発明は、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制するためのものでもある。本発明の組成物で使用される（Ｔ）ＥＷ－７１９７は、角膜内皮障害を抑制することが知られているＳＢ４３１５４２と同様に角膜内皮障害を抑制することができる。驚くべきことに、（Ｔ）ＥＷ－７１９７による角膜内皮障害抑制効果は、非常に低濃度でも観察され、ＳＢ４３１５４２ではサブμＭ（１μＭ～０．１μＭ）では角膜内皮障害抑制効果が観察されなかったのに対し、（Ｔ）ＥＷ－７１９７では、０．０３μＭという低い濃度でも非常に優れた角膜内皮障害抑制効果が観察された。このように、本発明で使用される（Ｔ）ＥＷ－７１９７は、角膜内皮において非常に高い治療効果を発揮し得る。また、生存細胞率の試験においては細胞に対する毒性はほとんど観察されず、（Ｔ）ＥＷ－７１９７は安全性においても優れている。
１つの局面において、本発明は、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制するためのものでもある。本発明の組成物で使用される（Ｔ）ＥＷ－７１９７は、角膜内皮障害を抑制することが知られているＳＢ４３１５４２と同様に角膜内皮障害を抑制することができる。驚くべきことに、（Ｔ）ＥＷ－７１９７による角膜内皮障害抑制効果は、非常に低濃度でも観察され、ＳＢ４３１５４２ではサブμＭ（１μＭ～０．１μＭ）では角膜内皮障害抑制効果が観察されなかったのに対し、（Ｔ）ＥＷ－７１９７では、０．０３μＭという低い濃度でも非常に優れた角膜内皮障害抑制効果が観察された。このように、本発明で使用される（Ｔ）ＥＷ－７１９７は、角膜内皮において非常に高い治療効果を発揮し得る。また、生存細胞率の試験においては細胞に対する毒性はほとんど観察されず、（Ｔ）ＥＷ－７１９７は安全性においても優れている。
【0027】
別の局面において、本発明は、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮細胞密度の減少を抑制するための組成物を提供する。
【0028】
別の局面において、本発明は、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物（以下、本発明の化合物等ともいう。）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物等は、角膜内皮細胞密度の減少を抑制するためのものでもある。本発明の化合物等における（Ｔ）ＥＷ－７１９７は、角膜内皮障害を抑制することが知られているＳＢ４３１５４２と同様に角膜内皮障害を抑制することができる。驚くべきことに、（Ｔ）ＥＷ－７１９７による角膜内皮障害抑制効果は、非常に低濃度でも観察され、ＳＢ４３１５４２ではサブμＭ（１μＭ～０．１μＭ）では角膜内皮障害抑制効果が観察されなかったのに対し、（Ｔ）ＥＷ－７１９７では、０．０３μＭという低い濃度でも非常に優れた角膜内皮障害抑制効果が観察された。このように、本発明で使用される（Ｔ）ＥＷ－７１９７は、角膜内皮において非常に高い治療効果を発揮し得る。また、生存細胞率の試験においては細胞に対する毒性はほとんど観察されず、（Ｔ）ＥＷ－７１９７は安全性においても優れている。
【0029】
本発明の組成物は、医薬組成物（例えば、点眼剤、前房内注射剤、硝子体内注射剤、結膜下注射剤）であり得る。医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容され得る担体としては、所望の特定の剤形に適するように、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などが挙げられるが、これらに限定されない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年は、医薬組成物の製剤化およびその調製のための公知の技術において使用される種々の担体を開示する。薬学的に許容される担体として役割を果たすことができる材料の一部の例として、これらに限定されないが、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、およびセルロースアセテートなどのその誘導体；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；エチルオレエートおよびエチルラウレートなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質不含水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液が挙げられ、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性かつ適合性の滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、矯味矯臭剤および芳香剤、保存料および酸化防止剤も、配合者の判断に従って、組成物中に存在しうる。
【0030】
１つの実施形態では、本発明の組成物は、角膜内皮細胞密度の減少に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防し得る。角膜内皮細胞密度の減少に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患としては、フックス角膜内皮ジストロフィ、滴状角膜、後部多形性角膜ジストロフィ、虹彩角膜内皮症候群、先天性遺伝子角膜内皮ジストロフィ、ウイルス性疾患（サイトメガロウイルス角膜内皮炎、単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎）、落屑症候群、角膜移植後拒否反応、水疱性角膜症、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢からなる群より選択される。
【0031】
１つの実施形態では、角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、滴状角膜、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ：posterior polymorphous dystrophy）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ：congenital hereditary endothelial dystrophy）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される。別の実施形態では、角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィまたは滴状角膜である。
【0032】
さらに別の局面では、本発明は、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための組成物を提供する。別の局面では、本発明は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物（以下、本発明の化合物等ともいう。）を提供する。（Ｔ）ＥＷ－７１９７は予想外にも、角膜内皮細胞におけるフィブロネクチンなどの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の異常（例えば、過剰発現）を抑制することができる。また、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィにおいては、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンなどの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の異常（例えば、過剰発現）も確認されており、本発明の組成物または本発明の化合物等は、これらの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の異常も抑制し得る。細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患としては、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視などが挙げられる。フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜内皮細胞の密度が著しく減少し、さらに細胞外マトリクスがデスメ膜に沈着しグッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚を生じる疾患であるため、細胞外マトリックスの過剰発現を抑制することは、フックス角膜内皮ジストロフィの治療および予防における著明な改善が可能であり、場合によっては完全な治癒が可能であることを意味している。また、フックス角膜内皮ジストロフィ等の角膜内皮障害における細胞外マトリクス過剰産生により発生し得るグッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚やこのほか混濁や沈着に関連する症状（遷延化する角膜浮腫による不可逆的な角膜実質混濁など）を改善し、処置しまたは予防することができる。さらに、アグリン等のプロテオグリカンの過剰発現もフックス角膜内皮ジストロフィにおいて確認されており、アグリン等のプロテオグリカンの過剰発現が、上記グッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚やこのほか混濁や沈着に関連する症状をもたらしうる。本発明の組成物または本発明の化合物等は、アグリン等のプロテオグリカンの過剰発現も抑制し得る。
【0033】
１つの実施形態において、本発明の利用法としては、例えば点眼剤が挙げられるが、これに限定されず、眼軟膏、前房内への注射、徐放剤への含浸、結膜下注射、全身投与（内服、静脈注射）などの投与形態（投与方法および剤型）も挙げることができる。
【0034】
本発明で使用される（Ｔ）ＥＷ－７１９７の濃度は、通常約０．００１～約１００μＭ（μｍｏｌ／ｌ）、好ましくは約０．０１～約３０μＭ、より好ましくは約０．０３～約１０μＭ、さらに好ましくは約０．０３～約１μＭであり、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．０１ｎＭ～約１００μＭ、約０．１ｎＭ～約１００μＭ、約０．００１～約１００μＭ、約０．０１～約７５μＭ、約０．０５～約５０μＭ、約１～約１０μＭ、約０．０１～約１０μＭ、約０．０５～約１０μＭ、約０．０７５～約１０μＭ、約０．１～約１０μＭ、約０．５～約１０μＭ、約０．７５～約１０μＭ、約１．０～約１０μＭ、約１．２５～約１０μＭ、約１．５～約１０μＭ、約１．７５～約１０μＭ、約２．０～約１０μＭ、約２．５～約１０μＭ、約３．０～約１０μＭ、約４．０～約１０μＭ、約５．０～約１０μＭ、約６．０～約１０μＭ、約７．０～約１０μＭ、約８．０～約１０μＭ、約９．０～約１０μＭ、約０．０１～約５０μＭ、約０．０５～約５．０μＭ、約０．０７５～約５．０μＭ、約０．１～約５．０μＭ、約０．５～約５．０μＭ、約０．７５～約５．０μＭ、約１．０～約５．０μＭ、約１．２５～約５．０μＭ、約１．５～約５．０μＭ、約１．７５～約５．０μＭ、約２．０～約５．０μＭ、約２．５～約５．０μＭ、約３．０～約５．０μＭ、約４．０～約５．０μＭ、約０．０１～約３．０μＭ、約０．０５～約３．０μＭ、約０．０７５～約３．０μＭ、約０．１～約３．０μＭ、約０．５～約３．０μＭ、約０．７５～約３．０μＭ、約１．０～約３．０μＭ、約１．２５～約３．０μＭ、約１．５～約３．０μＭ、約１．７５～約３．０μＭ、約２．０～約３．０μＭ、約０．０１～約１．０μＭ、約０．０５～約１．０μＭ、約０．０７５～約１．０μＭ、約０．１～約１．０μＭ、約０．５～約１．０μＭ、約０．７５～約１．０μＭ、約０．０９～約３５μＭ、または約０．０９～約３．２μＭであり、より好ましくは、約０．０１～約１０μＭ、約０．１～約３μＭ、または約０．１～約１．０μＭを挙げることができるがこれらに限定されない。
【0035】
点眼剤として用いられる場合は、涙液などでの希釈も考慮し、毒性にも気を付けながら、上記有効濃度の約１～１００００倍、好ましくは約１００～１００００倍、例えば、約１０００倍を基準として製剤濃度を決定することができ、これらを上回る濃度を設定することも可能である。例えば、約０．０１μＭ（μｍｏｌ／ｌ）～約１０００ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）、約０．０３μＭ～約１０００ｍＭ、約０．１μＭ～約１００ｍＭ、約０．３μＭ～約１００ｍＭ、約１μＭ～約１００ｍＭ、約３μＭ～約１００ｍＭ、約１０μＭ～約１００ｍＭ、約３０μＭ～約１００ｍＭ、約０．１μＭ～約３０ｍＭ、約０．３μＭ～約３０ｍＭ、約１μＭ～約３０ｍＭ、約３μＭ～約３０ｍＭ、約１μＭ～約１０ｍＭ、約３μＭ～約１０ｍＭ、約１０μＭ～約１ｍＭ、約３０μＭ～約１ｍＭ、約１０μＭ～約１０ｍＭ、約３０μＭ～約１０ｍＭ、約１００μＭ～約１０ｍＭ、約３００μＭ～約１０ｍＭ、約１０μＭ～約１００ｍＭ、約３０μＭ～約１００ｍＭ、約１００μＭ～約１００ｍＭ、約３００μＭ～約１００ｍＭであり、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭであり得、これらの上限下限は適宜組み合わせて設定されることができる。
【0036】
１つの実施形態では、（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物は、約０．０３μＭ～約１０μＭ、好ましくは、約０．０３μＭ～約１μＭの濃度で前記組成物中に存在し得る。
【0037】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は点眼剤として提供され、（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物が、約０．０３ｍＭ～約１００ｍＭで存在し、好ましくは約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭ、より好ましくは約０．０５ｍＭ～約１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．０１ｍＭ～約５ｍＭ、最も好ましくは約０．１ｍＭ～約５ｍＭで存在し得る。特定の実施形態では、点眼剤として提供される本発明の組成物は、約０．５ｍＭの（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含み得る。
【0038】
特定の疾患、障害または状態の治療に有効な本発明の医薬の有効量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、必要に応じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり０．００１、１、５、１０、１５、１００、または１０００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与回数、投与間隔、投与期間、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、投与形態、対象臓器等により、適宜選択してもよい。例えば、本発明は点眼剤として使用され得る。また、本発明の医薬を前房内に注入することもできる。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。治療マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量－反応曲線から推定可能である。
【0039】
＜治療または予防方法＞
一局面において、本発明は、被験体における角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防する方法であって、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の有効量を該被験体に投与することを含む方法を提供する。本明細書において＜組成物＞などにおいて記載される上記１または複数の実施形態が、本発明の方法において適宜採用され得る。
一局面において、本発明は、被験体における角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防する方法であって、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の有効量を該被験体に投与することを含む方法を提供する。本明細書において＜組成物＞などにおいて記載される上記１または複数の実施形態が、本発明の方法において適宜採用され得る。
【0040】
さらに別の局面では、本発明は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防する方法であって、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の有効量を該被験体に投与することを含む方法を提供する。本明細書において＜組成物＞などにおいて記載される上記１または複数の実施形態が、本発明の方法において適宜採用され得る。
【0041】
＜使用＞
一局面において、本発明は、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬の製造における、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の使用を提供する。本明細書において＜組成物＞などにおいて記載される上記１または複数の実施形態が、本発明の使用において適宜採用され得る。
さらに別の局面では、本発明は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬の製造における、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の使用を提供する。本明細書において＜組成物＞などにおいて記載される上記１または複数の実施形態が、本発明の使用において適宜採用され得る。
一局面において、本発明は、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬の製造における、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の使用を提供する。本明細書において＜組成物＞などにおいて記載される上記１または複数の実施形態が、本発明の使用において適宜採用され得る。
さらに別の局面では、本発明は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬の製造における、（Ｔ）ＥＷ－７１９７（Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン）もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の使用を提供する。本明細書において＜組成物＞などにおいて記載される上記１または複数の実施形態が、本発明の使用において適宜採用され得る。
【0042】
＜保存用組成物および保存方法＞
別の局面において、本発明は、（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮細胞の保存のための組成物を提供する。好ましい実施形態では、保存は凍結保存である。本発明において用いられる（Ｔ）ＥＷ－７１９７は、本明細書において説明される任意の形態、例えば、医薬として説明されている実施形態のうち、保存用組成物として適切なものを用いることができると理解される。本明細書において「保存用組成物」とは、ドナーから摘出した角膜片を、レシピエントに移植するまでの期間において保存するため、あるいは増殖前または増殖した角膜内皮細胞を保存するための組成物である。
別の局面において、本発明は、（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む、角膜内皮細胞の保存のための組成物を提供する。好ましい実施形態では、保存は凍結保存である。本発明において用いられる（Ｔ）ＥＷ－７１９７は、本明細書において説明される任意の形態、例えば、医薬として説明されている実施形態のうち、保存用組成物として適切なものを用いることができると理解される。本明細書において「保存用組成物」とは、ドナーから摘出した角膜片を、レシピエントに移植するまでの期間において保存するため、あるいは増殖前または増殖した角膜内皮細胞を保存するための組成物である。
【0043】
一局面において、本発明は、角膜内皮細胞の保存用組成物の製造における、（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物の使用を提供する。別の局面において、角膜内皮細胞の保存における使用のための（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を提供する。さらなる別の局面において、（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む角膜内皮細胞の保存用組成物を用いて保存することを含む、角膜内皮細胞を保存する方法を提供する。
【0044】
１つの実施形態では、本発明の保存用組成物は、従来使用される保存剤または保存液に本発明の（Ｔ）ＥＷ－７１９７を添加して調製され得る。そのような角膜保存液としては、角膜移植時に通常用いられる保存液（強角膜片保存液（Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ：登録商標）、角膜移植用眼球保存液（ＥＰＩＩ：登録商標））、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。
【0045】
本発明の保存用組成物は、臓器移植などに用いられる角膜の保存用に用いられる。また、本発明の保存用組成物は、角膜内皮細胞を凍結保存するための保存液またはその成分としても用いられる。
【0046】
凍結保存のために使用される本発明の保存用組成物の別の実施形態では、既存の凍結保存液に本発明の（Ｔ）ＥＷ－７１９７もしくはその誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはその溶媒和物を含む保存用組成物を添加して使用することもできる。凍結保存液としては、例えば、タカラバイオにより提供されるＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）シリーズ（ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ＰＬＵＳ（カタログ番号：ＣＢ０２１）、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ２（カタログ番号：ＣＢ０３１）、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（カタログ番号：ＣＢ０４３）など）、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲ（コージンバイオ カタログ番号：ＫＯＪ－１６０９２００５）、およびＦｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ， Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｒｅｅ， ＣＲＹＯ Ｄｅｆｉｎｅｄ（Ｃｎｔ－ＣＲＹＯとも記載される）（ＣＥＬＬＮＴＥＣ カタログ番号：ＣｎＴ－ＣＲＹＯ－５０）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、使用される凍結保存液はＫＭ ＢＡＮＫＥＲであってもよい。また、当業者であれば、上記凍結保存液の構成成分を適宜変更またはさらなる構成成分を添加し、改変された適切な凍結保存液を使用することができることが理解される。凍結保存のためには、本発明の保存液にグリセロール、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、アセトアミド等をさらに添加してもよい。
【0047】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【0048】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【0049】
以下に、本発明の例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、エルランゲン大学（ドイツ）、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの倫理委員会またはそれに準ずるものの承認を受けた。
【0050】
（調製例：フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）モデルの作製）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）を作製した。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）を作製した。
【0051】
（培養方法）
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５－０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０－５００）、２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ７９０２－５００Ｇ）、０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９－５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４－２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０－０６４）および５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルホニルフェニル）－５（４－ピリジル）イミダゾール＜４－［４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルフィニルフェニル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（本明細書では「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」ともいう）で培養した。
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５－０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０－５００）、２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ７９０２－５００Ｇ）、０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９－５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４－２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０－０６４）および５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルホニルフェニル）－５（４－ピリジル）イミダゾール＜４－［４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルフィニルフェニル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（本明細書では「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」ともいう）で培養した。
【0052】
（取得方法）
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（デスメ膜内皮角膜移植＝ＤＭＥＫ）を実施されたヒト患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ－ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５－ＴＯＰＯ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ； Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて２９３Ｔ 細胞 （ＲＣＢ２２０２； Ｒｉｋｅｎ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｂａｒａｋｉ， Ｊａｐａｎ）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像を確認した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）および不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をみると、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）により維持培養を行った。
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（デスメ膜内皮角膜移植＝ＤＭＥＫ）を実施されたヒト患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ－ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５－ＴＯＰＯ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ； Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて２９３Ｔ 細胞 （ＲＣＢ２２０２； Ｒｉｋｅｎ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｂａｒａｋｉ， Ｊａｐａｎ）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像を確認した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）および不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をみると、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）により維持培養を行った。
【0053】
（位相差顕微鏡による観察例）
フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（－）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（－）を添加し、３７℃（５％ ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（－）除去後、０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８－３４）を添加し、３７℃（５％ ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６－３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０－５００）＋１％Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２－９４）を使用した。
フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（－）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（－）を添加し、３７℃（５％ ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（－）除去後、０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８－３４）を添加し、３７℃（５％ ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６－３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０－５００）＋１％Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２－９４）を使用した。
【0054】
１２ウェルプレートにフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）を１ウェル当たり８．０×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％ ＣＯ２）で２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0055】
２４時間後、培地を交換し、再び２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0056】
２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β２ Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＷＡＫＯ、２００－１９９１１）を添加し、２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【0057】
図１に示されるように、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）をＴＧＦ―βにより刺激した場合、顕著に細胞が障害された。
【0058】
（実施例１：ＥＷ－７１９７による角膜内皮細胞障害抑制効果）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）を用いて、ＥＷ－７１９７による角膜内皮細胞障害抑制効果を観察した。細胞の観察方法は、上記観察例に基づいて行った。対象として角膜内皮細胞障害を抑制することが知られているＳＢ４３１５４２を使用した（国際公開第２０１５／０６４７６８号を参照のこと。）。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）を用いて、ＥＷ－７１９７による角膜内皮細胞障害抑制効果を観察した。細胞の観察方法は、上記観察例に基づいて行った。対象として角膜内皮細胞障害を抑制することが知られているＳＢ４３１５４２を使用した（国際公開第２０１５／０６４７６８号を参照のこと。）。
【0059】
（材料および方法）
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを播種して２４時間培養した後、培地を除去し、ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２－１６５４１）およびＥＷ－７１９７（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ７５３０）をそれぞれ終濃度０．１、０．３、１、３、１０μＭとなるように添加し、２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを播種して２４時間培養した後、培地を除去し、ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２－１６５４１）およびＥＷ－７１９７（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ７５３０）をそれぞれ終濃度０．１、０．３、１、３、１０μＭとなるように添加し、２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0060】
２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β２ Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＷＡＫＯ、２００－１９９１１）と共にＳＢ４３１５４２およびＥＷ－７１９７をそれぞれ終濃度０．１、０．３、１、３、１０μＭとなるように添加し、２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0061】
２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
（結果）
図２、図３に結果を示す。ＳＢ４３１５４２によりプレトリートメントした場合は、３μＭおよび１０μＭにおいて特に１０μＭにおいて、角膜内皮細胞の障害が抑制されており、特に１０μＭにおいて、効果的に角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。一方で、ＥＷ－７１９７によりプレトリートメントした場合は、特に０．１、０．３、１μＭにおいて効果的に角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。また３μＭおよび１０μＭにおいても角膜内皮細胞障害抑制効果が確認された。驚くべきことに、ＥＷ－７１９７は、従来から角膜内皮細胞の障害を抑制できることが知られているＳＢ４３１５４２と比較して、極めて低い濃度でも角膜内皮細胞の障害を抑制することができることが明らかになった。
（結果）
図２、図３に結果を示す。ＳＢ４３１５４２によりプレトリートメントした場合は、３μＭおよび１０μＭにおいて特に１０μＭにおいて、角膜内皮細胞の障害が抑制されており、特に１０μＭにおいて、効果的に角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。一方で、ＥＷ－７１９７によりプレトリートメントした場合は、特に０．１、０．３、１μＭにおいて効果的に角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。また３μＭおよび１０μＭにおいても角膜内皮細胞障害抑制効果が確認された。驚くべきことに、ＥＷ－７１９７は、従来から角膜内皮細胞の障害を抑制できることが知られているＳＢ４３１５４２と比較して、極めて低い濃度でも角膜内皮細胞の障害を抑制することができることが明らかになった。
【0062】
（実施例２：ＥＷ－７１９７の濃度の検討）
本実施例では、効果的に角膜内皮細胞障害抑制効果が観察されるＥＷ－７１９７の濃度を検討した。角膜内皮細胞障害抑制効果は、実施例１と同様の方法により観察した。
本実施例では、効果的に角膜内皮細胞障害抑制効果が観察されるＥＷ－７１９７の濃度を検討した。角膜内皮細胞障害抑制効果は、実施例１と同様の方法により観察した。
【0063】
（材料および方法）
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを７．０×１０４個の割合で播種して２４時間培養した後、培地を除去し、ＥＷ－７１９７（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ７５３０）を終濃度０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０μＭとなるように添加し、２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを７．０×１０４個の割合で播種して２４時間培養した後、培地を除去し、ＥＷ－７１９７（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ７５３０）を終濃度０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０μＭとなるように添加し、２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0064】
２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β２ Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＷＡＫＯ、２００－１９９１１）およびＥＷ－７１９７を終濃度０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０μＭとなるように添加し、２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0065】
２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【0066】
（結果）
図４に結果を示す。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）をＴＧＦ－βにより刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められた。ＥＷ－７１９７を添加した群においては、特に０．０３、０．１、０．３、１μＭにおいて、特に優れた角膜内皮細胞障害抑制効果が観察された。また、３μＭおよび１０μＭにおいても効果的に角膜内皮細胞の障害を抑制することが確認された。このように、ＥＷ－７１９７は、広い濃度範囲で、効果的に角膜内皮細胞の障害を抑制することが明らかになった。
図４に結果を示す。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）をＴＧＦ－βにより刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められた。ＥＷ－７１９７を添加した群においては、特に０．０３、０．１、０．３、１μＭにおいて、特に優れた角膜内皮細胞障害抑制効果が観察された。また、３μＭおよび１０μＭにおいても効果的に角膜内皮細胞の障害を抑制することが確認された。このように、ＥＷ－７１９７は、広い濃度範囲で、効果的に角膜内皮細胞の障害を抑制することが明らかになった。
【0067】
（実施例３：生存細胞率およびカスパーゼ３／７活性）
本実施例では、ＥＷ－７１９７存在下での生存細胞率およびカスパーゼ３／７活性の解析を行った。比較対照としてＳＢ４３１５４２を用いた。
本実施例では、ＥＷ－７１９７存在下での生存細胞率およびカスパーゼ３／７活性の解析を行った。比較対照としてＳＢ４３１５４２を用いた。
【0068】
（材料および方法）
（細胞生存率の解析）
９６ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり３×１０３個の割合で播種し、３７℃（５％ ＣＯ２）でコンフルエントになるまで培養した。培地は、ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
（細胞生存率の解析）
９６ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり３×１０３個の割合で播種し、３７℃（５％ ＣＯ２）でコンフルエントになるまで培養した。培地は、ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0069】
２４時間後、培地を除去し、ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２－１６５４１）およびＥＷ－７１９７（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ７５３０）をそれぞれ終濃度０．０１、０．１、１、１０μＭとなるように添加し、４８時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0070】
２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態を観察した。
【0071】
観察後、以下の手順で、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙによる生存細胞率の解析を行った。１ウェル当り５０μｌになるように培地を捨て、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７２）を培地と１：１になるように５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。ここからの作業は遮光で行った。シェイカーを用いて１２０ｍｉｎ－１程度で２分間よく混ぜ、１０分間静置させた。静置後、Ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９１２、Ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ ９６ｗｅｌｌ、ｗｈｉｔｅ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に８０μｌを移し、ＧｌｏＭａｘ－Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ７０５１）を用いて吸光度を測定した。
【0072】
（カスパーゼ３／７の解析）
９６ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり３×１０３個の割合で播種し、３７℃（５％ ＣＯ２）でコンフルエントになるまで培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
９６ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり３×１０３個の割合で播種し、３７℃（５％ ＣＯ２）でコンフルエントになるまで培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0073】
２４時間後、培地を除去し、ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２－１６５４１）およびＥＷ－７１９７（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ７５３０）をそれぞれ終濃度０．０１、０．１、１、１０μＭとなるように添加し、２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0074】
２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β２ Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＷＡＫＯ、２００－１９９１１）およびＳＢ４３１５４２を終濃度０．０１、０．１、１、１０μＭとなるように添加し、２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0075】
２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態を観察した。
【0076】
観察後、以下の手順で、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ ＡｓｓａｙによるＣａｓｐａｓｅ ３／７活性の測定を行った。１ウェル当り５０μｌになるように培地を捨て、Ｃａｓｐａｓｅ Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ ＢｕｆｆｅｒとＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの混合液）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ８０９１）溶液を培地と１：１になるように５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。ここからの作業は遮光で行った。シェイカーを用いて１２０ｍｉｎ－１程度で２分間よく混ぜ、室温で４０分間静置させた。静置後、Ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９１２、Ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ ９６ｗｅｌｌ、ｗｈｉｔｅ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に８０μｌを移し、ＧｌｏＭａｘ－Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ７０５１）を用いて吸光度を測定した。
【0077】
なお、陽性対照としてカスパーゼ阻害剤である１０μＭＺ－ＶＤ－ＦＭＫ（ＷＡＫＯ、２６２－０２０６Ｉ）を使用した。
【0078】
（結果）
（細胞生存率の解析）
結果を図５および図６に示す。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙにより、生存細胞率を測定した結果、ＳＢ４３１５４２を添加した場合、０．０１、０．１、１、１０μＭの全ての濃度においてＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して生存細胞率に有意な差は認められなかった。これらのことから０．０１、０．１、１、１０μＭの濃度においては、ＳＢ４３１５４２の添加は細胞に障害をきたさない。ＥＷ－７１９７を添加した場合も同様に、０．０１、０．１、１、１０μＭの全ての濃度においてＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して生存細胞率に有意な差は認められなかった。これらのことから０．０１、０．１、１、１０μＭの濃度においては、ＥＷ－７１９７の添加は細胞に障害をきたさない。
（細胞生存率の解析）
結果を図５および図６に示す。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙにより、生存細胞率を測定した結果、ＳＢ４３１５４２を添加した場合、０．０１、０．１、１、１０μＭの全ての濃度においてＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して生存細胞率に有意な差は認められなかった。これらのことから０．０１、０．１、１、１０μＭの濃度においては、ＳＢ４３１５４２の添加は細胞に障害をきたさない。ＥＷ－７１９７を添加した場合も同様に、０．０１、０．１、１、１０μＭの全ての濃度においてＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して生存細胞率に有意な差は認められなかった。これらのことから０．０１、０．１、１、１０μＭの濃度においては、ＥＷ－７１９７の添加は細胞に障害をきたさない。
【0079】
（カスパーゼ３／７の解析）
結果を図５および図６に示す。Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙは、アポトーシス誘導に伴うＣａｓｐａｓｅ ３／７の活性を測定することができる。つまり、Ｃａｓｐａｓｅ ３／７の活性が高いほど、細胞障害が誘導されていることを表す。図５より、ＴＧＦ―βで刺激した場合、刺激していない場合と比べて有意にＣａｓｐａｓｅ ３／７が活性したことが認められた。一方でＳＢ４３１５４２を添加すると、０．０１、０．１、１、１０μＭの順にＣａｓｐａｓｅ ３／７の活性が低下しており、特に１０μＭではＴＧＦ－βで刺激していないＣｏｎｔｒｏｌ群と同程度の値となった。よってＳＢ４３１５４２は濃度依存的にＣａｓｐａｓｅ ３／７の活性を阻害しており、１０μＭで最も効果的にその効果を示す。ＥＷ－７１９７を添加すると０．０１μＭで有意にＣａｓｐａｓｅ ３／７を阻害しており、特に０．１、１、１０μＭではＴＧＦ－βで刺激していないＣｏｎｔｒｏｌ群と同程度の値となった。ＥＷ－７１９７もまた、ＳＢ４３１５４２と同様にＣａｓｐａｓｅ ３／７を阻害することができることが明らかになった。特に、ＥＷ－７１９７は、０．１μＭの濃度でも、ＳＢ４３１５４２と比べて高い阻害効果が観察された。
結果を図５および図６に示す。Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙは、アポトーシス誘導に伴うＣａｓｐａｓｅ ３／７の活性を測定することができる。つまり、Ｃａｓｐａｓｅ ３／７の活性が高いほど、細胞障害が誘導されていることを表す。図５より、ＴＧＦ―βで刺激した場合、刺激していない場合と比べて有意にＣａｓｐａｓｅ ３／７が活性したことが認められた。一方でＳＢ４３１５４２を添加すると、０．０１、０．１、１、１０μＭの順にＣａｓｐａｓｅ ３／７の活性が低下しており、特に１０μＭではＴＧＦ－βで刺激していないＣｏｎｔｒｏｌ群と同程度の値となった。よってＳＢ４３１５４２は濃度依存的にＣａｓｐａｓｅ ３／７の活性を阻害しており、１０μＭで最も効果的にその効果を示す。ＥＷ－７１９７を添加すると０．０１μＭで有意にＣａｓｐａｓｅ ３／７を阻害しており、特に０．１、１、１０μＭではＴＧＦ－βで刺激していないＣｏｎｔｒｏｌ群と同程度の値となった。ＥＷ－７１９７もまた、ＳＢ４３１５４２と同様にＣａｓｐａｓｅ ３／７を阻害することができることが明らかになった。特に、ＥＷ－７１９７は、０．１μＭの濃度でも、ＳＢ４３１５４２と比べて高い阻害効果が観察された。
【0080】
（実施例４：ウェスタンブロット）
本実施例では、ＥＷ－７１９７の添加時のｉＦＥＣＤにおけるフィブロネクチン（約２４０ｋＤａ）、活性型である切断カスパーゼ３（約１７ｋＤａ）およびＰＡＲＰ（約８９ｋＤａ）の発現をウェスタンブロットにより確認した。
本実施例では、ＥＷ－７１９７の添加時のｉＦＥＣＤにおけるフィブロネクチン（約２４０ｋＤａ）、活性型である切断カスパーゼ３（約１７ｋＤａ）およびＰＡＲＰ（約８９ｋＤａ）の発現をウェスタンブロットにより確認した。
【0081】
（材料および方法）
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり８．０×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％ ＣＯ２）で２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり８．０×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％ ＣＯ２）で２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0082】
２４時間後、培地を除去し、ＥＷ－７１９７（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ７５３０）が終濃度０．１、１、１０μＭ、ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２－１６５４１）が終濃度１０μＭとなるように２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0083】
２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β２ Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＷＡＫＯ、２００－１９９１１）およびＥＷ－７１９７が終濃度０．１、１、１０μＭ、ＳＢ４３１５４２が終濃度１０μＭとなるように２４時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
【0084】
２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【0085】
観察後、以下手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
【0086】
１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（－）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５ｍｉｎ遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（－）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５ｍｉｎ遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。
【0087】
洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、１％ ＮＰ－４０）を加えてタンパク質を抽出した。
【0088】
その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０ｓｅｃ、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心し、タンパク質の上清を回収した。
【0089】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。なお、タンパク量はフィブロネクチン、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨを４μｇ、カスパーゼ３を１０μｇとした。１次抗体は、マウス抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６１００７７）、ウサギ抗Ｃａｓｐａｓｅ ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１－３）を用いた。
上記抽出したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。なお、タンパク量はフィブロネクチン、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨを４μｇ、カスパーゼ３を１０μｇとした。１次抗体は、マウス抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６１００７７）、ウサギ抗Ｃａｓｐａｓｅ ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１－３）を用いた。
【0090】
２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ，ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体は、マウス抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体については２００００倍希釈、ラビット抗ＰＡＲＰ抗体については１０００倍希釈、ラビット抗Ｃａｓｐａｓｅ ３抗体については１０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体については３０００倍希釈し、２次抗体はいずれも５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ Ｌｕｍｉ ＯＮＥ Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４－４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ－４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。
【0091】
（結果）
図７に結果を示す。ｉＦＥＣＤをＴＧＦ－βにより刺激した場合、フィブロネクチン（約２４０ｋＤａ）、活性型である切断カスパーゼ３（約１７ｋＤａ）およびＰＡＲＰ（約８９ｋＤａ）の発現が認められた。一方で、ＥＷ－７１９７の存在下ではいずれの濃度においてもフィブロネクチンの発現はＴＧＦ－βで刺激していないＣｏｎｔｒｏｌ群や１０μＭのＳＢ４３１５４２と同程度に抑制されていた。また、活性型の切断カスパーゼ３およびＰＡＲＰの活性もＴＧＦ－βで刺激していないＣｏｎｔｒｏｌ群や１０μＭのＳＢ４３１５４２と同程度に活性が抑制された。したがって、ウェスタンブロットによる解析よりＥＷ－７１９７はＳＢ４３１５４２と同様にフィブロネクチンの発現を抑制することが明らかになった。
図７に結果を示す。ｉＦＥＣＤをＴＧＦ－βにより刺激した場合、フィブロネクチン（約２４０ｋＤａ）、活性型である切断カスパーゼ３（約１７ｋＤａ）およびＰＡＲＰ（約８９ｋＤａ）の発現が認められた。一方で、ＥＷ－７１９７の存在下ではいずれの濃度においてもフィブロネクチンの発現はＴＧＦ－βで刺激していないＣｏｎｔｒｏｌ群や１０μＭのＳＢ４３１５４２と同程度に抑制されていた。また、活性型の切断カスパーゼ３およびＰＡＲＰの活性もＴＧＦ－βで刺激していないＣｏｎｔｒｏｌ群や１０μＭのＳＢ４３１５４２と同程度に活性が抑制された。したがって、ウェスタンブロットによる解析よりＥＷ－７１９７はＳＢ４３１５４２と同様にフィブロネクチンの発現を抑制することが明らかになった。
【0092】
（実施例５：Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスを用いたフックス角膜内皮ジストロフィに対するＥＷ－７１９７点眼液の薬効評価）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル動物であるＣｏｌ８ａ２ノックインマウスを用いたフックス角膜内皮ジストロフィに対するＥＷ－７１９７点眼液の薬効を評価した。Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスは、フックス角膜内皮ジストロフィの確立された動物モデルである（文献Ｊｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１２ Ｊａｎ １５；２１（２）：３８４－９３）。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル動物であるＣｏｌ８ａ２ノックインマウスを用いたフックス角膜内皮ジストロフィに対するＥＷ－７１９７点眼液の薬効を評価した。Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスは、フックス角膜内皮ジストロフィの確立された動物モデルである（文献Ｊｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１２ Ｊａｎ １５；２１（２）：３８４－９３）。
【0093】
（材料および方法）
４ヵ月齢のａｌｐｈａ ２ ｃｏｌｌａｇｅｎ ８遺伝子（Ｃｏｌ８ａ２）ノックインマウスに０．０２％（約０．５ｍＭ）ＥＷ－７１９７点眼液または基剤（７％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ）を５μＬ、１日４回、８週間、両眼に点眼投与した。点眼前、点眼２、４、６、８週後にスペキュラーマイクロスコープＫＳ３Ｍ（株式会社コーナンメディカル）を用いて角膜内皮細胞密度を計測した。点眼８週後に過剰量（２００ｍｇ／ｋｇ体重以上）のソムノペンチル麻酔用注射液（共立製薬株式会社）を腹腔内投与することによりマウスを安楽死させ、心停止を確認後、両眼球を採取した。採取した眼球を切開して角膜片を作製し、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの免疫染色を以下のとおり行った。Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ（株式会社日本ローパー）を用いて、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの発現面積を解析した。
４ヵ月齢のａｌｐｈａ ２ ｃｏｌｌａｇｅｎ ８遺伝子（Ｃｏｌ８ａ２）ノックインマウスに０．０２％（約０．５ｍＭ）ＥＷ－７１９７点眼液または基剤（７％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ）を５μＬ、１日４回、８週間、両眼に点眼投与した。点眼前、点眼２、４、６、８週後にスペキュラーマイクロスコープＫＳ３Ｍ（株式会社コーナンメディカル）を用いて角膜内皮細胞密度を計測した。点眼８週後に過剰量（２００ｍｇ／ｋｇ体重以上）のソムノペンチル麻酔用注射液（共立製薬株式会社）を腹腔内投与することによりマウスを安楽死させ、心停止を確認後、両眼球を採取した。採取した眼球を切開して角膜片を作製し、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの免疫染色を以下のとおり行った。Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ（株式会社日本ローパー）を用いて、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの発現面積を解析した。
【0094】
（Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの免疫染色方法）
マウス角膜片を４％パラホルムアルデヒド中で１０分間、室温で固定した後、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を加え、５分間浸透化処理をした。１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加え室温で１時間インキュベートした後、一次抗体液に角膜片を浸漬させ、４℃で一晩反応させた。一次抗体は、Ｉ型コラーゲンポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の１：２００希釈液、フィブロネクチンポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ）の１：２５０希釈を用いた。次いで、二次抗体液およびＤＡＰＩ溶液（株式会社同仁化学研究所）の混合液に角膜片を浸漬させ、遮光して室温で１時間反応させた。二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を用いた。ＤＡＰＩ溶液は、１：１０００希釈を用いた。角膜片を伸展させスライドガラス上に置き、カバーガラスをかけて封入した。作製した標本は、共焦点レーザー走査型顕微鏡 オリンパスＦＶ１０００ ＦＬＵＯＶＩＥＷ（オリンパス株式会社）を用いて観察した。
マウス角膜片を４％パラホルムアルデヒド中で１０分間、室温で固定した後、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を加え、５分間浸透化処理をした。１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加え室温で１時間インキュベートした後、一次抗体液に角膜片を浸漬させ、４℃で一晩反応させた。一次抗体は、Ｉ型コラーゲンポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の１：２００希釈液、フィブロネクチンポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ）の１：２５０希釈を用いた。次いで、二次抗体液およびＤＡＰＩ溶液（株式会社同仁化学研究所）の混合液に角膜片を浸漬させ、遮光して室温で１時間反応させた。二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を用いた。ＤＡＰＩ溶液は、１：１０００希釈を用いた。角膜片を伸展させスライドガラス上に置き、カバーガラスをかけて封入した。作製した標本は、共焦点レーザー走査型顕微鏡 オリンパスＦＶ１０００ ＦＬＵＯＶＩＥＷ（オリンパス株式会社）を用いて観察した。
【0095】
（結果）
Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスにおける点眼前からの点眼４週および８週後の角膜内皮細胞密度の変化量（ΔＥＣＤ（ｃｅｌｌ／ｍｍ２）の結果を表１に示す。なお、Ｃｏｌ８ａ２遺伝子を導入していない正常なマウスでは、４週後に５１．５ｃｅｌｌ／ｍｍ２の角膜内細胞密度の減少、８週後に１２３．６ｃｅｌｌ／ｍｍ２の角膜内細胞密度の減少が観察された。正常なマウスにおける角膜内皮細胞密度のわずかな減少は、加齢による角膜内皮細胞の減少によるものと考えられる。
Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスにおける点眼前からの点眼４週および８週後の角膜内皮細胞密度の変化量（ΔＥＣＤ（ｃｅｌｌ／ｍｍ２）の結果を表１に示す。なお、Ｃｏｌ８ａ２遺伝子を導入していない正常なマウスでは、４週後に５１．５ｃｅｌｌ／ｍｍ２の角膜内細胞密度の減少、８週後に１２３．６ｃｅｌｌ／ｍｍ２の角膜内細胞密度の減少が観察された。正常なマウスにおける角膜内皮細胞密度のわずかな減少は、加齢による角膜内皮細胞の減少によるものと考えられる。
【表1】
【0096】
表１から明らかなように、０．０２％ ＥＷ－７１９７点眼液投与群において、角膜内皮細胞密度の減少が基剤を投与した群と比べ顕著に抑制された。Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスでは、免疫染色によりＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの顕著な発現増加が観察された。図８は、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの発現面積の解析結果を示す。０．０２％ ＥＷ－７１９７点眼液投与群において、基剤投与群と比べＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの発現が減少傾向であった。
【0097】
このように、ＥＷ－７１９７の点眼により、ＥＷ－７１９７は、角膜内皮に十分に移行し、角膜内皮細胞の減少（角膜内皮細胞のアポトーシス等）および／または細胞外マトリクス（Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチン等）の過剰発現に代表される角膜内皮障害を効果的に抑制したことが明らかになった。
【0098】
（実施例６：Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスを用いたフックス角膜内皮ジストロフィに対する種々の濃度のＥＷ－７１９７点眼液の薬効評価）
本実施例では、Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスを用いたフックス角膜内皮ジストロフィに対する種々の濃度のＥＷ－７１９７点眼液の薬効を評価した。
本実施例では、Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスを用いたフックス角膜内皮ジストロフィに対する種々の濃度のＥＷ－７１９７点眼液の薬効を評価した。
【0099】
（方法）
４ヵ月齢のａｌｐｈａ ２ ｃｏｌｌａｇｅｎ ８遺伝子（Ｃｏｌ８ａ２）ノックインマウスに０．０２％（約０．５ｍＭ）ＥＷ－７１９７点眼液、０．１％（約２．５ｍＭ）ＥＷ－７１９７点眼液又は基剤（ＤＭＳＯ含有リン酸緩衝液）を５μＬ、１日４回、１２週間、両眼に点眼投与した。基剤には必要に応じて界面活性剤を加えた。当業者であれば、適宜適切な界面活性剤を使用することができる（本瀬賢治（１９８４）．「点眼剤」南山堂； 日本医薬品添加剤協会（２０１６）．「医薬品添加物辞典」薬事日報社）。点眼前、点眼３、６、９、１２週後にスペキュラーマイクロスコープＫＳ３Ｍ（株式会社コーナンメディカル）を用いて角膜中央部の角膜内皮細胞密度を計測した。点眼１２週後に過剰量（２００ｍｇ／ｋｇ体重以上）のソムノペンチル麻酔用注射液（共立製薬株式会社）を腹腔内投与することによりマウスを安楽死させ、心停止を確認後、両眼球を採取した。採取した眼球を切開して角膜片を作製し、フィブロネクチンの免疫染色を行った。免疫染色方法は以下の通りである。Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ（株式会社日本ローパー）を用いて、フィブロネクチンの発現面積を解析した。
４ヵ月齢のａｌｐｈａ ２ ｃｏｌｌａｇｅｎ ８遺伝子（Ｃｏｌ８ａ２）ノックインマウスに０．０２％（約０．５ｍＭ）ＥＷ－７１９７点眼液、０．１％（約２．５ｍＭ）ＥＷ－７１９７点眼液又は基剤（ＤＭＳＯ含有リン酸緩衝液）を５μＬ、１日４回、１２週間、両眼に点眼投与した。基剤には必要に応じて界面活性剤を加えた。当業者であれば、適宜適切な界面活性剤を使用することができる（本瀬賢治（１９８４）．「点眼剤」南山堂； 日本医薬品添加剤協会（２０１６）．「医薬品添加物辞典」薬事日報社）。点眼前、点眼３、６、９、１２週後にスペキュラーマイクロスコープＫＳ３Ｍ（株式会社コーナンメディカル）を用いて角膜中央部の角膜内皮細胞密度を計測した。点眼１２週後に過剰量（２００ｍｇ／ｋｇ体重以上）のソムノペンチル麻酔用注射液（共立製薬株式会社）を腹腔内投与することによりマウスを安楽死させ、心停止を確認後、両眼球を採取した。採取した眼球を切開して角膜片を作製し、フィブロネクチンの免疫染色を行った。免疫染色方法は以下の通りである。Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ（株式会社日本ローパー）を用いて、フィブロネクチンの発現面積を解析した。
【0100】
（フィブロネクチンの免疫染色方法）
マウス角膜片を４％パラホルムアルデヒド中で１０分間、室温で固定した後、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を加え、５分間浸透化処理をした。１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加え室温で１時間インキュベートした後、一次抗体液に角膜片を浸漬させ、４℃で一晩反応させた。一次抗体は、フィブロネクチンポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ）の１：２５０希釈を用いた。次いで、二次抗体液およびＤＡＰＩ溶液（株式会社同仁化学研究所）の混合液に角膜片を浸漬させ、遮光して室温で１時間反応させた。二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を用いた。ＤＡＰＩ溶液は、１：１０００希釈を用いた。角膜片を伸展させスライドガラス上に置き、カバーガラスをかけて封入した。作製した標本は、共焦点レーザー走査型顕微鏡オリンパスＦＶ１０００ ＦＬＵＯＶＩＥＷ（オリンパス株式会社）又は共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８８０（カールツァイスマイクロスコピー株式会社）を用いて観察した。角膜の中央部、６時方向、９時方向（耳側）、３時方向（鼻側）の領域において、４０倍または１００倍の視野で観察を行った。
マウス角膜片を４％パラホルムアルデヒド中で１０分間、室温で固定した後、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を加え、５分間浸透化処理をした。１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加え室温で１時間インキュベートした後、一次抗体液に角膜片を浸漬させ、４℃で一晩反応させた。一次抗体は、フィブロネクチンポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ）の１：２５０希釈を用いた。次いで、二次抗体液およびＤＡＰＩ溶液（株式会社同仁化学研究所）の混合液に角膜片を浸漬させ、遮光して室温で１時間反応させた。二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を用いた。ＤＡＰＩ溶液は、１：１０００希釈を用いた。角膜片を伸展させスライドガラス上に置き、カバーガラスをかけて封入した。作製した標本は、共焦点レーザー走査型顕微鏡オリンパスＦＶ１０００ ＦＬＵＯＶＩＥＷ（オリンパス株式会社）又は共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８８０（カールツァイスマイクロスコピー株式会社）を用いて観察した。角膜の中央部、６時方向、９時方向（耳側）、３時方向（鼻側）の領域において、４０倍または１００倍の視野で観察を行った。
【0101】
（結果）
第６週までは、ＥＷ－７１９７点眼群において、角膜中央部における角膜内皮密度の減少を抑制する傾向が観察されたが、第１２週では、ＥＷ－７１９７点眼群と基剤点眼群との間で、角膜中央部における角膜内皮密度の大きな差が観察されなかった。角膜中央部よりも角膜周辺部においてグッタータが多い傾向があったため、第１２週では、ＥＷ－７１９７点眼群と基剤点眼群との間で、角膜中央部における角膜内皮密度に大きな差が観察されなかったと考えられる。実際、中央部よりも周辺部の方がフィブロネクチンの発現量が高い傾向にあった（図９）。図９において示されるように、０．０２％および０．１％ＥＷ－７１９７点眼群において、フィブロネクチンの明確な発現抑制が観察された。低濃度での薬理効果を試験するために、０．０２％ＥＷ－７１９７点眼液の５分の１の濃度である０．００４％（０．１ｍＭ）で同様の実験を行ったところ、フィブロネクチンの発現を抑制する傾向が観察された。以上より、ＥＷ－７１９７は幅広い濃度で有効であることが明らかになった。
第６週までは、ＥＷ－７１９７点眼群において、角膜中央部における角膜内皮密度の減少を抑制する傾向が観察されたが、第１２週では、ＥＷ－７１９７点眼群と基剤点眼群との間で、角膜中央部における角膜内皮密度の大きな差が観察されなかった。角膜中央部よりも角膜周辺部においてグッタータが多い傾向があったため、第１２週では、ＥＷ－７１９７点眼群と基剤点眼群との間で、角膜中央部における角膜内皮密度に大きな差が観察されなかったと考えられる。実際、中央部よりも周辺部の方がフィブロネクチンの発現量が高い傾向にあった（図９）。図９において示されるように、０．０２％および０．１％ＥＷ－７１９７点眼群において、フィブロネクチンの明確な発現抑制が観察された。低濃度での薬理効果を試験するために、０．０２％ＥＷ－７１９７点眼液の５分の１の濃度である０．００４％（０．１ｍＭ）で同様の実験を行ったところ、フィブロネクチンの発現を抑制する傾向が観察された。以上より、ＥＷ－７１９７は幅広い濃度で有効であることが明らかになった。
【0102】
（実施例７：ＥＷ－７１９７を含有する角膜保存液の製剤例）
本実施例では、製剤例として、ＥＷ－７１９７を含有する角膜保存液を以下のように製造する。
本実施例では、製剤例として、ＥＷ－７１９７を含有する角膜保存液を以下のように製造する。
【0103】
常法により下に示す保存液を調製する。
【0104】
ＥＷ－７１９７ 有効量（例えば、０．１μＭ）
Ｏｐｔｉｓｏｌ－ＧＳ（Ｂａｕｓｃｈ－Ｌｏｍｂ）適量
全量１００ｍＬ
（実施例８：点眼剤の調製例）
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
Ｏｐｔｉｓｏｌ－ＧＳ（Ｂａｕｓｃｈ－Ｌｏｍｂ）適量
全量１００ｍＬ
（実施例８：点眼剤の調製例）
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
【0105】
ＥＷ－７１９７ ０．１ｍＭ
塩化ナトリウム ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物 ０．１ｇ
（任意に）ベンザルコニウム塩化物 ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）
濃度は、以下からなる基剤を用いて希釈してもよい。
塩化ナトリウム ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物 ０．１ｇ
（任意に）ベンザルコニウム塩化物 ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）
濃度は、以下からなる基剤を用いて希釈してもよい。
【0106】
塩化ナトリウム ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物 ０．１ｇ
（任意に）ベンザルコニウム塩化物 ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）
有効成分以外の各成分としては、例えば、日本薬局方またはその等価物に適合した、市販のものを利用することができる。
リン酸二水素ナトリウム二水和物 ０．１ｇ
（任意に）ベンザルコニウム塩化物 ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）
有効成分以外の各成分としては、例えば、日本薬局方またはその等価物に適合した、市販のものを利用することができる。
【0107】
（実施例９：診断および治療例）
フックス角膜内皮ジストロフィおよび類縁の角膜内皮疾患と診断された際に（具体例としては、1）細隙灯顕微鏡検査によるグッテー形成、デスメ膜肥厚、角膜上皮浮腫、角膜実質浮腫の観察、2）スペキュラマイクロスコープによるグッテー像、角膜内皮障害像の観察、3)ペンタカム、OCT、超音波角膜厚測定装置などによる角膜浮腫の観察、4）遺伝子診断により高リスクと判断された場合）使用する。本発明の組成物を、点眼剤、前房内注射、徐放剤を用いた投与、硝子体内注射、結膜下注射として用いて治療することができる。
フックス角膜内皮ジストロフィおよび類縁の角膜内皮疾患と診断された際に（具体例としては、1）細隙灯顕微鏡検査によるグッテー形成、デスメ膜肥厚、角膜上皮浮腫、角膜実質浮腫の観察、2）スペキュラマイクロスコープによるグッテー像、角膜内皮障害像の観察、3)ペンタカム、OCT、超音波角膜厚測定装置などによる角膜浮腫の観察、4）遺伝子診断により高リスクと判断された場合）使用する。本発明の組成物を、点眼剤、前房内注射、徐放剤を用いた投与、硝子体内注射、結膜下注射として用いて治療することができる。
【0108】
有効成分以外の各成分としては、例えば、日本薬局方またはその等価物に適合した、市販のものを利用することができる。
【0109】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は日本国特許出願特願２０１７－２３９０４９号（２０１７年１２月１３日出願）および特願２０１８－１８４７８３号（２０１８年９月２８日）に対して優先権主張を行うものであり、それらの内容全体が本明細書において参照として援用される。
【産業上の利用可能性】
【0110】
（Ｔ）ＥＷ－７１９７を含む、角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬が提供され、特に、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害を治療または予防するための医薬が提供された。このような技術に基づく製剤等に関連する技術に関与する産業（製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
