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▶ ヴィフォール （インターナショナル） アーゲーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-07
(45)【発行日】2023-12-15
(54)【発明の名称】腎疾患に対するシュウ酸カルシウム結晶化阻害剤
(51)【国際特許分類】
C07F 9/09 20060101AFI20231208BHJP
A61K 31/6615 20060101ALI20231208BHJP
A61P 19/06 20060101ALN20231208BHJP
A61P 13/10 20060101ALN20231208BHJP
A61P 3/00 20060101ALN20231208BHJP
A61P 13/04 20060101ALN20231208BHJP
A61P 13/12 20060101ALN20231208BHJP
A61K 47/54 20170101ALN20231208BHJP
A61K 47/60 20170101ALN20231208BHJP
【ＦＩ】
C07F9/09 K CSP
A61K31/6615
A61P19/06
A61P13/10
A61P3/00
A61P13/04
A61P13/12
A61K47/54
A61K47/60
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021538929
(86)(22)【出願日】2019-09-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-06
(86)【国際出願番号】 EP2019074986
(87)【国際公開番号】W WO2020058321
(87)【国際公開日】2020-03-26
【審査請求日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】18195316.7
(32)【優先日】2018-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】19164195.0
(32)【優先日】2019-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】523057644
【氏名又は名称】ヴィフォール （インターナショナル） アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(72)【発明者】
【氏名】アイバーソン，マティアス エマニュエル
(72)【発明者】
【氏名】ルルー，ジャン－クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】クレッツマイヤー，アンナ
【審査官】三木 寛
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０９８０４７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５１３６９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５３２０４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Journal of Biological Chemistry，2002年，Vol.277(43)，p.40290-40295
【文献】Expert Opinion on Drug Delivery，2009年，Vol.6(1)，p.1-16
【文献】International Journal of Nanomedicine，2015年，Vol.10，p.2871-2884
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｆ ９／
Ｃ０７Ｃ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
共通の中央リンカーＬによって連結された一般式（Ｉ）によって表されるシクロヘキサノールペンタキスエステル部分を２個以上含む化合物であって、【化1】
前記共通の中央リンカーＬは、分子量が１０００ｇ／ｍｏｌ未満であって、Ｌは、ポリ（エチレングリコール）鎖及び／又は非置換のＣ1 ～Ｃ4 のアルキレン鎖からなる、前記化合物。
【請求項2】
前記一般式（Ｉ）によって表されるシクロヘキサノールペンタキスエステル部分のいずれか１個は、独立して、一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される部分から選択され、【化2】
【請求項3】
前記化合物が、一般式（ＩＩ）、（ＩＩｉ）、（ＩＩｉｉ）又は（ＩＩｉｉｉ）によって特徴付けられ、【化3】
Ｌは、－（Ｏ－ＣＨ2 －ＣＨ2 ）m －Ｏ－であり、ｍは、１～１２の値である、請求項１～２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項4】
前記化合物が、一般式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩｈ）、（ＩＩｉ）、（ＩＩｋ）、（ＩＩｍ）又は（ＩＩｎ）によって特徴付けられ、【化4】
【化5】
【化6】
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
前記化合物が、一般式（ＩＩＩ）によって特徴付けられ、【化7】
前記リンカーＬは、一般式（ＩＩＩａ）又は一般式（ＩＩＩｃ）であり、
【化8】
【化9】
Ａは、炭素原子（Ｃ）であり、
Ｒは、水素原子及びＣ1 ～Ｃ3 非置換アルキルから選択され、
又は、
ｕ、ｖ及びｗは、互いに独立して、１～１２の値であり、ｕ、ｖ及びｗの合計が３０以下である、請求項１～２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
前記化合物が、一般式（ＩＩＩｄ）又は一般式（ＩＩＩｅ）によって特徴付けられる、【化10】
【請求項7】
前記化合物が、一般式（ＩＶ）によって特徴付けられ、【化11】
前記リンカーＬは、一般式（ＩＶａ）又は一般式（ＩＶｃ）であり、
【化12】
Ａは非置換のＣ4 ～Ｃ7 のシクロアルキルであり、
又は、
ｕ、ｖ、ｗ及びｙは、互いに独立して、１～１２の値であり、ｕ、ｖ、ｗ及びｙの合計が４０以下である、請求項１～２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項8】
前記化合物が、一般式（ＩＶｄ）又は一般式（ＩＶｅ）によって特徴付けられる、【化13】
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物を医薬品として使用する、化合物。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物であり、病理学的結晶化に関連する症状の治療又は予防に使用される、前記化合物。
【請求項11】
前記病理学的結晶化に関連する症状は、患者における病理学的シュウ酸カルシウム又はリン酸塩の結晶化による腎石灰化症又は腎結石症であり、特に前記症状が原発性及び続発性の高シュウ酸尿症、デント病、バーター症候群、遠位尿細管性アシドーシス、神経因性膀胱、常染色体優勢多発性嚢胞腎疾患、シュウ酸カルシウム腎結石形成、スツルバイト結石及び腎石灰化である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項12】
前記病理学的結晶化に関連する症状は、シュウ酸塩、リン酸塩、及び／又はカルシウムの沈殿物の形成に関連する、請求項１０～１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項13】
前記化合物が、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、局所、静脈内、又は特に皮下投与用に処方される、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項14】
一般式（Ｖａ）、一般式（Ｖｂ）、一般式（Ｖｃ）、一般式（ＶＩａ）、一般式（ＶＩｂ）又は一般式（ＶＩｃ）によって表される、化合物。【化14】
【請求項15】
ｋが、２、３、４、５、６、又は７から選択される整数である、請求項１４に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腎疾患に対するシュウ酸カルシウム結晶化阻害剤に関する。
【背景技術】
【0002】
腎結石は、腎組織内のミネラル沈着物であり、特定のミネラルによる尿の過飽和によって形成される。腎結石の有病率は１４．８％と高く、再発の危険性も高い。さらに、ライフスタイルや食生活の変化、肥満、糖尿病、高血圧などの関連する危険因子の増加により、発症率は増加傾向にある。
【0003】
腎結石の形成につながる原因は様々である。しかしながら、主な腎結石に共通する成分はシュウ酸カルシウム（ＣａＯｘ）である。シュウ酸カルシウムの結晶化と腎臓での結石の形成は、尿細管が物理的に閉塞するだけでなく、組織の炎症と線維症を誘発し、臓器の機能を損ない、慢性腎臓病や末期腎疾患を発症するリスクを生み出す。
【0004】
腎臓において臨床的に重要なもう１つのカルシウム沈殿物はリン酸カルシウムである。主に（５０％以上）リン酸カルシウムで構成される腎結石は、すべての結石の最大１０％、カルシウム結石の１５％～２０％を構成し、その８０％はシュウ酸カルシウムで構成される。リン酸カルシウムは、シュウ酸カルシウム結石の最大３０％の微量成分でもある。
【0005】
高シュウ酸尿症、デント病、バーター症候群等の様々な疾患が、ＣａＯｘ腎結石の形成につながる可能性がある。例えば、原発性高シュウ酸尿症の場合、シュウ酸塩の代謝に関与する肝臓タンパク質の欠如又は機能不全のために、シュウ酸塩が過剰に産生される。尿中にシュウ酸塩が多く含まれると、腎管内でＣａＯｘの結晶化が起こり、腎結石が形成され、組織が損傷する。患者は若くして腎不全や末期腎疾患に陥る。治療の選択肢が限られているため、８０％の患者が３０歳で肝腎複合移植を必要とする。
【0006】
現在のところ、腎結石患者の治療法は緩和的なものにとどまっており、疾患の改善にはほど遠いため、患者は結石の再発や、慢性腎臓病や末期腎不全等の重篤な合併症のリスクにさらされている。既に存在する結石は外科的に除去し、腎結石に伴う痛みを内科的に治療することができる。しかしながら、再発率は高く、予防策も限られている。提案されている対策としては、大量の水分摂取、適切な栄養摂取、尿中のカルシウム濃度が高い患者に対するチアシド系薬剤の投与等が挙げられる。
【0007】
ＣａＯｘ結晶化阻害剤（例えばクエン酸塩、リン酸塩等）は、腎結石の形成を予防するために使用することが提案されているが、限られた有効性と望ましくない副作用により、医療機関での適用が制限される。クエン酸塩は、再発性ＣａＯｘ結石患者の予防措置としてある程度の有効性を示すが、その作用機序は不明なままである。
【0008】
まとめると、ＣａＯｘ結晶の核形成、成長、及び腎上皮細胞への付着の傾向を低下させ、最終的には根本的な原因に関わらず腎臓の損傷を軽減することができる医薬品は、治療上重要な価値があると考えられる。尿中のＣａＯｘ結晶化の強力な阻害剤は、腎結石の形成に関連する様々な疾患に適用可能であり、さらに重篤な合併症のリスクを減らすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上記技術状況に基づき、本発明の目的は、病理学的なシュウ酸カルシウムの結晶化に関連する症状において、シュウ酸カルシウム及び／又はリン酸カルシウムの結晶化を治療又は予防するための医薬化合物を提供することである。この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【0010】
［発明の要約］
本発明の第１の態様は、共通の中央リンカーＬによって連結された一般式（Ｉ）によって表されるシクロヘキサノールペンタキスエステル部分を２個以上含む化合物に関する。
ここで、Ｘは、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-、又はＯＳＯ3 -から選択され、Ｌは、括弧内の式で特徴付けられるｎ個の個々の部分が付加される共通の中央リンカーであり、ｎは２～１０の整数である。
本発明の第１の態様は、共通の中央リンカーＬによって連結された一般式（Ｉ）によって表されるシクロヘキサノールペンタキスエステル部分を２個以上含む化合物に関する。
ここで、Ｘは、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-、又はＯＳＯ3 -から選択され、Ｌは、括弧内の式で特徴付けられるｎ個の個々の部分が付加される共通の中央リンカーであり、ｎは２～１０の整数である。
【0011】
【化1】
【0012】
特定の実施形態では、前記化合物は、一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）によって表される。
【0013】
【化2】
【0014】
【化3】
【0015】
【化4】
【0016】
本明細書で負に帯電した化合物として定義される本発明の任意の化合物は、薬学的に許容される対イオンと関連することが理解される。
【0017】
本発明の第２の態様は、カルシウム及び／又はマグネシウムの沈殿物の結晶化又は形成に関連する病状の治療のための、本明細書で規定される化合物の使用に関する。
【0018】
同様に、本発明は、シュウ酸塩沈殿物の結晶化又は形成に関連する病状の治療のための、本明細書で特定される化合物の使用に関する。
【0019】
本発明の別の態様は、治療有効量の本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１は、ｐＨ６．２及びｐＨ５．５におけるＩＩｃ（ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 ）と比較のＩＰ５－ｍｏｎｏ－ＰＥＧ2 （ＯＥＧ2 －ＩＰ５）によるＣａＯｘ結晶化の阻害を示す。ＣａＯｘ結晶化は、１ｍＭのシュウ酸ナトリウムをヒトの尿に加えて誘発し、光学顕微鏡で観察した後、自動画像解析で結晶数、水和物形態（ＣＯＭ－ＣａＯｘ一水和物、ＣＯＤ－ＣａＯｘ二水和物、ｎ．ｄ．定義なし）、結晶面積が決定された。異なる水和物の表面積をコントロールの全表面積で正規化してプロットした。ＩＩｃ（ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 ）では、３００ｎＭでＣＯＭの結晶のみが完全に阻害され、続いて４μＭでＣａＯｘ（ＣＯＭ及びＣＯＤ）が完全に阻害された。一方、従前の化合物ＩＰ５－ｍｏｎｏ－ＰＥＧ2 のＣＯＭの場合、１１μＭで阻害が観察されたが、１００μＭまでの試験範囲ではＣａＯｘ（ＣＯＭ及びＣＯＤ）の完全な阻害は観察されなかった。
【図3】図３は、ｐＨ６．２において、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０８０６５７に記載のＩＰ６類似体によるＣａＯｘ結晶化の阻害を示す。ＣａＯｘ結晶化は、１ｍＭシュウ酸ナトリウムをヒトの尿に加えて誘発し、光学顕微鏡で観察した後、自動画像解析で結晶数、（ＣＯＭ－ＣａＯｘ一水和物、ＣＯＤ－ＣａＯｘ二水和物、ｎ．ｄ．定義なし）、結晶面積が決定された。異なる水和物の表面積をコントロールの全表面積で正規化してプロットした。
【図8】図８は、ＩＰ６類似体によって誘発されたＣａＯｘ結晶化パターンの変化を示す。１ｍＭ ＮａＯｘを添加したヒトの尿中のＣａＯｘバルク結晶化に対する（ＯＥＧ4 ）3 －（ＩＰ５）3 の効果を、ｔ＝７時間後に光学顕微鏡で評価した。ＣＯＭ－ＣａＯｘ一水和物ＣＯＤ－ＣａＯｘ二水和物、ｎ．ｄ．定義なし；Ｎ＝３、平均総面積／視野＋ＳＤ それぞれの結晶型について、コントロール（阻害剤なし）を基準とする。
【図9】図９は、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 が初期の前駆体粒子を安定化させ、ＣＯＤの成長を遅らせることを示す。（Ａ）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）中のＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 による用量依存的なＣａＯｘ結晶化の阻害を、ｔ＝７時間後にＳＥＭで特徴付けた。代表的なＳＥＭ画像を示す（スケールバー：１μｍ）。（Ｂ）５００ｎＭのＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 と阻害剤なしのＣａＯｘ結晶化をｔ＝１０分でサンプリングし、ＳＥＭで画像化した（スケールバー：１μｍ）。結晶化度はＳＡＥＤ付きＴＥＭで特徴付けた（インレット）。
【図10】図１０は、ＩＰ６類似体による腎上皮細胞へのＣａＯｘ付着の阻害を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞へのＣａＯｘ付着に対する（Ａ）ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 、（Ｂ）ＯＥＧ2 －ＩＰ５及び（Ｃ）（ＯＥＧ2 ）2 －ＩＰ４の抗付着効果を、微分干渉コントラスト顕微鏡で評価した後、結晶占有面積を定量化した。コンフルエントになった細胞を、化合物と予め混合した１５０μｇ／ｃｍ2 のＣａＯｘで３０分間処理した後、洗浄、固定、イメージングを行った。（Ｄ）コンフルエントな細胞層に付着したＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 の有無による事前混合されたＣａＯｘの画像例（Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６０００、６３ｘオイル対物レンズ）。（Ｅ）ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 が細胞層に既に付着したＣａＯｘを除去する能力を評価するために、上記アッセイの改良版を実施した。ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞をＣａＯｘと３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄して結合していないＣａＯｘを除去し、さらにＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 又は培地コントロールと２時間インキュベートした。（Ｎ＝３，平均値＋ＳＤをＣａＯｘ ｃｔｒｌに正規化，Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較による一元的ＡＮＯＶＡ，****ｐ＜０．０００１，*** ｐ＜０．００１，**ｐ＜０．０１，* ｐ＜０．０５，ＣａＯｘコントロールとの比較）
【図11】図１１は、ＣａＯｘによる腎上皮細胞の損傷がＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 によって抑制されることを示す。（Ａ）ＲＮＡシークエンスで得られた相対的な遺伝子発現レベルのヒートマップと階層的なクラスタリング（ＣａＯｘとＣａＯｘ－ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 との間で差次的に発現する遺伝子 ｐ＜０．０１、ｌｏｇ2 ｒａｔｉｏ＝０．５、有意な特徴の数２０００）。（Ｂ）培地群に対するＣａＯｘの遺伝子発現レベルと、ＣａＯｘ－ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 群の対応する値の遺伝子セット濃縮解析。中程度の対照群と比較して、ＣａＯｘ群で差次的に上方制御又は下方制御された遺伝子の上位遺伝子オントロジー用語及び対応する正規化濃縮スコアがプロットされる（上位１０の上方制御遺伝子オントロジー用語、すべてのＦＤＲ≦０．０５及び下方制御遺伝子オントロジー用語ＦＤＲ≦０．０５を示す）。ＣａＯｘ－ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 群で差次的に発現する遺伝子の対応する値が示される（ＦＤＲ≦０．０５は濃い青で示され、ＦＤＲ＞０．０５は水色で示される）。（Ｃ）各治療群における炎症・免疫反応、細胞シグナル、ＥＣＭ産生に関わる遺伝子の発現量。（Ｄ）ＣａＯｘのみを処理した細胞と比較して、ＲＰＴＥＣ細胞を処理する前にＣａＯｘ－ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 とＣａＯｘをプレインキュベートすることによる死細胞数の用量依存的な減少を、ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｓｔａｉｎにより評価した（平均値＋ＳＤをＣａＯｘ ｃｔｒｌに正規化，Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較による一元的ＡＮＯＶＡ，****ｐ＜０．０００１，**ｐ＜０．０１）。（Ｅ）ＣａＯｘ沈着（黒いスポット）を示す明視野画像の例と、未処理、ＣａＯｘのみ、又はＣａＯｘ＋１０μＭ ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 処理を受けた細胞の細胞死を示す赤色蛍光画像の例（Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６０００、１０ｘ対物レンズ、スケールバー：１００μｍ）（すべての実験でＮ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【0021】
［用語と定義］
本明細書の文脈における用語「Ｃ1 ～Ｃ4 のアルキル」は、１、２、３又は４個の炭素原子を有する飽和直鎖状又は分岐状の炭化水素を示す。特定の実施形態では、１個の炭素－炭素結合が不飽和であってもよく、１個のＣＨ2 部分が酸素（エーテルブリッジ）又は窒素（ＮＨ、又はＲがメチル、エチル、又はｎ－又はｉｓｏ－プロピルであるＮＲ；アミノブリッジ）と交換されてもよい。Ｃ1 ～Ｃ4 のアルキルの非限定的な例としては、メチル、エチル、プロピル、プロプ－２－エニル、ｎ－ブチル、２－メチルプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル、ブト－３－エニル、プロプ－２－イニル及びブト－３－イニルが挙げられる。特定の実施形態では、Ｃ1 ～Ｃ4 のアルキルは、メチル、エチル、プロピル又はブチル部分である。
本明細書の文脈における用語「Ｃ1 ～Ｃ4 のアルキル」は、１、２、３又は４個の炭素原子を有する飽和直鎖状又は分岐状の炭化水素を示す。特定の実施形態では、１個の炭素－炭素結合が不飽和であってもよく、１個のＣＨ2 部分が酸素（エーテルブリッジ）又は窒素（ＮＨ、又はＲがメチル、エチル、又はｎ－又はｉｓｏ－プロピルであるＮＲ；アミノブリッジ）と交換されてもよい。Ｃ1 ～Ｃ4 のアルキルの非限定的な例としては、メチル、エチル、プロピル、プロプ－２－エニル、ｎ－ブチル、２－メチルプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル、ブト－３－エニル、プロプ－２－イニル及びブト－３－イニルが挙げられる。特定の実施形態では、Ｃ1 ～Ｃ4 のアルキルは、メチル、エチル、プロピル又はブチル部分である。
【0022】
本明細書の文脈における用語「Ｃ1 ～Ｃ6 のアルキル」は、１、２、３、４、５又は６個の炭素原子を有する飽和直鎖状又は分岐状の炭化水素を示す。１個の炭素－炭素結合が不飽和であってもよく、１個のＣＨ2 部分が酸素（エーテルブリッジ）又は窒素（ＮＨ、又はＲがメチル、エチル、又はｎ－又はｉｓｏ－プロピルであるＮＲ；アミノブリッジ）と交換されてもよい。Ｃ1 ～Ｃ6 のアルキルの非限定的な例としては、上記Ｃ1 ～Ｃ4 のアルキルで示した例に加え、３－メチルブト－２－エニル、２－メチルブト－３－エニル、３－メチルブト－３－エニル、ｎ－ペンチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、１，１－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、ペント－４－イニル、３－メチル－２－ペンチル及び４－メチル－２－ペンチルが挙げられる。特定の実施形態では、Ｃ5 アルキルは、ペンチル又はシクロペンチル部分であり、Ｃ6 アルキルは、ヘキシル又はシクロヘキシル部分である。
【0023】
本明細書において狭義で使用される場合の「非置換Ｃn アルキル」は、分子の部分間のブリッジとして使用される場合は－Ｃn Ｈ2n－部分、又は末端部分という文脈で使用される場合は－Ｃn Ｈ2n+1部分に関する。環状構造又は１個以上の（非芳香族）二重結合が存在する場合は、Ｈ原子が少なくなり得る。
【0024】
本明細書の文脈における用語「非置換Ｃn アルキル及び置換Ｃn アルキル」という用語は、環状構造、例えば、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン又はシクロヘキサン部分を含むか又はそれに連結される直鎖状アルキルを含み、注釈又は言及の文脈に応じて置換されていないか又は置換されていて、直鎖状アルキルの置換基を有する。炭素の総数と、必要に応じて、直鎖状又は環状構造内のＮ、Ｏ又はその他のヘテロ原子の合計はｎ個となる。
【0025】
化学式の文脈で使用される場合、以下の略語が使用される。
Ｍｅ；メチル ＣＨ3
Ｅｔ；エチル －ＣＨ2 ＣＨ3
Ｐｒｏｐ；プロピル －（ＣＨ2 ）2 ＣＨ3 （ｎ－プロピル；ｎ－ｐｒ）又は－ＣＨ（ＣＨ3 ）2 （ｉｓｏ－ｐｒｏｐｙｌ；ｉ－ｐｒ）
ｂｕｔ；ブチル －Ｃ4 Ｈ9 、－（ＣＨ2 ）3 ＣＨ3 、－ＣＨＣＨ3 ＣＨ2 ＣＨ3 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ3 ）2 又は－Ｃ（ＣＨ3 ）3
Ｍｅ；メチル ＣＨ3
Ｅｔ；エチル －ＣＨ2 ＣＨ3
Ｐｒｏｐ；プロピル －（ＣＨ2 ）2 ＣＨ3 （ｎ－プロピル；ｎ－ｐｒ）又は－ＣＨ（ＣＨ3 ）2 （ｉｓｏ－ｐｒｏｐｙｌ；ｉ－ｐｒ）
ｂｕｔ；ブチル －Ｃ4 Ｈ9 、－（ＣＨ2 ）3 ＣＨ3 、－ＣＨＣＨ3 ＣＨ2 ＣＨ3 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ3 ）2 又は－Ｃ（ＣＨ3 ）3
【0026】
本明細書の文脈における用語「Ｃ4 ～Ｃ7 のシクロアルキル」は、４、５、６又は７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に関する。特定の実施形態では、１個の炭素－炭素結合が不飽和であってもよく、及び／又は１個のＣＨ2 部分が酸素（エーテルブリッジ）又は窒素（ＮＨ、又はＲがメチル、エチル、又はｎ－又はｉｓｏ－プロピルであるＮＲ；アミノブリッジ）と交換されてもよい。Ｃ4 ～Ｃ7 のシクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロパニル（-Ｃ4 Ｈ7 ）、シクロペンテニル（Ｃ5 Ｈ9 ）及びシクロヘキセニル（Ｃ6 Ｈ11）部分が挙げられる。特定の実施形態において、シクロアルキルは、１個のＣ1 ～Ｃ4 の非置換アルキル部分によって置換されている。特定の実施形態において、シクロアルキルは、１個以上のＣ1 ～Ｃ4 の非置換アルキル部分によって置換されている。
【0027】
広義の用語「置換アルキル」とは、上記で定義された広義のアルキルであって、炭素又は水素ではない原子、特にＮ、Ｏ、Ｆ、Ｂ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択される原子に共有結合しており、場合によってはこのグループの１個又は複数個の他の原子、水素、又は不飽和若しくは飽和の炭化水素（広義のアルキル又はアリール）に結合していてもよい。狭義では、置換アルキルとは、アミンＮＨ2 、アルキルアミンＮＨＲ、イミドＮＨ、アルキルイミドＮＲ、アミノ（カルボキシアルキル）ＮＨＣＯＲ又はＮＲＣＯＲ、ヒドロキシルＯＨ、オキシアルキルＯＲ、オキシ（カルボキシアルキル）ＯＣＯＲ、カルボニルＯ及びそのケタール又はアセタール（ＯＲ）2 、ニトリルＣＮ、イソニトリルＮＣ、シアネートＣＮＯ、イソシアネートＮＣＯ、チオシアネートＣＮＳ、イソチオシアネートＮＣＳ、フッ化物Ｆ、塩化物Ｃｌ、臭化物Ｂｒ、ヨウ化物Ｉ、ホスホネートＰＯ3 Ｈ2 、ＰＯ3 Ｒ2 、ホスフェートＯＰＯ3 Ｈ2 、ＯＰＯ3Ｒ2 、スルフヒドリルＳＨ、スルフアルキルＳＲ、スルホキシドＳＯＲ、スルホニルＳＯ2 Ｒ、スルファニルアミドＳＯ2 ＮＨＲ、スルフェートＳＯ3 Ｈ及びスルフェートエステルＳＯ3 Ｒから選択される基で１個又は複数個の炭素原子が置換された広義の上記定義のアルキルを示す。ここで、この段落で使用されるＲの置換基は、本明細書でＲに割り当てられている他の用途とは異なり、広義にはそれ自体が非置換又は置換されたＣ1 ～Ｃ12アルキルであり、狭義には、特に指定のない限り、Ｒはメチル、エチル又はプロピルである。
【0028】
アミノ置換アルキル又はヒドロキシル置換アルキルという用語は、１個又は複数個のアミン又はヒドロキシル基ＮＨ2 、ＮＨＲ、ＮＲ2 又はＯＨによって修飾された上記定義によるアルキルを示す。この段落で使用されるＲ置換は、本明細書でＲに割り当てられている他の用途とは異なり、広義にはそれ自体が非置換又は置換されたＣ1 ～Ｃ12アルキルであり、狭義には、特に指定のない限り、Ｒはメチル、エチル又はプロピルである。複数個の炭素を有するアルキルは、複数個のアミン又はヒドロキシルを含み得る。特に明記しない限り、用語「置換アルキル」は、アルキル鎖、末端メチル、又は水素への結合に加えて、各Ｃが多くても１個のアミン又はヒドロキシル基によってのみ置換されるアルキルを示す。
【0029】
カルボキシル置換アルキルという用語は、１個又は複数個のカルボキシル基ＣＯＯＨ、又はその誘導体、特にカルボキシルアミドＣＯＮＨ2 、ＣＯＮＨＲ及びＣＯＮＲ2 、又はカルボン酸エステルＣＯＯＲによって修飾される上記の定義によるアルキルを示し、Ｒは前段落で述べたような意味を有し、本明細書でＲに割り当てられている他の意味とは異なる。
【0030】
アミノ置換アルキルの非限定的な例としては、末端部分として、－ＣＨ2 ＮＨ2 、－ＣＨ2 ＮＨＭｅ、－ＣＨ2 ＮＨＥｔ、－ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨ2 、－ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨＭｅ，－ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨＥｔ、－（ＣＨ2 ）3 ＮＨ2 、－（ＣＨ2 ）3 ＮＨＭｅ，－（ＣＨ2 ）3 ＮＨＥｔ，－ＣＨ2 ＣＨ（ＮＨ2 ）ＣＨ3 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＮＨＭｅ）ＣＨ3 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＮＨＥｔ）ＣＨ3 、－（ＣＨ2 ）3 ＣＨ2 ＮＨ2 、－（ＣＨ2 ）3 ＣＨ2 ＮＨＭｅ、－（ＣＨ2 ）3 ＣＨ2 ＮＨＥｔ、－ＣＨ（ＣＨ2 ＮＨ2 ）ＣＨ2 ＣＨ3 、－ＣＨ（ＣＨ2 ＮＨＭｅ）ＣＨ2 ＣＨ3 、－ＣＨ（ＣＨ2 ＮＨＥｔ）ＣＨ2 ＣＨ3 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＮＨ2 ）ＣＨ3 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＮＨＭｅ）ＣＨ3 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＮＨＥｔ）ＣＨ3 、－ＣＨ（ＮＨ2 ）（ＣＨ2 ）2 ＮＨ2 、－ＣＨ（ＮＨＭｅ）（ＣＨ2 ）2 ＮＨＭｅ、－ＣＨ（ＮＨＥｔ）（ＣＨ2 ）2 ＮＨＥｔ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＮＨ2 ）ＣＨ2 ＮＨ2 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＮＨＭｅ）ＣＨ2 ＮＨＭｅ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＮＨＥｔ）ＣＨ2 ＮＨＥｔ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＮＨ2 ）（ＣＨ2 ）2 ＮＨ2 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＮＨＭｅ）（ＣＨ2 ）2 ＮＨＭｅ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＮＨＥｔ）（ＣＨ2 ）2 ＮＨＥｔ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＮＨ2 ）2 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＮＨＭｅ）2 、及び－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＮＨＥｔ）2 が挙げられ、２個の他の部分を架橋するアミノ置換アルキルとして、－ＣＨ2 ＣＨＮＨ2 －、－ＣＨ2 ＣＨＮＨＭｅ－、－ＣＨ2 ＣＨＮＨＥｔ－が挙げられる。
ヒドロキシ置換アルキルの非限定的な例としては、末端部分として、－ＣＨ2 ＯＨ、－（ＣＨ2 ）2 ＯＨ、－（ＣＨ2 ）3 ＯＨ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3 、－（ＣＨ2 ）4 ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨ2 ＣＨ3 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨ3 、－ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2 ）2 ＯＨ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2 ＯＨ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2 ）2 ＯＨ、及び－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）2 が挙げられ、２個の他の部分を架橋するヒドロキシル置換アルキルとして、－ＣＨＯＨ－、－ＣＨ2 ＣＨＯＨ－、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2 －、－（ＣＨ2 ）2 ＣＨＯＨＣＨ2 －、－ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨ2 ＣＨ2 －、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨ2 －、－ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2 ＣＨＯＨ－、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2 ＯＨ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2 ）2 ＯＨ、及び－ＣＨ2 ＣＨＣＨ2 ＯＨＣＨＯＨ－が挙げられる。
ヒドロキシ置換アルキルの非限定的な例としては、末端部分として、－ＣＨ2 ＯＨ、－（ＣＨ2 ）2 ＯＨ、－（ＣＨ2 ）3 ＯＨ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3 、－（ＣＨ2 ）4 ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨ2 ＣＨ3 、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨ3 、－ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2 ）2 ＯＨ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2 ＯＨ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2 ）2 ＯＨ、及び－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）2 が挙げられ、２個の他の部分を架橋するヒドロキシル置換アルキルとして、－ＣＨＯＨ－、－ＣＨ2 ＣＨＯＨ－、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2 －、－（ＣＨ2 ）2 ＣＨＯＨＣＨ2 －、－ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨ2 ＣＨ2 －、－ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨ2 －、－ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2 ＣＨＯＨ－、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2 ＯＨ、－ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2 ）2 ＯＨ、及び－ＣＨ2 ＣＨＣＨ2 ＯＨＣＨＯＨ－が挙げられる。
【0031】
「ハロゲン置換アルキル」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉから（独立して）選択される1個又は複数個のハロゲン原子によって修飾される上記の定義によるアルキルを示す。
【0032】
「フルオロ置換アルキル」という用語は、１個又は複数個のフッ化物基Ｆによって修飾される上記の定義によるアルキルを示す。フルオロ置換アルキルの非限定的な例としては、－ＣＨ2 Ｆ、－ＣＨＦ2 、－ＣＦ3 、－（ＣＨ2 ）2 Ｆ、－（ＣＨＦ）2 Ｈ、－（ＣＨＦ）2 Ｆ、－Ｃ2 Ｆ5 、－（ＣＨ2 ）3 Ｆ、－（ＣＨＦ）3 Ｈ、－（ＣＨＦ）2 Ｆ、－Ｃ3Ｆ7 、－（ＣＨ2 ）4 Ｆ、－（ＣＨＦ）4 Ｈ、－（ＣＨＦ）4 Ｆ、及び－Ｃ4 Ｆ9 が挙げられる。
【0033】
ヒドロキシル及びフルオロ置換アルキルの非限定的な例としては、－ＣＨＦＣＨ2 ＯＨ、－ＣＦ2 ＣＨ2 ＯＨ、－（ＣＨＦ）2 ＣＨ2 ＯＨ、－（ＣＦ2 ）2 ＣＨ2 ＯＨ、－（ＣＨＦ）3 ＣＨ2 ＯＨ、－（ＣＦ2 ）3 ＣＨ2 ＯＨ、－（ＣＨ2 ）3 ＯＨ、－ＣＦ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3 、－ＣＦ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＦ3 、－ＣＦ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨＦＣＨ3 、及び－ＣＦ（ＣＨ2 ＯＨ）ＣＨＦＣＦ3 が挙げられる。
【0034】
本明細書の文脈における用語「アリール」は、ヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ）を含み得る環状芳香族Ｃ5 ～Ｃ10炭化水素を示す。アリールの例としては、特に限定されないが、フェニル及びナフチル、並びに任意のヘテロアリールが含まれる。ヘテロアリールは、１個又は複数個の窒素、酸素、及び／又は硫黄原子を含むアリールである。ヘテロアリールの例としては、ピロール、チオフェン、フラン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、ピリジン、ピリミジン、チアジン、キノリン、ベンゾフラン、インドールが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の文脈におけるアリール又はヘテロアリールは、さらに、１個又は複数個のアルキル基によって置換され得る。
【0035】
本明細書では、「医薬組成物」という用語は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を、少なくとも１個の薬学的に許容される担体と組み合わせたものを示す。特定の実施形態において、本発明による医薬組成物は、局所的、非経口的又は注射による投与に適した形態で提供される。
【0036】
本明細書では、「薬学的に許容される担体」という用語は、当業者に公知の、溶媒、分散媒体、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬剤、薬剤安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香味料、色素、及びこれらの組み合わせが含まれる。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ＩＳＢＮ ０８５７１１０６２４ 参照。）
【0037】
本発明の第１の態様は、共通の中央リンカーＬによって連結された一般式（Ｉ）によって表されるシクロヘキサノールペンタキスエステル部分を２個以上含む化合物に関する。
ここで、Ｘは、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-又はＯＳＯ3 -から選択され、Ｌは、括弧内の式で特徴付けられるｎ個の個々の部分が付加される共通の中央リンカーであり、ｎは２～１０の整数である。
ここで、Ｘは、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-又はＯＳＯ3 -から選択され、Ｌは、括弧内の式で特徴付けられるｎ個の個々の部分が付加される共通の中央リンカーであり、ｎは２～１０の整数である。
【0038】
【化5】
【0039】
一般式（Ｉ）及び本明細書中の直線は、個々の環炭素原子の立体化学が定義されていないことを示すことを意味する。この式は、任意のジアステレオマーを包含することを意味する。
【0040】
特定の実施形態では、ｎは２～８の値である。特定の実施形態では、ｎは２の値である。特定の実施形態では、ｎは３の値である。特定の実施形態では、ｎは４の値である。特定の実施形態では、ｎは６の値である。特定の実施形態では、ｎは８の値である。
【0041】
特定の実施形態では、２、３及び４から選択される。
【0042】
特定の実施形態では、中央リンカーＬは、直鎖状又は分岐状のポリ（エチレングリコール）又はポリグリセロールを含む又はそれからなる。特定の実施形態では、中央リンカーＬは、直鎖状又は分岐状アルキルを含む又はそれからなる。
【0043】
特定の実施形態では、中央リンカーＬは、分子量が１０００ｇ／ｍｏｌ未満であり、特に、７００ｇ／ｍｏｌ未満であり、詳細には、５００ｇ／ｍｏｌ未満であり、より詳細には、４００ｇ／ｍｏｌ未満である。
【0044】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、上記で定義された中央リンカーＬ及び一般式（Ｉ）によって示された２個以上の部分からなる。
【0045】
特定の実施形態では、本発明の化合物において構成される任意の部分（Ｉ）の任意のＸは、互いに独立して、ＯＰＯ3
2-、ＯＰＳＯ2
2-又はＯＳＯ3
-から選択される。
【0046】
特定の実施形態では、本発明の化合物において構成される任意の特定の部分（Ｉ）のＸの全てが同じであり、ＯＰＯ3
2-、ＯＰＳＯ2
2-又はＯＳＯ3
-から選択される。
【0047】
特定の実施形態では、本発明の化合物において構成される全ての部分（Ｉ）のＸの全てがＯＰＯ3
2-である。
【0048】
特定の実施形態では、本発明の化合物において構成される全ての部分（Ｉ）のＸの全てがＯＰＳＯ2
2-である。
【0049】
特定の実施形態では、本発明の化合物において構成される全ての部分（Ｉ）のＸの全てがＯＳＯ3
-である。
【0050】
特定の実施形態では、中央リンカーＬは、分子量が１０００ｇ／ｍｏｌ未満、特に、７００ｇ／ｍｏｌ未満である直鎖状又は分岐状のポリ（エチレングリコール）又はポリグリセロールを含む又はそれからなる。
【0051】
特定の実施形態では、中央リンカーＬは、一般式（Ｉ）のシクロヘキサノールエステル部分を分離するポリグリセロール鎖又はポリ（エチレングリコール）鎖が結合している中央コアＡを含む。
【0052】
特定の実施形態では、中央コアＡは、存在する場合、置換又は非置換のＣ1 ～Ｃ4 のアルキル、置換又は非置換のＣ4 ～Ｃ7 のシクロアルキル、又は置換又は非置換の５員又は６員のアリールから選択することができる。
【0053】
連結部分は、一般的に、比較的低コストで合成しやすく、化合物中の２個以上のシクロヘキサノールペンタキシエステル部分の組み立てを容易にするように設計された、単純で代謝に適合したリンカーである。特定の実施形態では、連結部分は、水素以外の置換基、例えば、酸素、窒素、フッ素又は化合物の吸収、分布、代謝処理、排泄又は毒性の質を調整するために医薬化学の技術分野で知られている他の置換基から選択される１個以上の置換基で置換された炭化水素であってもよい。
【0054】
連結部分Ｌが、置換Ｃ1 ～Ｃ4 のアルキル、置換Ｃ4 ～Ｃ7 のシクロアルキル、又は置換５員又は６員のアリールであるか又はそれらを含む実施形態では、置換は、酸素を含む１個又は複数の機能（非限定的な例：－ＯＨ又は＝Ｏ）、窒素を含む１個又は複数の機能（非限定的な例：ＮＨ2 、ＮＨＲN 、ＮＲN
2、ＲN は非置換Ｃ1 ～Ｃ4 のアルキルから選択される）、１個又は複数のフッ素置換、又は酸素、窒素又はフッ素置換のいずれかの組み合わせである。
【0055】
一般式（Ｉ）で表される化合物の特定の実施形態では、連結部分Ｌはペプチドリンカーである。一般式（Ｉ）で表される部分は、タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖、特にシクロヘキサノエステル部分の化学的結合を容易にする側鎖を有するものに共有結合させることができる。好ましい結合機能を有するそのようなアミノ酸の例としては、非限定的な例として、セリン及びスレオニンが挙げられる。
【0056】
特定の実施形態では、一般式（Ｉ）で表されるシクロヘキサノールペンタキシエステル部分のいずれか１個は、独立して一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）から選択される。
ここで、各Ｘは、（独立して）上記の定義であり、Ｌは連結部分である。
ここで、各Ｘは、（独立して）上記の定義であり、Ｌは連結部分である。
【0057】
【化6】
【0058】
特定の実施形態では、化合物は一般式（ＩＩ）で表される。
ここで、各Ｘは、互いに独立して、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-、ＯＳＯ3 -又はＣＯ2 -とすることができる。Ｌは、上記で定義した共通の中央リンカー（本明細書では「連結部分」とも呼ばれる）である。
ここで、各Ｘは、互いに独立して、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-、ＯＳＯ3 -又はＣＯ2 -とすることができる。Ｌは、上記で定義した共通の中央リンカー（本明細書では「連結部分」とも呼ばれる）である。
【0059】
【化7】
【0060】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩｉ）、（ＩＩｉｉ）又は（ＩＩｉｉｉ）で表される。
ここで、各Ｘは、互いに独立して、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-、ＯＳＯ3 -又はＣＯ2 -とすることができ、Ｌは、上記で定義した共通の中央リンカー（本明細書では「連結部分」とも呼ばれる）である。
ここで、各Ｘは、互いに独立して、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-、ＯＳＯ3 -又はＣＯ2 -とすることができ、Ｌは、上記で定義した共通の中央リンカー（本明細書では「連結部分」とも呼ばれる）である。
【0061】
【化8】
【0062】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩ）、（ＩＩｉ）、（ＩＩｉｉ）又は（ＩＩｉｉｉ）で表される。
ここで、連結部分Ｌは、式－（Ｏ－ＣＨ2 －ＣＨ2 ）m －Ｏ－で表されるポリ（エチレングリコール）から選択され、ｍは、１～１２の値であり、特に、ｍは、２、３又は４から選択される。
ここで、連結部分Ｌは、式－（Ｏ－ＣＨ2 －ＣＨ2 ）m －Ｏ－で表されるポリ（エチレングリコール）から選択され、ｍは、１～１２の値であり、特に、ｍは、２、３又は４から選択される。
【0063】
特定の実施形態では、連結部分Ｌは、－（Ｏ－ＣＨ2 －ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2 ）m －Ｏ－で表されるポリグリセロールから選択され、ｍは、１～１２の値であり、特に、ｍは、２、３又は４から選択される。
【0064】
特定の実施形態では、一般式（Ｉ）で表される部分の全てが、一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）である。
【0065】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩ）、（ＩＩｉ）、（ＩＩｉｉ）又は（ＩＩｉｉｉ）で表され、各Ｘが、ＯＰＯ3
2-であり、連結部分Ｌが直鎖状のポリ（エチレングリコール）又はポリグリセロールである。
【0066】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩ）、（ＩＩｉ）、（ＩＩｉｉ）又は（ＩＩｉｉｉ）で表され、分子量が１０００ｇ／ｍｏｌ～１５００ｇ／ｍｏｌである。
【0067】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩ）、（ＩＩｉ）、（ＩＩｉｉ）又は（ＩＩｉｉｉ）で表され、各Ｘが、ＯＰＯ3
2-であり、連結部分Ｌが直鎖状のポリ（エチレングリコール）又はポリグリセロールであり、分子量が１０００ｇ／ｍｏｌ～１５００ｇ／ｍｏｌである。
【0068】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩｉｖ）、（ＩＩｖ）又は（ＩＩｖｉ）で表され、Ｌは、上記で定義した共通の中央リンカー（本明細書では「連結部分」とも呼ばれる）である。
【0069】
【化9】
【0070】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩｖｉｉ）、（ＩＩｖｉｉｉ）又は（ＩＩｉｘ）で表される。
【0071】
【化10】
【0072】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）又は（ＩＩｄ）で表される。
【0073】
【化11】
【0074】
【化12】
【0075】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩｅ）又は（ＩＩｆ）で表される。
【0076】
【化13】
【0077】
特定の実施形態では、化合物（ＩＩａ）（ＯＥＧ2 －（ＩＰ５* ）2 ）及び化合物（ＩＩｂ）（ＯＥＧ2 －（ＩＰ５）2 ）は、１２０４．０４ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。一実施形態では、化合物（ＩＩｃ）（ＰＯ１－１）及び化合物（ＩＩｅ）は、１２９８．１５ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。一実施形態では、化合物（ＩＩｄ）（ＯＥＧ8 －（ＩＰ５）2 ）及び化合物（ＩＩｆ）は、１４７４．３６ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【0078】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩｋ）、（ＩＩｍ）又は（ＩＩｎ）で表される。
【0079】
【化14】
【0080】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩｇ）、（ＩＩｈ）又は（ＩＩｊ）で表される。
ここで、ｋは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択される整数である。
ここで、ｋは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択される整数である。
【0081】
【化15】
【0082】
特定の実施形態では、本発明の化合物は一般式（ＩＩＩ）で表される。
ここで、各Ｘは、互いに独立して、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-又はＯＳＯ3 -から選択され、Ｌは、上記で定義した共通の中央リンカー（本明細書では「連結部分」とも呼ばれる）である。
ここで、各Ｘは、互いに独立して、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-又はＯＳＯ3 -から選択され、Ｌは、上記で定義した共通の中央リンカー（本明細書では「連結部分」とも呼ばれる）である。
【0083】
【化16】
【0084】
一般式（ＩＩＩ）で表される化合物の特定の実施形態では、連結部分Ｌが一般式（ＩＩＩａ）で表される。
ここで、ｏ、p及びｑは、互いに独立して、１～１２の値であり、ｏ、p及びｑの合計が３０以下である。
ここで、ｏ、p及びｑは、互いに独立して、１～１２の値であり、ｏ、p及びｑの合計が３０以下である。
【0085】
【化17】
【0086】
特定の実施形態では、Ａは、炭素原子（Ｃ）、ヒドロキシ－、アミノ－、ハロゲン－、又はカルボキシ－置換又は非置換のＣ4 ～Ｃ7 のシクロアルキル、又は、ヒドロキシ－、アミノ－、ハロゲン－、又はカルボキシ－置換又は非置換のアリールから選択される。特定の実施形態では、Ａは、炭素原子である。
【0087】
特定の実施形態では、Ｒは、水素原子及びＣ1 ～Ｃ3 非置換又は窒素、酸素及び／又はハロゲン置換のアルキルから選択される。特定の実施形態では、Ｒは、水素原子又は非置換アルキルである。
【0088】
一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩａ）で表され、ｏ、p及びｑは、互いに独立して、２～４の値である。
【0089】
一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩａ）で表され、ｏ、p及びｑの合計が１５以下である。
【0090】
一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩａ）で表され、ｏ、p及びｑは、互いに独立して、２～４の値であり、ｏ、p及びｑの合計が１５以下である。
【0091】
特定の実施形態では、Ｒは、水素原子及びＣ1 ～Ｃ3 非置換又は窒素、酸素及び／又はハロゲン置換のアルキルから選択される。特定の実施形態では、Ｒは、水素原子又は非置換アルキルである。
【0092】
一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、連結部分Ｌが一般式（ＩＩＩｂ）で表される。
ここで、ｏ、p及びｑは、互いに独立して、１～１２の値であり、ｏ、p及びｑの合計が３０以下である。
ここで、ｏ、p及びｑは、互いに独立して、１～１２の値であり、ｏ、p及びｑの合計が３０以下である。
【0093】
【化18】
【0094】
特定の実施形態では、Ａは、炭素原子（Ｃ）、ヒドロキシ－、アミノ－、ハロゲン－、又はカルボキシ－置換又は非置換のＣ4 ～Ｃ7 のシクロアルキル、又は、ヒドロキシ－、アミノ－、ハロゲン－、又はカルボキシ－置換又は非置換のアリールから選択される。特定の実施形態では、Ａは、炭素原子である。
【0095】
特定の実施形態では、Ｒは、水素原子及びＣ1 ～Ｃ3 非置換又は窒素、酸素及び／又はハロゲン置換のアルキルから選択される。特定の実施形態では、Ｒは、水素原子又は非置換アルキルである。
【0096】
一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩｂ）で表され、ｏ、p及びｑは、互いに独立して、２～４の値である。
【0097】
一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩｂ）で表され、ｏ、p及びｑの合計が１５以下である。
【0098】
一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩｂ）で表され、ｏ、p及びｑは、それぞれ独立して、２～４の値であり、ｏ、p及びｑの合計が１５以下である。
【0099】
一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表され、Ａが炭素原子である。一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表され、Ａが、置換又は非置換のＣ1 ～Ｃ4 アルキルから選択される。一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表され、Ａが、置換又は非置換のＣ4 ～Ｃ7 のシクロアルキルから選択される。一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表され、Ａが、置換又は非置換の５員又は６員のアリールから選択される。
【0100】
一般式（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、連結部分Ｌが一般式（ＩＩＩｃ）で表される。
ここで、ｕ、ｖ及びｗは、互いに独立して、１～１２の値であり、特に２～４の値であり、ｕ、ｖ及びｗの合計が３０以下であり、特に１２以下である。
ここで、ｕ、ｖ及びｗは、互いに独立して、１～１２の値であり、特に２～４の値であり、ｕ、ｖ及びｗの合計が３０以下であり、特に１２以下である。
【0101】
【化19】
【0102】
特定の実施形態では、Ｒは、水素原子及びＣ1 ～Ｃ3 非置換又は窒素、酸素及び／又はハロゲン置換のアルキルから選択され、特にＲは、水素原子又は非置換アルキルである。
【0103】
特定の実施形態では、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物は、１５００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【0104】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＩＩｄ）又は一般式（ＩＩＩｅ）で表される。
【0105】
【化20】
【0106】
特定の実施形態では、化合物（ＩＩＩｄ）（（ＯＥＧ）3 －（ＩＰ５）3 ）は、１９２２．２１ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の実施形態では、化合物（ＩＩＩｅ）（（ＯＥＧ4 ）3 －（ＩＰ５）3 ）は、２３１８．６９ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【0107】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＶ）で表される。
ここで、各Ｘは、互いに独立して、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-又はＯＳＯ3 -から選択され、Ｌは、上記で定義した共通の中央リンカー（本明細書では「連結部分」とも呼ばれる）である。
ここで、各Ｘは、互いに独立して、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-又はＯＳＯ3 -から選択され、Ｌは、上記で定義した共通の中央リンカー（本明細書では「連結部分」とも呼ばれる）である。
【0108】
【化21】
【0109】
一般式（ＩＶ）で表される化合物の特定の実施形態では、連結部分Ｌは、一般式（ＩＶａ）で表される。
ここで、ｏ、p、ｑ及びsは、互いに独立して、１～１２の値であり、ｏ、p、ｑ及びsの合計が４０以下である。
ここで、ｏ、p、ｑ及びsは、互いに独立して、１～１２の値であり、ｏ、p、ｑ及びsの合計が４０以下である。
【0110】
【化22】
【0111】
特定の実施形態では、Ａは、炭素原子（Ｃ）、ヒドロキシ－、アミノ－、ハロゲン－、又はカルボキシ－置換又は非置換のＣ4 ～Ｃ7 のシクロアルキル、又は、ヒドロキシ－、アミノ－、ハロゲン－、又はカルボキシ－置換又は非置換のアリールから選択される。特定の実施形態では、Ａは、炭素原子である。
【0112】
特定の実施形態では、ｏ、p、ｑ及びsは、互いに独立して、２～４の値である。特定の実施形態では、ｏ、p、ｑ及びsの合計が２０以下である。
【0113】
特定の実施形態では、ｏ、p、ｑ及びsは、互いに独立して、２～４の値であり、ｏ、p、ｑ及びsの合計が２０以下である。
【0114】
一般式（ＩＶ）で表される化合物の特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＶａ）であり、Ａは、置換又は非置換のＣ1 ～Ｃ4 アルキルから選択される。特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＶａ）であり、Ａが、置換又は非置換のＣ4 ～Ｃ7 のシクロアルキルから選択される。特定の実施形態では、Ｌが一般式（ＩＶａ）であり、Ａが、置換又は非置換の５員又は６員のアリールから選択される。
【0115】
一般式（ＩＶ）で表される化合物の特定の実施形態では、連結部分Ｌは、一般式（ＩＶｂ）で表される。
ここで、ｏ、p、ｑ及びsは、互いに独立して、１～１２の値であり、特に２～４の値であり、ｏ、p、ｑ及びsの合計が４０以下であり、特に２０以下である。
ここで、ｏ、p、ｑ及びsは、互いに独立して、１～１２の値であり、特に２～４の値であり、ｏ、p、ｑ及びsの合計が４０以下であり、特に２０以下である。
【0116】
【化23】
【0117】
一般式（ＩＶ）で表される化合物の特定の実施形態では、連結部分Ｌは、一般式（ＩＶｃ）で表される。
ここで、ｕ、ｖ、ｗ及びｙは、互いに独立して、１～１２の値であり、特に２～４の値であり、ｕ、ｖ、ｗ及びｙの合計が４０以下であり、特に１２以下である。
ここで、ｕ、ｖ、ｗ及びｙは、互いに独立して、１～１２の値であり、特に２～４の値であり、ｕ、ｖ、ｗ及びｙの合計が４０以下であり、特に１２以下である。
【0118】
【化24】
【0119】
特定の実施形態では、一般式（ＩＶ）で表される化合物は、２５００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【0120】
特定の実施形態では、化合物は、一般式（ＩＶｄ）又は一般式（ＩＶｅ）で表される。
【0121】
【化25】
【0122】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、ナトリウム塩として提供される。特定の実施形態では、本発明の化合物は、カリウム塩として提供される。特定の実施形態では、本発明の化合物は、マグネシウム塩として提供される。
【0123】
本発明はさらに、本発明の化合物の合成に有用な中間生成物、具体的には一般式（Ｖａ）、（Ｖｂ）又は（Ｖｃ）で表される化合物を包含する。
ここで、ＯＰＭＢは、Ｏ－(ビスパラメトキシベンジル)ホスフェート部分であり、ｋは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択される整数である。
ここで、ＯＰＭＢは、Ｏ－(ビスパラメトキシベンジル)ホスフェート部分であり、ｋは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択される整数である。
【0124】
【化26】
【0125】
本発明の合成に有用な別の化合物は、一般式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）又は（ＶＩｃ）で表される。
ここで、ｋは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択される整数である。
ここで、ｋは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択される整数である。
【0126】
【化27】
【0127】
特定の実施形態では、化合物（ＩＶｄ）（（ＯＥＧ）4 －（ＩＰ５）4 ）は、２５２０．２０ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の実施形態では、化合物（ＩＶｅ）（（ＯＥＧ4 ）4 －（ＩＰ５）4 ）は、３０４８．８４ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【0128】
本発明の別の態様は、医薬品としての使用に関するものである。
【0129】
本発明の第２の態様は、病理学的結晶化、特にカルシウム塩の病理学的結晶化、さらにはシュウ酸カルシウム塩及び／又はリン酸カルシウム塩の病理学的結晶化に関連する症状の治療又は予防に使用するための本発明の化合物に関するものである。
【0130】
広義において、本発明による化合物のそのような使用は、本発明の第１の態様に従って本明細書に記載した任意の化合物の使用を包含するが、さらに、共通の中央リンカーＬによって連結された一般式（Ｉ）で表される２個以上のシクロヘキサノールペンタキスエステル部分を含む、特にそれからなる化合物の構造的にわずかに広い化学空間を包含する。
ここで、Ｘは、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-又はＯＳＯ3 -であり、ｎは２～１０の整数であり、Ｌは、直鎖状又は分岐状のアルキルを含み又はそれからなる連結部分であって、任意で酸素、窒素、（フッ素）によって置換され、特に連結部分は、分子量が１０００ｇ／ｍｏｌ未満であり、特に、７００ｇ／ｍｏｌ未満であり、詳細には、５００ｇ／ｍｏｌ未満であり、より詳細には、４００ｇ／ｍｏｌ未満である。
ここで、Ｘは、ＯＰＯ3 2-、ＯＰＳＯ2 2-又はＯＳＯ3 -であり、ｎは２～１０の整数であり、Ｌは、直鎖状又は分岐状のアルキルを含み又はそれからなる連結部分であって、任意で酸素、窒素、（フッ素）によって置換され、特に連結部分は、分子量が１０００ｇ／ｍｏｌ未満であり、特に、７００ｇ／ｍｏｌ未満であり、詳細には、５００ｇ／ｍｏｌ未満であり、より詳細には、４００ｇ／ｍｏｌ未満である。
【0131】
【化28】
【0132】
特定の実施形態では、病理的結晶化に関連する症状の治療又は予防に使用するための化合物は、一般式（Ｉ）による２、３、４、６又は８個の部分を含む。特定の実施形態では、２、３又は４個の部分が分子内に含まれる。
【0133】
特定の実施形態では、本発明の病理学的結晶化に関連する症状の治療又は予防に使用するための化合物は、一般式（ＶＩＩ）で表される。
ここで、ｋは、１～２０、特に１～１０、より詳細には１、２、３、４、５及び６から選択される整数である。
ここで、ｋは、１～２０、特に１～１０、より詳細には１、２、３、４、５及び６から選択される整数である。
【0134】
【化29】
【0135】
本発明の化合物が特に有用である患者における病理学的なシュウ酸カルシウム又はリン酸カルシウム結晶化による病理学的カルシウム結晶化に関連する症状としては、腎石灰化症、腎結石症、皮膚石灰化症、腎結石、心血管死亡率（特に慢性腎臓病患者の場合）、慢性腎臓病の進行、腎移植グラフトの失敗などが挙げられる。病理学的結晶化は、慢性腎臓病患者の罹患率と関連することが示されており、特に、その症状が、原発性及び続発性高シュウ酸尿症、デント病、バーター症候群、遠位尿細管性アシドーシス、神経因性膀胱、常染色体優勢多発性嚢胞腎疾患、シュウ酸カルシウム腎結石形成、ストルバイト結石及び腎石灰化である。したがって、本発明の化合物は、一般的に慢性腎臓病患者に適応される。
【0136】
特に高い活性を示す本発明の一実施形態は、上記の適応症に対して、同様のＣａＯｘ阻害効果（図２）を有する新規の２価のＩＰ５化合物（ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 、ＯＥＧ8 －（ＩＰ５）2 、ＯＥＧ2 －（ＩＰ５）2 ）を使用することである。本発明者らは以前、イノシトールヘキサリン酸（ＩＰ６）類似体に基づいた一連の小分子を開発した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／００４０８８、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０８０６５７）。この小分子は、ヒトの尿中のＣａＯｘ結晶の核生成と成長を減少させることができ、薬物動態（ＰＫ）特性が改善されている。さらに、それらの化合物は、ＣａＯｘ結晶の腎上皮細胞への付着を妨げ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａＯｘ処理で細胞保護効果を示すことが明らかにされている。これらの初期のＩＰ６類似体は、生体内で達成可能な濃度範囲でＣａＯｘ結晶化を完全に阻害することができなかったが、本発明者らは驚くべきことに、ＣａＯｘ結晶化を阻害する効力がＩＰ５部分の組み合わせに大きく依存することを発見した。そこで、本発明者らは、オリゴ（エチレングリコール）リンカー（ＯＥＧ）を用いて２個のイノシトールペンタリン酸（ＩＰ５）分子を連結することで、分子の総負電荷量を増加させた新規多価ＩＰ５化合物を開発した。以前に開発された最も強力な化合物であるＩＰ５－ｍｏｎｏ－ＰＥＧ２（ＯＥＧ2 －ＩＰ５）と比較して、トリス（エチレングリコール）化合物ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 で連結されたｂｉｓ－ＩＰ５は、ＣａＯｘ結晶化をコントロールの５０％以下に抑制する効力が２５００倍に増加した（図１）。この結論は、ヒトの尿のＣａＯｘ結晶化傾向を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏの分析結果から導き出されたものである。
【0137】
化合物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、局所、静脈内、又は特に皮下投与のために製剤化されてもよい。任意に、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。
【0138】
本発明の別の態様によれば、上記の病理学的カルシウム結晶化に関連する症状のいずれかを治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象者に上記のいずれかの一般式で規定される化合物を投与することを含む方法が提供される。
【0139】
当業者は、本明細書に具体的に記載されている任意の化合物が、その薬学的に許容される塩として存在することを認識している。薬学的に許容される塩は、イオン化した化合物及び反対に帯電した対イオンを含む。薬学的に許容されるカチオン性塩の形態の非限定的な例としては、アルミニウム、ベンザチン、エチレンジアミン、リジン、マグネシウム、メグルミン、カリウム、プロカイン、ナトリウム、トロメタミン及び亜鉛が挙げられる。
【0140】
医薬品の組成と投与
本発明の別の態様は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関するものである。さらなる実施形態では、組成物は、本明細書に記載されているような、少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
本発明の別の態様は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関するものである。さらなる実施形態では、組成物は、本明細書に記載されているような、少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
【0141】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、典型的には、薬物の容易に制御可能な投与量を提供し、患者に簡潔で容易な取り扱い可能な製品を与えるために、医薬品の投与形態に配合される。
【0142】
本発明の医薬組成物は、経口投与、非経口投与、又は直腸投与のために製剤化することができる。また、本発明の医薬組成物は、固体形態（カプセル、錠剤、丸薬、顆粒、粉末又は坐薬を含むがこれらに限定されない）、又は液体形態（溶液、懸濁液又は乳濁液を含むがこれらに限定されない）で構成することができる。
【0143】
本発明の化合物の投与方法は、特定の薬剤の薬力学的特性及びその投与様式と投与経路；投与対象者の種、年齢、性別、健康状態、症状、体重；症状の性質と程度；同時治療の種類；治療の頻度；投与経路、患者の腎機能及び肝機能、求める効能等の既知の要因によって変化する。特定の実施形態では、本発明の化合物は、１日１回の投与でもよいし、１日の総投与量を１日２回、３回又は４回に分けて投与してもよい。
【0144】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物又は組み合わせは、約５０ｋｇ～７０ｋｇの対象者に対して、約１ｍｇ～１０００ｍｇの有効成分（複数可）の単位投与量とすることができる。化合物、医薬組成物、又はそれらの組み合わせの治療上有効な投与量は、対象者の種、体重、年齢、及び個々の状態、治療される障害又は疾患又はその重症度に依存する。通常の技術を有する医師、臨床医又は獣医師であれば、障害や疾患の予防、治療、進行の抑制に必要な各有効成分の有効量を容易に決定することができる。
【0145】
本発明の医薬組成物は、滅菌等の従来の製薬処理を行うことができ、及び／又は、従来の不活性な希釈剤、潤滑剤、又は緩衝剤、並びに、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等のアジュバントを含むことができる。これらは、標準的なプロセス、例えば、従来の混合、造粒、溶解又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物を調製するための多くのそのような手順及び方法は、当技術分野では公知である（例えば、Ｌ． Ｌａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ４ｔｈ Ｅｄ， ２０１３ （ＩＳＢＮ ８１２３９２２８９２）参照）。
【0146】
本明細書では、単一の分離可能な特徴のための代替案が「実施形態」としてレイアウトされているが、そのような代替案は自由に組み合わせて、本明細書に開示されている本発明の個別の実施形態を形成することができる。
【0147】
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0148】
実施例１：ＩＩｃ（ＯＥＧ
4
－（ＩＰ５）
2
）の合成
工程１：
試薬：ＤＭＦ、水素化ナトリウム、ｐ－メトキシベンジルクロリド。
ミオイノシトール－１，３，５－オルトホルメートを窒素雰囲気下の乾燥ＤＭＦに溶解し、０℃～５℃に冷却した後、水素化ナトリウム（２．２当量）を少しずつ加える。室温で１時間撹拌した後、ｐ－メトキシベンジルクロリド（２．３当量）を滴下して加える。混合物を室温で１２時間撹拌した後、水を加え、酢酸エチルで抽出する。真空下で溶媒を除去し、残渣はジエチルエーテルで結晶化した。収率７０％。
工程１：
試薬：ＤＭＦ、水素化ナトリウム、ｐ－メトキシベンジルクロリド。
ミオイノシトール－１，３，５－オルトホルメートを窒素雰囲気下の乾燥ＤＭＦに溶解し、０℃～５℃に冷却した後、水素化ナトリウム（２．２当量）を少しずつ加える。室温で１時間撹拌した後、ｐ－メトキシベンジルクロリド（２．３当量）を滴下して加える。混合物を室温で１２時間撹拌した後、水を加え、酢酸エチルで抽出する。真空下で溶媒を除去し、残渣はジエチルエーテルで結晶化した。収率７０％。
【0149】
工程２：
試薬：メタノール、２Ｎ塩酸。
工程１の生成物を１０ｖｏｌのメタノールに溶解し、１ｖｏｌの２Ｎ塩酸を加え、５０℃で３時間加熱する。冷却後、混合物を水酸化アンモニウム３０％で中和し、室温で一晩放置する。形成された固体をろ過し、水で洗浄し、乾燥させる。ジエチルエーテルで結晶化させると、化合物２が白っぽい固体として得られる。収率８０％。
試薬：メタノール、２Ｎ塩酸。
工程１の生成物を１０ｖｏｌのメタノールに溶解し、１ｖｏｌの２Ｎ塩酸を加え、５０℃で３時間加熱する。冷却後、混合物を水酸化アンモニウム３０％で中和し、室温で一晩放置する。形成された固体をろ過し、水で洗浄し、乾燥させる。ジエチルエーテルで結晶化させると、化合物２が白っぽい固体として得られる。収率８０％。
【0150】
工程３：
試薬：ＤＭＦ、水素化ナトリウム、ｐ－メトキシベンジルクロライド。
工程２の生成物を窒素雰囲気下の乾燥ＤＭＦに溶解し、０℃～５℃で冷却した後、水素化ナトリウム（２当量）を少しずつ加える。室温で１時間後、混合物を０℃～５℃で冷却し、ｐ－メトキシベンジルクロリド（２当量）を加える。室温で１２時間後、混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出する。残渣をヘキサン／酢酸エチル（６／４）で溶出するカラムクロマトグラフィーで精製し、ジエチルエーテルで結晶化させる。収率３５％。
試薬：ＤＭＦ、水素化ナトリウム、ｐ－メトキシベンジルクロライド。
工程２の生成物を窒素雰囲気下の乾燥ＤＭＦに溶解し、０℃～５℃で冷却した後、水素化ナトリウム（２当量）を少しずつ加える。室温で１時間後、混合物を０℃～５℃で冷却し、ｐ－メトキシベンジルクロリド（２当量）を加える。室温で１２時間後、混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出する。残渣をヘキサン／酢酸エチル（６／４）で溶出するカラムクロマトグラフィーで精製し、ジエチルエーテルで結晶化させる。収率３５％。
【0151】
工程４：
試薬：ジクロロメタン、ｐ－トルエンスルホニルクロリド、トリエチルアミン。
テトラエチレングリコールを乾燥ジクロロメタンに溶解し、トリエチルアミン（３当量）を加え、次にｐ－トルエンスルホニルクロリド（２．５当量）を加える。室温で１２時間撹拌した後、真空下で溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル／ヘキサン（７／３）で溶出するカラムクロマトグラフィーで精製する。収率８０％。
試薬：ジクロロメタン、ｐ－トルエンスルホニルクロリド、トリエチルアミン。
テトラエチレングリコールを乾燥ジクロロメタンに溶解し、トリエチルアミン（３当量）を加え、次にｐ－トルエンスルホニルクロリド（２．５当量）を加える。室温で１２時間撹拌した後、真空下で溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル／ヘキサン（７／３）で溶出するカラムクロマトグラフィーで精製する。収率８０％。
【0152】
工程５：
試薬：ＤＭＦ、水素化ナトリウム、ビス(ｐ－トルエンスルホン酸)トリエチレングリコール（工程４）
工程３の生成物を窒素雰囲気下の乾燥ＤＭＦに溶解し、０℃～５℃に冷却した後、水素化ナトリウム（１．１当量）を少しずつ加える。室温で１時間撹拌した後、混合物を再び０℃～５℃に冷却し、ＤＭＦ（３ｖｏｌ）中の化合物４（０．５当量）の溶液を加える。室温で１２時間撹拌した後、混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出する。溶媒を除去した後、混合物をヘキサン／酢酸エチルで溶出するクロマトグラフィーで精製する。収率４０％。
試薬：ＤＭＦ、水素化ナトリウム、ビス(ｐ－トルエンスルホン酸)トリエチレングリコール（工程４）
工程３の生成物を窒素雰囲気下の乾燥ＤＭＦに溶解し、０℃～５℃に冷却した後、水素化ナトリウム（１．１当量）を少しずつ加える。室温で１時間撹拌した後、混合物を再び０℃～５℃に冷却し、ＤＭＦ（３ｖｏｌ）中の化合物４（０．５当量）の溶液を加える。室温で１２時間撹拌した後、混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出する。溶媒を除去した後、混合物をヘキサン／酢酸エチルで溶出するクロマトグラフィーで精製する。収率４０％。
【0153】
工程６：
試薬：ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸。未精製。
工程５の生成物をジクロロメタン（１０ｖｏｌ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２ｖｏｌ）を加える。室温で２時間撹拌した後、真空下で溶媒を除去し、残渣をさらに精製することなく次の工程で使用する。定量的収率。
試薬：ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸。未精製。
工程５の生成物をジクロロメタン（１０ｖｏｌ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２ｖｏｌ）を加える。室温で２時間撹拌した後、真空下で溶媒を除去し、残渣をさらに精製することなく次の工程で使用する。定量的収率。
【0154】
工程７：
試薬：ＤＭＦ、５－メチルテトラゾール、ジベンジルオキシ－ジイソプロピルホスホロアミド、過酸化水素。
工程６の生成物を窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１０ｖｏｌ）に溶解し、５－メチルテトラゾール（９当量）を加え、－１０℃に冷却した後、ジベンジルオキシ－ジイソプロピルホスホロアミド（６当量）を滴下して加える。室温で１２時間撹拌した後、混合物を０℃～５℃に冷却し、過酸化水素３０％（９当量）を滴下して加える。室温で１時間撹拌した後、水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出する。溶媒を除去した後、残渣をクロロホルム／メタノール（９６／４）で溶出するカラムクロマトグラフィーで精製する。収率４０％。
試薬：ＤＭＦ、５－メチルテトラゾール、ジベンジルオキシ－ジイソプロピルホスホロアミド、過酸化水素。
工程６の生成物を窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１０ｖｏｌ）に溶解し、５－メチルテトラゾール（９当量）を加え、－１０℃に冷却した後、ジベンジルオキシ－ジイソプロピルホスホロアミド（６当量）を滴下して加える。室温で１２時間撹拌した後、混合物を０℃～５℃に冷却し、過酸化水素３０％（９当量）を滴下して加える。室温で１時間撹拌した後、水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出する。溶媒を除去した後、残渣をクロロホルム／メタノール（９６／４）で溶出するカラムクロマトグラフィーで精製する。収率４０％。
【0155】
工程８：
試薬：水素、Ｐｄ／Ｃ。マグネシウムエトキシドによるマグネシウム塩の形成。
工程７の生成物をメタノール（１５ｖｏｌ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ １０％を加えて、室温、常圧で２４時間かけて水素化する。触媒をろ過した後、減圧下で溶媒を除去すると、酸としての化合物８が得られる。定量的収率。マグネシウム塩の形成は、化合物８の水溶液にマグネシウムエトキシドの水溶液を加えた後、真空下で溶媒を蒸留することにより行われる。
試薬：水素、Ｐｄ／Ｃ。マグネシウムエトキシドによるマグネシウム塩の形成。
工程７の生成物をメタノール（１５ｖｏｌ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ １０％を加えて、室温、常圧で２４時間かけて水素化する。触媒をろ過した後、減圧下で溶媒を除去すると、酸としての化合物８が得られる。定量的収率。マグネシウム塩の形成は、化合物８の水溶液にマグネシウムエトキシドの水溶液を加えた後、真空下で溶媒を蒸留することにより行われる。
【0156】
実施例２：（ＯＥＧ
4
）
4
－（ＩＰ５）
4
の合成
ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 の合成（実施例１；図４）で記載したように、ミオイノシトール－１，３，５－オルトホルメートから出発して、３段階で化合物５（ＰＭＢ＝ｐ－メトキシベンジル；図７）を調製した。
ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 の合成（実施例１；図４）で記載したように、ミオイノシトール－１，３，５－オルトホルメートから出発して、３段階で化合物５（ＰＭＢ＝ｐ－メトキシベンジル；図７）を調製した。
【0157】
工程Ａの試薬（図７）：Ｐ－トルエンスルホニルクロリド；ジクロロメタン、トリエチルアミン。カラムクロマトグラフィー。収率８０％。
【0158】
工程Ｂの試薬（図７）：トリメチロールプロパン、ＤＭＦ、水素化ナトリウム。カラムクロマトグラフィー。収率４５％。
【0159】
工程Ｃの試薬（図７）：メタノール、水素、Ｐｄ／Ｃ。収率８０％。
【0160】
工程Ｄの試薬（図７）：Ｐ－トルエンスルホニルクロリド、ジクロロメタン、トリエチルアミン。カラムクロマトグラフィー。収率７０％。
【0161】
【0162】
工程Ｆの試薬（図７）：ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸。定量的収率。
【0163】
工程Ｇの試薬（図７）：ＤＭＦ、ジベンジル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト、５－メチルテトラゾール。カラムクロマトグラフィー。収率３０％。
【0164】
工程Ｈの試薬（図７）：メタノール、水素、Ｐｄ／Ｃ。収率９０％。その後、ナトリウム塩の形成、定量的収率。
【0165】
実施例３：ＣａＯｘ結晶化の阻害
シュウ酸カルシウム（ＣａＯｘ）結晶化を阻害する化合物の有効性を比較するために、尿中での簡単なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。すなわち、ヒトの尿（ｐＨ ６．２）を化合物と混合した後、ＣａＯｘ結晶化を誘発する１ｍＭシュウ酸ナトリウムを添加した。室温で７時間放置した後、結晶化を光学顕微鏡で測定し、自動画像解析を用いて、形成されたＣａＯｘ結晶タイプ、すなわちＣａＯｘ一水和物（ＣＯＭ）とＣａＯｘ二水和物（ＣＯＤ）を検出、分類、定量化した。
シュウ酸カルシウム（ＣａＯｘ）結晶化を阻害する化合物の有効性を比較するために、尿中での簡単なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。すなわち、ヒトの尿（ｐＨ ６．２）を化合物と混合した後、ＣａＯｘ結晶化を誘発する１ｍＭシュウ酸ナトリウムを添加した。室温で７時間放置した後、結晶化を光学顕微鏡で測定し、自動画像解析を用いて、形成されたＣａＯｘ結晶タイプ、すなわちＣａＯｘ一水和物（ＣＯＭ）とＣａＯｘ二水和物（ＣＯＤ）を検出、分類、定量化した。
【0166】
本発明者らは、３種類の新規２価ＩＰ５構造体がいずれも、ｉｎ ｖｉｔｒｏで同様のＣａＯｘ阻害効果を示し、４μｍｏｌ／ＬでＣａＯｘ結晶化を完全に阻害することを見出した（図１）。リンカーの長さは、阻害効果に重要な影響を与えなかった。従前に開発された最も強力な化合物であるＩＰ５－ｍｏｎｏ－ＰＥＧ２（ＯＥＧ2 －ＩＰ５）（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／００４０８８及びＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０８０６５７）と比較して、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 は、ＣａＯｘ結晶化をコントロールの５０％以下に阻害する効力が２５００倍に増加した（図１）。
【0167】
本発明者らは、まず、阻害濃度以下の化合物では、結晶化がＣＯＭからＣＯＤにシフトし、さらに化合物の濃度を上げると、予想外の効率でＣａＯｘの成長を完全に抑制できることを確認した。試験したすべての２価ＩＰ５構造体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、生体内で期待される低マイクロモル濃度で完全なＣａＯｘ阻害効果を示した（図２、表１）。
【0168】
本発明者らは、ＣａＯｘ結晶化阻害効果は、分子上のリン酸基の数に依存し、すべてのＯＥＧx －（ＩＰ５）2 化合物で４μｍｏｌ／Ｌで完全な結晶化阻害効果が認められた（表１）。また、ＩＰ６と他の化合物をそれぞれ３０μＭ又は１００μＭまで試したが、完全なＣａＯｘ阻害には至らなかった（図３、表１）。ＯＥＧ鎖の長さやリンカーの長さがＣａＯｘ結晶化に与える影響はほとんどなく、主にＣＯＭ－ＣＯＤ形成力学に影響を与えていることがわかった。さらに、ｐＨを５．５に下げると、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 よりもＯＥＧ2 －ＩＰ５の活性が急激に低下する。化合物ＯＥＧ2 －ＩＰ５を１００μＭに設定しても、＜５０％の完全な阻害又はＣＯＭの阻害には至らなかった。加えて、化合物ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 は、０．３μＭでＣＯＭ阻害、２．４μＭで５０％完全阻害を保持していた（図１、表１）。化合物（ＯＥＧ4 ）3 －（ＩＰ５）3 は、０．０４μＭでＣＯＭ阻害、２．４μＭで完全阻害を示した（図８、表１）。
【0169】
【表1】
【0170】
実施例４：ＯＥＧ
4
－（ＩＰ５）
2
における初期段階の前駆体の安定化によるＣａＯｘ結晶化の阻害について
ｔ＝１０分間での初期結晶化の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）実験では、ＣＯＭ形状と円形の両方のナノサイズ粒子の両方の存在が示されたが、５００ｎＭのＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 ではナノサイズ粒子のみが検出された（図９Ｂ）。阻害剤を０．５μＭ～１０μＭ添加した場合、ｔ＝１時間でもナノサイズ粒子が存在していたが、コントロール試料ではマイクロメートルサイズのＣＯＭ結晶が優勢であったことから、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 によって初期段階のナノサイズＣａＯｘ粒子が安定化されていることが示唆された。
ｔ＝１０分間での初期結晶化の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）実験では、ＣＯＭ形状と円形の両方のナノサイズ粒子の両方の存在が示されたが、５００ｎＭのＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 ではナノサイズ粒子のみが検出された（図９Ｂ）。阻害剤を０．５μＭ～１０μＭ添加した場合、ｔ＝１時間でもナノサイズ粒子が存在していたが、コントロール試料ではマイクロメートルサイズのＣＯＭ結晶が優勢であったことから、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 によって初期段階のナノサイズＣａＯｘ粒子が安定化されていることが示唆された。
【0171】
さらに、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 が、用量依存的に、主にＣＯＭからＣＯＤへの結晶化に移行し、ＣＯＤ面に特異的な成長阻害を示すことをＳＥＭ実験で確認した（図９Ａ）。これらの結果から、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 は、結晶の核生成や成長の速度、結晶の多形性や形状など、いくつかの段階で結晶化プロセスを変化させることがわかった。
【0172】
実施例５：ＯＥＧ
4
－（ＩＰ５）
2
において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＯＥＧ
2
－ＩＰ５よりも効率的にＣａＯｘの腎上皮細胞への付着を阻害することについて
ＩＰ６類似体のＣａＯｘ結晶に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣｓ）への抗付着効果を、微分干渉顕微鏡を用いて検討した。ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 、ＯＥＧ2 －ＩＰ５及び（ＯＥＧ2 ）2 －ＩＰ４を比較すると、それぞれ２００ｎＭ、４μＭ、１００μＭ以上の濃度では、コントロールと比較して、ＣａＯｘの付着率が２５％以下になることがわかった（図１０Ａ～図１０Ｄ）。クエン酸塩処理は、１００μＭまでのＣａＯｘ付着に対する検出可能な保護をもたらさなかった。さらに、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 は、ＣａＯｘ付着を阻害するだけでなく、事前結合したＣａＯｘ結晶の結合をマイクロモルの低濃度で逆転させた（図１０Ｅ）。
ＩＰ６類似体のＣａＯｘ結晶に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣｓ）への抗付着効果を、微分干渉顕微鏡を用いて検討した。ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 、ＯＥＧ2 －ＩＰ５及び（ＯＥＧ2 ）2 －ＩＰ４を比較すると、それぞれ２００ｎＭ、４μＭ、１００μＭ以上の濃度では、コントロールと比較して、ＣａＯｘの付着率が２５％以下になることがわかった（図１０Ａ～図１０Ｄ）。クエン酸塩処理は、１００μＭまでのＣａＯｘ付着に対する検出可能な保護をもたらさなかった。さらに、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 は、ＣａＯｘ付着を阻害するだけでなく、事前結合したＣａＯｘ結晶の結合をマイクロモルの低濃度で逆転させた（図１０Ｅ）。
【0173】
実施例６：ＯＥＧ
4
－（ＩＰ５）
2
におけるＣａＯｘ誘発細胞傷害に対する細胞保護効果について
ＲＰＴＥＣｓのＲＮＡシークエンスでは、培地コントロールと、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 コントロールと、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 と予め混合したＣａＯｘで処理した細胞との間で同様の遺伝子発現プロファイルが見られたが、ＣａＯｘ処理のみで劇的な変化が引き起こされた（図１１Ａ）。培地サンプル上のＣａＯｘで異なって発現する遺伝子の遺伝子セットのエンリッチメント解析を行ったところ、文献と一致するように、主に免疫・炎症反応に関わる遺伝子が変化していることがわかった。また、構造的な変化（例：微小管の組織化）やタンパク質の修飾・シグナル作用（例：ペプチジルグルタミン酸の修飾、小胞体－核のシグナル伝達経路）も明らかになった（図１１Ｂ）。培地サンプル上のＣａＯｘと、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 サンプル上のＣａＯｘで発現量の異なる上位１０個のエンリッチメント遺伝子セットを比較すると、同様の変化が見られ、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 とＣａＯｘを事前に混合することで、ＣａＯｘによるトランスクリプトームの変化を防ぐことができることが示された（図１１Ｂ）。ＣａＯｘ群では、ＴＮＦα及びＴＧＦβシグナル伝達経路遺伝子、細胞表面糖タンパク質、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド及び補体カスケード遺伝子の発現が、他のすべての治療群と比較して上昇していた（図１１Ｃ）。さらに、ＣａＯｘ結晶を処理すると、エチジウムホモダイマー－１の染色で明らかなように、細胞膜の損傷が引き起こされたが、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 によって用量依存的に防止された（図１１Ｄ及び図１１Ｅ）。
ＲＰＴＥＣｓのＲＮＡシークエンスでは、培地コントロールと、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 コントロールと、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 と予め混合したＣａＯｘで処理した細胞との間で同様の遺伝子発現プロファイルが見られたが、ＣａＯｘ処理のみで劇的な変化が引き起こされた（図１１Ａ）。培地サンプル上のＣａＯｘで異なって発現する遺伝子の遺伝子セットのエンリッチメント解析を行ったところ、文献と一致するように、主に免疫・炎症反応に関わる遺伝子が変化していることがわかった。また、構造的な変化（例：微小管の組織化）やタンパク質の修飾・シグナル作用（例：ペプチジルグルタミン酸の修飾、小胞体－核のシグナル伝達経路）も明らかになった（図１１Ｂ）。培地サンプル上のＣａＯｘと、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 サンプル上のＣａＯｘで発現量の異なる上位１０個のエンリッチメント遺伝子セットを比較すると、同様の変化が見られ、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 とＣａＯｘを事前に混合することで、ＣａＯｘによるトランスクリプトームの変化を防ぐことができることが示された（図１１Ｂ）。ＣａＯｘ群では、ＴＮＦα及びＴＧＦβシグナル伝達経路遺伝子、細胞表面糖タンパク質、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド及び補体カスケード遺伝子の発現が、他のすべての治療群と比較して上昇していた（図１１Ｃ）。さらに、ＣａＯｘ結晶を処理すると、エチジウムホモダイマー－１の染色で明らかなように、細胞膜の損傷が引き起こされたが、ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 によって用量依存的に防止された（図１１Ｄ及び図１１Ｅ）。
【0174】
材料と方法
材料
化合物は、Ｃｈｉｍｅｔｅ Ｓｒｌ社（Ｔｏｒｔｏｎａ、Ｉｔａｌｙ）によってカスタム合成された。フィチン酸十二ナトリウム塩は、ＢｉｏｓｙｎｔｈＡＧ社（Ｔｈａｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。ヒトの尿は、Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から入手した。シュウ酸塩アッセイキット（ＭＡＫ３１５）、カルシウム比色分析キット（ＭＡＫ０２２）、ビストリス、シュウ酸ナトリウム、１０％中性緩衝ホルマリン溶液、及びＭｏｗｉｏｌ ４－８８は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から入手した。塩化ナトリウムと塩化カルシウム脱水物は、Ｍｅｒｃｋ社（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手した。シュウ酸カルシウム一水和物は、ａｂｃｒ社（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。８ウェルグラスボトムスライド（８０８２７）は、ｉｂｉｄｉ社（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。クエン酸三ナトリウム二水和物分析グレード、Ｎｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩチャンバースライド、細胞培養プレート、哺乳動物細胞用の生／死生存率／細胞毒性キット、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）から入手した。ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、ＰｒｏｘＵｐ基礎培地及びサプリメントは、Ｅｖｅｒｃｙｔｅ社（Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）から入手した。ＲＮｅａｓｙキットは、Ｑｕｉａｇｅｎ社（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、ＴｒｕｅＳｅｑ ＲＮＡキットは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。
材料
化合物は、Ｃｈｉｍｅｔｅ Ｓｒｌ社（Ｔｏｒｔｏｎａ、Ｉｔａｌｙ）によってカスタム合成された。フィチン酸十二ナトリウム塩は、ＢｉｏｓｙｎｔｈＡＧ社（Ｔｈａｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。ヒトの尿は、Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から入手した。シュウ酸塩アッセイキット（ＭＡＫ３１５）、カルシウム比色分析キット（ＭＡＫ０２２）、ビストリス、シュウ酸ナトリウム、１０％中性緩衝ホルマリン溶液、及びＭｏｗｉｏｌ ４－８８は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から入手した。塩化ナトリウムと塩化カルシウム脱水物は、Ｍｅｒｃｋ社（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手した。シュウ酸カルシウム一水和物は、ａｂｃｒ社（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。８ウェルグラスボトムスライド（８０８２７）は、ｉｂｉｄｉ社（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。クエン酸三ナトリウム二水和物分析グレード、Ｎｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩチャンバースライド、細胞培養プレート、哺乳動物細胞用の生／死生存率／細胞毒性キット、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）から入手した。ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、ＰｒｏｘＵｐ基礎培地及びサプリメントは、Ｅｖｅｒｃｙｔｅ社（Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）から入手した。ＲＮｅａｓｙキットは、Ｑｕｉａｇｅｎ社（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、ＴｒｕｅＳｅｑ ＲＮＡキットは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。
【0175】
ＣａＯｘスクリーニングアッセイと分析
ヒトの尿は５０ｍＬの分注で－２０℃において保存した。解凍後、アリコートを遠心分離し、０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過し、ｐＨを６．２に設定した。ヒトの尿サンプルのシュウ酸塩濃度を、シュウ酸塩アッセイキットを用いてキットのプロトコルに従って測定したところ、使用したサンプルでは１００μＭ未満であった。ナトリウムと化合物の希釈液をＢｉｓ Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２）で調製した。尿と化合物をエッペンドルフチューブに入れて混合し、続いてシュウ酸ナトリウムを添加した。総容量１ｍＬの最終測定用混合液には、尿９０％、シュウ酸ナトリウム（１ｍＭ）５％、化合物希釈液５％が含まれていた。シュウ酸ナトリウムを添加した直後に、最終的なアッセイ混合物をボルテックスし、イメージングスライド（８ウェルガラスボトムチャンバー、ｉｂｉｄｉ）に加えた。１ウェルあたり４００μＬを加え、各サンプルに２つのウェルを用意した。結晶化は、Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６０００顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の明視野モードを用いて、室温で７時間インキュベートした後に評価した。可視化には、４０倍の対物レンズによる画像を使用した。定量化には、２つのウェル／サンプルと、それぞれ５つの２０倍対物レンズ像を使用した。シュウ酸ナトリウムを添加しないと、結晶化は観察できなかった。
ヒトの尿は５０ｍＬの分注で－２０℃において保存した。解凍後、アリコートを遠心分離し、０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過し、ｐＨを６．２に設定した。ヒトの尿サンプルのシュウ酸塩濃度を、シュウ酸塩アッセイキットを用いてキットのプロトコルに従って測定したところ、使用したサンプルでは１００μＭ未満であった。ナトリウムと化合物の希釈液をＢｉｓ Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２）で調製した。尿と化合物をエッペンドルフチューブに入れて混合し、続いてシュウ酸ナトリウムを添加した。総容量１ｍＬの最終測定用混合液には、尿９０％、シュウ酸ナトリウム（１ｍＭ）５％、化合物希釈液５％が含まれていた。シュウ酸ナトリウムを添加した直後に、最終的なアッセイ混合物をボルテックスし、イメージングスライド（８ウェルガラスボトムチャンバー、ｉｂｉｄｉ）に加えた。１ウェルあたり４００μＬを加え、各サンプルに２つのウェルを用意した。結晶化は、Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６０００顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の明視野モードを用いて、室温で７時間インキュベートした後に評価した。可視化には、４０倍の対物レンズによる画像を使用した。定量化には、２つのウェル／サンプルと、それぞれ５つの２０倍対物レンズ像を使用した。シュウ酸ナトリウムを添加しないと、結晶化は観察できなかった。
【0176】
同様の方法で結晶種の阻害を評価した。結晶化は、上記のように尿中の１ｍＭシュウ酸ナトリウムで誘発し、その後、室温で１．５時間放置した後、化合物を各ウェルに直接添加した。サンプルは、化合物を添加する前のｔ＝１．５時間と、その後のｔ＝７時間で撮影された。
【0177】
結晶の定量化と分類は、Ｍａｔｌａｂ（バージョンＲ２０１６ｂ又はＲ２０１８ｂ）で行った。すなわち、エッジ検出と流域アルゴリズムを用いて結晶をセグメント化し、続いて各結晶の形状、強度、テクスチャの特徴を抽出した。抽出された特徴は、ＣＯＭ（クラス０）、ＣＯＤ（クラス１）、決定されていない構造（クラス２）、バックグラウンドノイズ（クラス３）を区別するための半教師あり分類アプローチの入力とした。３次構造のサポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類器を学習し、テスト画像の分類に使用した。
【0178】
すべてのテスト画像は、バッチ処理アプリを使用して処理された。ＣａＯｘ結晶化を阻害する化合物の有効性は、各結晶タイプの視野あたりの総面積を分析することで比較した。各実験（Ｎ＝３）において、ＣＯＭ、ＣＯＤ、未分類の３つの結晶クラスの総面積の合計をコントロールに対して正規化した。結晶化プロセス自体には固有のばらつきがあるため、各実験で正規化することで、実験間のばらつきの影響を低減させた。
【0179】
走査型電子顕微鏡
ＳＥＭ用のＣａＯｘ結晶は、１ｍＭのＮａＯｘ、２ｍＭのＣａＣｌ2 、表示濃度の化合物を含むＢｉｓ Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２）で調製した。２４ウェルプレートの底に１２ｍｍの丸いガラスカバースリップを置いた。まず、ＣａＣｌ2 と阻害剤の２０倍最終濃度と、ＮａＯｘの１０倍最終濃度のストック液をＢｉｓ Ｔｒｉｓ緩衝液で調製した。アッセイ混合液は、エッペンドルフチューブに、まず８００μＬのＢｉｓ Ｔｒｉｓ緩衝液を加え、続いて５０μＬのＣａＣｌ2 （２０倍濃度）と５０μＬの阻害剤（２０倍濃度）を加え、ボルテックスして調製した。その後、１００μＬのＮａＯｘ（最終濃度１０倍）を加え、アッセイ混合物をボルテックスして、準備した２４ウェルプレートに直ちに加えた。１ウェルあたり４００μＬ、１サンプルあたり２ウェルを用意した。サンプルを室温で示された時間だけインキュベートした。試料を二重蒸留水（ｄｄＨ2 Ｏ）で１回洗浄し、室温で乾燥させる前に、Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６０００顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社）を用いて明視野モードでサンプル画像を撮影した。乾燥プロセスが結晶形態に与える影響が少ないことを確認するため、乾燥後に再び明視野顕微鏡でサンプルを撮影した。乾燥後、ガラスカバースリップを銀色の塗料でＳＥＭスタブに取り付け、ＣＣＵ－０１０ Ｍｅｔａｌ Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｃｏａｔｅｒ（Ｓａｆｅｍａｔｉｃ， Ｂａｄ Ｒａｇａｚ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて６ｎｍのプラチナ／パラジウム層をコーティングした。サンプルは、ＴＬＤ検出器を使用して二次電子モードでＭａｇｅｌｌａｎ ４００ ＦＥＳＥＭ顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用して画像化された。
ＳＥＭ用のＣａＯｘ結晶は、１ｍＭのＮａＯｘ、２ｍＭのＣａＣｌ2 、表示濃度の化合物を含むＢｉｓ Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２）で調製した。２４ウェルプレートの底に１２ｍｍの丸いガラスカバースリップを置いた。まず、ＣａＣｌ2 と阻害剤の２０倍最終濃度と、ＮａＯｘの１０倍最終濃度のストック液をＢｉｓ Ｔｒｉｓ緩衝液で調製した。アッセイ混合液は、エッペンドルフチューブに、まず８００μＬのＢｉｓ Ｔｒｉｓ緩衝液を加え、続いて５０μＬのＣａＣｌ2 （２０倍濃度）と５０μＬの阻害剤（２０倍濃度）を加え、ボルテックスして調製した。その後、１００μＬのＮａＯｘ（最終濃度１０倍）を加え、アッセイ混合物をボルテックスして、準備した２４ウェルプレートに直ちに加えた。１ウェルあたり４００μＬ、１サンプルあたり２ウェルを用意した。サンプルを室温で示された時間だけインキュベートした。試料を二重蒸留水（ｄｄＨ2 Ｏ）で１回洗浄し、室温で乾燥させる前に、Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６０００顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社）を用いて明視野モードでサンプル画像を撮影した。乾燥プロセスが結晶形態に与える影響が少ないことを確認するため、乾燥後に再び明視野顕微鏡でサンプルを撮影した。乾燥後、ガラスカバースリップを銀色の塗料でＳＥＭスタブに取り付け、ＣＣＵ－０１０ Ｍｅｔａｌ Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｃｏａｔｅｒ（Ｓａｆｅｍａｔｉｃ， Ｂａｄ Ｒａｇａｚ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて６ｎｍのプラチナ／パラジウム層をコーティングした。サンプルは、ＴＬＤ検出器を使用して二次電子モードでＭａｇｅｌｌａｎ ４００ ＦＥＳＥＭ顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用して画像化された。
【0180】
細胞実験
ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１ヒト近位尿細管細胞（Ｅｖｅｒｃｙｔｅ）を、ＰｒｏｘＵｐサプリメント（Ｅｖｅｒｃｙｔｅ）を混合したＰｒｏｘＵｐ基礎培地（Ｅｖｅｒｃｙｔｅ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ′ｓ Ｆ１２、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ）で、メーカーの推奨に従って３７℃、５％ＣＯ2 で培養した。細胞は定期的にマイコプラズマ感染の検査を行った。
ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１ヒト近位尿細管細胞（Ｅｖｅｒｃｙｔｅ）を、ＰｒｏｘＵｐサプリメント（Ｅｖｅｒｃｙｔｅ）を混合したＰｒｏｘＵｐ基礎培地（Ｅｖｅｒｃｙｔｅ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ′ｓ Ｆ１２、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ）で、メーカーの推奨に従って３７℃、５％ＣＯ2 で培養した。細胞は定期的にマイコプラズマ感染の検査を行った。
【0181】
細胞の生存率は、生／死生存率／細胞毒性キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて評価した。細胞を２４ウェルプレートで培養し、播種から４８時間後（コンフルエントに達した時点）に１５０μｇ／ｃｍ2 のシュウ酸カルシウム一水和物（ａｂｃｒ）をＰｒｏｘＵｐ ｂａｓａｌで化合物とプレミックスして処理した。４８時間処理後、生／死生存率／細胞毒性キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、キットのプロトコルに従って染色し、細胞生存率を測定した。画像は、Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６０００顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社製、３ウェル／サンプル、３画像／ウェル）を用いた落射蛍光顕微鏡により得られ、赤色蛍光ドットの数を定量した。
【0182】
ＲＰＴＥＣ細胞へのＣａＯｘの付着を定量化するために、８ウェルのＮｕｎｃ Ｌａｂ Ｔｅｋチャンバースライド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で細胞を培養し、４８時間後にコンフルエントになったところで、ＰｒｏｘＵｐ基礎培地（ｐＨを６．９に設定）に化合物をプレミックスしたＣＯＭ（ａｂｃｒ）で３７℃、５％ＣＯ2 で３０分間処理した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリンで１５分間固定した後、ＰＢＳで洗浄し、最後にｄｄＨ2 Ｏですすいだ。スライドのチャンバーを外し、Ｍｏｗｉｏｌで細胞をマウントした。Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６０００顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社）のＤＩＣモード、６３倍オイル対物レンズで画像を取得し（１サンプルにつき３ウェル、１ウェルにつき８枚の画像）、結晶占有面積を定量化した。
【0183】
ＲＮＡシークエンシング
細胞は、細胞生存率アッセイに記載された通りに培養した。４つの処理グループは、培地対照（ＰｒｏｘＵｐ ｂａｓａｌ）、１５０μｇ／ｃｍ2 シュウ酸カルシウム一水和物（ａｂｃｒ）のみ、１５０μｇ／ｃｍ2 シュウ酸カルシウム一水和物（ａｂｃｒ）と１０μＭ ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 のプレミックス、１０μＭ ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 のみ、から構成した。トータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いて、メーカーのプロトコルに従って抽出した。ｍＲＮＡを精製し、ＴｒｕｅＳｅｑ ＲＮＡキットを用いてＲＮＡｓｅｑライブラリーをプレパラート化した。シークエンスはＮｏｖａｓｅｑ ６０００ （Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて行った。読み取り値は、ＳＴＡＲツールを用いてヒト参照ゲノムＧＲＣｈ３８．ｐ１０にアライメントし、Ｋａｌｌｉｓｔｏプログラムを用いて転写産物の定量化を行った。遺伝子モデルの定義にはＥｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ ９１を使用した。有意に異なる遺伝子のヒートマップと階層的クラスタリングのために、全サンプルの平均値と比較してｌｏｇ２ｆｏｌｄ変化を計算し、ｌｏｇ２ｆｏｌｄ変化＞４とした。遺伝子セット濃縮分析は、Ｗｅｂｇｅｓｔａｌｔ．ｏｒｇ（ｖ２０１９）41で実行された。ＧＳＥＡの入力は、アンサンブル遺伝子ＩＤを持つ遺伝子リストと、２つの処理グループ間の差次的発現の指標となるランキングスコア（－ｌｏｇ10 * ｐ－ｖａｌｕｅ * ｓｉｇｎ （ｌｏｇ2 ｒａｔｉｏ））である。差次的に発現する遺伝子を遺伝子オントロジー（生物学的プロセス機能データベース）と比較し、参照セットとしてヒトゲノム－タンパク質コーディングを使用した。選択された遺伝子の発現レベルを比較するために、正規化された遺伝子数を使用した。
細胞は、細胞生存率アッセイに記載された通りに培養した。４つの処理グループは、培地対照（ＰｒｏｘＵｐ ｂａｓａｌ）、１５０μｇ／ｃｍ2 シュウ酸カルシウム一水和物（ａｂｃｒ）のみ、１５０μｇ／ｃｍ2 シュウ酸カルシウム一水和物（ａｂｃｒ）と１０μＭ ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 のプレミックス、１０μＭ ＯＥＧ4 －（ＩＰ５）2 のみ、から構成した。トータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いて、メーカーのプロトコルに従って抽出した。ｍＲＮＡを精製し、ＴｒｕｅＳｅｑ ＲＮＡキットを用いてＲＮＡｓｅｑライブラリーをプレパラート化した。シークエンスはＮｏｖａｓｅｑ ６０００ （Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて行った。読み取り値は、ＳＴＡＲツールを用いてヒト参照ゲノムＧＲＣｈ３８．ｐ１０にアライメントし、Ｋａｌｌｉｓｔｏプログラムを用いて転写産物の定量化を行った。遺伝子モデルの定義にはＥｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ ９１を使用した。有意に異なる遺伝子のヒートマップと階層的クラスタリングのために、全サンプルの平均値と比較してｌｏｇ２ｆｏｌｄ変化を計算し、ｌｏｇ２ｆｏｌｄ変化＞４とした。遺伝子セット濃縮分析は、Ｗｅｂｇｅｓｔａｌｔ．ｏｒｇ（ｖ２０１９）41で実行された。ＧＳＥＡの入力は、アンサンブル遺伝子ＩＤを持つ遺伝子リストと、２つの処理グループ間の差次的発現の指標となるランキングスコア（－ｌｏｇ10 * ｐ－ｖａｌｕｅ * ｓｉｇｎ （ｌｏｇ2 ｒａｔｉｏ））である。差次的に発現する遺伝子を遺伝子オントロジー（生物学的プロセス機能データベース）と比較し、参照セットとしてヒトゲノム－タンパク質コーディングを使用した。選択された遺伝子の発現レベルを比較するために、正規化された遺伝子数を使用した。
【0184】
データ解析
統計解析及びグラフは、特に記載のない限り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて作成された。データは平均＋ＳＤで表した。投与群と対照群の比較には、通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とポストホックＤｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた。画像解析は、特に記載のない限り、Ｍａｔｌａｂ ｖｅｒｓｉｏｎ Ｒ２０１８ｂ及びＲ２０１６ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ， Ｎａｔｉｃｋ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて行った。
統計解析及びグラフは、特に記載のない限り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて作成された。データは平均＋ＳＤで表した。投与群と対照群の比較には、通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とポストホックＤｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた。画像解析は、特に記載のない限り、Ｍａｔｌａｂ ｖｅｒｓｉｏｎ Ｒ２０１８ｂ及びＲ２０１６ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ， Ｎａｔｉｃｋ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて行った。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
