(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-07
(45)【発行日】2023-12-15
(54)【発明の名称】抗体または抗原結合フラグメントの結晶化
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20231208BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231208BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231208BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20231208BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231208BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20231208BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00 ZNA
C07K16/46
C07K19/00
C07K1/14
C12N15/13
C12N15/62 Z
【請求項の数】
21
(21)【出願番号】P 2022548676
(86)(22)【出願日】2021-02-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-04
(86)【国際出願番号】 US2021017212
(87)【国際公開番号】W WO2021163031
(87)【国際公開日】2021-08-19
【審査請求日】2022-09-26
(31)【優先権主張番号】62/975,269
(32)【優先日】2020-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】アットウェル，シェイン クルメン
(72)【発明者】
【氏名】リュウ，リッキー ロン
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５３２３７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５１２０２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２６９７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５０６１４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５０３１７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１５２６４２（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質であって、前記バリアントＣκは、ヒトＣκ（ヒトカッパ軽鎖定常ドメイン）において１９９位～２０３位のアミノ酸がＱＧＴＴＳであり、ヒトＣκの１９８位および２０４位におけるアミノ酸が、前記バリアントＣκにおいて欠失している（すべての位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている）、抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質。
【請求項2】
前記バリアントＣκが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質。
【請求項3】
前記バリアントＣκが、ヒトＣκにおいて１２６位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）のアミノ酸がアラニンである、請求項１に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質。
【請求項4】
前記バリアントＣκが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質。
【請求項5】
前記バリアントＣκが、ヒトＣκにおいて２１４位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）のアミノ酸がプロリンである、請求項１または３に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質。
【請求項6】
前記バリアントＣκが、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質。
【請求項7】
前記抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質が、ヒト軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒト重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質。
【請求項8】
前記抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質が、ヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質。
【請求項9】
前記ヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインが、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインである、請求項８に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質。
【請求項10】
前記抗原結合フラグメントが、ヒトＦａｂまたはＦａｂ’である、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項11】
ヒトＣκを含む抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質の結晶構造を生成するための方法であって、バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を生成することであって、前記バリアントＣκは、ヒトＣκにおいて１９９位～２０３位のアミノ酸がＱＧＴＴＳであり、ヒトＣκの１９８位および２０４位におけるアミノ酸が、前記バリアントＣκにおいて欠失していることと（すべての位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている）、
前記バリアントＣκを含む前記抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を結晶化することとを含む、方法。
【請求項12】
抗原と、前記抗原に結合する抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質との複合体の結晶構造を生成するための方法であって、前記抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質が、ヒトＣκを含み、前記方法が、バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を生成することであって、前記バリアントＣκは、ヒトＣκにおいて１９９位～２０３位のアミノ酸がＱＧＴＴＳであり、ヒトＣκの１９８位および２０４位におけるアミノ酸が、前記バリアントＣκにおいて欠失していることと（すべての位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている）、
前記抗原と、前記バリアントＣκを含む前記抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質とを共結晶化することとを含む、方法。
【請求項13】
前記バリアントＣκが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項14】
前記バリアントＣκが、ヒトＣκにおいて１２６位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）のアミノ酸がアラニンである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項15】
前記バリアントＣκが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記バリアントＣκが、ヒトＣκにおいて２１４位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）のアミノ酸がプロリンである、請求項１１～１２または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記バリアントＣκが、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記抗体、抗原結合フラグメント、または融合タンパク質が、ヒトＶＬおよびヒトＶＨをさらに含む、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質が、ヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインが、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記抗原結合フラグメントが、ヒトＦａｂまたはＦａｂ’である、請求項１１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）もしくは抗原結合フラグメント、例えば、ＦａｂもしくはＦａｂ’、または融合タンパク質、およびＦａｂ／Ｆａｂ’／ｍＡｂ：抗原複合体の結晶化を改善するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体治療薬は、最も重要な薬物クラスの１つである。２０１９年の終わりまでに、免疫疾患、感染疾患、心血管疾患、がんおよびその他を治療する９０個のモノクローナル抗体薬物が、米国および欧州において承認されており、２０１８年において１１５０億ドルの売り上げを計上している（Ｋａｐｌｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ，２０２０．１２（１）：１７０３５３１、Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ．２０２０；２７：１）。かつては、げっ歯類抗体がヒトでの使用のために開発されたが、これに長期間のヒト化抗体が続き、これは過去２０年間にわたってファージおよび酵母ディスプレイのような（Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ，１９８８．７３（２）：３０５－１８、Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７．１５（６）：５５３－７）またはヒト生殖系列レパートリーを有するげっ歯類の免疫化による（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００８．（１８１）：６９－９７）完全にヒトの発見プラットフォームにシフトした。これらのプラットフォームにおいて、操作は、ヒト化のためには必要でないが、他の問題（親和性、交差反応性、翻訳後修飾、疎水性、静電気、粘度、および免疫原性）に対処するために使用され続けている。さらに、特に、抗体薬物コンジュゲートおよび二重特異性抗体のように新たな抗体由来フォーマットが開発されていることから、抗体の特徴付けはより複雑になり続けている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｌａｚａｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．，２０１８．１７（３）１９７－２２３）。
【0003】
抗体構造のモデリングは、特に、疎水性、安定性、電荷／双極子モーメントおよび脱アミド化傾向などの特性について、潜在的な治療薬の挙動を予測することの不可欠な部分になっている（Ｘｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ，２０１９．１１（２）２３９－２６４）。このモデリングは、典型的には、公開されている結晶構造に基づく。ＣＤＲ構造、特に重鎖ＣＤＲ３をモデリングすることの困難性に起因して、高度に類似した（または同一の）Ｆａｂ結晶構造の結晶構造に対するモデリングは、抗体特性の予測の正確さを改善するはずである。利用可能な場合、高解像度のＦａｂ構造は、計算のための最良の基礎を提供する。
【0004】
Ｆａｂ：抗原複合体の構造は、さらに大きな価値を有する。それは、上記のためのＦａｂの結晶構造を供給し得、エピトープ：パラトープ情報も供給し得る。Ｆａｂ：抗原複合体構造を取得することは、抗原およびＦａｂの相対的な３次元位置を、個々の原子の精度まで直接的に決定するための唯一の方法である。エピトープを、推測するのでなく、見ることができる。アミノ酸側鎖を調べ、親和性および交差反応性におけるその役割に関する仮説を形成し、計算を行って、親和性（向上または低下）および交差反応性を予測および操作し得る。加えて、Ｆａｂ：抗原複合体の構造は、他の変異を考慮するときに参照され得、異なるアッセイフォーマットの妥当性を決定することにおける必須のクロスチェックとなり得る。
【0005】
しかしながら、結晶構造決定は、困難で費用がかかる（Ｓｌａｂｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２００７．１６（１１）：２４７２－８２）。最も困難なステップは、精製タンパク質からの十分に秩序化された結晶の生成である傾向がある。タンパク質の結晶化可能性を妨げ得る、純度、安定性、無秩序（ドメイン、ループまたは末端間）、表面電荷および疎水性などの、多くの要因が存在する（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９９．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。十分に回折する結晶を取得するには、数日もしくは数年かかり得るか、または著しい努力の後に単に放棄される場合がある。
【0006】
Ｆａｂの結晶化および構造決定は、多くの他のタンパク質クラス、特に、膜タンパク質と比較して容易であるが、広範なスクリーニングおよび結晶化方法の最適化は依然として必要である。他のタンパク質のように、いくつかのＦａｂは、著しい結晶最適化を必要とし、全く手に負えないＦａｂの例が存在する。Ｆａｂ：抗原複合体は、しばしば抗原単独よりも結晶化することが容易であるが（それゆえの、Ｆａｂの「結晶化シャペロン」としての使用）（Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１１．１６５（３）：２８５－９１）、依然として困難であり得、大規模なスクリーニングおよび最適化を必要とし得る。結晶化および構造精密化において必要とされる数日から数か月にわたる個々の注意のために、これらの２つのステップは、配列から最終構造までのプロセスにおいて最も高価である。困難なケースは、総平均に対して特にそして否定的に強い影響がある。Ｆａｂ結晶化に必要とされる努力が、おそらく、なぜそのように少ない構造が操作または計算のために使用されているのかを説明している。
【0007】
ＥｄｍｕｎｄｓｏｎおよびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋは、ヒトＦａｂの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）との間の結晶充填相互作用およびβシート形成を調べ、ベータシートを形成する傾向を有する３つの交互残基である「充填トライアド（ｐａｃｋｉｎｇ ｔｒｉａｄ）」の重要性を観察した。（Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎ ａｎｄ Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８．３（４）：３０９－１７）。
【0008】
κ鎖のヒトＣＬドメインを含むＦａｂ、例えば、ヒトＦａｂおよび／またはヒトＦａｂ：抗原複合体の結晶化を改善するための必要性が存在する。
【発明の概要】
【0009】
詳細な説明
ヒト抗体軽鎖カッパ定常ドメイン（Ｃκ）を含むヒト抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質、およびＦａｂ／Ｆａｂ’／ｍＡｂ：抗原複合体の結晶化を著しく改善する方法および組成物が本明細書で提供される。本明細書に記載の方法および組成物は、ヒトＣκを含む、大部分のヒトＦａｂ、いくつかのヒトｍＡｂ、およびヒトＦａｂまたはｍＡｂを含む融合タンパク質に普遍的に適用され得、それらの結晶化を著しく改善し得る（それらをより迅速に、より高い解像度に、より低い濃度で、および／または不均一な混合物から結晶化する可能性を高くすることを含む）。
ヒト抗体軽鎖カッパ定常ドメイン（Ｃκ）を含むヒト抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質、およびＦａｂ／Ｆａｂ’／ｍＡｂ：抗原複合体の結晶化を著しく改善する方法および組成物が本明細書で提供される。本明細書に記載の方法および組成物は、ヒトＣκを含む、大部分のヒトＦａｂ、いくつかのヒトｍＡｂ、およびヒトＦａｂまたはｍＡｂを含む融合タンパク質に普遍的に適用され得、それらの結晶化を著しく改善し得る（それらをより迅速に、より高い解像度に、より低い濃度で、および／または不均一な混合物から結晶化する可能性を高くすることを含む）。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】ウサギＦａｂ結晶構造における例示的なＧストランドベータシート充填を示す。図１Ａは、４ＺＴＯ．ｐｄｂにおけるＨＣ：ＨＣおよびＬＣ：ＬＣベータ充填を示す。重鎖を黒色および淡灰色で示す。軽鎖を濃灰色および白色で示す。
【図2A】ヒトＣκ ＦＧループのウサギ様ＬＣ：ＬＣ充填との不適合性を示す。図２Ａは、４ＮＺＵ．ｐｄｂからのヒトＦａｂ（濃灰色）の、４ＺＴＯからのウサギＦａｂ結晶充填（中灰色および淡灰色）に対する構造アラインメントを示す。これは、ウサギＣκ ＦＧループ（中灰色）が、より長く、バルジしているヒトＣκ ＦＧループとは異なり、よりコンパクトであり、ベータシート充填とより適合性であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
一態様では、バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質であって、バリアントＣκは、ヒトＣκの１９９位～２０３位（位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている、配列番号１の９２位～９６位に対応する）におけるアミノ酸ＱＧＴＴＳを含み、ヒトＣκの１９８位および２０４位（位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている、配列番号１の９１位および９７位に対応する）におけるアミノ酸は、バリアントＣκにおいて欠失している、抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、ヒトＣκの１２６位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う、配列番号１の１９位に対応する）におけるアラニンをさらに含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、ヒトＣκの２１４位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う、配列番号１の１０７位に対応する）におけるプロリンをさらに含む。
【0012】
別段の指定がない限り、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントにおけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１）。
【0013】
いくつかの実施形態では、配列番号３を含むバリアントＣκドメインを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４を含むバリアントＣκドメインを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５を含むバリアントＣκドメインを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６を含むバリアントＣκドメインを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質が本明細書で提供される。
【0014】
いくつかの実施形態では、抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質は、ヒト軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒト重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質は、ヒトＩｇＧヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４ヒンジ領域）の一部をさらに含む。
【0015】
別の態様では、バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質のライブラリーであって、バリアントＣκは、ヒトＣκの１９９位～２０３位におけるアミノ酸ＱＧＴＴＳを含み、ヒトＣκの１９８位および２０４位におけるアミノ酸は、バリアントＣκにおいて欠失している（すべての位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている）、ライブラリーが本明細書で提供される。
【0016】
別の態様では、本明細書に記載のバリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質の結晶構造を生成するための方法が本明細書で提供される。そのような方法は、バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を結晶化することであって、バリアントＣκは、ヒトＣκの１９９位～２０３位におけるアミノ酸ＱＧＴＴＳを含み、ヒトＣκの１９８位および２０４位におけるアミノ酸は、バリアントＣκにおいて欠失している（すべての位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている）、結晶化することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載のバリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質のライブラリーを構築することをさらに含む。例えば、バリアントＣκは、ヒトＣκの１９９位～２０３位におけるアミノ酸ＱＧＴＴＳを含み得、ヒトＣκの１９８位および２０４位におけるアミノ酸は、バリアントＣκにおいて欠失している（すべての位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている）。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号６を含む。
【0017】
ヒトＣκドメインを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質の結晶構造を生成するための方法もまた本明細書で提供される。そのような方法は、バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質を生成することであって、バリアントＣκは、ヒトＣκの１９９位～２０３位におけるアミノ酸ＱＧＴＴＳを含み、ヒトＣκの１９８位および２０４位におけるアミノ酸は、バリアントＣκにおいて欠失している（すべての位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている）、生成することと、バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質を結晶化することと、を含み得る。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、ヒトＣκの１２６位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）におけるアラニンをさらに含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、ヒトＣκの２１４位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）におけるプロリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号６を含む。
【0018】
別の態様では、抗原と、抗原に結合する抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）との複合体の結晶構造を生成するための方法であって、抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質は、ヒトＣκを含み、方法は、バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質を生成することであって、バリアントＣκは、ヒトＣκの１９９位～２０３位におけるアミノ酸ＱＧＴＴＳを含み、ヒトＣκの１９８位および２０４位におけるアミノ酸は、バリアントＣκにおいて欠失している（すべての位置はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされている）、生成することと、抗原と、バリアントＣκを含む抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’）または融合タンパク質とを共結晶化することと、を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、ヒトＣκの１２６位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）におけるアラニンをさらに含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、ヒトＣκの２１４位（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）におけるプロリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣκは、配列番号６を含む。
【0019】
本明細書で使用される場合、本開示の文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語および同様の用語は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。
【0020】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体の実施形態には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体が含まれる。抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）および任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のものであり得る。
【0021】
例示的な抗体は、４つのポリペプチド鎖：鎖間ジスルフィド結合を介して架橋されている２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）から構成される免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体である。４つのポリペプチド鎖の各々のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１２５個以上のアミノ酸の可変領域を含む。４つのポリペプチド鎖の各々のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を含有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域から構成される。ＩｇＧアイソタイプは、さらにサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に分割され得る。
【0022】
ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分され得る。ＣＤＲはタンパク質の表面上に露出しており、抗原結合特異性のための抗体の重要な領域である。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。アミノ酸残基のＣＤＲへの割り当ては、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））、Ｎｏｒｔｈ（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））、またはＩＭＧＴ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能な国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：２０９－２１２を参照のこと）に記載されているものを含む、周知のスキームに従って行われ得る。
【0023】
「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の部分を指す。抗原結合フラグメントの例としては、ＦａｂまたはＦａｂ’が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ」フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）を伴う、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む抗体軽鎖全体からなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して一価である。すなわち、それは、単一の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上の残基を含むＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個のさらなる残基を有することによって、Ｆａｂフラグメントと異なる。本明細書に記載のＦａｂまたはＦａｂ’は、ヒトＦａｂもしくはＦａｂ’、またはヒトＣＬを含むキメラＦａｂもしくはＦａｂ’であり得る。
【0024】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、ヒト抗体または抗体フラグメントの重鎖または軽鎖のいずれかのアミノ末端またはカルボキシル末端で異種ペプチドまたはポリペプチドに直接連結されたヒト抗体または抗体フラグメントを含む組換えタンパク質を指す。
【0025】
図面の簡単な説明
図１Ａ～１Ｂは、ウサギＦａｂ結晶構造における例示的なＧストランドベータシート充填を示す。図１Ａは、４ＺＴＯ．ｐｄｂにおけるＨＣ：ＨＣおよびＬＣ：ＬＣベータ充填を示す。重鎖を黒色および淡灰色で示す。軽鎖を濃灰色および白色で示す。図１Ｂは、４ＪＯ１．ｐｄｂにおけるＨＣ：ＬＣベータ充填を示す。
図１Ａ～１Ｂは、ウサギＦａｂ結晶構造における例示的なＧストランドベータシート充填を示す。図１Ａは、４ＺＴＯ．ｐｄｂにおけるＨＣ：ＨＣおよびＬＣ：ＬＣベータ充填を示す。重鎖を黒色および淡灰色で示す。軽鎖を濃灰色および白色で示す。図１Ｂは、４ＪＯ１．ｐｄｂにおけるＨＣ：ＬＣベータ充填を示す。
【0026】
図２Ａ～２Ｃは、ヒトＣκ ＦＧループのウサギ様ＬＣ：ＬＣ充填との不適合性を示す。図２Ａは、４ＮＺＵ．ｐｄｂからのヒトＦａｂ（濃灰色）の、４ＺＴＯからのウサギＦａｂ結晶充填（中灰色および淡灰色）に対する構造アラインメントを示す。これは、ウサギＣκ ＦＧループ（中灰色）が、より長く、バルジしているヒトＣκ ＦＧループとは異なり、よりコンパクトであり、ベータシート充填とより適合性であることを示す。図２Ｂは、ヒト、マウスおよびウサギのＣκドメインおよびＣλドメインのＦＧループの配列アラインメントを示す。ウサギＦＧループは２残基短く、これはＣλドメインからのＦＧループに似ている。図２Ｃは、第２の干渉の潜在的部位がヒトＫ１２６側鎖であることを示す。
【0027】
図３Ａ～３Ｃは、Ｃκ構築物における結晶充填を示す。図３Ａは、デュピルマブ親Ｆａｂにおける結晶充填を示す。Ｇストランドベータ充填は存在しない。図３Ｂは、結晶カッパ（ｃｒｙｓｔａｌ ｋａｐｐａ）バージョンにおける結晶充填の１つの平面を示す。各カッパ定常（淡灰色）は、近くのＣＨ１ドメイン（黒色）とベータシートを形成する。図３Ｃは、ＣκドメインのＧストランド（白色）とＣＨ１ドメインのＧストランド（濃灰色）との間に形成されたベータシートを示す。シートは、Ｃκ Ｔ２０５からＳ２１１およびＣＨ１ Ｎ２１６からＲ２２２に伸長し（残基を結晶構造において順次番号付けする）、これは擬似対称であり、Ｃκ Ｖ２０８（２０５位、Ｋａｂａｔ番号付け番号付けに従う）とＣＨ１ Ｖ２１９（Ｋａｂａｔ番号付け）との間に中心を置く。
【0028】
図４Ａ～４Ｂは、結晶カッパ設計の結晶構造を示す。図４Ａは、ヒトＩＬ４Ｒ細胞外ドメインと複合体形成したデュピルマブＦａｂの結晶カッパバージョン（上部右）の結晶構造を示す。図４Ｂは、セクキヌマブＦａｂと複合体形成したヒトＩＬ１７二量体の結晶カッパバージョン（上部中央）の結晶構造を示す。
【0029】
図５Ａ～５Ｃは、カラム画分結晶化を示す。サイズ排除クロマトグラフィーからのカラム画分を、４つの条件での蒸気拡散結晶化実験において直接使用する。図５Ａは、クロマトグラムを示す。図５Ｂは、９日目のすべての結晶化ドロップの画像を示す。図５Ｃは、各条件に割り当てられたスコアを示し、ここで、結晶性のもののすべては９０以上でスコア化されている。
【0030】
図６Ａ～６Ｂは、結晶カッパ設計を使用する完全長ｍＡｂの結晶化および構造決定を示す。図６Ａは、完全長ｍＡｂの結晶を示す画像である。図６Ｂは、得られた構造のリボンダイアグラムであり、抗体重鎖を黒色で（棒で示すＦｃグリコシル化を含む）、抗体軽鎖を淡灰色で示す。
【0031】
図７Ａ～７Ｂは、結晶カッパ設計を使用するペプチド－Ｆａｂ複合体の結晶化を示す。図７Ａは、４時間後の、タウペプチドに融合したＬ１４Ｈ１８の結晶カッパ軽鎖の結晶を示す画像である。図７Ｂは、Ｆａｂ軽鎖（灰色）のＮ末端への大部分が秩序化されたＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを用いて、Ｌ１４Ｈ１８ Ｆａｂに結合したタウペプチド（白色）の得られた２．３Åの構造のリボンダイアグラムである。Ｆａｂ重鎖を黒色で示す。
【実施例】
【0032】
実施例１：ＦａｂおよびＦａｂ：抗原複合体の結晶化
ウサギＦａｂ結晶充填の分析およびヒト結晶化可能カッパの設計
３６個の公開されているウサギＦａｂ結晶構造および専有のウサギＦａｂ結晶構造における結晶充填相互作用の目視検査は、定常ドメインベータストランド－ベータストランド結晶充填が一般的であることを示す（表Ｉ）。１９個の寄託されているウサギＦａｂ構造（Ｆａｂ複合体を含む）の６８％において、ＬＣ－ＬＣベータ相互作用が生じ、２つのＦａｂ分子にわたる連続的なベータシートを形成する（図１Ａ）。これらの構造の３分の１以上はまた、ＨＣ：ＨＣベータ充填相互作用を有する。全体として、構造の８４％は、定常ドメインのＧストランドにおいて何らかの種類のベータシート充填相互作用を形成する。社内の経験は類似しているが、ＨＣ：ＨＣおよびＬＣ：ＬＣの両方の結晶充填相互作用を有するＦａｂの例がより多く、ＨＣ：ＬＣ充填を有する例はより少ない（表Ｉおよび図１Ｂ）。ＨＣ：ＨＣおよびＬＣ：ＬＣの両方を形成するＦａｂの結晶、またはＨＣ：ＬＣ充填相互作用を形成するＦａｂの結晶は、定常ドメインの連続的なカラムを有し、各ドメインは典型的なＦａｂ ＨＣ：ＬＣ相互作用ならびに別のドメインとのベータシートを形成する。
ウサギＦａｂ結晶充填の分析およびヒト結晶化可能カッパの設計
３６個の公開されているウサギＦａｂ結晶構造および専有のウサギＦａｂ結晶構造における結晶充填相互作用の目視検査は、定常ドメインベータストランド－ベータストランド結晶充填が一般的であることを示す（表Ｉ）。１９個の寄託されているウサギＦａｂ構造（Ｆａｂ複合体を含む）の６８％において、ＬＣ－ＬＣベータ相互作用が生じ、２つのＦａｂ分子にわたる連続的なベータシートを形成する（図１Ａ）。これらの構造の３分の１以上はまた、ＨＣ：ＨＣベータ充填相互作用を有する。全体として、構造の８４％は、定常ドメインのＧストランドにおいて何らかの種類のベータシート充填相互作用を形成する。社内の経験は類似しているが、ＨＣ：ＨＣおよびＬＣ：ＬＣの両方の結晶充填相互作用を有するＦａｂの例がより多く、ＨＣ：ＬＣ充填を有する例はより少ない（表Ｉおよび図１Ｂ）。ＨＣ：ＨＣおよびＬＣ：ＬＣの両方を形成するＦａｂの結晶、またはＨＣ：ＬＣ充填相互作用を形成するＦａｂの結晶は、定常ドメインの連続的なカラムを有し、各ドメインは典型的なＦａｂ ＨＣ：ＬＣ相互作用ならびに別のドメインとのベータシートを形成する。
【表1】
【0033】
数十個のヒトＦａｂ構造の調査は、そのような相互作用を示さない。ヒトＦａｂ構造の、ウサギＦａｂへのアラインメントは、ヒトＣκドメイン中に存在するより長いＦＧループが、ベータシート充填相互作用を妨げる屈曲しバルジしているコンフォメーションを形成することを示す（図２Ａ）。このより長いＦＧループは、マウスＣκによって共有されるが、ウサギＣκドメインによっては（ラムダ定常ドメインＣλによっても）共有されない（図２Ｂ）。ウサギ充填相互作用に対してアラインしたヒトＦａｂの目視検査はまた、ヒトＣκリジン１２６（Ｋ１２６、Ｋａｂａｔ番号付け）が、ドメインの反対側のベータシート充填に対する障害であり得ることを示唆する（図２Ｃ）。
【0034】
ヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグ付きＦａｂフラグメントのいくつかのバリアントを、ＣκのＦＧループまたはＫ１２６を変異させることによって生成し、結晶化に対するその影響を試験する。ＦＧループの場合、これは、構造的に相同なＴおよびＶ（それぞれ、１９７位および２０５位、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）の間のセプタマーヒト配列ＨＱＧＬＳＳＰ（１９８位～２０４位、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を、五量体ウサギ配列ＱＧＴＴＳ（１９９位～２０３位、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）で置換することからなる。得られた変異体は、１９８位のヒスチジンおよび２０５位のプロリンの欠失により、２残基短く、本明細書においてΔＱＧＴＴＳΔ（１９８位～２０４位、Ｋａｂａｔ番号付けに従う、配列番号３を参照のこと）または「結晶カッパ」設計と称される。いくつかのバリアントにおいて、Ｋ１２６をアラニンに変異させる（Ｋ１２６Ａ、Ｋａｂａｔ番号付け、配列番号２、４、６を参照のこと）。
【0035】
結晶充填分析とは別に、Ｃ末端の鎖間ジスルフィドはＦａｂ構造においてほとんど秩序化されていないことが観察される。これは、コンフォメーションの不均一性に起因し得るかまたは不均一な酸化に起因し得る。これに対処するために、２つのバリアントを設計する。「ＧＥＰ＊」と呼ばれる１つのバリアントを、Ｃ末端カッパ鎖システインをプロリンに（Ｃ２１４Ｐ、Ｋａｂａｔ番号付けに従う、配列番号５または６を参照のこと）、ＩｇＧ４重鎖システイン１２７をアラニンに（Ｃ１２７Ａ、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）変異させることによりジスルフィド結合を除去することによって生成する。「ＥＳＫＣＧＧＨ６」と呼ばれる第２の設計を、カッパシステインをプロリンに変異させ（Ｃ２１４Ｐ、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）、Ｔｙｒ２２９をシステインに変異させることにより（Ｙ２２９Ｃ、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）重鎖のＣ末端に新たなジスルフィドパートナーを作製することによって生成する。
【0036】
Ｆａｂの結晶化
これらの変異を単独でまたは組み合わせでのいずれかで組み込む前後の２つのＦａｂ（Ｇ６およびデュピルマブ）の結晶化の結果を表ＩＩに示す。１つのＦａｂは、公開されているデュピルマブ（Ｄｕｐｉｘｅｎｔ（商標））配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／ｅｎｔｒｙ／Ｄ１０３５４で入手可能である）に由来する。第２のＦａｂは、細胞表面受容体に対する内部の発見努力の一部である。２つの９６ウェル結晶化スクリーニングを、同一に精製し、およそ１０ｍｇ／ｍｌに調整し、無関係なＦａｂ結晶でストリークシードした（核形成に起因する確率的差異を排除するために）Ｆａｂに使用し、同じ時点で分析する（９日）。両方の親Ｆａｂは、少しの条件で結晶性ヒットを生成し、デュピルマブＦａｂ結晶でさえ、２．０Åのデータセットおよび構造をもたらす。Ｋ１２６Ａ変異（表ＩＩ）もジスルフィドバリアントのいずれも（示さず）、有意により多くの結晶を伴う条件をもたらさない。最も劇的な差異は、ΔＱＧＴＴＳΔ ＦＧループ（すなわち、結晶カッパ設計）を組み込んだ際のものである。この設計を有するＦａｂは、Ｇ６ Ｆａｂについては１９２個のうちおよそ９０～１１４個の条件で、デュピルマブＦａｂについては１９２個のうちおよそ１１３～１３６個の条件で結晶をもたらす。これらのスクリーニングから直接回収した（すなわち、後のスクリーニングにおいて最適化していない）結晶は、高解像度のデータセットをもたらす（表ＩＩ）。最良のデュピルマブＦａｂは、ΔＱＧＴＴＳΔ単独（ＣＫ１．０）から１．４Åに回折し、最良のＧ６ Ｆａｂは、ΔＱＧＴＴＳΔ変異のＫ１２６Ａおよび鎖内ジスルフィドとの組み合わせ（ＣＫ１．５）から１．１５Åに回折する。
これらの変異を単独でまたは組み合わせでのいずれかで組み込む前後の２つのＦａｂ（Ｇ６およびデュピルマブ）の結晶化の結果を表ＩＩに示す。１つのＦａｂは、公開されているデュピルマブ（Ｄｕｐｉｘｅｎｔ（商標））配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／ｅｎｔｒｙ／Ｄ１０３５４で入手可能である）に由来する。第２のＦａｂは、細胞表面受容体に対する内部の発見努力の一部である。２つの９６ウェル結晶化スクリーニングを、同一に精製し、およそ１０ｍｇ／ｍｌに調整し、無関係なＦａｂ結晶でストリークシードした（核形成に起因する確率的差異を排除するために）Ｆａｂに使用し、同じ時点で分析する（９日）。両方の親Ｆａｂは、少しの条件で結晶性ヒットを生成し、デュピルマブＦａｂ結晶でさえ、２．０Åのデータセットおよび構造をもたらす。Ｋ１２６Ａ変異（表ＩＩ）もジスルフィドバリアントのいずれも（示さず）、有意により多くの結晶を伴う条件をもたらさない。最も劇的な差異は、ΔＱＧＴＴＳΔ ＦＧループ（すなわち、結晶カッパ設計）を組み込んだ際のものである。この設計を有するＦａｂは、Ｇ６ Ｆａｂについては１９２個のうちおよそ９０～１１４個の条件で、デュピルマブＦａｂについては１９２個のうちおよそ１１３～１３６個の条件で結晶をもたらす。これらのスクリーニングから直接回収した（すなわち、後のスクリーニングにおいて最適化していない）結晶は、高解像度のデータセットをもたらす（表ＩＩ）。最良のデュピルマブＦａｂは、ΔＱＧＴＴＳΔ単独（ＣＫ１．０）から１．４Åに回折し、最良のＧ６ Ｆａｂは、ΔＱＧＴＴＳΔ変異のＫ１２６Ａおよび鎖内ジスルフィドとの組み合わせ（ＣＫ１．５）から１．１５Åに回折する。
【表2】
【0037】
操作されたＦａｂの結晶構造
１１個の結晶形態を包含する、５９個のデータセットを、Ｇ６バリアントについて収集する。構造を７個について解析し、５個の結晶形態について精密化する：Ｐ２１２１２１ ４３×７５×１６５Åセル（５個の精密化された構造）、Ｐ４３２１２ ７７×７７×３３０（３）、Ｐ２１２１２１ ６６×７４×９１（１）、Ｐ１ ５３×６５×６７ ８５×７１×８４（１）、およびＣ２ ２０６×１０３×７０ β＝９２．７°（１）。１１個の結晶形態を包含する、４４個のデータセットを、デュピルマブＦａｂバリアントについて収集する。構造を４個について解析し、３個のデータセットについて精密化する：Ｐ２１ ５３×６６×１３５ β＝９１．６°（１）、Ｐ２１２１２１ ５９×７３×１０５（１）、Ｐ４３２１２ ７４×７４×１８５（１）。
１１個の結晶形態を包含する、５９個のデータセットを、Ｇ６バリアントについて収集する。構造を７個について解析し、５個の結晶形態について精密化する：Ｐ２１２１２１ ４３×７５×１６５Åセル（５個の精密化された構造）、Ｐ４３２１２ ７７×７７×３３０（３）、Ｐ２１２１２１ ６６×７４×９１（１）、Ｐ１ ５３×６５×６７ ８５×７１×８４（１）、およびＣ２ ２０６×１０３×７０ β＝９２．７°（１）。１１個の結晶形態を包含する、４４個のデータセットを、デュピルマブＦａｂバリアントについて収集する。構造を４個について解析し、３個のデータセットについて精密化する：Ｐ２１ ５３×６６×１３５ β＝９１．６°（１）、Ｐ２１２１２１ ５９×７３×１０５（１）、Ｐ４３２１２ ７４×７４×１８５（１）。
【0038】
親を含む、ΔＱＧＴＴＳΔなしのＦａｂバリアントの構造は、伸長したベータシート相互作用を有して充填しない。例えば、親デュピルマブＦａｂは、様々なタイプの相互作用を有して充填するが、連続的なベータシートを形成するものはない（図３Ａ）。一方、ΔＱＧＴＴＳΔ ＦＧループを有するＦａｂに由来するすべての構造は充填し、ＣκドメインのＧストランドとＣＨ１ドメインのＧストランドとの間にベータシートを形成する（図３Ｂおよび３Ｃ）。この相互作用は、ウサギＦａｂ結晶充填において見られるものと類似しているが、同一ではない。これは、図１Ｂに見られるものと同じストランドを含むが、より広範であり、図１Ａに見られるＨ：ＨまたはＬ：Ｌ相互作用のように両側に７個の残基を含む。このベータシートの疑似対称中心は、Ｃκ Ｖ２０８（２０５位、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）とＣＨ１ Ｖ２１９（Ｋａｂａｔ番号付け）との間にある。
【0039】
Ｋ１２６Ａ変異は、結晶充填または回折品質に影響を与えないようである。Ｇ６ Ｆａｂについての最高解像度の構造はこの変異を組み込むが、変異の影響は体系的でない。例えば、デュピルマブＦａｂについての最高解像度の構造は、ＦＧループ変異ΔＱＧＴＴＳΔのみを組み込む。ジスルフィド除去（Ｃ１２７Ａ＋ＧＥＰ＊）も鎖内ジスルフィド（ＥＳＫＣ＋ＧＥＰ＊）も、結晶充填または回折に影響を与えないようである。鎖内ジスルフィドが秩序化された構造が取得される。この領域における温度因子は、鎖間ジスルフィドが秩序化された他の構造において見られるように、平均よりも高い。
【0040】
Ｆａｂ：抗原複合体の結晶化
結晶化変異をＦａｂ：抗原複合体に適用する。Ｇ６ Ｆａｂの場合、ＦａｂのＣＫ１．５バリアントを利用する。なぜなら、それは、Ｆａｂ単独のように最良に回折したからである。デュピルマブＦａｂおよび他の４つの複合体については、ＣＫ１．０（すなわち、ΔＱＧＴＴＳΔのみ）を利用する。すべてのＣＨ１ドメインは、ＩｇＧ４であり、同じＣ末端ヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグを有する（配列番号７）。親複合体（すなわち、Ｆａｂに適用された結晶化操作なしの抗原：Ｆａｂ複合体）はいずれも、用いた限られたスクリーニングおよび時間枠で結晶を生成しない（表ＩＩＩ）。すべての操作された複合体は、結晶を生成する（Ｇ６受容体複合体についての４個の条件（１９２個のうち）からＨ４受容体複合体についての８７個の条件まで）（図４Ｃおよび表ＩＩＩ）。６個の複合体のうち４個は、大部分がより低い解像度で、構造をもたらす。ＧＩＴＲ複合体結晶は、構造を解析する際に実際はＦａｂ単独であり、ＴＩＧＩＴ複合体結晶は、データセットをもたらすのに十分には良好に回折しない。デュピルマブおよびセクキヌマブの両方についての結晶は、それらのそれぞれの３および３．２Åの解像度に到達するための最適化を必要とする（図４Ａ～４Ｂ）。最初のスクリーニングからの結晶は、前者の場合は５Åに回折し、後者についてはまったく回折しない。
結晶化変異をＦａｂ：抗原複合体に適用する。Ｇ６ Ｆａｂの場合、ＦａｂのＣＫ１．５バリアントを利用する。なぜなら、それは、Ｆａｂ単独のように最良に回折したからである。デュピルマブＦａｂおよび他の４つの複合体については、ＣＫ１．０（すなわち、ΔＱＧＴＴＳΔのみ）を利用する。すべてのＣＨ１ドメインは、ＩｇＧ４であり、同じＣ末端ヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグを有する（配列番号７）。親複合体（すなわち、Ｆａｂに適用された結晶化操作なしの抗原：Ｆａｂ複合体）はいずれも、用いた限られたスクリーニングおよび時間枠で結晶を生成しない（表ＩＩＩ）。すべての操作された複合体は、結晶を生成する（Ｇ６受容体複合体についての４個の条件（１９２個のうち）からＨ４受容体複合体についての８７個の条件まで）（図４Ｃおよび表ＩＩＩ）。６個の複合体のうち４個は、大部分がより低い解像度で、構造をもたらす。ＧＩＴＲ複合体結晶は、構造を解析する際に実際はＦａｂ単独であり、ＴＩＧＩＴ複合体結晶は、データセットをもたらすのに十分には良好に回折しない。デュピルマブおよびセクキヌマブの両方についての結晶は、それらのそれぞれの３および３．２Åの解像度に到達するための最適化を必要とする（図４Ａ～４Ｂ）。最初のスクリーニングからの結晶は、前者の場合は５Åに回折し、後者についてはまったく回折しない。
【表3】
【0041】
セクキヌマブ：ＩＬ１７複合体は低解像度であるが回折する結晶を生成することから、それをＣＨ１ドメインアイソタイプおよびＣ末端のさらなる比較のために選択する。５残基短く、配列ＤＫＲＶＥＳＫで終わるＩｇＧ４バージョン（タグなし、配列番号１１）、ＤＫＲＶＨ６で終わるもの（タグ付き、配列番号１２）、およびＨ６タグあり（配列番号１０）またはＨ６タグなし（配列番号９）の配列ＫＳＣで終わるＩｇＧ１バージョンの４つの新たな構築物を作製する。これらを、以前のように１０ｍｇ／ｍｌで、また５ｍｇ／ｍｌで、精製およびスクリーニングする。より短いＩｇＧ４バージョンは、元よりも少ない結晶を生成する（元のタグ付きバージョンについての５４個に対して、タグ付きについては２４個、タグなしについては１８個）。ＩｇＧ１バージョンは、同様の数の結晶を伴う条件を与える（元についての５４個に対して、タグ付きは８８個、タグなしは４３個）。１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ４タグ付きバージョンは、最初は回折しないが最適化後に３．２Åをもたらす親のように、４．２Åに回折する。一方、１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ１タグ付きバージョンは、最初のスクリーニングから直接２．７Åのデータセットをもたらし、５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ１タグなしバージョンは、最初のスクリーニングから２．４Åのデータセットをもたらす。
【0042】
カラム画分結晶化（ＣＦＣ）
操作されたＦａｂの堅固な結晶化は、カラム画分から直接の結晶化を可能にする。Ｇ６ ＦａｂのΔＱＧＴＴＳΔバリアントは、カラム画分から直接結晶化したときに、精製および濃縮されたサンプルと同じ結晶形態を１０ｍｇ／ｍｌで生成する（図５Ａ～５Ｃ）。ＣＦＣ構造は、２．４Åの相当な解像度にある（１．４Åに対して）。
操作されたＦａｂの堅固な結晶化は、カラム画分から直接の結晶化を可能にする。Ｇ６ ＦａｂのΔＱＧＴＴＳΔバリアントは、カラム画分から直接結晶化したときに、精製および濃縮されたサンプルと同じ結晶形態を１０ｍｇ／ｍｌで生成する（図５Ａ～５Ｃ）。ＣＦＣ構造は、２．４Åの相当な解像度にある（１．４Åに対して）。
【0043】
本明細書に記載の設計は、いくつかのターゲットに適用され、匹敵するアイソタイプおよびＣ末端を利用し、同じ精製、結晶化および結晶回収手順を使用し（可能な限り並行して）、核形成の変動を減らすために結晶シーディングを利用し、同じ経過時間で結晶化実験を評価し、同じ科学者にすべての実験にわたって精製および結晶化を実施させた。
【0044】
バリアントＣκドメイン（ΔＱＧＴＴＳΔ）は、ヒトＦａｂについて結晶化の頻度を５０倍改善した。Ｇ６親Ｆａｂ（完全ヒト）は、１つのみの条件で結晶をもたらすが、ΔＱＧＴＴＳΔを含有するＧ６バリアントは、およそ９０～１１４個の条件で結晶をもたらす。デュピルマブ親Ｆａｂは、４個の条件で結晶をもたらすが、ΔＱＧＴＴＳΔを含有するデュピルマブバリアントは、およそ１１３～１３６個の条件で結晶をもたらす。さらに、Ｃκドメインの改変ＦＧループ（「結晶化可能カッパ（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ Ｋａｐｐａ」」または「結晶カッパ」）は、Ｆａｂ：抗原複合体の結晶化を可能にするが、改善倍率を計算することはできない。なぜなら、結晶カッパ設計なしで結晶をもたらすものはないからである。大部分の結晶カッパバージョンは、複合体について３０～９０個の結晶化条件をもたらす（注：統計は、１つの比較的控えめな時点での２つのプレートからのものである）。
【0045】
Ｆａｂの結果と比較すると、複合体についての結果は希望を与えるものではない。結晶カッパを使用する複合体はすべて結晶を生成し、これはあらゆる努力に対する著しい利点であるが、６個のうち４個のみが、解析および精密化をするために十分に良好な複合体データセットをもたらし、これらはより低い解像度に向かう傾向がある。１つ（ｈ２１５５＋ＧＩＴＲ）は、Ｆａｂ単独の結晶を生成する。
【0046】
ヒトＩＬ４Ｒと複合体形成したデュピルマブＦａｂの３．０Åの構造は、ＩＬ４およびＩＬ１３の結合と実質的に重複するエピトープを示し、これは、そのブロッキング活性を説明する（図４Ａ）。エピトープの中心部分はＣＤループであり（Ｕｌ－Ｈａｑ ２０１６）、これは、なぜデュピルマブがこの領域において非常に異なる配列を有するカニクイザルＩＬ４Ｒとの交差反応性を有しないかを説明する（Ｌ６７Ｌ６８対Ｑ６７Ｓ６８）。３．０ÅのセクキヌマブＩＬ１７複合体（およびその２．４Åの改善された構造）は、両方のＩＬ１７鎖の各Ｆａｂ結合部分である、不連続なエピトープでＩＬ１７二量体に結合した２つのＦａｂを示す（図４Ｂ）。Ｈ４複合体は、非対称ユニットにおいて３つのＦａｂと結晶充填配置をもたらす（示さず）。Ｆａｂの１つは、ＣＫ設計に典型的な２つのＨＣ：ＬＣベータ充填相互作用を形成する。別のＦａｂは、ＬＣ側に１つを形成し、ＨＣ側には何も形成しない。そして、第３のＦａｂは、第２のものとＨＣ：ＬＣ相互作用を形成し、そのＬＣは、ＬＣ：ＬＣベータ充填相互作用を形成する。これは、そのような相互作用が見られた唯一のものである。
【0047】
セクキヌマブ構築物の追加の精密化は、ＩｇＧ４構築物のＣ末端を短縮させ、初めてＩｇＧ１バージョンを含み、Ｈ６タグ付きバージョン対タグなしバージョンの比較をした。回収目的のために結晶をより混雑しないようにするために、１０ｍｇ／ｍｌを５ｍｇ／ｍｌと比較する。このシリーズにおいて、ＩｇＧ１バージョンは、ＩｇＧ４よりも良好に挙動し、タグ付き（１０ｍｇ／ｍｌの）バージョンについては２．７Åのデータセットを、タグなしＦａｂ（５ｍｇ／ｍｌの）バージョンについては２．４Åのデータセットを直接的にもたらし、一方、ＣＫ１．０構築物からの３．０Åのデータセットは、多数の結晶の最適化およびスクリーニングの後に取得される。興味深いことに、Ｇ１、Ｇ４（２つのバージョン）（タグ付きおよびタグなし）はすべて同形の結晶を生成する。
【0048】
結晶化の速度に関して、記載されるすべての結晶は１週間以内に成長し、より頻繁にチェックしたものについては、結晶は数時間以内に出現する。濃度に関して、カラム画分結晶化実験は、少なくともＦａｂ単独について、０．１ｍｇ／ｍｌほど希薄なサンプルから結晶を取得することが可能であることを示す。必要とされる濃度についての意義に加えて、ＣＦＣは他の潜在的な利点を有する。例えば、カラムピークの前縁におけるタンパク質の特性は、おそらく後縁とは異なり、一方または他方が構造を決定することにおいてより生産的であり得る。ＣＦＣ実験と、Ｆａｂが高濃度で結晶化条件の半分以上で結晶化するという事実とは、Ｆａｂについて、結晶カッパ設計が、スクリーニング条件の劇的に単純化されたセットを可能にするはずであることを示唆する。
【0049】
結論として、ＦａｂおよびＦａｂ：抗原複合体について結晶形成の頻度を劇的に改善し、Ｆａｂ（およびＦａｂ：ペプチド複合体）について高解像度の構造をもたらし、大部分の場合に、Ｆａｂ：タンパク質複合体の少なくとも低解像度のデータセットおよび構造もたらし得る、ヒト定常カッパドメインの結晶化可能なバリアント（バリアントＣκ）が本明細書で提供される。結晶カッパ設計は、ひと握りの条件のスクリーニングにおける希薄なサンプルからの一晩の結晶化を可能にするようである。結晶カッパ設計は、より小さなスクリーニングおよびより少ないタンパク質を使用してさえもＦａｂ構造決定を堅固にし、困難なターゲットとのＦａｂシャペロン複合体を含む、複合体構造決定を加速するはずである。
【0050】
材料および方法
操作および分子生物学
ウサギＦａｂ結晶充填の分析を、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａｂａｎｋおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙの専有構造データベースにおいて利用可能な構造を利用してＰｙｍｏｌにおいて行う。様々な種からのＬＣ定常ドメインのアラインメントは、ＢＬＡＳＴを利用する。デュピルマブおよびセクキヌマブの可変ドメインのアミノ酸配列を、ｔｈｅ Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓウェブサイト（ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ、Ｋａｎｅｈｉｓａ ２０００）、エントリーＤ１０３５４およびＤ０９９６７から取得する。ｈ２１５５およびｈ２２Ｇ２の配列を、特許ＵＳ２０１３１０８６４１およびＵＳ２０１６１７６９６３から取得する。発現ベクターを、対応するＤＮＡフラグメントをｇｂｌｏｃｋとして合成し（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）、標準的な技術を使用して哺乳動物発現ベクター中にクローニングすることによって作製する。
操作および分子生物学
ウサギＦａｂ結晶充填の分析を、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａｂａｎｋおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙの専有構造データベースにおいて利用可能な構造を利用してＰｙｍｏｌにおいて行う。様々な種からのＬＣ定常ドメインのアラインメントは、ＢＬＡＳＴを利用する。デュピルマブおよびセクキヌマブの可変ドメインのアミノ酸配列を、ｔｈｅ Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓウェブサイト（ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ、Ｋａｎｅｈｉｓａ ２０００）、エントリーＤ１０３５４およびＤ０９９６７から取得する。ｈ２１５５およびｈ２２Ｇ２の配列を、特許ＵＳ２０１３１０８６４１およびＵＳ２０１６１７６９６３から取得する。発現ベクターを、対応するＤＮＡフラグメントをｇｂｌｏｃｋとして合成し（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）、標準的な技術を使用して哺乳動物発現ベクター中にクローニングすることによって作製する。
【0051】
発現および精製
Ｆａｂおよび抗原ＥＣＤを、哺乳動物細胞培養ＣＨＯ細胞において発現させる。タンパク質含有細胞培養上清を回収し、清澄化した培地を、結合バッファーとしてＰＢＳバッファー＋１５ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．５を使用するＨｉｓ Ｔｒａｐ（商標）Ｅｘｃｅｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製する。次いで、タンパク質を、ＰＢＳ＋０．３Ｍイミダゾール、ｐＨ７．４中の１０カラム体積勾配溶出で溶出する。溶出液を収集し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １０ＫＤａスピンコンセントレーターを使用して濃縮する。濃縮ＩＭＡＣプールを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５またはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかのカラムにロードする。タンパク質を、結晶化トレー用に１０ｍｇ／ｍｌに再度濃縮する。
Ｆａｂおよび抗原ＥＣＤを、哺乳動物細胞培養ＣＨＯ細胞において発現させる。タンパク質含有細胞培養上清を回収し、清澄化した培地を、結合バッファーとしてＰＢＳバッファー＋１５ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．５を使用するＨｉｓ Ｔｒａｐ（商標）Ｅｘｃｅｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製する。次いで、タンパク質を、ＰＢＳ＋０．３Ｍイミダゾール、ｐＨ７．４中の１０カラム体積勾配溶出で溶出する。溶出液を収集し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １０ＫＤａスピンコンセントレーターを使用して濃縮する。濃縮ＩＭＡＣプールを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５またはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかのカラムにロードする。タンパク質を、結晶化トレー用に１０ｍｇ／ｍｌに再度濃縮する。
【0052】
タンパク質を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって特徴付ける（データは示さず）。
【0053】
結晶化および構造決定
すべてのサンプルを５～１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｌａｓｓｉｃｓ ＩＩおよびＰＥＧ結晶化スクリーニングを使用して、１：１の比率で蒸気拡散シッティングドロップ中室温に調整する。ドロップを、Ｆａｂ結晶化のための関連するＦａｂ結晶シード、および複合体結晶化のための複合体結晶シードと直ちにクロスシード（ｃｒｏｓｓ ｓｅｅｄ）する。結晶化トレーの画像を、１日目、４日目、および９日目に撮影する。液体窒素中で凍結する前に、結晶を、追加の１０％のその結晶化ウェルにおいて使用される沈殿剤および２５％のグリセロールを補充したウェル溶液、または、それが凍結保護に十分な濃度の凍結保護品質の沈殿剤（ＰＥＧ ４００、ＰＥＧ ＭＭＥ ５５０、ＰＥＧ ＭＭＥ ２Ｋなど）を含む場合は、母液のいずれかからなる凍結防止剤溶液に移す。
すべてのサンプルを５～１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｌａｓｓｉｃｓ ＩＩおよびＰＥＧ結晶化スクリーニングを使用して、１：１の比率で蒸気拡散シッティングドロップ中室温に調整する。ドロップを、Ｆａｂ結晶化のための関連するＦａｂ結晶シード、および複合体結晶化のための複合体結晶シードと直ちにクロスシード（ｃｒｏｓｓ ｓｅｅｄ）する。結晶化トレーの画像を、１日目、４日目、および９日目に撮影する。液体窒素中で凍結する前に、結晶を、追加の１０％のその結晶化ウェルにおいて使用される沈殿剤および２５％のグリセロールを補充したウェル溶液、または、それが凍結保護に十分な濃度の凍結保護品質の沈殿剤（ＰＥＧ ４００、ＰＥＧ ＭＭＥ ５５０、ＰＥＧ ＭＭＥ ２Ｋなど）を含む場合は、母液のいずれかからなる凍結防止剤溶液に移す。
【0054】
構造決定回折データセットを、以下のソースで収集する：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅのＬｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅａｍ（ＬＲＬ－ＣＡＴ）Ｂｅａｍｌｉｎｅ ３１－ＩＤ（Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅのＢｅａｍｌｉｎｅ ＡＬＳ－５０２（Ｂｅｒｋｌｅｙ，ＣＡ）、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅのＢｅａｍｌｉｎｅ Ｉ０４－１（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）。データを、ＭＯＳＦＬＭ（Ｌｅｓｌｉｅ ＡＧＷ＆Ｐｏｗｅｌｌ ＨＲ．Ｉｎ：Ｒｅａｄ ＲＪ，＆Ｓｕｓｓｍａｎ ＪＬ（Ｅｄｓ．），Ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ：ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐａｔｈ ｔｏ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＢＲＮ Ａｇｅｎｔｓ．Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．２００７）およびＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ｗｉｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４）：２３５－４２）を使用して統合および縮小する。最初の分子置換ソリューションを、Ｐｈａｓｅｒ（ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ）（ＭｃＣｏｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，２００７．４０（Ｐｔ ４）：６５８－６７４）を使用して取得する。モデルを、ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１０．６６（Ｐｔ ４）：４８６－５０１）を使用して構築し、Ｒｅｆｍａｃ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４））：３５５－６７）またはＢｕｓｔｅｒ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，ｅｔ ａｌ．ＢＵＳＴＥＲバージョン２．１１．５．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ：Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ．２０１１）を使用して精密化し、内部で開発したプロトコルを使用して検証する。
【0055】
実施例２：完全長モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結晶化およびＸ線構造決定
Ｆａｂフラグメントに加えて、結晶カッパ設計を利用して、以下のように完全長ＩｇＧ抗体を結晶化し得る。抗体の軽鎖を、標準的な分子生物学技術を使用して標準的な発現ベクター中で結晶カッパ設計を用いて改変する。次いで、軽鎖を、対応する重鎖とともに、抗体を分泌するのに適切な発現システム、例えば、ＨＥＫ２９３またはチャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させる。次いで、抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたカラム精製などの技術を使用して培地から精製し、例えば、５ｍｇ／ｍｌに濃縮する。次いで、蒸気拡散の方法を利用して、精製抗体からのタンパク質結晶の成長のための条件をスクリーニングする。次いで、結晶を、単離、移送および凍結し、その後、Ｘ線データを収集する。次いで、標準的な技術を使用して、分子置換によって、例えばソフトウェアＰｈａｓｅｒを使用し、次いで原子モデルを精密化して、構造をそのデータから決定し得る。
Ｆａｂフラグメントに加えて、結晶カッパ設計を利用して、以下のように完全長ＩｇＧ抗体を結晶化し得る。抗体の軽鎖を、標準的な分子生物学技術を使用して標準的な発現ベクター中で結晶カッパ設計を用いて改変する。次いで、軽鎖を、対応する重鎖とともに、抗体を分泌するのに適切な発現システム、例えば、ＨＥＫ２９３またはチャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させる。次いで、抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたカラム精製などの技術を使用して培地から精製し、例えば、５ｍｇ／ｍｌに濃縮する。次いで、蒸気拡散の方法を利用して、精製抗体からのタンパク質結晶の成長のための条件をスクリーニングする。次いで、結晶を、単離、移送および凍結し、その後、Ｘ線データを収集する。次いで、標準的な技術を使用して、分子置換によって、例えばソフトウェアＰｈａｓｅｒを使用し、次いで原子モデルを精密化して、構造をそのデータから決定し得る。
【0056】
１つの抗体構造は、結晶カッパ設計を、ＩｇＧ４－Ｐ（Ｓ２４１Ｐ（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）、またはＳ２２８Ｐ（ＥＵインデックス番号付けに従う）を有するＩｇＧ４）アイソタイプ抗体のカッパ軽鎖に組み込むことから得られた。２１℃での９６ウェルスクリーニング（ＣｏｍＰＡＳ，Ｑｉａｇｅｎ）から、１８％エタノール＋１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含むいくつかの条件が結晶をもたらした。これらの条件を最適化することによって、回折する結晶および４Åのデータセットを、２０％エタノール、２１℃から取得した。このデータセットの分子置換ソリューションは、完全長抗体の構造（２つの重鎖、２つの軽鎖およびグリコシル化）をもたらし、そのコンフォメーションは、２つの既知のヒトＩｇＧ４構造（５ＤＫ３．ｐｄｂおよび６ＧＦＥ．ｐｄｂ）のコンフォメーションとは著しく異なっており、既知のヒトＩｇＧ１構造（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）により類似している。結晶カッパ設計は、抗体における他の接触点と同様に、結晶充填に寄与した。
【0057】
図６Ａ～６Ｂは、完全長ｍＡｂの結晶化および構造決定を示す。図６Ａは、完全長ｍＡｂの結晶を示す画像である。図６Ｂは、得られた構造のリボンダイアグラムであり、抗体重鎖を黒色で（棒で示すＦｃグリコシル化を含む）、抗体軽鎖を淡灰色で示す。
【0058】
実施例３：融合タンパク質の生成によるＦａｂ：抗原ペプチド複合体の結晶化
その抗原ペプチドとの複合体中のＦａｂの結晶構造決定を、２つの方法で達成し得る。第１に、そしてより典型的には、抗原ペプチドを、購入し得るか、または種々の技術を使用して調製し得る（Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ Ｓ，Ｓｉｍｅｒｓｋａ Ｐ，Ｔｏｔｈ Ｉ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１３ Ａｐｒ １２；１８（４）：４３７３－８８）。次いで、このペプチドを可溶化し、モルでのＦａｂの濃度に等しいかまたはそれを超える最終濃度でＦａｂに添加し得る。次いで、結晶カッパ Ｆａｂ単独についてと同様に、複合体の結晶化および構造決定を達成する。第２の技術（これは、ペプチドを購入する必要性を取り除く）は、ペプチドのコード配列を、Ｆｄまたはカッパ軽鎖のいずれかのオープンリーディングフレーム中に直接挿入して、Ｆａｂ発現ベクターの構築の間にペプチドとＦｄ／カッパ軽鎖との間に適切なリンカーを有する融合タンパク質を生成することである。次いで、融合タンパク質において、ペプチドは、正確な１対１の化学量論で、リンカーによってＦａｂに繋ぎ止められる。繋ぎ止めはまた、ペプチドの有効濃度を増加させ、低親和性ペプチドが結晶または得られる構造において出現しない状況を回避するという利点を有する。繋ぎ止めは、結晶中の抗原ペプチドの存在を保証する。
その抗原ペプチドとの複合体中のＦａｂの結晶構造決定を、２つの方法で達成し得る。第１に、そしてより典型的には、抗原ペプチドを、購入し得るか、または種々の技術を使用して調製し得る（Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ Ｓ，Ｓｉｍｅｒｓｋａ Ｐ，Ｔｏｔｈ Ｉ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１３ Ａｐｒ １２；１８（４）：４３７３－８８）。次いで、このペプチドを可溶化し、モルでのＦａｂの濃度に等しいかまたはそれを超える最終濃度でＦａｂに添加し得る。次いで、結晶カッパ Ｆａｂ単独についてと同様に、複合体の結晶化および構造決定を達成する。第２の技術（これは、ペプチドを購入する必要性を取り除く）は、ペプチドのコード配列を、Ｆｄまたはカッパ軽鎖のいずれかのオープンリーディングフレーム中に直接挿入して、Ｆａｂ発現ベクターの構築の間にペプチドとＦｄ／カッパ軽鎖との間に適切なリンカーを有する融合タンパク質を生成することである。次いで、融合タンパク質において、ペプチドは、正確な１対１の化学量論で、リンカーによってＦａｂに繋ぎ止められる。繋ぎ止めはまた、ペプチドの有効濃度を増加させ、低親和性ペプチドが結晶または得られる構造において出現しない状況を回避するという利点を有する。繋ぎ止めは、結晶中の抗原ペプチドの存在を保証する。
【0059】
Ｆａｂ：抗原ペプチド複合体を、抗タウ抗体Ｌ１４Ｈ１８（ＷＯ２０１７／００５７３４）およびその同族タウペプチド抗原について以下のように取得した。既知のエピトープ、ＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭ（配列番号１８）を包含するタウペプチド（アミノ酸２３１～２５０）を、それらの２７個のアミノ酸に翻訳するＤＮＡ配列を、オープンリーディングフレームのシグナル配列とＦａｂ鎖の成熟開始との間に組み込むことによって、Ｌ１４Ｈ１８ ＦａｂのＦｄ－Ｈｉｓ６または結晶カッパ軽鎖のいずれかのＮ末端に、ＧＳリンカー（配列番号１９）を用いて融合した。タウペプチド－リンカー－Ｆｄ－Ｈｉｓ／結晶カッパ軽鎖バージョンおよびＦｄ－Ｈｉｓ／タウペプチド－リンカー－結晶カッパ軽鎖バージョンの両方を、ＣＨＯ細胞において発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過によって精製し、４．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、市販のスクリーニングにおいて結晶化した。数十個の条件が、ＣｌａｓｓｉｃおよびＰＥＧスクリーニング（Ｑｉａｇｅｎ）において両方のバージョンについて結晶を生成した。結晶カッパ融合物について、２０％ＰＥＧ ３３５０／２００ｍＭ酒石酸カリウムナトリウムからの１．２２Åの構造、および１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．６／２５％ＰＥＧ ４０００／２００ｍＭ硫酸アンモニウムからの２．３Åの構造の２つの複合体構造を解析および精密化した。構造の両方は、ＦａｂのＣＤＲに結合した１つのヘリカルターンを有する大部分が伸長されたペプチドを示し、リンカー部分における秩序の程度でのみ異なった。
【0060】
図７Ａ～７Ｂは、タウペプチド－Ｆａｂ複合体の結晶化を示す。図７Ａは、４時間後の、タウペプチドに融合したＬ１４Ｈ１８の結晶カッパ軽鎖の結晶を示す画像である。図７Ｂは、Ｆａｂ軽鎖（灰色）のＮ末端への大部分が秩序化されたＧＳリンカーを用いて、Ｌ１４Ｈ１８ Ｆａｂに結合したタウペプチド（白色）の得られた２．３Åの構造のリボンダイアグラムである。Ｆａｂ重鎖を黒色で示す。
【0061】
配列表
野生型ヒトカッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃκ）アミノ酸配列（配列番号１）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ヒトＣκ Ｋ１２６Ａバリアントアミノ酸配列（配列番号２）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＡＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ヒトＣκ ΔＱＧＴＴＳΔバリアントアミノ酸配列（配列番号３）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＱＧＴＴＳＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ヒトＣκ Ｋ１２６Ａ ΔＱＧＴＴＳΔバリアントアミノ酸配列（配列番号４）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＡＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＱＧＴＴＳＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ヒトＣκ ΔＱＧＴＴＳΔ ＧＥＰ＊バリアントアミノ酸配列（配列番号５）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＱＧＴＴＳＶＴＫＳＦＮＲＧＥＰ
ヒトＣκ Ｋ１２６Ａ ΔＱＧＴＴＳΔ ＧＥＰ＊バリアントアミノ酸配列（配列番号６）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＡＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＱＧＴＴＳＶＴＫＳＦＮＲＧＥＰ
ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインＥＳＫＹＧＨ６バリアントアミノ酸配列（配列番号７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＨＨＨＨＨＨ
ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインＥＳＫＹＧＨ６ Ｃ１２７Ａバリアントアミノ酸配列（配列番号８）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＨＨＨＨＨＨ
野生型ヒトＩｇＧ１タグなしＣＨ１ドメインアミノ酸配列（配列番号９）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ
ヒトＩｇＧ１タグ付きＣＨ１ドメインアミノ酸配列（配列番号１０）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＨＨＨＨＨＨ
ヒトＩｇＧ４タグなしＣＨ１ドメイン（配列番号１１）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫ
ヒトＩｇＧ４タグ付きＣＨ１ドメイン（配列番号１２）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＨＨＨＨＨＨ
野生型マウスＣκアミノ酸配列（配列番号１３）
ＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
野生型ウサギＣκアミノ酸配列（配列番号１４）
ＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
野生型ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン（Ｃλ）アミノ酸配列（配列番号１５）
ＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
野生型マウスＣλアミノ酸配列（配列番号１６）
ＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＥＴＮＫＡＴＬＶＣＴＩＴＤＦＹＰＧＶＶＴＶＤＷＫＶＤＧＴＰＶＴＱＧＭＥＴＴＱＰＳＫＱＳＮＮＫＹＭＡＳＳＹＬＴＬＴＡＲＡＷＥＲＨＳＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＨＴＶＥＫＳＬＳＲＡＤＣＳ
野生型ウサギＣλアミノ酸配列（配列番号１７）
ＱＰＡＶＴＰＳＶＩＬＦＰＰＳＳＥＥＬＫＤＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＲＴＶＫＶＮＷＫＡＤＧＮＳＶＴＱＧＶＤＴＴＱＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＦＬＨＬＴＡＮＱＷＫＳＹＱＳＶＴＣＱＶＴＨＥＧＨＴＶＥＫＳＬＡＰＡＥＣＳ
タウペプチド（配列番号１８）
ＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭ
ＧＳリンカー（配列番号１９）
ＧＧＧＳＧＧＧ
野生型ヒトカッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃκ）アミノ酸配列（配列番号１）
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ヒトＣκ Ｋ１２６Ａバリアントアミノ酸配列（配列番号２）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＡＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ヒトＣκ ΔＱＧＴＴＳΔバリアントアミノ酸配列（配列番号３）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＱＧＴＴＳＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ヒトＣκ Ｋ１２６Ａ ΔＱＧＴＴＳΔバリアントアミノ酸配列（配列番号４）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＡＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＱＧＴＴＳＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ヒトＣκ ΔＱＧＴＴＳΔ ＧＥＰ＊バリアントアミノ酸配列（配列番号５）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＱＧＴＴＳＶＴＫＳＦＮＲＧＥＰ
ヒトＣκ Ｋ１２６Ａ ΔＱＧＴＴＳΔ ＧＥＰ＊バリアントアミノ酸配列（配列番号６）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＡＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＱＧＴＴＳＶＴＫＳＦＮＲＧＥＰ
ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインＥＳＫＹＧＨ６バリアントアミノ酸配列（配列番号７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＨＨＨＨＨＨ
ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインＥＳＫＹＧＨ６ Ｃ１２７Ａバリアントアミノ酸配列（配列番号８）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＨＨＨＨＨＨ
野生型ヒトＩｇＧ１タグなしＣＨ１ドメインアミノ酸配列（配列番号９）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ
ヒトＩｇＧ１タグ付きＣＨ１ドメインアミノ酸配列（配列番号１０）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＨＨＨＨＨＨ
ヒトＩｇＧ４タグなしＣＨ１ドメイン（配列番号１１）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫ
ヒトＩｇＧ４タグ付きＣＨ１ドメイン（配列番号１２）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＨＨＨＨＨＨ
野生型マウスＣκアミノ酸配列（配列番号１３）
ＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
野生型ウサギＣκアミノ酸配列（配列番号１４）
ＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
野生型ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン（Ｃλ）アミノ酸配列（配列番号１５）
ＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
野生型マウスＣλアミノ酸配列（配列番号１６）
ＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＥＴＮＫＡＴＬＶＣＴＩＴＤＦＹＰＧＶＶＴＶＤＷＫＶＤＧＴＰＶＴＱＧＭＥＴＴＱＰＳＫＱＳＮＮＫＹＭＡＳＳＹＬＴＬＴＡＲＡＷＥＲＨＳＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＨＴＶＥＫＳＬＳＲＡＤＣＳ
野生型ウサギＣλアミノ酸配列（配列番号１７）
ＱＰＡＶＴＰＳＶＩＬＦＰＰＳＳＥＥＬＫＤＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＲＴＶＫＶＮＷＫＡＤＧＮＳＶＴＱＧＶＤＴＴＱＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＦＬＨＬＴＡＮＱＷＫＳＹＱＳＶＴＣＱＶＴＨＥＧＨＴＶＥＫＳＬＡＰＡＥＣＳ
タウペプチド（配列番号１８）
ＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭ
ＧＳリンカー（配列番号１９）
ＧＧＧＳＧＧＧ
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【配列表】