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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-08
(45)【発行日】2023-12-18
(54)【発明の名称】エピジェネティックに調節される部位特異的ヌクレアーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20231211BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231211BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20231211BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20231211BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20231211BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231211BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20231211BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20231211BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/09 100
A61K48/00
A61K38/46
A61K47/64
A61K35/74 D
A61K47/68
C12N15/55 ZNA
C12N9/16 Z
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2019520038
(86)(22)【出願日】2017-10-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-12-05
(86)【国際出願番号】 US2017056738
(87)【国際公開番号】W WO2018071892
(87)【国際公開日】2018-04-19
【審査請求日】2020-09-28
(31)【優先権主張番号】62/408,645
(32)【優先日】2016-10-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】592017633
【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ジェイ．キース
(72)【発明者】
【氏名】ゲールケ，ジェーソン マイケル
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１２３５７８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００３／００１７１４９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１１５３５５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Cell, 2016 Sep 22, vol. 167, no. 1, pp. 233-247
【文献】Oncotarget, 2016 Jun 23, vol. 7, no. 29, pp. 46545-46556
【文献】Nat Biotechnol, 2016 Oct (Epub 2016 Aug 29), vol. 34, no. 10, pp. 1060-1065
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞のゲノムを修飾するエキソビボまたはインビトロの方法であって、前記方法は、融合タンパク質を前記細胞において発現させること、または前記細胞を前記融合タンパク質と接触させることを含み、
前記融合タンパク質が、以下：
（ａ）(i) ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦ ＤＢＤ）もしくは
(ii)ＴＡＬ ＤＮＡ結合アレイ
と融合された、Ｒ１０１５に変異を含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）ヌクレアーゼ、または
（ｂ） 内因性転写因子（ＴＦ）かもしくは内因性の翻訳後ヒストン修飾かに対して親和性を有する操作親和性タンパク質（ＡＰ）と連結された、少なくともＲ６６１およびＱ６９５に変異を有する化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼ
を含むものであり、
部分（ａ）の前記ＳａＣａｓ９または部分（ｂ）の前記ＳｐＣａｓ９は、切断活性を保っているが標的部位を効率的に切断できない、
方法。
【請求項2】
前記融合タンパク質が部分（ｂ）を含み、前記ＡＰが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載のエキソビボまたはインビトロの方法。
【請求項3】
前記融合タンパク質が部分（ｂ）を含み、前記方法が、ガイドＲＮＡの存在下で行われる、請求項１に記載のエキソビボまたはインビトロの方法。
【請求項4】
前記部分（ｂ）のＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼが、以下の変異を有する、請求項３に記載のエキソビボまたはインビトロの方法：Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＬ１６９Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＹ４５０Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＭ４９５Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＮ４９７Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＭ６９４Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＨ６９８Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＫ８１０Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＲ８３２Ａ；または
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＤ１１３５Ｅ。
【請求項5】
前記融合タンパク質が部分（ａ）を含み、前記ＳａＣａｓ９が、Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、およびＲ１０１５Ｈからなる群から選択される変異を含む、請求項１に記載のエキソビボまたはインビトロの方法。
【請求項6】
細胞のゲノムを修飾する方法で使用するための融合タンパク質であって、前記方法が、前記融合タンパク質を前記細胞において発現させること、または前記融合タンパク質と前記細胞とを接触させることを含み、
前記融合タンパク質が、以下：
（ａ）(i) ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦ ＤＢＤ）もしくは
(ii)ＴＡＬ ＤＮＡ結合アレイ
と融合された、Ｒ１０１５に変異を含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）ヌクレアーゼ、または
（ｂ） 内因性転写因子（ＴＦ）もしくは内因性の翻訳後ヒストン修飾に対して親和性を有する操作親和性タンパク質（ＡＰ）と連結された、少なくともＲ６６１およびＱ６９５に変異を有する、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼ
を含むものであり、
部分（ａ）の前記ＳａＣａｓ９または部分（ｂ）の前記ＳｐＣａｓ９は、切断活性を保っているが標的部位を効率的に切断できない、融合タンパク質。
【請求項7】
前記融合タンパク質が部分（ｂ）を含み、前記ＡＰが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記融合タンパク質が部分（ｂ）を含み、前記方法がガイドＲＮＡの存在下で行われる、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記部分（ｂ）のＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼが、以下の変異を有する、請求項６に記載の融合タンパク質：Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＬ１６９Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＹ４５０Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＭ４９５Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＮ４９７Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＭ６９４Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＨ６９８Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＫ８１０Ａ；
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＲ８３２Ａ；または
Ｒ６６１ＡとＱ６９５ＡとＤ１１３５Ｅ。
【請求項10】
前記融合タンパク質が部分（ａ）を含み、前記ＳａＣａｓ９が、Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、およびＲ１０１５Ｈからなる群から選択される変異を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
細胞のゲノムを修飾する方法で使用するための組成物であって、請求項６～１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含み、前記方法が、前記融合タンパク質を前記細胞において発現させること、または前記融合タンパク質と前記細胞とを接触させることを含む、組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０１６年１０月１４日に提出された米国仮特許出願第６２／４０８，６４５号明細書の利益を主張する。前記出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
本出願は、２０１６年１０月１４日に提出された米国仮特許出願第６２／４０８，６４５号明細書の利益を主張する。前記出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【0002】
連邦政府により支援された研究または開発
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）により与えられた助成番号ＤＰ１ ＧＭ１０５３７８およびＲ３５ ＧＭ１１８１５８の下で政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）により与えられた助成番号ＤＰ１ ＧＭ１０５３７８およびＲ３５ ＧＭ１１８１５８の下で政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【0003】
研究用試薬として、遺伝子ドライブ中に、または治療剤として使用するための、ゲノム編集ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼまたは操作ジンクフィンガーヌクレアーゼ）およびカスタマイズ可能なＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質（例えば、ＲＮＡガイドｄｅａｄ－Ｃａｓ９、ＲＮＡガイドｄｅａｄ－Ｃｐｆ１、または転写調節ドメインと融合した操作ジンクフィンガーアレイ）の特異性を改善するための方法および組成物が、本明細書において記載される。
【背景技術】
【0004】
操作標的ヌクレアーゼは、ヒト細胞における病原変異を遺伝的に修正するために使用することができる。このような治療戦略は、ヌクレアーゼがゲノム中の特定部位に配列特異的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することに依存している。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓなどのＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）プラットフォームの特異性は、標的ＤＮＡ部位に対する相補性を担持するガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）によって主として指示される。ジンクフィンガー（ＺＦ）ヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼのような他のゲノム編集プラットフォームは、それらの特異性を配列特異的なタンパク質－ＤＮＡ接触から導き出すが、ユーザー定義の配列と特異的に結合するタンパク質ドメインを産生するには、より複雑な操作戦略が必要となる。ゲノム編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と呼ばれる誤りがちな経路を介して、または相同な外因性「ドナー鋳型」もしくはゲノム自体の内部に見出される相同配列を使用するより正確な相同組換え修復（ＨＤＲ）によってのいずれかでこれらの標的ＤＳＢを修復する内因性細胞機構を利用することによって達成される。ゲノム編集ヌクレアーゼは、それらの特定の標的部位でＤＳＢを強く誘導することができるものの、全てのヌクレアーゼプラットフォームが、目的の標的に類似する配列に望まれないＤＳＢを誘導することも知られている。これらのオフターゲットＤＳＢは、ＮＨＥＪによって効率的に修復されるが、その結果、これらの部位で意図されない変異が生じ、これらの変異がゲノム全体に分布するおそれがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、少なくとも部分的に、研究用試薬として、遺伝子ドライブ中に（例えば、Hammond et al., Nature Biotechnology 34:78-83 (2016)に記載）、または治療剤として使用するための、ゲノム編集ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼまたは操作ジンクフィンガーヌクレアーゼ）およびカスタマイズ可能なＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質（例えば、ＲＮＡガイドｄｅａｄ－Ｃａｓ９、ＲＮＡガイドｄｅａｄ－Ｃｐｆ１、または転写調節ドメインと融合した操作ジンクフィンガーアレイ）の特異性を改善するための方法および組成物の開発に基づく。
【0006】
したがって、特異的ＴＦまたは翻訳後ヒストン修飾に対して高い親和性を有する操作親和性タンパク質（ＡＰ）と遺伝的に連結された標的ヌクレアーゼを含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲノムを修飾するための方法であって、特異的ＴＦまたは翻訳後ヒストン修飾が標的部位の近位に存在する場合にかぎり、融合タンパク質がその標的部位で活性である、方法が、本明細書に提供される。
【課題を解決するための手段】
【0007】
一部の実施形態では、ＡＰは、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される。
【0008】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、１）メガヌクレアーゼ、２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、３）転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および４）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）からなる群より選択される。
【0009】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ＲＧＮであり、方法は、ガイドＲＮＡの存在下で行われる。
【0010】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、表１に示される残基のうちの１つまたは複数の変異を有する化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。
【0011】
Ｒ１０１５に変異、例えば、Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、またはＲ１０１５Ｈを担持する黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９と融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦ ＤＢＤ）またはＴＡＬ ＤＮＡ結合アレイを含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲノムを修飾するための方法も、本明細書に提供される。
【0012】
（ｉ）標的ＤＮＡ結合ドメインまたはガイドＲＮＡと一緒の触媒不活性「ｄｅａｄ」ＲＧＮ（ｄＲＧＮ）、（ｉｉ）異種機能性ドメイン、および（ｉｉｉ）操作親和性タンパク質（ＡＰ）によって認識される転写因子またはヒストン修飾がＤＮＡ結合ドメインまたはｄＲＧＮの標的部位の近位に存在する場合にかぎり活性であるＡＰ、を含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲノムを修飾するための方法が、本明細書にさらに提供される。
【0013】
一部の実施形態では、ＡＰは、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される。
【0014】
一部の実施形態では、機能性ドメインは、転写調節ドメイン、ヒストン修飾酵素、またはＤＮＡ修飾酵素である。
【0015】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、（ｉ）１９、１８、および１７ｂｐのスペーサー長を有するｇＲＮＡ；（ｉｉ）目的の標的部位と比べて１、２、または３つの意図的なミスマッチを有するｇＲＮＡ；（ｉｉｉ）オンターゲット部位と相補的な２０ｎｔを有し、追加的なＧ塩基（標的ＤＮＡ配列とミスマッチである）が５’に付加されたｇＲＮＡ；ならびに（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組合せからなる群から選択される。
【0016】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡに対する、９、１０、１１、１２、または１３個のヌクレオチド塩基の非常に短い相補性配列を担持する切断型ｇＲＮＡである。
【0017】
特に定義しないかぎり、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本発明における使用のための方法および材料が、本明細書において記載されているが、当技術分野において公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は、単なる例証であり、限定することを意図しない。全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録事項、および本明細書において言及される他の参考文献は、その全体で参照により組み込まれている。矛盾する場合、定義を含めて本出願が優先される。
【0018】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【0019】
本特許または出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許商標庁から提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】近位の転写因子またはヒストン修飾に依存するＲＧＮヌクレアーゼ活性を示す図である。（Ａ）遺伝子内の部位に標的化されたＲＧＮと共有結合的に連結した親和性タンパク質をここではｓｃＦｖとして表示。ｓｃＦｖの結合パートナーがｇＲＮＡ標的部位に隣接した部位に存在しないので、ＲＧＮは、ＤＳＢを誘導することができない。（Ｂ）逆に、ｓｃＦｖの結合パートナーがｇＲＮＡ標的部位に隣接して存在するとき、ｓｃＦｖは、ここで転写因子として表示するその標的と結合する。この結合事象は、標的部位でのＲＧＮの結合を安定化し、ＲＧＮにＤＳＢを誘導させる。次に、このＤＳＢをＮＨＥＪまたはＨＤＲによって修復することができる。
【図2-1】図２Ａは、結合部位がｇＲＮＡ標的部位に隣接している操作ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであるＺＦ２９２Ｒと、２つのＳｐＣａｓ９バリアントが融合した、または融合していないときのＥＧＦＰ破壊活性を特徴づける図である。試験した４つのｇＲＮＡの全てで、両方のＳｐＣａｓ９バリアントは、ＺＦ２９２Ｒと融合したときの方が高いＥＧＦＰ破壊能力を表す。これらのＳｐＣａｓ９バリアント－ｇＲＮＡの組合せの活性を立て直すには、第２のＤＢＤからの結合親和性が増加することで十分であることが示されている。
【図2-3】図２Ｃは、タンパク質が単独で発現したときまたはＧＣＮ４－ＺＦ２９２Ｒと共発現したとき、ｓｃＦｖ ＧＣＮ４と融合したときの２つのＳｐＣａｓ９バリアントのＥＧＦＰ破壊活性を特徴づける図である。試験された３つのｇＲＮＡで、両方のＳｐＣａｓ９バリアントは、単独で発現したときと比べてＧＣＮ４－ＺＦ２９２Ｒと共発現したときの方が高いＥＧＦＰ破壊活性を示す。野生型ＳｐＣａｓ９と一緒の各ｇＲＮＡの活性も対照として示す。
【図3-1】図３Ａは、単独で発現したときまたはＨ３（１－３８）－ＺＦ２９２ＲもしくはＧＣＮ４－ＺＦ２９２Ｒと共発現したときのＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）－ｓｃＦｖ ＧＣＮ４のＥＧＦＰ破壊活性を特徴づける図である。ＳｐＣａｓ９バリアントによるＥＧＦＰ破壊活性の増加は、ＧＣＮ４－ＺＦ２９２Ｒとの共発現に特異的であり、ＧＣＮ４－ＺＦ２９２ＲとｓｃＦｖ ＧＣＮ４との間の相互作用がＥＧＦＰの破壊増加を媒介していることを示唆している。さらに、完全にマッチしたｇＲＮＡ５は、ＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）－ｓｃＦｖ ＧＣＮ４のＥＧＦＰ破壊活性を野生型のレベルに回復させるが、これは、戦略１および戦略２に概要を示したｇＲＮＡの修飾が、このシステムで試験されたＳｐＣａｓ９バリアントの誘導活性に重要であることを示している。
【図3-2】図３Ｂは、図３Ａと同じ細胞集団のＴＩＤＥ分析を示す図であり、この図は、ＧＣＮ４－ＺＦ２９２ＲとＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）－ｓｃＦｖ ＧＣＮ４との間の相互作用がＥＧＦＰ標的部位での挿入欠失の形成を刺激することを実証している。
【図4-1】図４Ａは、タンパク質がｇＲＮＡ標的部位に隣接するＰＡＭと相互作用する能力に影響する変異を担持するＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９バリアントは、ＥＧＦＰ標的部位と結合してその部位でＤＳＢを誘導することができないことを示す図である。図４Ｂは、ＺＦ２９２Ｒと示される第２のＤＢＤが、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤと融合していることを示す図である。第２のＤＢＤは、ｇＲＮＡ標的部位に隣接する配列と結合し、Ｃａｓ９ ＰＩＤ ＫＤにその標的部位と結合させ、ＤＳＢを誘導する。このアッセイでは、ＤＳＢを標的部位に導入し、誤りがちなＮＨＥＪにより修復したとき、コード配列はフレーム外に移動し、その結果、ＥＧＦＰ産生の喪失が生じる。
【図4-2】図４Ｃは、操作ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＳａＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤと共有結合的に連結することで、そのヌクレアーゼ活性を立て直すことができることを示す図である。ジンクフィンガーアレイ結合部位（ＺＦ２９２Ｒ）がＳａＣａｓ９標的部位のＰＡＭから１０ｂｐ離れて位置する（これらは、両方ともＥＧＦＰのコード領域内にある）、代表的なＥＧＦＰ破壊アッセイからのデータ。ＳａＣａｓ９のＲ１０１５がＡ、Ｑ、またはＨに変異すると、これらの変異を担持するＳａＣａｓ９タンパク質は、ＤＳＢを誘導することができない。しかし、ＺＦ２９２ＲをＳａＣａｓ９分子と共有結合的に連結すると、これらのタンパク質は、ＤＳＢを誘導することができる。
【図5】図５Ａ及びＢは、長距離クロマチンループ形成に依存するＲＧＮヌクレアーゼ活性を示す図である。（Ａ）ここでＺＦアレイとして表すプログラム可能なＤＢＤは、Ｃａｓ９ ＰＩＤ ＫＤ変異体と共有結合的に連結されている。ＤＢＤは、遠位エンハンサー配列に標的化され、一方で、ＲＧＮは、関心対象の遺伝子内の領域に標的化されている。（例えば、関心対象の遺伝子が転写的に活性でない細胞型において）遠位エンハンサーが関心対象の遺伝子に近接していないとき、Ｃａｓ９ ＰＩＤ ＫＤは、標的部位でＤＳＢを誘導することができない。（Ｂ）しかし、（例えば、関心対象の遺伝子が転写的に活性である細胞型において）遠位エンハンサーと関心対象の遺伝子との間にループ形成が起こると、第２のＤＢＤを介してエンハンサーに繋がれたＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤは、その標的部位に近づけられ、ＤＳＢを誘導可能になり、次にＤＳＢはＮＨＥＪまたはＨＤＲによって修復される。
【図6】図６Ａは、ＤＮＡ結合活性が、ＡＰ（ここでｓｃＦｖタンパク質として示す）と近位の転写因子またはヒストン修飾との相互作用に依存するＡＰ－ｄＲＧＮ－エフェクター融合物（表１に記載のエピゲノム編集タンパク質）は、（例えば、エンハンサー、プロモーター、または遺伝子の転写領域（gene body）の中または近位の）遺伝子調節エレメントに標的化されることを示す図である。ＡＰの結合パートナーの不在下では、ＡＰ－ｄＲＧＮ－エフェクター融合タンパク質は、ｇＲＮＡによって特定される標的部位と安定的に結合することができず、標的遺伝子の転写状態を変化させない。図６Ｂ：しかし、ここで転写因子として示すＡＰの結合パートナーが、ｇＲＮＡ標的部位に隣接して存在するとき、ＡＰとそのパートナーとの間の結合事象は、ＡＰ－ｄＲＧＮ－エフェクター融合タンパク質の結合を安定化する。標的部位にＡＰ－ｄＲＧＮ－エフェクタータンパク質が安定的に動員される結果として、モジュレートされた（例えば、活性化または抑制された）転写アウトプットが標的遺伝子から生じる。
【発明を実施するための形態】
【0021】
治療応用のためには、ヌクレアーゼ活性を特定のＤＮＡ配列だけでなく、特別なエピジェネティック状況だけに、（特別なエピジェネティック状況は、次には特定の細胞型を表す可能性があるので）例えば、疾患表現型を生成する細胞または遺伝的変化の導入が治療上の利益を有すると予想される細胞だけに限定することが、望ましい能力であろう。このような能力を有することで、ヌクレアーゼが活性である細胞の数および種類を制限することができ、したがって、オンターゲットまたはオフターゲットＤＳＢのいずれかが生じ得る細胞数が最小になるであろう。細胞型特異的にゲノム編集を行うための既存の戦略は、関連する細胞型を分離するためのｅｘ ｖｉｖｏ選別アプローチ、特定の細胞もしくは組織型に親和性を有するウイルス中にゲノム編集試薬をコードする核酸を送達すること、または細胞型特異的調節エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を使用して、ヌクレアーゼの細胞型発現を推進することを含む。細胞表面標識および細胞選別による特定の細胞型の富化は、費用がかかり、骨が折れ、場合により、近縁の細胞型同士を識別することが不可能な場合がある。一部のウイルスは、細胞型に対して顕著な選好性を有するものの、標的化可能な細胞型がかぎられており、多くの場合に中和宿主免疫応答を回避することが困難であり得る。加えて、プロモーターなどの多くの細胞型特異的調節エレメントは、関係する細胞型において漏出性の発現を示すので、ヌクレアーゼ活性の厳重な制御を必要とするゲノム編集応用のためのそれらの有用性を限定する。この戦略は、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡによる送達よりも明らかに低いオフターゲットヌクレアーゼ効果を示した戦略である、細胞の混合集団へのＲＮＡ、精製ヌクレアーゼタンパク質、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の送達とも不適合である。
【0022】
戦略１ エピジェネティックに調節される配列特異的ヌクレアーゼ
一態様では、本方法は、標的部位に隣接する特異的転写因子（ＴＦ）またはヒストン修飾の存在に依存するように配列特異的ヌクレアーゼの切断活性を操作することによって、その活性を特定の細胞型に限定する。そのために、それ自体、最小限のＤＳＢを誘導するまたはＤＳＢを誘導しないヌクレアーゼが、特異的ＴＦまたは翻訳後ヒストン修飾に対して高い親和性を有する操作親和性タンパク質（ＡＰ）と遺伝的に連結される（（図１）。ＡＰの例には、非限定的に、単鎖抗体（例えば、Chothia, Cyrus, et al. "Domain association in immunoglobulin molecules: the packing of variable domains."Journal of molecular biology 186.3 (1985): 651-663）、操作フィブロネクチンドメイン（例えば、Koide, Akiko, et al. "The fibronectin type III domain as a scaffold for novel binding proteins." Journal of molecular biology 284.4 (1998): 1141-1151に記載）、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ（例えば、Nord, Karin, et al. "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain." Nature biotechnology 15.8 (1997): 772-777に記載）、操作ナノボディー（例えば、Hamers-Casterman, C. T. S. G., et al. "Naturally occurring antibodies devoid of light chains." Nature 363.6428 (1993): 446-448に記載）、および設計アンキリンリピートタンパク質（例えば、Binz, H. Kaspar, et al. "Designing repeat proteins: well-expressed、soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins." Journal of molecular biology 332.2 (2003): 489-503に記載）が挙げられる。これらのヌクレアーゼ－ＡＰ融合物の切断活性は、ヌクレアーゼによって特定される標的部位の認識および標的部位の近位のＡＰ結合パートナーの存在の両方に依存する。
一態様では、本方法は、標的部位に隣接する特異的転写因子（ＴＦ）またはヒストン修飾の存在に依存するように配列特異的ヌクレアーゼの切断活性を操作することによって、その活性を特定の細胞型に限定する。そのために、それ自体、最小限のＤＳＢを誘導するまたはＤＳＢを誘導しないヌクレアーゼが、特異的ＴＦまたは翻訳後ヒストン修飾に対して高い親和性を有する操作親和性タンパク質（ＡＰ）と遺伝的に連結される（（図１）。ＡＰの例には、非限定的に、単鎖抗体（例えば、Chothia, Cyrus, et al. "Domain association in immunoglobulin molecules: the packing of variable domains."Journal of molecular biology 186.3 (1985): 651-663）、操作フィブロネクチンドメイン（例えば、Koide, Akiko, et al. "The fibronectin type III domain as a scaffold for novel binding proteins." Journal of molecular biology 284.4 (1998): 1141-1151に記載）、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ（例えば、Nord, Karin, et al. "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain." Nature biotechnology 15.8 (1997): 772-777に記載）、操作ナノボディー（例えば、Hamers-Casterman, C. T. S. G., et al. "Naturally occurring antibodies devoid of light chains." Nature 363.6428 (1993): 446-448に記載）、および設計アンキリンリピートタンパク質（例えば、Binz, H. Kaspar, et al. "Designing repeat proteins: well-expressed、soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins." Journal of molecular biology 332.2 (2003): 489-503に記載）が挙げられる。これらのヌクレアーゼ－ＡＰ融合物の切断活性は、ヌクレアーゼによって特定される標的部位の認識および標的部位の近位のＡＰ結合パートナーの存在の両方に依存する。
【0023】
特異的転写因子は、本明細書に記載されたもの、ならびに例えば：造血ＴＦ：例えば、ＧＡＴＡ１、ＴＡＬ１、ＥＬＦ１、およびＫＬＦ１；基本転写因子、例えば、転写前開始複合体のメンバーである因子、そのＣ末端ドメインの差次的リン酸化状態を有するＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ（活発に転写中、休止済みなどに関連）、Ｐ３００およびメディエーター；下記の「親和性タンパク質」の節に挙げられるＴＦ；ならびにＤＮＡ結合モチーフが特定疾患に重要な調節エレメントに隣接するＴＦを含み得る。ヒストン修飾には、本明細書に記載された修飾および異なる転写活性化状態と関連する修飾、例えば：Ｈ３Ｋ４ｍｅ１／２／３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ１／２／３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１／２／３、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ５６ａｃ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ１／２／３、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ１／２／３、またはＨ４Ｋ１６ａｃが含まれる。
【0024】
切断活性を保っている（が、その標的部位を効率的に切断することができない）部位特異的ヌクレアーゼを操作するために、これらのヌクレアーゼとその標的部位との結合を、（ｉ）標的ＤＮＡ鎖と接触する残基への標的変異により、ＤＮＡに対するヌクレアーゼの非特異的親和性を低下させること、および／または（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドヌクレアーゼについて標的部位に対する親和性または相互作用能がかぎられているまたは低下しているガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を操作することによって、不安定化することができる。このような戦略の一具体例は、ＤＮＡに対するタンパク質の親和性を低下させることが意図される化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼに作成された変異の組合せを使用し、このような変異の例には、非限定的に、表１に示される変異およびそれらの変異の任意の可能な組合せが挙げられる。
【0025】
【表1】
【0026】
類似の効果を有するジンクフィンガーおよびＺＦＮにおける変異が記載されており、それらを本明細書において使用することもできる。例えば、Guilinger et al., Nat Methods. 2014 Apr; 11(4): 429-435; Khalil et al., Cell. 2012 Aug 3;150(3):647-58を参照されたい。
【0027】
結果として生じたＳｐＣａｓ９バリアントは、（ｉ）スペーサー長１９、１８、および１７ｂｐを有するｇＲＮＡ、（ｉｉ）意図される標的部位と比べて１、２、または３つの意図的なミスマッチを有するｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）オンターゲット部位と２０、１９、１８、または１７ｎｔの相補性を有する追加的なＧ塩基（標的ＤＮＡ配列とミスマッチである）をｇＲＮＡの５’に付加すること、ならびに（ｉｖ）これらの前記ｇＲＮＡバリエーションのいずれかの組合せなどの、ゲノム標的部位に対して低下した親和性を有するｇＲＮＡと共に使用することもできる。
【0028】
戦略２ 三次元クロマチンコンフォメーションに依存する配列特異的ヌクレアーゼ
多数の遺伝子の転写調節は、特定の状況および細胞型において遺伝子発現を上方調節するように作用するエンハンサーエレメントの状況により制御される。これらのエンハンサーは、しばしば一次配列における遺伝子プロモーターから数十～数百キロ塩基離れたどこかまで非常に離れている場合がある。しかし、長距離クロマチンループ形成によりこれらのエンハンサーをプロモーターに近づけて、それらの標的遺伝子を活性化することができる。この態様では、ＲＧＮを調節エレメント（すなわち、エンハンサーまたはエンハンサー周囲の配列）と標的遺伝子または遺伝子プロモーターとの間の長距離クロマチンループ形成の出現に依存するように操作することによって、ヌクレアーゼの切断活性は、特定の細胞型に限定される。
多数の遺伝子の転写調節は、特定の状況および細胞型において遺伝子発現を上方調節するように作用するエンハンサーエレメントの状況により制御される。これらのエンハンサーは、しばしば一次配列における遺伝子プロモーターから数十～数百キロ塩基離れたどこかまで非常に離れている場合がある。しかし、長距離クロマチンループ形成によりこれらのエンハンサーをプロモーターに近づけて、それらの標的遺伝子を活性化することができる。この態様では、ＲＧＮを調節エレメント（すなわち、エンハンサーまたはエンハンサー周囲の配列）と標的遺伝子または遺伝子プロモーターとの間の長距離クロマチンループ形成の出現に依存するように操作することによって、ヌクレアーゼの切断活性は、特定の細胞型に限定される。
【0029】
以前の研究は、ＳｐＣａｓ９が操作ジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）またはＴＡＬＥリピートアレイなどの第２のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）によりその標的部位近くに繋がれたときにかぎり、ＤＳＢを誘導するように操作することができることを示した（Bolukbasi, Mehmet Fatih, et al. "DNA-binding-domain fusions enhance the targeting range and precision of Cas9." Nature methods 12.12 (2015): 1150-1156）。これは、タンパク質がそのＰＡＭモチーフを認識する能力に影響するＳｐＣａｓ９の位置Ｒ１３３３またはＲ１３３５に変異を導入することによって成し遂げられる（このような変異は、Ｃａｓ９ ＰＡＭ相互作用ドメインノックダウンまたはＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤと呼ばれる）。ＳａＣａｓ９を用いた類似のシステムは、標的部位でＳａＣａｓ９とＰＡＭ配列との間の相互作用に影響する変異Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、またはＲ１０１５Ｈを担持するＳａＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤに第２のＺＦ ＤＢＤを融合することによって操作することができる（Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec;33(12):1293-1298）。
【0030】
戦略３ エピジェネティックに調節されるエピゲノム編集タンパク質
多く疾患が、遺伝子サブセットの発現変化によって特徴づけられ、これらの遺伝子サブセットは、疾患の表現型自体の原因となることが多い。疾患表現型を有する細胞中の遺伝子を調節しているプロモーターおよび／またはエンハンサーの近位に特定の転写因子が結合する、または結合しない結果として、遺伝子発現が変化する。ＺＦアレイ、ＴＡＬＥリピートアレイなどのプログラム可能な配列特異的ＤＢＤ、および触媒不活性ＲＧＮ（ｄｅａｄ ＲＧＮまたはｄＲＧＮ）とエフェクタータンパク質を遺伝的に融合することによって遺伝子発現をモジュレートする現行方法が存在するものの、これらのツールは試薬が送達される全ての細胞型において機能すると予想され、特定の疾患または非疾患表現型を有する細胞に対して内因性特異性を有しない。結果として、所望の細胞サブセットにこれらの試薬を送達することは、複雑なｅｘ ｖｉｖｏアプローチまたは細胞型特異的転写調節エレメントからこれらの試薬を発現させること（タンパク質送達と不適合な戦略）を要する。本態様では、遺伝子発現は、関心対象の遺伝子の近位に位置する特異的ＴＦまたはヒストン修飾の存在次第で修飾され、その結果、特異的ＴＦの結合またはヒストン修飾プロファイルを有する細胞にかぎり、遺伝子発現のプログラムされたモジュレーションが生じる。
多く疾患が、遺伝子サブセットの発現変化によって特徴づけられ、これらの遺伝子サブセットは、疾患の表現型自体の原因となることが多い。疾患表現型を有する細胞中の遺伝子を調節しているプロモーターおよび／またはエンハンサーの近位に特定の転写因子が結合する、または結合しない結果として、遺伝子発現が変化する。ＺＦアレイ、ＴＡＬＥリピートアレイなどのプログラム可能な配列特異的ＤＢＤ、および触媒不活性ＲＧＮ（ｄｅａｄ ＲＧＮまたはｄＲＧＮ）とエフェクタータンパク質を遺伝的に融合することによって遺伝子発現をモジュレートする現行方法が存在するものの、これらのツールは試薬が送達される全ての細胞型において機能すると予想され、特定の疾患または非疾患表現型を有する細胞に対して内因性特異性を有しない。結果として、所望の細胞サブセットにこれらの試薬を送達することは、複雑なｅｘ ｖｉｖｏアプローチまたは細胞型特異的転写調節エレメントからこれらの試薬を発現させること（タンパク質送達と不適合な戦略）を要する。本態様では、遺伝子発現は、関心対象の遺伝子の近位に位置する特異的ＴＦまたはヒストン修飾の存在次第で修飾され、その結果、特異的ＴＦの結合またはヒストン修飾プロファイルを有する細胞にかぎり、遺伝子発現のプログラムされたモジュレーションが生じる。
【0031】
例えば、本方法は、ＤＮＡに対する非特異的親和性を低下させることを意図する戦略１および２に記載の修飾を有するまたは有しないｄＲＧＮを、ＡＰと、および遺伝子の転写アウトプットを変化させることができるエフェクタータンパク質（異種機能性ドメイン）と、遺伝的に融合したものを使用することを含み得る（表２）。これらのｄＲＧＮは、ｄＲＧＮと複合するとｇＲＮＡ配列によって特定される標的部位と安定的に結合することができない様々な修飾ｇＲＮＡ（例えば、戦略１および２で概要を示したもの）と一緒に使用される。しかし、ＡＰとの結合パートナー（例えば、特定のＴＦまたはヒストン修飾）が、また、ｇＲＮＡ結合部位に近接して存在するとき、ＡＰ－結合パートナー相互作用から標的部位に対する親和性が増加することにより、複合体が特定の標的部位と安定的に会合できるようになる（図６Ａおよび６Ｂ）。次に、ｄＲＧＮ－ＡＰと融合したエフェクターは、標的遺伝子の発現を変化させることができる。戦略１および２に記載した修飾ｇＲＮＡに加えて、本発明者らは、９、１０、１１、１２、または１３個のヌクレオチド塩基という非常に短いスペーサー配列を担持するｇＲＮＡと一緒に、触媒不活性化変異のみを担持する（すなわち、ＤＮＡに対する非特異的親和性を低下させることを意図する追加的な変異を有しない）ｄＲＧＮタンパク質を使用することも提案する。この戦略は、標的部位へのｄＲＧＮ複合体の安定結合だけを必要とし、ヌクレアーゼ活性を必要としないので、ＡＰ－結合パートナー相互作用に関連して複合体が結合できるために、９～１３個の塩基のスペーサー配列を担持するｇＲＮＡで十分な可能性がある。
【0032】
【表2】
【0033】
操作親和性タンパク質（ＡＰ）
本発明の融合タンパク質に有用なＡＰは、特異的転写因子（ＴＦ）または翻訳後ヒストン修飾（例えば、図１に示すもの）に対して高い親和性を有するＡＰである。ＡＰの例には、非限定的に、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質が挙げられる。ＴＦの例には、基本転写因子（例えば、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、およびＴＦＩＩＨ）；発生学的に調節されているＴＦ（例えば、ＧＡＴＡ、ＨＮＦ、ＰＩＴ－１、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｈｏｘ、ウィングドヘリックス（Winged Helix））；およびシグナル依存性ＴＦ（例えば、ＳＰ１、ＡＰ－１、Ｃ／ＥＢＰ、熱ショック因子、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ＭＥＦ２、ＳＴＡＴ、Ｒ－ＳＭＡＤ、ＮＦ－κＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＵＢＢＹ、ＮＦＡＴ、およびＳＲＥＢＰ）が挙げられる。特異的翻訳後ヒストン修飾の例には、メチル化、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、およびＳＵＭＯ化が挙げられる。これらは、操作タンパク質に行われたこれらの修飾に特異的親和性を有して、これらのタンパク質を介して標的化することができる。
本発明の融合タンパク質に有用なＡＰは、特異的転写因子（ＴＦ）または翻訳後ヒストン修飾（例えば、図１に示すもの）に対して高い親和性を有するＡＰである。ＡＰの例には、非限定的に、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質が挙げられる。ＴＦの例には、基本転写因子（例えば、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、およびＴＦＩＩＨ）；発生学的に調節されているＴＦ（例えば、ＧＡＴＡ、ＨＮＦ、ＰＩＴ－１、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｈｏｘ、ウィングドヘリックス（Winged Helix））；およびシグナル依存性ＴＦ（例えば、ＳＰ１、ＡＰ－１、Ｃ／ＥＢＰ、熱ショック因子、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ＭＥＦ２、ＳＴＡＴ、Ｒ－ＳＭＡＤ、ＮＦ－κＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＵＢＢＹ、ＮＦＡＴ、およびＳＲＥＢＰ）が挙げられる。特異的翻訳後ヒストン修飾の例には、メチル化、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、およびＳＵＭＯ化が挙げられる。これらは、操作タンパク質に行われたこれらの修飾に特異的親和性を有して、これらのタンパク質を介して標的化することができる。
【0034】
特異的転写因子は、上に記載されたもの、ならびに例えば：造血ＴＦ：例えば、ＧＡＴＡ１、ＴＡＬ１、ＥＬＦ１、およびＫＬＦ１；基本転写因子、例えば、転写前開始複合体のメンバーである因子、そのＣ末端ドメインの差次的リン酸化状態を有するＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ（活発に転写中、休止済みなどに関連）、Ｐ３００およびメディエーター；下記の「親和性タンパク質」の節に挙げられるＴＦ；ならびにＤＮＡ結合モチーフが特定疾患に重要な調節エレメントに隣接するＴＦを含み得る。ヒストン修飾には、本明細書において記載された修飾および異なる転写活性化状態と関連する修飾、例えば：Ｈ３Ｋ４ｍｅ１／２／３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ１／２／３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１／２／３、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ５６ａｃ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ１／２／３、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ１／２／３、またはＨ４Ｋ１６ａｃが含まれる。
【0035】
配列特異的ヌクレアーゼ
現在４つの主なクラスの配列特異的ヌクレアーゼ：１）メガヌクレアーゼ、２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、３）転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および４）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）Ｃａｓ ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）がある。ＤＮＡに対するタンパク質の非特異的親和性をノックダウンすることにより、タンパク質が親和性タンパク質結合パートナーからの追加的な結合エネルギーなしには、その標的配列と安定的に結合できないようにするために、これらのタンパク質の修飾を行うことができる。ＺＦＮについて、リン酸ＤＮＡ骨格と接触するＺＦドメイン中の残基をノックアウトすることができる（Khalil et al., Cell 2012参照）。ＴＡＬＥについて、ＤＮＡリン酸接触を媒介する各リピート中に、変異させることができる特定の残基がある。一部の実施形態では、非常に長い結合事象だけがヌクレアーゼ活性をもたらすように、ヌクレアーゼドメインがノックダウンされた３－フィンガーＺＦアレイまたは結合エネルギーがより小さくなるような短鎖ＴＡＬＥＮアレイ（例えば７．５または８．５）を使用することができる。また、これらのプラットフォームの様々な成分を一緒に融合して、Ｍｅｇａ－ＴＡＬおよびＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９融合物のような追加的なヌクレアーゼを生み出すことができる。例えば、Gaj et al., Trends Biotechnol. 2013 Jul;31(7):397-405を参照されたい。当技術分野において公知の方法を使用して、ヌクレアーゼを細胞に一過性または安定的に発現させることもでき、概して、発現を得るために、タンパク質をコードする配列が、転写を指示するためのプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な真核発現システムは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th ed. 2013); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (2006);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技法に従って行われる（例えば、上記参考文献およびMorrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい。
現在４つの主なクラスの配列特異的ヌクレアーゼ：１）メガヌクレアーゼ、２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、３）転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および４）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）Ｃａｓ ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）がある。ＤＮＡに対するタンパク質の非特異的親和性をノックダウンすることにより、タンパク質が親和性タンパク質結合パートナーからの追加的な結合エネルギーなしには、その標的配列と安定的に結合できないようにするために、これらのタンパク質の修飾を行うことができる。ＺＦＮについて、リン酸ＤＮＡ骨格と接触するＺＦドメイン中の残基をノックアウトすることができる（Khalil et al., Cell 2012参照）。ＴＡＬＥについて、ＤＮＡリン酸接触を媒介する各リピート中に、変異させることができる特定の残基がある。一部の実施形態では、非常に長い結合事象だけがヌクレアーゼ活性をもたらすように、ヌクレアーゼドメインがノックダウンされた３－フィンガーＺＦアレイまたは結合エネルギーがより小さくなるような短鎖ＴＡＬＥＮアレイ（例えば７．５または８．５）を使用することができる。また、これらのプラットフォームの様々な成分を一緒に融合して、Ｍｅｇａ－ＴＡＬおよびＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９融合物のような追加的なヌクレアーゼを生み出すことができる。例えば、Gaj et al., Trends Biotechnol. 2013 Jul;31(7):397-405を参照されたい。当技術分野において公知の方法を使用して、ヌクレアーゼを細胞に一過性または安定的に発現させることもでき、概して、発現を得るために、タンパク質をコードする配列が、転写を指示するためのプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な真核発現システムは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th ed. 2013); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (2006);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技法に従って行われる（例えば、上記参考文献およびMorrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい。
【0036】
ホーミングメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、細菌、酵母、藻類、および植物オルガネラなどの多様な生物を起源にもつ配列特異的エンドヌクレアーゼである。内因性メガヌクレアーゼは、１２～３０塩基対の認識部位を有する。１８ｂｐおよび２４ｂｐ長のメガヌクレアーゼ認識部位を有する特注のＤＮＡ結合部位が記載されており、どちらも本発明の方法および構築物に使用することができる。例えば、Silva, G., et al., Current Gene Therapy, 11:11-27, (2011); Arnould et al., Journal of Molecular Biology, 355:443-58 (2006); Arnould et al., Protein Engineering Design & Selection, 24:27-31 (2011);およびStoddard, Q. Rev. Biophys. 38, 49 (2005); Grizot et al., Nucleic Acids Research, 38:2006-18 (2010)を参照されたい。
メガヌクレアーゼは、細菌、酵母、藻類、および植物オルガネラなどの多様な生物を起源にもつ配列特異的エンドヌクレアーゼである。内因性メガヌクレアーゼは、１２～３０塩基対の認識部位を有する。１８ｂｐおよび２４ｂｐ長のメガヌクレアーゼ認識部位を有する特注のＤＮＡ結合部位が記載されており、どちらも本発明の方法および構築物に使用することができる。例えば、Silva, G., et al., Current Gene Therapy, 11:11-27, (2011); Arnould et al., Journal of Molecular Biology, 355:443-58 (2006); Arnould et al., Protein Engineering Design & Selection, 24:27-31 (2011);およびStoddard, Q. Rev. Biophys. 38, 49 (2005); Grizot et al., Nucleic Acids Research, 38:2006-18 (2010)を参照されたい。
【0037】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ
最近の研究により、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（Wiedenheft et al., Nature 482, 331-338 (2012); Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010); Terns et al., Curr Opin Microbiol 14, 321-327 (2011)）が、細菌、酵母およびヒト細胞において、ならびにショウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびマウスなどの生物全体においてｉｎ ｖｉｖｏで、ゲノム編集を行うための簡単で高効率的な方法の基礎として役立つことができると実証された（Wang et al., Cell 153, 910-918 (2013); Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Gratz et al., Genetics 194(4):1029-35 (2013)）。化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）由来Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（以後、単にＣａｓ９と呼ぶ）は、１７～２０個のヌクレオチドの操作ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、例えば、単一のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対と、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば配列ＮＧＧまたはＮＡＧとマッチするＰＡＭの隣にある関心対象の標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖との間の単純な塩基対相補性を介してガイドされ得る（Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）。例えば、Zetsche et al., Cell 163, 759-771 (2015); Schunder et al., Int J Med Microbiol 303, 51-60 (2013); Makarova et al., Nat Rev Microbiol 13, 722-736 (2015); Fagerlund et al., Genome Biol 16, 251 (2015)に記載されているように操作されたプレボテラ属（Prevotella）およびフランシステラ属（Francisella）由来ＣＲＩＳＰＲ １（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼも使用することができる。ＳｐＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は、その３’末端に標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーと相補的な２３ｎｔを有する、４２ｎｔのｃｒＲＮＡを１つだけ必要とする（Zetsche et al., 2015）。さらに、ＳｐＣａｓ９がプロトスペーサーの３’にあるＮＧＧ ＰＡＭ配列を認識するのに対し、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐ１は、プロトスペーサーの５’に見られるＴＴＴＮ ＰＡＭを認識する（同上）。
最近の研究により、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（Wiedenheft et al., Nature 482, 331-338 (2012); Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010); Terns et al., Curr Opin Microbiol 14, 321-327 (2011)）が、細菌、酵母およびヒト細胞において、ならびにショウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびマウスなどの生物全体においてｉｎ ｖｉｖｏで、ゲノム編集を行うための簡単で高効率的な方法の基礎として役立つことができると実証された（Wang et al., Cell 153, 910-918 (2013); Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Gratz et al., Genetics 194(4):1029-35 (2013)）。化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）由来Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（以後、単にＣａｓ９と呼ぶ）は、１７～２０個のヌクレオチドの操作ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、例えば、単一のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対と、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば配列ＮＧＧまたはＮＡＧとマッチするＰＡＭの隣にある関心対象の標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖との間の単純な塩基対相補性を介してガイドされ得る（Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）。例えば、Zetsche et al., Cell 163, 759-771 (2015); Schunder et al., Int J Med Microbiol 303, 51-60 (2013); Makarova et al., Nat Rev Microbiol 13, 722-736 (2015); Fagerlund et al., Genome Biol 16, 251 (2015)に記載されているように操作されたプレボテラ属（Prevotella）およびフランシステラ属（Francisella）由来ＣＲＩＳＰＲ １（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼも使用することができる。ＳｐＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は、その３’末端に標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーと相補的な２３ｎｔを有する、４２ｎｔのｃｒＲＮＡを１つだけ必要とする（Zetsche et al., 2015）。さらに、ＳｐＣａｓ９がプロトスペーサーの３’にあるＮＧＧ ＰＡＭ配列を認識するのに対し、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐ１は、プロトスペーサーの５’に見られるＴＴＴＮ ＰＡＭを認識する（同上）。
【0038】
一部の実施形態では、本システムは、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）もしくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の野生型もしくはバリアントＣａｓ９タンパク質、あるいは細菌にコードされているか、もしくは哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されているかのいずれかであり、かつ／またはそのＰＡＭ認識特異性および／もしくはそのゲノムワイド特異性が修飾されている、アシダミノコッカス属（Acidaminococcus）の菌種ＢＶ３Ｌ６またはラクノスピラ科（Lachnospiraceae）細菌ＮＤ２００６由来の野生型Ｃｐｆ１タンパク質を利用する。いくつかのバリアントが記載されているが、例えば、とりわけ国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット、ＰＣＴ／ＵＳ第２０１６／０４９１４７号明細書、Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2016 Aug;34(8):869-74; Tsai and Joung, Nat Rev Genet. 2016 May;17(5):300-12; Kleinstiver et al., Nature. 2016 Jan 28;529(7587):490-5; Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97; Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec;33(12):1293-1298; Dahlman et al., Nat Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1159-61; Kleinstiver et al., Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5; Wyvekens et al., Hum Gene Ther. 2015 Jul;26(7):425-31; Hwang et al., Methods Mol Biol. 2015;1311:317-34; Osborn et al., Hum Gene Ther. 2015 Feb;26(2):114-26; Konermann et al., Nature. 2015 Jan 29;517(7536):583-8; Fu et al., Methods Enzymol. 2014;546:21-45;およびTsai et al., Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):569-76を参照されたい。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１と一緒に細胞において発現されるまたは存在する。ガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼの一方または両方を、細胞において一過性もしくは安定的に発現させる、または精製されたタンパク質もしくは核酸として導入することができる。
【0039】
一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、タンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒不活性にするために、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低下または破壊する以下の変異：Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６のうちの１つ、およびＨ８４０またはＮ８６３、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙも含み、これらの位置での置換は、アラニン（Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)におけるように）、または他の残基、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリン、もしくはアスパラギン酸、例えば、Ｅ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３Ｓ、またはＮ８６３Ｈ（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット参照）であり得る。一部の実施形態では、バリアントは、Ｄ１０ＡもしくはＨ８４０Ａでの変異（一本鎖ニッカーゼを生み出す）、またはＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａでの変異（ヌクレアーゼ活性を消失させる；この変異はｄｅａｄ Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９として公知）を含む。
【0040】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９融合体、すなわち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが変異により触媒不活性（例えば、ｄＣａｓ９）にされ、ＦｏｋＩヌクレアーゼが任意選択で介在リンカーを用いてｄＣａｓ９とフレーム内融合したＲＮＡガイドＦｏｋＩヌクレアーゼである。例えば、国際公開第２０１４／１４４２８８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレットを参照されたい。
【0041】
この方法は、低下した親和性を有するガイドＲＮＡ、例えば、（１）標的部位と相同な２０ｎｔを有するｇＲＮＡであって、標的部位配列とミスマッチである、追加的に５’に付加されたＧを有するｇＲＮＡ；（２）標的部位と相同な１９ｎｔを有するｇＲＮＡであって、５’の２０番目のｎｔに標的部位とミスマッチであるＧを有するｇＲＮＡ；または（３）標的部位と相同な１８ｎｔを有するｇＲＮＡであって、標的部位とミスマッチである２つのＧを５’に有するｇＲＮＡと共に、ＤＮＡに対して通常の親和性を有する野生型Ｃａｓタンパク質を使用することを含み得る。例えば、上記参考文献のいずれかに記載されているような適切なガイドＲＮＡを設計および製造するために、公知の方法を改変することができる。
【0042】
したがって、本明細書においてＳｐＣａｓ９バリアントを含むＣａｓ９バリアントが提供される。ＳｐＣａｓ９の野生型配列は、以下の通りである：
【0043】
【化1】
【0044】
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９バリアントは、本明細書に記載または当技術分野において公知の変異（すなわち、異なるアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、またはセリンによる天然アミノ酸の置換）を有する、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、または９５％同一であり、例えば、本明細書に記載の変異に加えて、配列番号１の残基の最大５％、１０％、１５％、または２０％に、例えば保存的変異により置換された差異を有する。
【0045】
本明細書においてＳａＣａｓ９バリアントも提供される。ＳａＣａｓ９の野生型配列は、以下の通りである：
【0046】
【化2】
【0047】
本明細書に記載のＳａＣａｓ９バリアントは、本明細書に記載または当技術分野において公知の変異を有する配列番号２のアミノ酸配列を含み、例えば、本明細書に記載または当技術分野において公知の変異を有する配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、または９５％同一である配列を含む。
【0048】
２つの核酸配列の同一率を決定するために、最適な比較を行う目的で配列がアライメントされる（例えば、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的で非相同配列を無視することができる）。比較目的でアライメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態では、少なくとも９０％または１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されている場合、当該分子はその位置で同一である（本明細書において使用される核酸の「同一性」は、核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列の間の同一率は、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、両配列によって共有される同一な位置の数の関数である。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の同一率は、当業者の技術の範囲内である様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれている「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981))、Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-358；ＢＬＡＳＴプログラム（Basic Local Alignment Search Tool；（Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して決定される。加えて、当業者は、比較される配列の長さにわたり最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、アライメントを測定するために適切なパラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸について、比較の長さは、最大で完全長である任意の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）であり得る。本発明の組成物および方法のために、配列の完全長の少なくとも８０％がアライメントされる。
【0049】
本発明のために、配列の比較および２つの配列の間の同一率の決定は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスをギャップペナルティー１２、ギャップ伸長ペナルティー４、およびフレームシフトギャップペナルティー５で使用して達成することができる。
【0050】
保存的置換は、概して、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの中の置換を含む。
【0051】
ＴＡＬエフェクターリピートアレイ
キサントモナス（Xanthomonas）属における植物病原細菌のＴＡＬエフェクターは、宿主ＤＮＡと結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、疾患に重要な役割を果たす、または防御を誘起する。特異性は、エフェクターの様々な数の不完全な、概して約３３～３５個のアミノ酸リピートに依存する。多型は、主としてリピート位置１２および１３に存在し、それらの位置は、本明細書においてリピート可変二残基（ＲＶＤ）と称される。ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、標的部位におけるヌクレオチドと直接線形的に１つのＲＶＤが１つのヌクレオチドへと対応し、幾分の縮重を有し、明らかな状況依存性を有しない。一部の実施形態では、ヌクレオチド特異性を与える多型領域は、三残基またはトリプレットとして表示される場合がある。
キサントモナス（Xanthomonas）属における植物病原細菌のＴＡＬエフェクターは、宿主ＤＮＡと結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、疾患に重要な役割を果たす、または防御を誘起する。特異性は、エフェクターの様々な数の不完全な、概して約３３～３５個のアミノ酸リピートに依存する。多型は、主としてリピート位置１２および１３に存在し、それらの位置は、本明細書においてリピート可変二残基（ＲＶＤ）と称される。ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、標的部位におけるヌクレオチドと直接線形的に１つのＲＶＤが１つのヌクレオチドへと対応し、幾分の縮重を有し、明らかな状況依存性を有しない。一部の実施形態では、ヌクレオチド特異性を与える多型領域は、三残基またはトリプレットとして表示される場合がある。
【0052】
各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含む場合があり、その際、各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の一塩基対を認識することを担う。一部の実施形態では、ＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＡ；Ｃを認識するためのＮＤ；Ｃを認識するためのＨＩ；Ｇを認識するためのＨＮ；Ｇを認識するためのＮＡ；ＧまたはＡを認識するためのＳＮ；Ｔを認識するためのＹＧ；およびＧを認識するためのＮＫのうちの１つまたは複数、ならびにＣを認識するためのＨＤ；Ｔを認識するためのＮＧ；Ａを認識するためのＮＩ；ＧまたはＡを認識するためのＮＮ；ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ；ＣまたはＴを認識するためのＮ＊（＊は、ＲＶＤの第２の位置におけるギャップを表す）；Ｔを認識するためのＨＧ；Ｔを認識するためのＨ＊（＊は、ＲＶＤの２番目の位置におけるギャップを表す）；およびＴを認識するためのＩＧのうちの１つまたは複数を含む場合がある。
【0053】
ＴＡＬＥタンパク質は、ゲノム工学において相同組換えを促すことができる標的キメラヌクレアーゼとして研究およびバイオテクノロジーに有用であり得る（例えば、バイオ燃料またはバイオ再生可能物（biorenewable）に有用な形質を植物に付加または強化するため）。これらのタンパク質は、また、例えば転写因子として、特に非限定的な例として病原体（例えばウイルス）に対する治療薬などの、非常に高いレベルの特異性を要する治療応用のために有用であり得る。
【0054】
操作ＴＡＬＥアレイを作製するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許出願第６１／６１０，２１２号明細書、およびReyon et al., Nature Biotechnology 30,460-465 (2012) に記載された迅速なライゲーションベースの自動化可能固相高スループット（fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput）（ＦＬＡＳＨ）システム、ならびにBogdanove & Voytas, Science 333, 1843-1846 (2011); Bogdanove et al., Curr Opin Plant Biol 13, 394-401 (2010); Scholze & Boch, J. Curr Opin Microbiol (2011); Boch et al., Science 326, 1509-1512 (2009); Moscou & Bogdanove, Science 326, 1501 (2009); Miller et al., Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011); Morbitzer et al., T. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 21617-21622 (2010); Morbitzer et al., Nucleic Acids Res 39, 5790-5799 (2011); Zhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011); Geissler et al., PLoS ONE 6, e19509 (2011); Weber et al., PLoS ONE 6, e19722 (2011); Christian et al., Genetics 186, 757-761 (2010); Li et al., Nucleic Acids Res 39, 359-372 (2011); Mahfouz et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2623-2628 (2011); Mussolino et al., Nucleic Acids Res (2011); Li et al., Nucleic Acids Res 39, 6315-6325 (2011); Cermak et al., Nucleic Acids Res 39, e82 (2011); Wood et al., Science 333, 307 (2011); Hockemeye et al. Nat Biotechnol 29, 731-734 (2011); Tesson et al., Nat Biotechnol 29, 695-696 (2011); Sander et al., Nat Biotechnol 29, 697-698 (2011); Huang et al., Nat Biotechnol 29, 699-700 (2011)；およびZhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)に記載された方法を参照されたく、これらの全ては、その全体で参照により本明細書に組み込まれている。
【0055】
メガヌクレアーゼとＴＡＬエフェクターとの融合物であるＭｅｇａＴＡＬも、本方法に使用するために適切である。例えば、Boissel et al., Nucl. Acids Res. 42(4):2591-2601 (2014); Boissel and Scharenberg, Methods Mol Biol. 2015;1239:171-96を参照されたい。
【0056】
ＴＡＬを、転写活性化因子、転写抑制因子、メチル化ドメイン（例えば、ＤＮＡ中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒する配列を含む触媒ドメイン、国際公開第２０１３１８１２２８号パンフレット参照）、およびヌクレアーゼなどの機能性ドメインと融合して、遺伝子発現を調節し、ＤＮＡメチル化を変化させ、モデル生物、植物、およびヒト細胞のゲノムに標的変化を導入することができる。例えば、Tan et al., PNAS 100:11997-12002 (2003); Wong et al., Cancer Res. 59:71-73 (1999); Zhang et al., Nat. Biotech. 29:149-154 (2011)；および国際公開第２０１３１８１２２８号パンフレットを参照されたい。
【0057】
ジンクフィンガー
ジンクフィンガータンパク質は、１つまたは複数のジンクフィンガー、すなわち独立してフォールディングした亜鉛含有ミニドメインを含有するＤＮＡ結合タンパク質であり、その構造は、当技術分野において周知であり、例えば、Miller et al., 1985, EMBO J., 4:1609; Berg, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:99; Lee et al., 1989, Science. 245:635;およびKlug, 1993, Gene, 135:83に定義されている。ＤＮＡと結合したジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８およびそのバリアントの結晶構造は、半分保存された相互作用パターンを示しており、そのパターンでは、概してジンクフィンガーのアルファ－ヘリックスからの３つのアミノ酸が、ＤＮＡ中の３つの隣接塩基対または「サブサイト」と接触している（Pavletich et al., 1991, Science, 252:809; Elrod-Erickson et al., 1998, Structure, 6:451）。したがって、Ｚｉｆ２６８の結晶構造は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーとＤＮＡ配列中の３塩基対の「サブサイト」との間で１対１に相互作用してモジュール的に機能し得ることを示唆した。天然ジンクフィンガー転写因子では、複数のジンクフィンガーが、概してタンデムアレイとして一緒に連結して、連続ＤＮＡ配列の配列特異的認識を達成する（Klug, 1993, Gene 135:83）。
ジンクフィンガータンパク質は、１つまたは複数のジンクフィンガー、すなわち独立してフォールディングした亜鉛含有ミニドメインを含有するＤＮＡ結合タンパク質であり、その構造は、当技術分野において周知であり、例えば、Miller et al., 1985, EMBO J., 4:1609; Berg, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:99; Lee et al., 1989, Science. 245:635;およびKlug, 1993, Gene, 135:83に定義されている。ＤＮＡと結合したジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８およびそのバリアントの結晶構造は、半分保存された相互作用パターンを示しており、そのパターンでは、概してジンクフィンガーのアルファ－ヘリックスからの３つのアミノ酸が、ＤＮＡ中の３つの隣接塩基対または「サブサイト」と接触している（Pavletich et al., 1991, Science, 252:809; Elrod-Erickson et al., 1998, Structure, 6:451）。したがって、Ｚｉｆ２６８の結晶構造は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーとＤＮＡ配列中の３塩基対の「サブサイト」との間で１対１に相互作用してモジュール的に機能し得ることを示唆した。天然ジンクフィンガー転写因子では、複数のジンクフィンガーが、概してタンデムアレイとして一緒に連結して、連続ＤＮＡ配列の配列特異的認識を達成する（Klug, 1993, Gene 135:83）。
【0058】
関心対象のＤＮＡ標的部位と結合可能な所望のバリアントを同定するためにＤＮＡ結合に関与するアルファ－ヘリックス位置でアミノ酸をランダム化することおよびファージディスプレイなどの選択方法論を使用することによって、個別のジンクフィンガーのＤＮＡ結合特性を人工的に操作可能であることが、複数の研究によって示された（Rebar et al., 1994, Science, 263:671; Choo et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163; Jamieson et al., 1994, Biochemistry 33:5689; Wu et al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 344）。そのような組換えジンクフィンガータンパク質は、転写活性化因子、転写抑制因子、メチル化ドメイン、およびヌクレアーゼなどの機能性ドメインと融合して、遺伝子発現を調節し、ＤＮＡメチル化を変化させ、モデル生物、植物、およびヒト細胞のゲノムに標的変化を導入することができる（Carroll, 2008, Gene Ther., 15:1463-68; Cathomen, 2008, Mol. Ther., 16:1200-07; Wu et al., 2007, Cell. Mol. Life Sci., 64:2933-44）。
【0059】
「モジュール集合」として公知の、ジンクフィンガーアレイを操作するための既存の一方法は、予備選択されたジンクフィンガーモジュールを単純に一緒に繋げてアレイにすることを提唱している（Segal et al., 2003, Biochemistry, 42:2137-48; Beerli et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20:135-141; Mandell et al., 2006, Nucleic Acids Res., 34:W516-523; Carroll et al., 2006, Nat. Protoc. 1:1329-41; Liu et al., 2002, J. Biol. Chem., 277:3850-56; Bae et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:275-280; Wright et al., 2006, Nat. Protoc., 1:1637-52）。あらゆる研究者によって実施されるに足るほど直接的であるものの、最近の報告により、本方法に関して、特にジンクフィンガーヌクレアーゼに関連する高い失敗率が実証された（Ramirez et al., 2008, Nat. Methods, 5:374-375; Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88）。これは、概して任意の所与の標的遺伝子について非常に多数のジンクフィンガータンパク質の構築および細胞ベースの試験を必要とする制約である（Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88）。
【0060】
ランダム化されたライブラリーからジンクフィンガーアレイを同定するコンビナトリアル選択ベース法は、モジュール集合よりも高い成功率を有することが示されている（Maeder et al., 2008, Mol. Cell, 31:294-301; Joung et al., 2010, Nat. Methods, 7:91-92; Isalan et al., 2001, Nat. Biotechnol., 19:656-660）。好ましい実施形態では、ジンクフィンガーアレイは、国際公開第２０１１／０１７２９３号パンフレットおよび同第２００４／０９９３６６号パンフレットに記載されている、またはそれらに記載されているように作製される。追加的で適切なジンクフィンガーＤＢＤは、米国特許第６，５１１，８０８号明細書、同第６，０１３，４５３号明細書、同第６，００７，９８８号明細書、および同第６，５０３，７１７号明細書ならびに米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号明細書に記載されている。
【0061】
異種機能性ドメイン
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、米国特許第８，９９３，２３３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１８９７７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号明細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１５００７１８９９号明細書および国際公開第２０１４／１２４２８４号パンフレットに記載されたような異種機能性ドメインを含む。好ましい実施形態では、異種機能性ドメインはＤＮＡを変化させる。例えば、好ましくは１つもしくは複数のヌクレアーゼ活性の低下もしくは死滅変異、および／またはＤＮＡ結合親和性を低下させる１つもしくは複数の変異を含むヌクレアーゼを、転写活性化ドメインまたは他の異種機能性ドメイン（例えば、転写抑制因子（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、ＳＩＤ、およびその他、例えば、ｅｔｓ２抑制因子（ＥＲＦ）の抑制ドメイン（ＥＲＤ）のアミノ酸４７３～５３０番、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインのアミノ酸１～９７番、もしくはＭａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１～３６番；Beerli et al., PNAS USA 95:14628-14633 (1998)参照）と融合させることができ、または当技術分野において公知のヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても公知）、例えば、ＨＰ１αもしくはＨＰ１βなどのサイレンサー；ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、もしくはラムダＮタンパク質によって結合されたもののような固定ＲＮＡ結合配列と融合した長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を動員できるタンパク質もしくはペプチド；ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）もしくはＴＥＴタンパク質）；またはヒストンサブユニットを修飾する酵素（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、リシンもしくはアルギニン残基のメチル化用）もしくはヒストンデメチラーゼ（例えば、リシンもしくはアルギニン残基の脱メチル化用））を使用することもできる。そのようなドメイン、例えば、ＤＮＡ中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインについてのいくつかの配列が、当技術分野において公知である。タンパク質の例には、ＤＮＡ中の５－メチルシトシン（５－ｍＣ）を５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ）に変換する酵素であるＴｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ－Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）１～３ファミリーが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、米国特許第８，９９３，２３３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１８９７７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号明細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１５００７１８９９号明細書および国際公開第２０１４／１２４２８４号パンフレットに記載されたような異種機能性ドメインを含む。好ましい実施形態では、異種機能性ドメインはＤＮＡを変化させる。例えば、好ましくは１つもしくは複数のヌクレアーゼ活性の低下もしくは死滅変異、および／またはＤＮＡ結合親和性を低下させる１つもしくは複数の変異を含むヌクレアーゼを、転写活性化ドメインまたは他の異種機能性ドメイン（例えば、転写抑制因子（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、ＳＩＤ、およびその他、例えば、ｅｔｓ２抑制因子（ＥＲＦ）の抑制ドメイン（ＥＲＤ）のアミノ酸４７３～５３０番、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインのアミノ酸１～９７番、もしくはＭａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１～３６番；Beerli et al., PNAS USA 95:14628-14633 (1998)参照）と融合させることができ、または当技術分野において公知のヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても公知）、例えば、ＨＰ１αもしくはＨＰ１βなどのサイレンサー；ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、もしくはラムダＮタンパク質によって結合されたもののような固定ＲＮＡ結合配列と融合した長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を動員できるタンパク質もしくはペプチド；ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）もしくはＴＥＴタンパク質）；またはヒストンサブユニットを修飾する酵素（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、リシンもしくはアルギニン残基のメチル化用）もしくはヒストンデメチラーゼ（例えば、リシンもしくはアルギニン残基の脱メチル化用））を使用することもできる。そのようなドメイン、例えば、ＤＮＡ中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインについてのいくつかの配列が、当技術分野において公知である。タンパク質の例には、ＤＮＡ中の５－メチルシトシン（５－ｍＣ）を５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ）に変換する酵素であるＴｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ－Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）１～３ファミリーが挙げられる。
【0062】
ヒトＴＥＴ１～３についての配列は、当技術分野において公知であり、次表に示される：
【0063】
【表3】
【0064】
一部の実施形態では、触媒ドメインの完全長配列の全部または一部、例えば、システインリッチ伸長部を含む触媒モジュールおよび７つの高度に保存されたエクソンによってコードされる２ＯＧＦｅＤＯドメイン、例えば、アミノ酸１５８０～２０５２番を含むＴｅｔ１触媒ドメイン、アミノ酸１２９０～１９０５番を含むＴｅｔ２、およびアミノ酸９６６～１６７８番を含むＴｅｔ３が含まれる場合がある。例えば、３つのＴｅｔタンパク質全てにおける主要な触媒残基を示しているアライメントについては、Iyer et al., Cell Cycle. 2009 Jun 1;8(11):1698-710. Epub 2009 Jun 27の図１を、完全長配列についてはその補足資料（ｆｔｐのサイト、ftp.ncbi.nih.gov/pub/aravind/DONS/supplementary_material_DONS.htmlから入手可能）を参照されたい（例えば、ｓｅｑ ２ｃ参照）。一部の実施形態では、配列は、Ｔｅｔ１のアミノ酸１４１８～２１３６番またはＴｅｔ２／３における対応する領域を含む。
【0065】
他の触媒モジュールは、Iyer et al., 2009において同定されたタンパク質に由来し得る。
【0066】
一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、生物学的テザーであり、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮタンパク質（に由来するＤＮＡ結合ドメイン、例えば）の全部または一部を含む。これらのタンパク質を使用して、特異的ステムループ構造を含有するＲＮＡ分子を、ｄＣａｓ９ ｇＲＮＡ標的化配列によって特定される場所に動員することができる。例えば、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮと融合したｄＣａｓ９バリアントを使用して、例えば、Ｃｓｙ４、ＭＳ２またはラムダＮ結合配列に連結されたＸＩＳＴまたはＨＯＴＡＩＲなどの長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を動員することができる。Keryer-Bibens et al., Biol. Cell 100:125-138 (2008)を参照されたい。あるいは、例えばKeryer-Bibens et al.（上記）のようにＣｓｙ４、ＭＳ２またはラムダＮタンパク質結合配列を別のタンパク質と連結することができ、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、このタンパク質をｄＣａｓ９バリアント結合部位に標的化することができる。一部の実施形態では、Ｃｓｙ４は触媒不活性である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアント、好ましくはｄＣａｓ９バリアントは、米国特許第８，９９３，２３３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１８９７７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号明細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１５００７１８９９号明細書および国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレットに記載されているように、ＦｏｋＩと融合される。
【0067】
リンカーおよびタグ
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ヌクレアーゼとＡＰとの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質（または連鎖状構造における融合タンパク質同士の間）に使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配列を含み得る。好ましい実施形態では、リンカーは、短鎖、例えばアミノ酸２～２０個であり、概して柔軟である（すなわち、グリシン、アラニン、およびセリンなどの高い自由度を有するアミノ酸を含む）。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号３）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４）からなる１つまたは複数のユニット、例えばＧＧＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＧＳ（配列番号６）ユニットの２、３、４つ、またはより多くのリピートを含む。他のリンカー配列、例えばＳＳＧＮＳＮＡＮＳＲＧＰＳＦＳＳＧＬＶＰＬＳＬＲＧＳＨを使用することもできる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ヌクレアーゼとＡＰとの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質（または連鎖状構造における融合タンパク質同士の間）に使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配列を含み得る。好ましい実施形態では、リンカーは、短鎖、例えばアミノ酸２～２０個であり、概して柔軟である（すなわち、グリシン、アラニン、およびセリンなどの高い自由度を有するアミノ酸を含む）。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号３）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４）からなる１つまたは複数のユニット、例えばＧＧＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＧＳ（配列番号６）ユニットの２、３、４つ、またはより多くのリピートを含む。他のリンカー配列、例えばＳＳＧＮＳＮＡＮＳＲＧＰＳＦＳＳＧＬＶＰＬＳＬＲＧＳＨを使用することもできる。
【0068】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、細胞内腔への送達を促す細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドを含む。例えば、Caron et al., (2001) Mol Ther. 3(3):310-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002); El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611;およびDeshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49を参照されたい。
【0069】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞膜を通過して細胞質または他のオルガネラ、例えばミトコンドリアおよび核への幅広い生体分子の移動を促す短鎖ペプチドである。ＣＰＰによって送達できる分子の例には、治療薬、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、およびリポソームが挙げられる。ＣＰＰは、一般的にアミノ酸３０個以下であり、天然または非天然のタンパク質またはキメラ配列由来であり、高い相対存在量の正荷電アミノ酸、例えばリシンもしくはアルギニン、または交互パターンの極性アミノ酸および非極性アミノ酸のいずれかを含有する。当技術分野において通常使用されるＣＰＰには、Ｔａｔ（Frankel et al., (1988) Cell. 55:1189-1193, Vives et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017）、ペネトラチン（Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:10444-10450）、ポリアルギニンペプチド配列（Wender et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008、Futaki et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840）、およびトランスポータン（Pooga et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:857-861）が挙げられる。
【0070】
ＣＰＰは、それらのカーゴと共有または非共有戦略により連結することができる。ＣＰＰとそのカーゴとを共有結合的に繋ぐ方法は、当技術分野において公知であり、例えば化学的架橋結合（Stetsenko et al., (2000) J. Org. Chem. 65:4900-4909、Gait et al. (2003) Cell. Mol. Life. Sci. 60:844-853）または融合タンパク質をクローニングすること（Nagahara et al., (1998) Nat. Med. 4:1449-1453）である。カーゴと、極性および非極性ドメインを含む短鎖両親媒性ＣＰＰとの間の非共有結合的カップリングは、静電および疎水性相互作用により確立される。
【0071】
ＣＰＰは、当技術分野において潜在的治療用生体分子を細胞内に送達するために利用されている。例には、免疫抑制用にポリアルギニンと連結されたシクロスポリン（Rothbard et al., (2000) Nature Medicine 6(11):1253-1257）、腫瘍形成を阻害するためのＭＰＧと呼ばれる、サイクリンＢ１に対するｓｉＲＮＡをＣＰＰと連結させたもの（Crombez et al., (2007) Biochem Soc. Trans. 35:44-46）、がん細胞の成長を低下させるための、ＣＰＰと連結した腫瘍抑制因子ｐ５３ペプチド（Takenobu et al., (2002) Mol. Cancer Ther. 1(12):1043-1049、Snyder et al., (2004) PLoS Biol. 2:E36）、および喘息を治療するための、Ｔａｔと融合した優性ネガティブ形態のＲａｓまたはホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）（Myou et al., (2003) J. Immunol. 171:4399-4405）が挙げられる。
【0072】
ＣＰＰは、当技術分野においてイメージングおよびバイオセンシング応用のために細胞内に造影剤を輸送するために利用されている。例えば、Ｔａｔと結合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、がん細胞を標識するために使用されている（Shokolenko et al., (2005) DNA Repair 4(4):511-518）。量子ドットとコンジュゲートしたＴａｔは、ラット脳の視覚化用に、血液脳関門をうまく通過させるために使用されている（Santra et al., (2005) Chem. Commun. 3144-3146）。ＣＰＰは、細胞イメージングのために磁気共鳴イメージング技術とも併用されている（Liu et al., (2006) Biochem. and Biophys. Res. Comm. 347(1):133-140）。Ramsey and Flynn, Pharmacol Ther. 2015 Jul 22. pii: S0163-7258(15)00141-2も参照されたい。
【0073】
代替的または追加的に、融合タンパク質は、核局在配列、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号７））およびヌクレオプラスミンＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号８））を含み得る。他のＮＬＳは、当技術分野において公知である。例えば、Cokol et al., EMBO Rep. 2000 Nov 15; 1(5): 411-415; Freitas and Cunha, Curr Genomics. 2009 Dec; 10(8): 550-557を参照されたい。
【0074】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、リガンドに対して高い親和性を有する部分、例えばＧＳＴ、ＦＬＡＧまたはヘキサヒスチジン配列を含む。そのような親和性タグは、組換えバリアントタンパク質の精製を容易にすることができる。
【0075】
融合タンパク質が細胞に送達される方法のために、当技術分野において公知の任意の方法を用いて、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳、または適切な宿主細胞中でバリアントタンパク質をコードする核酸からの発現により、融合タンパク質を産生させることができ、タンパク質を産生させるためにいくつかの方法が当技術分野において公知である。例えば、融合タンパク質は、酵母、大腸菌（E. coli）、昆虫細胞株、植物、トランスジェニック動物、または培養哺乳動物細胞から産生および精製することができる。例えば、Palomares et al., "Production of Recombinant Proteins: Challenges and Solutions," Methods Mol Biol. 2004;267:15-52を参照されたい。加えて、融合タンパク質は、任意選択でタンパク質が細胞内に入った後で切断されるリンカーと共に、細胞内への輸送を容易にする部分、例えば脂質ナノ粒子と連結することができる。例えば、LaFountaine et al., Int J Pharm. 2015 Aug 13;494(1):180-194を参照されたい。
【0076】
発現システム
本明細書に記載の融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましい場合がある。これは、様々な方法で行うことができる。例えば、複製および／または発現用に原核または真核細胞中で形質転換するために、融合タンパク質をコードする核酸を中間ベクターにクローニングすることができる。中間ベクターは、概して融合タンパク質の産生のために融合タンパク質をコードする核酸の貯蔵または操作のための原核生物ベクター、例えばプラスミド、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。融合タンパク質をコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞への投与用に発現ベクター中にクローニングすることもできる。
本明細書に記載の融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましい場合がある。これは、様々な方法で行うことができる。例えば、複製および／または発現用に原核または真核細胞中で形質転換するために、融合タンパク質をコードする核酸を中間ベクターにクローニングすることができる。中間ベクターは、概して融合タンパク質の産生のために融合タンパク質をコードする核酸の貯蔵または操作のための原核生物ベクター、例えばプラスミド、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。融合タンパク質をコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞への投与用に発現ベクター中にクローニングすることもできる。
【0077】
発現を得るために、融合タンパク質をコードする核酸配列は、概して、転写を指示するためにプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌および真核生物プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。操作タンパク質を発現させるための細菌発現システムは、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス属菌種（Bacillus sp.）、およびサルモネラ属（Salmonella）（Palva et al., 1983, Gene 22:229-235）において利用可能である。そのような発現システム用のキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞用の真核発現システムは、当技術分野において周知であり、これも市販されている。
【0078】
核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、強い構成性プロモーターが、概して、融合タンパク質の発現および精製のために使用される。対照的に、遺伝子調節のために融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで投与しようとする場合、融合タンパク質の特定の使用に応じて構成性または誘導性プロモーターのいずれかを使用することができる。加えて、融合タンパク質の投与に好ましいプロモーターは、ＨＳＶ ＴＫまたは類似の活性を有するプロモーターのような弱いプロモーターであり得る。プロモーターは、トランス活性化に応答性のエレメント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃ抑制因子応答エレメント、ならびにテトラサイクリン調節システムおよびＲＵ－４８６システムのような小分子調節システムも含み得る（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547; Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496; Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441; Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55;およびRendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol., 16:757-761を参照されたい）。
【0079】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、概して、原核または真核のいずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要な全ての追加的なエレメントを含有する転写ユニットまたは発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、融合タンパク質をコードする核酸配列と作動的に連結したプロモーター、および例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に必要な任意のシグナルを含有する。カセットの追加的なエレメントは、例えば、エンハンサーおよびスプライシングされた異種内部シグナルを含み得る。
【0080】
遺伝情報を細胞内に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、融合タンパク質の意図される使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの市販のタグ融合発現システムが挙げられる。
【0081】
真核ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターが、多くの場合に、真核発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルス由来のベクターに使用される。他の例示的な真核ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ならびにＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示された他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【0082】
融合タンパク質を発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を推進するためのＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばＨ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドのトランスフェクション後に哺乳動物細胞における融合タンパク質の発現を可能にする。
【0083】
いくつかの発現システムは、安定的にトランスフェクトされた細胞の選択用のマーカー、例えばチミジンキナーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。ポリヘドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイルスプロモーターの指示下でｇＲＮＡコード配列を有するバキュロウイルスベクターを昆虫細胞において使用することなどの高収率の発現システムも、適切である。
【0084】
概して発現ベクター中に含まれるエレメントには、大腸菌（E. coli）において機能するレプリコン、組換えプラスミドを収容する細菌を選択できるようにする抗生物質耐性コード遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミドの可欠領域中の独特な制限部位も挙げられる。
【0085】
標準的なトランスフェクション方法は、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞株を産生するために使用され、それらのタンパク質は、次に、標準的な技法を用いて精製される（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)を参照されたい）。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技法に従って行われる（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい。
【0086】
宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための公知の手順のいずれかが使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、エピソームおよび組込みの両方のウイルスベクターの使用、ならびにクローニング後のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝材料を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかが挙げられる（例えば、Sambrook et al.、上記を参照されたい）。必要なことは、使用される特定の遺伝子操作手順が、融合タンパク質を発現可能な宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子をうまく導入できることだけである。
【0087】
本発明は、本明細書に記載のベクターを含む核酸、ベクターおよび細胞も含む。
【0088】
キット
本明細書に記載の方法に使用するためのキットも、本明細書に提供される。キットは、以下：フレーム内に連結したＡＰを有する、またはＡＰの包含のための１つもしくは複数のクローニング部位を有する、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクター；精製組換えヌクレアーゼタンパク質；例えば必要ならば対照としての、ガイドＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生されたもの）；任意選択で対照鋳型ＤＮＡおよび／もしくはガイドＲＮＡを含む、ヌクレアーゼと共に使用するための試薬；ならびに／または本明細書に記載の方法に使用するための説明書の１つまたは複数を含み得る。
本明細書に記載の方法に使用するためのキットも、本明細書に提供される。キットは、以下：フレーム内に連結したＡＰを有する、またはＡＰの包含のための１つもしくは複数のクローニング部位を有する、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクター；精製組換えヌクレアーゼタンパク質；例えば必要ならば対照としての、ガイドＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生されたもの）；任意選択で対照鋳型ＤＮＡおよび／もしくはガイドＲＮＡを含む、ヌクレアーゼと共に使用するための試薬；ならびに／または本明細書に記載の方法に使用するための説明書の１つまたは複数を含み得る。
【実施例】
【0089】
以下の実施例の中で本発明をさらに説明するが、この実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【0090】
[実施例１]
エピジェネティックに調節される配列特異的ヌクレアーゼ
Ｒ６６１ＡおよびＱ６９５Ａ変異を担持する、またはＲ６６１ＡおよびＱ９２６Ａ変異を担持するＳｐＣａｓ９バリアントを、ゲノムに組み込まれた単一コピーＥＧＦＰレポーター遺伝子に標的化された操作ジンクフィンガーアレイ（ＺＦ２９２Ｒ）と遺伝的に融合させたシステムを開発した。ＥＧＦＰコード領域にヌクレアーゼ誘導ＤＳＢを導入し、それを次にＮＨＥＪにより修復することで、フレームシフト変異の導入をもたらすことができ、細胞を、フローサイトメトリーを用いて定量的にアッセイできる表現型であるＥＧＦＰ陰性にすることができる。本発明者らは、ＥＧＦＰ中の同じ部位を標的化する４つの異なるｇＲＮＡバリアント：（１）標的部位と相同な２０ｎｔを有するｇＲＮＡであって、標的部位配列とミスマッチである、追加的に５’に付加されたＧを有するｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１）、（２）標的部位と相同な１９ｎｔを有するｇＲＮＡであって、５’の２０番目のｎｔに標的部位とミスマッチであるＧを有するｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ２）、（３）標的部位と相同な１８ｎｔを有するｇＲＮＡであって、標的部位とミスマッチである２つのＧを５’に有するｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ３）、および（４）標的部位と相同な１７ｎｔを有するｇＲＮＡであって、追加的なミスマッチのＧのｎｔを有しない、完全にマッチしたｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ４）と一緒にＺＦ２９２Ｒジンクフィンガーアレイを有するおよび有しないこれらのバリアントヌクレアーゼの活性を試験した。４つのｇＲＮＡの全てを用いて試験したとき、ＥＧＦＰ破壊アッセイで判定して、ＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）およびＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ９２６Ａ）は、ＺＦ２９２Ｒと融合したときに両方ともヌクレアーゼ活性の増加を示した（図２Ａ）。本発明者らは、配列ベースの挿入欠失定量アッセイであるＴＩＤＥも行って、これらのヌクレアーゼ複合体のそれぞれのヌクレアーゼ活性を直接評価した。フローサイトメトリーアッセイと一致して、ＴＩＤＥによる細胞集団の分析により、試験した４つのｇＲＮＡの全てで両方のＳｐＣａｓ９バリアントがＺＦ２９２Ｒと融合したときに、挿入欠失の形成率が増加することが実証された（図２Ｂ）。
エピジェネティックに調節される配列特異的ヌクレアーゼ
Ｒ６６１ＡおよびＱ６９５Ａ変異を担持する、またはＲ６６１ＡおよびＱ９２６Ａ変異を担持するＳｐＣａｓ９バリアントを、ゲノムに組み込まれた単一コピーＥＧＦＰレポーター遺伝子に標的化された操作ジンクフィンガーアレイ（ＺＦ２９２Ｒ）と遺伝的に融合させたシステムを開発した。ＥＧＦＰコード領域にヌクレアーゼ誘導ＤＳＢを導入し、それを次にＮＨＥＪにより修復することで、フレームシフト変異の導入をもたらすことができ、細胞を、フローサイトメトリーを用いて定量的にアッセイできる表現型であるＥＧＦＰ陰性にすることができる。本発明者らは、ＥＧＦＰ中の同じ部位を標的化する４つの異なるｇＲＮＡバリアント：（１）標的部位と相同な２０ｎｔを有するｇＲＮＡであって、標的部位配列とミスマッチである、追加的に５’に付加されたＧを有するｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１）、（２）標的部位と相同な１９ｎｔを有するｇＲＮＡであって、５’の２０番目のｎｔに標的部位とミスマッチであるＧを有するｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ２）、（３）標的部位と相同な１８ｎｔを有するｇＲＮＡであって、標的部位とミスマッチである２つのＧを５’に有するｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ３）、および（４）標的部位と相同な１７ｎｔを有するｇＲＮＡであって、追加的なミスマッチのＧのｎｔを有しない、完全にマッチしたｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ４）と一緒にＺＦ２９２Ｒジンクフィンガーアレイを有するおよび有しないこれらのバリアントヌクレアーゼの活性を試験した。４つのｇＲＮＡの全てを用いて試験したとき、ＥＧＦＰ破壊アッセイで判定して、ＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）およびＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ９２６Ａ）は、ＺＦ２９２Ｒと融合したときに両方ともヌクレアーゼ活性の増加を示した（図２Ａ）。本発明者らは、配列ベースの挿入欠失定量アッセイであるＴＩＤＥも行って、これらのヌクレアーゼ複合体のそれぞれのヌクレアーゼ活性を直接評価した。フローサイトメトリーアッセイと一致して、ＴＩＤＥによる細胞集団の分析により、試験した４つのｇＲＮＡの全てで両方のＳｐＣａｓ９バリアントがＺＦ２９２Ｒと融合したときに、挿入欠失の形成率が増加することが実証された（図２Ｂ）。
【0091】
ＤＮＡと結合した人工転写因子への結合に活性が依存するヌクレアーゼを生み出すための原理証明をもたらすために、本発明者らは、次に、操作ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ ＧＣＮ４）が堅固および特異的に結合できるＧＣＮ４ペプチドに、ＺＦ２９２Ｒが遺伝的に融合している（ＧＣＮ４－ＺＦ２９２Ｒ）システムを開発した。本発明者らは、このｓｃＦｖ ＧＣＮ４をＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）およびＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ９２６Ａ）と直接融合し、ＧＣＮ４－ＺＦ２９２Ｒ融合物の存在下または不在下でこれらのＳｐＣａｓ９－ｓｃＦｖ ＧＣＮ４融合物がＥＧＦＰを破壊することができるかどうかを、ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、またはｇＲＮＡ３を使用して評価した（図２Ｃ）。ＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）－ｓｃＦｖ ＧＣＮ４およびＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ９２６Ａ）－ｓｃＦｖ ＧＣＮ４の両方は、ＧＣＮ４－ＺＦ２９２Ｒと同時発現したときにフローサイトメトリーにより判定されたＥＧＦＰの破壊の強化を示した。この活性がＧＣＮ４－ＺＦ２９２ＲとｓｃＦｖ ＧＣＮ４との間の相互作用に特異的であったかどうか判定するために、本発明者らは、ＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）－ｓｃＦｖ ＧＣＮ４をＧＣＮ４－ＺＦ２９２ＲまたはＨ３（１－３８）－ＺＦ２９２Ｒ（同じＺＦ２９２ＲジンクフィンガーアレイをヒストンＨ３のＮ末端のアミノ酸３８個に融合したもの）と同時発現させた第２の実験を行った。ｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２を使用して、Ｈ３（１－３８）－ＺＦ２９２ＲではなくＧＣＮ４－ＺＦ２９２Ｒと同時発現したときに、ＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）－ｓｃＦｖ ＧＣＮ４は、実際にＥＧＦＰ破壊の増加を示した（図３Ａ）。フローサイトメトリーアッセイと一致して、ＴＩＤＥによるこれらの細胞集団の分析により、Ｈ３（１－３８）－ＺＦ２９２Ｒではなく、ＧＣＮ４－ＺＦ２９２Ｒと同時発現した場合にかぎり、ＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ）－ｓｃＦｖ ＧＣＮ４による挿入欠失の形成率の増加が実証された（図３Ｂ）。追加的に対照として、ＥＧＦＰ中の異なる標的部位と完全に相補的な２０ｎｔを担持し、５’にミスマッチのＧが付加されていないｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ５）を用いて各ＳｐＣａｓ９融合構築物を試験して、これらのタンパク質が上記のｇＲＮＡ修飾の不在下で野生型ＳｐＣａｓ９に匹敵するヌクレアーゼ活性を保持していることを確認した。
【0092】
[実施例２]
クロマチンの三次元コンフォメーションに依存する配列特異的ヌクレアーゼ
以前の研究により、ＳｐＣａｓ９は、操作ジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）またはＴＡＬＥリピートアレイなどの第２のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）によりその標的部位近くに繋がれた場合にかぎり、ＤＳＢを誘導するように操作できることが示された。これは、ＳｐＣａｓ９の位置Ｒ１３３３またはＲ１３３５に、このタンパク質がそのＰＡＭモチーフを認識する能力に影響する変異を導入することによって達成される（このような変異体は、Ｃａｓ９ ＰＡＭ相互作用ドメインノックダウンまたはＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤと呼ばれる）。戦略１に記載されたものと類似のＥＧＦＰ破壊アッセイを使用して、本発明者らは、標的部位でＳａＣａｓ９とＰＡＭ配列との間の相互作用に影響する変異Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、またはＲ１０１５Ｈを担持するＳａＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤに第２のＺＦ ＤＢＤを融合することによって、ＳａＣａｓ９を用いた類似のシステムを操作できることを示した（図４Ａおよび４Ｂ）。これを試験するために、本発明者らは、ＺＦ２９２Ｒドメインの結合部位に隣接するＥＧＦＰレポーター遺伝子中の部位に標的化された、Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、またはＲ１０１５Ｈ変異を担持するＳａＣａｓ９バリアントの融合物を、標的部位と２１ｎｔの相補性を有するｇＲＮＡを用いて試験した。ＺＦ２９２Ｒ ＤＢＤにこれらのＳａＣａｓ９バリアントを融合させることで、これらのヌクレアーゼに有意なＥＧＦＰ破壊活性が回復した（図４Ｃ）。本発明のために、本発明者らは、直鎖配列においてＣａｓ９標的部位から遠位であるが、特定の細胞型における三次元空間ではほんの近位であるＤＮＡ配列に結合する操作ＺＦまたはＴＡＬＥにＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤを融合することを構想している。したがって、この立体配置で、第２のＤＢＤによって標的化される遠位配列と、Ｃａｓ９ ＰＩＤ ＫＤの標的部位との間の細胞型特異的クロマチンループ形成は、ヌクレアーゼをｇＲＮＡ標的部位に近づけ、Ｃａｓ９ ＰＩＤ ＫＤに標的遺伝子のＤＳＢを誘導させる（図５Ａおよび５Ｂ）。さらに本発明者らは、Ｃａｓ９ ＰＩＤ ＫＤの代わりに、表１に概略を示したＳｐＣａｓ９バリアントを、遠位調節配列を標的化する操作ＤＢＤと融合することを提案する。戦略１および戦略２に概要を示したｇＲＮＡ修飾を使用して、第２のＤＢＤが、ｇＲＮＡ標的部位の近位のその標的部位と結合可能な場合にかぎり（例えば、遠位の調節エレメントと関心対象の遺伝子との間にループ形成がある細胞型にかぎり）、ＳｐＣａｓ９バリアントからヌクレアーゼ活性を獲得することができるであろう。
クロマチンの三次元コンフォメーションに依存する配列特異的ヌクレアーゼ
以前の研究により、ＳｐＣａｓ９は、操作ジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）またはＴＡＬＥリピートアレイなどの第２のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）によりその標的部位近くに繋がれた場合にかぎり、ＤＳＢを誘導するように操作できることが示された。これは、ＳｐＣａｓ９の位置Ｒ１３３３またはＲ１３３５に、このタンパク質がそのＰＡＭモチーフを認識する能力に影響する変異を導入することによって達成される（このような変異体は、Ｃａｓ９ ＰＡＭ相互作用ドメインノックダウンまたはＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤと呼ばれる）。戦略１に記載されたものと類似のＥＧＦＰ破壊アッセイを使用して、本発明者らは、標的部位でＳａＣａｓ９とＰＡＭ配列との間の相互作用に影響する変異Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、またはＲ１０１５Ｈを担持するＳａＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤに第２のＺＦ ＤＢＤを融合することによって、ＳａＣａｓ９を用いた類似のシステムを操作できることを示した（図４Ａおよび４Ｂ）。これを試験するために、本発明者らは、ＺＦ２９２Ｒドメインの結合部位に隣接するＥＧＦＰレポーター遺伝子中の部位に標的化された、Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、またはＲ１０１５Ｈ変異を担持するＳａＣａｓ９バリアントの融合物を、標的部位と２１ｎｔの相補性を有するｇＲＮＡを用いて試験した。ＺＦ２９２Ｒ ＤＢＤにこれらのＳａＣａｓ９バリアントを融合させることで、これらのヌクレアーゼに有意なＥＧＦＰ破壊活性が回復した（図４Ｃ）。本発明のために、本発明者らは、直鎖配列においてＣａｓ９標的部位から遠位であるが、特定の細胞型における三次元空間ではほんの近位であるＤＮＡ配列に結合する操作ＺＦまたはＴＡＬＥにＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９ ＰＩＤ ＫＤを融合することを構想している。したがって、この立体配置で、第２のＤＢＤによって標的化される遠位配列と、Ｃａｓ９ ＰＩＤ ＫＤの標的部位との間の細胞型特異的クロマチンループ形成は、ヌクレアーゼをｇＲＮＡ標的部位に近づけ、Ｃａｓ９ ＰＩＤ ＫＤに標的遺伝子のＤＳＢを誘導させる（図５Ａおよび５Ｂ）。さらに本発明者らは、Ｃａｓ９ ＰＩＤ ＫＤの代わりに、表１に概略を示したＳｐＣａｓ９バリアントを、遠位調節配列を標的化する操作ＤＢＤと融合することを提案する。戦略１および戦略２に概要を示したｇＲＮＡ修飾を使用して、第２のＤＢＤが、ｇＲＮＡ標的部位の近位のその標的部位と結合可能な場合にかぎり（例えば、遠位の調節エレメントと関心対象の遺伝子との間にループ形成がある細胞型にかぎり）、ＳｐＣａｓ９バリアントからヌクレアーゼ活性を獲得することができるであろう。
【0093】
本出願は例えば以下の発明も提供する。
[１] 特異的転写因子（ＴＦ）または翻訳後ヒストン修飾に対して高い親和性を有する操作親和性タンパク質（ＡＰ）と連結された標的ヌクレアーゼを含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[２] 前記ＡＰが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、[１]に記載の方法。
[３] 前記ヌクレアーゼが、１）メガヌクレアーゼ、２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、３）転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および４）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）からなる群から選択される、[１]に記載の方法。
[４] 前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ＲＧＮであり、前記方法が、ガイドＲＮＡの存在下で行われる、[３]に記載の方法。
[５] 前記ヌクレアーゼが、表１に示される残基のうちの１つまたは複数の変異を有する化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、[４]に記載の方法。
[６] Ｒ１０１５に変異を含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９と融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦ ＤＢＤ）またはＴＡＬ ＤＮＡ結合アレイを含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[７] 前記黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９が、Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、およびＲ１０１５Ｈからなる群から選択される変異を含む、[６]に記載の方法。
[８] （ｉ）標的ＤＮＡ結合ドメインまたはガイドＲＮＡと一緒の触媒不活性「ｄｅａｄ」ＲＧＮ（ｄＲＧＮ）、（ｉｉ）異種機能性ドメイン、および（ｉｉｉ）操作親和性タンパク質（ＡＰ）によって認識される転写因子またはヒストン修飾がＤＮＡ結合ドメインまたはｄＲＧＮの標的部位の近位に存在する場合にかぎり活性である前記ＡＰ、を含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[９] 前記ＡＰが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、[８]に記載の方法。
[１０] 前記機能性ドメインが、転写調節ドメイン、ヒストン修飾酵素、またはＤＮＡ修飾酵素である、[９]に記載の方法。
[１１] 前記ガイドＲＮＡが、（ｉ）１９、１８、および１７ｂｐのスペーサー長を有するｇＲＮＡ；（ｉｉ）目的の標的部位と比べて１、２、または３つの意図的なミスマッチを有するｇＲＮＡ；（ｉｉｉ）オンターゲット部位と相補的な２０ｎｔを有し、追加的なＧ塩基（標的ＤＮＡ配列とミスマッチである）が５’に付加されたｇＲＮＡ；ならびに（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組合せからなる群から選択される、[４]または[８]に記載の方法。
[１２] 前記ガイドＲＮＡが、前記標的ＤＮＡに対する、９、１０、１１、１２、または１３個のヌクレオチド塩基の非常に短い相補性配列を担持する切断型ｇＲＮＡである、[８]に記載の方法。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明したが、前記の説明は、添付の特許請求の範囲によ
って定義される本発明の範囲を限定するのではなく、例証することを意図していることを
理解すべきである。他の態様、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
[１] 特異的転写因子（ＴＦ）または翻訳後ヒストン修飾に対して高い親和性を有する操作親和性タンパク質（ＡＰ）と連結された標的ヌクレアーゼを含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[２] 前記ＡＰが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、[１]に記載の方法。
[３] 前記ヌクレアーゼが、１）メガヌクレアーゼ、２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、３）転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および４）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）からなる群から選択される、[１]に記載の方法。
[４] 前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ＲＧＮであり、前記方法が、ガイドＲＮＡの存在下で行われる、[３]に記載の方法。
[５] 前記ヌクレアーゼが、表１に示される残基のうちの１つまたは複数の変異を有する化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、[４]に記載の方法。
[６] Ｒ１０１５に変異を含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９と融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦ ＤＢＤ）またはＴＡＬ ＤＮＡ結合アレイを含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[７] 前記黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９が、Ｒ１０１５Ａ、Ｒ１０１５Ｑ、およびＲ１０１５Ｈからなる群から選択される変異を含む、[６]に記載の方法。
[８] （ｉ）標的ＤＮＡ結合ドメインまたはガイドＲＮＡと一緒の触媒不活性「ｄｅａｄ」ＲＧＮ（ｄＲＧＮ）、（ｉｉ）異種機能性ドメイン、および（ｉｉｉ）操作親和性タンパク質（ＡＰ）によって認識される転写因子またはヒストン修飾がＤＮＡ結合ドメインまたはｄＲＧＮの標的部位の近位に存在する場合にかぎり活性である前記ＡＰ、を含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[９] 前記ＡＰが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）免疫グロブリン結合プロテインＡ、操作ナノボディー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、[８]に記載の方法。
[１０] 前記機能性ドメインが、転写調節ドメイン、ヒストン修飾酵素、またはＤＮＡ修飾酵素である、[９]に記載の方法。
[１１] 前記ガイドＲＮＡが、（ｉ）１９、１８、および１７ｂｐのスペーサー長を有するｇＲＮＡ；（ｉｉ）目的の標的部位と比べて１、２、または３つの意図的なミスマッチを有するｇＲＮＡ；（ｉｉｉ）オンターゲット部位と相補的な２０ｎｔを有し、追加的なＧ塩基（標的ＤＮＡ配列とミスマッチである）が５’に付加されたｇＲＮＡ；ならびに（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組合せからなる群から選択される、[４]または[８]に記載の方法。
[１２] 前記ガイドＲＮＡが、前記標的ＤＮＡに対する、９、１０、１１、１２、または１３個のヌクレオチド塩基の非常に短い相補性配列を担持する切断型ｇＲＮＡである、[８]に記載の方法。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明したが、前記の説明は、添付の特許請求の範囲によ
って定義される本発明の範囲を限定するのではなく、例証することを意図していることを
理解すべきである。他の態様、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
