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特許7399885内胚葉細胞から肝臓系統の細胞集団を作り出すためのプロセス、及び、それを含む細胞組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-08
(45)【発行日】2023-12-18
(54)【発明の名称】内胚葉細胞から肝臓系統の細胞集団を作り出すためのプロセス、及び、それを含む細胞組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20231211BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020564836
(86)(22)【出願日】2019-05-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-16
(86)【国際出願番号】 CA2019050705
(87)【国際公開番号】W WO2019222853
(87)【国際公開日】2019-11-28
【審査請求日】2022-05-09
(31)【優先権主張番号】62/676,582
(32)【優先日】2018-05-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】519185052
【氏名又は名称】バロリゼーション－エイチエスジェイ リミテッド パートナーシップ
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＬＯＲＩＳＡＴＩＯＮ－ＨＳＪ， ＬＩＭＩＴＥＤ ＰＡＲＴＮＥＲＳＨＩＰ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】マッシミリアーノ パガネッリ
(72)【発明者】
【氏名】クラウディア ラッジ
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５３４２６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０４８１９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Stem Cells，2016年，Vol.34，pp.2635-2647
【文献】Stem Cell Reports，2018年03月13日，Vol.10，pp.780-793
【文献】bioRxiv，2017年，doi: https://doi.org/10.1101/174698
【文献】Gastroentertology，2010年，Vol.138，pp.2233-2245
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
内胚葉細胞から後方前腸細胞を作り出すプロセスであって、前記プロセスは、前記内胚葉細胞を、インスリンを含まない第１の培養培地と接触させることを含み、かつ、前記内胚葉細胞を前記後方前腸細胞に分化させることを許容する条件下で第１の添加剤セットを含み、前記第１の添加剤セットは、インスリンを含んでおらず、かつ：●骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子であるＢＭＰ４；
●線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子であるｂＦＧＦ；
●Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子であるＩＷＰ２；及び
●形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達経路の阻害因子であるＡ８３－０１、を含む、または、それらからなる、前記プロセス。
【請求項2】
前記後方前腸細胞から肝前駆細胞を作り出すこと、及び、肝前駆細胞から肝細胞様細胞を作り出すことをさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
前記第１の培養培地は、血清を含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項4】
前記内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、または、ＥＯＭＥＳの内の少なくとも１つを発現する、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項5】
前記内胚葉細胞は、ｃ－Ｋｉｔを発現することができない、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項6】
前記後方前腸細胞は、ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、または、アルブミンの内の少なくとも１つを発現する、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項7】
請求項１または２に記載のプロセスによって取得した後方前腸細胞の集団であって、
前記後方前腸細胞がＦＯＸＡ１、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＨＨＥＸおよび、ＰＲＯＸ１遺伝子を発現する、後方前腸細胞の集団。
【請求項8】
請求項１に記載の第１の添加剤セットを含み、かつ、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子を含まない第１の培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月２５日に出願した米国仮出願第６２／６７６５８２号の優先権を主張するものであり、その出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
本出願は、２０１８年５月２５日に出願した米国仮出願第６２／６７６５８２号の優先権を主張するものであり、その出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【背景技術】
【0002】
生存能力を備えており、かつ、機能的な肝細胞様細胞を高収率で取得すること、とりわけ、そのような細胞を、人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞から分化させて取得することが困難であることは証明されている。再現性のある方法で、均質な細胞集団を取得することが困難であることも証明されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
したがって、特に、治療薬、及び／または、潜在的治療薬などの分子の代謝を可能ならしめる生物学的活性を示す肝細胞系統由来の細胞の提供が待望されている。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示は、培養の間に特定の添加剤を提供または除外することによって、多能性細胞を、生存能力を備えており、かつ、機能的である肝細胞様細胞に分化させるプロセスに関する。このプロセスは、多能性細胞（または、結果として生じる分化細胞）を中胚葉系統へ分化することを促さず、また、一部の実施形態では、それを許容せずに、多能性細胞を内胚葉系統に分化させるプロセスでもある。このプロセスは、内胚葉への分化を促すために、Ｗｎｔ経路（Ｎｏｄａｌ発現を許容する）、及び、ＴＧＦβ経路の活性化を含む。内胚葉の前後パターンの最初の移行は、胚体内胚葉の後端でのＷｎｔ、ＦＧＦ、及び、ＢＭＰシグナル伝達の組み合わせで開始する。ＴＧＦβ経路の阻害、ならびに、ＦＧＦ及びＢＭＰシグナル伝達の使用と相まって、前方内胚葉におけるＷｎｔ経路の初期抑制は、Ｈｅｘ（肝臓（及び、膵臓）の発達に必要である）の発現を可能にする。Ｗｎｔシグナル伝達の最初の抑制の直後に、肝臓の成長のための同じ経路が活性化を受ける。分化を促すための肝間葉、及び、内皮細胞由来のＦＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔ、及び、ＨＧＦ経路を含む継続的なシグナル伝達。肝細胞様細胞への成熟には、サイトカイン、糖質コルチコイド、ＨＧＦ、及び、Ｗｎｔが有用である。ＯＳＭなどのサイトカインは、分極した上皮への形態学的成熟を誘導する。
【0005】
第１の態様では、本開示は、内胚葉細胞から後方前腸細胞を作り出すプロセスを提供する。このプロセスは、内胚葉細胞を、インスリンを含まない第１の培養培地と接触させること、及び、内胚葉細胞から後方前腸細胞への分化を許容する条件下で第１の添加剤セットを含む、ことを含む。第１の添加剤セットは、インスリンを含んでおらず、かつ、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子；Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子；及び、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達経路の阻害因子を含む、または、本質的にそれらからなる。ある実施形態では、第１の培養培地は、血清を含む。別の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子は、ＢＭＰ受容体アゴニスト、例えば、ＢＭＰ４である。別の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子は、ＦＧＦ受容体アゴニスト、例えば、塩基性ＦＧＦである。さらなる実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子は、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ、例えば、ＩＷＰ２の生物学的活性を阻害することができる。さらに別の実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子は、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、または、ＡＬＫ７の内の少なくとも１つ、例えば、Ａ８３－０１の生物学的活性を阻害することができる。ある実施形態では、内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、または、ＥＯＭＥＳの内の少なくとも１つを発現し、及び／または、ｃ－Ｋｉｔを実質的に発現しない。本開示に関連して使用する後方前腸細胞の細胞集団は、細胞の３％未満が、ｃ－Ｋｉｔマーカーに対して陽性であると、「ｃ－Ｋｉｔを、実質的に発現することができない」。したがって、後方前腸細胞に由来する細胞は、それらの内胚葉起源が故に、ｃ－Ｋｉｔを実質的に発現することもできない。別の実施形態では、後方前腸細胞は、ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、または、アルブミンの内の少なくとも１つを発現する。本開示は、本明細書に記載したプロセスによって取得可能である、または、取得した後方前腸細胞の集団も提供する。
【0006】
第２の態様では、本開示は、後腸前腸細胞から肝前駆細胞を作り出すためのプロセスを提供する。このプロセスは、後方前腸細胞から肝前駆細胞への分化を許容する条件下で、後方前腸細胞を、第２の添加剤セットを含む第２の培養培地と接触させることを含み、第２の添加剤セットは：インスリンシグナル伝達経路の活性化因子；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子；及び、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子を含む、または、本質的にそれらからなる。ある実施形態では、第２の培養培地は、血清を含む。別の実施形態では、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子は、インスリン受容体アゴニスト、例えば、インスリンである。別の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子は、ＢＭＰ受容体アゴニスト、例えば、ＢＭＰ４である。さらなる実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子は、ＦＧＦ受容体アゴニスト、例えば、塩基性ＦＧＦである。さらに別の実施形態では、ＨＧＦシグナル伝達の活性化因子は、ＨＧＦ受容体アゴニスト、例えば、ＨＧＦである。さらに別の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子は、ＧＳＫ３、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１の生物学的活性を阻害することができる。ある実施形態では、後方前腸細胞は、ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、または、アルブミンの内の少なくとも１つを発現する。別の実施形態では、肝細胞前駆細胞は、α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、または、ＨＮＦ４ａの内の少なくとも１つを発現する。本開示はまた、本明細書に記載したプロセスによって取得可能である、または、取得した肝細胞前駆細胞の集団を提供する。
【0007】
第３の態様によれば、本開示は、肝前駆細胞から肝細胞様細胞を作り出すためのプロセスを提供する。このプロセスは、（ｉ）肝細胞系統の細胞を取得する条件下で、肝前駆細胞を、第３の添加剤セットを含む第３の培養培地と接触させる、（ｉｉ）未成熟肝細胞様細胞を取得する条件下で、肝細胞系統の細胞を、第４の添加剤セットを含む第４の培養培地と接触させる、及び、（ｉｉｉ）成熟肝細胞様細胞を取得する条件下で、未成熟肝細胞様細胞を、サイトカインを含まず、かつ、第５の添加剤セットを含む第５の培養培地と接触させる、ことを含む。第３の添加剤セットは、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達経路の阻害因子、サイトカイン、及び、糖質コルチコイドを含む、または、本質的にそれらからなる。第４の添加剤セットは、サイトカイン、及び、糖質コルチコイドを含む、または、本質的にそれらからなる。第５の添加剤セットは、サイトカインを含まず、かつ、糖質コルチコイドを含む、または、本質的にそれからなる。ある実施形態では、第４、第５、及び／または、第６の培養培地は、血清を含む。別の実施形態では、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子は、インスリン受容体アゴニスト、例えば、インスリンである。さらなる実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子は、ＢＭＰ受容体アゴニスト、例えば、ＢＭＰ４である。さらに別の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子は、ＦＧＦ受容体アゴニスト、例えば、塩基性ＦＧＦである。さらに別の実施形態では、ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子は、ＨＧＦ受容体アゴニスト、例えば、ＨＧＦである。なおも別の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子は、ＧＳＫ３、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１の生物学的活性を阻害することができる。さらに別の実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子は、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、または、ＡＬＫ７の内の少なくとも１つ、例えば、Ａ８３－０１の生物学的活性を阻害することができる。別の実施形態では、サイトカインは、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）である。別の実施形態では、糖質コルチコイドは、デキサメタゾンである。さらに別の実施形態では、肝前駆細胞は、α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、または、ＨＮＦ４ａの内の少なくとも１つを発現する。さらに別の実施形態では、未成熟肝細胞様細胞、及び／または、成熟肝細胞様細胞は、α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１、ＨＮＦ４ａ、または、ＳＯＸ９の内の少なくとも１つを発現する。ある実施形態では、成熟肝細胞様細胞は、検出可能なＣｙｐ３Ａ４活性を有しており、検出可能なレベルのアルブミン、及び／または、尿素を発現する。本開示は、本明細書に記載したプロセスによって取得可能である、または、取得した肝細胞様細胞の集団も提供する。
【0008】
第４の態様によれば、本開示は、内胚葉細胞から肝前駆細胞を作り出すためのプロセスを提供する。このプロセスは、（ａ）本明細書に記載したプロセスを実行して、後方前腸細胞を取得する、または、本明細書に記載した後方前腸細胞の集団を提供する；及び、（ｂ）後方前腸細胞を、本明細書に記載したプロセスに供して、肝前駆細胞を取得する、ことを含む、または、本質的にそれらからなる。本開示は、本明細書に記載したプロセスによって取得可能である、または、取得した肝前駆細胞の集団も提供する。
【0009】
第５の態様によれば、本開示は、肝前駆細胞から肝細胞様細胞を作り出すためのプロセスを提供する。このプロセスは、（ａ）本明細書に記載したプロセスを実行して、肝前駆細胞を取得する、または、本明細書に記載した肝前駆細胞の集団を提供する；及び、（ｂ）肝前駆細胞を、本明細書に記載したプロセスに供して、肝細胞様細胞を取得する、ことを含む、または、本質的にそれらからなる。本開示は、本明細書に記載したプロセスによって取得可能である、または、取得した肝細胞様細胞の集団も提供する。
【0010】
第６の態様によれば、本開示は、内胚葉細胞から肝細胞様細胞を作り出すためのプロセスを提供する。このプロセスは：（ａ）本明細書に記載したプロセスを任意に実行して、後方前腸細胞を取得する、または、本明細書に記載した後前腸細胞の集団を任意に提供する；（ｂ）後方前腸細胞を、本明細書に記載したプロセスに供して、肝前駆細胞を取得する、または、本明細書に記載した肝前駆細胞の集団を提供する；及び、（ｃ）肝前駆細胞を本明細書に記載したプロセスに供して、肝細胞様細胞を取得する、ことを含む、または、本質的にそれらからなる。本開示は、本明細書に記載したプロセスによって取得可能である、または、取得した肝細胞様細胞の集団も提供する。
【0011】
第７の態様によれば、本開示は、被包化肝臓組織を作り出すためのプロセスを提供する。このプロセスは、（ａ）本明細書に記載した肝細胞様細胞の集団を提供する；（ｂ）懸濁液において、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞を組み合わせ、そして、培養して、（ｉ）肝細胞様細胞、及び／または、胆管上皮細胞で少なくとも部分的に覆われており、かつ、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞を含む細胞コア、（ｉｉ）球状の形態、及び、（ｉｉｉ）約５０～約５００μｍの相対直径を含む、少なくとも１つの肝臓オルガノイドを取得する；及び、（ｃ）少なくとも１つの前記肝臓オルガノイドを、第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも一部を覆う、ことを含む。ある実施形態では、内胚葉細胞と肝細胞様細胞は、培養前に、１：０．２～７の比率で組み合わせる。別の実施形態では、肝細胞と内皮細胞は、培養前に、１：０．２～１の比率で組み合わせる。さらに別の実施形態では、肝細胞、内胚葉細胞、及び、内皮細胞の内の少なくとも１つは、多能性幹細胞などの多能性細胞を分化して取得する。ある実施形態では、内皮細胞は、内皮前駆細胞である。さらなる実施形態では、このプロセスは、少なくとも１つの肝臓オルガノイドを、例えば、架橋ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）グリコール（ＰＥＧ）を含む、第１の生体適合性架橋ポリマーで実質的に覆うことを含む。別の実施形態では、このプロセスは、第２の生体適合性架橋ポリマーで、第１の生体適合性架橋ポリマーの少なくとも一部を覆うこと、及び、一部の実施形態では、実質的に覆うことをさらに含む。ある実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマー、及び／または、第２の生体適合性架橋ポリマーは、少なくとも一部が生分解性である。さらに別の実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含む。本開示は、本明細書に記載したプロセスによって取得可能である、または、取得した被包化肝臓組織も提供する。
【0012】
第８の態様によれば、本開示は、添加剤セット、ならびに、それを含む培地を提供する。ある実施形態では、本開示は、本明細書に記載した第１の添加剤セット、ならびに、第１の添加剤セットを含み、かつ、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子を含まない第１の培養培地を提供する。ある実施形態では、第１の培養培地は、内胚葉細胞、及び／または、後方前腸細胞をさらに含む。別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載した第２の添加剤セット、ならびに、第２の添加剤セットを含む第２の培養培地を提供する。ある実施形態では、第２の培養培地は、後方前腸細胞、及び／または、肝前駆細胞を含む。さらに別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載した第３の添加剤セット、ならびに、第３の添加剤セットを含む第３の培養培地を提供する。なおも別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載した第４の添加剤セット、ならびに、第４の添加剤セットを含む第４の培養培地を提供する。さらに別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載した第５の添加剤セット、ならびに、サイトカインを含まない第５の添加剤セットを含む第５の培養培地を提供する。本開示は、後方前腸細胞、肝前駆細胞、または、肝細胞様細胞を作り出すためのキットも提供する。キットは、本明細書に記載した少なくとも１つの添加剤セット、及び／または、本明細書に記載した少なくとも１つの培地；及び、後方前腸細胞、肝前駆細胞、または、肝細胞様細胞を作り出すための（例えば、本明細書に記載したプロセスを実行するための）説明書を含む。一部の実施形態では、キットは、内胚葉細胞、後方前腸細胞、及び／または、肝前駆細胞をさらに含む。
【0013】
本発明の要旨の概略は上記した通りであり、次に、添付した例示目的の図面を参照しながら、その好適な実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】Ａ及びＢは、内胚葉特異的遺伝子の発現を示す。（Ａ）ＲＴ－ｑＰＣＲで測定した、未分化ｉＰＳＣ（ｉＰＳＣ－淡灰色の棒）と比較した、ｉＰＳＣ由来内胚葉細胞（ＤＥ－暗灰色の棒）での内胚葉特異的遺伝子（ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＧＡＴＡ４）のアップレギュレーション。結果を、試験した様々な遺伝子での対数倍数変化として示す。データは、平均±標準偏差である。ＤＥはＮ＝６、ｉＰＳＣはＮ＝３。＊ｐ＜０，０５＊＊ｐ＜０，０１。（Ｂ）内胚葉へのｉＰＳＣ分化の間の内胚葉特異的遺伝子（ＥＯＭＥＳ、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７）発現に関するＲＴ－ｑＰＣＲを用いた経時的分析。結果を、試験した様々な遺伝子での対数倍数変化として示す（Ｘ軸で識別）。データは、平均±標準偏差である。すべての時点で、Ｎ＝３である。＊＊ｐ＜０，０１＊＊＊ｐ＜０，００１＊＊＊＊ｐ＜０，０００１。
【図2】図２は、ＦｏｘＡ２、Ｃｘｃｒ４、Ｓｏｘ１７、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、及び、ｃ－Ｋｉｔマーカーに関する、ｉＰＳＣ由来内胚葉細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。細胞の８５％超が、ＦｏｘＡ２、Ｃｘｃｒ４、及び、Ｓｏｘ１７に対してトリプル陽性を示している；細胞の９０％が、ｂｒａｃｈｙｕｒｙに対して陽性を示している；細胞の１％未満が、ｃ－Ｋｉｔに対して陽性を示しており、このことは、中胚葉細胞が存在しないことを示す。データは、平均±標準偏差である。ｎ＝４。
【図3】図３は、ｉＰＳＣ由来の内胚葉細胞（下方のパネル）と、未分化のｉＰＳＣ（上方のパネル）における内胚葉マーカーＳｏｘ１７、ＦｏｘＡ２、及び、Ｃｘｃｒ４の代表的な免疫蛍光分析を示す。挿入図は、核（ＤＡＰＩ）染色を示す（スケールバー２００μｍ）。
【図4】ｉＰＳＣ由来の腹側後方前腸細胞での後方前腸特異的遺伝子の発現の増大を示しており、これにより、肝前駆細胞が生じる。結果を、ｉＰＳＣ由来の内胚葉細胞（ＤＥ－暗灰色の棒）、及び、ｉＰＳＣ由来の後方前腸細胞（ＰＦＧ－淡灰色の棒）でのこれらの遺伝子（ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、及び、アルブミン（ＡＬＢ））のｍＲＮＡ発現の倍数変化として示す。データは、平均±標準偏差である。ＤＥはｎ＝３、ＰＦＧはＮ＝６である。＊ｐ＜０，０５＊＊ｐ＜０，０１＊＊＊ｐ＜０，００１。
【図5】Ａ～Ｄは、免疫蛍光法で測定した、ｉＰＳＣ由来肝前駆細胞での肝臓特異的マーカー（Ａ ＡＦＰ、Ｂ アルブミン、Ｃ ＣＫ１９及びＣＫ７、Ｄ ＥｐＣＡＭ）の発現を示す（スケールバー２００μＭ）。
【図6】多能性マーカーＴＲＡ１－６０、及び、Ｎａｎｏｇの未分化ｉＰＳＣ（ｉＰＳＣ－白色の棒）と比較した、ｉＰＳＣ由来肝前駆細胞（ＨＢ－灰色の棒）の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。データは、平均±標準偏差である。ｎ＝３。
【図7】ｉＰＳＣ由来後部前腸細胞（ＰＦＧ－淡灰色の棒）との比較で、ＲＴ－ｑＰＣＲで決定した、ｉＰＳＣ由来肝前駆細胞（ＨＢ－黒色の棒）での肝芽細胞及び肝細胞特異的遺伝子（アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＦＰ、ＣＫ１９、ＣＫ７、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ４α、ＨＨＥＸ）の発現を示す。結果を、試験した様々な遺伝子の対数倍率変化として示す（Ｘ軸で識別）。データは、平均±標準偏差である。ＨＢはｎ＝８、ＰＦＧはｎ＝３である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図8】図８は、肝前駆細胞へのｉＰＳＣ分化の間における細胞増殖の時間経過を示しており、細胞収量の有意な増加を示す。データは、平均±標準偏差である。未分化ｉＰＳＣ（ｉＰＳＣ）はｎ＝６、ｉＰＳＣ由来の内胚葉細胞（ＤＥ）はｎ＝３、ｉＰＳＣ由来の肝前駆細胞（ＨＢ）はｎ＝６である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図9A】ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞の特徴を例示している。光学顕微鏡で測定した、２８日目のｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞（ＨＬＣ）の典型的な態様（スケールバー、上方のパネルでは１，０００μｍ、下方のパネルでは２００μｍ）。
【図9B】ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞の特徴を例示している。免疫蛍光法で決定した、ｉＰＳＣ由来の肝様細胞での肝特異的マーカー（Ｂ１ ＡＦＰ、Ｂ２ アルブミン、Ｂ３及びＢ４ ＣＫ１９）の発現（スケールバー、上方及び左下のパネルでは２００μｍ、右下のパネルでは１００μｍ）。
【図10】Ａ及びＢは、アルブミン発現の均一性の大きさ（ゲート細胞の９８．５％）を示す、アルブミンを発現するｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞（ＨＬＣ）の（Ａ）典型的なフローサイトメトリーの結果、及び、（Ｂ）関連分析を提供する。データは、平均±標準偏差である。ｎ＝４。
【図11】新たに単離した胎児肝細胞（ＦＰＨＨ－淡灰色の棒）との比較で、ＲＴ－ｑＰＣＲで決定した、ｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞（ＨＬＣ－暗灰色の棒）での肝特異的遺伝子（ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、アルブミン（ＡＬＢ）、ＳＯＸ９、ＡＳＧＰＲ）の発現を提供する。結果を、試験した様々な遺伝子の対数倍数変化として示す（Ｘ軸で識別）。データは、平均±標準偏差である。ＦＰＨＨはｎ＝６、ＨＬＣはＮ＝１０である。＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ＝有意でない。
【図12】Ａ～Ｃは、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）、未分化ｉＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ由来内胚葉細胞（ＤＥ）、ｉＰＳＣ由来腹側後方前腸細胞（ＰＦＧ）、ｉＰＳＣ由来肝前駆細胞（ＨＢ）、及び、ｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞（ＨＬＣ）の肝臓特異的機能を示す。（Ａ）ＣｙＰ３Ａ４活性の比較。結果は、試験した条件に応じた活性（ＲＬＵ／１×１０６個の細胞）として示す。データは、平均±標準偏差である。ＰＨＨはｎ＝１０、ＨｅｐＧ２及びｉＰＳＣはｎ＝３、ＨＬＣはＮ＝６である。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）アルブミン合成の比較。データは、平均±標準偏差である。ｉＰＳＣ、ＤＥ、ＰＦＧ、及び、ＨＢはｎ＝３、ＨＬＣはｎ＝６、ＰＨＨはｎ＝１０である。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）尿素の比較。データは、平均±標準偏差である。ＨｅｐＧ２はｎ＝３、ＨＬＣはｎ＝６、ＰＨＨはｎ＝１０である。
【図13】図１３は、標準的な分化プロトコルで得た、ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞（ＨＬＣ－Ａ、黒色の棒）との比較で、ＲＴ－ｑＰＣＲで決定した、ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞（ＨＬＣ－Ｂ、灰色の棒）での肝特異的遺伝子（ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１、ＴＡＴ）の発現を提供する。結果を、試験した様々な遺伝子での対数倍率変化として示す（Ｘ軸で識別）。データは、平均±標準偏差である。ＨＬＣ－Ａはｎ＝８、ＨＬＣ－Ｂはｎ＝４である。＊ｐ＜０，０５＊＊＊ｐ＜０，００１＊＊＊＊ｐ＜０，０００１。
【図14】Ａ～Ｃは、ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞（ＨＬＣ－Ａ、黒色の棒）、ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞（ＨＬＣ－Ｂ、灰色の棒）の特徴を比較している。（Ａ）ＣｙＰ３Ａ４活性の比較。結果を、試験した条件に応じた活性（ＲＬＵ／１×１０６個の細胞）として示す。データは、平均±標準偏差である。ＨＬＣ－ＡはＮ＝４、ＨＬＣ－ＢはＮ＝６である。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）アルブミン合成の比較。データは、平均（μｇ／１×１０６個の細胞／２４時間）±標準偏差である。ＨＬＣ－ＡはＮ＝４、ＨＬＣ－ＢはＮ＝６である。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）分化終了時の細胞の収量：新規の分化プロトコル（淡灰色の棒）では、プロセス開始時の未分化ｉＰＳＣ（白色の棒）の量と比較して、細胞数の有意な増加が認められるが、標準的な分化プロトコル（黒色の棒）では減量が認められる。データは、平均±標準偏差である。ＨＬＣ－Ａはｎ＝３、ＨＬＣ－Ｂはｎ＝４である。＊ｐ＜０．０５。
【図15】Ｓｅａｈｏｒｓｅで酸素消費率（ＯＣＲ）を測定して、ベースライン（淡灰色の棒）、及び、異なる用量のアミオダロン（２、４、８、１６μＭ－暗灰色の棒）、及び、アセトアミノフェン（２、４、８ｍＭ－黒色の棒）を与えた後のｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞（ＨＬＣ）でのミトコンドリア機能の主要パラメーターを評価している。データは、平均±標準偏差である。ｎ＝６。＊ｐ＜０，０５＊＊ｐ＜０，０１＊＊＊ｐ＜０，００１＊＊＊＊ｐ＜０，０００１。
【発明を実施するための形態】
【0015】
細胞、及び、それを含む組成物を作り出すためのプロセス
本発明によれば、内胚葉細胞を、有能な肝細胞系統の細胞（例えば、後方前腸細胞、肝前駆細胞、及び／または、肝細胞）に分化させるプロセスを提供する。肝細胞系統の細胞は、肝細胞に分化することができる細胞、または、肝細胞である細胞とし得る。本開示のプロセスは、一部の実施形態では、それらが、大量の肝細胞系統の細胞、及び／または、生物学的にさらに強力な細胞の生産を可能にするので、有利である。
本発明によれば、内胚葉細胞を、有能な肝細胞系統の細胞（例えば、後方前腸細胞、肝前駆細胞、及び／または、肝細胞）に分化させるプロセスを提供する。肝細胞系統の細胞は、肝細胞に分化することができる細胞、または、肝細胞である細胞とし得る。本開示のプロセスは、一部の実施形態では、それらが、大量の肝細胞系統の細胞、及び／または、生物学的にさらに強力な細胞の生産を可能にするので、有利である。
【0016】
ある実施形態では、このプロセスを使用して、内胚葉細胞から様々な細胞集団を作り出すことができる。本開示で使用する「内胚葉細胞」とは、内胚葉由来の細胞の特徴を有する細胞のことを指す。発生学の分野で公知の通り、内胚葉とは、３つの主要な胚葉の最も内側の層のことである。内胚葉の細胞は、一般的には平坦であり、また、胃腸管、呼吸器、肝臓、膵臓、内分泌器、及び、泌尿器の細胞の大半を発生させる役割を担っている。内胚葉細胞は、当業者であれば、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して同定し得る。例えば、内胚葉細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲＡ、及び／または、ＥＯＭＥＳの内の少なくとも１つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドの存在または非存在、ならびに、発現レベルを決定して、同定をすることができる。特定の実施形態では、内胚葉細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲＡ、及び／または、ＥＯＭＥＳの内の少なくとも２つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。さらに別の実施形態では、内胚葉細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲＡ、及び／または、ＥＯＭＥＳの内の少なくとも３つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドの発現を検出し、及び、任意に測定をして、同定をすることができる。なおも別の実施形態では、内胚葉細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲＡ、及び／または、ＥＯＭＥＳの少なくとも４つ、または、それらのあらゆる組み合わせの発現を検出し、及び、任意に測定をして、同定をすることができる。さらに別の実施形態では、内胚葉細胞は、次の遺伝子（または、それらに関連するポリペプチド）：ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲＡ、及び／または、ＥＯＭＥＳの発現を検出し、及び、任意に測定をして、同定をすることができる。一部の実施形態では、内胚葉細胞に発現をさせ、そして、次の遺伝子：ＳＯＸ２、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲＡ、及び／または、ＥＯＭＥＳ、または、それらがコードするポリペプチドの発現レベルを、（未分化の）幹細胞での同じ遺伝子／ポリペプチドの発現のレベルと比較して、同定をすることができる。特定の実施形態では、内胚葉細胞は、未分化多能性（幹）細胞での対応するレベルと比較して、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、及び／または、ＥＯＭＥＳ遺伝子、または、それらがコードするポリペプチドを強く発現する。
【0017】
内胚葉細胞は、あらゆる起源のものとすることができ、特に、哺乳動物に由来し得るものであり、そして、一部の実施形態では、ヒトに由来し得る。
【0018】
内胚葉細胞は、内胚葉細胞に分化した多能性細胞（例えば、胚性幹細胞、または、多能性幹細胞）から取得できる。一部の実施形態では、内胚葉細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を分化させて取得することができる。多能性（幹）細胞は、あらゆる起源、特に、哺乳動物に由来し得るものであり、そして、一部の実施形態では、ヒトに由来し得る。多能性（幹）細胞を内胚葉細胞に分化させる一部の実施形態では、多能性（幹）細胞は、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路を活性化することができる化合物、例えば、Ａｃｔｉｖｉｎ ＡなどのＮｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎ受容体アゴニストと接触させることができる。一部のさらなる実施形態では、多能性（幹）細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子、例えば、Ｗｎｔ受容体アゴニスト、または、ＧＳＫ３の生物学的活性を阻害することができる化合物、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１と接触させることもできる。
【0019】
多能性（幹）細胞は、内胚葉細胞に分化する前に、ＡＰＥＬＡ／ＥＬＡＢＥＬＡシグナル伝達経路の１つ以上の活性化因子、例えば、ＡＰＥＬＡ／ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドなどのＡＰＥＬＡ／ＥＬＡＢＥＬＡ受容体のアゴニスト、または、その自己複製、及び／または、多能性を誘導、最適化、及び、維持するための機能的フラグメント（米国特許第９，３０９，３１４号に記載のものなど）と接触させることができる。
【0020】
本開示は、内胚葉細胞から後方前腸細胞を作り出すための第１のプロセスを提供する。このプロセスは、１つ以上の内胚葉細胞を、内胚葉細胞から後方前腸細胞への分化を許容する条件下で、第１の添加剤セットを含む第１の培養培地と接触させる、ことを含む。第１のプロセスは、培養細胞を、例えば、インスリンなどのインスリンシグナル伝達経路の活性化因子と接触させることは含まない。本開示で使用する「後方前腸細胞」とは、後方前腸の細胞の生物学的特徴を有する細胞のことを指す。発生学の分野で公知の通り、後方前腸とは、その後に肝臓を形成する内胚葉での領域のことである。したがって、後方前腸の細胞は、肝臓、膵臓、胃、及び、小腸の一部へとさらに分化することができる。当業者であれば、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して、後方前腸細胞の同定をすることができる。例えば、後方前腸細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰのあらゆる組み合わせの内の少なくとも１つ、及び／または、アルブミン、または、それらがコードするポリペプチドの存在または非存在、ならびに、発現レベルを決定して、同定をすることができる。特定の実施形態では、後方前腸細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰのあらゆる組み合わせの内の少なくとも２つ、及び／または、アルブミン、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。さらに別の実施形態では、後方前腸細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰのあらゆる組み合わせの内の少なくとも３つ、及び／または、アルブミン、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、後方前腸細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰのあらゆる組み合わせの内の少なくとも４つ、及び／または、アルブミン、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、後方前腸細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰのあらゆる組み合わせの内の少なくとも５つ、及び／または、アルブミン、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、後方前腸細胞は、次の遺伝子：ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、及び／または、アルブミン、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、後方前腸細胞は、次の遺伝子（または、それらに対応するポリペプチド）：ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、及び／または、アルブミンの発現を検出し、及び、任意に測定をして、同定をすることができる。一部の実施形態では、後方前腸細胞に発現をさせ、そして、次の遺伝子：ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、及び／または、アルブミン、または、それらがコードするポリペプチドの発現レベルを、（未分化の）幹細胞、または、内胚葉細胞での同じ遺伝子／ポリペプチドの発現のレベルと比較して、同定をすることができる。特定の実施形態では、後方前腸細胞は、多能性（幹）細胞、または、内胚葉細胞での対応するレベルと比較して、ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、及び／または、アルブミン遺伝子、または、それらがコードするポリペプチドを強く発現する。さらなる実施形態では、後方前腸細胞は、内胚葉細胞での対応するレベルと比較して、高レベルで、ＳＯＸ２遺伝子、または、それがコードするポリペプチドを発現する。さらなる実施形態では、後方前腸細胞は、内胚葉細胞での対応するレベルと比較して、ＦＯＸＡ１遺伝子、または、それがコードするポリペプチドを強く発現する。さらなる実施形態では、後方前腸細胞は、内胚葉細胞での対応するレベルと比較して、ＦＯＸＡ２遺伝子、または、それがコードするポリペプチドを強く発現する。さらなる実施形態では、後方前腸細胞は、内胚葉細胞での対応するレベルと比較して、ＨＮＦ４ａ遺伝子、または、それがコードするポリペプチドを強く発現する。さらなる実施形態では、後方前腸細胞は、内胚葉細胞での対応するレベルと比較して、ＡＦＰ遺伝子、または、それがコードするポリペプチドを強く発現する。さらなる実施形態では、後方前腸細胞は、内胚葉細胞での対応するレベルと比較して、ＡＬＢ遺伝子、または、それがコードするアルブミンポリペプチドを強く発現する。
【0021】
後方前腸細胞は、あらゆる起源のものとすることができ、特に、哺乳動物に由来し得るものであり、そして、一部の実施形態では、ヒトに由来し得る。
【0022】
第１のプロセスで使用する第１の培養培地を、無血清（例えば、血清を補充していない）とすることができる。別の実施形態では、第１のプロセスで使用する第１の培養培地は、血清を含むことができ、同血清を、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とし得る。ある実施形態では、第１の培養培地は、約０．１～約５％（ｖ／ｖ）の血清を含む。さらに別の実施形態では、第１の培養培地は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５％以上の血清を含む。別の実施形態では、第１の培養培地は、約５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２％以下の血清を含む。なおも別の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、または、４．５％と、約５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、または、０．２％との間の血清を含む。ある実施形態では、第１の培養培地は、約１％の血清を含む。
【0023】
第１の培養培地は、第１の添加剤セットを含んでおり、同セットは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子；Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子；及び、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達経路の阻害因子を含む、または、本質的にそれらからなる。第１の添加剤セットは、インスリンなどのインスリンシグナル伝達経路の活性化因子を含まない。本開示の関連で使用する表現「第１の培養培地は、本質的に第１の添加剤セットからなる」とは、内胚葉細胞から後方前腸細胞への分化において非必須のさらなる添加剤を含むが、分化を促すことはできる第１の培養培地のことを指す。これらのさらなる添加剤として、例えば、レチノイン酸、ビタミン類、及び、ミネラルがあるが、これらに限定されない。
【0024】
第１の培養培地は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子を含む。成長の過程で、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子は、通常、心臓の中胚葉から提供され、そして、内胚葉細胞から後方前腸細胞への分化を促す。本開示の関連で使用する「ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子」とは、ＢＭＰと、その同族受容体（例えば、ＢＭＰＲ１、及び／または、ＢＭＰＲ２）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。シグナル伝達ＢＭＰ受容体は、ＳＭＡＤ及びＭＡＰキナーゼ経路を介して発生し、そして、ＢＭＰ標的遺伝子の転写を行う。この化合物は、（ＢＭＰＲ１、または、ＢＭＰＲ２に特異的であるか、または、両方の受容体に結合し、そして、活性化することができる）ＢＭＰ受容体のアゴニスト、ＢＭＰシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。公知のＢＭＰとして、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、及び、ＢＭＰ１５があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、活性化因子は、ＤＭ３１８９である。別の実施形態では、活性化因子は、ＢＭＰ４（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）である。ＢＭＰ４は、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）ファミリーのメンバーであり、ＢＭＰＲ１、及び、ＢＭＰＲ２として公知の２つの異なるタイプのセリン－スレオニンキナーゼ受容体に結合する。ＢＭＰ４を、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＢＭＰ４は、第１の培養培地で、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または、それを超えるｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。ＢＭＰ４を、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＢＭＰ４は、第１の培養培地で、少なくとも約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。ＢＭＰ４を、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＢＭＰ４は、第１の培養培地で、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または、２９と、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または、１１ｎｇ／ｍＬとの間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、ＢＭＰ４は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で第１の培養培地に提供し得る。
【0025】
第１の培養培地は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子も含む。成長の過程で、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子は、通常、心臓の中胚葉から提供され、そして、内胚葉細胞から後方前腸細胞への分化を促す。本開示の関連で使用する「ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子」とは、ＦＧＦと、その同族受容体（例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及び／または、ＦＧＦＲ４）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。この化合物は、（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及び／または、ＦＧＦＲ４に特異的であるか、または、複数の受容体に結合し、そして、活性化することができる）ＦＧＦ受容体のアゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、ＦＧＦシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。公知のＦＧＦとして、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５／１９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、及び、ＦＧＦ２３があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、活性化因子は、塩基性ＦＧＦまたはＦＧＦ２（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）である。ＦＧＦ２は、ＦＧＦＲ２（別名、ＣＤ３３２）、及び、ＦＧＦＲ３として公知の２つの異なるタイプの受容体に結合する。塩基性ＦＧＦを、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第１の培養培地で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または、それを超えるｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。塩基性ＦＧＦを、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第１の培養培地で、少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。塩基性ＦＧＦを、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第１の培養培地で、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または、１９と、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２ｎｇ／ｍＬとの間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、塩基性ＦＧＦを、約５ｎｇ／ｍＬの濃度で第１の培養培地に提供し得る。
【0026】
第１の培養培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子をさらに含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子の存在は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子と組み合わせることで、肝臓の発生に必要なポリペプチドをコードするＨＥＸ及びＰＲＯＸ１遺伝子の発現において有利に作用する。本開示の関連で使用する「Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子」とは、Ｗｎｔタンパク質リガンドと、その同族Ｆｒｉｚｚｌｅ受容体（例えば、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、または、ＦＺＤ１０）との結合に関連するシグナル伝達経路を阻害することができる化合物のことを指す。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のファミリーは、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質である。この化合物は、（ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、または、ＦＺＤ１０のいずれかに特異的であるか、または、複数の受容体に結合し、そして、阻害することができる）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のアンタゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの阻害因子、及び／または、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの活性化因子のいずれかとし得る。公知のＷｎｔタンパク質として、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、及び、ＷＮＴ１６があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、阻害因子は、１つ以上のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の生物学的活性を阻害することができる。別の実施形態では、阻害因子は、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅタンパク質の生物学的活性を阻害することができる。例えば、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅタンパク質の生物学的活性を阻害することができる阻害因子を、ＩＷＰ２とし得る。ＩＷＰ２を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、ＩＷＰ２は、第１の培養培地で、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５μＭ、または、それを超える濃度で提供することができる。ＩＷＰ２を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、ＩＷＰ２は、第１の培養培地で、１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２μＭ、または、それに満たない濃度で提供することができる。ＩＷＰ２を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、ＩＷＰ２は、第１の培養培地で、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、または、９．５と、約１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、または、０．２μＭとの間の濃度で提供することができる。ＩＷＰ２を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、ＩＷＰ２を、約４μＭの濃度で第１の培養培地に提供し得る。
【0027】
第１の培養培地は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達経路の阻害因子をさらに含む。ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子の存在は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子と組み合わせることで、肝臓の発生に必要なポリペプチドをコードするＨＥＸ及びＰＲＯＸ１遺伝子の発現において有利に作用する。本開示の関連で使用する「ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子」とは、ＴＧＦβと、その同族受容体との結合に関連するシグナル伝達経路を阻害することができる化合物のことを指す。ＴＧＦβ受容体のファミリーは、ＳＭＡＤタンパク質を介してシグナル伝達を媒介する。この化合物は、ＴＧＦβ受容体のアンタゴニスト、ＴＧＦβシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの阻害因子、及び／または、ＴＧＦβシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの活性化因子のいずれかとし得る。公知のＴＧＦβタンパク質として、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、及び、ＴＧＦＢ４があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、阻害因子は、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、または、ＡＬＫ７ポリペプチドの内の少なくとも１つの生物学的活性を阻害することができる。一部の実施形態では、阻害因子は、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及び、ＡＬＫ７ポリペプチドの生物学的活性を阻害することができる。例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及び、ＡＬＫ７ポリペプチドの生物学的活性を阻害することができる阻害因子を、Ａ８３－０１とすることができる。あるいは、または、組み合わせで、ＳＢ４３１５４２、及び／または、ＬＹ３６４９４７を、阻害因子とすることができる。Ａ８３－０１を、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、Ａ８３－０１は、第１の培養培地で、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５μＭ、または、それを超える濃度で提供することができる。Ａ８３－０１を、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、Ａ８３－０１は、第１の培養培地で、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２μＭ、または、それに満たない濃度で提供することができる。Ａ８３－０１を、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、Ａ８３－０１は、第１の培養培地で、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、または、４．５と、約５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２μＭとの間の濃度で提供することができる。Ａ８３－０１を、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、Ａ８３－０１を、約１μＭの濃度で第１の培養培地に提供し得る。
【0028】
第１の培養培地は、分化が起こるまで、少なくとも１日以上、内胚葉細胞、及び、後方前腸細胞と接触させておく。第１の培養培地を、培養細胞と２日以上接触させることを意図している場合、培地は、毎日交換することができる。本開示のプロセスの一部の実施形態では、第１の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数の間、培養細胞と接触させておく。別の実施形態では、第１の培養培地を、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。さらに別の実施形態では、第１の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数、そして、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。なおも別の実施形態では、第１の培養培地を、約１日～５日の間、培養細胞と接触させておく。
【0029】
内胚葉細胞を含む第１の培養培地を使用すると、内胚葉細胞を後方前腸細胞に分化させることができる。したがって、本開示は、本明細書に記載したプロセスで得た後方前腸細胞の集団を提供する。本開示の後方前腸細胞の集団において、細胞の大部分が、後方前腸細胞であると考えられており、そして、一部の実施形態では、一部の内胚葉細胞を含むことができる。
【0030】
本開示は、後方前腸細胞から、肝前駆細胞（本明細書では肝芽細胞とも称する）を作り出すための第２のプロセスを提供する。このプロセスは、後方前腸細胞の１つ以上を、後方前腸細胞から後方前腸細胞への分化を許容する条件下で、第２の添加剤セットを含む第２の培養培地と接触させる、ことを含む。第２のプロセスで使用する後方前腸細胞は、第１のプロセスを実行して取得することができる。
【0031】
本開示で使用する「肝前駆細胞」または「肝芽細胞」とは、胆管細胞、及び、肝細胞のいずれかで分化することができる二能性前駆細胞のことを指す。当業者であれば、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して、肝前駆細胞の同定をすることができる。例えば、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ遺伝子、及び／または、ＨＮＦ４ａの内の少なくとも１つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、及び／または、それらがコードするポリペプチドの存在または非存在、ならびに、発現レベルを決定して、同定をすることができる。特定の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、または、ＨＮＦ４ａの内の少なくとも１つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。さらに別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、または、ＨＮＦ４ａの内の少なくとも１つ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、及び／または、ＨＮＦ４ａのあらゆる組み合わせの内の少なくとも２つ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、及び／または、ＨＮＦ４ａのあらゆる組み合わせの内の少なくとも３つ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、及び／または、ＨＮＦ４ａのあらゆる組み合わせの内の少なくとも４つ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子 α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、及び／または、ＨＮＦ４ａのあらゆる組み合わせの内の少なくとも５つを発現する。なおも別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、及び／または、ＨＮＦ４ａのあらゆる組み合わせがコードする少なくとも６つ以上のポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、及び／または、ＨＮＦ４ａのあらゆる組み合わせがコードする少なくとも７つ以上のポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、及び／または、ＨＮＦ４ａのあらゆる組み合わせがコードする少なくとも８つ以上のポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、及び／または、ＨＮＦ４ａのあらゆる組み合わせがコードする少なくとも９つ以上のポリペプチドを発現する。なおも別の実施形態では、肝前駆細胞は、次の遺伝子（または、それらがコードするポリペプチド）：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＨＥＸ、及び／または、ＨＮＦ４ａを発現する。一部の実施形態では、肝前駆細胞に発現をさせ、そして、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、及び／または、ＨＮＦ４ａ、または、それらがコードするポリペプチドの発現レベルを、後方前腸細胞での同じ遺伝子／ポリペプチドの発現レベルと比較して、同定をすることができる。ある実施形態では、肝前駆細胞は、後方前腸細胞と実質的に同量のアルブミンを発現する。ある実施形態では、肝前駆細胞は、後方前腸細胞と実質的に同量のＡＦＰを発現する。ある実施形態では、肝前駆細胞は、後方前腸細胞よりもＣＫ１９遺伝子を強く発現する。ある実施形態では、肝前駆細胞は、後方前腸細胞よりもＣＫ７遺伝子を強く発現する。ある実施形態では、肝前駆細胞は、後方前腸細胞よりもＰＤＸ１遺伝子を強く発現する。ある実施形態では、肝前駆細胞は、後方前腸細胞よりもＳＯＸ９遺伝子を強く発現する。ある実施形態では、肝前駆細胞は、後方前腸細胞よりもＰＲＯＸ１遺伝子を強く発現する。ある実施形態では、肝前駆細胞は、ＨＨＥＸ遺伝子を発現するが、後方前腸細胞よりも弱い。ある実施形態では、肝前駆細胞は、未分化多能性細胞（ｉＰＳＣなど）と比較して、ＴＲＡ－１－６０、及び／または、Ｎａｎｏｇ遺伝子を実質的に発現せず、または、これらの遺伝子を非常に低レベルで発現する。
【0032】
肝前駆細胞は、あらゆる起源のものとすることができ、特に、哺乳動物に由来し得るものであり、そして、一部の実施形態では、ヒトに由来し得る。
【0033】
第２のプロセスで使用する第２の培養培地を、無血清（例えば、血清を補充していない）とすることができる。別の実施形態では、第２のプロセスで使用する第２の培養培地は、血清を含むことができ、同血清を、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とし得る。ある実施形態では、第２の培養培地は、約０．１～約５％（ｖ／ｖ）の血清を含む。さらに別の実施形態では、第２の培養培地は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５％以上の血清を含む。別の実施形態では、第２の培養培地は、約５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２％以下の血清を含む。なおも別の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、または、４．５％と、約５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、または、０．２％との間の血清を含む。ある実施形態では、第２の培養培地は、約２％の血清を含む。
【0034】
第２の培養培地は、第２の添加剤セットを含んでおり、同セットは、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子、及び、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子を含む、または、本質的にそれらからなる。本開示の関連で使用する表現「第２の培養培地は、本質的に第２の添加剤セットからなる」とは、後方前腸細胞から肝前駆細胞への分化において非必須のさらなる添加剤を含むが、分化を促すことはできる第２の培養培地のことを指す。これらのさらなる添加剤として、例えば、Ｂ２７サプリメント、レチノイン酸、ビタミン類、及び、ミネラルがあるが、これらに限定されない。
【0035】
第２の培養培地は、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子も含む。本開示の関連で使用する「インスリンシグナル伝達経路の活性化因子」とは、インスリンと、その同族受容体（チロシンキナーゼ受容体）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。この化合物は、インスリン受容体（インスリン、ＩＧＦ－Ｉ、または、ＩＧＦ－ＩＩ）のアゴニスト、インスリンシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、インスリンシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。ある実施形態では、活性化因子は、（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）インスリンである。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、インスリンは、第２の培養培地で、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または、それを超えるｎｇ／ｍＬで提供し得る。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、インスリンは、第２の培養培地で、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、インスリンは、第２の培養培地で、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または、９５と、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または、５との間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、インスリンは、第２の培養培地で、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で提供することができる。さらに別の実施形態では、インスリンは、Ｂ２７サプリメントの形態、ＨＢＭ／ＨＣＭ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（商標）、及び／または、初代肝細胞（ＰＨＨ）サプリメントの形態で提供する。
【0036】
第２の培養培地は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子を含む。成長の過程で、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子は、通常、心臓の中胚葉から提供され、そして、内胚葉細胞から後方前腸細胞への分化を促す。本開示の関連で使用する「ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子」とは、ＢＭＰと、その同族受容体（例えば、ＢＭＰＲ１、及び／または、ＢＭＰＲ２）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。シグナル伝達ＢＭＰ受容体は、ＳＭＡＤ及びＭＡＰキナーゼ経路を介して発生し、そして、ＢＭＰ標的遺伝子の転写を行う。この化合物は、（ＢＭＰＲ１、または、ＢＭＰＲ２に特異的であるか、または、両方の受容体に結合し、そして、活性化することができる）ＢＭＰ受容体のアゴニスト、ＢＭＰシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。公知のＢＭＰとして、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、及び、ＢＭＰ１５があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、活性化因子は、ＤＭ３１８９である。別の実施形態では、活性化因子は、ＢＭＰ４（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）である。ＢＭＰ４は、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）ファミリーのメンバーであり、ＢＭＰＲ１、及び、ＢＭＰＲ２として公知の２つの異なるタイプのセリン－スレオニンキナーゼ受容体に結合する。ＢＭＰ４を、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＢＭＰ４は、第２の培養培地で、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または、それを超えるｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。ＢＭＰ４を、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＢＭＰ４は、第２の培養培地で、少なくとも約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。ＢＭＰ４を、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＢＭＰ４は、第２の培養培地で、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または、２９と、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または、１１ｎｇ／ｍＬとの間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、ＢＭＰ４は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で第２の培養培地に提供し得る。さらなる実施形態では、ＢＭＰ４を、第１、及び、第２の添加剤セットの両方での活性化因子として提供し得る。
【0037】
第２の培養培地は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子も含む。成長の過程で、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子は、通常、心臓の中胚葉から提供され、そして、内胚葉細胞から後方前腸細胞への分化を促す。本開示の関連で使用する「ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子」とは、ＦＧＦと、その同族受容体（例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及び／または、ＦＧＦＲ４）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。この化合物は、（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及び／または、ＦＧＦＲ４に特異的であるか、または、複数の受容体に結合し、そして、活性化することができる）ＦＧＦ受容体のアゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、ＦＧＦシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。公知のＦＧＦとして、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５／１９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、及び、ＦＧＦ２３があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、活性化因子は、塩基性ＦＧＦまたはＦＧＦ２（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）である。ＦＧＦ２は、ＦＧＦＲ２（別名、ＣＤ３３２）、及び、ＦＧＦＲ３として公知の２つの異なるタイプの受容体に結合する。塩基性ＦＧＦを、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第２の培養培地で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または、それを超えるｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。塩基性ＦＧＦを、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第２の培養培地で、少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。塩基性ＦＧＦを、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第２の培養培地で、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または、１９と、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２ｎｇ／ｍＬとの間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、塩基性ＦＧＦを、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で第２の培養培地に提供し得る。さらなる実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第２、及び、第２の添加剤セットの両方において活性化因子として提供し得る。
【0038】
第２の培養培地は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子も含む。成長の過程で、ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子は、内胚葉細胞から肝前駆細胞への分化を促す。本開示の関連で使用する「ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子」とは、ＨＧＦと、その同族受容体（例えば、ｃ－Ｍｅｔ）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。この化合物は、ＨＧＦ受容体のアゴニスト、ＨＧＦシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、ＨＧＦシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。ある実施形態では、活性化因子は、ＨＧＦ（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）である。ＨＧＦを、ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＨＧＦは、第２の培養培地で、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または、それを超えるｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。ＨＧＦを、ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＨＧＦは、第２の培養培地で、少なくとも約４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。ＨＧＦを、ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＨＧＦは、第２の培養培地で、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または、３９と、約４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または、１１ｎｇ／ｍＬとの間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、ＨＧＦを、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で、第２の培養培地に提供し得る。
【0039】
第２の培養培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子をさらに含む。一部の実施形態では、（例えば、第１のプロセスで示したようにして）すでに阻害をした場合のみ、後方前腸細胞でのＷｎｔシグナル伝達経路を活性化させることが重要である。本開示の関連で使用する「Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子」とは、Ｗｎｔタンパク質リガンドと、その同族Ｆｒｉｚｚｌｅ受容体（例えば、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、または、ＦＺＤ１０）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のファミリーは、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質である。この化合物は、（ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、または、ＦＺＤ１０のいずれかに特異的であるか、または、複数の受容体に結合し、そして、活性化することができる）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のアゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。公知のＷｎｔタンパク質として、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、及び、ＷＮＴ１６があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、活性化因子は、Ｗｎｔ３ａ、ＳＢ－２１６７６３、及び／または、ＬＹ２０９０３１４である。ある実施形態では、活性化因子は、ＧＳＫ３タンパク質の生物学的活性を阻害することができる。例えば、ＧＳＫ３タンパク質の生物学的活性を阻害することができる活性化因子を、ＣＨＩＲ９９０２１とすることができる。ＣＨＩＲ９９０２１を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は、第２の培養培地で、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５μＭ、または、それを超える濃度で提供することができる。ＣＨＩＲ９９０２１を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は、第２の培養培地で、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、または、それ未満のμＭに満たない濃度で提供することができる。ＣＨＩＲ９９０２１を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は、第２の培養培地で、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、または、７．５と、約８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、または、１μＭとの間の濃度で提供することができる。ＣＨＩＲ９９０２１を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１を、約３μＭの濃度で、第２の培養培地に提供し得る。
【0040】
第２の培養培地は、分化を可能ならしめるために、少なくとも１日以上、後方前腸細胞、及び、肝前駆細胞と接触させておく。第２の培養培地を、培養細胞と２日以上接触させることを意図している場合、培地は、毎日交換することができる。本開示のプロセスの一部の実施形態では、第２の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数の間、培養細胞と接触させておく。別の実施形態では、第２の培養培地を、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。さらに別の実施形態では、第２の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数、そして、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。なおも別の実施形態では、第２の培養培地を、約１日～５日の間、培養細胞と接触させておく。
【0041】
後方前腸細胞を含む第２の培養培地を使用すると、後方前腸細胞を肝前駆細胞に分化させることができる。したがって、本開示は、本明細書に記載したプロセスで得た肝前駆細胞の集団を提供する。本開示の肝前駆細胞の集団において、細胞の大部分が、肝前駆細胞であると考えられており、そして、一部の実施形態では、一部の肝前駆細胞を含むことができる。ある実施形態では、第２のプロセスで得た肝前駆細胞の集団は、肝前駆細胞（例えば、ＣＫ１９、または、ＥｐＣＡＭの発現を決定して同定をすることができる）を、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または、９９％で含む。
【0042】
本開示は、肝前駆細胞から肝細胞様細胞を作り出すための第３のプロセスを提供する。このプロセスは、肝前駆細胞から肝細胞への分化を可能ならしめる条件下で、１つ以上の肝前駆細胞を、第３の添加剤セットを含む（肝前駆細胞から肝細胞系統の細胞への分化を促す）第３の培養培地と接触させ、続いて、第４の添加剤セットを含む（肝細胞系統の細胞から未成熟細胞への分化を促す）第４の培養培地と接触させ、続いて、第５の添加剤セットを含む（未成熟肝細胞から成熟肝細胞への分化を促す）第５の培養培地と接触させる。第３のプロセスで使用する肝前駆細胞は、本明細書に記載したように、第１のプロセス、及び／または、第２のプロセスを実行して取得できる。
【0043】
本開示で使用する「肝細胞様細胞」とは、総じて、肝細胞系統の細胞、未成熟肝細胞様細胞、及び、成熟肝細胞様細胞のことを指す。肝細胞系統の細胞は、胆管細胞に分化することができないが、肝細胞へと分化することはできる。一部の実施形態では、肝細胞様細胞（特に、成熟肝細胞様細胞）は、特定のタンパク質（アルブミン、凝固因子、アルファ－１－アンチトリプシンなど）の生産、アンモニアから尿素への無害化処理、薬物の代謝、グリコーゲンの貯蔵、ビリルビンの抱合、胆汁の合成など、肝臓特異的機能を再現できる細胞である。当業者であれば、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して、肝細胞様細胞の同定をすることができる。例えば、肝細胞様細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＰＲ、ＨＮＦ４ａ、または、ＳＯＸ９の内の少なくとも１つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドの存在または非存在、ならびに、発現レベルを決定して、同定をすることができる。特定の実施形態では、肝細胞様細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１（ＡＳＧＰＲ）、ＨＮＦ４ａ、及び／または、ＳＯＸ９の内の少なくとも１つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。特定の実施形態では、肝細胞様細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１（ＡＳＧＰＲ）、ＨＮＦ４ａ、及び／または、ＳＯＸ９の内の少なくとも２つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。特定の実施形態では、肝細胞様細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１（ＡＳＧＰＲ）、ＨＮＦ４ａ、及び／または、ＳＯＸ９の内の少なくとも３つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。特定の実施形態では、肝細胞様細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１（ＡＳＧＰＲ）、ＨＮＦ４ａ、及び／または、ＳＯＸ９の内の少なくとも４つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。特定の実施形態では、肝細胞様細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１（ＡＳＧＰＲ）、ＨＮＦ４ａ、及び／または、ＳＯＸ９、または、それらがコードするポリペプチドを発現する。さらに別の実施形態では、肝細胞様細胞は、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１（ＡＳＧＰＲ）、ＨＮＦ４ａ、及び／または、ＳＯＸ９の少なくとも１つ、または、それらのあらゆる組み合わせ、または、それらがコードするポリペプチドの発現を検出し、そして、任意に測定することで、同定をすることができる。なおも別の実施形態では、肝細胞様細胞に発現をさせ、そして、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１、ＨＮＦ４ａ、及び／または、ＳＯＸ９の少なくとも１つ、または、それらのあらゆる組み合わせがコードする１つ以上のポリペプチドの発現を検出し、そして、任意に測定することで、同定をすることができる。一部の実施形態では、肝細胞様細胞に発現をさせ、そして、次の遺伝子：α－胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＧＲ１、ＨＮＦ４ａ、及び／または、ＳＯＸ９、または、それらがコードするポリペプチドの発現のレベルを、肝細胞（例えば、胎児肝細胞など）での同じ遺伝子／ポリペプチドの発現のレベルと比較をして、同定をすることができる。特定の実施形態では、肝細胞様細胞は、胎児肝細胞での対応するレベルと比較して、ＳＯＸ９遺伝子、または、それがコードするポリペプチドを強く発現する。特定の実施形態では、肝細胞様細胞は、胎児肝細胞と比較して、実質的に同じレベルで、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、ＡＬＢ、及び、ＡＳＧＰＲ遺伝子を発現する。成熟肝細胞様細胞は、例えば、少なくとも１００００単位／１００万個の細胞という相対活性など、検出可能なレベルのＣｙＰ３Ａ４を有することができる。さらに別の実施形態では、成熟肝細胞様細胞は、未成熟肝細胞様細胞よりも強いＣｙＰ３Ａ４活性を有することができる。成熟肝細胞様細胞は、例えば、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２μｇ／Ｌ／１０６／２４時間、または、それを超える検出可能なレベルのアルブミンを生産することができる。成熟肝細胞様細胞は、例えば、少なくとも約１０、１００、または、１０００μｇ／Ｌ／１０６／２４時間、または、それを超える検出可能なレベルのアルブミンを生産することができる。
【0044】
肝細胞様細胞は、あらゆる起源のものとすることができ、特に、哺乳動物に由来し得るものであり、そして、一部の実施形態では、ヒトに由来し得る。
【0045】
第３のプロセスで使用する第３、第４、及び、第５の培養培地を、無血清（例えば、血清を補充していない）とすることができる。別の実施形態では、第３のプロセスで使用する第３、第４、及び、第５の培養培地は、血清を含むことができ、同血清を、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とし得る。ある実施形態では、第３、第４、及び、第５の培養培地は、約０．１～約５％（ｖ／ｖ）の血清を含む。さらに別の実施形態では、第３、第４、及び、第５の培養培地は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５％以上の血清を含む。別の実施形態では、第３、第４、及び、第５の培養培地は、約５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２％以下の血清を含む。なおも別の実施形態では、第３、第４、及び、第５の培養培地は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、または、４．５％と、約５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、または、０．２％との間の血清を含む。ある実施形態では、第３の培養培地は、約２％の血清を含む。別の実施形態では、第３の培養培地は、約１％の血清を含む。別の実施形態では、第４の培養培地は、約１％の血清を含む。さらに別の実施形態では、第５の培養培地は、約１％の血清を含む。
【0046】
第３の培養培地は、第３の添加剤セットを含んでおり、同セットは、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子、サイトカイン、及び、糖質コルチコイドを含む、または、本質的にそれらからなる。本開示の関連で使用する表現「第３の培養培地は、本質的に第３の添加剤セットからなる」とは、肝細胞前駆細胞の肝細胞様細胞への分化において非必須のさらなる添加剤を含むが、分化を促すことはできる第３の培養培地のことを指す。これらのさらなる添加剤として、例えば、Ｂ２７サプリメント、初代肝細胞サプリメント（ＰＨＨ）、ＨＢＭ／ＨＣＭ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（商標）レチノイン酸、インスリン、ビタミン類、及び、ミネラルがあるが、これらに限定されない。
【0047】
第３の培養培地は、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子も含む。本開示の関連で使用する「インスリンシグナル伝達経路の活性化因子」とは、インスリンと、その同族受容体（チロシンキナーゼ受容体）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。この化合物は、インスリン受容体（インスリン、ＩＧＦ－Ｉ、または、ＩＧＦ－ＩＩ）のアゴニスト、インスリンシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、インスリンシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。ある実施形態では、活性化因子は、（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）インスリンである。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、インスリンは、第３の培養培地で、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または、それを超えるｎｇ／ｍＬで提供し得る。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、インスリンは、第３の培養培地で、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、インスリンは、第３の培養培地で、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または、９５と、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または、５との間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、インスリンは、第３の培養培地で、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で提供することができる。さらに別の実施形態では、インスリンは、Ｂ２７サプリメントの形態、ＨＢＭ／ＨＣＭ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（商標）、及び／または、初代肝細胞（ＰＨＨ）サプリメントの形態で提供する。
【0048】
第３の培養培地は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の活性化因子を含む。成長の過程で、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子は、通常、心臓の中胚葉から提供され、そして、内胚葉細胞から後方前腸細胞への分化を促す。本開示の関連で使用する「ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子」とは、ＢＭＰと、その同族受容体（例えば、ＢＭＰＲ１、及び／または、ＢＭＰＲ２）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。シグナル伝達ＢＭＰ受容体は、ＳＭＡＤ及びＭＡＰキナーゼ経路を介して発生し、そして、ＢＭＰ標的遺伝子の転写を行う。この化合物は、（ＢＭＰＲ１、または、ＢＭＰＲ２に特異的であるか、または、両方の受容体に結合し、そして、活性化することができる）ＢＭＰ受容体のアゴニスト、ＢＭＰシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。公知のＢＭＰとして、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、及び、ＢＭＰ１５があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、活性化因子は、ＤＭ３１８９である。別の実施形態では、活性化因子は、ＢＭＰ４（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）である。ＢＭＰ４は、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）ファミリーのメンバーであり、ＢＭＰＲ１、及び、ＢＭＰＲ２として公知の２つの異なるタイプのセリン－スレオニンキナーゼ受容体に結合する。ＢＭＰ４を、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＢＭＰ４は、第３の培養培地で、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または、それを超えるｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。ＢＭＰ４を、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＢＭＰ４は、第３の培養培地で、少なくとも約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。ＢＭＰ４を、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＢＭＰ４は、第３の培養培地で、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または、２９と、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または、１１ｎｇ／ｍＬとの間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、ＢＭＰ４は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で第３の培養培地に提供し得る。さらなる実施形態では、ＢＭＰ４は、第１、第２、及び、第３の添加剤セットの両方において活性化因子として提供し得る。
【0049】
第３の培養培地は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子も含む。成長の過程で、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子は、通常、心臓の中胚葉から提供され、そして、内胚葉細胞から後方前腸細胞への分化を促す。本開示の関連で使用する「ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子」とは、ＦＧＦと、その同族受容体（例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及び／または、ＦＧＦＲ４）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。この化合物は、（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及び／または、ＦＧＦＲ４に特異的であるか、または、複数の受容体に結合し、そして、活性化することができる）ＦＧＦ受容体のアゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、ＦＧＦシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。公知のＦＧＦとして、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５／１９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、及び、ＦＧＦ２３があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、活性化因子は、塩基性ＦＧＦまたはＦＧＦ２（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）である。ＦＧＦ２は、ＦＧＦＲ２（別名、ＣＤ３３２）、及び、ＦＧＦＲ３として公知の２つの異なるタイプの受容体に結合する。塩基性ＦＧＦを、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第１の培養培地で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または、それを超えるｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。塩基性ＦＧＦを、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第１の培養培地で、少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。塩基性ＦＧＦを、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第１の培養培地で、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または、１９と、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２ｎｇ／ｍＬとの間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、塩基性ＦＧＦを、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で第３の培養培地に提供し得る。さらなる実施形態では、塩基性ＦＧＦは、第２、及び、第３の添加剤セットの両方において活性化因子として提供し得る。
【0050】
第３の培養培地は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）シグナル伝達経路の活性化因子も含む。成長の過程で、ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子は、内胚葉細胞から肝細胞系統の細胞への分化を促す。本開示の関連で使用する「ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子」とは、ＨＧＦと、その同族受容体（例えば、ｃ－Ｍｅｔ）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。この化合物は、ＨＧＦ受容体のアゴニスト、ＨＧＦシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、ＨＧＦシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。ある実施形態では、活性化因子は、ＨＧＦ（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）である。ＨＧＦを、ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＨＧＦは、第３の培養培地で、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または、それを超えるｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。ＨＧＦを、ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＨＧＦは、第３の培養培地で、少なくとも約４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。ＨＧＦを、ＨＧＦシグナル伝達経路の活性化因子として提供する実施形態では、ＨＧＦは、第３の培養培地で、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または、３９と、約４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または、１１ｎｇ／ｍＬとの間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、ＨＧＦを、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で、第３の培養培地に提供し得る。ＨＧＦを、第２、及び、第３の添加剤セットでの活性化因子とし得る。
【0051】
第３の培養培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子をさらに含む。本開示の関連で使用する「Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子」とは、Ｗｎｔタンパク質リガンドと、その同族Ｆｒｉｚｚｌｅ受容体（例えば、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、または、ＦＺＤ１０）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のファミリーは、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質である。この化合物は、（ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、または、ＦＺＤ１０のいずれかに特異的であるか、または、複数の受容体に結合し、そして、阻害することができる）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のアゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。公知のＷｎｔタンパク質として、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、及び、ＷＮＴ１６があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、活性化因子は、Ｗｎｔ３ａ、ＳＢ－２１６７６３、及び／または、ＬＹ２０９０３１４である。ある実施形態では、活性化因子は、ＧＳＫ３タンパク質の生物学的活性を阻害することができる。例えば、ＧＳＫ３タンパク質の生物学的活性を阻害することができる活性化因子を、ＣＨＩＲ９９０２１とすることができる。ＣＨＩＲ９９０２１を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は、第３の培養培地で、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５μＭ、または、それを超える濃度で提供することができる。ＣＨＩＲ９９０２１を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は、第３の培養培地で、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、または、それ未満のμＭに満たない濃度で提供することができる。ＣＨＩＲ９９０２１を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は、第３の培養培地で、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、または、７．５と、約８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、または、１μＭとの間の濃度で提供することができる。ＣＨＩＲ９９０２１を、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１を、約３μＭの濃度で、第３の培養培地に提供し得る。ある実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１を、第２、及び、第３の添加剤セットでの活性化因子とし得る。
【0052】
第３の培養培地は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達経路の阻害因子をさらに含む。ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子の存在は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害因子と組み合わせることで、肝臓の発生に必要なポリペプチドをコードするＨＥＸ及びＰＲＯＸ１遺伝子の発現において有利に作用する。本開示の関連で使用する「ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子」とは、ＴＧＦβと、その同族受容体との結合に関連するシグナル伝達経路を阻害することができる化合物のことを指す。ＴＧＦβ受容体のファミリーは、ＳＭＡＤタンパク質を介してシグナル伝達を媒介する。この化合物は、ＴＧＦβ受容体のアンタゴニスト、ＴＧＦβシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの阻害因子、及び／または、ＴＧＦβシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの活性化因子のいずれかとし得る。公知のＴＧＦβタンパク質として、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、及び、ＴＧＦＢ４があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、阻害因子は、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、または、ＡＬＫ７ポリペプチドの内の少なくとも１つの生物学的活性を阻害することができる。一部の実施形態では、阻害因子は、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及び、ＡＬＫ７ポリペプチドの生物学的活性を阻害することができる。例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及び、ＡＬＫ７ポリペプチドの生物学的活性を阻害することができる阻害因子を、Ａ８３－０１とすることができる。あるいは、または、組み合わせで、ＳＢ４３１５４２、及び／または、ＬＹ３６４９４７を阻害因子とすることができる。Ａ８３－０１を、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、Ａ８３－０１は、第３の培養培地で、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５μＭ、または、それを超える濃度で提供することができる。Ａ８３－０１を、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、Ａ８３－０１は、第３の培養培地で、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２μＭ、または、それに満たない濃度で提供することができる。Ａ８３－０１を、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、Ａ８３－０１は、第３の培養培地で、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、または、４．５と、約５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２μＭとの間の濃度で提供することができる。Ａ８３－０１を、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害因子として使用する実施形態では、Ａ８３－０１を、約１μＭの濃度で第２の培養培地に提供し得る。一部の実施形態では、Ａ８３－０１は、第１、及び、第３の添加剤セットでの阻害因子とし得る。
【0053】
第３の培養培地は、例えば、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）などのサイトカインも含む。オンコスタチンＭを、サイトカインとして使用する実施形態では、オンコスタチンＭは、第３の培養培地で、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９ｎｇ／ｍｌ、または、それを超える濃度で存在することができる。オンコスタチンＭを、サイトカインとして使用する実施形態では、オンコスタチンＭは、第３の培養培地で、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１ｎｇ／ｍｌ、または、それ未満にも満たない濃度で存在することができる。オンコスタチンＭを、サイトカインとして使用する実施形態では、オンコスタチンＭは、第３の培養培地で、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または、２９と、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または、１１ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で存在することができる。特定の実施形態では、オンコスタチンＭは、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で第３の培養培地に存在する。
【0054】
第３の培養培地は、例えば、デキサメタゾンなどの糖質コルチコイドをさらに含む。デキサメタゾンを、糖質コルチコイドとして使用する実施形態では、デキサメタゾンは、第３の培養培地で、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４μＭ、または、それを超える濃度で存在することができる。デキサメタゾンを、糖質コルチコイドとして使用する実施形態では、デキサメタゾンは、第３の培養培地で、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６μＭ、または、それ未満にも満たない濃度で存在することができる。デキサメタゾンを、糖質コルチコイドとして使用する実施形態では、デキサメタゾンは、第３の培養培地で、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または、１４と、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または、６μＭとの間の濃度で存在することができる。特定の実施形態では、デキサメタゾンは、約１０μＭの濃度で第３の培養培地に存在する。
【0055】
第３の培養培地は、分化を可能ならしめるために、少なくとも１日以上、肝前駆細胞、及び、肝細胞系統の細胞と接触させておく。第３の培養培地を、培養細胞と２日以上接触させることを意図している場合、培地は、毎日交換することができる。本開示のプロセスの一部の実施形態では、第３の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数の間、培養細胞と接触させておく。別の実施形態では、第３の培養培地を、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。さらに別の実施形態では、第３の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数、そして、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。なおも別の実施形態では、第３の培養培地を、約１日～５日の間、培養細胞と接触させておく。
【0056】
後方前腸細胞を含む第３の培養培地を使用すると、肝前駆細胞を肝細胞系統の細胞に分化させることができる。したがって、本開示は、本明細書に記載したプロセスで得た肝細胞系統の細胞の集団を提供する。本開示の肝細胞系統の細胞の集団において、細胞の大部分が、肝細胞系統の細胞であると考えられており、そして、一部の実施形態では、一部の肝前駆細胞、及び／または、内胚葉細胞を含むことができる。
【0057】
第４の培養培地は、第４の添加剤セットを含んでおり、同セットは、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子、サイトカイン、及び、糖質コルチコイドを含む、または、本質的にそれらからなる。本開示の関連で使用する表現「第４の培養培地は、本質的に第４の添加剤セットからなる」とは、肝細胞系統の未成熟肝細胞様細胞への分化において非必須のさらなる添加剤を含むが、分化を促すことはできる第４の培養培地のことを指す。これらのさらなる添加剤として、例えば、Ｂ２７サプリメント、初代肝細胞サプリメント（ＰＨＨ）、ＨＢＭ／ＨＣＭ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（商標）レチノイン酸、インスリン、ビタミン類、及び、ミネラルがあるが、これらに限定されない。
【0058】
第４の培養培地は、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子も含む。本開示の関連で使用する「インスリンシグナル伝達経路の活性化因子」とは、インスリンと、その同族受容体（チロシンキナーゼ受容体）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。この化合物は、インスリン受容体（インスリン、ＩＧＦ－Ｉ、または、ＩＧＦ－ＩＩ）のアゴニスト、インスリンシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、インスリンシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。ある実施形態では、活性化因子は、（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）インスリンである。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、インスリンは、第４の培養培地で、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または、それを超えるｎｇ／ｍＬで提供し得る。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、インスリンは、第４の培養培地で、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、インスリンは、第４の培養培地で、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または、９５と、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または、５との間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、インスリンは、第４の培養培地で、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で提供することができる。さらに別の実施形態では、インスリンは、Ｂ２７サプリメントの形態、ＨＢＭ／ＨＣＭ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（商標）、及び／または、初代肝細胞（ＰＨＨ）サプリメントの形態で提供する。
【0059】
第４の培養培地は、例えば、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）などのサイトカインも含む。オンコスタチンＭを、サイトカインとして使用する実施形態では、オンコスタチンＭは、第４の培養培地で、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９ｎｇ／ｍｌ、または、それを超える濃度で存在することができる。オンコスタチンＭを、サイトカインとして使用する実施形態では、オンコスタチンＭは、第４の培養培地で、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１ｎｇ／ｍｌ、または、それ未満にも満たない濃度で存在することができる。オンコスタチンＭを、サイトカインとして使用する実施形態では、オンコスタチンＭは、第４の培養培地で、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または、２９と、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または、１１ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で存在することができる。特定の実施形態では、オンコスタチンＭは、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で第４の培養培地に存在する。
【0060】
第４の培養培地は、例えば、デキサメタゾンなどの糖質コルチコイドをさらに含む。デキサメタゾンを、糖質コルチコイドとして使用する実施形態では、デキサメタゾンは、第４の培養培地で、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４μＭ、または、それを超える濃度で存在することができる。デキサメタゾンを、糖質コルチコイドとして使用する実施形態では、デキサメタゾンは、第４の培養培地で、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６μＭ、または、それ未満にも満たない濃度で存在することができる。デキサメタゾンを、糖質コルチコイドとして使用する実施形態では、デキサメタゾンは、第４の培養培地で、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または、１４と、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または、６μＭとの間の濃度で存在することができる。特定の実施形態では、デキサメタゾンは、約１０μＭの濃度で第４の培養培地に存在する。
【0061】
第４の培養培地は、分化を可能ならしめるために、少なくとも１日以上、肝細胞系統の細胞、及び、未成熟肝細胞様細胞と接触させておく。第４の培養培地を、培養細胞と２日以上接触させることを意図している場合、培地は、毎日交換することができる。本開示のプロセスの一部の実施形態では、第４の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数の間、培養細胞と接触させておく。別の実施形態では、第４の培養培地を、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。さらに別の実施形態では、第４の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数、そして、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。なおも別の実施形態では、第４の培養培地を、約１日～５日の間、培養細胞と接触させておく。
【0062】
後方前腸細胞を含む第４の培養培地を使用すると、肝細胞系統の細胞を未成熟肝細胞様細胞に分化させることができる。したがって、本開示は、本明細書に記載したプロセスで得た未成熟肝細胞様細胞の集団を提供する。本開示の未成熟肝細胞様細胞の集団において、細胞の大部分が、未成熟肝細胞様細胞であると考えられており、そして、一部の実施形態では、肝細胞系統の一部の細胞、肝前駆細胞、及び／または、内胚葉細胞を含むことができる。
【0063】
第５の培養培地は、第５の添加剤セットを含んでおり、同セットは、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子、及び、糖質コルチコイドを含む、または、本質的にそれらからなる。本開示の関連で使用する表現「第５の培養培地は、本質的に第５の添加剤セットからなる」とは、未成熟肝細胞様細胞の成熟肝細胞様細胞への分化において非必須のさらなる添加剤を含むが、分化を促すことはできる第５の培養培地のことを指す。これらのさらなる添加剤として、例えば、Ｂ２７サプリメント、初代肝細胞サプリメント、レチノイン酸、インスリン、ビタミン類、ＨＢＭ／ＨＣＭ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（商標）、及び、ミネラルがあるが、これらに限定されない。
【0064】
第５の培養培地は、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子も含む。本開示の関連で使用する「インスリンシグナル伝達経路の活性化因子」とは、インスリンと、その同族受容体（チロシンキナーゼ受容体）との結合に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる化合物のことを指す。この化合物は、インスリン受容体（インスリン、ＩＧＦ－Ｉ、または、ＩＧＦ－ＩＩ）のアゴニスト、インスリンシグナル伝達経路を活性化することが公知のポリペプチドの活性化因子、及び／または、インスリンシグナル伝達経路を阻害することが公知のポリペプチドの阻害因子のいずれかとし得る。ある実施形態では、活性化因子は、（組換え形態、または、精製した形態で提供し得る）インスリンである。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、インスリンは、第５の培養培地で、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または、それを超えるｎｇ／ｍＬで提供し得る。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、インスリンは、第５の培養培地で、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、または、それ未満のｎｇ／ｍＬに満たない濃度で提供することができる。インスリンを、インスリンシグナル伝達経路の活性化因子として使用する実施形態では、インスリンは、第５の培養培地で、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または、９５と、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または、５との間の濃度で提供することができる。一部の特定の実施形態では、インスリンは、第５の培養培地で、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で提供することができる。さらに別の実施形態では、インスリンは、Ｂ２７サプリメントの形態、ＨＢＭ／ＨＣＭ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（商標）、及び／または、初代肝細胞（ＰＨＨ）サプリメントの形態で提供する。
【0065】
第５の培養培地は、例えば、デキサメタゾンなどの糖質コルチコイドをさらに含む。デキサメタゾンを、糖質コルチコイドとして使用する実施形態では、デキサメタゾンは、第５の培養培地で、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４μＭ、または、それを超える濃度で存在することができる。デキサメタゾンを、糖質コルチコイドとして使用する実施形態では、デキサメタゾンは、第５の培養培地で、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６μＭ、または、それ未満にも満たない濃度で存在することができる。デキサメタゾンを、糖質コルチコイドとして使用する実施形態では、デキサメタゾンは、第５の培養培地で、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または、１４と、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または、６μＭとの間の濃度で存在することができる。特定の実施形態では、デキサメタゾンは、約１０μＭの濃度で第５の培養培地に存在する。特定の実施形態では、デキサメタゾンは、約１０μＭの濃度で第５の培養培地に存在する。
【0066】
第５の培養培地は、分化を可能ならしめるために、少なくとも１日以上、未成熟肝細胞様細胞、及び、成熟肝細胞様細胞と接触させておく。第５の培養培地を、培養細胞と２日以上接触させることを意図している場合、培地は、毎日交換することができる。本開示のプロセスの一部の実施形態では、第５の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数の間、培養細胞と接触させておく。別の実施形態では、第５の培養培地を、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。さらに別の実施形態では、第５の培養培地を、少なくとも１、２、３、４、または、それ以上の日数、そして、５、４、３、２、または、それ未満の日数の間、培養細胞と接触させておく。なおも別の実施形態では、第５の培養培地を、約１日～５日の間、培養細胞と接触させておく。
【0067】
後方前腸細胞を含む第５の培養培地を使用すると、未成熟肝細胞様細胞を成熟肝細胞様細胞に分化させることができる。したがって、本開示は、本明細書に記載したプロセスで得た成熟肝細胞様細胞の集団を提供する。本開示の成熟肝細胞様細胞の集団において、細胞の大部分が、成熟肝細胞様細胞であると考えられており、そして、一部の実施形態では、一部の未成熟肝細胞様細胞、肝細胞系統の細胞、肝前駆細胞、及び／または、内胚葉細胞を含むことができる。
【0068】
本明細書に記載した培地は、胆管細胞の形成を促すことができるので、ＥＧＦを含める必要性は特にない。
【0069】
本開示は、本明細書に開示したように、第１、第２、及び／または、第３のプロセスの組み合わせを提供する。例えば、第１のプロセスを、第２のプロセスと組み合わせて、内胚葉細胞から肝前駆細胞を作り出すことができる。別の例では、第２のプロセスを、第３のプロセスと組み合わせて、後方前腸細胞から肝細胞様細胞を作り出すことができる。さらなる例では、第１、第２、及び、第３のプロセスを組み合わせて、内胚葉細胞から肝細胞様細胞を作り出すことができる。本明細書に記載したプロセスは、強力な生物学的活性（例えば、高いＣｙｐ３Ａ４活性、高いアルブミン発現レベル、及び／または、高い尿素生産レベル）を有する、及び／または、治療薬（または、潜在的な治療薬）を代謝することができる、数多くの肝細胞様細胞、及び／または、肝細胞様細胞を生成する。この特定の実施形態は、後述するように、被包化肝臓組織に取り込ませることを意図した肝細胞様細胞を作り出す上で特に有用である。
【0070】
本開示は、後方前腸細胞、肝前駆細胞、及び／または、肝細胞様細胞を作り出すキットのための構成要素も提供する。概して、キットは、本明細書に記載した少なくとも１つの添加剤セット、または、本明細書に記載した少なくとも１つの培養培地、任意の細胞、ならびに、本明細書に記載したプロセスを実施するための説明書を含む。後方前腸細胞を作り出すためのキットは、例えば、第１の添加剤セット、または、第１の培養培地、任意の内胚葉細胞、ならびに、第１のプロセスを実施するための説明書を含むことができる。肝前駆細胞を作り出すためのキットは、例えば、第２の添加剤セット、または、第２の培養培地、任意の後方前腸細胞、ならびに、第２のプロセスを実施するための説明書を含むことができる。肝細胞様細胞を作り出すためのキットは、例えば、第３の添加剤セットまたは第３の培養培地、第４の添加剤セットまたは第４の培養培地、第５の添加剤セットまたは第５の培養培地、任意の肝前駆細胞、肝細胞系統の細胞、または、未成熟肝細胞様細胞、ならびに、第３のプロセスを実施するための説明書を含むことができる。
【0071】
被包化肝組織
被包化肝組織は、生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆した肝臓オルガノイドを、少なくとも１つ（そして、ある実施形態では、複数）含む。本開示との関連で使用する「肝臓オルガノイド」とは、培養した肝細胞、間葉細胞、及び、内皮細胞の混合物のことを指しており、肝細胞は、本明細書に記載したプロセスを使用して取得する。一部の実施形態では、肝臓オルガノイドは、培養した肝細胞、間葉細胞、及び、内皮細胞の混合物を含む。肝臓オルガノイドは、一般的に、球状の形態を有しており、その表面は不規則となり得る。肝臓オルガノイドの相対直径は、約５０～約５００μｍである。肝臓の細胞コアは、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞から構成されており、そして、一部の実施形態では、培養の間に、細胞外マトリックス、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞から生産、及び、構築する。肝臓オルガノイドは、細胞を懸濁培養して得ることができる。一部の実施形態では、特に、被包化肝組織の培養／分化の前に、肝細胞、例えば、肝実質細胞、及び／または、胆管上皮細胞などで、肝臓オルガノイドの表面を、少なくとも部分的に被覆する（一部の実施形態では、実質的に被覆する）。別の実施形態では、肝細胞は、細胞コア全体に分散する（しかし、必ずしも均一である必要はない）。被包化肝組織に存在するオルガノイドは、第１の生体適合性架橋ポリマーで、少なくとも部分的に被覆する（一部の実施形態では、実質的に被覆する）。
被包化肝組織は、生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆した肝臓オルガノイドを、少なくとも１つ（そして、ある実施形態では、複数）含む。本開示との関連で使用する「肝臓オルガノイド」とは、培養した肝細胞、間葉細胞、及び、内皮細胞の混合物のことを指しており、肝細胞は、本明細書に記載したプロセスを使用して取得する。一部の実施形態では、肝臓オルガノイドは、培養した肝細胞、間葉細胞、及び、内皮細胞の混合物を含む。肝臓オルガノイドは、一般的に、球状の形態を有しており、その表面は不規則となり得る。肝臓オルガノイドの相対直径は、約５０～約５００μｍである。肝臓の細胞コアは、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞から構成されており、そして、一部の実施形態では、培養の間に、細胞外マトリックス、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞から生産、及び、構築する。肝臓オルガノイドは、細胞を懸濁培養して得ることができる。一部の実施形態では、特に、被包化肝組織の培養／分化の前に、肝細胞、例えば、肝実質細胞、及び／または、胆管上皮細胞などで、肝臓オルガノイドの表面を、少なくとも部分的に被覆する（一部の実施形態では、実質的に被覆する）。別の実施形態では、肝細胞は、細胞コア全体に分散する（しかし、必ずしも均一である必要はない）。被包化肝組織に存在するオルガノイドは、第１の生体適合性架橋ポリマーで、少なくとも部分的に被覆する（一部の実施形態では、実質的に被覆する）。
【0072】
被包化前の肝臓オルガノイドは、外来性の細胞外マトリックスを含んでいない。肝臓オルガノイドは、培養した肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞から実質的に構成されている。さらに、肝臓オルガノイド（第１の生体適合性ポリマーに被包されているもの、または、被包されていないもの）は、肝機能を示し、例えば、肝臓オルガノイドは、アルブミン及び凝固因子を合成すること、ＣｙＰ３Ａ４活性を示すこと、アンモニアから尿素へと無害化処理すること、ならびに、肝臓特異的な薬物（すなわち、タクロリムス、または、リファンピシン）代謝を行うことができる。
【0073】
本開示の肝臓オルガノイドは、実質的に球状の形態を有しており、かつ、マイクロメートル範囲の相対直径を有する（例えば、その直径は、１ｍｍ未満である）。ある実施形態では、肝臓オルガノイドは、その被包化前は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、または、４９０μｍの相対直径を有する。なおも別の実施形態では、肝臓オルガノイドは、その被包化前は、約５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、または、６０μｍ以下の相対直径を有する。別の実施形態では、肝臓オルガノイドは、その被包化前に、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、または、４９０μｍと、約５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０または６０μｍ以下との間の相対直径を有する。一部の実施形態では、肝臓オルガノイドは、その被包化前に、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、または、２９０μｍと、約３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、または、６０μｍ以下との間の相対直径を有する。なおも別の実施形態では、被包化前の肝臓オルガノイドは、少なくとも約１００μｍであり、かつ、約３００μｍ以下の相対直径を有する。例えば、被包化前の肝臓オルガノイドは、少なくとも約１５０、１６０、１７０、１８０、または、１９０μｍであり、かつ、２００、１９０、１８０、１７０、または、１６０μｍよりも小さい相対直径を有する。なおもさらなる実施形態では、被包化前の肝臓オルガノイドは、少なくとも約１５０μｍであり、かつ、約２００μｍ以下の相対直径を有する。肝臓オルガノイドの大きさによって、そこに含まれる細胞は、様々な栄養素や、被包化肝臓組織と接触する生体液／細胞に曝露されることが増える。一部の実施形態では、これにより、宿主の血管系（例えば、被包化肝臓組織を移植した宿主の管脈系）での肝臓オルガノイドの血管形成の必要がなくなり、インビボで生存可能で、かつ、生物学的に活性な状態を保つことができるようになる。
【0074】
肝臓オルガノイドの肝細胞は、オルガノイド全体に分散することができ、一部の実施形態では、それらの一部は、肝臓オルガノイドの細胞コアの表面に位置することができる。肝臓オルガノイドの肝細胞は、例えば、胚体内胚葉、後方前腸細胞、肝細胞系統の細胞、または、肝前駆細胞、または、肝細胞様細胞に由来する細胞とすることができる。肝臓オルガノイドの肝細胞は、肝細胞様細胞、及び／または、胆管上皮細胞とすることができる。肝臓オルガノイドの肝細胞は、単一の細胞型（例えば、胚体内胚葉細胞、後方前腸細胞、肝細胞系統の細胞、肝細胞様細胞、または、胆管上皮細胞）に由来する、あるいは、細胞型の混合物（例えば、次の細胞型：胚体内胚葉細胞、後方前腸細胞、肝細胞系統の細胞、肝細胞様細胞、及び／または、胆管上皮細胞の少なくとも２つの混合物）に由来することができる。肝臓オルガノイドをインビトロで細胞培養する間、または、肝臓オルガノイドをインビボで移植を行うと、肝細胞型（複数可）が変化すること、または、肝細胞が分化することができる。例えば、肝臓オルガノイドの肝細胞は、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞と共培養している間、または、インビボで移植を行うと、（胚体内胚葉、後方前腸、または、肝細胞系統の細胞から、肝細胞様細胞または胆管上皮細胞へと）分化することができる。肝臓オルガノイドに肝細胞様細胞が存在するか否かを決定するために、チトクロムＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡメンバー４（ＣｙＰ３Ａ４）の活性を、当該技術分野で公知の手段で決定することができる。肝臓オルガノイドでの肝細胞様細胞の存在の有無を決定するために、アルブミン、凝固因子、及び、尿素の合成／生産、ならびに、ＣｙＰ３Ａ４の活性をモニターすることもできる。肝臓オルガノイドでの胚体内胚葉または後方前腸細胞の存在の有無を決定するために、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４の発現を、当該技術分野で公知の手段で決定することができる。
【0075】
肝臓オルガノイドの間葉細胞を、例えば、異なる起源（骨髄（血液を含む）、臍帯、または、脂肪組織）の間葉系幹細胞／前駆細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝星細胞、筋線維芽細胞、及び／または、線維芽細胞とすることができる。肝臓オルガノイドの間葉細胞は、単一の細胞型（例えば、間葉系幹細胞／前駆細胞、脂肪細胞、筋細胞、または、線維芽細胞）に由来するか、または、細胞型の混合物（例えば、次の細胞型：間葉系幹細胞／前駆細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝星細胞、筋線維芽細胞、及び／または、線維芽細胞の少なくとも２つの混合物）に由来することができる。肝臓オルガノイドの間葉細胞の型は、肝細胞、及び、任意の内皮細胞との共培養の間、または、インビボで移植を行うと、（間葉系幹細胞／前駆細胞から、線維芽細胞、脂肪細胞、または、筋細胞へと）分化することができる。間葉系幹細胞／前駆細胞は、数ある遺伝子の中でもとりわけ、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）、フィブロネクチン、ＣＤ９０、及び、ＣＤ７３を発現することが公知である。肝臓オルガノイドにおける間葉細胞の位置または存在を決定するために、数ある中でもとりわけ、間葉系系統に特異的である、または、間葉系系統と関連する、遺伝子またはタンパク質の発現を決定することができる。
【0076】
肝臓オルガノイドの内皮細胞は、存在する場合、例えば、様々な起源の内皮前駆細胞、及び／または、内皮細胞とすることができる。肝臓オルガノイドの内皮細胞は、単一の細胞型（例えば、内皮前駆細胞、または、内皮細胞）に由来する、または、細胞型の混合物（例えば、内皮前駆細胞と内皮細胞との混合物）に由来することができる。肝臓オルガノイドの内皮細胞の型は、内胚葉細胞と間葉細胞とのインビトロでの共培養の間、または、インビボで移植を行うと、（内皮前駆細胞から内皮細胞へと）分化することができる。一部の実施形態では、肝臓オルガノイドの内皮細胞は、管腔の内面に内皮細胞が並ぶ（部分的とすることができる）毛細管または毛細管様形状を組織することができる。
【0077】
上記したように、肝臓オルガノイドの細胞コアは、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞からから構成されており、そして、一部の実施形態では、培養の間に細胞が生産及び構築した細胞外マトリックスからなる。肝臓オルガノイドの細胞コアは、壊死細胞／アポトーシス細胞が実質的に少なく（例えば、肝臓オルガノイドの細胞コアは、組織学的に調べると壊死領域を有していない）、この理由は、肝臓オルガノイドを培養する培地から細胞コア全体に栄養分が拡散することができ、これにより、細胞コア内の細胞に栄養分を送達することができ、さらに、細胞コアの細胞の代謝老廃物を肝臓オルガノイドの外部に拡散させることができるためである。肝臓オルガノイド自体（被包化前）は、外因性の細胞外マトリックス、または、合成高分子材料を含んでいない（例えば、それらが存在しない）。一部の実施形態では、肝細胞は、細胞コアの表面に存在することができる。別の実施形態では、肝細胞は、細胞コアの細胞と組み合わせることで、細胞外マトリックス材料（例えば、コラーゲン、及び、フィブロネクチン）を生産及び構築することができ、加えて、一部の実施形態では、基底膜材料も生産及び構築することができる。
【0078】
上記したように、肝細胞は、肝臓オルガノイドの細胞コアの表面を、少なくとも部分的に被覆することができる。本開示との関連において「肝細胞は、細胞コアの表面を少なくとも部分的に被覆する」という表現は、細胞コアの表面の少なくとも約１０％、２０％、３０％、または、４０％を、肝細胞が占めることを示す。一部の実施形態では、肝細胞は、細胞コアの表面を実質的に被覆する。本開示との関連において「肝細胞は、細胞コアの表面を実質的に被覆する」という表現は、細胞コアの表面の大部分を、肝細胞が占めることを示し、例えば、細胞コアの表面の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％を肝細胞が占める。ある実施形態では、肝細胞は、細胞コアの表面を完全に被覆する（例えば、細胞コアの表面の９９％超を肝細胞で被覆する）。
【0079】
ある実施形態では、本開示の肝臓オルガノイドは、第１の架橋生体適合性ポリマーで被包する前は、哺乳動物の肝臓で認められるものと比較すると、肝細胞様細胞、及び／または、胆管上皮細胞よりも、間葉細胞（及び、存在する場合には、内皮細胞）の比率が大きい。しかしながら、第１の架橋生体適合性ポリマーで被包した後は、本開示の肝臓オルガノイドは、間葉細胞（及び、存在する場合には、内皮細胞）よりも、肝細胞の比率が大きい。哺乳動物の肝臓の約９０％は、肝細胞から構成されていることは公知である。したがって、本開示の一部の実施形態では、肝臓オルガノイドでの肝細胞の比率は、（肝臓オルガノイドの総細胞数と比較した場合）約９０％、約８５％、約８０％、または、約７５％未満である。
【0080】
肝臓オルガノイドは、異なる起源の細胞から作り出すことができる。ある実施形態では、肝細胞、間葉細胞、または、内皮細胞の少なくとも１つは、哺乳動物、例えば、ヒトに由来する。別の実施形態では、肝細胞、間葉細胞、または、内皮細胞の少なくとも２つは、哺乳動物、例えば、ヒトに由来する。さらに別の実施形態では、肝細胞、間葉細胞、及び、内皮細胞はすべて、哺乳動物、例えば、ヒトに由来する。肝臓オルガノイド内では、異なる起源に由来する細胞を組み合わせることができる。例えば、間葉細胞及び内皮細胞を、マウス起源またはブタ起源に由来したものとする一方で、肝細胞は、ヒト起源に由来することができる。こうした組み合わせは網羅的なものではなく、当業者であれば、本開示との関連において適切である、さらなる組み合わせを想到することができる。
【0081】
肝臓オルガノイドの細胞は、異なる供給源に由来することができる。例えば、肝臓オルガノイドの細胞は、初代細胞培養、確立した細胞株、または、分化した幹細胞に由来することができる。肝臓オルガノイド内では、異なる供給源に由来する細胞を組み合わせることができる。例えば、肝細胞は、初代細胞培養に由来することができ、間葉細胞は、確立した細胞株に由来することができ、そして、内皮細胞は、分化した細胞株に由来することができる。あるいは、肝臓オルガノイド内では、同一の供給源（例えば、分化した幹細胞）に由来する細胞を組み合わせることもできる。本実施形態では、単一の細胞源（例えば、幹細胞）から被包化肝臓組織を作り出すために細胞を取得できるので、特に有用である。特定の実施形態では、肝臓オルガノイドの細胞は、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞に分化した単一の幹細胞集団に由来する。幹細胞集団は、胚性幹細胞、または、人工多能性幹細胞に由来することができる。特定の実施形態では、肝臓オルガノイドの細胞は、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞に分化している単一の多能性幹細胞集団に由来する。
【0082】
被包化肝組織で使用可能なポリマー（別名、ポリマーマトリックス）は、肝臓オルガノイド（複数可）の周囲にハイドロゲルを形成する。当該技術分野で周知の通り、ハイドロゲルとは、水が分散媒体である親水性のポリマー鎖のことを指す。ハイドロゲルは、天然または合成のポリマーネットワークから得ることができる。本開示との関連で、ハイドロゲルで被包すると、包埋される肝臓オルガノイドが、ポリマーから漏出することが妨げられるので、肝臓オルガノイドの細胞が、移植時のレシピエントの体内で免疫反応または腫瘍を招くリスクを排除または抑制する。ある実施形態では、肝臓オルガノイドを、それぞれ、個別に被包し、被包化肝臓オルガノイドを、別の実施形態では、ポリマーマトリックスにさらに含める。さらに別の実施形態では、肝臓オルガノイドは、それらを被包するようにポリマーマトリックスに取り込む。
【0083】
本開示との関連において、ポリマーは、対象（例えば、ヒト）に導入したときに毒性を示さない場合に「生体適合性」であると考えられる。本開示との関連において、生体適合性ポリマーは、肝臓オルガノイドの細胞に対して毒性を示さず、または、対象（例えば、ヒト）にインビボ移植したときに毒性を示さないことが好ましい。肝毒性は、例えば、肝細胞様細胞のアポトーシス死の割合（例えば、アポトーシスの増加は、肝毒性を示す）、トランスアミナーゼレベル（例えば、トランスアミナーゼレベルの高まりは、肝毒性を示す）、肝細胞様細胞の肥大（例えば、肥大の増加は、肝毒性を示す）、肝細胞様細胞における微小空胞変性（例えば、変性の増加は、肝毒性を示す）、胆管細胞の死の割合（例えば、胆管細胞の死亡率の高まりは、肝毒性を示す）、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）レベル（例えば、ＧＧＴレベルの高まりは、肝毒性を示す）を決定して測定することができる。生体適合性ポリマーとして、炭水化物（ヒアルロン酸（ＨＡ）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、アルギン酸、キトサン、ヘパリン、アガロース、デキストラン、セルロースなどのグリコサミノグリカン、及び／または、それらの誘導体）、タンパク質（コラーゲン、エラスチン、フィブリン、アルブミン、ポリ（アミノ酸）、糖タンパク質、抗体、及び／または、それらの誘導体）、及び／または、合成ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、及び／または、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）に基づくもの）があるが、これらに限定されない。生体適合性ポリマーを、単一のポリマー、または、異なるポリマーの混合物（例えば、ＵＳ２０１２／０１４２０６９に記載されたもの）とすることができる。生体適合性ポリマーの例として、ポリ（エチレン）グリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、フィブリン、多糖材料（キトサン、プロテオグリカン、または、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のようなもの）、アルギン酸塩、コラーゲン、チオール化ヘパリン、及び、それらの混合物があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、直鎖状、分岐鎖状とすることができ、そして、任意に、ペプチド（例えば、ＲＧＤ）、成長因子、インテグリン、または、薬物を取り込むことができる。
【0084】
一部の実施形態では、ポリマーは、「低免疫原性ポリマー」であり、レシピエントにおいて免疫応答を誘発せず、または、最小限の免疫応答しか誘発しない（すなわち、結果として、このポリマーが、分解、改変、または、機能喪失を被ることはない）。この低免疫原性ポリマーは、細胞の１つ以上の抗原決定基をブロックし、そのような抗原決定基を同種異系対象に導入したときに、その抗原決定基に対する免疫応答を抑制するか、または阻止することさえもできる。
【0085】
本開示の被包化肝組織に存在するポリマーは、好ましくは、架橋可能なものであり、例えば、架橋することができる。ポリマーは、熱的、化学的（例えば、ＶＰＭＳ、ＲＧＤなどの１つ以上のペプチドを使用する）、または、ｐＨまたは光の使用（例えば、ＵＶ光を使用する光重合）で架橋することができる。一部の実施形態では、架橋は、肝臓オルガノイド（ポリマーマトリックスによる被包の有無にかかわらず）を、ポリマーマトリックス内に分散させた後に実施することができる。
【0086】
本開示のポリマーを、全体的または部分的に生分解性（例えば、生体の代謝によって加水分解されやすい）のものとするか、または、生分解に対して全体的または部分的に抵抗性（例えば、生体の代謝を受けたときの加水分解抵抗性）を示すものとすることができる。生体適合性かつ生分解性のポリマーの例として、ポリ（エチレン－グリコール）－（マレイミド）（ＰＥＧ－Ｍａｌ）８－アームがあるが、これに限定されない。生体適合性かつ生分解抵抗性のポリマーの例として、ポリ（エチレン－グリコール）－ビニルスルホン（ＰＥＧ－ＶＳ）があるが、これに限定されない。
【0087】
被包化肝組織は、肝臓オルガノイドを、少なくとも部分的に（一部の事例では、実質的に）被覆する第１の生体適合性架橋ポリマーを含む。第１の生体適合性ポリマーは、肝臓オルガノイドの細胞と物理的に接触する。本開示との関連において、表現「第１の生体適合性架橋ポリマーによって少なくとも部分的に被覆した肝臓オルガノイド（複数可）」とは、肝臓オルガノイドの表面の少なくとも約１０％、２０％、３０％、または、４０％を、第１の生体適合性架橋ポリマーが占めることを指す。一部の実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、肝臓オルガノイド（複数可）の表面を実質的に被覆する。本開示との関連において、表現「第１の生体適合性架橋ポリマーによって実質的に被覆した肝臓オルガノイド（複数可）」は、肝臓オルガノイドの表面の大部分を第１の生体適合性架橋ポリマーが占めることを指しており、例えば、オルガノイドの表面の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％を、第１の生体適合性架橋ポリマーが占める。ある実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、肝臓オルガノイドの表面を完全に被覆する（例えば、肝臓オルガノイドの表面の９９％超を、第１の生体適合性架橋ポリマーで被覆する）。
【0088】
一部の実施形態では、被包化肝組織は、第１の生体適合性架橋ポリマーを少なくとも部分的に（一部の事例では、実質的に）被覆する第２の生体適合性架橋ポリマーも含むことができる。第２の生体適合性ポリマーは、第１の生体適合性架橋ポリマーと物理的に接触しており、一部の実施形態では、肝臓オルガノイドの細胞と物理的に接触する。本開示との関連において、表現「第２の生体適合性架橋ポリマーによって少なくとも部分的に被覆した第１の生体適合性架橋ポリマー」とは、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面の少なくとも約１０％、２０％、３０％、または、４０％を、第２の生体適合性架橋ポリマーが占めることを指す。一部の実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面を実質的に被覆する。本開示との関連において、表現「第２の生体適合性架橋ポリマーによって実質的に被覆した第１の生体適合性架橋ポリマー」とは、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面の大部分を第２の生体適合性架橋ポリマーが占めることを指しており、例えば、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％を、第２の生体適合性架橋ポリマーが占める。ある実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面を完全に被覆する（例えば、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面の９９％超を、第２の生体適合性架橋ポリマーで被覆する）。さらに別の実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、肝臓オルガノイド（第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆したもの）が散在するマトリックスを形成する。そのような実施形態では、肝臓オルガノイド（第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆したもの）は、その周囲に、第２の生体適合性架橋マトリックスを存在させることができ、または、別の肝臓オルガノイド（第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆したもの）と物理的に接触させることができる。被包化肝組織は、第２の生体適合性架橋ポリマーを被覆するさらな生体適合性架橋ポリマーを含むことができる。
【0089】
第１の生体適合性架橋ポリマーと第２の生体適合性架橋ポリマーとは、同一であるか、または、異なるものとすることができる。ある実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、少なくとも部分的に（一部の実施形態では、完全に）生分解性のポリマーである。組み合わせて、もしくは、第２の生体適合性架橋ポリマーは、生分解に対して少なくとも部分的に（一部の実施形態では、完全に）抵抗性である。さらに別の実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、生分解性ポリマーであり、第２の生体適合性架橋ポリマーは、生分解に対して抵抗性である。そのような実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、第２の生体適合性架橋ポリマーと比較して、生分解性を高く（例えば、生分解に対する抵抗性を小さく）することができる。
【0090】
一部の実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、複数の肝臓オルガノイドを含む。そのような実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または、５００の肝臓オルガノイドを含むことができる。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、最大で約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、または、５０の肝臓オルガノイドを含むことができる。なおも別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、または、４５０と、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、または、６０との間の数の肝臓オルガノイドを含む。なおも別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、約５０～５００の肝臓オルガノイドを含む。別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、少なくとも約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または、２５００の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、最大で約２５００、２４００、２３００、２２００、２１００、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、または、２５０の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、または、２４００と、約２５００、２４００、２３００、２２００、２１００、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、または、３００との間の数の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、約２５０～２５００の肝臓オルガノイドを含む。
【0091】
ある実施形態では、被包化肝組織を、培養し、または、インビボで移植すると、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞と関連する遺伝子、及び、タンパク質を発現することができる。さらなる実施形態では、被包化肝組織は（インビトロ、または、インビボで）、アルブミンを生産すること、アンモニアから尿素を合成すること、ＣｙＰ３Ａ４活性を示すこと、及び／または、薬物（タクロリムス、及び／または、リファンピシンなど）を代謝することができる。一部の実施形態では、被包化肝組織は、組織内の肝臓オルガノイドのｇ当たり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または、２０ｍｇのアルブミンを生産することができる。別の実施形態では、被包化肝組織は、１回以上の凍結融解サイクルで、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞と関連する遺伝子、及び、タンパク質を発現すること、アルブミンを生産すること、アンモニアから尿素を合成すること、ＣｙＰ３Ａ４活性を示すこと、及び／または、薬物（タクロリムス及び／またはリファンピシンなど、肝臓で代謝を受けることが公知のもの）の代謝を行うことができる。一部の実施形態では、被包化肝組織は、凍結した後に、組織内の肝臓オルガノイドのｇ当たり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または、２０ｍｇのアルブミンを生産することができる。
【0092】
被包化肝組織を作り出すプロセス
被包化肝組織を作り出すプロセスでは、まず、肝臓オルガノイド（複数可）を作り出すことが必要であり、次に、この（これらの）肝臓オルガノイドを、第１の生体適合性架橋ポリマーに（少なくとも部分的に）被包すること（さらに任意に、第２の生体適合性架橋ポリマー、及び、さらなる生体適合性架橋ポリマーに被包すること）が必要である。
被包化肝組織を作り出すプロセスでは、まず、肝臓オルガノイド（複数可）を作り出すことが必要であり、次に、この（これらの）肝臓オルガノイドを、第１の生体適合性架橋ポリマーに（少なくとも部分的に）被包すること（さらに任意に、第２の生体適合性架橋ポリマー、及び、さらなる生体適合性架橋ポリマーに被包すること）が必要である。
【0093】
肝臓オルガノイドは、（ｉ）肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞を含む細胞コア、（ｉｉ）実質的に球状の形態、及び、（ｉｉｉ）約５０～約５００μｍの相対直径を有する肝臓オルガノイドを得るために必要な条件下で、肝細胞、間葉細胞、及び、任意の内皮細胞（すべて上記したもの）を共培養して、作り出すことができる。一部の実施形態では、こうした条件として、肝臓オルガノイドの形成を促すための細胞の懸濁培養（例えば、超低接着条件）がある。
【0094】
被包化肝組織に含めるべき肝細胞は、それらが、本明細書に記載した少なくとも１つのプロセスに供するのであれば、異なる起源（例えば、哺乳動物）、及び、供給源（初代細胞培養、細胞株、分化した幹細胞）から得ることができる。肝細胞は、胚体内胚葉細胞、後方前腸細胞、肝細胞系統の細胞、肝細胞様細胞、及び／または、胆管上皮細胞などの異なる型に由来することができる。単一のオルガノイドに由来する肝細胞は、同一または異なる起源、同一または異なる供給源、及び、同一または異なる型に由来することができる。
【0095】
被包化肝組織に含める間葉細胞は、異なる起源（例えば、哺乳動物）、及び、供給源（初代細胞培養、細胞株、分化した幹細胞）から得ることができる。間葉細胞は、間葉系幹細胞、脂肪細胞、筋細胞、または、線維芽細胞などの異なる型に由来することができる。単一のオルガノイドに由来する間葉細胞は、同一または異なる起源、同一または異なる供給源、及び、同一または異なる型に由来することができる。ある実施形態では、間葉系幹細胞／前駆細胞を使用する。さらに別の実施形態では、間葉系幹細胞／前駆細胞を、分化性の幹細胞（多能性幹細胞など）から得る。さらに別の実施形態では、間葉系幹細胞／前駆細胞は、分化性の多能性幹細胞から（例えば、ノックアウト血清代替物を添加したグルコース高含有ＤＭＥＭに入れた被覆を施していないプラスチックで多能性幹細胞を培養して）得る。間葉細胞は、新鮮な状態で使用するか、または、肝臓オルガノイドを形成するために使用に供するまで、凍結保存することができる。
【0096】
被包化肝組織に含める内皮細胞は、存在する場合、異なる起源（例えば、哺乳動物）、及び、供給源（初代細胞培養、細胞株、分化した幹細胞）から取得することができる。内皮細胞は、内皮前駆細胞、及び、内皮細胞などの異なる型に由来することができる。ある実施形態では、内皮前駆細胞を使用する。単一のオルガノイドに由来する内皮細胞は、同一または異なる起源、同一または異なる供給源、及び、同一または異なる型に由来することができる。さらに別の実施形態では、内皮前駆細胞は、分化性の幹細胞（多能性幹細胞など）から得る。さらに別の実施形態では、内皮前駆細胞は、分化性の多能性幹細胞から得る（例えば、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、及び／または、ＶＥＧＦと組み合わせて、ＣＨＩＲ９９０２１、及び／または、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａと共に、多能性幹細胞を培養して得る）。内皮細胞は、新鮮な状態で使用するか、または、肝臓オルガノイドを形成するために使用に供するまで、凍結保存することができる。
【0097】
ある実施形態では、肝臓オルガノイドを、単一の多能性幹細胞集団から調製する。多能性幹細胞は、ウイルス形質導入（例えば、センダイウイルス系を使用するもの）など、当該技術分野で公知の方法を使用して誘導する、または、合成ｍＲＮＡによる手法を使用して誘導することができる。多能性幹細胞集団は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の１つ以上のコロニーから得ることができる。同一の多能性幹細胞集団から肝臓オルガノイドを調製する実施形態では、ｉＰＳＣ集団は、少なくとも２つ（及び、一部の実施形態では、少なくとも３つ）の亜集団に分割され、それぞれを、肝細胞、及び、間葉細胞（及び、一部の実施形態では、内皮細胞）を生成するための異なる培養条件に供する。
【0098】
異なる細胞の各々が得られると、こうした細胞を、肝臓オルガノイドを生成するために混合して、懸濁培養する。肝臓オルガノイドの大きさを制御するために、１００～１０００μｍの直径を有するマイクロキャビティを使用する超低接着条件（例えば、懸濁液）で、細胞を培養することができる。一部の実施形態では、ｃｍ２当たりに、約５００μｍの直径と深さを有するマイクロキャビティが、複数存在する。一部の実施形態では、当初の肝臓オルガノイドが形成されると、こうした肝臓オルガノイドを、バイオリアクターで、（成長目的で）懸濁培養することができる。ある実施形態では、０．１～０．７の間葉細胞に対して、１の内胚葉細胞の比で、肝細胞と間葉細胞を、培養前に混合する。さらに別の実施形態では、内皮細胞が存在する場合、０．２～１の内皮細胞に対して、１の内胚葉細胞の比で、内皮細胞と内胚葉細胞とを、培養前に混合する。さらに別の実施形態では、肝細胞、間葉細胞、及び、内皮細胞の培養前の比は、１：０．２：０．７である。一部を優先的に増殖させるのであれば、優先的に分化するものがでてくるので、異なる細胞間の比は、培養の間に変わり得るものと理解される。本明細書に記載した肝臓オルガノイドを得るために、その他の比を使用することができる、ことも理解される。肝臓オルガノイドを作り出すプロセスの間に、物理的足場、または、外来性のマトリックス材料（組織培養容器以外）は必要ない。
【0099】
肝臓オルガノイドは、被包化肝組織を作り出すために直接的に使用することができる。ある実施形態では、肝臓オルガノイドは、それを被包化肝組織に導入するまで、凍結保存することができる。
【0100】
被包化肝組織において使用することができるポリマーは、肝臓オルガノイド（複数可）の周囲にハイドロゲルを形成する。当該技術分野で公知の通り、ハイドロゲルは、水が分散媒体である親水性のポリマー鎖のことを指す。ハイドロゲルは、天然または合成のポリマーネットワークから得ることができる。本開示との関連において、ハイドロゲル内に被包すると、包埋した肝臓オルガノイドがポリマーから漏出することが妨げられるので、肝臓オルガノイドの細胞が、移植時のレシピエントの体内で免疫反応または腫瘍を招くリスクを排除または抑制する。
【0101】
本開示との関連において、ポリマーは、肝臓オルガノイドの細胞に対して毒性を示さない場合、または、対象（例えば、ヒト）に導入したときに毒性を示さない場合に「生体適合性」であると考えられる。本開示との関連において、生体適合性ポリマーは、対象（例えば、ヒト）にインビボで移植したときに、肝臓オルガノイドの細胞に対して毒性を示さないことが好ましい。肝毒性は、例えば、肝細胞様細胞のアポトーシス死の割合（例えば、アポトーシスの増加は、肝毒性を示す）、トランスアミナーゼレベル（例えば、トランスアミナーゼレベルの高まりは、肝毒性を示す）、肝細胞様細胞の肥大（例えば、肥大の増加は、肝毒性を示す）、肝細胞様細胞における微小空胞変性（例えば、変性の増加は、肝毒性を示す）、胆管細胞の死の割合（例えば、胆管細胞の死亡率の高まりは、肝毒性を示す）、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）レベル（例えば、ＧＧＴレベルの高まりは、肝毒性を示す）を決定して、測定することができる。生体適合性ポリマーとして、炭水化物（ヒアルロン酸（ＨＡ）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、アルギン酸、キトサン、ヘパリン、アガロース、デキストラン、セルロースなどのグリコサミノグリカン、及び／または、それらの誘導体）、タンパク質（コラーゲン、エラスチン、フィブリン、アルブミン、ポリ（アミノ酸）、糖タンパク質、抗体、及び／または、それらの誘導体）、及び／または、合成ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、及び／または、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）に基づくもの）があるが、これらに限定されない。生体適合性ポリマーを、単一のポリマー、または、異なるポリマーの混合物（例えば、ＵＳ２０１２／０１４２０６９に記載されたもの）とすることができる。生体適合性ポリマーの例として、ポリ（エチレン）グリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、フィブリン、多糖材料（キトサン、プロテオグリカン、または、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のようなもの）、アルギン酸塩、コラーゲン、チオール化ヘパリン、及び、それらの混合物があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、直鎖状、分岐鎖状とすることができ、そして、任意に、ペプチド（例えば、ＲＧＤ）、成長因子、インテグリン、または、薬物を取り込むことができる。
【0102】
一部の実施形態では、ポリマーは、「低免疫原性ポリマー」であり、レシピエントにおいて免疫応答を誘発せず、または、最小限の免疫応答しか誘発しない。この低免疫原性ポリマーは、細胞の１つ以上の抗原決定基をブロックし、そのような抗原決定基が同種異系対象に導入したときに、その抗原決定基に対する免疫応答を抑制するか、または阻止することさえもできる。
【0103】
本開示の被包化肝組織に存在するポリマーは、好ましくは、架橋可能なものであり、例えば、架橋することができる。ポリマーは、熱的、化学的（例えば、ＶＰＭＳ、ＲＧＤなどの１つ以上のペプチドを使用する）、または、ｐＨまたは光の使用（例えば、ＵＶ光を使用する光重合）で架橋することができる。
【0104】
本開示のポリマーを、生分解性（例えば、生体の代謝によって加水分解されやすい）のものとするか、または、生分解に対して全体的または部分的に抵抗性（例えば、生体の代謝を受けたときの加水分解抵抗性）を示すものとすることができる。生体適合性かつ生分解性のポリマーの例として、ポリ（エチレン－グリコール）－（マレイミド）（ＰＥＧ－Ｍａｌ）８－アームがあるが、これに限定されない。生体適合性かつ生分解抵抗性のポリマーの例として、ポリ（エチレン－グリコール）－ビニルスルホン（ＰＥＧ－ＶＳ）があるが、これに限定されない。
【0105】
肝臓オルガノイドを得ると、少なくとも部分的に（一部の実施形態では、実質的に）肝臓オルガノイドを被覆するために、肝臓オルガノイドを、第１の生体適合性架橋可能ポリマーと接触させる。ポリマーは、様々な濃度で使用することができる。ある実施形態では、肝臓オルガノイドとの接触時のポリマーの濃度は、約１％～１５％（重量／体積）の間である。ある実施形態では、肝臓オルガノイドとの接触時のポリマーの濃度は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、または、１４％である。なおも別の実施形態では、肝臓オルガノイドとの接触時のポリマーの濃度は、約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、または、２％以下である。肝臓オルガノイドが、第１のポリマーと接触すると、第１のポリマーは（熱的に、化学的に、または、ｐＨまたは光のいずれかを使用して）架橋される。第１の生体適合性ポリマーの架橋は、ポリマーの異なる分子間、及び／または、ポリマーの同一分子内にさらなる結合（及び、一部の実施形態では、さらなる共有結合）を生成して達成される。一部の実施形態では、第１の生体適合性ポリマーの架橋が、ポリマー分子と肝臓オルガノイドの表面との間に、さらなる結合（及び、一部の実施形態では、さらなる共有結合）を生成する。一部の実施形態では、第１のポリマーは、少なくとも部分的に生分解性である。
【0106】
一部の実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーで（少なくとも部分的に）被覆または被包している肝臓オルガノイドを、第２の生体適合性架橋可能ポリマーと接触させて、被包化肝組織を、少なくとも部分的に（一部の実施形態では、実質的に）被覆することができる。被包化肝臓オルガノイドが第２のポリマーと接触すると、後者は架橋する（熱的に、化学的に、または、ｐＨまたは光のいずれかを使用して架橋する）。第２の生体適合性ポリマーの架橋は、ポリマーの異なる分子間、及び／または、ポリマーの同一分子内にさらなる結合（及び、一部の実施形態では、さらなる共有結合）を生成して達成される。一部の実施形態では、第２の生体適合性ポリマーの架橋が、ポリマー分子と第１の生体適合性架橋ポリマーとの間に、そして、一部の実施形態では、ポリマー分子と肝臓オルガノイドの表面との間に、さらなる結合（及び、一部の実施形態では、さらなる共有結合）を生成する。一部の実施形態では、第２のポリマーは、生分解に対して少なくとも部分的に抵抗性である。
【0107】
一部の実施形態では、このプロセスは、被包化肝臓オルガノイド（第１の生体適合性架橋ポリマー／第２の生体適合性架橋ポリマーによって少なくとも部分的に被覆したもの）を被覆するために、被包化肝臓オルガノイドを、さらなる生体適合性架橋可能ポリマーと接触させる工程も含む。肝臓オルガノイドがさらなるポリマーと接触すると、後者は架橋する（熱的に、化学的に、または、ｐＨまたは光のいずれかを使用して架橋する）。さらなる生体適合性ポリマーの架橋は、ポリマーの異なる分子間、及び／または、ポリマーの同一分子内にさらなる結合（一部の実施形態では、さらなる共有結合）を生成して達成される。一部の実施形態では、さらなる生体適合性ポリマーの架橋が、ポリマー分子と第２の生体適合性架橋ポリマーとの間に、そして、一部の実施形態では、ポリマー分子と第１の生体適合性架橋ポリマー、及び／または、肝臓オルガノイドの表面との間に、さらなる結合（及び、一部の実施形態では、さらなる共有結合）を生成する。
【0108】
このプロセスは、第１の生体適合性架橋ポリマー内に複数の単分散した肝臓オルガノイドが含まれるようにデザインすることができる。例えば、分化性の単一ｉＰＳＣから肝前駆細胞、内皮前駆細胞、及び、間葉系前駆細胞を得る。これらの細胞を、混合し、そして、懸濁培養して、肝臓オルガノイドを形成する。一部の実施形態では、肝細胞系統の細胞は、（被包化肝臓組織に肝臓オルガノイドを導入する前に）肝細胞様細胞に分化しており、この肝細胞様細胞は、間葉系及び内皮前駆細胞によって形成した細胞コアを実質的に被覆する。さらなる実施形態では、肝臓オルガノイドは、実質的に球状の形態と、約１５０μＭの相対直径を有する。次に、架橋剤（実施例で示すＵＶ光）を使用して、第１の適合性架橋可能マトリックスで、肝臓オルガノイドを被包することができる。この被包化肝組織を、再生医薬に含ませて、移植可能な肝組織（例えば、５ｍｍ～１０ｃｍのサイズを有するもの）として使用することができる。あるいは、肝臓オルガノイドを、マルチウェルプレート向けにデザインし、そして、スクリーニングした化合物の代謝または肝毒性を決定するために、医薬品開発において使用することができる。
【0109】
このプロセスは、第１の生体適合性架橋ポリマーで（少なくとも部分的に）個別に被覆した複数の肝臓オルガノイドを提供するようにデザインすることができ、次いで、この複数の肝臓オルガノイドを、第２の生体適合性架橋ポリマーからなるマトリックスに取り込む。そのような実施形態では、まず、第１の生体適合性架橋ポリマーで（少なくとも部分的に）個別に被覆した複数の肝臓オルガノイドが形成され、次いで、この複数の肝臓オルガノイドを、架橋する第２の生体適合性架橋可能ポリマーと接触させる。
【0110】
このプロセスは、第１の適合性架橋ポリマー、及び、任意の第２の適合性架橋ポリマーで被覆した複数の個別（例えば、単分散）の肝臓オルガノイドを提供するようにデザインすることもできる。そのような実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または、５００の肝臓オルガノイドを含むことができる。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、最大で約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、または、５０の肝臓オルガノイドを含むことができる。なおも別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、または、４５０と、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、または、６０との間の肝臓オルガノイドを含む。なおも別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、約５０～５００の肝臓オルガノイドを含む。別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、少なくとも約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または、２５００の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、最大で約２５００、２４００、２３００、２２００、２１００、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、または、２５０の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、または、２４００と、約２５００、２４００、２３００、２２００、２１００、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、または、３００との間の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、約２５０～２５００の肝臓オルガノイドを含む。
【0111】
ある実施形態では、被包化肝組織は、本明細書に記載した治療方法、及び、スクリーニングにおいて直接的に使用することができ、または、その保管期間を延長するために凍結保存することができる。
【0112】
被包化肝組織の治療的な使用
本明細書に記載した被包化肝組織は、医薬として使用することができる。本明細書に記載した被包化肝組織は、肝臓の生物学的機能の一部を示すので、それを必要とする対象の肝機能を回復または改善するために、インビボまたはエクスビボで使用することができる。肝機能は、例えば、アルブミン、及び、凝固因子（例えば、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩ、第ＸＩＩＩ因子、ならびに、プロテインＣ、プロテインＳ、及び、アンチトロンビン）の合成を決定して、評価することができ、一方で、アルブミン、及び／または、凝固因子の合成の増加は、肝機能の回復または改善を示す。肝機能は、国際標準化比、または、ＩＮＲを測定して、評価することもできる（例えば、ＩＮＲの減少は、肝機能の回復または改善を示す）。肝機能は、アンモニアから尿素への無毒化を測定して、評価することもできる（例えば、アンモニアレベルの減少、及び／または、尿素レベルの増加は、肝機能の回復または改善を示す）。
本明細書に記載した被包化肝組織は、医薬として使用することができる。本明細書に記載した被包化肝組織は、肝臓の生物学的機能の一部を示すので、それを必要とする対象の肝機能を回復または改善するために、インビボまたはエクスビボで使用することができる。肝機能は、例えば、アルブミン、及び、凝固因子（例えば、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩ、第ＸＩＩＩ因子、ならびに、プロテインＣ、プロテインＳ、及び、アンチトロンビン）の合成を決定して、評価することができ、一方で、アルブミン、及び／または、凝固因子の合成の増加は、肝機能の回復または改善を示す。肝機能は、国際標準化比、または、ＩＮＲを測定して、評価することもできる（例えば、ＩＮＲの減少は、肝機能の回復または改善を示す）。肝機能は、アンモニアから尿素への無毒化を測定して、評価することもできる（例えば、アンモニアレベルの減少、及び／または、尿素レベルの増加は、肝機能の回復または改善を示す）。
【0113】
そのような実施形態では、被包化肝組織は、治療を意図している対象の生体液と接触させることを意図している。そのような実施形態では、被包化肝臓は、対象が必要とする合成タンパク質、及び、代謝物（アルブミン、凝固因子、及び／または、尿素）を生体液に放出し、そして、代謝されるべき毒性物質（アンモニア、非抱合ビリルビン、コレステロール、チロシンなど）を生体液から吸収することさえもできる。被包化肝組織は、肝臓代謝の先天異常において欠損／低下した酵素機能を回復させるために使用することができる。
【0114】
肝機能を回復または改善させるために、肝機能が、ほぼ皆無～皆無にまで低下した対象に対して、被包化肝組織をインビボで移植することができる。したがって、被包化肝組織は、例えば、腹水と接触するように、腹膜腔に移植することができる。あるいは、被包化肝組織は、肝臓液と接触するように、レシピエントの肝臓に移植することができる。さらに別の例では、被包化肝組織は、リンパ液または血液と接触するように、皮下または筋肉内に移植することができる。
【0115】
あるいは、肝機能を回復または改善するために、エクスビボの解毒デバイス（例えば、体外式装置）の細胞成分として、被包化肝組織を使用することができる。そのような実施形態では、タンパク質、及び、代謝物（アルブミン、凝固因子、及び／または、尿素）を供給し、そして、潜在的に毒性物質（アンモニア、非抱合ビリルビン、コレステロール、チロシンなど）を吸収または代謝するために、治療対象の血液、及び／または、腹水を、被包化肝組織とエクスビボで接触させる。
【0116】
被包化肝組織は、様々な対象に使用することができ、これら対象として、肝機能が回復または改善することで恩恵を受けると想定される哺乳動物、特に、ヒトがある。被包化肝組織の細胞は、治療を意図している対象に対して自家、同種異系、または、異種とすることができる。しかしながら、被包化肝組織は、意図しているレシピエントの細胞（特に、免疫細胞）との物理的接触を阻止するようにデザインできるので、意図しているレシピエントによる免疫学的な認識、及び、反応を阻止するために、自家細胞または免疫抑制剤を使用する必要はない。このことは、例えば、１つだけの生体適合性架橋ポリマーを含む被包化肝組織を使用して、または、第１の生体適合性架橋ポリマーと第２の生体適合性架橋ポリマーとの両方を含む被包化肝組織を使用して、及び／または、低免疫原性ポリマーを使用して、実施することができる。
【0117】
一部の実施形態では、被包化肝組織は、外科手術、例えば、腹腔鏡下での手順を使用して操作し、そして、対象に導入するようにデザインすることができる。さらに、肝組織は、生体適合性（及び、一部の実施形態では、低免疫原性）ポリマーに被包されているので、肝機能が回復するか、または、被包化肝組織が、もはや肝機能を改善することができなくなった時点で、対象から被包化肝組織を除去することができる。
【0118】
被包化肝組織は、肝不全の治療に使用することができる。肝不全は、修復を上回る損傷を肝臓の大部分が受けると生じるものであって、このような肝臓は、もはや機能することはない。肝不全の初期症状として、嘔気、食欲不振、疲労、及び、下痢がある。症状が進行すると、黄疸、出血、腹部膨満、精神錯乱、及び、混乱（肝性脳症として公知である）、眠気、ならびに、昏睡といった症状も認めることができる。肝不全には、急性、慢性、または、急性増悪する慢性のものがある。慢性肝不全の最も一般的な原因は、非アルコール性脂肪性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、長期のアルコール摂取、肝硬変、ヘモクロマトーシス、及び、栄養障害である。慢性肝不全では、肝細胞移植は、門脈循環を介して実施されることが最も多い。しかしながら、肝硬変に続いて慢性肝不全を発症する症例では、肝類洞の小孔が消失（毛細血管化）してしまうと、門脈循環を介して注入した注入細胞が肝実質に到達して、肝小葉への取り込みが妨げられる。これにより、移植細胞の成熟及び機能が妨げられ、類洞及び門脈の血栓症などの合併症を発症することになる。本明細書に記載した被包化肝組織は、門脈内注射または免疫抑制を必要としないので、何十万人もの肝硬変患者、及び、慢性（または、急性増悪する慢性）肝不全患者、移植に不適な患者でさえも治療し、重篤な合併症（肝性脳症、凝固障害など）を予防または抑制し、生存率を改善することができると考えられる。
【0119】
本明細書に記載した被包化肝組織は、急性肝不全の治療にも使用することができる。急性肝不全の最も一般的な原因は、処方薬、及び、植物由来の生薬に対する反応、または、その過剰摂取、ウイルス感染症（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、及び、Ｃ型肝炎を含む）、ならびに、有毒な野生キノコの摂取、自己免疫性肝炎、または、ウィルソン病である。急性肝不全は、急激に発症するものであり、発症までの時間が４８時間に満たないこともあるので、予防は困難である。さらに、急性肝不全では、完全に成熟した機能性の肝細胞を対象に移植することが必要になるほどに、肝機能が損なわれる。一部の実施形態では、被包化肝組織は、急性肝不全の症状の治療または軽減に使用することができる。被包化肝組織を、それを必要とする対象に対して移植するか、または、それを必要とする対象の血液を処理するための外部（エクスビボ）解毒装置（体外式の肝機能補助、バイオ人工肝臓装置、または、肝臓透析）に使用する。被包化肝組織内の肝臓オルガノイドの数、及び、病態の重症度に応じて、１つ以上の被包化肝組織を使用して、対象を治療することができる。被包化肝組織（複数可）は、同時使用、または、順次使用することができる。肝不全の症状を治療または軽減するために被包化肝組織を使用すると、治療すべき対象に対して、同種異系の細胞を使用することができる。
【0120】
被包化肝組織は、肝臓代謝の一遺伝子性の先天異常（例えば、クリグラー・ナジャー症候群、家族性高コレステロール血症、尿素サイクル異常症、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、シトルリン血症、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、アルギナーゼ欠損症など、高チロシン血症Ｉ型など）の症状を、治療または軽減するためにも使用することができる。この実施形態では、被包化肝組織によって、欠如している代謝機能を付与し、症状を軽減し、合併症を予防または抑制し、及び／または、生涯にわたる治療または食事制限を行う必要性を抑制または排除する。
【0121】
被包化肝組織は、免疫抑制を必要とせずに、急性及び慢性の肝不全を治療するための埋込式製品（例えば、被包化肝組織シート）としてデザインすることができる。そのような実施形態では、埋込式組織シートは、ｃｍ２当たり、約数千個の肝臓オルガノイドを含む。一部の実施形態では、被包化肝組織シートは、所望の埋込部位に対する操作及び固定を容易ならしめる容器（例えば、特注の透過性バッグなど）内に配置することができる。別の実施形態では、操作を容易にするために、埋込式組織シートは、厚さを、少なくとも１ｍｍとし、そして、一部のさらなる実施形態では、幅を、少なくとも５ｍｍ～１０ｃｍとすることができる。被包化肝組織は、必要とするあらゆる形状または大きさにすることができ、実施中に整形または切断することができる。
【0122】
肝代謝、及び、肝毒性のスクリーニング方法、及び、スクリーニングキット
本明細書に記載した被包化肝組織は、少なくとも一部の肝機能を保持するために、肝臓による作用物質（候補薬物など）の代謝を決定して、新薬の発見と開発を合理化するインビトロモデルとして使用することができる。本明細書に記載した被包化肝組織は、作用物質が奏する肝毒性の有無を決定するためにも使用することができる。全身循環に投与すると、（疑わしい）治療薬（認可済、または、開発中のもの）の大多数が、何らかの様式で肝臓の細胞によって代謝される。一部の実施形態では、作用物質（推定治療薬剤など）に肝毒性（例えば、薬物誘導性の肝毒性）が存在するのであれば、本明細書に記載した被包化肝組織を、肝毒性を決定するために使用することができる。薬物（認可済、及び、治験中のもの）は、肝損傷の重要な原因である。肝損傷を招くと報告されている薬物、毒素、及び、薬草は、９００を超えており、すべての劇症肝不全症例の２０～４０％で薬物が主な原因である。特異体質による薬物反応では、その約７５％が、肝移植または死に至る。薬物誘導性の肝損傷は、認可薬物が取り下げられる最も一般的な理由である。作用物質（薬物など）の肝毒性プロファイルを早期に決定することは、新薬の発見と開発を合理化する上で役立つ。
本明細書に記載した被包化肝組織は、少なくとも一部の肝機能を保持するために、肝臓による作用物質（候補薬物など）の代謝を決定して、新薬の発見と開発を合理化するインビトロモデルとして使用することができる。本明細書に記載した被包化肝組織は、作用物質が奏する肝毒性の有無を決定するためにも使用することができる。全身循環に投与すると、（疑わしい）治療薬（認可済、または、開発中のもの）の大多数が、何らかの様式で肝臓の細胞によって代謝される。一部の実施形態では、作用物質（推定治療薬剤など）に肝毒性（例えば、薬物誘導性の肝毒性）が存在するのであれば、本明細書に記載した被包化肝組織を、肝毒性を決定するために使用することができる。薬物（認可済、及び、治験中のもの）は、肝損傷の重要な原因である。肝損傷を招くと報告されている薬物、毒素、及び、薬草は、９００を超えており、すべての劇症肝不全症例の２０～４０％で薬物が主な原因である。特異体質による薬物反応では、その約７５％が、肝移植または死に至る。薬物誘導性の肝損傷は、認可薬物が取り下げられる最も一般的な理由である。作用物質（薬物など）の肝毒性プロファイルを早期に決定することは、新薬の発見と開発を合理化する上で役立つ。
【0123】
本明細書に記載した被包化肝組織は、少なくとも一部の肝機能を実際に示すため、作用物質（化学薬剤、生物学的薬剤、天然薬物の製剤または混合物など）の肝代謝、及び／または、肝毒性を決定するために、インビトロで使用することができる。この方法は、単一の薬剤、または、薬剤の組み合わせの肝代謝を決定するために使用することができる。
【0124】
そうしたことを実施するために、被包化肝組織の少なくとも１つの肝臓オルガノイドの少なくとも１つ（及び、一部の実施形態では、２つまたは３つ）の細胞型に対して作用物質を作用せしめるに十分な条件下で、試験混合物が得られるように試験対象の作用物質、または、作用物質の組み合わせを、被包化肝組織との接触に供する。試験混合物は、作用物質と、被包化肝組織とを含む。次に、被包化肝組織の少なくとも１つの肝臓オルガノイドの少なくとも１つ（及び、一部の実施形態では、少なくとも２つまたは３つ）の細胞型、または、試験混合物において、作用物質の少なくとも１つの作用物質関連肝代謝物を決定する。本開示と関連して使用する表現「作用物質関連代謝物」とは、試験する作用物質の加水分解によって形成することができる代謝物のことを指す。
【0125】
あるいは、または、組み合わせて、被包化組織の少なくとも１つの肝臓オルガノイドの少なくとも１つ（及び、一部の実施形態では、少なくとも２つまたは３つ）の細胞型、または、試験混合物において、少なくとも１つの肝臓パラメーターを決定する。決定することができる肝臓パラメーターとして、アルブミン生産、尿素生産、ＡＴＰ生産、グルタチオン生産、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）代謝活性、肝臓特異的遺伝子またはタンパク質（例えば、ＣＹＰ酵素（ＣｙＰ２Ｃ９、ＣｙＰ３Ａ４、ＣｙＰ１Ａ１、ＣｙＰ１Ａ２、ＣｙＰ２Ｂ６、及び／または、ＣｙＰ２Ｄ６）の発現、肝臓毒に対する応答、細胞死（例えば、試験混合物における乳酸脱水素酵素またはトランスアミナーゼの測定によるもの）、細胞のアポトーシス、細胞の壊死、細胞の代謝活性（例えば、生／死アッセイ、カスパーゼ３／７アッセイ、ＭＴＴアッセイ、または、ＷＳＴ－１に基づいた試験）、ミトコンドリア機能、及び／または、胆汁酸生産があるが、これらに限定されない。少なくとも１つ（または、複数）の肝臓パラメーターが得られると、対応するコントロールの肝臓パラメーターと、その肝臓パラメーターとを比較する。ある実施形態では、コントロールの肝臓パラメーターを、スクリーニングした作用物質（または、スクリーニングした作用物質の組み合わせの）の非存在下で得る、または、スクリーニングした作用物質（または、スクリーニングした作用物質の組み合わせ）を溶解する媒体の存在下で得ることができる。決定ステップは、被包化肝組織の細胞の全部または一部に対して実施することができる。ある実施形態では、決定ステップを、被包化肝組織の肝細胞様細胞、及び／または、胆管上皮細胞に対して実施する。
【0126】
この方法は、被包化肝組織の肝臓オルガノイドが作用物質を代謝するか否か、及び／または、被包化肝組織の肝臓オルガノイドの細胞に対して作用物質が肝毒性を示すか否か、を決定するための比較も含む。そうしたことを実施するために、測定する作用物質関連肝代謝物と、コントロールの作用物質関連肝代謝物との間で比較をする。例えば、コントロールの作用物質関連代謝物を、インタクトな（例えば、加水分解を受けていない）形態である、その作用物質それ自体とすることができる。コントロールの作用物質関連代謝物とは異なる作用物質関連代謝物の存在が決定されると、次に、肝細胞での作用物質の代謝について決定する。測定する肝臓パラメーターと、コントロールの肝臓パラメーターとの間で比較をすることもできる。例えば、コントロールの肝臓パラメーターは、作用物質の非存在下で取得することができる。コントロールの肝臓パラメーターと肝臓パラメーターとが相違することが決定されると、次に、作用物質が肝毒性を示すか否かについて決定する。
【0127】
ある実施形態では、この方法は、スクリーニングした作用物質（または、スクリーニングした作用物質の組み合わせ）が、肝毒性を示すか否かを決定するために使用する。そのような実施形態では、スクリーニングした作用物質（または、スクリーニングした作用物質の組み合わせ）を接触させることで、被包化肝組織の肝臓オルガノイドの少なくとも１つの細胞（例えば、肝細胞、または、胆管上皮細胞）において毒性を誘導するか否かを決定する。毒性は、例えば、細胞死（例えば、試験混合物での乳酸脱水素酵素またはトランスアミナーゼの測定による）、細胞の代謝実行能（例えば、生／死アッセイ、カスパーゼ３／７アッセイ、ＭＴＴアッセイ、または、ＷＳＴ－１に基づいた試験）、ミトコンドリア機能（例えば、ミトコンドリア機能の低下は、肝毒性を示す）、チトクロムＰ４５０系の１つ以上の酵素（例えば、ＣＹＰ２Ｅ１など）の活性の調節（例えば、チトクロムＰ４５０系の酵素（複数可）の活性増加は、肝毒性を示す）、及び／または、胆汁酸生産の調節（例えば、胆汁酸生産の増加は、肝毒性を示す）を決定して測定することができる。この方法は、スクリーニングした作用物質の毒性結果を、コントロール作用物質（肝毒性を誘導しないことが公知のもの、または、肝毒性を誘導することが公知のもの）の毒性結果と比較することを含む、ことができる。
【0128】
この方法は、異なる代謝活性を有する肝臓オルガノイドを用いて得た被包化肝組織に対してスクリーニングした作用物質（または、複数のスクリーニングした作用物質）を接触させる、ことも含むことができる。例えば、異なるレベルで特定の代謝機能を実施するために、異なる起源、及び、供給源に由来する細胞を使用して肝臓オルガノイドを作り出すことができる（これにより、一般的な集団の個体間で認められる多様性が得られる）。例えば、代謝活性が相違している得られた被包化肝組織は、それらのそれぞれ、及び、すべてに対して比較しながらスクリーニングした作用物質を試験することができるようになるように、単一のプレートの異なるウェルで生成することができる。ある実施形態では、肝臓オルガノイドは、異なる性別、人種、及び／または、遺伝子型に由来することができる。こうした異なる性別、人種、及び／または、遺伝子型に対してスクリーニングした作用物質を試験することで、代謝差異の決定、あるいは、性別、人種、及び／または、遺伝子型の全部または一部のみに肝毒性が存在するか否かの決定が可能となる。ある実施形態では、複数の肝臓オルガノイドの間で、肝臓オルガノイドの間葉系成分、及び／または、内皮成分は同様とすることができるが、肝細胞様細胞、及び、胆管上皮細胞は、異なる性別、人種、及び／または、遺伝子型に由来する。一例として、それぞれの異なる被包化肝組織を、異なるウェルに配置（必要に応じて複数の反復検体として配置）することができ、同一のスクリーニングした作用物質を、それぞれの異なる被包化肝組織と接触させることができる。
【0129】
一部の実施形態では、このスクリーニング方法で使用する被包化肝組織は、第２の生体適合性架橋ポリマー、または、さらなる生体適合性架橋ポリマーを含んでおらず、代わりに、本明細書に記載した肝臓オルガノイド、及び、第１の生体適合性架橋ポリマーから本質的になる。
【0130】
このスクリーニング方法では、個別に被包している肝臓オルガノイド、または、複数の肝臓オルガノイドを含むマトリックスで被包している肝臓オルガノイドを使用することができる。後者の場合、被包化肝組織は、ウェルの底に位置しており、それにより、スクリーニングした作用物質の添加、及び、決定ステップの前での被包化肝組織の洗浄が非常に簡便となる。
【0131】
本開示は、肝代謝または肝毒性を決定するためのキットも提供する。このキットは、本明細書に記載した被包化肝組織と、本明細書に記載した方法を実施するための説明書とを含む。一部の実施形態では、このキットは、組織培養支持体をさらに含み、同支持体は、少なくとも１つのウェルを任意に含むことができる。さらなる実施形態では、被包化肝組織を、少なくとも１つのウェルの底に配置し、必要に応じて、ウェルの表面に（共有結合、または、非共有結合で）付着させることができる。このキットは、肝代謝または肝毒性の測定（例えば、生／死アッセイ、カスパーゼ３／７アッセイ、ＭＴＴアッセイ、ＷＳＴ－１アッセイ、及び／または、ＬＤＨの測定）を実施するための試薬も含むことができる。
【0132】
以下の実施例を参照することで、本発明は容易に理解できることになるが、同実施例は、本発明を例示するために記載したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0133】
肝細胞様細胞の生産、及び、特徴決定
肝細胞様細胞（ＨＬＣ）を、２つの異なるプロトコル：本明細書に記載したプロトコル（プロトコルＢと称する）、ＰＣＴ／ＣＡ２０１７／０５１４０４に記載された標準プロトコル（プロトコルＡと称する）で得た。そして、ＨＬＣを比較した。
肝細胞様細胞（ＨＬＣ）を、２つの異なるプロトコル：本明細書に記載したプロトコル（プロトコルＢと称する）、ＰＣＴ／ＣＡ２０１７／０５１４０４に記載された標準プロトコル（プロトコルＡと称する）で得た。そして、ＨＬＣを比較した。
【0134】
分化プロトコル（プロトコルＢ）
ｉＰＳＣ調製（－３～０日目）。分化を開始する３日前に、ＴｒｙｐＬＥを使用して、単一細胞継代を実施した。ｉＰＳＣを、ラミニンでコーティングしたプレートに置き、そして、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地で培養した。この培地に、最初の２４時間だけ、Ｒｅｖｉｔａ Ｃｅｌｌ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した。培地は、毎日交換した。
ｉＰＳＣ調製（－３～０日目）。分化を開始する３日前に、ＴｒｙｐＬＥを使用して、単一細胞継代を実施した。ｉＰＳＣを、ラミニンでコーティングしたプレートに置き、そして、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地で培養した。この培地に、最初の２４時間だけ、Ｒｅｖｉｔａ Ｃｅｌｌ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した。培地は、毎日交換した。
【0135】
内胚葉の詳細（１～２日目）。培地ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地で洗浄した。次に、細胞を、インスリンを含まず、１％ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）を含み、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、及び、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を補充した、ＲＰＭＩ／Ｂ２７で、細胞を培養した。３７℃で、雰囲気Ｏ２／５％ＣＯ２にて、２日間、細胞を培養した。培地は、毎日交換した。
【0136】
内胚葉の関与（胚体内胚葉、３～５日目）。インスリンを含まず、１％ノックアウト血清代替物を含み、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａを補充した、ＲＰＭＩ／Ｂ２７で、細胞を培養した。３７℃で、雰囲気Ｏ２／５％ＣＯ２にて、３日間、細胞を培養した。培地は、毎日交換した。
【0137】
後方前腸（６～１０日目）。インスリンを含まず、１％ノックアウト血清代替物を含み、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、４μＭ ＩＷＰ２、及び、１μＭ Ａ８３－０１を補充した、ＲＰＭＩ／Ｂ２７で、細胞を培養した。３７℃で、雰囲気Ｏ２／５％ＣＯ２にて、５日間、細胞を培養した。培地は、毎日交換した。
【0138】
肝臓の詳細（二能性前駆細胞、１１～１５日目）。インスリン、２％ノックアウト血清代替物を含み、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ、及び、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を補充した、ＲＰＭＩ／Ｂ２７で、細胞を培養した。３７℃で、雰囲気Ｏ２／５％ＣＯ２にて、５日間、細胞を培養した。培地は、毎日交換した。
【0139】
肝成熟１（未成熟肝細胞様細胞、１６～２０日目：）。１％ノックアウト血清代替物を含み、２０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＯＳＭ、１０μＭ デキサメタゾン、及び、１μＭ Ａ８３－０１を補充した、ＨＢＭ／ＨＣＭ培地（ＥＧＦ、Ｌｏｎｚａを含まず）で、細胞を培養した。細胞を、３７℃で、雰囲気Ｏ２／５％ＣＯ２にて、５日間培養した。培地は、毎日交換した。ＨＢＭ／ＨＣＭ培地の代わりに、インスリン、２％ノックアウト血清代替物を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７を使用して、同等の結果が得られた（データ示さず）。
【0140】
肝成熟２（未成熟肝細胞様細胞、２１～２５日目）。１％ノックアウト血清代替物を含み、２０ｎｇ／ｍｌ ＯＳＭ、１０μＭ デキサメタゾンを補充した、ＨＢＭ／ＨＣＭ培地（ＥＧＦ、Ｌｏｎｚａを含まず）で、細胞を培養した。３７℃で、雰囲気Ｏ２／５％ＣＯ２にて、５日間、細胞を培養した。培地は、毎日交換した。ＨＢＭ／ＨＣＭ培地の代わりに、１％ノックアウト血清代替物、及び、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ培地を使用して、同等の結果が得られた（データ示さず）。
【0141】
肝成熟３（成熟肝細胞様細胞、２５～３０日目）。１％ノックアウト血清代替物を含み、１０μＭ デキサメタゾンを補充した、ＨＢＭ／ＨＣＭ培地（ＥＧＦ、Ｌｏｎｚａを含まず）で、細胞を培養した。３７℃で、雰囲気Ｏ２／５％ＣＯ２にて、５日間、細胞を培養した。培地は、１日おきに交換した。ＨＢＭ／ＨＣＭ培地の代わりに、１％ノックアウト血清代替物、及び、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ培地を使用して、同等の結果が得られた（データ示さず）。
【0142】
表１．本実施例で比較した肝細胞様細胞を取得するための２つのプロトコルの詳細。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0143】
細胞顕微鏡検査。位相差顕微鏡（ＥＶＯＳ ＦＬ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、分化プロセスの最後の生細胞を観察して形態を研究した。
【0144】
細胞計数。ＴｒｙｐＬＥを使用して培養プレートから細胞を回収し、そして、自動細胞計数器Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを使用して計数した。
【0145】
免疫蛍光。細胞を、４％パラホルムアルデヒドに固定し、そして、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で、室温で、５分間、透過処理をした。非特異的部位は、細胞を、（抗体に対応する）３％ブロッキング血清溶液と共に、室温で、３０分間、インキュベートしてブロックした。次いで、固定及び透過処理した細胞を、一次抗体溶液（抗体は、ＰＢＳ－ＢＳＡで２％に希釈する）と共に、室温で、１時間、インキュベートした。細胞を、二次標識抗体溶液（蛍光）と共に、室温で、３０分間、光から保護をしながらインキュベートした。二次標識抗体とのインキュベーションの最後の１５分間に、色素（Ｐｕｒｅｂｌｕｅ ｎｕｃｌｅｉ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＢｉｏＲａｄ）を添加して、核を染色した。次に、細胞を、退色防止試薬（ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ）で固定した。この手順の翌日に、蛍光を分析した。以下の抗体を使用した：ＡＢＣＡＭの抗ヒトＳＯＸ１７希釈１：１００、ＡＢＣＡＭの抗ヒトＦＯＸＡ２希釈１：１００；ＡＢＣＡＭの抗ヒトＣＸＣＲ４希釈１：１００；ＤＡＫＯの抗ヒトＡＦＰ希釈１：１００；ＤＡＫＯの抗ヒトアルブミン（ＡＬＢ）希釈１：１００；ＡＢＣＡＭの抗ヒトＣＫ１９希釈１：１００、及び、ＡＢＣＡＭの抗ヒトＣＫ７希釈１：２００。
【0146】
ＦＡＣＳ分析。それぞれのアッセイチューブに０．５～１×１０６個の細胞を分注した。１００μＬの蛍光色素結合一次抗体溶液（膜抗原）で、細胞を、室温で、光から保護をしながら２０分間染色した。その後、４％のパラホルムアルデヒドで、細胞を、室温で、１０分間固定した。１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で、細胞の透過処理を行った。１００μＬの蛍光色素結合抗体溶液（細胞内抗原）で、細胞を染色し、そして、暗所で、室温で、２０分間インキュベートした。０．５ｍＬのＰＢＳ－ＢＳＡ１％に細胞を再懸濁させ、４℃で保持し、そして、解析を行った。次の抗体を、ＦＡＣＳに使用した：Ｐｅｒ－ＣＰ－Ｃｙ ５．５抗ヒトＳＯＸ１７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ抗ヒトＦＯＸＡ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ抗ヒトＥｐＣＡＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ抗ヒトアルブミン（Ｒ＆Ｄシステム）、ＦＩＴＣ抗ヒトＴＲＡ１－６０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ａｌｅｘａ６４７抗ヒトＮａｎｏｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ抗ヒトＢｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ）、及び、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗ヒトｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【0147】
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ。一本鎖ｃＤＮＡを合成するための鋳型として、培養した細胞、または、オルガノイドから全ＲＮＡを抽出した（Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）。逆転写を実施して、ｃＤＮＡを得た。ＰＣＲ反応混合物を調製した後に、プレートにロードした。プレートを密封し、遠心分離した後に、機器にロードした。標準的なＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ反応条件を使用した。遺伝子発現の相対定量を計算するために、比較ＣＴ（ΔΔＣＴ）法を使用してデータを解析した。以下のＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手）を使用した：Ｈｓ１０５３０４９＿Ｓ１ ＳＯＸ２ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００７５１７５２＿Ｓ１ ＳＯＸ１７ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００１７１４０３＿Ｍ１ ＧＡＴＡ４ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００２２３０８５３＿Ｍ１ ＨＮＦ４Ａ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００１７３４９０＿Ｍ１ ＡＦＰ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００６０９４１１＿Ｍ１ アルブミン Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ９９９９９９０５＿Ｍ１ ＧＡＰＤＨ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ０４１８７５５５＿ｍ１ ＦＯＸＡ１ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００２４２１６０ ｍｌ ＨＨＥＸ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００２３６８３０ ｍｌ ＰＤＸ１ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００２３２７６４ ｍｌ ＦＯＸＡ２ Ｔａｑ発現アッセイ、Ｈｓ０１００５０１９＿ｍ１ ＡＳＧＲ１ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００１７３４９０ ＡＦＰ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００６０７９７８ ｓ１ ＣＸＣＲ４ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００７６１７６７＿ｓ１ ＫＲＴ１９ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００５５９８４０＿ｍ１ ＫＲＴ７ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、及び、Ｈｓ００９４４６２６＿ｍ１ ＴＡＴ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ。
【0148】
Ｃｙｐ ３Ａ４活性。Ｐｒｏｍｅｇａの「Ｐ４５０－Ｇｌｏ（商標）Ａｓｓａｙ」を、製造業者者の指示に従って使用して、Ｃｙｐ３Ａ４活性を評価した。
【0149】
尿素合成。Ｇｅｎｔａｕｒの「Ｑｕａｎｔｉｃｈｒｏｍ ｕｒｅａ ａｓｓａｙ ｋｉｔ」を、製造業者の指示に従って使用して、尿素合成を測定した。
【0150】
アルブミン生産。Ａｂｃａｍの「Ａｌｂｕｍｉｎ ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ」を、製造業者の指示に従って使用して、アルブミン生産を評価した。
【0151】
ミトコンドリア呼吸分析。Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＸＦ９６分析器（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を使用して、９６ウェルプレートで、３７℃で、製造業者の指示に若干の修正を加えた指示に従って、ミトコンドリアストレス試験を行った。簡単に説明すると、細胞を、１×１０５個の細胞／ウェルで播種し、そして、アッセイの２４時間前に、異なる用量のアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ－２、４、８ｍＭ）、及び、アミオダロン（ＡＭＩＯ－２、４、８、１９μＭ）で前処理した。試験日に、増殖培地を取り除いて、２回洗浄し、そして、ＸＦアッセイ培地（非緩衝ＤＭＥＭ、ｄ５０３０ Ｓｉｇｍａ、２５ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）と交換し、そして、プレートを、３７℃で、１時間、ＣＯ２フリーインキュベーターでインキュベートした。水和カートリッジセンサーに、適切な量のミトコンドリアモジュレーターをロードして、各ウェルの最終濃度を達成した：オリゴマイシン（２μＭ）、カルボニルシアニドｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）（２μＭ）、及び、ロテノン／アンチマイシンＡ（両方とも１μＭ）。次に、製造業者のプロトコルの記載にされているようにして、ＯＣＲ値から、基礎呼吸、ＡＴＰ生産、プロトン漏出、最大呼吸、及び、非ミトコンドリア呼吸のレベルを分析した。
表２．使用する略語。
表２．使用する略語。
【0152】
【表2】
【0153】
ｈｉＰＳＣの内胚葉誘導処理を５日間にわたって行ったところ、特定の内胚葉マーカーＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＣＸＣＲ４、及び、ＥＯＭＥＳを発現する細胞の均質な単層を得た（図１）。集団の均一性は、フローサイトメトリー分析で確認しており、８０％超の細胞が、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、及び、ＣＸＣＲ４に対してトリプル陽性であり、そして、細胞は、ｃ－Ｋｉｔを発現しない、ことが認められた（図２）。免疫染色によって、ほとんどの細胞が、胚体内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、及び、ＣＸＣＲ４に対して陽性である、ことが明らかになった（図３－下方のパネル）。ｉＰＳ細胞の代わりに、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ、データ示さず）を分化させても同様の結果が得られた。
【0154】
内胚葉を誘導した後に、細胞を５日間処理して、後方前腸への分化を誘導した。その段階で、通常は心臓の中胚葉から出現するＦＧＦ－２やＢＭＰ４などのシグナルが認められた。加えて、Ｗｎｔ／β－カテニン、及び、ＴＧＦβシグナル伝達経路が（それぞれ、ＩＷＰ２、及び、Ａ８３－０１を使用して）阻害されて、Ｈｅｘ及びＰｒｏｘｌの発現が可能になった。図４に示すように、細胞は、前腸特異的マーカーＦＯＸＡ２、ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ４Ａ、ＡＦＰ、及び、アルブミンの発現を強めた。
【0155】
続いて、ＦＧＦ－２、及び、ＢＭＰ４シグナルを維持し、ＨＧＦを添加し、そして、肝臓の成長を促すＷｎｔ経路を（ＣＨＩＲ９９０２１を使用して）活性化することによって、５日間、肝臓の特異性を誘導した（多角形形態の肝芽細胞）。これらの細胞は、肝特異的マーカーであるＡＦＰ、アルブミン、ＣＫ１９、ＣＫ７、及び、ＥｐＣＡＭの発現を示した（図５）。また、ｉＰＳＣ由来の肝前駆細胞集団が、未分化細胞を含んでいないことも確認した（図６）。ＲＴ－ｑＰＣＲは、アルブミン、ＡＦＰ、ＡＦＰ、ＣＫ１９、ＣＫ７、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ４α、及び、ＨＨＥＸなどの特徴的な肝芽細胞／肝細胞マーカーの発現を示した（図７）。図８に示したように、肝前駆細胞は、内胚葉細胞、または、未分化ｉＰＳＣと比較して、細胞収量の有意な増加を示した。
【0156】
肝臓への関与をさらに明確にするために、ＴＧＦβシグナル伝達を阻害し（胆管細胞を回避するため、Ａ８３－０１を使用して）、そして、Ｗｎｔ経路を活性化した（ＣＨＩＲ９９０２１を使用して）。ＦＧＦ－２、ＢＭＰ４、ＨＧＦ、ＯＳＭ、及び、デキサメタゾンを含んでいた。分化の最終段階では、（出生後、肝臓で造血が起こらなくなったので）ＯＳＭを除去し、そして、デキサメタゾンを維持した。
【0157】
分化の過程で、細胞集団は、核に対する細胞質の比率が大きく、多数の液胞及び小胞、ならびに、顕著な核小体を有する肝細胞様細胞の典型的な形態を徐々に獲得した。幾つかの細胞が、二核であることがわかった（図９Ａ）。また、これらの細胞は、ＡＦＰ、アルブミン、及び、ＣＫ１９の発現を示した（図９Ｂ）。免疫蛍光法は、肝芽細胞期と比較して、アルブミンの発現を示し、発現を増加させ、そして、ＡＦＰ及びＣＫ１９の発現を減少させた（図９Ｂ、及び、データ示さず）。フローサイトメトリー分析で評価したところ、大半の細胞（９８．５％）が、アルブミン陽性であった（図１０）。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、アルブミン、ＡＦＰ、ＨＮＦ４ａ、ＡＳＧＲ１、及び、ＳＯＸ９などの特定の肝遺伝子の発現が、ＨＬＣとＦＰＨＨとの間で類似していることを示した（図１１）。
【0158】
図１２は、プロトコルＢで得たＨＬＣを、初代ヒト肝細胞ＨｅｐＧ２、未分化ｉＰＳＣ、ＤＥ細胞、または、ＰＦＧ細胞と比較している。これらの結果は、ＨＬＣ－ＢとＦＰＨＨが、同様のＣｙＰ３Ａ４活性（図１２Ａ）、及び、尿素生産（図１２Ｃ）を示すことを明らかにしている。ＨＬＣ－Ｂ細胞は、成人の肝細胞と比較して、同等以下のレベルのアルブミンを生産する（図１２Ｂ）。
【0159】
プロトコルＢで得たＨＬＣは、肝臓マーカーの高発現（図１３）、有意に大きなＣｙＰ３ａ４活性（図１４Ａ）、アルブミン生産（図１４Ｂ）、及び、細胞収量（図１４Ｃ）を示したプロトコルＡで得たＨＬＣと比較して、有意の重要性を有する分化を達成する、ことを示した。
【0160】
肝細胞様細胞の（プロトコルＢを使用して取得した）代謝機能、ミトコンドリア呼吸能力、及び、ＡＴＰに関連する呼吸を、基本条件で、かつ、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）、及び、アミオダロン（ＡＭＩＯ）、肝臓で特異的に代謝する薬剤の用量を増やした後に評価をした（図１５）。実施例１５に示した結果は、薬物と接触させると、プロトコルＢで得たＨＬＣが、それらの呼吸を調節し、したがって、代謝的に活性であることを示している。
【0161】
本発明を、その特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求の範囲は、実施例に記載した好ましい実施形態によって限定されるものではなく、本明細書全体と整合する最も広範な解釈が与えられるべきである、ことを理解されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
