特許7401116新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼ及びＤ－アミノ酸又はその誘導体の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-11
(45)【発行日】2023-12-19
(54)【発明の名称】新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼ及びＤ－アミノ酸又はその誘導体の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20231212BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231212BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231212BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231212BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231212BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231212BHJP
C12N 9/06 20060101ALI20231212BHJP
C12P 13/10 20060101ALI20231212BHJP
C12P 13/14 20060101ALI20231212BHJP
C12P 13/06 20060101ALI20231212BHJP
C12P 13/22 20060101ALI20231212BHJP
C12P 13/12 20060101ALI20231212BHJP
C12P 41/00 20060101ALI20231212BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N9/06 Z
C12P13/10 B
C12P13/14 B
C12P13/06 C
C12P13/06 B
C12P13/22 A
C12P13/22 C
C12P13/22 B
C12P13/12 A
C12P41/00 A
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021509501
(86)(22)【出願日】2020-03-25
(86)【国際出願番号】 JP2020013326
(87)【国際公開番号】W WO2020196619
(87)【国際公開日】2020-10-01
【審査請求日】2023-01-30
(31)【優先権主張番号】P 2019062177
(32)【優先日】2019-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （１）集会名 イノベーション・ジャパン２０１９ 開催日 ２０１９年８月２９日・３０日 （２）集会名 Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＸＸＶ 開催日 ２０１９年９月１５～１９日（公開日：２０１９年９月１６日） （３）集会名 第７１回日本生物工学会大会 開催日 ２０１９年９月１６～１８日（公開日：２０１９年９月１６日） （４）集会名 第８回食品薬学シンポジウム 開催日 ２０１９年１０月１８～１９日（公開日：２０１９年１０月１８日） （５）集会名 ＪＳＴ新技術説明会 開催日 ２０１９年１０月２９日 （６）掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｂｊ．ｏｒ．ｊｐ／２０１９／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ 掲載日 ２０１９年８月９日 （７）掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｎｇｃｏｎｆ．ｏｒｇ／ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｅｎｚｙｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－ｘｘｖ／ 掲載日 ２０１９年９月 （８）掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕ－ｓｈｉｚｕｏｋａ－ｋｅｎ．ａｃ．ｊｐ／ｎｅｗｓ／２０１９１０２３－３／ 掲載日 ２０１９年１０月２３日 （９）掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｓｈｉｎｇｉ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｌｉｓｔ／３ｃｈｕｂｕ／２０１９＿３ｃｈｕｂｕ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｓｈｉｎｇｉ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｖａｒ／ｒｅｖ０／０００１／０２４２／２０１９＿３ｃｈｕｂｕ＿２．ｐｄｆ 掲載日 ２０１９年１０月２９日 （１０）発行者名 日本薬学会生薬天然物部会 刊行物名 第８回食品薬学シンポジウム講演要旨集、第７１～７３頁 発行日 ２０１９年９月３０日 （１１）発行者名 アメリカ化学会（ＡＣＳ） 刊行物名 ＡＣＳ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ、第９巻、第１１号、第１０１５２～１０１５８頁、Ｓ１～Ｓ２３頁 発行日 ２０１９年９月２７日
(73)【特許権者】
【識別番号】507219686
【氏名又は名称】静岡県公立大学法人
(74)【代理人】
【識別番号】100205914
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 総明
(74)【代理人】
【識別番号】100162189
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 真弓
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 創平
(72)【発明者】
【氏名】中野 祥吾
(72)【発明者】
【氏名】南野 優季
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】特開２００２－２６２８９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Uniprot，2019年01月16日，ID U1JIG9_9GAMM, Version 20，[retrieved on 2020.06.05], Retrieved from the Internet: <URL: https://www.uniprot.org/uniprot/U1JIG9.txt?version=20>
【文献】Uniprot，2018年12月05日，ID A0A0C1MMN3_9GAMM , Version 17，[retrieved on 2020.06.05], Retrieved from the Internet: <URL: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A0C1MMN3.txt?version=17>
【文献】Uniprot，2018年12月05日，ID A0A2A5JV24_PSEO7, Version 5，[retrieved on 2020.06.05], Retrieved from the Internet: <URL: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A2A5JV24.txt?version=5>
【文献】丹羽正純、ほか，祖先型設計法を用いたL‐アルギニン酸化酵素の基質特異性の改変と熱安定化，日本農芸化学会大会講演要旨集，2018年，講演番号：3A25a10
【文献】NAKANO, Shogo, et al.，Deracemization and Stereoinversion to Aromatic D-Amino Acid Derivatives with Ancestral L-Amino Acid，ACS Catalysis，2019年09月27日，Vol. 9, No. 11，pp. 10152-10158
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／５３
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ９／０６
Ｃ１２Ｐ １３／１０
Ｃ１２Ｐ １３／１４
Ｃ１２Ｐ １３／０６
Ｃ１２Ｐ １３／２２
Ｃ１２Ｐ １３／１２
Ｃ１２Ｐ ４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の（１）～（４）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。（１）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号１で表わされるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、又は
（４）配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【請求項2】
下記の（５）～（８）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。（５）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（６）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（７）配列番号１で表わされるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（８）配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項3】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子又は請求項２に記載の遺伝子を含む組換えベクター。【請求項4】
請求項３に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。【請求項5】
Ｌ－アミノ酸又はその誘導体に対し、請求項１に記載のタンパク質をＬ－アミノ酸オキシダーゼとして作用させて、イミノ酸を生じさせる工程と、前記イミノ酸に対し、還元剤を作用させる工程と、を有することを特徴とするＤ－アミノ酸又はその誘導体の製造方法。
【請求項6】
Ｌ－アミノ酸又はその誘導体に対し、請求項１に記載のタンパク質をＬ－アミノ酸オキシダーゼとして作用させて、イミノ酸を生じさせる工程と、前記イミノ酸を加水分解させる工程と、を有することを特徴とするケト酸の製造方法。
【請求項7】
ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体に対し、請求項１に記載のタンパク質をＬ－アミノ酸オキシダーゼとして作用させる工程を有することを特徴とする光学分割方法。【請求項8】
前記ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体が、ＤＬ－フェニルアラニン、ＤＬ－トリプトファン、ＤＬ－メチオニン、ＤＬ－ロイシン、ＤＬ－グルタミン、ＤＬ－グルタミン酸、ＤＬ－チロシン、ＤＬ－イソロイシン、ＤＬ－アルギニン及びそれらの誘導体からなる群から選択される化合物であることを特徴とする請求項７に記載の光学分割方法。【請求項9】
前記Ｌ－アミノ酸オキシダーゼが前記ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体に作用することにより生じたイミノ酸に対し、アンモニアボラン、水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム及びシアノトリヒドロホウ酸ナトリウムからなる群から選択される還元剤を作用させる工程を有することを特徴とする請求項７又は８に記載の光学分割方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼに関するものであり、特にＤＬ－アミノ酸を高効率に動的光学分割してＤ－アミノ酸を得ることができるＬ－アミノ酸オキシダーゼに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、新たな医薬品として、アミノ酸およびその誘導体が複数個繋がって構成されるペプチド医薬品が注目されている。ペプチド医薬品は、ＤＬ－アミノ酸及びこれらの誘導体の組み合わせ、そして立体構造の違いから多様な機能を発揮できることが報告されている。ペプチド医薬品を合成するためには、その前駆体となるアミノ酸、アミノ酸誘導体又は合成中間体について、Ｄ体またはＬ体のいずれか一方だけを取得する必要がある。これは化学合成で作られるアミノ酸及びその誘導体の多くはラセミ体であることに起因している。そこで、ラセミ体のアミノ酸、アミノ酸誘導体又は合成中間体から、Ｄ体のみ又はＬ体のみのアミノ酸を高い収率で合成できる方法として動的光学分割法が報告されている。この動的光学分割法は、酵素を利用した分割方法であり、常圧条件下で実施できることから環境に優しいクリーンな合成方法として今日、注目されている。
【0003】
動的光学分割法によるＬ－アミノ酸の合成に関しては、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）が一般的に用いられている。ＤＡＡＯを用いたＬ－アミノ酸及びその誘導体の光学分割については、一例として特許文献１及び非特許文献１、２に示すように、多くの文献で報告があり、広く工業利用されている。
【0004】
他方、動的光学分割法によるＤ－アミノ酸の合成に関しては、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＬＡＡＯ）は、ほとんど利用されていない。ラセミ体のアミノ酸、アミノ酸誘導体又は合成中間体から酵素法によってＤ体のみを光学分割するにあたっては、Ｌ－アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）が広く工業利用されているほか、ラセマーゼとアシラーゼとを組み合わせた方法、または、ラセマーゼとアミダーゼとを組み合わせた方法が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２００７－５２２８１０号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Turner N. J., Curr. Opin. Chem. Biol., Vol.8, 2004年, p.114-119
【文献】Henderson R. K. et al., Ind. Biotechnol., Vol.4, 2008年, p.180-192
【文献】Yang et al., J. Exp. Biol., Vol.208, 2005年, p.3609-3622
【文献】“Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ ガラガラヘビ毒由来”、[online]、富士フィルム 和光純薬株式会社 ウェブサイト、［平成31年3月5日検索］、インターネット＜ＵＲＬ： https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01MPB02100272.html＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
Ｄ－アミノ酸の合成にＬＡＡＯが用いられない理由としては、ＬＡＡＯの強い毒性のために大量発現系の構築が困難であること、ＬＡＡＯに関する研究報告のほとんどが動物（特にヘビ毒）などから直接精製され性質決定された内容に留まっていること、等が挙げられる。ＬＡＡＯの大量発現が困難である理由としては、基質であるＬ－アミノ酸が生物自身を構成する重要な化合物であり、さらに、ＬＡＡＯの酵素反応によって過酸化水素が発生する事も一因であると推測されている。具体的には、ＬＡＡＯの組換えタンパク質による大量発現系の構築については、大腸菌でAplysia californica（ジャンボアメフラシ）由来のＬＡＡＯを発現させたことが報告されているが（非特許文献３）、このAplysia californica由来のＬＡＡＯの発現量は非常に僅かであり、培養液１Ｌあたり０．２ｍｇに留まっている。また、市販されているヘビ毒由来のＬＡＡＯは、研究用試薬とはいえ、１０ｍｇで２２万５千円と非常に高価である（非特許文献４）。このように、Ｌ－アミノ酸の合成にはＤＡＡＯが工業利用されていることとは対照的に、Ｄ－アミノ酸の合成におけるＬＡＡＯの利用は現段階では困難であるという問題があった。
【0008】
また、上述したように、現状ではＤ－アミノ酸の合成において、Ｌ－アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）が広く利用されている。しかしながら、ＬＡＡＤを利用した光学分割においては、反応進行のためにフェナジンメトサルフェイト（ＰＭＳ）等の高価な電子供与体が必要であり、さらには、ＬＡＡＤ自体の活性が数十ｍＵ／ｍｇ程度と弱いため、大量のＬＡＡＤを要するという問題があった。
【0009】
同様に、ラセマーゼとアシラーゼ、もしくはラセマーゼとアミダーゼを組み合わせてＤ－アミノ酸を合成する方法においては、ラセマーゼの基質特異性が高く、改変も困難であるため、反応基質が限られているという問題を有していた。例えば、アラニンラセマーゼ（ＥＣ番号５．１．１．１）やアミノ酸ラセマーゼ（ＥＣ番号５．１．１．１０）は、特にフェニルアラニンやトリプトファンといった芳香族アミノ酸に対する活性が無いか、非常に低いかのいずれかであり、非天然型の基質、アミノ酸の誘導体や薬剤の合成中間体に対する反応性の報告も皆無であった。また、フェニルアラニンラセマーゼ（ＥＣ番号５．１．１．１１）であっても、反応自体にＡＴＰが必要である等の問題を有していた。さらに、これらアミノ酸ラセマーゼの多くはＰＬＰ型酵素で副反応や停止反応が発生しやすい。そして、Ｄ－アミノ酸を合成するためには、複数の酵素の安定性、反応性、基質選択性を合わせる必要があり、工業応用には適していないという問題があった。
【0010】
本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼそのものを組換えタンパク質の大量発現等により低コスト且つ大量に生産することができ、広い基質選択性を有するＬ－アミノ酸オキシダーゼを人工的に創出して、新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼとして提供することにある。
【0011】
さらに、本発明の他の目的は、ラセミ体のアミノ酸、アミノ酸誘導体又は合成中間体に対し、高い活性を有し、高効率の光学分割を可能とする新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼを提供することにある。
【0012】
さらに、本発明の他の目的は、ラセミ体のアミノ酸、アミノ酸誘導体又は合成中間体から、Ｄ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸誘導体又は合成中間体を得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、大腸菌発現系にて大量発現が可能であり、かつ、基質選択性が広く、活性が高いＬ－アミノ酸オキシダーゼを人工的に設計し、新規な人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ）を得ることに成功した。また、このＡｒｔＬＡＡＯを用いたＤＬ－アミノ酸からのＤ－アミノ酸の合成方法、すなわち、動的光学分割方法を開発した。具体的には、後述する実施例にて示すように、本発明のＡｒｔＬＡＡＯは、複数のＤＬ－フェニルアラニン誘導体について、９９％を超えるｅｅ値と極めて高い光学純度かつ高い収率にて各々のＤ－フェニルアラニン誘導体に分割することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0014】
上記課題を解決するため、本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼは、（１）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、（２）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、（３）配列番号１で表わされるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、又は（４）配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、の（１）～（４）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質である。これにより、組換えタンパク質の大量発現が可能であり、広い基質選択性を有する新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼが得られる。また、新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼは、ラセミ体のアミノ酸、アミノ酸誘導体又は合成中間体に対し、高効率の光学分割を行うことができる。なお、本発明におけるＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性には、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性だけでなく、Ｌ－アミノ酸誘導体オキシダーゼ活性も含まれる。
【0015】
また、本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼの遺伝子は、（５）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、（６）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、（７）配列番号１で表わされるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（８）配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、の（５）～（８）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。これにより、組換えタンパク質の大量発現が可能であり、広い基質選択性を有する新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼの遺伝子が得られる。
【0016】
また、本発明の組換えベクターは、上述したＬ－アミノ酸オキシダーゼのタンパク質をコードする遺伝子又は上述したＬ－アミノ酸オキシダーゼの遺伝子を含む組換えベクターである。これにより、本発明のＬ－アミノ酸オキシダーゼの組換えタンパク質の大量発現が可能であり、簡単かつ低コストにＬ－アミノ酸オキシダーゼを大量生産することができる。
【0017】
また、本発明の宿主細胞は、上述した組換えベクターを含んでいる。これにより、簡単かつ低コストに本発明のＬ－アミノ酸オキシダーゼを大量生産することができる。
【0018】
また、本発明のＤ－アミノ酸又はその誘導体の製造方法は、Ｌ－アミノ酸又はその誘導体に対し、上述したタンパク質をＬ－アミノ酸オキシダーゼとして作用させて、イミノ酸を生じさせる工程と、この生じたイミノ酸に対し、還元剤を作用させる工程と、を有している。Ｌ－アミノ酸又はＬ－アミノ酸の誘導体に対し、本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼを作用させると、Ｌ－アミノ酸又はその誘導体は酸化されてイミノ酸が形成される。このイミノ酸に還元剤を作用させることにより、ラセミ体のアミノ酸又はその誘導体に変換される。ラセミ体のうち、Ｌ－アミノ酸又はその誘導体はＬ－アミノ酸オキシダーゼと反応して再度イミノ酸を形成するが、Ｄ－アミノ酸又はその誘導体はＬ－アミノ酸オキシダーゼとは反応せずに残存する。それゆえ、最終的にはＬ－アミノ酸又はその誘導体は、Ｄ－アミノ酸またはその誘導体に変換される。
【0019】
また、本発明のケト酸の製造方法は、Ｌ－アミノ酸又はその誘導体に対し、上述したタンパク質をＬ－アミノ酸オキシダーゼとして作用させて、イミノ酸を生じさせる工程と、この生じたイミノ酸を加水分解させる工程と、を有している。Ｌ－アミノ酸又はＬ－アミノ酸の誘導体に対し、本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼを作用させると、Ｌ－アミノ酸又はその誘導体は酸化されてイミノ酸が形成される。このイミノ酸は水系反応液中で自然に加水分解されるため、ケト酸が生じる。ケト酸は有機合成では合成し難い化合物であるところ、本発明においては、上述した新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼによる酵素反応のみで製造できるため、低コストに生産することができる。
【0020】
また、本発明の光学分割方法は、ＤＬ－アミノ酸又はＤＬ－アミノ酸誘導体に対し、上述したタンパク質をＬ－アミノ酸オキシダーゼとして作用させる工程を有している。ＤＬ－アミノ酸等に対し、本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼを作用させると、Ｄ－アミノ酸等とは反応しないが、Ｌ－アミノ酸等は酸化され、中間体としてイミノ酸が形成される。このイミノ酸は、（１）還元剤等のラセミ化触媒を作用させることによって再びラセミ体に変換するか、または、（２）反応系中で加水分解してケト酸を形成するものである。（１）の場合には、再び生じたラセミ体のうち、Ｌ－アミノ酸等は再度Ｌ－アミノ酸オキシダーゼと反応してイミノ酸を形成するが、Ｄ－アミノ酸等は反応せずに残存するため、最終的にＤＬ－アミノ酸等がＤ－アミノ酸等に変換され、分離される。（２）の場合には、未反応のＤ－アミノ酸等と反応により生じたケト酸とを分離することにより、Ｄ－アミノ酸等が分離される。
【0021】
また、ＤＬ－アミノ酸又はＤＬ－アミノ酸の誘導体が、ＤＬ－フェニルアラニン、ＤＬ－トリプトファン、ＤＬ－メチオニン、ＤＬ－ロイシン、ＤＬ－グルタミン、ＤＬ－グルタミン酸、ＤＬ－チロシン、ＤＬ－イソロイシン、ＤＬ－アルギニン及びそれらの誘導体からなる群から選択される化合物であることが好ましい。これにより、基質として好適なアミノ酸が選択される。
【0022】
また、本発明の光学分割方法は、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼがＤＬ－アミノ酸又はＤＬ－アミノ酸誘導体に作用することにより生じたイミノ酸に対し、アンモニアボラン、水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム及びシアノトリヒドロホウ酸ナトリウムからなる群から選択される還元剤を作用させる工程を有している。これにより、Ｌ－アミノ酸等の酸化により形成されたイミノ酸をラセミ化させるラセミ化触媒として好適な化合物が選択される。
【発明の効果】
【0023】
本発明によれば、以下のような優れた効果を有する新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼ及びそれを用いたＤ－アミノ酸又はその誘導体の製造方法、ケト酸の製造方法、並びに新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼを用いた光学分割方法を提供することができる。
（１）大腸菌発現系にて大量発現が可能であるため、簡単且つ低コストにＬ－アミノ酸オキシダーゼを得ることができる。それゆえ、工業利用も可能である。
（２）基質選択性が広いため、アミノ酸の種類を問わず作用させることができ、汎用性が高い。さらに、アミノ酸だけでなく、アミノ酸誘導体に対しても高い活性で作用することができる。
（３）反応系中に共存するラセミ化触媒である還元剤からの影響を受けることなく、効率の良い動的光学分割をワンポットで行うことができ、高純度の光学活性体を高収率で得ることができる。
（１）大腸菌発現系にて大量発現が可能であるため、簡単且つ低コストにＬ－アミノ酸オキシダーゼを得ることができる。それゆえ、工業利用も可能である。
（２）基質選択性が広いため、アミノ酸の種類を問わず作用させることができ、汎用性が高い。さらに、アミノ酸だけでなく、アミノ酸誘導体に対しても高い活性で作用することができる。
（３）反応系中に共存するラセミ化触媒である還元剤からの影響を受けることなく、効率の良い動的光学分割をワンポットで行うことができ、高純度の光学活性体を高収率で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】実施例４における、ＤＬ－フェニルアラニン（ＤＬ－１ａ）の動的光学分割結果を示すキラルＨＰＬＣのクロマトグラム（上段：コントロール（光学分割前）、下段：ＡｒｔＬＡＡＯによる光学分割後）である。
【図2】実施例４における、２－フルオロ－ＤＬ－フェニルアラニン（ＤＬ－１ｂ）の動的光学分割結果を示すキラルＨＰＬＣのクロマトグラム（上段：コントロール（光学分割前）、下段：ＡｒｔＬＡＡＯによる光学分割後）である。
【図3】実施例４における、３－フルオロ－ＤＬ－フェニルアラニン（ＤＬ－１ｃ）の動的光学分割結果を示すキラルＨＰＬＣのクロマトグラム（上段：コントロール（光学分割前）、下段：ＡｒｔＬＡＡＯによる光学分割後）である。
【図4】実施例４における、４－フルオロ－ＤＬ－フェニルアラニン（ＤＬ－１ｄ）の動的光学分割結果を示すキラルＨＰＬＣのクロマトグラム（上段：コントロール（光学分割前）、下段：ＡｒｔＬＡＡＯによる光学分割後）である。
【図5】実施例４における、４－ニトロ－ＤＬ－フェニルアラニン（ＤＬ－１ｅ）の動的光学分割結果を示すキラルＨＰＬＣのクロマトグラム（上段：コントロール（光学分割前）、下段：ＡｒｔＬＡＡＯによる光学分割後）である。
【図6】実施例４における、４－ブロモ－ＤＬ－フェニルアラニン（ＤＬ－１ｆ）の動的光学分割結果を示すキラルＨＰＬＣのクロマトグラム（上段：コントロール（光学分割前）、下段：ＡｒｔＬＡＡＯによる光学分割後）である。
【図7】実施例１２における３種類のＡｒｔＬＡＡＯの（Ａ）耐熱性及び（Ｂ）耐久性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明のタンパク質は、次の（１）～（４）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質であり、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する。（１）配列番号１（ＡｒｔＬＡＡＯ１）、配列番号３（ＡｒｔＬＡＡＯ４）又は配列番号５（ＡｒｔＬＡＡＯ５）で表わされるアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、（２）配列番号１（ＡｒｔＬＡＡＯ１）、配列番号３（ＡｒｔＬＡＡＯ４）又は配列番号５（ＡｒｔＬＡＡＯ５）で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、（３）配列番号１（ＡｒｔＬＡＡＯ１）で表わされるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、又は（４）配列番号３（ＡｒｔＬＡＡＯ４）又は配列番号５（ＡｒｔＬＡＡＯ５）で表わされるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。ここで、本発明におけるＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性とは、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性、Ｌ－アミノ酸誘導体オキシダーゼ活性、又はこの両方を意味している。
【0026】
本明細書において、「配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」の欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数の範囲は、アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＡｒｔＬＡＡＯ１）と同程度の特性を有する限り、特に限定されない。具体的には、そのＬ－アミノオキシダーゼ活性や基質選択性の広さ、組換えタンパク質が大量発現可能といった優れた特性を備える観点から、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数の範囲は１～６０個が好ましく、１～３０個がより好ましく、１～１０個がさらに好ましい。
【0027】
また、本明細書において、「配列番号１で表わされるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」の同一性の範囲は、異なる同一性を有するタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＡｒｔＬＡＡＯ１）と同程度の特性を有する限り、特に限定されない。具体的には、そのＬ－アミノオキシダーゼ活性や基質選択性の広さ、組換えタンパク質が大量発現可能といった優れた特性を備える観点から、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に対する同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。
【0028】
また、本明細書において、「配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」の欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数の範囲は、アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたタンパク質が、配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＡｒｔＬＡＡＯ４又はＡｒｔＬＡＡＯ５）と同程度の特性を有する限り、特に限定されない。具体的には、そのＬ－アミノオキシダーゼ活性や基質選択性の広さ、組換えタンパク質が大量発現可能といった優れた特性を備える観点から、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数の範囲は１～１５個が好ましく、１～１０個がより好ましく、１～５個がさらに好ましい。
【0029】
さらに、本明細書において、「配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列」の同一性の範囲は、異なる同一性を有するタンパク質が、配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＡｒｔＬＡＡＯ４又はＡｒｔＬＡＡＯ５）と同程度の特性を有する限り、特に限定されない。具体的には、そのＬ－アミノオキシダーゼ活性や基質選択性の広さ、組換えタンパク質が大量発現可能といった優れた特性を備える観点から、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列に対する同一性は、９８％以上であることが好ましく、９８．５％以上であることがより好ましく、９９％以上であることがさらに好ましい。
【0030】
本発明のタンパク質には、糖鎖等による修飾が付加されたタンパク質も含まれる。タンパク質に付加される糖鎖等の種類、位置等は、組換えタンパク質の製造に用いた宿主細胞によって異なるが、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。
【0031】
本発明のタンパク質は、新規な人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ）であり、以下化学式１に示すように、Ｌ－アミノ酸又はその誘導体を酸化し、イミノ酸を形成する作用を有する。ここで、アンモニアボランのような還元剤存在下では、生じたイミノ酸はラセミ化されてラセミ体に変換されるため、最終的にＬ－アミノ酸はＤ－アミノ酸に変換される。他方、反応系に還元剤が存在しない場合には、生じたイミノ酸は加水分解されてケト酸が形成されるため、Ｌ－アミノ酸又はその誘導体からはケト酸が合成されることとなる。それゆえ、本発明のＬ－アミノ酸オキシダーゼは、ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体の光学分割に好適に用いられる。
【0032】
【化1】
【0033】
本発明のＡｒｔＬＡＡＯはいずれも広い基質選択性を有しており、親水性アミノ酸や疎水性アミノ酸だけでなく、芳香族アミノ酸及びこれらの誘導体に対しても、高い活性を有する。このように、本発明のＡｒｔＬＡＡＯは反応基質を選ばないため、汎用性が高く、医薬品や医薬品の合成中間体等の製造に用いることができる。基質としては、本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼによって酸化されるＬ－アミノ酸又はその誘導体であれば特に限定されないが、具体的には、一例として、Ｌ－メチオニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－チロシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－アルギニン及びこれらの誘導体が挙げられる。このうち、特に高い活性を有する反応基質としては、疎水性アミノ酸ではＬ－メチオニン又はＬ－ロイシン、芳香族アミノ酸ではＬ－フェニルアラニン又はＬ－トリプトファン、親水性アミノ酸ではＬ－グルタミン又はＬ－グルタミン酸が挙げられる。
【0034】
さらに、本発明のＡｒｔＬＡＡＯは天然のＬ－アミノ酸だけでなく、Ｌ－アミノ酸の種々誘導体に対する活性も十分に備えている。例えば、後述する実施例では、Ｌ－フェニルアラニンのフェニル基部分の水素原子がフッ素原子、臭素原子、ニトロ基、アミノ基、メトキシ基又はトリフルオロメチル基等でそれぞれ置換されたＬ－フェニルアラニン誘導体、Ｌ－トリプトファンのインドール環部分の水素原子がフッ素原子、メチル基又はメトキシ基等でそれぞれ置換されたＬ－トリプトファン誘導体、並びに、Ｌ－チロシンのフェノール基部分の水素原子がフッ素原子又はニトロ基でそれぞれ置換されたＬ－チロシン誘導体等に対しても優れた活性を備えていることが示されている。それゆえ、本発明のＡｒｔＬＡＡＯは、Ｌ－アミノ酸誘導体をＤ－アミノ酸誘導体に変換したり、Ｌ－アミノ酸誘導体をケト酸に変換することも容易に行うことができる。
【0035】
また、本発明のＡｒｔＬＡＡＯのうち、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＡｒｔＬＡＡＯ１の特性としては、以下の通りである。
（１）至適ｐＨは７～８である。
（２）至適温度は２５℃～３５℃である。
（３）等電点（ｐＩ）は５．０１である。
（４）分子量は７４．２７ｋＤａである。
（１）至適ｐＨは７～８である。
（２）至適温度は２５℃～３５℃である。
（３）等電点（ｐＩ）は５．０１である。
（４）分子量は７４．２７ｋＤａである。
【0036】
また、本発明のＡｒｔＬＡＡＯのうち、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＡｒｔＬＡＡＯ４の特性としては、以下の通りである。
（１）至適ｐＨは６．５～７．０である。
（２）等電点（ｐＩ）は４．９である。
（３）分子量は７４．１ｋＤａである。
（１）至適ｐＨは６．５～７．０である。
（２）等電点（ｐＩ）は４．９である。
（３）分子量は７４．１ｋＤａである。
【0037】
また、本発明のＡｒｔＬＡＡＯのうち、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＡｒｔＬＡＡＯ５の特性としては、以下の通りである。
（１）至適ｐＨは６．０である。
（２）等電点（ｐＩ）は５．１である。
（３）分子量は７３．９ｋＤａである。
（１）至適ｐＨは６．０である。
（２）等電点（ｐＩ）は５．１である。
（３）分子量は７３．９ｋＤａである。
【0038】
＜ＡｒｔＬＡＡＯの製造方法＞
本発明のタンパク質、すなわちＡｒｔＬＡＡＯは、常法に従い、このタンパク質をコードする遺伝子を用いて、大腸菌等を宿主としたタンパク質発現等により製造することができる。また、化学合成によりＡｒｔＬＡＡＯを製造することも可能であるが、本発明のＡｒｔＬＡＡＯは、従来のＬＡＡＯと異なり、組換えタンパク質の大量発現を実現できた新規なタンパク質であるため、遺伝子組換え技術を用いて製造することが好ましい。
本発明のタンパク質、すなわちＡｒｔＬＡＡＯは、常法に従い、このタンパク質をコードする遺伝子を用いて、大腸菌等を宿主としたタンパク質発現等により製造することができる。また、化学合成によりＡｒｔＬＡＡＯを製造することも可能であるが、本発明のＡｒｔＬＡＡＯは、従来のＬＡＡＯと異なり、組換えタンパク質の大量発現を実現できた新規なタンパク質であるため、遺伝子組換え技術を用いて製造することが好ましい。
【0039】
本発明のＡｒｔＬＡＡＯの組換えタンパク質を製造するにあたっては、このタンパク質をコードする遺伝子を準備し、この遺伝子を適当な発現系に導入する必要があるところ、このタンパク質をコードする遺伝子は、次の（５）～（８）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。（５）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、（６）配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、（７）配列番号１で表わされるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（８）配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。このＡｒｔＬＡＡＯタンパク質をコードする遺伝子は、人工遺伝子合成等の既知の方法により得ることができる。
【0040】
本発明のタンパク質を製造するにあたっては、一例として、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表わされる塩基配列からなる遺伝子を使用することができる。人工遺伝子合成により得られたＡｒｔＬＡＡＯをコードするＤＮＡ断片をインサートとして、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターが得られる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。この組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、本発明のＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体が得られる。形質転換された宿主細胞を培養し、組換えタンパク質の発現を誘導させると、培養細胞又は培養物中にタンパク質が生産される。生産されたタンパク質は、所定の方法にて回収することが可能である。
【0041】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立的に複製可能なもの、又は宿主細胞の染色体中へ組み込みされるもの、のいずれも用いられるが、宿主細胞において自立的に複製可能なベクターであるプラスミドベクター、ファージベクター又はウイルスベクター等が好適に用いられる。特に限定されないが、一例として、ｐＥＴベクター、ｐＣｏｌｄベクター、ｐＢＲベクター及びｐＵＣベクター等の大腸菌発現用のプラスミドベクターが好適に用いられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等のプロモーターが挙げられる。また、発現ベクターには、上述したプロモーターのほか、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー、リボソーム結合部位等を含有していてもよい。
【0042】
宿主細胞としては、組換えベクターを導入でき、目的とする遺伝子を発現可能であれば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれも使用することができる。微生物としては、特に限定されないが、例えば、エシェリヒア属（大腸菌）、バチルス属、ストレプトミセス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属等の微生物等が挙げられる。用いられる大腸菌としては、具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株等が挙げられる。また、組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知のあらゆる方法に基づいて行うことができ、例えば、エレクトロポレーションやカルシウムイオンを用いる方法等により行うことができる。
【0043】
ＡｒｔＬＡＡＯタンパク質をコードする遺伝子を有する組換えベクターが導入された形質転換体は、宿主細胞の培養に用いられる通常の培地及び培養方法に基づき培養される。タンパク質発現を誘導するプロモーターを含む発現ベクターを用いた際には、誘導剤を培地に添加することにより、タンパク質の発現が生じる。具体的には、例えば、ｌａｃプロモーターを含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を用いた場合には、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、プロモーター下流に連結されたタンパク質が発現する。
【0044】
形質転換体の培養細胞又は培養液等の培養物から、本発明のタンパク質を回収することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養処理後の培養液又は培地、培養後の細胞又はこれらの破砕物のいずれもが含まれる。発現したタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、公知の方法に従い、細胞を破砕すること等によって発現したタンパク質を回収することができる。他方、発現したタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養液の上清部分を回収することにより、所望のタンパク質が得られる。また、回収されたタンパク質は、既存のタンパク質の精製方法に基づいて精製することが可能である。
【0045】
本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ）は、従来のＬＡＡＯとは異なり、大腸菌発現系での大量発現が可能である。これにより、簡単かつ低コストに、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼを生産することができるため、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの工業利用を可能とすることができる。
【0046】
＜ＡｒｔＬＡＡＯを用いたＤＬ－アミノ酸又はその誘導体の動的光学分割＞
本発明のＡｒｔＬＡＡＯは、ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体をＤ－アミノ酸又はその誘導体に変換する動的光学分割に利用でき、工業的なＤ－アミノ酸又はＤ－アミノ酸誘導体の製造を実現することができる。本発明のＡｒｔＬＡＡＯを利用した動的光学分割方法は、以下順序で行われる。ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体に対し、ＡｒｔＬＡＡＯを作用させると、ＡｒｔＬＡＡＯとＤ－アミノ酸等とは反応しないが、Ｌ－アミノ酸等は酸化され、中間体としてイミノ酸が形成される（上記の化学式１参照）。このイミノ酸は、還元剤等のラセミ化触媒を作用させることによって再びラセミ体に変換される。ここで、再び生じたラセミ体のうち、Ｌ－アミノ酸等は再度Ｌ－アミノ酸オキシダーゼと反応してイミノ酸を形成するが、Ｄ－アミノ酸等は反応せずに残存する。この繰り返しによって、最終的にＤＬ－アミノ酸等はＤ－アミノ酸等に変換され、高純度の光学活性体として得られる。
本発明のＡｒｔＬＡＡＯは、ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体をＤ－アミノ酸又はその誘導体に変換する動的光学分割に利用でき、工業的なＤ－アミノ酸又はＤ－アミノ酸誘導体の製造を実現することができる。本発明のＡｒｔＬＡＡＯを利用した動的光学分割方法は、以下順序で行われる。ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体に対し、ＡｒｔＬＡＡＯを作用させると、ＡｒｔＬＡＡＯとＤ－アミノ酸等とは反応しないが、Ｌ－アミノ酸等は酸化され、中間体としてイミノ酸が形成される（上記の化学式１参照）。このイミノ酸は、還元剤等のラセミ化触媒を作用させることによって再びラセミ体に変換される。ここで、再び生じたラセミ体のうち、Ｌ－アミノ酸等は再度Ｌ－アミノ酸オキシダーゼと反応してイミノ酸を形成するが、Ｄ－アミノ酸等は反応せずに残存する。この繰り返しによって、最終的にＤＬ－アミノ酸等はＤ－アミノ酸等に変換され、高純度の光学活性体として得られる。
【0047】
上述したＤＬ－アミノ酸又はその誘導体の動的光学分割の反応条件としては、反応原料（ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体）１ｍＭ（基質として０．５ｍＭ）に対し、生じたイミノ酸のラセミ化を確実に行わせる観点から、還元剤を１５ｍＭ以上共存させることが好ましく、２０ｍＭ以上共存させることがさらに好ましく、３０ｍＭ以上共存させることが特に好ましい。なお、ラセミ化触媒として用いられる還元剤としては、アンモニアボラン、水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム等が挙げられ、ＡｒｔＬＡＡＯと共存させた際においても互いの機能にあまり影響を与えず、互いの反応性を保持できる観点から、アンモニアボランが特に好ましい。
【0048】
また、反応原料（ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体）１ｍＭ（基質としては０．５ｍＭ）に対するＡｒｔＬＡＡＯの添加量は、１Ｕ以上とすることが好ましく、２Ｕ以上とすることがさらに好ましい。反応温度は２０℃～４０℃が好ましく、２５℃～３５℃がより好ましく、２８℃～３２℃がさらに好ましい。反応は弱アルカリ性の緩衝液中にて行われることが好ましく、特に限定されないが、例えば、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）等で好適に反応を行うことができる。なお、反応時間は、反応原料の量によって変化するが、３～２４時間程度であり、反応終了のタイミングは反応液をキラルＨＰＬＣ等で分析することにより、判断することも可能である。本発明のＡｒｔＬＡＡＯを用いることにより、後述する実施例に示すように、９９％を超える高い鏡像体過剰率（ｅｅ）を有する光学活性体を得ることができており、また、７８％を超える収率を示すなど、高効率に高純度の光学活性体がワンポットで得られる動的光学分割が実現される。
【0049】
＜ＡｒｔＬＡＡＯを用いたＤ－アミノ酸又はその誘導体の製造方法＞
上述した動的光学分割反応条件において、反応原料をラセミ体ではない１組のエナンチオマー又はＬ－アミノ酸等とした場合においても、上述と同様の反応により、反応原料に含まれるＬ－アミノ酸等がＤ－アミノ酸又はその誘導体に変換される。
上述した動的光学分割反応条件において、反応原料をラセミ体ではない１組のエナンチオマー又はＬ－アミノ酸等とした場合においても、上述と同様の反応により、反応原料に含まれるＬ－アミノ酸等がＤ－アミノ酸又はその誘導体に変換される。
【0050】
＜ＡｒｔＬＡＡＯを用いたＤＬ－アミノ酸又はその誘導体の光学分割＞
本発明のＡｒｔＬＡＡＯは、ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体をＤ－アミノ酸又はその誘導体とケト酸とに変換する光学分割に利用することも可能である。この場合には、ラセミ化触媒である還元剤の添加は不要となる。本発明のＡｒｔＬＡＡＯを利用した光学分割方法は、以下順序で行われる。ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体に対し、ＡｒｔＬＡＡＯを作用させると、ＡｒｔＬＡＡＯとＤ－アミノ酸等とは反応しないが、Ｌ－アミノ酸等は酸化され、中間体としてイミノ酸が形成される。このイミノ酸は、ラセミ化触媒が無い条件下では、水系反応液中で自然に加水分解されて、ケト酸に変換される。反応せずに残存したＤ－アミノ酸等と、酵素反応及び加水分解により生じたケト酸とを分離することにより、Ｄ－アミノ酸等とケト酸とをそれぞれ得ることができる。なお、Ｄ－アミノ酸等とケト酸との分離は、例えば酸性水溶液中での選択的沈殿方法、又は、イオン交換クロマトグラフィー法等により行うことができる。
本発明のＡｒｔＬＡＡＯは、ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体をＤ－アミノ酸又はその誘導体とケト酸とに変換する光学分割に利用することも可能である。この場合には、ラセミ化触媒である還元剤の添加は不要となる。本発明のＡｒｔＬＡＡＯを利用した光学分割方法は、以下順序で行われる。ＤＬ－アミノ酸又はその誘導体に対し、ＡｒｔＬＡＡＯを作用させると、ＡｒｔＬＡＡＯとＤ－アミノ酸等とは反応しないが、Ｌ－アミノ酸等は酸化され、中間体としてイミノ酸が形成される。このイミノ酸は、ラセミ化触媒が無い条件下では、水系反応液中で自然に加水分解されて、ケト酸に変換される。反応せずに残存したＤ－アミノ酸等と、酵素反応及び加水分解により生じたケト酸とを分離することにより、Ｄ－アミノ酸等とケト酸とをそれぞれ得ることができる。なお、Ｄ－アミノ酸等とケト酸との分離は、例えば酸性水溶液中での選択的沈殿方法、又は、イオン交換クロマトグラフィー法等により行うことができる。
【0051】
＜ＡｒｔＬＡＡＯを用いたケト酸の製造方法＞
上述した光学分割反応条件において、反応原料をラセミ体ではなく、例えば、Ｌ－アミノ酸等とした場合には、上述と同様の反応により、反応原料に含まれるＬ－アミノ酸等がケト酸に変換される。ケト酸は有機合成し難い化合物であることから、酵素を用いた工業的なケト酸の合成も実現することができる。
上述した光学分割反応条件において、反応原料をラセミ体ではなく、例えば、Ｌ－アミノ酸等とした場合には、上述と同様の反応により、反応原料に含まれるＬ－アミノ酸等がケト酸に変換される。ケト酸は有機合成し難い化合物であることから、酵素を用いた工業的なケト酸の合成も実現することができる。
【実施例】
【0052】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。以下実施例においては、本発明に係る新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼの設計及び作出を行い、その活性及び動的光学分割能を評価した。
【0053】
［実施例１］
１．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）の設計
基質選択性の広いＬＡＡＯを人工的に設計するため、以下の操作を行った。報告のあるＬ－アルギニン酸化酵素（ＡＲＯＤ）のアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴプログラムのＢｌａｓｔｐ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins）で解析した。その後、発明者らの研究室で開発したタンパク質配列マイニング法により検討した結果、以下表１に示す６つのＡＲＯＤホモログ配列を抽出した。
１．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）の設計
基質選択性の広いＬＡＡＯを人工的に設計するため、以下の操作を行った。報告のあるＬ－アルギニン酸化酵素（ＡＲＯＤ）のアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴプログラムのＢｌａｓｔｐ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins）で解析した。その後、発明者らの研究室で開発したタンパク質配列マイニング法により検討した結果、以下表１に示す６つのＡＲＯＤホモログ配列を抽出した。
【0054】
【表1】
【0055】
得られた６つのＡＲＯＤホモログ配列をマルチプルシーケンスアラインメントソフトウェア（ＭＡＦＦＴ）により整列後、系統解析ソフトウェア（ＭＥＧＡ６）を用いて最尤法により系統樹を作成した。これらのデータを祖先配列の確率的再構築のためのソフトウェアであるＦａｓｔＭＬ（http://fastml.tau.ac.il）で解析した。これに基づき、下記表２に示す６５５アミノ酸のアミノ酸配列（配列番号１）からなる新規な人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）を設計した。
【0056】
【表2】
【0057】
設計されたＡｒｔＬＡＡＯ１のアミノ酸配列について、データベースに存在する配列との同一性（identity）を確認したところ、上記表１に示すホモログとの同一性が最も高く、その同一性は最も高いもので８４％であった。しかしながら、ＡｒｔＬＡＡＯ１のアミノ酸配列にはこれら天然のアミノ酸配列には見られない人工的な変異が１００残基以上も含まれていた。これにより、新規な配列を有する人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ）が設計されたことがわかった。
【0058】
［実施例２］
２．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）の製造
実施例１で得た６５５残基のアミノ酸からなるＡｒｔＬＡＡＯ１をコードする遺伝子（配列番号２）を人工遺伝子合成により作成した。下記表３にその遺伝子配列を示す。作成したＡｒｔＬＡＡＯ１遺伝子をｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製品）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、ＡｒｔＬＡＡＯ１遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したＡｒｔＬＡＡＯ１発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換を行い、ＡｒｔＬＡＡＯ１生産株を得た。
２．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）の製造
実施例１で得た６５５残基のアミノ酸からなるＡｒｔＬＡＡＯ１をコードする遺伝子（配列番号２）を人工遺伝子合成により作成した。下記表３にその遺伝子配列を示す。作成したＡｒｔＬＡＡＯ１遺伝子をｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製品）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、ＡｒｔＬＡＡＯ１遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したＡｒｔＬＡＡＯ１発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換を行い、ＡｒｔＬＡＡＯ１生産株を得た。
【0059】
【表3】
【0060】
得られたＡｒｔＬＡＡＯ１生産株を１ＬのＬＢ培地に植菌して大量培養を行った。具体的には、３７℃の条件で４～６時間程度振とう培養を行い、６００ｎｍでのＯＤ値が０．４～０．６に到達した時点でＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド）を終濃度０．５ｍＭになるように添加し、ＡｒｔＬＡＡＯ１タンパク質の発現を誘導させた。ＩＰＴＧ添加後は、培養温度を２３℃に下げて１６時間振とう培養した。培養後の菌体を回収し、菌体から発現したＡｒｔＬＡＡＯ１タンパク質を回収した。タンパク質の回収は、具体的には、次の方法により行った。培養液を６０００×ｇで１０分間遠心分離し、ＬＢ液体培地を取り除いた。６０ｍＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーに懸濁後、超音波ホモジナイザーにて細胞を破砕した。この破砕液を１１０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清画分を粗酵素液とした。粗酵素液は直ちにＨｉｓＴｒａｐＴＭ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製品）に吸着させ、３０ｍＬのバッファーで洗浄した後、７０及び３００ｍＭのイミダゾールを含むバッファーを用いて溶出した。各溶出画分についてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、７５ｋＤａ付近にバンドを持つ溶出画分を回収した。必要に応じて回収した画分を濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーカラムであるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製品）を用いて精製を行った。
【0061】
回収したタンパク質について、以下表４に示す活性測定用反応液を調整し、この反応液９０μＬに、回収したＡｒｔＬＡＡＯ１を１０μＬ添加し、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの活性を測定した。その菌体比活性からＡｒｔＬＡＡＯ１タンパク質の発現量を確認した。
【0062】
【表4】
【0063】
この結果、１Ｌの液体培地における培養によって、５００Ｕ以上ものＡｒｔＬＡＡＯ１が得られたことがわかった。これは培養液１Ｌあたり、約３０ｍｇのＡｒｔＬＡＡＯ１が生産されたことを示している。これまで、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの組換えタンパク質の発現による生産については、同じく大腸菌でAplysia californica由来ＬＡＡＯを発現させたことが報告されているが（非特許文献３）、このAplysia californica由来ＬＡＡＯでは培養液１Ｌあたり０．２ｍｇしか生産することができなかった。本発明におけるＡｒｔＬＡＡＯはこれと比べて１５０倍ほども収量が多く、大量に生産できることが判明した。
【0064】
［実施例３］
３．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）の活性測定
２０種類のＬ－アミノ酸及び２種類のＬ－アミノ酸誘導体、並びに２種類のＤＬ－アミノ酸及び１６種類のＤＬ－アミノ酸誘導体について、実施例２で得られた人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）の比活性測定を行った。本実施例におけるＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性の測定方法は、具体的には、次のとおりである。表４に示す活性測定用反応液をマイクロチューブに量りとり、これをウォーターバスにて３０℃の条件で３０分インキュベートした。活性測定用反応液を石英セルに９０μＬ量りとり、実施例２で得られた酵素液を１０μＬ添加して、反応を開始し、直ちに紫外可視分光光度計（ＵＶ－２４５０、株式会社島津製作所）で５０５ｎｍの吸光度変化を測定して酵素活性を求めた。
３．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）の活性測定
２０種類のＬ－アミノ酸及び２種類のＬ－アミノ酸誘導体、並びに２種類のＤＬ－アミノ酸及び１６種類のＤＬ－アミノ酸誘導体について、実施例２で得られた人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）の比活性測定を行った。本実施例におけるＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性の測定方法は、具体的には、次のとおりである。表４に示す活性測定用反応液をマイクロチューブに量りとり、これをウォーターバスにて３０℃の条件で３０分インキュベートした。活性測定用反応液を石英セルに９０μＬ量りとり、実施例２で得られた酵素液を１０μＬ添加して、反応を開始し、直ちに紫外可視分光光度計（ＵＶ－２４５０、株式会社島津製作所）で５０５ｎｍの吸光度変化を測定して酵素活性を求めた。
【0065】
２０種類のＬ－アミノ酸、２種類のＤＬ－アミノ酸及び１８種類のアミノ酸誘導体についての酵素活性測定結果を以下表５に示す。表５に示すように、配列番号１のタンパク質は、１３種類の異なるＬ－アミノ酸、２種類のＤＬ－アミノ酸及び１８種類のアミノ酸誘導体に対して活性を示した。よって、実施例２で得られたタンパク質は広くＬ－アミノ酸及びアミノ酸誘導体を酸化可能な酵素であることが明らかとなった。
【0066】
【表5】
【0067】
２０種類のＬ－アミノ酸のうち、特に高い活性を示した６つのＬ－アミノ酸（Ｌ－メチオニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－グルタミン及びＬ－グルタミン酸）に関して酵素学的パラメータを決定した。結果を以下表６に示す。解析の結果、ＡｒｔＬＡＡＯ１はＬ－メチオニンに対する酵素効率が最も高いことが明らかとなった。その一方でＡｒｔＬＡＡＯ１はＬ－フェニルアラニンに対しても高い活性を有することが明らかとなった。以上の結果より、本発明のＡｒｔＬＡＡＯは基質選択性の広いＬ－アミノ酸オキシダーゼであることが示された。
【0068】
【表6】
【0069】
［実施例４］
４．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）による動的光学分割（１）
次にＤＬ－フェニルアラニン及びその誘導体について、以下化学式２に示す、ＡｒｔＬＡＡＯを用いた動的光学分割（ＤＫＲ）を試みた。以下化学式２では、本実施例４における、本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ）を用いたＤＬ－フェニルアラニン誘導体の動的光学分割により、Ｄ－フェニルアラニン誘導体が製造されるフローが示されている。ＤＬ－フェニルアラニン及びその誘導体として、下記表７に示す１０種類の反応原料（ＤＬ－１ａ～ＤＬ－１ｊ）を準備した。ＤＫＲは、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）、５ｍＭの各反応原料、１５０ｍＭのアンモニアボラン（ＮＨ３：ＢＨ３）及び１０ＵのＡｒｔＬＡＡＯ１の反応液を調製したのち、３０℃で約２０時間反応させることで実施した。
４．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）による動的光学分割（１）
次にＤＬ－フェニルアラニン及びその誘導体について、以下化学式２に示す、ＡｒｔＬＡＡＯを用いた動的光学分割（ＤＫＲ）を試みた。以下化学式２では、本実施例４における、本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ）を用いたＤＬ－フェニルアラニン誘導体の動的光学分割により、Ｄ－フェニルアラニン誘導体が製造されるフローが示されている。ＤＬ－フェニルアラニン及びその誘導体として、下記表７に示す１０種類の反応原料（ＤＬ－１ａ～ＤＬ－１ｊ）を準備した。ＤＫＲは、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）、５ｍＭの各反応原料、１５０ｍＭのアンモニアボラン（ＮＨ３：ＢＨ３）及び１０ＵのＡｒｔＬＡＡＯ１の反応液を調製したのち、３０℃で約２０時間反応させることで実施した。
【0070】
【化2】
【0071】
ＤＫＲの反応終了後、反応液をマイクロチューブに５００μＬ回収し、５００μＬのメタノールを添加した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ）にて沈殿物を除去後、その上清を回収した。回収した各上清についてキラルＨＰＬＣによる分析を行った。ＨＰＬＣのランニングバッファーは１．１５％（ｗ／ｖ）ＨＣｌＯ４、キラル分析用カラムはＣＲＯＷＮＰＡＫ－ＣＲ－I（＋）（１５０ｍｍ×３．０ｍｍ×５μｍ、株式会社ダイセル製品）を用いた。その他の分析条件については以下表７に示す通りとした。
【0072】
【表7】
【0073】
図１～６にＡｒｔＬＡＡＯ１を用いたＤＬ－フェニルアラニン及びその誘導体（ＤＬ－１ａ～ＤＬ－１ｆ）の光学分割の結果を示す。図１～６に示した通り、ＡｒｔＬＡＡＯ添加（＋ＡｒｔＬＡＡＯ）によりＬ体のピークが消失し、Ｄ体に変換されることが判明した。さらに、下記表８にＤ体及びＬ体のピーク面積値より算出した鏡像体過剰率（ｅｅ）及び収率を示す。ＤＬ－フェニルアラニン誘導体のうち、４－アミノ－ＤＬ－フェニルアラニン（ＤＬ－１ｇ）のｅｅ値は８８％であり、他の誘導体のｅｅ値はいずれも９９％を超えていた。また、収率はいずれの化合物も６８～８５％と高い値を示した。以上の結果より本発明のＡｒｔＬＡＡＯを用いることにより、動的光学分割法により、ＤＬ－フェニルアラニン誘導体を高い光学純度かつ高い収率でＤ－フェニルアラニン誘導体に変換できることが判明した。
【0074】
【表8】
【0075】
［実施例５］
５．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）による動的光学分割（２）
さらに、ＤＬ－トリプトファン及びその誘導体、並びにグリシン誘導体について、実施例４と同様の方法にてＡｒｔＬＡＡＯ１を用いた動的光学分割（ＤＫＲ）を試みた。ＤＬ－トリプトファン及びその誘導体、並びにグリシン誘導体として、下記表９に示す８種類の反応原料（ＤＬ－２ａ～ＤＬ－２ｈ）を準備し、ＤＫＲを行った。ＤＫＲ及びその結果の分析は実施例４と同様の方法で行った。表９に各化合物のキラルＨＰＬＣの分析条件及び保持条件を示す。
５．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）による動的光学分割（２）
さらに、ＤＬ－トリプトファン及びその誘導体、並びにグリシン誘導体について、実施例４と同様の方法にてＡｒｔＬＡＡＯ１を用いた動的光学分割（ＤＫＲ）を試みた。ＤＬ－トリプトファン及びその誘導体、並びにグリシン誘導体として、下記表９に示す８種類の反応原料（ＤＬ－２ａ～ＤＬ－２ｈ）を準備し、ＤＫＲを行った。ＤＫＲ及びその結果の分析は実施例４と同様の方法で行った。表９に各化合物のキラルＨＰＬＣの分析条件及び保持条件を示す。
【0076】
【表9】
【0077】
表１０にＡｒｔＬＡＡＯ１を用いたＤＬ－トリプトファン及びその誘導体、並びにグリシン誘導体（ＤＬ－２ａ～ＤＬ－２ｈ）の光学分割の結果として、Ｄ体及びＬ体のピーク面積値より算出した鏡像体過剰率（ｅｅ）及び収率を示す。ＤＬ－７－アザトリプトファン（ＤＬ－２ｇ）のｅｅ値は８６％と若干低いものの、他の誘導体のｅｅ値はいずれも９９％を超えていた。また、収率はいずれの化合物も６９～８０％と高い値を示した。以上の結果より本発明のＡｒｔＬＡＡＯを用いることにより、動的光学分割法により、ＤＬ－トリプトファン誘導体等についても、高い光学純度かつ高い収率でＤ－トリプトファン誘導体等に変換できることが判明した。
【0078】
【表10】
【0079】
［実施例６］
６．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）の設計
実施例１～５で得られた人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）と同様の機能を有する酵素をさらに得るべく、上述した表１に示すＡＲＯＤホモログ配列に基づいて新たな人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの設計を試みた。
６．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）の設計
実施例１～５で得られた人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）と同様の機能を有する酵素をさらに得るべく、上述した表１に示すＡＲＯＤホモログ配列に基づいて新たな人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの設計を試みた。
【0080】
表１に示す６つのＡＲＯＤホモログ配列をマルチプルシーケンスアラインメントソフトウェア（ＭＡＦＦＴ）により整列後、系統解析ソフトウェア（ＭＥＧＡ６）を用いて最尤法により系統樹を作成した。これらのデータを祖先配列の確率的再構築のためのソフトウェアであるＦａｓｔＭＬ（http://fastml.tau.ac.il）で解析した。これに基づき、下記表１１に示す６５６アミノ酸のアミノ酸配列（配列番号３）からなる新規な人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）を設計した。
【0081】
【表11】
【0082】
設計されたＡｒｔＬＡＡＯ４のアミノ酸配列について、データベースに存在する配列との同一性（identity）を確認したところ、上記表１に示すホモログとの同一性が最も高く、その同一性は最も高いもので９４．５％であった。しかしながら、ＡｒｔＬＡＡＯ４のアミノ酸配列にはこれら天然のアミノ酸配列には見られない人工的な変異が３０残基以上も含まれていた。これにより、新規な配列を有する人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）が設計されたことがわかった。
【0083】
［実施例７］
７．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）の製造
実施例６で得た６５６残基のアミノ酸からなるＡｒｔＬＡＡＯ４をコードする遺伝子（配列番号４）を人工遺伝子合成により作成した。下記表１２にその遺伝子配列を示す。作成したＡｒｔＬＡＡＯ４遺伝子をｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製品）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、ＡｒｔＬＡＡＯ４遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したＡｒｔＬＡＡＯ４発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換を行い、ＡｒｔＬＡＡＯ４生産株を得た。
７．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）の製造
実施例６で得た６５６残基のアミノ酸からなるＡｒｔＬＡＡＯ４をコードする遺伝子（配列番号４）を人工遺伝子合成により作成した。下記表１２にその遺伝子配列を示す。作成したＡｒｔＬＡＡＯ４遺伝子をｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製品）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、ＡｒｔＬＡＡＯ４遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したＡｒｔＬＡＡＯ４発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換を行い、ＡｒｔＬＡＡＯ４生産株を得た。
【0084】
【表12】
【0085】
得られたＡｒｔＬＡＡＯ４生産株を１ＬのＬＢ培地に植菌して大量培養を行った。具体的には、３７℃の条件で４～６時間程度振とう培養を行い、６００ｎｍでのＯＤ値が０．４～０．６に到達した時点でＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド）を終濃度０．５ｍＭになるように添加し、ＡｒｔＬＡＡＯ４タンパク質の発現を誘導させた。ＩＰＴＧ添加後は、培養温度を２３℃に下げて１６時間振とう培養した。培養後の菌体を回収し、菌体から発現したＡｒｔＬＡＡＯ４タンパク質を回収した。上述したＡｒｔＬＡＡＯ１と同程度の量のタンパク質を回収できた。タンパク質の回収は、具体的には、次の方法により行った。培養液を６０００×ｇで１０分間遠心分離し、ＬＢ液体培地を取り除いた。６０ｍＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーに懸濁後、超音波ホモジナイザーにて細胞を破砕した。この破砕液を１１０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清画分を粗酵素液とした。粗酵素液は直ちにＨｉｓＴｒａｐＴＭ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製品）に吸着させ、３０ｍＬのバッファーで洗浄した後、７０及び３００ｍＭのイミダゾールを含むバッファーを用いて溶出した。各溶出画分についてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、７５ｋＤａ付近にバンドを持つ溶出画分を回収した。必要に応じて回収した画分を濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーカラムであるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製品）を用いて精製を行った。上記表４に示した活性測定用反応液９０μＬに、回収したＡｒｔＬＡＡＯ４タンパク質を１０μＬ添加してＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性の測定を行い、得られたＡｒｔＬＡＡＯ４がＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有することを確認した。
【0086】
［実施例８］
８．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）の活性測定
２０種類のＬ－アミノ酸について、実施例７で得られた人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）の比活性測定を行った。Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性の測定は、上述した実施例３と同様の方法で行った。ＡｒｔＬＡＡＯ４の２０種類のＬ－アミノ酸についての酵素活性測定結果を以下表１３に示す。
８．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）の活性測定
２０種類のＬ－アミノ酸について、実施例７で得られた人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）の比活性測定を行った。Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性の測定は、上述した実施例３と同様の方法で行った。ＡｒｔＬＡＡＯ４の２０種類のＬ－アミノ酸についての酵素活性測定結果を以下表１３に示す。
【0087】
【表13】
【0088】
表１３に示すように、配列番号３のタンパク質は、１１種類の異なるＬ－アミノ酸に対して活性を示した。よって、実施例７で得られたタンパク質は広くＬ－アミノ酸を酸化可能な酵素であることが明らかとなった。２０種類のＬ－アミノ酸のうち、特に高い活性を示した６つのＬ－アミノ酸（Ｌ－メチオニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－グルタミン及びＬ－グルタミン酸）に関して酵素学的パラメータを決定した。結果を以下表１４に示す。解析の結果、ＡｒｔＬＡＡＯ４はＬ－メチオニンに対する酵素効率が最も高いことが明らかとなった。その一方でＡｒｔＬＡＡＯ４はＬ－フェニルアラニンに対しても高い活性を有することが明らかとなった。以上の結果より、本発明のＡｒｔＬＡＡＯは基質選択性の広いＬ－アミノ酸オキシダーゼであることが示された。
【0089】
【表14】
【0090】
［実施例９］
９．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）の設計
実施例１～５で得られたＡｒｔＬＡＡＯ１及び実施例６～８で得られたＡｒｔＬＡＡＯ４と同様の機能を有する酵素をさらに得るべく、上述した表１に示すＡＲＯＤホモログ配列に基づいて新たな人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの設計を試みた。
９．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）の設計
実施例１～５で得られたＡｒｔＬＡＡＯ１及び実施例６～８で得られたＡｒｔＬＡＡＯ４と同様の機能を有する酵素をさらに得るべく、上述した表１に示すＡＲＯＤホモログ配列に基づいて新たな人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの設計を試みた。
【0091】
表１に示す６つのＡＲＯＤホモログ配列をマルチプルシーケンスアラインメントソフトウェア（ＭＡＦＦＴ）により整列後、系統解析ソフトウェア（ＭＥＧＡ６）を用いて最尤法により系統樹を作成した。これらのデータを祖先配列の確率的再構築のためのソフトウェアであるＦａｓｔＭＬ（http://fastml.tau.ac.il）で解析した。これに基づき、下記表１５に示す６５５アミノ酸のアミノ酸配列（配列番号５）からなる新規な人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＡｒｔＬＡＡＯ５」という）を設計した。
【0092】
【表15】
【0093】
設計されたＡｒｔＬＡＡＯ５のアミノ酸配列について、データベースに存在する配列との同一性（identity）を確認したところ、上記表１に示すホモログとの同一性が最も高く、その同一性は最も高いもので９５．４％であった。しかしながら、ＡｒｔＬＡＡＯ５のアミノ酸配列にはこれら天然のアミノ酸配列には見られない人工的な変異が３０残基以上も含まれていた。これにより、新規な配列を有する人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）が設計されたことがわかった。
【0094】
［実施例１０］
１０．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）の製造
実施例９で得た６５５残基のアミノ酸からなるＡｒｔＬＡＡＯ５をコードする遺伝子（配列番号６）を人工遺伝子合成により作成した。下記表１６にその遺伝子配列を示す。作成したＡｒｔＬＡＡＯ５遺伝子をｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製品）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、ＡｒｔＬＡＡＯ５遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したＡｒｔＬＡＡＯ５発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換を行い、ＡｒｔＬＡＡＯ５生産株を得た。
１０．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）の製造
実施例９で得た６５５残基のアミノ酸からなるＡｒｔＬＡＡＯ５をコードする遺伝子（配列番号６）を人工遺伝子合成により作成した。下記表１６にその遺伝子配列を示す。作成したＡｒｔＬＡＡＯ５遺伝子をｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製品）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、ＡｒｔＬＡＡＯ５遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したＡｒｔＬＡＡＯ５発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換を行い、ＡｒｔＬＡＡＯ５生産株を得た。
【0095】
【表16】
【0096】
得られたＡｒｔＬＡＡＯ５生産株を１ＬのＬＢ培地に植菌して大量培養を行い、実施例７と同様の方法でＡｒｔＬＡＡＯ５タンパク質を回収した。上述したＡｒｔＬＡＡＯ１と同程度の量のタンパク質を回収できた。上記表４に示した活性測定用反応液９０μＬに、回収したＡｒｔＬＡＡＯ５タンパク質を１０μＬ添加してＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性の測定を行い、得られたＡｒｔＬＡＡＯ５がＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有することを確認した。
【0097】
［実施例１１］
１１．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）の活性測定
２０種類のＬ－アミノ酸について、実施例１０で得られた人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）の比活性測定を行った。Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性の測定は、上述した実施例３と同様の方法で行った。ＡｒｔＬＡＡＯ５の２０種類のＬ－アミノ酸についての酵素活性測定結果を以下表１７に示す。
１１．人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）の活性測定
２０種類のＬ－アミノ酸について、実施例１０で得られた人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）の比活性測定を行った。Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性の測定は、上述した実施例３と同様の方法で行った。ＡｒｔＬＡＡＯ５の２０種類のＬ－アミノ酸についての酵素活性測定結果を以下表１７に示す。
【0098】
【表17】
【0099】
表１７に示すように、配列番号５のタンパク質は、８種類の異なるＬ－アミノ酸に対して活性を示した。よって、実施例１０で得られたタンパク質は広くＬ－アミノ酸を酸化可能な酵素であることが明らかとなった。２０種類のＬ－アミノ酸のうち、特に高い活性を示した５つのＬ－アミノ酸（Ｌ－メチオニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－グルタミン及びＬ－グルタミン酸）に関して酵素学的パラメータを決定した。結果を以下表１８に示す。解析の結果、ＡｒｔＬＡＡＯ５はＬ－ロイシンに対する酵素効率が最も高いことが明らかとなった。以上の結果より、本発明のＡｒｔＬＡＡＯは基質選択性の広いＬ－アミノ酸オキシダーゼであることが示された。
【0100】
【表18】
【0101】
［実施例１２］
上述の実施例で得られた３種類の人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１、ＡｒｔＬＡＡＯ４及びＡｒｔＬＡＡＯ５）について、それぞれの耐熱性及び耐久性を調べた。耐熱性については、次のようにして試験を行った。３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃及び８０℃に各々設定したヒートブロックで人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの酵素液を１０分間インキュベートし、氷浴した。以下表１９に示す活性測定用反応液を調製し、ウォーターバスにて３０℃で１０分間インキュベートした。この活性測定用反応液を石英セルに９０μＬ量りとり、熱処理後の各酵素液を１０μＬ添加して、反応を開始し、直ちに紫外可視分光光度計（ＵＶ－２４５０、株式会社島津製作所）で５０５ｎｍの吸光度変化を測定して残存する酵素活性を求めた。結果を図７（Ａ）に示す。
上述の実施例で得られた３種類の人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１、ＡｒｔＬＡＡＯ４及びＡｒｔＬＡＡＯ５）について、それぞれの耐熱性及び耐久性を調べた。耐熱性については、次のようにして試験を行った。３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃及び８０℃に各々設定したヒートブロックで人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの酵素液を１０分間インキュベートし、氷浴した。以下表１９に示す活性測定用反応液を調製し、ウォーターバスにて３０℃で１０分間インキュベートした。この活性測定用反応液を石英セルに９０μＬ量りとり、熱処理後の各酵素液を１０μＬ添加して、反応を開始し、直ちに紫外可視分光光度計（ＵＶ－２４５０、株式会社島津製作所）で５０５ｎｍの吸光度変化を測定して残存する酵素活性を求めた。結果を図７（Ａ）に示す。
【0102】
【表19】
【0103】
他方、耐久性については、次のようにして試験を行った。人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの酵素液を３０℃に設定したヒートブロックで１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間及び１６８時間インキュベートした。表１９に示す活性測定用反応液を調製し、ウォーターバスにて３０℃で１０分間インキュベートした。この活性測定用反応液を石英セルに９０μＬ量りとり、熱処理後の各酵素液を１０μＬ添加して、反応を開始し、直ちに紫外可視分光光度計（ＵＶ－２４５０、株式会社島津製作所）で５０５ｎｍの吸光度変化を測定して残存する酵素活性を求めた。結果を図７（Ｂ）に示す。
【0104】
これらの結果によれば、ＡｒｔＬＡＡＯ１は３０～３５℃での加熱処理では酵素活性に影響はないが、４０～４５℃での加熱処理後には酵素活性が半分程度に減少することが分かった。他方、ＡｒｔＬＡＡＯ４及びＡｒｔＬＡＡＯ５は５５℃での加熱処理を行った後も９割程度の酵素活性を維持しており、耐熱性に優れることが分かった。さらに、ＡｒｔＬＡＡＯ１は３０℃条件下では数時間で酵素活性が１～２割程度に減少するが、酵素活性自体はそのまま１４４時間（６日間）程度残存するため、長時間の反応にも耐えられることがわかった。他方、ＡｒｔＬＡＡＯ４及びＡｒｔＬＡＡＯ５は２４時間後でも３割程度の酵素活性を維持しており、特にＡｒｔＬＡＡＯ４は１６８時間後（７日後）でも３割程度の酵素活性を維持し、耐久性に優れることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0105】
本発明の新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ）は、組換えタンパク質の大量発現が可能であることから安価かつ大量に生産することができ、さらに、広い基質選択性を有することから、Ｄ－アミノ酸又はその誘導体の光学分割に広く利用されるものである。それゆえＡｒｔＬＡＡＯは医薬品原料や原料中間体の合成等に有用である。
【0106】
本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。
【配列表フリーテキスト】
【0107】
配列番号１：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）のアミノ酸配列
配列番号２：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）のアミノ酸配列
配列番号４：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号５：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）のアミノ酸配列
配列番号６：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ１）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）のアミノ酸配列
配列番号４：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ４）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号５：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）のアミノ酸配列
配列番号６：人工Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＡｒｔＬＡＡＯ５）をコードする遺伝子の塩基配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】