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特許7401865機能的な間葉系幹細胞の富化集団を得る方法、それによって得られる細胞、およびその細胞を含む組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-12
(45)【発行日】2023-12-20
(54)【発明の名称】機能的な間葉系幹細胞の富化集団を得る方法、それによって得られる細胞、およびその細胞を含む組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20231213BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231213BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231213BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20231213BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231213BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231213BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/35 20060101ALI20231213BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231213BHJP
C12N 5/0775 20100101ALN20231213BHJP
C07K 14/765 20060101ALN20231213BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61P19/02
A61P37/06
A61P9/00
A61P29/00 101
A61P25/28
A61P29/00
A61P9/10
A61K31/35
A61P43/00 121
C12N5/0775
C07K14/765
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021510380
(86)(22)【出願日】2019-09-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-06
(86)【国際出願番号】 EP2019074991
(87)【国際公開番号】W WO2020058324
(87)【国際公開日】2020-03-26
【審査請求日】2022-08-26
(31)【優先権主張番号】18382679.1
(32)【優先日】2018-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】521075147
【氏名又は名称】シトスピン，エス．エル．
(73)【特許権者】
【識別番号】521075158
【氏名又は名称】ウニベルシダ デ バリャドリード
(74)【復代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】サンチェス ガルシア，アナ
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア－サンチョ マルティン，フランシスコ ハビエル
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア ディアス，ベロニカ
(72)【発明者】
【氏名】アルベルカ サバジョス，メルセデス
(72)【発明者】
【氏名】グエメス グティエレス，サンドラ
【審査官】横田 倫子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５１０９８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０３３９１１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Stem Cell Res., 2017, Vol.19, p.94-103
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００
Ａ６１Ｐ
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療における投与に適した間葉系幹細胞を含む組成物を得るための方法であって、前記方法は、ａ．ジメチルスルホキシドを５％から１０％含む凍結保護培地中に５ｘ１０６から１０ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料を懸濁する工程と、
ｂ．骨髄間葉系幹細胞の試料を、該試料の保存の前の少なくとも２４時間にわたって、液体窒素中で、最初に－７０℃から－９０℃に冷却して、凍結保存する工程と、
ｃ．以下の工程、
ｃ１．１分から５分間、温度を３５～３９℃まで次第に上昇させることにより、骨髄間葉系幹細胞の試料を解凍する工程、
ｃ２．適切な培養培地で試料を初期試料の体積の１０から３０倍に希釈する工程、
ｃ３．試料を遠心分離処理し、上澄み液を廃棄し、そして間葉系幹細胞のペレットを適切な培養培地において再懸濁する工程、
ｃ４．少なくとも７０％の生存率がある間葉系幹細胞を選択する工程、
ｃ５．プラスチック支持体上に工程（ｃ４）において選択された間葉系幹細胞を播種し、７．５％から１０％のＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む適切な培養培地を用いて、１０００から５０００細胞／ｃｍ２の間の細胞濃度で、３５～３９℃の適切な培養条件で、前記間葉系幹細胞をインキュベートする工程、
ｃ６．一定の時間間隔で、７．５％から１０％のＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む新鮮な適切な培養培地に交換し、および、間葉系幹細胞を、その細胞が支持体の表面の８０～１００％を占める時に支持体から単離させる工程、
ｃ７．間葉系幹細胞であって、
－ プラスチックに対する付着性を示し、および、
－ 少なくとも７０％の生存率を呈し、および、
－ ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の９０％以上の発現を呈し、および、
－ ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５の１０％以下の発現、および１０％以下のＨＬＡ－ＤＲの発現を呈し、および、
－ 染色体異常の特徴を持たず、および、
－ 骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を持ち合わせる
間葉系幹細胞を選択する工程
を実行することによって、骨髄間葉系幹細胞の試料を回復させる工程と、
ｄ．機能的な間葉系幹細胞を含む組成物を得るために、工程（ｃ７）において単離された間葉系幹細胞を、２～８℃での輸送および保管に適した培地中に懸濁させる工程であって、ここで、２～８℃での輸送および保管に適した前記培地は、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸０．２５から１ｍＭを含む等張の培地である、工程と
を含む、方法。
【請求項2】
工程（ａ）の凍結保護培地はウシ胎児血清と５％から１０％のＤＭＳＯを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程（ａ）の凍結保護培地は、動物成分がない、無血清の、および無タンパク質の培地であって、５％または１０％のＤＭＳＯを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
工程（ｂ）は、骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の少なくとも２５時間前から、液体窒素中で、－７０℃から－９０℃までの温度で、１℃／分のスピードで、凍結保存することを含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項5】
等張の培地は、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸０．２５ｍＭから１ｍＭを含み、動物成分なしの、無血清、無タンパク質の培地であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項6】
６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸０．２５ｍＭから１ｍＭを含む等張の培地は、Ｎａ＋１３０ｍＭ、Ｋ＋４ｍＭ、Ｃａ２＋１．３５ｍＭ、塩化物１０９ｍＭ、および乳酸塩１６ｍＭを含む第１の組成物と、Ｎａ＋１５９ｍＭ、Ｋ＋５ｍＭ、Ｍｇ２＋０．８ｍＭ、塩化物７７ｍＭ、リン酸二水素２８ｍＭ、クエン酸塩１０ｍＭ、および酢酸塩３２ｍＭを含む第２の組成物との、１：９から９：１の混合物（ｖ／ｖ）を含み、グルコース５ｍＭとヒト血清アルブミン０．１％から０．５％を補充されている、請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物であって、前記細胞はエクスビボの骨髄間葉系幹細胞の試料から得られ、前記凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を低体温輸送し、および治療において局所投与するための、組成物を得るための方法を提供する。最後に、本発明は、記載された方法によって得られ、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む前記組成物の、局所的または全身的処置のいずれかによる、間葉系幹細胞治療が有効な疾病の自己由来または同種異型の処置における、および、とりわけ、変性椎間板疾患、変形性関節症、および骨修復などの骨関節の疾患の処置における、紅斑性狼瘡、移植片対宿主疾患、および他の自己免疫疾患における、末梢血管不全症および他の循環器疾患における、使用法に関する。
【背景技術】
【0002】
臨床的効果を伴う高度な変形性関節症治療のゴールドスタンダードは人工置換である。関節の補綴は、持続期間が制限され、また高価な手術でもあるため、このことは、若い患者において特に問題であり、新しい、潜在的により効果的な治療方法を調査することを正当化する課題である。
【0003】
骨髄には、間質性の始原細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と呼ばれる非造血幹細胞の集団がある。これらの細胞は、多能性、すなわち他の細胞型に分化するそれらの能力によって特徴づけられる。ＭＳＣは繊維芽細胞の紡錘状形態の集団を有し、それは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５抗原を発現し、および、血液生成の抗原、単球のマーカー、マクロファージ、およびＢリンパ球の欠如を示す。加えて、適切な条件下の環境において維持された時、それらは、インビトロで、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への分化能力を保持する。
【0004】
例えば、変形性関節症における、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の関節内の注入は、その認識された再生と抗炎症の潜在能力により、研究の、これらの新しい系統の１つである。
【0005】
動物モデルにおけるＭＳＣを用いた研究は、前記ＭＳＣが関節（椎間板、膝、など）の人体環境への注入後に生き延びる、および、用量依存的な方法において軟骨を修復する、能力を証明した。
【0006】
従って、ＭＳＣは、損傷を受けた、または破壊された骨、軟骨、および他の組織などの組織を、再生させる能力を有する。加えて、免疫反応を調整し、および炎症を制御するそれらの能力は、Ｔリンパ球に対するそれらの作用によって実証されてきた。
【0007】
ＭＳＣは様々な臓器および組織から得ることができるが、骨髄は、その最良で、最も利用可能な源泉の１つを代表する。
【0008】
しかしながら、骨髄におけるＭＳＣの頻度は少なく、骨髄単核細胞のうちたった０．００１～０．０１％の間を占める。事実、単一の全身処置のために、体重１ｋｇにつき１．０ｘ１０６から２．０ｘ１０６までの間のＭＳＣが一般的には使用され、および局所処置において局所的に投与される一回量が２０～４０ｘ１０６細胞におよぶ量になることは、従って、骨髄からそのように大量にインサイチュで直接収集することを不可能にしている。
【0009】
凍結保存は、たった一回量で、骨髄間葉系幹細胞のいくつかのアリコートが投与されることを可能にし、従って、患者への連続的な介入を回避させ、および製造原価の一部を削減させ得る。加えて、それは、我々が結局処置のために様々な投与量を実行することを可能にし、従って、その有効性を改善させる。
【0010】
さらに、凍結保存は、ＭＳＣの同種異系の投与を実行するために必須であり、処置される同じ患者からの新鮮なもので調製される必要があることが、処置を非効率的に、より高価に、およびロジスティックの面でより複雑にしている自己由来のＭＳＣの使用と比較した場合に、コストを削減し、および患者を処置するためにより効率的な方式をもたらしている。
【0011】
しかしながら、凍結保存は簡単な処理手順ではなく、および、しばしば、重大な細胞の病変も、細胞が解凍される時にではなく後の段階でしか明らかにならない隠れた損傷も同様に、もたらす。このことは、損傷を受けた組織を再生させるそれらの能力と、前記再生が実行される速度と、の両方の差別化する性能において、ＭＳＣの機能性を損なわせる。加えて、ＭＳＣが投与される時、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結保存薬剤が懸濁液中に存続する場合に、吐き気、頻脈、徐脈、低血圧などの副作用が報告されている。他方、０．５％程度の低い濃度で細胞培養物に添加されたＤＭＳＯは、インビトロのＭＳＣの増殖の速度を減少させる。
【0012】
他方、同種異系の経路は、自己の細胞が処置しなければならない疾患を生じ、および従って、治癒効果を欠く自己免疫疾患のある患者の処置の可能性を開く。加えて、ＭＳＣは、他の細胞型に比べ免疫原性が非常に低く、および、通常、拒絶反応を触発せず、およびドナーに対する抗ＨＬＡ抗原の生成さえ、全般的に貧弱か、または不検出である（Ｊ Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｎｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｄｉｒｅｃｔ ３ （９）： ｅ２０５）。
【0013】
現在、いくつかの研究が、凍結保存された間葉細胞を解凍後に血流中に、直接および事前の処置なしで、注入することを特色としている。しかしながら、変形性関節症の処置における関節腔内への、または変性椎間板疾患における椎間板内への、ＭＳＣの局所的な注入は、すべての細胞が処置される部位に到達することができ、および、処置が同種異系の場合、ホストの免疫系による攻撃にほとんど影響を受けないため、常に好まれる。他方、局所療法は、凍結保護物質の事前の除去を必要とし、さもなければ、凍結保護物質、多くの場合ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｐｈｏｘｙｄｅ）（ＤＭＳＯ）は、ＭＳＣの増殖の妨げとなる。ＤＭＳＯが除去された場合でさえ、隠れた損傷がある細胞は、生存率の、または代謝のアッセイで検出されず、および、説明されたように、投与されると直ちに、前記隠れた損傷がそれらの生存率を、機能性も同様に、損傷を受けた組織を再生させるそれらの能力と前記再生が実行される速度の両方の分化する性能において、損なわせる。
【0014】
例えば、Ｍａｒｑｕｅｚ－Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ７１（２０１５）１８１－１９７）は、間葉系幹細胞を凍結保存し、および解凍するために使用された様々な条件／プロセスが、得られた細胞生成物にいかに異なった細胞生存率および増殖能力もたらすかについての報告を提供する。具体的に、前記報告は、凍結保存後に得られる細胞生成物の性質を改善する複数の解決策を提唱する。一方、Ｍａｒｑｕｅｚ－Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用を伴う解凍後の細胞生成物の品質を改善し、およびＤＭＳＯの毒性を制限するために、凍結保存のための条件（凍結速度、貯蔵温度、凍結保護物質の％）を調整する様々なプロトコルを記載している。他方、著者たちは、また、特に、ＤＭＳＯの使用に起因する毒性の課題を回避しながら、解凍後に得られる細胞生成物の品質を保つために、グリセロール、トレハロース、ラフィノース、ラクトース、スクロース、などの砂糖、抗酸化剤、アポトーシス阻害剤、またはそれらの混合物、などの他の凍結保護物質を、ガラス化、磁界における凍結、などのプロセスと共に、提案する。凍結保存の状態を調査している間、前記論文は解凍後に生細胞の回復における重大な減少が生じることが知られていることを指摘する、著者らは、培養条件、凍結保存前に細胞を培養すること、アポトーシスを減少させるために、レスベラトロールまたはサルブリナール（ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ）として、化学的修飾物質を使用すること、を指摘することなく、解凍後に細胞を培養することを含む様々な可能な解決法を、単に示唆しただけで、それらの示唆の間にいかなる詳細な指導を提供することもなかった。
【0015】
Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ． （Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｓｕｒｇｅｒｙ， ２０１８；４７：１９－２９） もまた、ＤＭＳＯの毒性の課題を認識し、および、前記凍結保護物質の使用は結果として細胞喪失および集落形成単位のより低い数をもたらすことを指摘しながら、その除去について実践上の複雑さを認める。この意味において、この論文は、十分な表現型、分化と生存率のプロファイルを備えた幹細胞生成物を発展させる先導として、ＤＭＳＯとは異なる、他の凍結保護物質の開発に向かう方向を指しており、それは、ＤＭＳＯの毒性の課題を回避しながら解凍後に直接使用することができる。
【0016】
同じ系統において、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｃｒｙｏｔｈｅｒａｐｙ， ２０１６： １８： ８６０－８６９） は、その毒性の課題のためにＤＭＳＯを置き換える必要性に同意し、および、ＤＭＳＯを置き換え、かつ細胞生成物を得るために、凍結保護物質としてＺＥＮＡＬＢ（登録商標）４．５（タンパク質サプリメント）を提案しており、それは、解凍の直後に、十分な表現型、分化、および生存率のプロファイルを有する。
【0017】
国際特許出願公開ＷＯ ２０１０／０６４０５４ Ａ１も、同様に、普通に用いられている凍結保護物質ＤＭＳＯの毒性を記載して、開発の同じ系統に追随している。その公開は、間葉系幹細胞を含む幹細胞を保存するために、しかし凍結保護物質としてＤＭＳＯを必要とせずにそれらを凍結保存するために、代わりに、ハイポサーモソール（Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ）（登録商標）および酸化防止剤６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸（６－ｈｙｄｒｏｘｙ－２，５，７，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ－２－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（トロロックス（ｔｒｏｌｏｘ））を備えた組成物を提案する。再び、文献ＷＯ ２０１０／０６４０５４ Ａ１は、解凍後直接的に細胞を使用することを提案する。
【0018】
国際特許出願公開ＷＯ ２０１７／０６８１４０ Ａ１は、脂肪に由来する細胞に基づく幹細胞治療を記載する。前記公開は、吸引脂肪組織（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）の間質性の脈管の小片から得られた幹細胞が、生物反応器において培養され、結果的に、少なくとも２度、冷凍および解凍され、および解凍後に直接投与される方法を提案する。
【0019】
従って、先行技術は、凍結保存の後に処置において使用することができる、間葉系幹細胞生成物を含む細胞生成物を開発するための、一般的なリードとして、解凍後の細胞生成物を直接的に使用することと同様に、直面する生存率と毒性の課題を回避するためにＤＭＳＯを置換することを示唆する、ということがわかった。
【0020】
他方、Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ． （Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； ｐａｒｔ Ａ， ｖｏｌ． １９， ｎｕｍｂｅｒｓ ７ ａｎｄ ８， ２０１３） は、生体外で培養する間にＭＳCが受ける酸化ストレスの影響と分化可能性の緩やかな減少、および低下した臨床的有効度を分析する。このため、著者らは、前記酸化損傷を予防するための酸化防止剤としてトロロックスを使用することを提案する。しかしながら、著者らは、トロロックスの補充は初期の培養期間に酸化損傷を低下させることができるが、その一方で、酸化防止剤によって示された有益な効果は、それにもかかわらず、インビトロでの拡大の後でヒトＭＳＣの分化能力を救うことができなかった、と結論する。
【0021】
このため、効率的で標準化されたＭＳＣに基づく治療を開発するための主要な鍵となる課題が、凍結保存または拡大などの前記細胞の操作が、細胞を損傷してそれらの活性、例えば、投与されると直ちに増殖および分化する能力などを損なうことがないことを確実にすることであるのは、明らかである。
【0022】
さらに、一般的には数時間内に失われるそれらの機能性および生存率を、輸送の間に、およびその投与まで保持することができる組成物において、ＭＳＣを製剤化することが必須である。
【0023】
本発明は、凍結保存され、回復され、および輸送調整される、機能的なＭＳＣの富化集団を得る方法を提供し、ここでＭＳＣは、低体温輸送および局所投与のために開発された組成物において製剤化され、それは前述の課題を解決する。
【発明の概要】
【0024】
本発明は、治療における投与に適した、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を得るための方法に関し、前記方法は、
ａ．ジメチルスルホキシドを５％から１０％含む凍結保護培地中に５ｘ１０６から１０ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料を懸濁する工程と、
ｂ．骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の前少なくとも２４時間にわたって、最初に液体窒素中で、－７０℃から－９０℃に冷却して、凍結保存する工程と、
ｃ．以下の工程を実行することによって、骨髄間葉系幹細胞の試料を回復させる工程と；
ｃ１．１分から５分間、温度を３５～３９℃まで次第に上昇させることにより、骨髄間葉系幹細胞の試料を解凍する工程、
ｃ２．適切な培養培地で試料を初期試料の体積の１０から３０倍に希釈する工程と、
ｃ３．試料を遠心分離処理し、上澄み液を廃棄し、そして間葉系幹細胞のペレットを適切な培養培地において再懸濁する工程、
ｃ４．少なくとも７０％の生存率がある間葉系幹細胞を選択する工程、
ｃ５．工程（ｃ４）において選択された間葉系幹細胞をプラスチック支持体上に播種し、前記間葉系幹細胞を、７．５％から１０％までのＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む、適切な培養培地を用いて、１０００から５０００細胞／ｃｍ２の間の細胞濃度で、３５～３９℃の適切な培養条件でインキュベートする工程、
ｃ６．一定の時間間隔で、７．５％から１０％までのＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む新鮮な適切な培養培地に交換し、および、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞を、その細胞が支持体の表面の８０～１００％を占める時に支持体から単離させる、工程、
ｄ．凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な、間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を得るために、工程（ｃ６）において単離された、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を、２～８℃での輸送および保管に適した培地において懸濁させる工程であって、ここで、前記２～８℃での輸送および保管に適した培地は、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を０．２５から１ｍＭ含む等張の培地である、工程と、を含む。
ａ．ジメチルスルホキシドを５％から１０％含む凍結保護培地中に５ｘ１０６から１０ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料を懸濁する工程と、
ｂ．骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の前少なくとも２４時間にわたって、最初に液体窒素中で、－７０℃から－９０℃に冷却して、凍結保存する工程と、
ｃ．以下の工程を実行することによって、骨髄間葉系幹細胞の試料を回復させる工程と；
ｃ１．１分から５分間、温度を３５～３９℃まで次第に上昇させることにより、骨髄間葉系幹細胞の試料を解凍する工程、
ｃ２．適切な培養培地で試料を初期試料の体積の１０から３０倍に希釈する工程と、
ｃ３．試料を遠心分離処理し、上澄み液を廃棄し、そして間葉系幹細胞のペレットを適切な培養培地において再懸濁する工程、
ｃ４．少なくとも７０％の生存率がある間葉系幹細胞を選択する工程、
ｃ５．工程（ｃ４）において選択された間葉系幹細胞をプラスチック支持体上に播種し、前記間葉系幹細胞を、７．５％から１０％までのＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む、適切な培養培地を用いて、１０００から５０００細胞／ｃｍ２の間の細胞濃度で、３５～３９℃の適切な培養条件でインキュベートする工程、
ｃ６．一定の時間間隔で、７．５％から１０％までのＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む新鮮な適切な培養培地に交換し、および、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞を、その細胞が支持体の表面の８０～１００％を占める時に支持体から単離させる、工程、
ｄ．凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な、間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を得るために、工程（ｃ６）において単離された、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を、２～８℃での輸送および保管に適した培地において懸濁させる工程であって、ここで、前記２～８℃での輸送および保管に適した培地は、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を０．２５から１ｍＭ含む等張の培地である、工程と、を含む。
【0025】
本発明は、さらに、本発明の方法によって入手可能である、凍結保存され、回復され、および輸送調整される機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物に関する。
【0026】
さらに、本発明はまた、本発明の方法によって得られる組成物であって、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む、薬剤として使用するための、組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本発明は、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の富化集団を含む組成物をインビトロで得るための方法に関する。前記方法は、
ａ．５％から１０％のジメチルスルホキシドを含む凍結保護培地中に５ｘ１０６から１０ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料を懸濁させる工程と、
ｂ．骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の前少なくとも２４時間にわたって、液体窒素中で、最初に－７０℃から－９０℃に冷却して、温度を下げることによって凍結保存する工程と、
ｃ．以下の工程を実行することによって、骨髄間葉系幹細胞の試料を回復させる工程と；
ｃ１．１分から５分間、温度を３５～３９℃まで次第に上昇させることにより、骨髄間葉系幹細胞の試料を解凍する工程、
ｃ２．適切な培養培地を用いて、試料を試料体積の１０から３０倍に希釈する工程、
ｃ３．試料を遠心分離処理し、上澄み液を廃棄し、および、適切な培養培地中に間葉系幹細胞を再懸濁させる工程、
ｃ４．少なくとも７０％の生存率がある間葉系幹細胞を選択する工程、
ｃ５．プラスチック支持体上に工程（ｃ４）において選択された間葉系幹細胞を播種し、７．５％から１０％のＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む適切な培養培地を用いて、１０００から５０００細胞／ｃｍ２の間の濃度で、３５～３９℃の適切な培養条件で、前記間葉系幹細胞をインキュベートする工程、
ｃ６．一定の時間間隔で、７．５％から１０％のＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む新鮮な適切な培養培地に交換し、および、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を、その細胞が支持体の表面の８０～１００％を占める時に支持体から単離させる工程、
ｄ．凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を得るために、工程（ｃ６）において単離された、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞を、２～８℃での輸送および保管に適した培地中に懸濁させる工程であって、ここで、前記２～８℃での輸送および保管に適した培地は、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を０．２５から１ｍＭを含む等張の培地である、工程と、を含む。
ａ．５％から１０％のジメチルスルホキシドを含む凍結保護培地中に５ｘ１０６から１０ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料を懸濁させる工程と、
ｂ．骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の前少なくとも２４時間にわたって、液体窒素中で、最初に－７０℃から－９０℃に冷却して、温度を下げることによって凍結保存する工程と、
ｃ．以下の工程を実行することによって、骨髄間葉系幹細胞の試料を回復させる工程と；
ｃ１．１分から５分間、温度を３５～３９℃まで次第に上昇させることにより、骨髄間葉系幹細胞の試料を解凍する工程、
ｃ２．適切な培養培地を用いて、試料を試料体積の１０から３０倍に希釈する工程、
ｃ３．試料を遠心分離処理し、上澄み液を廃棄し、および、適切な培養培地中に間葉系幹細胞を再懸濁させる工程、
ｃ４．少なくとも７０％の生存率がある間葉系幹細胞を選択する工程、
ｃ５．プラスチック支持体上に工程（ｃ４）において選択された間葉系幹細胞を播種し、７．５％から１０％のＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む適切な培養培地を用いて、１０００から５０００細胞／ｃｍ２の間の濃度で、３５～３９℃の適切な培養条件で、前記間葉系幹細胞をインキュベートする工程、
ｃ６．一定の時間間隔で、７．５％から１０％のＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む新鮮な適切な培養培地に交換し、および、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を、その細胞が支持体の表面の８０～１００％を占める時に支持体から単離させる工程、
ｄ．凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を得るために、工程（ｃ６）において単離された、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞を、２～８℃での輸送および保管に適した培地中に懸濁させる工程であって、ここで、前記２～８℃での輸送および保管に適した培地は、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を０．２５から１ｍＭを含む等張の培地である、工程と、を含む。
【0028】
適切な培養培地は、少なくとも５％のウシ胎児血清を、７．５％から１０％のＣＯ２と必要な量の－ＨＣＯ３と共に含む。この意味において、適切な培養培地中のＣＯ２と－ＨＣＯ３の割合は、７．５％から１０％までのＣＯ２と、少なくとも５％のウシ胎児血清の濃度とを含めて、一定のままである。
【0029】
好ましくは、前記方法は、凍結保存され、回復され、および輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を選択する付加的な工程（ｃ７）をさらに含み、それらは、
－ プラスチックに対する接着性を示し、および、
－ 少なくとも７０％の生存率を呈し、および、
－ ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の９０％以上の発現を呈し、および、
－ ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５の１０％以下の発現、および１０％以下のＨＬＡ－ＤＲの発現を呈し、および、
－ 染色体異常の特徴を持たず、および、
－ 骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を呈する。
－ プラスチックに対する接着性を示し、および、
－ 少なくとも７０％の生存率を呈し、および、
－ ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の９０％以上の発現を呈し、および、
－ ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５の１０％以下の発現、および１０％以下のＨＬＡ－ＤＲの発現を呈し、および、
－ 染色体異常の特徴を持たず、および、
－ 骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を呈する。
【0030】
用語「等張の培地」は、本発明の目的上、同じ有効なオスモル濃度を持っていることにより、または、細胞よりも非浸透性の溶質濃度、つまり、細胞の内部に対して同じ浸透圧を持っていることにより、細胞の体積を保存する溶液のことを指す。従って、細胞が前記溶液において懸濁され、およびそこで懸濁された細胞の体積を維持する時、懸濁された、等張溶液は、細胞膜を超えて水の自由な交換を可能にする。
【0031】
６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２ －カルボン酸、またはトロロックスは、ビタミンＥアナログである。
【0032】
さらに好ましい実施形態では、前記２～８℃での輸送および保管に適した、０．２５ｍＭから１ｍＭの６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸を含んでいる、等張の培地は、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を０．２５ｍＭから１ｍＭ含む、動物成分を含まない、無血清の、無タンパク質の、培地である。
【0033】
さらに好ましい実施形態では、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を０．２５ｍＭから１ｍＭ含む前記等張の培地は、Ｎａ＋１００ｍＭ、Ｋ＋４２．５ｍＭ、Ｃａ２＋０．０５ｍＭ、Ｍｇ２＋５ｍＭ、塩化物１７ｍＭ、リン酸二水素１０ｍＭ、ＨＣＯ３５ｍＭ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ペラジニルエタンスルホン酸（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＨＥＰＥＳ）２５ｍＭ、ラクトビオン酸塩１００ｍＭ、スクロース２０ｍＭ、マンニトール２０ｍＭ、４００００の質量平均分子量を持つデキストラン６％、アデノシン２ｍＭ、グルタチオン３ｍＭ、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミン０．５％、および６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸１ｍＭを含む、培地である。
【0034】
別の好ましい実施形態では、前記等張の培地は、Ｎａ＋１３０ｍＭ、Ｋ＋４ｍＭ、Ｃａ２＋１．３５ｍＭ、塩化物１０９ｍＭ、および乳酸塩１６ｍＭを含む第１の組成物とＮａ＋１５９ｍＭ、Ｋ＋５ｍＭ、Ｍｇ２＋０．８ｍＭ、塩化物７７ｍＭ、リン酸二水素２８ｍＭ、クエン酸塩１０ｍＭ、および酢酸塩３２ｍＭを含む第２の組成物との１：９から９：１の混合物（ｖ／ｖ）を含み、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミン０．１％から０．５％、および６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸０．２５から１ｍＭで補充される。
【0035】
さらに好ましい実施形態では、前記等張の培地は、前記第１の組成物と前記第２の組成物の、１：９の、または１：４の、または１：３の、または１：１の、または３：１の、または４：１の、または９：１の混合物（ｖ／ｖ）を含み、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミン０．１％から０．５％、および６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸０．２５から１ｍＭで補充される。
【0036】
さらに好ましい実施形態では、前記等張の培地は、前記第１の組成物と前記第２の組成物の、１：１の混合物（ｖ／ｖ）を含み、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミンから０．５％、および６ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２カルボキシル酸０．５ｍＭで補充される。
【0037】
またさらに好ましい実施形態では、前記等張の培地は、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミン０．５％、および６ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２カルボキシル酸０．５ｍＭを含む。
【0038】
またさらに好ましい実施形態では、前記等張の培地は、ヒト血清アルブミン０．５％、および６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸１ｍＭを含む。
【0039】
本発明は、また、治療における投与に適した、凍結保存され、回復され、および輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞富化集団を含む組成物であって、上に記載された、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の機能的な集団をインビトロで得る方法によって、入手可能である、組成物にも関する。
【0040】
本発明の一実施形態は治療における投与に適した、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物であって、上に記載された方法によって入手可能であり、薬剤として使用するための、特に間葉系幹細胞治療が有効な疾患の処置において使用するための、組成物に関する。
【0041】
別の実施形態は、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物であって、上に記載された方法によって入手可能であり、間葉系幹細胞治療が有効な疾患の処置において使用するための組成物に関し、ここで、凍結保存され、回復され、輸送調整される機能的な間葉系幹細胞集団を含む前記組成物は、局所的に、または全身処置において投与される。
【0042】
別の実施形態は、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物であって、上に記載された方法によって入手可能であり、骨関節疾患、骨修復の処置、自己免疫疾患、および循環器疾患において使用するための、組成物に関する。
【0043】
一実施形態では、骨関節の疾患は、変性椎間板疾患、変形性関節症、半月板損傷、および関節リウマチから選択される。
【0044】
一実施形態において、自己免疫疾患は、紅斑性狼瘡、移植片対宿主疾患および全身性硬化症から選択される。
【0045】
一実施形態において、循環器疾患は、末梢血管不全、心筋梗塞、脳卒中、および虚血から選択される。
【0046】
凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的なＭＳＣの富化集団を含む前記組成物は、解凍後に、およびまた２から８℃で低体温輸送する間にも、少なくとも７２時間、新鮮なＭＳＣの機能を保持することができる。
【0047】
本発明の目的上、骨髄間葉系幹細胞は、それらの中胚葉の多分化能によって特徴づけられる、骨髄の中に存在する非造血幹細胞であり、および、それは、従って、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞へと分化することができる。
【0048】
本発明によると、用語「機能的な間葉系幹細胞の集団」は、間葉系幹細胞治療が有効な疾患の処置における使用に適した、間葉系幹細胞の一分量を含む、間葉系幹細胞の試料を指し、および、ここで、前記試料は、新鮮な間葉系幹細胞の機能的な特性を持つ、つまり、プラスチックに対する接着性を示す、間葉系幹細胞だけを含み、少なくとも７０％の生存率を呈し、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の９０％以上の発現を呈し、および、ＣＤ１４，ＣＤ３４，ＣＤ４５の１０％以下の発現、および１０％以下のＨＬＡ－ＤＲを呈し、染色体異常の特徴を示さず、および骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞へと分化する能力を持つ。
【0049】
本発明の目的上、「機能的な間葉系幹細胞の富化集団」は、機能的な間葉系幹細胞であって、プラスチックに対する接着性を示し、少なくとも７０％の生存率を示し、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の９０％以上の発現を呈し、および、ＣＤ１４，ＣＤ３４，ＣＤ４５の１０％以下の発現、および１０％以下のＨＬＡ－ＤＲの発現を呈し、染色体異常の特徴を示さず、および骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞へと分化する能力を持つ、機能的な間葉系幹細胞の少なくとも０．５ｘ１０６の群を指す。
【0050】
本発明の目的上、用語「凍結保存された細胞」は－７０℃またはより低い温度で維持された細胞であって、低温保存しているため、代謝活性または化学的活性であって、実質的に止められた細胞に損傷を与える恐れがある、実質的にあらゆる活性を持つ、細胞である。
【0051】
本発明の目的上、用語「凍結保存され、および回復される細胞」または、「凍結保存され、および回復される間葉系幹細胞の試料」およびそれらの同義語は、本発明の方法により、予め凍結保存され、解凍され、希釈され、単離され、および、少なくとも５％のウシ胎児血清と高レベルのＣＯ２を含む適切な培養培地において３５～３９℃で培養された間葉系幹細胞であり、ここで、前記凍結保存され、および回復される細胞は、新鮮な間葉系幹細胞の実質的にすべての代謝および化学的活性を示し、少なくとも７０％の生存率、より好ましくは少なくとも８０％の生存率、およびさらに好ましくは、少なくとも９０％の生存率を有する。
【0052】
本発明の目的上、用語「凍結保存され、回復され、および輸送調整される細胞」または「凍結保存され、回復され、および輸送調整される間葉系幹細胞」およびそれらの同義語は、予め凍結保存され、および少なくとも５％のウシ胎児血清と高レベルのＣＯ２を含む適切な培養培地において、３５～３９℃で回復された間葉系幹細胞を指し、それは単離後に、トロロックスを０．２５ｍＭから１ｍＭ含む、２～８℃での輸送および保管に適した等張の培地を含む懸濁液において、輸送調整される。この意味において、本発明の目的上、用語「調整された」は、「輸送のために調整された」と、または「輸送調整された」と、または「２～８℃での輸送と保管のために調整された」と同義である。
【0053】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」は、一群の特徴を含むが、それらが請求項を実施不可能にしない限り、他の特徴の存在を除外しないことを意味すると解釈される。この目的のために、本発明の目的上、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」は、用語「～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ～）」および用語「本質的に～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」と取り替えられてもよい。このようにして、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」が特徴Ａ、Ｂ、およびＣの群を指すとき、それらが請求項を実施不可能にしない限り、最終的にＡ、Ｂ、およびＣとは異なる様々な他の特徴を含めると解釈されるべきであるが、また、前記特徴Ａ、Ｂ、およびＣのみを含めて考えること、または、実質的に言及された特徴だけを含めることと解釈される場合もあり、従って、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」は、特徴Ａ、Ｃ、およびＣ「から成る」群、および特徴Ａ、Ｂ、およびＣ「から本質的に成る」群も含めることと解釈されるべきである。
【0054】
本発明の方法において使用される間葉系幹細胞は、エクスビボ骨髄単核細胞に由来する。前記エクスビボ骨髄単核細胞は、エクスビボ造血幹細胞、エクスビボ間葉系幹細胞、およびエクスビボ内皮始原細胞、および他の前駆幹細胞を含む、いくつかのタイプのエクスビボ骨髄幹細胞を含む。外傷後、細胞増殖因子は骨髄ＭＳＣの組織分化を促進し、それ故に、損傷した臓器の修復と臓器機能の復旧を可能にすることがあり得る。
【0055】
ＭＳＣは、培養物における、プラスチックに対する強い接着性を特色とする。この接着能力は、骨髄単核細胞からの前記ＭＳＣの単離および精製のために使用される。
【0056】
好ましくは、治療における投与に適した、凍結保存され、回復され、および輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞富化集団を含む組成物を得るための方法は、１０～１５日間で実行される。
【0057】
好ましい実施形態において、骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料は、少なくとも８ｘ１０６の骨髄間葉系幹細胞を含む。
【0058】
好ましい実施形態において、骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料は、８ｘ１０６から１０ｘ１０６の骨髄間葉系幹細胞を含む。
【0059】
好ましくは、エクスビボ試料は、少なくとも９０％の生存率がある骨髄間葉系幹細胞を含む。
【0060】
好ましくは、エクスビボ試料は、少なくとも９０％の生存率があり、９０％以上のＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の発現と、１０％以下のＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲの発現とを伴う、８ｘ１０６から１０ｘ１０６の間葉系幹細胞を含む。
【0061】
好ましい実施形態において、エクスビボ骨髄間葉系幹細胞試料はプラスチック支持体において提供され、酵素法を使用して、プラスチック支持体から分離され、および、適切な培養培地で再懸濁される。
【0062】
好ましいプラスチック支持体は、親水性のプラスチック支持体、または負に帯電したプラスチック支持体である。好ましい実施形態において、前記好ましいプラスチック支持体は親水基を含む。好ましい実施形態において、前記好ましいプラスチック支持体は、親水性の性質を有する、組織処理（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｒｅａｔｅｄ）されたプラスチック支持体である。前記好ましいプラスチック支持体の商用の例はコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）支持体である。
【0063】
好ましい実施形態では、工程（ａ）に先立って、
ｉ． プラスチック支持体において適切な培養培地でエクスビボ骨髄間葉系幹細胞試料を洗浄する工程と、
ｉｉ． 酵素溶液を添加し、および、使用される培養培地に適切な条件でインキュベートする工程と、
ｉｉｉ． 等しい体積の培養培地を添加することにより酵素溶液を不活性化する工程と、
ｉｖ． 遠心分離処理し、および、上澄み液を廃棄する工程と、が行われる。
ｉ． プラスチック支持体において適切な培養培地でエクスビボ骨髄間葉系幹細胞試料を洗浄する工程と、
ｉｉ． 酵素溶液を添加し、および、使用される培養培地に適切な条件でインキュベートする工程と、
ｉｉｉ． 等しい体積の培養培地を添加することにより酵素溶液を不活性化する工程と、
ｉｖ． 遠心分離処理し、および、上澄み液を廃棄する工程と、が行われる。
【0064】
好ましい実施形態では、工程（ｉ）において細胞を洗浄するために適切な培地はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）である。
【0065】
別の好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ、イーグルの最少必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ヌクレオシド、グルコースなどで改変されたイーグルの最少必須培地、または、任意の他の適切な培養培地から選択された培養培地において実行される。
【0066】
好ましい実施形態では、適切な培地がＤＭＥＭである時、工程（ｉｉ）は酵素溶液を添加し、および、５～１０分間、３５～３７℃で、より好ましくは３７℃で、１０％ＣＯ２下で、インキュベートすることを含む。
【0067】
いずれの場合も、当業者は、工程（ｉ）の培養を行なうために可能な変更と同様に、どの培養培地および条件が可能であるかを認識するだろう。
【0068】
好適に、工程（ｉｉ）において使用される酵素溶液は０．０５％のトリプシンと０．０２％のエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ） 四ナトリウム（ｔｅｔｒａ ｓｏｄｉｕｍ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）をハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋｓ′ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に含む。
【0069】
工程（ｉｉ）において使用される酵素溶液の商用の例は、トリプシン－ＥＤＴＡ １Ｘ溶液（Ｓｉｇｍａ ９４１７Ｃ）である。
【0070】
好ましくは、工程（ｉｖ）は、試料を５から１０分間、１５から２５℃にて、３００～５００ｇで、より好ましくは５分間２０℃にて４００ｇで、遠心分離処理することを含む。
【0071】
好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、少なくとも９０％の生存率があり、９０％以上のＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の発現と、１０％以下のＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲの発現とを伴う、８ｘ１０６から１０ｘ１０６の間葉系幹細胞の試料を提供すること含む。
【0072】
好ましくは、工程（ａ）において使用される骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料は、以下の工程を含む方法によって得られる：
Ｉ． 少なくとも３０ｍｌのフィルタリングされた骨髄穿液のエクスビボ試料を提供する工程、
ｉｉ． エクスビボ骨髄穿刺液を抗凝血剤にさらす工程、
ｉｉｉ． エクスビボ骨髄穿刺液から単核細胞を選択する工程、
ＩＶ． ７０％を超える生存率を伴う単核細胞を選択する工程、
Ｖ． 適切な培養培地中の、プラスチック支持体に１．５ｘ１０６から２ｘ１０６細胞／ｃｍ２で単核細胞を播種し、および適切な培養条件においてそれらをインキュベートする工程、
ＶＩ． 細胞増殖パーセンテージおよびプラスチック支持体に接着した間葉系幹細胞の外観を一定の時間間隔で測定する工程、
ＶＩ．１ 細胞増殖パーセンテージが６０％未満である時、上澄み液を取り除いて、培養培地を替える工程、
ＶＩ．２ 細胞増殖パーセンテージが８０％を超えれば、プラスチック支持体に接着した間葉系幹細胞の試料を単離させる工程、
ＶＩ．３ 前記間葉系幹細胞を増加させ、および純化するために、２継代まで継代培養を実行し、および、増殖パーセンテージが８０％以上である場合、継代培養の各々からのプラスチック支持体に接着した間葉系幹細胞を単離させる工程。
Ｉ． 少なくとも３０ｍｌのフィルタリングされた骨髄穿液のエクスビボ試料を提供する工程、
ｉｉ． エクスビボ骨髄穿刺液を抗凝血剤にさらす工程、
ｉｉｉ． エクスビボ骨髄穿刺液から単核細胞を選択する工程、
ＩＶ． ７０％を超える生存率を伴う単核細胞を選択する工程、
Ｖ． 適切な培養培地中の、プラスチック支持体に１．５ｘ１０６から２ｘ１０６細胞／ｃｍ２で単核細胞を播種し、および適切な培養条件においてそれらをインキュベートする工程、
ＶＩ． 細胞増殖パーセンテージおよびプラスチック支持体に接着した間葉系幹細胞の外観を一定の時間間隔で測定する工程、
ＶＩ．１ 細胞増殖パーセンテージが６０％未満である時、上澄み液を取り除いて、培養培地を替える工程、
ＶＩ．２ 細胞増殖パーセンテージが８０％を超えれば、プラスチック支持体に接着した間葉系幹細胞の試料を単離させる工程、
ＶＩ．３ 前記間葉系幹細胞を増加させ、および純化するために、２継代まで継代培養を実行し、および、増殖パーセンテージが８０％以上である場合、継代培養の各々からのプラスチック支持体に接着した間葉系幹細胞を単離させる工程。
【0073】
好ましくは、骨髄穿刺液のエクスビボ試料から工程（ａ）の骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料を得る方法は、８～１０日間で実行される。
【0074】
一実施形態では、工程（ＩＩ）において使用される抗凝血剤はヘパリンである。
【0075】
一実施形態工程において、工程（ＩＩＩ）は、エクスビボ硬骨吸引液から単核細胞を密度勾配によって選択することを含む。
【0076】
好ましくは、工程（ＩＩＩ）は、フィコールを含む溶液を使用して、エクスビボ硬骨吸引液から単核細胞を密度勾配によってインビトロで選択することを含み、前記工程（ＩＩＩ）は、
ＩＩＩ．１ エクスビボ骨髄穿刺液試料にフィコール溶液をゆっくり加える工程と、
ＩＩＩ．２ 試料を、１５から２５℃にて少なくとも３０分間止めることなく、３００～５００ｇで、遠心分離処理する工程と、
ＩＩＩ．３ 適切な培養液で界面を分離させ、および、洗浄する工程と、
ＩＩＩ．４ 遠心分離処理して上澄み液を廃棄する工程と、
ＩＩＩ．５ 適切な培養液でペレットを洗浄する工程と、
ＩＩＩ．６ 遠心分離処理して上澄み液を廃棄する工程と、
ＩＩＩ．７ 単核細胞を備えたペレットを適切な培養培地中に再懸濁させる工程と、を含む。
ＩＩＩ．１ エクスビボ骨髄穿刺液試料にフィコール溶液をゆっくり加える工程と、
ＩＩＩ．２ 試料を、１５から２５℃にて少なくとも３０分間止めることなく、３００～５００ｇで、遠心分離処理する工程と、
ＩＩＩ．３ 適切な培養液で界面を分離させ、および、洗浄する工程と、
ＩＩＩ．４ 遠心分離処理して上澄み液を廃棄する工程と、
ＩＩＩ．５ 適切な培養液でペレットを洗浄する工程と、
ＩＩＩ．６ 遠心分離処理して上澄み液を廃棄する工程と、
ＩＩＩ．７ 単核細胞を備えたペレットを適切な培養培地中に再懸濁させる工程と、を含む。
【0077】
好ましい実施形態工程において、工程Ｉは、エクスビボ骨髄穿刺液試料に比率２：３ （ｖｏｌ：ｖｏｌ）でフィコール溶液をゆっくり加えることを含む。
【0078】
好ましい実施形態において、洗浄は０．５のヒト血清アルブミンを含有しているリン酸緩衝液を用いて実行される。
【0079】
別の好ましい実施形態では、工程ＩＩＩ．３において、洗浄は、生理食塩液を用いて実行される。
【0080】
別の好ましい実施形態では、洗浄はリンゲル液を用いて実行される。
【0081】
好ましくは、工程ＩＩＩ．４は、試料を５から１０分間、１５から２５℃にて、３００～５００ｇで、より好ましくは５分間２０℃にて４００ｇで、遠心分離処理することを含む。
【0082】
好ましくは、工程ＩＩＩ．６は、試料を５から１０分間、１５から２５℃にて、３００～５００ｇで、より好ましくは５分間２０℃にて４００ｇで、遠心分離処理することを含む。
【0083】
好ましい実施形態では、工程（ＩＶ）において選択された単核細胞は、７０％を超える、好ましくは８０％を超える、および最も好ましくは９０％を超える、生存率を有する。
【0084】
好ましくは、単核細胞の生存率は、色素排除試験を使用して決定される。前記色素排除試験は、生きている細胞はトリパンブルーなどの特定の染料を排除する無傷の細胞膜を持つが、死細胞はそうではない、という原理に基づく。この試験では、細胞懸濁液は、染料と単に混合され、そして、細胞が染料を取り込むか排除するかを視覚的に決定するために検査される。従って、染料を排除する細胞は生きている細胞である。
【0085】
好ましい実施形態では、工程Ｖは、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ、イーグルの最少必須培地、ヌクレオシド、グルコースなどで改変されたイーグルの最少必須培地、または、任意の他の適当な培養培地から選択された培養培地において実行される。
【0086】
好ましい実施形態工程では、工程Ｖは、少なくとも５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を伴うＤＭＥＭ中のプラスチック支持体に１．５ｘ１０６から２ｘ１０６細胞／ｃｍ２で単核細胞を播種し、および、７．５％から１０％のＣＯ２のもとで、３５～３９℃にてインキュベートして、実行される。培養培地は、好ましくは、少なくとも５％のウシ胎児血清を７．５％から１０％のＣＯ２、および必要な量の－ＨＣＯ３と共に含む。
【0087】
別の好ましい実施形態では、工程Ｖは、少なくとも５％のＦＢＳと０．５％のゲンタマイシンを伴うＤＭＥＭ中のプラスチック支持体に１．５ｘ１０６から２ｘ１０６細胞／ｃｍ２で単核細胞を播種し、および、７．５～１０％のＣＯ２のもとで、３５～３９℃にてインキュベートして、実行される。
【0088】
好ましいプラスチック支持体は、親水性のプラスチック支持体、または負に帯電したプラスチック支持体である。好ましい実施形態において、前記好ましいプラスチック支持体は親水基を含む。好ましい実施形態において、前記好ましいプラスチック支持体は、親水性の性質を有する、組織処理されたプラスチック支持体である。前記好ましいプラスチック支持体の商用の例は、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）支持体である。
【0089】
いずれの場合も、当業者は、工程（Ｖ）の培養を行なうために可能な変更と同様に、どの培養培地および条件が可能であるかを認識するだろう。
【0090】
好ましくは、工程ＶＩにおいて、細胞増殖パーセンテージが６０～８０％未満の場合には、培養培地の交換が行なわれる。
【0091】
好ましくは、工程ＶＩにおいて、それが８０％より多かった場合、細胞培養は、ＭＳＣの細胞系統を、増加させ、および純化するために２継代までの継代培養を実行することにより、細胞解離と拡大に進められる。
【0092】
好ましい実施形態において、工程（ＶＩ．３）は、継代培養の各々からのプラスチック支持体に対して接着した間葉系幹細胞を単離する工程を含み、ここでは、単離する工程は、
ｉ． 適切な培養培地を用いてプラスチック支持体中の骨髄間葉系幹細胞試料を洗浄する工程と、
ｉｉ． 酵素溶液を添加し、使用した培養培地に適切な条件において培養する工程と、
ｉｉｉ． 等しい体積の培養培地を添加することにより酵素溶液を不活性化する工程と、
ｉｖ． 遠心分離処理して上澄み液を廃棄する工程と、を含む。
ｉ． 適切な培養培地を用いてプラスチック支持体中の骨髄間葉系幹細胞試料を洗浄する工程と、
ｉｉ． 酵素溶液を添加し、使用した培養培地に適切な条件において培養する工程と、
ｉｉｉ． 等しい体積の培養培地を添加することにより酵素溶液を不活性化する工程と、
ｉｖ． 遠心分離処理して上澄み液を廃棄する工程と、を含む。
【0093】
好ましい実施形態において、工程（ｉ）において細胞を洗浄するためにふさわしい培養培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。
【0094】
好ましい実施形態において、適切な培養培地がＤＭＥＭである時、工程（ｉｉ）は、酵素溶液を添加し、および１０％ＣＯ２下で３５から３９℃にて５～１０分間インキュベートすることを含む。
【0095】
好ましくは、工程（ｉｉ）において使用される酵素溶液は、０．０５％のトリプシンおよび０．０２％および０．０５％のエチレンジアミン四酢酸塩ナトリウムを含有している溶液である。好ましくは、工程（ｉｉ）において使用される酵素の溶液は０．０５％のトリプシンおよび０．０２％のエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）四ナトリウムをハンクス平衡塩溶液中に含む。
【0096】
好ましくは、工程（ｉｖ）の遠心分離処理は、１５から２５℃にて、および３０分間、３００～５００ｇで実行される。
【0097】
いずれの場合でも、当業者は、工程（ＶＩＩ）の間葉系幹細胞の単離を行なうことが可能な様々な培養培地と条件を、可能な変更と同様に、認識するだろう。
【0098】
好ましい実施形態において、工程（ａ）で使用するための、上記で得られた間葉系幹細胞のエクスビボ試料は、少なくとも９０％の生存率を有し、９０％以上のＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の発現と、１０％以下のＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲの発現とを伴う。
【0099】
好ましい実施形態において、生体外の骨髄穿刺液試料は、３０００白血球／μｌを超える白血球を含有している。
【0100】
好ましい実施形態において、エクスビボ骨髄穿刺液試料はエクスビボ腸骨稜骨髄吸引液試料である。
【0101】
好ましい実施形態において、工程（ａ）の凍結保護培地は、ウシ胎児血清、および５から１０％のＤＭＳＯを含む培地を含む。
【0102】
別の好ましい実施形態では、工程（ａ）の凍結保護培地は、５％のＤＭＳＯ、および９５％のウシ胎児血清を含む。
【0103】
別の好ましい実施形態では、工程（ａ）の凍結保護培地は、１０％のＤＭＳＯ、および９０％のウシ胎児血清を含む。
【0104】
別の好ましい実施形態では、工程（ａ）の凍結保護培地は、５％のＤＭＳＯを含む、動物成分なしの、無血清の、無タンパク質の培地を含む。
【0105】
別のさらに好ましい実施形態では、工程（ａ）の凍結保護培地は、１０％のＤＭＳＯを含む、動物成分なしの、無血清の、無タンパク質の培地を含む。
【0106】
好ましい実施形態において、工程（ａ）の凍結保護培地は、ＤＭＳＯを５～１０％含み、および、Ｎａ＋１００ｍＭ、Ｋ＋４２．５ｍＭ、Ｃａ２＋０．０５ｍＭ、Ｍｇ２＋５ｍＭ、塩化物１７ｍＭ、二水素リン酸１０ｍＭ、ＨＣＯ３
－５ｍＭ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニルエタンスルホン酸塩（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＨＥＰＥＳ）２５ｍＭ、ラクトビオン酸１００ｍＭ、スクロース２０ｍＭ、マンニトール２０ｍＭ、平均分子量４００００のデキストラン ６％、アデノシン２ｍＭ、グルタチオン３ｍＭ、グルコース５ｍＭ、を含む、等張の組成物を９０から９５％含む。
【0107】
好ましい実施形態において、工程（ａ）の凍結保護培地は、ＤＭＳＯを５％含み、および、Ｎａ＋１００ｍＭ、Ｋ＋４２．５ｍＭ、Ｃａ２＋０．０５ｍＭ、Ｍｇ２＋５ｍＭ、塩化物１７ｍＭ、二水素リン酸１０ｍＭ、ＨＣＯ３
－５ｍＭ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニルエタンスルホン酸塩（ＨＥＰＥＳ）２５ｍＭ、ラクトビオン酸１００ｍＭ、マンニトール２０ｍＭ、４００００の平均分子量を伴うデキストラン６％、アデノシン２ｍＭ、グルタチオン３ｍＭ、グルコース５ｍＭ、を含む、等張の組成物を９０から９５％含む。
【0108】
好ましい実施形態において、工程（ａ）の凍結保護培地は、ＤＭＳＯを１０％含み、Ｎａ＋１００ｍＭ、Ｋ＋４２．５ｍＭ、Ｃａ２＋０．０５ｍＭ、Ｍｇ２＋５ｍＭ、塩化物１７ｍＭ、二水素リン酸１０ｍＭ、ＨＣＯ３
－５ｍＭ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニルエタンスルホン酸塩（ＨＥＰＥＳ）２５ｍＭ、スクロース２０ｍＭラクトビオン酸１００ｍＭ、マンニトール２０ｍＭ、４００００の平均分子量を伴うデキストラン６％、アデノシン２ｍＭ、グルタチオン３ｍＭ、グルコース５ｍＭ、を含む、等張の組成物を９０から９５％含む。
【0109】
好ましい実施形態において、工程（ｂ）は、骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の前少なくとも２５時間、液体窒素中で、－７０℃から－９０℃の温度まで、１℃／分のスピードで、凍結保存することを含む。
【0110】
好ましくは、凍結保存された間葉系幹細胞を回復する工程（ｃ）は、最長６から２０年になり得る処置のために設定された日付に従って始まる。
【0111】
好ましくは、工程（ｃ１）は、１５から２０分間ですばやく実行される。
【0112】
好ましくは、工程（ｃ１）は、制御された温度上昇速度を維持しながら、１から５分間、温度を３５～３９℃まで次第に上昇させることによって、凍結保存された間葉系幹細胞を解凍することを含む。工程（ｃ１）において凍結保存された間葉系幹細胞を解凍するために適当な装置は、ＴｈａｗＳＴＡＲ（登録商標）ＣＦＴ２である。
【0113】
好ましい実施形態では、工程（ｃ２）の適切な培養培地は、少なくとも５％のウシ胎児血清と７．５％から１０％のＣＯ２を伴った、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）である。培養培地は、好ましくは、７．５％から１０％のＣＯ２を伴う少なくとも５％のウシ胎児血清、および必要な量の－ＨＣＯ３を含む。
【0114】
別の好ましい実施形態では、工程（ｃ２）の適切な培養培地は、７．５％から１０％のＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ、イーグルの最少必須培地、ヌクレオシドやグルコースなどで改変されたイーグルの最少必須培地、または、他の任意の適切な培養培地から選択される。
【0115】
いずれの場合も、当業者は、どれが、少なくとも５％のＦＢＳ、と高レベルのＣＯ２と－ＨＣＯ３を含み、および３５～３９℃の条件で、使用可能な培養培地かを、工程（ｃ２）の培養を行なうために可能な変更と同様に、認識するだろう。
【0116】
好ましくは、工程（ｃ３）は試料を遠心分離処理することと、上澄み液を廃棄すること、および、１ｘ１０６から５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で適切な培養培地において間葉系幹細胞を再懸濁することと、を含む。好ましくは、前記適切な培養培地は、７．５％から１０％のＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む。
【0117】
好ましくは、工程（ｃ３）は、５～１０分間、１５から２５℃にて３００～５００ｇで、より好ましくは、５分間、２０℃にて４００ｇで、試料を遠心分離処理することを含む。
【0118】
好ましくは、工程（ｃ４）において、間葉系幹細胞の細胞生存率は、色素排除試験を使用して決定される。
【0119】
好ましくは、工程（ｃ４）において、間葉系幹細胞の細胞生存率は、トリパンブルーを使用して決定される。
【0120】
前記色素排除試験は、生きている細胞は、トリパンブルー、エオシン、またはプロピジウムなどの特定の染料を排除する無傷の細胞膜を持つが、死細胞はそうではない、という原理に基づく。この試験では、細胞懸濁液は、染料と単に混合され、そして、細胞が染料を取り込むか排除するかを視覚的に決定するために検査される。従って、染料を排除する細胞は生きている細胞である。
【0121】
好ましくは、工程（ｃ６）は、一定の時間間隔で、高レベルのＣＯ２を含む、好ましくは少なくとも５％のウシ胎児血清と７．５％から１０％のＣＯ２を含む適切な培養培地を新鮮なものに交換することを含み、および、細胞が支持体の表面の８０～１００％を占める時、凍結保存され回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を支持体から単離させることを含む。
【0122】
好ましい実施形態において、工程（ｃ５）および（ｃ６）の適切な培地は、７．５％から１０％のＣＯ２、必要とされる量の－ＨＣＯ３、および少なくとも５％のウシ胎児血清を伴うダルベッコ改変イーグル培地である。
【0123】
別の好ましい実施形態では、工程（ｃ５）および（ｃ６）の適切な培養培地は、７．５％から１０％のＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を伴う、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ、イーグルの最少必須培地、または、他の任意の適切な培養培地から選択される。
【0124】
好ましくは、工程（ｃ５）および（ｃ６）の培養は、少なくとも５％のウシ胎児血清を含む適切な培養培地で、７．５％から１０％のＣＯ２を伴って、３５～３９℃に維持されるだろう。培養培地は、付加的に、必要な量の－ＨＣＯ３を含む。
【0125】
好ましくは、工程（ｃ５）の培養は、選択された培養培地にとって適切な培養条件に維持されるだろう。
【0126】
いずれの場合も、当業者は、どれが使用可能な培養培地および３５～３９℃の条件であるのかを、高レベルのＣＯ２と少なくとも５％のウシ胎児血清を含む工程（ｃ５）および（ｃ６）の培養を行なうのに可能な改変と同様に、認識するだろう。
【0127】
好ましくは、工程（ｃ５）において、培養培地は、１００００から４００００細胞／ｃｍ２の産出を得て、細胞が増殖表面の８０～１００％を占めるまで、３～４日ごとに替えられる。好ましくは、工程（ｃ５）は、１０から１５日間で実行される。
【0128】
好ましい実施形態において、工程（ｃ６）は、凍結保存され回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を、その細胞が支持体の表面の８０～１００％を占める時、支持体から単離させる工程を含み、ここで、単離させる工程は、
ｉ． プラスチック支持体中の、凍結保存され、回復された、および機能的な間葉系幹細胞試料を、適切な培地で洗浄する工程と、
ｉｉ． 酵素溶液を添加し、および使用される培養培地に適切な条件でインキュベートする工程と、
ｉｉｉ． 等しい体積の培養培地を添加することより、酵素溶液を不活性化する工程と、
ｉｖ． 遠心分離処理し、および上澄み液を廃棄する工程と、を含む。
ｉ． プラスチック支持体中の、凍結保存され、回復された、および機能的な間葉系幹細胞試料を、適切な培地で洗浄する工程と、
ｉｉ． 酵素溶液を添加し、および使用される培養培地に適切な条件でインキュベートする工程と、
ｉｉｉ． 等しい体積の培養培地を添加することより、酵素溶液を不活性化する工程と、
ｉｖ． 遠心分離処理し、および上澄み液を廃棄する工程と、を含む。
【0129】
好ましい実施形態では、工程（ｉ）において細胞を洗浄するために適切な培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。
【0130】
好ましい実施形態において、適切な培養培地がＤＭＥＭである時、工程（ｉｉ）は酵素溶液を添加し、および、７．５％から１０％のＣＯ２のもと、３５～３９℃にて５から１０分間インキュベートすることを含む。
【0131】
好ましくは、工程（ｉｉ）において使用される酵素溶液は、０．０５％のトリプシン、および０．０２％のエチレンジアミン四酢酸塩を含有している溶液である。好ましくは、工程（ｉｉ）において使用される酵素溶液は、０．０５％のトリプシン、および０．０２％のエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）四ナトリウムをハンクス平衡塩溶液中に含む。
【0132】
いずれの場合も、当業者は、工程（ｃ６）の凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団の単離を行なうために可能な変更と同様に、どれが可能な様々な培養培地であり、および適切な条件であるかを、認識するであろう。
【0133】
好ましくは、工程（ｉｖ）の遠心分離処理は、１０から３０分間、１５から２５℃にて３００～５００ｇで、より好ましくは、１０分間、２０℃にて４００ｇで、実行される。
【0134】
好ましい実施形態では、工程（ｃ６）において単離させられた、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団は、８０％以上の生存率を有する。
【0135】
好ましい実施形態では、工程（ｃ６）において単離させられた、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団は、９０％以上の生存率を有する。
【0136】
好ましい実施形態において、前記２～８℃での輸送および保管に適した培地は、０．２５ｍＭから１ｍＭの６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（トロロックス）を含む、等張の培地である。
【0137】
６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸、またはトロロックスは、ビタミンＥアナログである。
【0138】
より好ましい実施形態において、前記０．２５ｍＭから１ｍＭの６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を含む等張の培地は、０．２５ｍＭから１ｍＭの６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を含む、動物成分なしの、無血清の、無タンパク質の培地である。
【0139】
より好ましい実施形態において、前記０．２５ｍＭから１ｍＭの６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を含む等張の培地は、Ｎａ＋１００ｍＭ、Ｋ＋４２．５ｍＭ、Ｃａ２＋０．０５ｍＭ、Ｍｇ２＋５ｍＭ、塩化物１７ｍＭ、二水素リン酸１０ｍＭ、ＨＣＯ３５ｍＭ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニルエタンスルホン酸塩（ＨＥＰＥＳ）２５ｍＭ、ラクトビオン酸塩１００ｍＭ、スクロース２０ｍＭ、マンニトール２０ｍＭ、４００００の平均分子量を伴うデキストラン ６％、アデノシン２ｍＭ、グルタチオン３ｍＭ、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミン０．５％、および６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸１ｍＭ、を含む。
【0140】
別の好ましい実施形態では、前記等張の培地は、Ｎａ＋１３０ｍＭ、Ｋ＋４ｍＭ、およびＣａ２＋１．３５ｍＭ、塩化物１０９ｍＭ、およびラクテート１６ｍＭを含む第１の組成物と、Ｎａ＋１５９ｍＭ、Ｋ＋５ｍＭ、Ｍｇ２＋０．８ｍＭ、塩化物７７ｍＭ、二水素リン酸２８ｍＭ、およびクエン酸塩１０ｍＭ、および酢酸塩３２ｍＭを含む第２の組成物との、１：９から９：１の混合物（ｖ／ｖ）を含み、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミン０．１％から０．５％、および、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸０．２５から１ｍＭで補充される。
【0141】
より好ましい実施形態において、前記等張の培地は、１：９、または１：４、または１：３、または１：１、または３：１、または４：１、または９：１の、前記第１の組成物と前記第２の組成物の混合物（ｖ／ｖ）を含み、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミン０．１％から０．５％、および、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸０．２５から１ｍＭで補充される。
【0142】
より好ましい実施形態において、前記等張の培地は、前記第１の組成物と前記第２の組成物の１：１の混合物（ｖ／ｖ）を含み、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミン０．５％、および、６ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２カルボキシル酸０．５ｍＭで補充される。
【0143】
さらにより好ましい実施形態において、前記等張の培地は、グルコース５ｍＭ、ヒト血清アルブミン０．５％、および６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸０．５をｍＭ、を含む。
【0144】
さらにより好ましい実施形態において、前記等張の培地は、ヒト血清アルブミン０．５％、および６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸１ｍＭ、を含む。
【0145】
適切な商用の等張の培地は、１ｍＭの ６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボキシル酸、および０．１％から０．５％のヒト血清アルブミンで補充された、Ｈｙｐｏｒｔｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）－Ｂａｓｅである。
【0146】
Ｈｙｐｏｒｔｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）－Ｂａｓｅ溶液は、Ｎａ＋１００ｍＭ、Ｋ＋４２．５ｍＭ、Ｃａ２＋０．０５ｍＭ、Ｍｇ２＋５ｍＭ、Ｃｌ－１７．１ｍＭ、二水素リン酸１０ｍＭ、重炭酸５ｍＭ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ペラジニルエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）２５ｍＭ、ラクトビオン酸塩１００ｍＭ、スクロース２０ｍＭ、マンニトール２０ｍＭ、グルコース５ｍＭ、アデノシン２ｍＭ、およびグルタチオン ３ｍＭを含有する。
【0147】
好ましくは、前記方法は、凍結保存され、回復され、および輸送調整された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を選択する付加的な工程（ｃ７）をさらに含み、該細胞は、
－ プラスチックに対する接着性を示し、および、
－ 少なくとも７０％の生存率を呈し、および
－ ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の９０％以上の発現を呈し、および、
－ ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５の１０％以下の発現、および１０％以下のＨＬＡ－ＤＲの発現を呈し、および、
－ 染色体異常の特徴を持たず、および、
－ 骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を持ち合わせる。
－ プラスチックに対する接着性を示し、および、
－ 少なくとも７０％の生存率を呈し、および
－ ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５の９０％以上の発現を呈し、および、
－ ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５の１０％以下の発現、および１０％以下のＨＬＡ－ＤＲの発現を呈し、および、
－ 染色体異常の特徴を持たず、および、
－ 骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を持ち合わせる。
【0148】
好ましくは、本発明の方法によって得られる、治療における投与に適した、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物は、年間のあらゆる時期と気候条件において、少なくとも７２時間を超えて２から８℃の間の一定の温度を保証する恒温のパッケージングに入って輸送される。本発明の方法と共に使用されるパッケージングの一例は、ＯＲＣＡ（登録商標）パッケージングシステムである。
【0149】
凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物は、１０回までの複製を被った後にさえ安定したままである。
【0150】
一実施形態は、本発明の方法によって得られる組成物であって、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物に関する。
【0151】
別の実施形態は、薬剤として使用するための、本発明の方法によって得られる組成物であって、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物に関する。別の実施形態は、本発明の方法によって得られる組成物であって、薬剤の製造において使用するための、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む、組成物に関する。
【0152】
加えて、本発明は、間葉系幹細胞治療が有効な疾患の処置において使用するための、本発明の方法によって得られる組成物であって、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む、組成物に関する。
【0153】
別の実施形態は、間葉系幹細胞治療が有効な疾患の処置において使用するための、本発明の方法によって得られる組成物であって、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物に関し、ここで、前記凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物は、局所的にまたは全身療法において投与される。
【0154】
別の実施形態は、骨関節疾患の処置、骨の修復、自己免疫疾患、および循環器疾患において使用するための、本発明の方法によって入手可能な、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物に関する。
【0155】
一実施形態では、骨関節疾患は、変性椎間板疾患、変形性関節症、半月板損傷、および関節リウマチから選択される。
【0156】
一実施形態では、自己免疫疾患は、紅斑性狼瘡、移植片対宿主疾患、および全身性硬化症から選択される。
【0157】
一実施形態では、循環器疾患は、末梢血管不全症、心筋梗塞、脳卒中、および虚血から選択される。好ましい実施形態では、疾患は視神経虚血性障害である。
【0158】
本発明の目的上、用語「自己由来の処置」、または「自己由来の治療」は、本発明の方法の工程（ａ）において使用される骨髄間葉系幹細胞が、本発明によって意図される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団が使用される対象の人物、または、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物が使用される対象の人物と同一の人物に由来する骨髄間葉系幹細胞である処置を指す。
【0159】
本発明の目的上、用語「同種異系の、または同種異系の処置」、または「同種異系の治療」は、本発明の方法の工程（ａ）において使用される骨髄間葉系幹細胞が、本発明によって意図される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団が使用される対象の人物、または、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物が使用される対象の人物とは異なる人物に由来する骨髄間葉系幹細胞である処置を指す。
【0160】
上に記載された、本発明の方法によって入手可能な、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物は、従って、特定の骨関節疾患、変形性関節症、自己免疫疾患、および循環器疾患における局所または全身の処置による間葉系幹細胞治療の効果がある疾患の処置の自己由来または同種異系の処置のための薬剤の製造において使用される。
【0161】
本発明のある実施形態は、５×１０６から１０×１０６細胞／ｍｌの濃度において投与される薬剤として使用するための、本発明の方法によって入手可能な、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物に関する。
【0162】
本発明のある実施形態は、兆候に応じて５×１０６から１０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度において、および５０万から９０００万個の細胞の１用量で投与される薬剤として使用するための、本発明の方法によって入手可能な、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物に関する。
【0163】
本発明のある実施形態は、骨関節疾患、骨修復、自己免疫疾患、および循環器疾患の自己由来の処置において使用するための、上に記載された、本発明の方法によって入手可能な、凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物に関する。
【0164】
別の実施形態は、骨関節疾患、骨修復、自己免疫疾患、および循環器疾患の処置の方法に関し、該方法は、凍結保存され、回復され、および輸送調整される機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物の治療量を、必要とする被験体に投与する工程を含み、ここで、前記富化集団を含む前記組成物は、本開示において記載される方法によって得られる。
【図面の簡単な説明】
【0165】
【図1】本発明による組成物（２）、参考組成物（１）、およびグルコースとヒト血清アルブミンで補充された乳酸リンゲル液を含む組成物の、低体温条件下（２～８℃）で３日間保管中の細胞の生存率に対する効果である。データは５人の異なるドナーの平均±ｓｅｍである。
【図2】本発明による組成物２と組成物３、および参考組成物１、およびグルコースとヒト血清アルブミンで補充されたリンゲル乳酸塩溶液を含む組成物の、低体温条件下（２～８℃）で３日間保管中の細胞の生存率に対する影響である。データは異なる５ドナーの平均±ｓｅｍである。
【図3】以下によって達成された細胞の生存率対時間。（１）本発明によって、ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存され、１０％のＣＯ２を含む培養培地で３５～３９℃にて回復され、および輸送調整された、組成物３を得るためのＭＳＣを含む、組成物（塗りつぶされた棒グラフ）。（２）ＷＯ２０１０／０６４０５４による、トロロックスを伴うＨｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）中で凍結保存され、解凍され、室温（２０～２５℃）にて表示された時間維持されたＭＳＣを含む組成物（斜線の棒グラフ）。および、（３）リンゲル乳酸塩と１０％のＤＭＳＯ中で凍結保存され、解凍されたＭＳＣを含む組成物（白い棒）。値は３ドナーの平均＋／－ＳＤである。すべての測定は、３回繰り返して行われた。
【図4】（参考図）間葉系幹細胞発育におけるＤＭＳＯの影響。新鮮な間葉系幹細胞は、ｃｍ２につき１０００細胞が、０％、０．１％、０．３％、１％、および５％のＤＭＳＯを伴って播種され、３７℃にて表示された時間培養された。値は３ドナーの平均±ＳＤである。
【図5】本発明によって得られる、凍結保存され、回復され、および輸送調整される間葉系幹細胞を含む組成物３の、７２時間の低体温輸送（２～８℃）の後の増殖曲線である。トリプリケートの値の平均±ＳＤ。異なるドナーを用いた３つの同様の実験の代表。
【0166】
実施例
本発明は、実施例において、図および総括的なスキームと同様に、例示される。以下のスキームにおいて使用される置換基と整数は、他に指示がない限り、本発明の実施形態において定義された通りである。このセクションは、本発明についての理解を支援するために設けられるが、特許請求の範囲に記載された本発明をいかなる形でも限定するものと解釈されるべきではない。
本発明は、実施例において、図および総括的なスキームと同様に、例示される。以下のスキームにおいて使用される置換基と整数は、他に指示がない限り、本発明の実施形態において定義された通りである。このセクションは、本発明についての理解を支援するために設けられるが、特許請求の範囲に記載された本発明をいかなる形でも限定するものと解釈されるべきではない。
【0167】
本発明に記載の方法によって得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含み、具体例において使用される組成物は、ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉａ ｙ Ｇｅｎｅｔｉｃａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ （ＩＢＧＭ） ｏｆ ＶａｌｌａｄｏｌｉｄのＧｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （ＧＭＰ） を使用して、Ｓｐａｎｉｓｈ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ，によって承認された標準操作手順、ＡＥＭＰＳ （ＰＥＩ Ｎｕｍ．１０－１３４ ａｎｄ ＰＥＩ ｎｕｍ １５－００７）に従って、処理された。
【0168】
実施例１：本発明の方法による機能的な間葉系幹細胞の集団を得ること
プロトコル化された抗凝固療法の対象とされた骨髄穿刺液は、実施例の組成物を得るために使用されるＭＳＣを得るための細胞の供給源である。骨髄穿刺液を、抽出の後、２４時間以内に処理した。
プロトコル化された抗凝固療法の対象とされた骨髄穿刺液は、実施例の組成物を得るために使用されるＭＳＣを得るための細胞の供給源である。骨髄穿刺液を、抽出の後、２４時間以内に処理した。
【0169】
ＭＳＣを得る過程は、ほぼ２１～２８日続く。
【0170】
最初の工程において、単核細胞画分（ＭＮＣ）をフィコール密度勾配で選択した。続いて、トリパンブルー色素排除法によって細胞の生存率調査を行った。培養を始めるために、単核細胞（ＭＮＣ）は７０％以上の生存率を持っていなければならなかった。ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳを含有している（細菌汚染の問題が疑われれば、０．５％のゲンタマイシンを添加する）培養フラスコにおいてＭＮＣを播種し、および、１０％のＣＯ２のもと、３７℃にてインキュベートした。３日または４日ごとに、倒立顕微鏡を用いて細胞の単層およびコンフルエンス（細胞によって占められた培養物表面の％）の外観を観察した。コンフルエンスが６０～８０％未満の場合には、培養培地の交換を行なった。コンフルエンスが８０％より大きかった場合、細胞培養物を細胞の分離と拡大培養（継代）に進め、数を増加させ、およびＭＳＣの細胞系統を純化するために継代培養を実行した。
【0171】
第１の継代で得られた細胞を洗浄し、定量し、および、凍結保存培養培地中に懸濁した。細胞濃度を９０％のＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯで作られた凍結保存培養培地（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｎｔ）１ｍｌあたり５～１０ｘ１０６ＭＳＣに設定した。
【0172】
２４～７２時間細胞を－８０±８℃に維持して、凍結保存手順を徐々に実行した。この期間の後、使用するまで細胞を液体窒素下で、名目上－１９６℃で保存した。
【0173】
再拡大培養を含めて、回復を、最長６年から２０年後になり得る治療のために設定された日付に合わせて予定した。
【0174】
回復中に、試料がその培養温度（３７℃）に適切に調節されるに違いないことを考慮に入れて、凍結保護物質を１５～２０分間で素早く取り除いた。
【0175】
最後に、細胞の集計と生存率調査を実行するために、生存率が７０％未満の細胞バッチを除いて、細胞を完全な培養培地において再懸濁した。
【0176】
この実施例において以下に見られるように、回復された生細胞の数がわかると直ちに、細胞遺伝学の分析のために５ｘ１０５細胞の試料を取った。残りの溶液をｃｍ２あたり１０００～５０００細胞の濃度で播種した。
【0177】
この培養物を１０％ＣＯ２で３７℃にて維持した。細胞が培養面の８０～１００％を占めるまで、培養培地を４日ごとに交換した。この時点で、トリプシン－ＥＤＴＡを用いて分離を実行した。解凍が行なわれてから、再拡大培養の時間を含む回復は、１０～１５日間続く。
【0178】
細胞の生存率は８０％以上であり、約１２時間変わらなかった。
【0179】
実施例２：本発明に記載の方法によって得られる、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物
実施例１において得られた、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団の機能的な特徴における低体温条件下（２～８の℃）の３日の保管にわたる細胞の生存率に対するいくつかの組成物の影響を調査した。異なる３つの培養培地、リンガー乳酸塩溶液、ＳＳＰ＋血小板添加溶液、および、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）－ＦＲＳを輸送用にＭＳＣを調節するために使用した。それらの組成物を表１に示す。
実施例１において得られた、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団の機能的な特徴における低体温条件下（２～８の℃）の３日の保管にわたる細胞の生存率に対するいくつかの組成物の影響を調査した。異なる３つの培養培地、リンガー乳酸塩溶液、ＳＳＰ＋血小板添加溶液、および、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）－ＦＲＳを輸送用にＭＳＣを調節するために使用した。それらの組成物を表１に示す。
【0180】
以下の機能的な作用を３つの溶液を組み合わせて調査した：
１．細胞への膜のＮａ／Ｋ ＡＴＰアーゼを介したＫ＋の送り込み、および、アルカリ・イオン勾配の回復を促進するために培養培地のＫ濃度を増加させたが、それは、温度の低下のために原形質膜のＮａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅが阻害されるため、失われる。加えて、原形質膜を安定させるために培養培地のＭｇ２＋容量を増加させた。
２．ｐＨのよりよい維持のために緩衝能力（リン酸、クエン酸塩、および重炭酸およびＨＥＰＥＳ）を増加させた。乳酸塩と酢酸塩の存在も代謝中に陽子生成を減少させることにより寄与した。
３．グルコース、酢酸塩、アデノシンなどの異なる代謝経路を介して作用する代謝基質を加えることにより、培養培地の栄養価は、向上された。
４．コロイド状浸透圧による細胞溶解に対抗するために、ラクトビオン酸塩、スクロース、マンニトール、またはデキストランなどの原形質膜不浸透性の浸透圧調整剤（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）を添加した。
５．最後に、グルタチオンを備えた培養培地と可溶性ビタミンＥアナログの６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（トロロックス）の相補性によって酸化防止能力を増加させた。
１．細胞への膜のＮａ／Ｋ ＡＴＰアーゼを介したＫ＋の送り込み、および、アルカリ・イオン勾配の回復を促進するために培養培地のＫ濃度を増加させたが、それは、温度の低下のために原形質膜のＮａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅが阻害されるため、失われる。加えて、原形質膜を安定させるために培養培地のＭｇ２＋容量を増加させた。
２．ｐＨのよりよい維持のために緩衝能力（リン酸、クエン酸塩、および重炭酸およびＨＥＰＥＳ）を増加させた。乳酸塩と酢酸塩の存在も代謝中に陽子生成を減少させることにより寄与した。
３．グルコース、酢酸塩、アデノシンなどの異なる代謝経路を介して作用する代謝基質を加えることにより、培養培地の栄養価は、向上された。
４．コロイド状浸透圧による細胞溶解に対抗するために、ラクトビオン酸塩、スクロース、マンニトール、またはデキストランなどの原形質膜不浸透性の浸透圧調整剤（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）を添加した。
５．最後に、グルタチオンを備えた培養培地と可溶性ビタミンＥアナログの６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（トロロックス）の相補性によって酸化防止能力を増加させた。
【0181】
改変の影響が陽性だったかどうかを示すために、これらの添加剤の各々の有益な活性を調査した。テストされた様々な溶液を、表１に示す。
【0182】
【表1】
【0183】
図１と２は、低体温条件下（２～８℃）での３日の保管の間における細胞の生存率に対するいくつかの組成物の影響を示す。
【0184】
通常の輸液、グルコースとヒト血清アルブミンで補充された乳酸リンゲル液（図１および２において円において示される）は、１２時間、凍結保存および回復されたＭＳＣを安定させたが、より長い期間には適さない。
【0185】
ＳＳＰ＋（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｒｉｎｇｗａｌｄ ｅｔ ａｌ． ２００６， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄ Ｒｅｖ， ｖｏｌ ２０， ｎｕｍ ２， １５８－１６４）と、グルコースとヒト血清アルブミンで補充された乳酸リンゲル液の組み合わせ（図１および２に空の三角形で示される組成物１）も、低体温条件下（２～８℃）での３日の保管の間に十分に細胞の生存率を改善させなかったが、組成物２を得るために、その溶液にｔｒｏｌｏｘを添加した時（図１および２にダイヤモンドで示される）、図１および２に示されるように、安定性が著しく増加し、ここで、前記組成物は、７２時間の後に８０％を超える生存率をもたらした。
【0186】
トロロックスを伴う組成物３もまた、図２において見られるような同様の働きを提供した（塗りつぶされた三角形で示される）。
【0187】
組成物２および３では、４℃での７日間の後にさえ、保存状態は十分であった。
【0188】
実施例３：実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物の生存率と特性評価。
本発明の方法によって、実施例１において記載されているように細胞を得た直後、実施例２に従って、トロロックスを伴う等張の培地、組成物３で調製した、機能的なＭＳＣの富化集団を含む組成物の、７人の異なるドナーに由来する、７つのバッチに関する調査を、実行し、および、一群のパラメーターを以下の目的のために評価した：
－ 本発明の方法により、実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団が治療における応用に適していることを証明するため、
－ 実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団が、ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （ＩＳＣＴ） （Ｄｏｍｉｎｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００６， ｖｏｌ ８， Ｎｏ ４， ３１５－３１７）によって定義されたＭＳＣの典型的な特徴を保護することを証明するため（Ｗｕｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｃｒｙｏｔｈｅｒａｐｙ， ２０１５， １７：１２８－１３９）、および、
－ 実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団中に表現型と遺伝子型の異常がないことを実証するため。
本発明の方法によって、実施例１において記載されているように細胞を得た直後、実施例２に従って、トロロックスを伴う等張の培地、組成物３で調製した、機能的なＭＳＣの富化集団を含む組成物の、７人の異なるドナーに由来する、７つのバッチに関する調査を、実行し、および、一群のパラメーターを以下の目的のために評価した：
－ 本発明の方法により、実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団が治療における応用に適していることを証明するため、
－ 実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団が、ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （ＩＳＣＴ） （Ｄｏｍｉｎｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００６， ｖｏｌ ８， Ｎｏ ４， ３１５－３１７）によって定義されたＭＳＣの典型的な特徴を保護することを証明するため（Ｗｕｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｃｒｙｏｔｈｅｒａｐｙ， ２０１５， １７：１２８－１３９）、および、
－ 実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団中に表現型と遺伝子型の異常がないことを実証するため。
【0189】
測定されたパラメーターは、
１．接着能力によって測定された細胞形態と、
２．ｃｍ２ごとの細胞の拡大（増殖）能力として測定された細胞の性能と、
３．トリパンブルーを使用して測定された細胞の生存率と、
４．ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の陽性の発現と、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲの陰性の発現を分析する免疫表現型分析と、
５．本発明の方法によって得られた組成物の無菌性と、
６．構造的異常および遺伝異常をチェックするための細胞遺伝学の調査と、であった。
１．接着能力によって測定された細胞形態と、
２．ｃｍ２ごとの細胞の拡大（増殖）能力として測定された細胞の性能と、
３．トリパンブルーを使用して測定された細胞の生存率と、
４．ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の陽性の発現と、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲの陰性の発現を分析する免疫表現型分析と、
５．本発明の方法によって得られた組成物の無菌性と、
６．構造的異常および遺伝異常をチェックするための細胞遺伝学の調査と、であった。
【0190】
形態：評価された７つすべての事例において、細胞培養は、繊維芽細胞様の接着細胞が存在した。
【0191】
細胞の性能：実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団、実施例１における（処理されたＭＳＣ）と、本発明の方法を経ていない対照ＭＳＣ（対照ＭＳＣ）とについて、得られた細胞のｃｍ２ごとの数を表２に示す。
【0192】
【表2】
【0193】
細胞／ｃｍ２の平均数、１８３９１対１７３７７（表２中の最終行）は、著しくは異なっておらず、本発明の方法が細胞の増殖に影響していないことを示している。
【0194】
生存率：実施例１で得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団の得られた細胞（処理ＭＳＣ）と、本発明の方法を経ていない対照のＭＳＣ（対照ＭＳＣ）との生存率は、表３において示される。
【0195】
【表3】
【0196】
生存率は非常に維持されており、および、対照と実施例１細胞において得られた細胞の間に有意な差はなかった。（９８対９５、表３中の最終行を参照されたい）
【0197】
すべてのケースで、細胞の生存率は必ず７０％以上である。
【0198】
データ分析解析：
２００６年、ＩＳＣＴは、間葉系細胞を定義する３つの基準を提案した。第１に、これらの細胞は培養物において接着性がなければならない。第２に、ＣＤ３４およびＣＤ４５などの血液生成の抗原がない状態において、ＣＤ９０およびＣＤ１０５抗原を発現する。および、第３に、間葉系細胞は「インビトロで」骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞へ分化することができなければならない。加えて、この集団は特徴的な表現型を示さないため、ＣＤ７３、ＣＤ１６６の存在下やＣＤ１４とＨＬＡ－ＤＲの欠如下などにおける、他の接着分子の存在が分析されるべきである。
２００６年、ＩＳＣＴは、間葉系細胞を定義する３つの基準を提案した。第１に、これらの細胞は培養物において接着性がなければならない。第２に、ＣＤ３４およびＣＤ４５などの血液生成の抗原がない状態において、ＣＤ９０およびＣＤ１０５抗原を発現する。および、第３に、間葉系細胞は「インビトロで」骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞へ分化することができなければならない。加えて、この集団は特徴的な表現型を示さないため、ＣＤ７３、ＣＤ１６６の存在下やＣＤ１４とＨＬＡ－ＤＲの欠如下などにおける、他の接着分子の存在が分析されるべきである。
【0199】
フローサイトメトリーによる表面抗原の分析によって、機能的な間葉系幹細胞の富化集団の表現型対照が行われており、これによって、間葉系細胞の特異的なマーカーの存在を確認することができた。
【0200】
２ｍｌのＰＢＳ中の１００万の機能的な間葉系幹細胞の懸濁液を調製し、４本のチューブに分配し（５００μｌの体積中に２５０，０００細胞／チューブ）、以下の表４に示す抗体パターンでマークした。使用した投与量は製造者によって推奨されたものだった。
【0201】
【表4】
【0202】
４℃にて２０分間、暗やみにおいてチューブをインキュベートした。この時間の後、洗浄するために２．５ｍｌのＰＢＳを加え、２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離処理した。上澄み液を除去し、および、試料をフローサイトメーターに通す前に、細胞ペレットを５００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。
【0203】
分析は、実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団と、本発明の方法を経ていないコントロールＭＳＣ（新鮮なＭＳＣ）の両方は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６を発現（＞９０％）し、および、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲについては陰性（＜１０％）である、ということを示した。
【0204】
他方では、我々は、７人のドナーにおいて、免疫表現型の研究において使用されるマーカーの発現のパーセンテージを調査した（表５を参照）。
【0205】
【表5】
【0206】
得られた細胞の無菌性。
生成物の無菌性評価において得られた結果は、確立された判定基準に従う。微生物の増殖（自動システム－Ｂａｃｔ／ＡｌｅｒｔにおいてＣＯ２産生量によって、およびヨーロッパ薬局方各条６．２．２７に準拠して、検知される）は、いずれの場合にも観察されず、および、マイコプラスマの存在は、ヨーロッパ薬局方各条６．２．７に従うＰＣＲ／ＮＡＴに基づく手順によっても検知されなかった。
生成物の無菌性評価において得られた結果は、確立された判定基準に従う。微生物の増殖（自動システム－Ｂａｃｔ／ＡｌｅｒｔにおいてＣＯ２産生量によって、およびヨーロッパ薬局方各条６．２．２７に準拠して、検知される）は、いずれの場合にも観察されず、および、マイコプラスマの存在は、ヨーロッパ薬局方各条６．２．７に従うＰＣＲ／ＮＡＴに基づく手順によっても検知されなかった。
【0207】
細胞遺伝学的調査。
上記すべてに加え、起こり得る薬剤の染色体異常を除外するために、実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団の核型を得て、および、評価した。
上記すべてに加え、起こり得る薬剤の染色体異常を除外するために、実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団の核型を得て、および、評価した。
【0208】
実施したにおいて、実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団の細胞遺伝学的調査を実施し、Ｇバンド（解像度４００バンドの）によって確認された構造的異常はなかった。
【0209】
要約すると、この実施例において得られた結果から、以下のことを結論付けることができる：
【0210】
１．実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団（処理されたＭＳＣ）と、本発明の方法を経ていない対照のＭＳＣ（対照ＭＳＣ）の両方は、繊維芽細胞様の接着細胞である。
【0211】
２．実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団におけるｃｍ２ごとの細胞数は、対照におけるのと同じであり、および、品質管理を実行するために、また同様に適切な処置用量を得るために、十分であった。
【0212】
実施例１で得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団（処理されたＭＳＣ）と、本発明の方法を経ていない対照のＭＳＣ（対照ＭＳＣ）の、両方の生存率は同じであり、および、設定された下限より上であった。
【0213】
４．実施例１で得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団（処理されたＭＳＣ）と、本発明の方法を経ていない対照のＭＳＣ（対照ＭＳＣ）の、両方の表現型は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲなどの典型的な血液生成のマーカーがない状態でのＣＤ１０５とＣＤ９０の発現という、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （ＩＳＣＴ）によって確立された基準を満たしている。細胞（対照細胞と処理細胞の両方）はまた、ＣＤ７３、ＣＤ１６６について陽性であり、ＣＤ１４を発現しない。得られた発現パーセンテージを考慮に入れ、および、ＩＳＣＴにおいて設定されたパラメーター（Ｗｕｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ， ２０１５）に従って、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６のようなマーカーについては９０％以上の発現が陽性と見なされ、および、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲのようなマーカーについては、１０％以下の発現が陰性と見なされる、という合格基準を確立した。
【0214】
５．要約すると、本発明の方法は、前記方法によって得られたが故に以前使用された本発明の方法を経ていないＭＳＣと生物学的に同等である機能的なＭＳＣの富化集団の特徴を改変も形質転換もせず、いくつかの指標において重大な治療値を示した（Ｏｒｏｚｃｏ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２０１１， ９２：８２２－８２８； Ｏｒｏｚｃｏ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２０１３， ９５（１２）：１５３５－１５４１； Ｖｅｇａ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２０１５， ９９：１６８１－１６９０； Ｎｏｒｉｅｇａ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２０１７， １０１：１９４５－１９５１）。
【0215】
６．実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団は、凍結保存プロセスの後に遺伝子型の異常を示さない。
【0216】
７．実施例１において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団中に染色体異常がない状態から、１０回までの複製を被る場合でもＭＳＣが安定したままであると結論を下すことが可能である。
【0217】
実施例４：７２時間の輸送後に本発明の方法によって得られる、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物の特性評価。
試験の目的は、
－ ７２時間の輸送プロセスの後に本発明の方法によって得られる機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物の、無菌性、生存率、および免疫表現型を評価することと、
－ ７２時間の輸送プロセスを実行した後に、前記組成物のＭＳＣがインビトロの再拡大能力、すなわち同じインビトロの増殖能力を維持すると示すこと、である。
試験の目的は、
－ ７２時間の輸送プロセスの後に本発明の方法によって得られる機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物の、無菌性、生存率、および免疫表現型を評価することと、
－ ７２時間の輸送プロセスを実行した後に、前記組成物のＭＳＣがインビトロの再拡大能力、すなわち同じインビトロの増殖能力を維持すると示すこと、である。
【0218】
本発明の方法によって処理されたＭＳＣを得るための細胞の供給源として、３人の異なるドナーから得た骨髄穿刺液を使用して、プロトコル抗凝固手順にかけた。骨髄穿刺液試料は、その抽出の後２４時間以内に処理された。
【0219】
機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を、実施例１において記載される本発明の方法によって得た。得られた機能的なＭＳＣの富化集団を、上記実施例３による組成物３中に懸濁し、および、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）の処置において使用するために、５ｍｌのシリンジにおいて２ｍｌ中に再懸濁された２０±２００万細胞の用量で、パッケージング・プロセスを行なった。変形性関節症における使用のために、細胞の用量は、８ｍｌ中に懸濁された４０００万細胞になるだろう。
【0220】
本発明に記載の方法によって得られる、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、およびＣＤ７３抗体の存在と、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲマーカーがない状態を伴う、間葉細胞の特徴的な免疫表現型を持っている。
【0221】
得られた組成物を医療用にリリースするために、細胞の生存率は、９０％以上である必要があり、および、この生成物は２～８℃にて７２時間の安定性を持つため、リリースされた組成物の生存率は、配送シミュレーションを実行した後、その発送の７２時間以内（生成物使用期限）は８０％以上でなければならない。
【0222】
治療のための用量は、２ｍｌの最終体積中に２０±２×１０６細胞だった。組成物を内包する容器は、生産された生成物のデータを内包するラベルによって識別された。
【0223】
年間のすべての時期と気候条件において、少なくとも１６８時間、２～８℃の間の一定温度を保証すると公認された恒温のパッケージングである、ＯＲＣＡ装置において組成物を輸送した。加えて、パッケージングは、冷凍自動車における輸送を必要としない。また、各々の箱には、生成物が運送時間を通じて維持された温度のグラフを提供するデータロガー（サーモレコーダ（ｔｈｅｒｍｏ－ｒｅｃｏｒｄｅｒ））が組み込まれた。
【0224】
ＯＲＣＡ（登録商標）パッケージングは、３４５×３１７ｘ３０８ｍｍの外寸、および、７．２ｋｇの重量がある、４．４Ｌの箱からなる。
【0225】
本発明による、組成物３で懸濁された、この実施例において得られた組成物が７２時間の輸送プロセス後に安定したままであり、および、ＭＳＣの無菌性、生存率、および、 ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （ＩＳＣＴ） （Ｄｏｍｉｎｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００６， ｖｏｌ ９， Ｎｏ ４， ３１５－３１７）によって定義された表現型の特徴を維持することを実証するために、３つのロットに関する調査を以下のパラメーターを評価するように行なった。
－ 輸送温度
－ 細胞の生存率
－ 免疫表現型の分析
－ 無菌性
－ 細胞が輸送プロセスの後に複製する能力を維持することを立証する増殖キネティクス試験。
－ 輸送温度
－ 細胞の生存率
－ 免疫表現型の分析
－ 無菌性
－ 細胞が輸送プロセスの後に複製する能力を維持することを立証する増殖キネティクス試験。
【0226】
ＯＲＣＡの恒温パッケージングは、２から８℃の範囲内で７２時間転位温度が維持されることを可能にした。
【0227】
細胞生存率
輸送プロセスの後７２時間、トリパンブルー色素排除法を用いて細胞の生存率を評価した。すべての試験を３回繰り返して実行した。表６は、分析されたドナーの初期の生存率、および７２時間に得られた平均生存率±標準偏差を示す。
輸送プロセスの後７２時間、トリパンブルー色素排除法を用いて細胞の生存率を評価した。すべての試験を３回繰り返して実行した。表６は、分析されたドナーの初期の生存率、および７２時間に得られた平均生存率±標準偏差を示す。
【0228】
【表6】
【0229】
すべての場合において、７２時間での細胞の生存率は８０％以上であり、そのため、この研究において確立された基準を満たす。
【0230】
免疫表現型の分析
フローサイトメトリー分析は、組成物が発送された後７２時間にて、試験された細胞が、すべての組成物の発現パターンにおいて、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６を発現し、また、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲについて陰性であることを示した。表７は、組成物の発送時点、および、生成物が発送された後７２時間における、フローサイトメトリーによって分析されたマーカーの発現のパーセンテージを示す。すべてのドナーは、輸送プロセスの後に間葉細胞表現型を示す。
フローサイトメトリー分析は、組成物が発送された後７２時間にて、試験された細胞が、すべての組成物の発現パターンにおいて、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６を発現し、また、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲについて陰性であることを示した。表７は、組成物の発送時点、および、生成物が発送された後７２時間における、フローサイトメトリーによって分析されたマーカーの発現のパーセンテージを示す。すべてのドナーは、輸送プロセスの後に間葉細胞表現型を示す。
【0231】
【表7】
【0232】
増殖キネティクス試験
輸送プロセスの後に培養する際、増殖キネティクス試験を異なる時間区間で細胞数を記録して実行した。これらの結果は、分析された３ドナーについて、機能的なＭＳＣの富化集団が、７２時間の輸送プロセスの後に複製の能力を維持するということを示す。
輸送プロセスの後に培養する際、増殖キネティクス試験を異なる時間区間で細胞数を記録して実行した。これらの結果は、分析された３ドナーについて、機能的なＭＳＣの富化集団が、７２時間の輸送プロセスの後に複製の能力を維持するということを示す。
【0233】
無菌性
輸送のシミュレーションの後に組成物の無菌性を評価した。機能的な間葉系幹細胞の富化集団を伴う組成物を得た７２時間後に、３つの細胞拡大プロセスを始めた。抗生物質を伴わない培地で１１日間にわたりこれらの拡大を維持した。３つの培養のどれもが、微生物学的汚染の兆候を示さず、すべての適切な増殖キネティックスが存在し、および従って、無菌性を維持する。
輸送のシミュレーションの後に組成物の無菌性を評価した。機能的な間葉系幹細胞の富化集団を伴う組成物を得た７２時間後に、３つの細胞拡大プロセスを始めた。抗生物質を伴わない培地で１１日間にわたりこれらの拡大を維持した。３つの培養のどれもが、微生物学的汚染の兆候を示さず、すべての適切な増殖キネティックスが存在し、および従って、無菌性を維持する。
【0234】
この調査において得られた結果から、以下のことを結論付けることができる：
１．７２時間の輸送プロセスの後、本発明の方法で得られた組成物における間葉系細胞の生存率は８０％以上である。
２．増殖キネティックスの調査において、組成物に含まれ、抗生物質を伴わない培養培地において維持された間葉系細胞は、輸送の後に無菌性を保つことが観察される。
３．７２時間の輸送プロセス後、組成物中に含まれた間葉系細胞の表現型は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲなどの典型的な血液生成マーカーがない状態におけるＣＤ１０５とＣＤ９０の発現という、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （ＩＳＣＴ）によって確立された基準を満たす。それらはまた、ＣＤ７３、ＣＤ１６６について陽性であり、かつＣＤ１４を発現しない。前と同様陽性のマーカーについての９０％以上の発現パーセンテージと、陰性のマーカーについての１０％以下の発現パーセンテージがある。
４．組成物中に含まれた間葉系細胞は、７２時間の低体温の輸送プロセスを実行した後に、分裂することができるため、「インビトロ」の再拡大能力を維持する。
１．７２時間の輸送プロセスの後、本発明の方法で得られた組成物における間葉系細胞の生存率は８０％以上である。
２．増殖キネティックスの調査において、組成物に含まれ、抗生物質を伴わない培養培地において維持された間葉系細胞は、輸送の後に無菌性を保つことが観察される。
３．７２時間の輸送プロセス後、組成物中に含まれた間葉系細胞の表現型は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲなどの典型的な血液生成マーカーがない状態におけるＣＤ１０５とＣＤ９０の発現という、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （ＩＳＣＴ）によって確立された基準を満たす。それらはまた、ＣＤ７３、ＣＤ１６６について陽性であり、かつＣＤ１４を発現しない。前と同様陽性のマーカーについての９０％以上の発現パーセンテージと、陰性のマーカーについての１０％以下の発現パーセンテージがある。
４．組成物中に含まれた間葉系細胞は、７２時間の低体温の輸送プロセスを実行した後に、分裂することができるため、「インビトロ」の再拡大能力を維持する。
【0235】
実施例５：方法の再現性
現在の実施例は、プロセスの再現性を実証し、前記プロセスが、医薬製造品として治療において使用するために適切な規格品を提供するかどうかを、評価し、得られた生成物が一組の最終生成物仕様書に準拠することを確証することを目的とする。
現在の実施例は、プロセスの再現性を実証し、前記プロセスが、医薬製造品として治療において使用するために適切な規格品を提供するかどうかを、評価し、得られた生成物が一組の最終生成物仕様書に準拠することを確証することを目的とする。
【0236】
試験において使用される、本発明の組成物を得るための細胞の供給源は、骨髄穿刺液であり、Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ２００６／１７／ＥＣ ａｎｄ Ｓｐａｎｉｓｈ ＲＤ１３０１／２００６によって設定されたドネーション要件にしたがって処理した。
【0237】
骨髄穿刺液を、抽出の後、２４時間以内に処理した。
【0238】
試料中の単核細胞の産出高および生存率を表８に示す。
【0239】
【表8】
【0240】
上に詳述されるように、本発明の方法において使用される間葉系幹細胞の試料の単離は、およそ２１～２８日かかる。単核細胞（ＭＮＣ）の数分の１はフィコールを伴う密度勾配法によって前記試料において選択された。このプロセスの終わりに、Ｎｅｕｂａｕｅｒ Ｃｈａｍｂｅｒを用いたトリパンブルー色素排除法を使用して、集計および生存率対照を実行した。この時点で、間葉系細胞を得るプロセスを始めるために、７０％を超える生存率をもつ単核細胞を選択した。
【0241】
選択工程の後、ＭＮＣを１７５，０００細胞／ｃｍ２の密度で撒き、３７℃および１０％ＣＯ２で培養を維持した。３日または４日ごとに、倒立顕微鏡で細胞の外観を観察し、および、増殖のパーセンテージを記録した。パーセンテージが６０～８０％未満の場合には、培地を交換し、８０％を超えた場合は、分離と細胞の拡大（ｐａｓｓ）を実施して、サンプル中にある他の非分裂細胞上のＭＳＣを増加させ、および精製するために継代培養を行なった。
【0242】
免疫表現型の調査はフローサイトメトリーによって実行され、サンプル中の間葉系細胞は、９０％以上のパーセンテージでＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６を発現し、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲのマーカーについては、それらの発現が１０％以下であったため、陰性であることを示した。
【0243】
表９は、分析された２ドナーの細胞株を得る時点での、フローサイトメトリーによって分析されたマーカーの発現パーセンテージを示す。
【0244】
【表9】
【0245】
この第１の工程の間に得られた細胞は、本発明の方法の工程（ａ）の間葉系幹細胞試料を得るために凍結保存された。
【0246】
この時点で、トリプシン－ＥＤＴＡによる酵素消化を行い、それにより細胞懸濁液を得て、１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳまたは市販のキット（ＣｒｙｏＳｔｏｒ （ｒ） ＣＳ５）を用いてそれを凍結保存し、液体窒素中で、－１９６℃にて２４日間保管した。
【0247】
回復と活性化のプロセスは約７～１０日続き、これにより本発明によるＭＳＣを含む組成物を得ることができる。
【0248】
３７℃で１～２分インキュベートしたクライオバイアルを解凍するか、ＴｈａｗＳＴＡＲ（登録商標） ＣＦＴ２ Ｔｈａｗｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔなどの自動化された装置を用いることによって回復プロセスを始め、２，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。
【0249】
サンプルの解凍後に行った対照では、表１０に示すように、生存率と細胞数の点で満足のいく結果が得られたため、本発明の組成物を得るための細胞回復プロセスを開始した。
【0250】
【表10】
【0251】
３７±２℃、および１０％ＣＯ２で培養を維持した。３－４日ごと、培地の交換を行なった。このプロセス中に、培養物は倒立顕微鏡でモニターし、および、間葉細胞が低温保存および解凍プロセスの後にそれらの繊維芽細胞の形態を維持することを立証した。
【0252】
培養物が合流の８０％に達した時、間葉系幹細胞はトリプシン－ＥＤＴＡを伴う酵素の解離によって回収された。
【0253】
回復した機能的な間葉系幹細胞の富化集団を次に実施例２の組成物３中に再懸濁し、５ｍｌのシリンジにおいて２ｍｌ中に再懸濁した２０±２００万細胞の用量でパッケージング・プロセスを行った。
【0254】
機能的な間葉系細胞の富化集団が凍結保存および解凍プロセスの後に核型レベルで変性を示したかどうかを確証するために、細胞遺伝学の調査によってそれらを分析した。この分析から得られた結果は染色体異常を示さない。対照の結果を表１１に示す。
【0255】
【表11】
【0256】
反応性物質上でのフローサイトメトリーによって免疫表現型の調査を実行し、得られた組成物の機能的な間葉系細胞の富化集団が９０％以上のパーセンテージでＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６を発現し、およびＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲについては発現が１０％以下だったため陰性であることを示した。表１２は、分析された２ドナーから性物質を得る時点での、フローサイトメトリーによって分析されたマーカーの発現パーセンテージを示す。
【0257】
【表12】
【0258】
加えて、実施した能力の調査では、細胞が軟骨組織に分化することが観察された。それらを順化培地で３０日間培養株において保持し、また、アルシアンブルーで染めることにより組織学的調査を行い、軟骨への分化細胞において酸性の多糖類を見出すことが可能となった。最終生成物について行った対照の結果を表１３に示す。
【0259】
【表13】
【0260】
本発明の方法によって得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含有する、得られた組成物は、実施例２による組成物３中に再懸濁された２０００万±２００万細胞を内包していた。
【0261】
この場合、それが椎間板再生の処置について確立された密度であるため、１ｍｌ中１０００万のパッケージングを選んだ。それらの組成物を、２～８℃にて７２時間の安定性がある、２ｍｌの細胞懸濁液を内包する５ｍｌのシリンジ中に充填した。
【0262】
本発明の組成物を保持する容器は、生成物のデータを含むラベルで識別される。その後、この容器を無菌のバッグへ導入し、および無菌ゾーンからコンディショニング領域へ出し、ここで対応する識別を備えた箱において二次パッケージングを行なった。
【0263】
温度が１６８時間以内２～８℃の間に維持すること保証し、またすべての生成物の温度の輸送プロセスの全体にわたるグラフを提供するデータロガーを内包する検証された恒温パッケージにおいて組成物を輸送した。
【0264】
加えて、全体の製造工程にわたって組成物の無菌の製造を確実にした。
【0265】
実施例６：細胞の生存率の評価
本発明の方法に従って得られた組成物に含まれる間葉系幹細胞の細胞生存率プロファイルを、現在の凍結保存法と比較する。
本発明の方法に従って得られた組成物に含まれる間葉系幹細胞の細胞生存率プロファイルを、現在の凍結保存法と比較する。
【0266】
この目的のために、間葉系幹細胞の最初のサンプルを１０％ＤＭＳＯとＦＢＳで凍結保存し、１０％ＣＯ２を含むＤＭＥＭで３５～３９℃で回復し、本発明の方法に従って組成物３を得るために輸送調整された。
【0267】
間葉系幹細胞の第２のサンプルをＨｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標） ＦＲＳ（ＤＭＳＯを含まない）で凍結し、室温（２１～２５℃）で解凍した。
【0268】
間葉系幹細胞の第３のサンプルを１０％のＤＭＳＯを含む生理食塩水で凍結し、室温（２１～２５℃）で解凍した。
【0269】
値は３ドナーの平均値＋／－ＳＤである。すべての測定を３回繰り返して行った。
【0270】
図３に見られるように、本発明の方法に従って得られた組成物に含まれる間葉系幹細胞は、７２時間の保存後でも８０％以上の生存率を提供した（黒い棒グラフ）。他方、ＤＭＳＯを含まないＨｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）ＦＲＳで凍結保存し、室温で解凍した間葉系幹細胞（斜線付きの棒グラフ）は、わずか２４時間の保存で５０％以下の生存率となった。生理食塩水中のＤＭＳＯで凍結保存した細胞を、本発明の手順に従って回復せずに直接解凍した場合の生存率の結果はさらに低かった。本発明に従って得られた組成物のみが、延期される治療目的での使用に十分な安定性と生存率を示した。
【0271】
参考実施例７：ＤＭＳＯ存在下での新鮮な間葉系幹細胞の細胞増殖プロファイルの評価
ＤＭＳＯが混入している可能性のある現在の凍結保存法におけるＤＭＳＯの影響を評価するため、ＤＭＳＯ存在下での間葉系幹細胞の細胞増殖プロファイルを分析した。
ＤＭＳＯが混入している可能性のある現在の凍結保存法におけるＤＭＳＯの影響を評価するため、ＤＭＳＯ存在下での間葉系幹細胞の細胞増殖プロファイルを分析した。
【0272】
示されるように、この目的のために、新鮮に調製したＭＳＣのサンプルを、ＦＢＳ、１０％のＣＯ２および異なる濃度のＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【0273】
参考図４は、ＤＭＳＯは０．３％という低濃度でも成長を大きく阻害することを示しており、これにより、凍結解凍工程での使用中に発生するようなＤＭＳＯなどがわずかなに混入するだけでもでも成長を阻害する可能性があることが示唆される。
【0274】
実施例８：細胞増殖プロファイルの評価
また、本発明の方法に従って得られた、凍結保存され、回復され、輸送調整された機能的な間葉系幹細胞を含む組成物について、解凍、回復、および、４℃で７２時間輸送した後の細胞増殖も評価した（ＣＲＴ）。
また、本発明の方法に従って得られた、凍結保存され、回復され、輸送調整された機能的な間葉系幹細胞を含む組成物について、解凍、回復、および、４℃で７２時間輸送した後の細胞増殖も評価した（ＣＲＴ）。
【0275】
図４のように、この目的のために、間葉系幹細胞のサンプルを１０％ＤＭＳＯとＦＢＳで凍結保存し、１０％ＣＯ２を含むＤＭＥＭを用いて３５～３９℃で７日間復元し、本発明の方法に従って組成物３を得るために輸送調整し、７２時間、低体温（２～８℃）でインキュベートし、その後、培養した。
【0276】
図５は、本発明の方法で得た組成物中に含まれた間葉系幹細胞の増殖プロファイルがＤＭＳＯなしで培養された細胞のプロファイル（図４）とどのくらい類似しているかを示している。このことは、本明細書に記載された回復のプロセスが、本発明の方法による回復、および輸送溶液における調節に続く、７２時間の低体温保管の後にさえ、顕著に改善された細胞の生存率プロファイルをもたらしながら、凍結保存中のＤＭＳＯの使用において見つかった如何なる可能な相互作用と毒性をも除去することを意味する。
【0277】
本発明の方法によって得られた組成物の安定性、生存率、および細胞増殖プロファイルは、それらの保管および治療における延期された使用を可能にし、および、投与時のＤＭＳＯの毒性に関する課題を解決する。本発明の方法はまた、適切な表現型、細胞増殖、および生存率を備えた治療投与のために十分な数間葉系幹細胞を得ることを可能にし、先行技術において記載されていた課題を解決する。最適な結果には、適切な組成物が要求されるだけでなく、記載された、それぞれにおける工程、即ち凍結保存、回復、および輸送調整手順の、各基礎工程の適切な順序および持続時間も要求される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
