特許7402163IP Force 特許公報全文掲載

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分野 本出願は、２Ａ型アッシャー症候群を処置するための材料および方法を提供する。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

概要 ２Ａ型アッシャー症候群を、排除しないとしても改善するための新規な方法を提示する。この新規なアプローチは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ４０変異を、この変異を含む遺伝子によってコードされるスプライスドナー部位として使用される配列の破壊をもたらす方法により、標的とする。スプライスドナー部位は、誤ったスプライシングを引き起こす。さらに、一部の場合には、処置は、少な・・・　続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1A】 図１Ａ～Ｂは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。図１Ａは、ｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。
【図1B】 図１Ａ～Ｂは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。図１Ｂは、ｓｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。
【図2A】 図２Ａ～Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ａ～Ｂは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
【図2B】 図２Ａ～Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ａ～Ｂは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
【図2C】 図２Ａ～Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｃ～Ｄは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を示す。
【図2D】 図２Ａ～Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｃ～Ｄは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を示す。
【図2E】 図２Ａ～Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｅ～Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
【図2F】 図２Ａ～Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｅ～Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
【図2G】 図２Ｇ～Ｉは、あるｓｇＲＮＡ配列について、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｇは、あるｓｇＲＮＡ配列について、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
【図2H】 図２Ｇ～Ｉは、あるｓｇＲＮＡ配列について、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｈは、あるｓｇＲＮＡ配列について、標的ＤＮＡ配列を示す。
【図2I】 図２Ｇ～Ｉは、あるｓｇＲＮＡ配列について、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｉは、あるｓｇＲＮＡ配列について、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
【図2J】 図２Ｊ～Ｌは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｊは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
【図2K】 図２Ｊ～Ｌは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｋは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を示す。
【図2L】 図２Ｊ～Ｌは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｌは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
【図3】 図３は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０に位置するＩＶＳ４０変異、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異を編集する結果、およびＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異を編集しない結果を示す図である。
【図4A】 図４Ａ～Ｂは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によってゲノムＤＮＡに導入されるＩＶＳ４０変異を示し、ＩＶＳ４０変異は、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０における一塩基変異（ＡからＧ）である。図４Ａは、ＨＤＲによるゲノムＤＮＡへのＩＶＳ４０変異の導入を示す。
【図4B】 図４Ａ～Ｂは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によってゲノムＤＮＡに導入されるＩＶＳ４０変異を示し、ＩＶＳ４０変異は、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０における一塩基変異（ＡからＧ）である。図４Ｂは、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０における一塩基変異（ＡからＧ）としてのＩＶＳ４０変異を示す。
【図5A】 図５Ａ～Ｂは、いくつかのＵＳＨ２Ａ ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡの結合領域、ならびにＵＳＨ２Ａ ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのそれぞれについて、オンターゲットおよびオフターゲット編集効率を示す。図５Ａは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のＩＶＳ４０変異の周囲のいくつかのｓｇＲＮＡスペーサー領域（配列番号５３２１、５３２３、５３２５、５３２７、および５３２８）の結合領域を示す。先端は、ゲノムＤＮＡにおいてＰＡＭ配列に隣接する領域である。
【図5B】 図５Ａ～Ｂは、いくつかのＵＳＨ２Ａ ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡの結合領域、ならびにＵＳＨ２Ａ ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのそれぞれについて、オンターゲットおよびオフターゲット編集効率を示す。図５Ｂは、図５Ａに示されるＵＳＨ２Ａ ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのそれぞれについて、オンターゲットおよびオフターゲット編集効率を示す。
【図6A】 図６Ａ～Ｃは、（１）ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９と会合し、（２）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、またはＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、ｓｇＲＮＡについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、－８－（＋１１）は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の８ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の１１ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、－５７１－５９０は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の５７１ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の５９０ヌクレオチド上流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、＋７４４－７６３は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の７４４ヌクレオチド下流の位置からＩＶＳ４０の７６３ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。図６Ａ～Ｂは、ＳｐＣａｓ９と会合し、（１）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、（２）ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、または（３）ＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、５２個のｓｇＲＮＡのそれぞれについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。
【図6B】 図６Ａ～Ｃは、（１）ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９と会合し、（２）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、またはＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、ｓｇＲＮＡについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、－８－（＋１１）は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の８ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の１１ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、－５７１－５９０は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の５７１ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の５９０ヌクレオチド上流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、＋７４４－７６３は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の７４４ヌクレオチド下流の位置からＩＶＳ４０の７６３ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。図６Ａ～Ｂは、ＳｐＣａｓ９と会合し、（１）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、（２）ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、または（３）ＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、５２個のｓｇＲＮＡのそれぞれについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。
【図6C】 図６Ａ～Ｃは、（１）ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９と会合し、（２）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、またはＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、ｓｇＲＮＡについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、－８－（＋１１）は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の８ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の１１ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、－５７１－５９０は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の５７１ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の５９０ヌクレオチド上流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、＋７４４－７６３は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の７４４ヌクレオチド下流の位置からＩＶＳ４０の７６３ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。図６Ｃは、ＳａＣａｓ９と会合し、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、または（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、１６個のｓｇＲＮＡのそれぞれについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。
【図7A】 図７Ａ～Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ａは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合、およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合を示す。
【図7B】 図７Ａ～Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｂは、ＩＶＳ４０変異を含む編集されていないゲノムＤＮＡを示す。
【図7C】 図７Ａ～Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｃは、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合する第１のｓｇＲＮＡまたは（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合する第２のｓｇＲＮＡのいずれかによる、ゲノムＤＮＡの編集を示す。
【図7D】 図７Ａ～Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｄは、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合する第１のｓｇＲＮＡおよび（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合する第２のｓｇＲＮＡの両方によるものであるが、編集が欠失をもたらさない、ゲノムＤＮＡの編集を示す。
【図7E】 図７Ａ～Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｅは、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合する第１のｓｇＲＮＡおよび（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合する第２のｓｇＲＮＡの両方によるものであり、編集が欠失をもたらす、ゲノムＤＮＡの編集を示す。
【図7F】 図７Ａ～Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｆは、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合する第１のｓｇＲＮＡおよび（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合する第２のｓｇＲＮＡの両方によるものであるが、編集が欠失をもたらさない、ゲノムＤＮＡの編集を示す。代わりに、編集は、逆転をもたらす。
【図8】 図８は、ｄｄＰＣＲを使用して、欠失の定量分析を行うためのスキームである。
【図9A】 図９Ａ～Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す。それぞれの二重ｓｇＲＮＡを構成する図９Ａ～Ｂに含まれるｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９と会合する。図９Ａは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す表である。
【図9B】 図９Ａ～Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す。それぞれの二重ｓｇＲＮＡを構成する図９Ａ～Ｂに含まれるｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９と会合する。図９Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示すグラフである。
【図10】 図１０は、ＳａＣａｓ９と会合するｓｇＲＮＡをコードするように操作することができる、ｐＡＡＶ－Ｕ６プラスミドを示す。
【図11A】 図１１Ａ～Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す。それぞれの二重ｓｇＲＮＡを構成する図１１Ａ～Ｂに含まれるｓｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９と会合する。図１１Ａは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す表である。
【図11B】 図１１Ａ～Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す。それぞれの二重ｓｇＲＮＡを構成する図１１Ａ～Ｂに含まれるｓｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９と会合する。図１１Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示すグラフである。
【図12A】 図１２Ａ～Ｃは、スプライシングレポータープラスミドであるｐＥＴ０１；２つの異なるＵＳＨ２Ａ ＤＮＡインサートの概略図；ならびに２つの異なるスプライスレポータープラスミドのうちの１つおよび４つの異なるＵＳＨ２Ａ ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのうちの１つをトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３ ＳｐＣａｓ９陽性細胞のｍＲＮＡから増幅させたＲＴ－ＰＣＲ産物のゲル画像を示す。図１２Ａは、スプライシングレポータープラスミドｐＥＴ０１を示す。
【図12B】 図１２Ａ～Ｃは、スプライシングレポータープラスミドであるｐＥＴ０１；２つの異なるＵＳＨ２Ａ ＤＮＡインサートの概略図；ならびに２つの異なるスプライスレポータープラスミドのうちの１つおよび４つの異なるＵＳＨ２Ａ ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのうちの１つをトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３ ＳｐＣａｓ９陽性細胞のｍＲＮＡから増幅させたＲＴ－ＰＣＲ産物のゲル画像を示す。図１２Ｂは、２つの異なるＵＳＨ２Ａ ＤＮＡインサート（変異体イントロン４０の一部または野生型イントロン４０の一部）およびインサートの周囲のベクターエレメントを示す。対応するＲＮＡスプライス産物（変異体スプライス産物または野生型スプライス産物）もまた、示される。
【図12C】 図１２Ａ～Ｃは、スプライシングレポータープラスミドであるｐＥＴ０１；２つの異なるＵＳＨ２Ａ ＤＮＡインサートの概略図；ならびに２つの異なるスプライスレポータープラスミドのうちの１つおよび４つの異なるＵＳＨ２Ａ ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのうちの１つをトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３ ＳｐＣａｓ９陽性細胞のｍＲＮＡから増幅させたＲＴ－ＰＣＲ産物のゲル画像を示す。図１２Ｃは、２つの異なるスプライスレポータープラスミド（変異体イントロン４０の一部を含むプラスミドまたは野生型イントロン４０の一部を含むプラスミド）のうちの１つ、ならびに４つの異なるＵＳＨ２Ａ ＩＶＳ４０変異－ターゲティングｓｇＲＮＡ（５３２１、５３２３、５３２５、または５３２７を含むｓｇＲＮＡ）のうちの１つをトランスフェクトした、ＨＥＫ ２９３ ＳｐＣａｓ９陽性細胞のｍＲＮＡから増幅させたＲＴ－ＰＣＲ産物のゲル画像を示す。
【図13A】 図１３Ａ～Ｃは、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）スプライシングレポーターアッセイに使用した構築物、ならびにゲノム編集が、構築物およびそれによるＢＦＰ遺伝子発現に対して有し得る、可能性のある効果を示す。図１３Ａは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを使用した、ＢＦＰを発現する構築物を示す。ＢＦＰ遺伝子は、ＢＦＰ ＯＲＦの上流に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０野生型配列の一部を含む。ＢＦＰの発現が、予測される。
【図13B】 図１３Ａ～Ｃは、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）スプライシングレポーターアッセイに使用した構築物、ならびにゲノム編集が、構築物およびそれによるＢＦＰ遺伝子発現に対して有し得る、可能性のある効果を示す。図１３Ｂは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを使用した、ＢＦＰを発現する構築物を示す。ＢＦＰ遺伝子は、ＢＦＰ ＯＲＦの上流に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０のＩＶＳ４０変異体配列の一部を含む。ＢＦＰの発現は、予測されない。
【図13C】 図１３Ａ～Ｃは、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）スプライシングレポーターアッセイに使用した構築物、ならびにゲノム編集が、構築物およびそれによるＢＦＰ遺伝子発現に対して有し得る、可能性のある効果を示す。図１３Ｃは、図１３Ｂからの構築物を、ゲノム編集前の第１の構成およびゲノム編集後の第２の構成で、示す。ゲノム編集後には、ＢＦＰの発現が予測される。
【図14】 図１４は、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイに供した後に、ＢＦＰを発現した生細胞のパーセントを示す。単一ｓｇＲＮＡおよび二重ｓｇＲＮＡを使用した編集戦略のデータが、示される。ｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９と対にした。
【図15】 図１５は、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイに供した後に、ＢＦＰを発現した生細胞のパーセントを示す。二重ｓｇＲＮＡを使用する編集戦略のデータが、示される。これらのｓｇＲＮＡ対を、ＳａＣａｓ９と対にした。
【図16】 図１６は、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイに供した後に、ＢＦＰを発現したＧＦＰ陽性細胞のパーセントを示す。単一ｓｇＲＮＡおよび二重ｓｇＲＮＡを使用する編集戦略のデータが、示される。これらのｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９のいずれかと対にした。編集の陰性対照もまた、示される。
【図17A】 図１７Ａ～Ｂは、ＵＳＨ２Ａ転写物のｄｄＰＣＲアッセイにおいて使用されるプライマーおよびプローブによって結合される部位を示す。図１７Ａは、ＩＶＳ４０変異体ＵＳＨ２Ａ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの配列を示す。プライマーおよびプローブが対応するｃＤＮＡに結合する位置もまた、示される。
【図17B】 図１７Ａ～Ｂは、ＵＳＨ２Ａ転写物のｄｄＰＣＲアッセイにおいて使用されるプライマーおよびプローブによって結合される部位を示す。図１７Ｂは、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子（または編集されたＵＳＨ２Ａ遺伝子）から転写されるｍＲＮＡの配列を示す。プライマーおよびプローブが対応するｃＤＮＡに結合する位置もまた、示される。
【図18】 図１８は、本開示によるゲノム編集に供された、ＩＶＳ４０変異体細胞における修正された転写物および修正されていない転写物のパーセントを示す。単一ｓｇＲＮＡおよび二重ｓｇＲＮＡを使用した編集戦略のデータを、示す。これらのｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９と対にした。陰性対照もまた、示される。

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