(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-12
(45)【発行日】2023-12-20
(54)【発明の名称】抗体変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231213BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20231213BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20231213BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231213BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231213BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20231213BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20231213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/24
A61P1/04
A61P29/00
A61K39/395 U
C12N15/63 Z
C12P21/08
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2022210008
(22)【出願日】2022-12-27
(62)【分割の表示】P 2020516456の分割
【原出願日】2018-09-11
(65)【公開番号】P2023036885
(43)【公開日】2023-03-14
【審査請求日】2023-01-24
(31)【優先権主張番号】17191989.7
(32)【優先日】2017-09-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】518330316
【氏名又は名称】ティロッツ ファーマ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】ＴＩＬＬＯＴＴＳ ＰＨＡＲＭＡ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｂａｓｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ １５，４３１０ Ｒｈｅｉｎｆｅｌｄｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100077012
【弁理士】
【氏名又は名称】岩谷 龍
(72)【発明者】
【氏名】フラー，エステル マリア
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１８７１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－０６０４９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－０５１２０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１３４８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１０６３８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】The Journal of Immunology，2009年，Vol. 182，p. 7663-7671，doi:10.4049/jimmunol.0804182
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ０７Ｋ １６／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＮＦα結合ドメイン及びＦｃＲｎ結合部位を備える抗体であって、ｐＨ６でヒトＦｃＲｎに対して高親和性を有し、前記高親和性は１００ｎＭ未満の解離平衡定数（ＫＤ）を特徴とし、更にｐＨ７．４でヒトＦｃＲｎに対して親和性を有さず又は低親和性を有し、前記低親和性は１０μＭよりも大きいＫＤを特徴とし、当該抗体のアミノ酸配列はアミノ酸４３４Ｗを含み、
当該抗体は（ｉ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＶ Ｈ ドメイン、及び（ｉｉ）配列番号２１又は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＶ Ｌ ドメインを備える、抗体。
【請求項2】
前記抗体のアミノ酸配列は更に、アミノ酸４２８Ｅ及び／又はアミノ酸３１１Ｒを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体のアミノ酸配列はアミノ酸３１１Ｒ、４２８Ｅ及び４３４Ｗを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
ｐＨ６でヒトＦｃＲｎに対してインフリキシマブのそれよりも大きい親和性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する前記高親和性は、１０ｎＭ未満の解離定数ＫＤを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
１００ｐＭ未満のＫＤでヒトＴＮＦαに結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
インフリキシマブよりも多い量で、極性細胞単層を頂端側から基底側に横断して輸送される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
前記極性細胞単層を横断して輸送される抗体の量は、前記極性細胞単層を横断して輸送されるインフリキシマブの量の２倍よりも大きい、請求項７に記載の抗体。
【請求項9】
１０倍過剰の競合免疫グロブリンの存在下において、インフリキシマブの割合よりも高い割合の前記抗体が極性細胞単層を頂端側から基底側に横断して輸送され、前記割合は、前記極性細胞単層を横断して輸送される免疫グロブリンの総質量を指す、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項10】
前記極性細胞単層を横断して輸送される前記抗体の割合は、前記極性細胞単層を横断して輸送されるインフリキシマブの割合の３倍よりも高い、請求項９に記載の抗体。
【請求項11】
非フコシル化抗体又はフコシル化が低減された抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項12】
炎症状態の治療に使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項13】
前記炎症状態は消化管の炎症性障害である、請求項１２に記載の使用のための抗体。
【請求項14】
前記治療は、有効量の前記抗体を経口投与することを含む、請求項１２又は１３に記載の使用のための抗体。
【請求項15】
前記抗体は局所に適用される、請求項１２又は１３に記載の使用のための抗体。
【請求項16】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項17】
請求項１に記載の抗体のトランスサイトーシスを改善する方法であって、前記抗体のアミノ酸配列に置換Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｅ及びＮ４３４Ｗを導入することを含む、方法。
【請求項18】
請求項１に記載の抗体の血漿中半減期を延長する方法であって、前記抗体のアミノ酸配列に置換Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｅ及びＮ４３４Ｗを導入することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改変されたエフェクター機能及び／又は改変された薬物動態特性を有する修飾抗体に関する。抗体は、様々な障害、特に炎症状態の治療的処置に有用である。
【背景技術】
【0002】
モノクローナル抗体は過去２０年間にわたり、臨床医学において治療用薬剤としての重要性を増している。長年にわたり、抗体を改善する取組みは潜在的な免疫原性の低減に集中しており、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体さえももたらした。別のアプローチは、エフェクター機能を改善することにより抗体を最適化することを目的とする。直接的な効果は抗体の可変抗原結合領域によって媒介されるが、間接的な効果は定常Ｆｃ領域によって媒介される。エフェクター機能を改善する取組みは、主にＦｃ領域の調節に集中している。更に、治療用抗体の血清半減期を改善することが望ましく、これにより、必要な抗体の量を減らすことができ、治療間隔を延長することで患者の利便性を高めることができる。
【0003】
治療用途では、いくつかの理由により、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が好適な選択クラスであった。ＩｇＧは精製が容易で、保管時に比較的安定しており、静脈内投与でき、インビボにおける生物学的半減期が延長されており、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の活性化や様々なＦｃ受容体相互作用（抗体依存性細胞毒性；ＡＤＣＣ）によるエフェクター細胞の動員など、様々な生物学的エフェクター機能に関与することができる。５つの免疫グロブリンクラスのうち、ＩｇＧは、ＩｇＧリサイクル受容体である胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）とのユニークな相互作用により、最も長い生物学的半減期を示す。この受容体の既知の機能のひとつは、触媒分解からＩｇＧをレスキューすることである。解明されたＦｃＲｎ－Ｆｃ共結晶構造は、ＩｇＧヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３領域においてＦｃとの相互作用が発生することを示している。この相互作用は、エンドソームにおいて酸性ｐＨ６．０～６．５で厳密にｐＨ依存的に発生する。結合したＩｇＧ分子はリサイクルされて細胞表面に戻り、そこで生理的ｐＨ７．４で循環に放出されるが、非複合ＩｇＧ分子はリソソーム分解の運命にある。このリサイクルは、ＩｇＧの半減期を延長するメカニズムである。したがって、ＦｃＲｎ－ＩｇＧ相互作用の調節により、ガンマ免疫グロブリン及びＦｃ融合タンパク質の血清半減期を特異的に制御することができる。
【0004】
用途によっては、ＩｇＧの血清滞留時間を延長又は短縮することが望ましいことがある。治療用途では、用量が小さく注入が少ないことが要求され得るので、より長い半減期が望ましい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の使用、アルブミン融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質の生成、ＦｃＲｎ－ＩｇＧ相互作用の強化など、半減期を増大するためのいくつかのアプローチが調査されている。ＰＥＧ化医薬品は１９９０年以来病院で用いられており、ＰＥＧ化は血液中の薬物滞留を延長するための確立された技術である。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もｐＨ依存性相互作用を介してＦｃＲｎによってリサイクルされるので、安定性と半減期を向上させるいくつかのアルブミン融合タンパク質も作製されている。更に、アルブミンに融合した抗体フラグメント又はアルブミン結合ドメインは、前臨床研究において血清滞留時間の延長を実証している。Ｆｃ融合タンパク質の生成は、インタクト抗体と同様の特性をもつタンパク質又はペプチドをもたらし得る別の戦略である。
【0005】
調査されたＦｃ領域の修飾は、Ｓａｘｅｎａ（２０１６）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ａｒｔｉｃｌｅ５８０にまとめられている。
【0006】
改善されたエフェクター機能及び／又は薬物動態を有する抗体には継続的に需要がある。
【発明の概要】
【0007】
本願の発明者らは、抗体のＦｃ領域におけるある特異的変異が、ｐＨ６でのＦｃＲｎに対する抗体の親和性を劇的に増加させるが、ｐＨ７．４での親和性は低いままであることを見出した。変異を有する抗体は、薬物動態特性が改善されると予想される。更に抗体は、インフリキシマブ（ＩＦＸ）などの既知の抗体と比較して優れたエフェクター機能を呈する。
【0008】
したがって本発明は、以下の項目［１］～［８８］に定義される主題に関する。
【0009】
［１］ＴＮＦα－結合ドメイン及びＦｃＲｎ－結合部位を備える抗体であって、ｐＨ６でヒトＦｃＲｎに対して高親和性を有し、上記高親和性は１００ｎＭ未満の解離平衡定数（ＫＤ）を特徴とし、更に、ｐＨ７．４でヒトＦｃＲｎに対して低親和性を有し、上記低親和性は１μＭよりも大きいＫＤを特徴とし、抗体のアミノ酸配列はアミノ酸４３４Ｗを含む、抗体。
【0010】
［２］抗体のアミノ酸配列は更に、アミノ酸４２８Ｅ及び／又はアミノ酸３１１Ｒを含む、項目［１］の抗体。
【0011】
［３］抗体のアミノ酸配列はアミノ酸３１１Ｒ、４２８Ｅ及び４３４Ｗを含む、項目［１］又は［２］の抗体。
【0012】
［４］抗体は、４３４位のアスパラギンをトリプトファンに置換する（Ｎ４３４Ｗ）こと、任意に４２８位のメチオニンをグルタミン酸に置換する（Ｍ４２８Ｅ）こと、及び任意に３１１位のグルタミンをアルギニンに置換する（Ｑ３１１Ｒ）ことによって得られる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0013】
［５］抗体は４２８位のメチオニンをグルタミン酸に置換する（Ｍ４２８Ｅ）ことによって得られる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0014】
［６］抗体は３１１位のグルタミンをアルギニンに置換する（Ｑ３１１Ｒ）ことによって得られる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0015】
［７］配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を有する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0016】
［８］ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する親和性はインフリキシマブのそれよりも大きい、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0017】
［９］ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する上記高親和性は５０ｎＭ未満の解離定数ＫＤを特徴とする、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0018】
［１０］ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する上記高親和性は２５ｎＭ未満の解離定数ＫＤを特徴とする、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0019】
［１１］ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する上記高親和性は１０ｎＭ未満の解離定数ＫＤを特徴とする、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0020】
［１２］１ｎＭ～５００ｎＭ、又は２ｎＭ～１００ｎＭ、又は３ｎＭ～５０ｎＭ、又は４ｎＭ～２５ｎＭ、又は５ｎＭ～１０ｎＭの範囲の解離定数ＫＤを特徴とする、ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する親和性を有する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0021】
［１３］上記高親和性、又は上記高親和性を特徴付ける上記ＫＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定される、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0022】
［１４］ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する上記低親和性は、１０μＭよりも大きいＫＤを特徴とする、先行項目のいずれか１つに記載の抗体。
【0023】
［１５］ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する親和性を特徴付ける上記ＫＤはＳＰＲによって決定される、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0024】
［１６］ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する親和性は、ＳＰＲによってＫＤ値を決定できない程度に低い、項目［１］～［１５］のいずれか１つの抗体。
【0025】
［１７］２００ｐＭ未満のＫＤでヒトＴＮＦαに結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0026】
［１８］１００ｐＭ未満のＫＤでヒトＴＮＦαに結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0027】
［１９］５０ｐＭ未満のＫＤでヒトＴＮＦαに結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0028】
［２０］２５ｐＭ未満のＫＤでヒトＴＮＦαに結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0029】
［２１］１０ｐＭ未満のＫＤでヒトＴＮＦαに結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0030】
［２２］極性細胞単層を頂端側から基底側に横断して輸送される、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0031】
［２３］配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖とを有する対照抗体よりも多い量で、極性細胞単層を頂端側から基底側に横断して輸送される、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0032】
［２４］インフリキシマブよりも多い量で、極性細胞単層を頂端側から基底側に横断して輸送される、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0033】
［２５］極性細胞単層を横断して輸送される抗体の量は、極性細胞単層を横断して輸送されるインフリキシマブの量の２倍よりも大きい、項目［２４］の抗体。
【0034】
［２６］上記量は、４時間以内に極性細胞単層を横断して輸送される抗体の質量を指す、項目［２３］～［２５］のいずれか１つの抗体。
【0035】
［２７］極性細胞単層を横断して輸送される抗体の量は、極性細胞単層を横断して輸送される親免疫グロブリンの量の２倍よりも多く、上記親免疫グロブリンは、そのＦｃ領域が野生型アミノ酸のみを有するという点でのみ、上記抗体と異なる、項目［２２］～［２６］のいずれか１つの抗体。
【0036】
［２８］１０倍過剰の競合免疫グロブリンの存在下において、インフリキシマブの割合よりも高い割合の抗体が極性細胞単層を頂端側から基底側に横断して輸送され、割合は、極性細胞単層を横断して輸送される免疫グロブリンの総質量を指す、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0037】
［２９］極性細胞単層を横断して輸送される抗体の割合は、極性細胞単層を横断して輸送される親免疫グロブリンの割合の３倍よりも高く、上記親免疫グロブリンは、そのＦｃ領域が野生型アミノ酸のみを有するという点でのみ、上記抗体と異なる、項目［２８］の抗体。
【0038】
［３０］極性細胞単層を横断して輸送される抗体の割合は、極性細胞単層を横断して輸送されるインフリキシマブの割合の３倍よりも大きい、項目［２８］又は［２９］の抗体。
【0039】
［３１］上記極性細胞単層は極性Ｔ８４細胞の単層である、項目［２２］～［３０］のいずれか１つの抗体。
【0040】
［３２］１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤでＣＤ６４に結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0041】
［３３］１０μＭ未満のＫＤでＣＤ３２ａ（Ｈ）に結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0042】
［３４］１０μＭ未満のＫＤでＣＤ３２ａ（Ｒ）に結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0043】
［３５］１０μＭ未満のＫＤでＣＤ３２ｂに結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0044】
［３６］５００ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満のＫＤでＣＤ１６ａ（Ｖ）に結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0045】
［３７］１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満のＫＤでＣＤ１６ａ（Ｆ）に結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0046】
［３８］１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満のＫＤでＣＤ１６ｂ（ＮＡ２）に結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0047】
［３９］インフリキシマブよりも高い強度でヒトＣ１ｑに結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0048】
［４０］相対的ＥＣ５０及び／又は相対最大死亡率に関して、ウサギ補体の補体依存性細胞毒性がインフリキシマブよりも大きい、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0049】
［４１］インフリキシマブ以上のレベルでＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋マクロファージを誘導することができる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0050】
［４２］インフリキシマブ以上の程度でＴ細胞増殖を抑制することができる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0051】
［４３］非フコシル化抗体又はフコシル化が低減された抗体である、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0052】
［４４］（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域とを有するＶＬドメイン、及び（ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域とを有するＶＨドメインを備える、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0053】
［４５］配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを備える、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0054】
［４６］配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖とを備える、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0055】
［４７］上記抗体は、（ｉ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域とを有するＶＬドメイン、及び（ｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域とを有するＶＨドメインを備える、項目［１］～［４３］のいずれか１つの抗体。
【0056】
［４８］配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１又は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを備える、項目［４７］の抗体。
【0057】
［４９］配列番号２３又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖とを備える、項目［４７］又は［４８］の抗体。
【0058】
［５０］上記抗体はヒトＴＮＦαに特異的に結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0059】
［５１］上記抗体はＴＮＦβに有意に結合しない、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0060】
［５２］上記抗体は、
（ｉ）１２５ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＴＮＦαに結合し、
（ｉｉ）アカゲザルＴＮＦα及びカニクイザルＴＮＦαとの交差反応性を有し、
（ｉｉｉ）Ｌ９２９アッセイで決定される効力がインフリキシマブよりも大きく、且つ／又は、
（ｉｖ）少なくとも２のストイキオメトリ（抗体：ＴＮＦαＴｒｉｍｅｒ）でヒトＴＮＦαＴｒｉｍｅｒに結合することができる、先行項目のいずれか１つの抗体。
（ｉ）１２５ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＴＮＦαに結合し、
（ｉｉ）アカゲザルＴＮＦα及びカニクイザルＴＮＦαとの交差反応性を有し、
（ｉｉｉ）Ｌ９２９アッセイで決定される効力がインフリキシマブよりも大きく、且つ／又は、
（ｉｖ）少なくとも２のストイキオメトリ（抗体：ＴＮＦαＴｒｉｍｅｒ）でヒトＴＮＦαＴｒｉｍｅｒに結合することができる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0061】
［５３］１ｎＭ未満のＫＤでアカゲザル由来のＴＮＦαに結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0062】
［５４］１ｎＭ未満のＫＤでカニクイザル由来のＴＮＦαに結合する、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0063】
［５５］Ｌ９２９アッセイで決定された、ＴＮＦα誘発アポトーシスを阻害する抗体の効力は、インフリキシマブのそれと比較すると（相対効力）３．５よりも大きく、上記相対効力は、Ｌ９２９アッセイにおけるインフリキシマブのｎｇ／ｍＬ単位のＩＣ５０値の、Ｌ９２９アッセイにおける抗体のｎｇ／ｍＬ単位のＩＣ５０値に対する比である、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0064】
［５６］示差走査蛍光定量法により決定されるｓｃＦｖ形式の抗体の可変ドメインの融解温度は少なくとも６５℃である、先行項目のいずれか１つに記載の抗体。
【0065】
［５７］示差走査蛍光定量法により決定されるｓｃＦｖ形式の抗体の可変ドメインの融解温度は少なくとも６８℃である、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0066】
［５８］示差走査蛍光定量法により測定される融解温度は少なくとも７０℃である、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0067】
［５９］上記抗体は、ヒトＴＮＦαとＴＮＦ受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ）との間の相互作用を遮断することができる、先行項目のいずれか１つに記載の抗体。
【0068】
［６０］上記抗体は、ヒトＴＮＦαとＴＮＦ受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）との間の相互作用を遮断することができる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0069】
［６１］混合リンパ球反応における末梢血単核細胞の細胞増殖を阻害することができる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0070】
［６２］ＣＤ１４＋単球からのインターロイキン１βのＬＰＳ誘導性分泌を阻害することができる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0071】
［６３］インターロイキン１βのＬＰＳ誘導性分泌を阻害するためのＩＣ５０値は１ｎＭ未満である、項目［６２］の抗体。
【0072】
［６４］インターロイキン１βのＬＰＳ誘導性分泌を阻害するための上記ＩＣ５０値は、モル基準で、アダリムマブのそれよりも低い、項目［６３］の抗体。
【0073】
［６５］ＣＤ１４＋単球からのＴＮＦαのＬＰＳ誘導性分泌を阻害することができる、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0074】
［６６］ＴＮＦαのＬＰＳ誘導性分泌を阻害するためのＩＣ５０値は１ｎＭ未満である、項目［６５］の抗体。
【0075】
［６７］ＴＮＦαのＬＰＳ誘導性分泌を阻害するための上記ＩＣ５０値は、モル基準で、アダリムマブのそれよりも低い、項目［６６］の抗体。
【0076】
［６８］免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、好ましくはＩｇＧ１である、先行項目のいずれか１つの抗体。
【0077】
［６９］先行項目のいずれか１つの抗体をコードする核酸。
【0078】
［７０］項目［６９］の核酸を含むベクター又はプラスミド。
【0079】
［７１］項目［６９］に記載の核酸又は項目［７０］のベクター若しくはプラスミドを含む細胞。
【0080】
［７２］項目［１］～［６８］のいずれか１つの抗体を作製する方法であって、抗体をコードする核酸の発現を可能にする条件下にある培地で項目［７１］の細胞を培養することと、細胞又は培地から抗体を回収することと、を含む方法。
【0081】
［７３］炎症状態又はＴＮＦα関連障害の治療における使用のための、項目［１］～［６８］のいずれか１つの抗体。
【0082】
［７４］上記炎症性障害は、以下のセクション「治療対象の障害」に記載される疾患及び障害のリストから選択される、項目［７３］に係る使用のための抗体。
【0083】
［７５］上記炎症性障害は消化管の炎症性障害である、項目［７３］使用のための抗体。
【0084】
［７６］上記消化管の炎症性障害は炎症性腸疾患である、項目［７５］に記載の使用のための抗体。
【0085】
［７７］上記消化管の炎症性障害はクローン病である、項目［７５］又は［７６］に係る使用のための抗体。
【0086】
［７８］上記クローン病は、回腸クローン病、結腸クローン病、回腸結腸クローン病又は限局性上部クローン病（胃、十二指腸及び／又は空腸）から成り、非狭窄性／非穿通性、狭窄性、穿通性及び肛門周囲の疾患経過を含む群から選択され、上記のいずれかの局在及び疾患経過の任意の組み合わせが考慮される、項目［７７］に係る使用のための抗体。
【0087】
［７９］上記消化管の炎症性障害は潰瘍性大腸炎である、項目［７５］又は［７６］に係る使用のための抗体。
【0088】
［８０］上記潰瘍性大腸炎は、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側大腸炎、全潰瘍性大腸炎及び回腸嚢炎から成る群から選択される、項目［７９］に係る使用のための抗体。
【0089】
［８１］上記消化管の炎症性障害は顕微鏡的大腸炎である、項目［７５］又は［７６］に係る使用のための抗体。
【0090】
［８２］上記炎症性障害は関節炎である、項目［７３］に係る使用のための抗体。
【0091】
［８３］上記炎症性障害は関節リウマチである、項目［７３］又は［８２］に記載の使用のための抗体。
【0092】
［８４］上記方法は、抗体を対象に経口投与することを含む、項目［７３］～［８３］のいずれか１つに係る使用のための抗体。
【0093】
［８５］上記方法は、抗体を局所的に適用することを含む、項目［７３］～［８４］のいずれか１つに係る使用のための抗体。
【0094】
［８６］項目［１］～［６８］のいずれか１つの抗体を含む医薬組成物。
【0095】
［８７］ＴＮＦαに対する抗体のトランスサイトーシスを改善する方法であって、抗体のアミノ酸配列に置換Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｅ及びＮ４３４Ｗを導入することを含む、方法。
【0096】
［８８］ＴＮＦαに対する抗体の血漿中半減期を延長する方法であって、抗体のアミノ酸配列に置換Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｅ及びＮ４３４Ｗを導入することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【0097】
【図1】Ｌ９２９アッセイにおける、抗ＴＮＦα抗体変異体のヒトＴＮＦαを中和する効力。抗ＴＮＦα抗体変異体と参照インフリキシマブの用量反応曲線を示す。
【図2】極性Ｔ８４細胞を横断する抗ＴＮＦα ＩｇＧ変異体の輸送。添加後４時間における頂端側から基底側リザーバーへの抗ＴＮＦα抗体変異体とインフリキシマブ（ＩＦＸ）の量を示す。ｎｇ／ｃｍ２として表示。エラーバーは、２～４つの個々の単層のＳＤを示す。
【図3】過剰量の骨髄腫ＩｇＧの存在下における、極性Ｔ８４細胞を横断する抗ＴＮＦα ＩｇＧ変異体の輸送。添加後４時間での１０倍過剰のヒト骨髄腫ＩｇＧの存在下における、頂端側から基底側リザーバーに輸送された抗ＴＮＦαＡｂ変異体とＩＦＸの量を示す。ｎｇ／ｃｍ２として表示。エラーバーは、３～４つの個々の単層のＳＤを示す。
【図4】ＡＤＣＣ活性。抗ＴＮＦα抗体変異体、野生型抗体及びＩＦＸによるＡＤＣＣの誘導。
【図5】ヒトＣ１ｑへの結合。ＩＦＸ及び抗ＴＮＦα抗体変異体のヒトＣ１ｑへの結合。各濃度は繰り返してアッセイされた。エラーバーはＳＤを示す。
【図6】ＣＤＣ活性。ＩＦＸと比較した様々な抗ＴＮＦα変異体の細胞死の割合。各標本点は、６つの独立した反復の平均である。
【図7】ＩＦＸの誘導と比較した各化合物によるＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋マクロファージの誘導。４つの独立した実験の要約データ。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図8】ＩＦＸと比較した各化合物によるＴ細胞増殖の抑制。３つの独立した実験の要約データ。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図9】部位特異的変異誘発の概略図。
【図10】抗ＴＮＦα抗体変異体のＮ２９７に結合した優勢なＮ－グリカン型の略図。試験した抗ＴＮＦα抗体変異体団の中で多数を占めた２つのＮ－グリカンプロファイルは４ＧｌｃＮａｃ－１Ｆｕｃ－３Ｍａｎと４ＧｌｃＮａｃ－１Ｆｕｃ－３Ｍａｎ－１Ｇａｌであったが、２ＦＦの存在下で産生されたＩｇＧ変異体については、これらがフコースを欠いたことを除いて同じ二分岐構造を生じた。
【発明を実施するための形態】
【0098】
本発明は、ＴＮＦαに結合することができＦｃＲｎ結合部位を備える抗体に関する。本願によれば、抗体は、ｐＨ６でＦｃＲｎ、好ましくはヒトＦｃＲｎに結合することができる場合、ＦｃＲｎ結合部位を備える。ｐＨ６でのＦｃＲｎへの結合は、例えば本願の実施例４に記載されるように、ＳＰＲによって決定することができる。ｐＨ６での抗体のＦｃＲｎへの結合がＳＰＲで検出できる場合、そのような抗体はＦｃＲｎ結合部位を有する。本発明の抗体は、ｐＨ６でヒトＦｃＲｎに対して高親和性を有し、これは１００ｎＭ未満の解離平衡定数（ＫＤ）を特徴とする。抗体は更に、ｐＨ７．４でヒトＦｃＲｎに対して低親和性を有し、これは１μＭよりも大きいＫＤを特徴とする。抗体のアミノ酸配列は、４３４位（ＥＵナンバリング）のアミノ酸トリプトファンを含む。
【0099】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、可変ドメイン内の残基（おおよそ、軽鎖の残基１～１０７と重鎖の残基１～１１３）に言及する場合、一般にＫａｂａｔナンバリングシステムが用いられる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。免疫グロブリン重鎖定常領域の残基に言及するときは、一般に「ＥＵナンバリングシステム」又は「ＥＵインデックス」が用いられる（例えば、参照により本明細書に明示的に組み込まれるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）で報告されたＥＵインデックス）。本明細書において別段の記載がない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号への言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる残基ナンバリングを意味する。本明細書で別段の記載がない限り、抗体の定常ドメインにおける残基番号への言及は、ＥＵナンバリングシステムによる残基ナンバリングを意味する（例えば国際公開第２００６／０７３９４１号を参照）。
【0100】
抗体
【0101】
本願の文脈において、用語「抗体」は、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）（クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤ（又はその任意のサブクラス）に属するタンパク質として定義される）の同義語として用いられ、従来既知の抗体とその機能的フラグメントを全て含む。本発明の文脈において、抗体／免疫グロブリンの「機能的フラグメント」は、抗原結合フラグメント、又は親抗体の特性のうち１つ以上を本質的に維持する該親抗体のその他の誘導体として定義される。抗体／免疫グロブリンの「抗原結合フラグメント」又は「抗原結合ドメイン」は、抗原結合領域を保持するフラグメント（例えばＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の１つ以上の超可変領域（複数可）、すなわちＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２及び／又はＣＤＲ－３領域に見られる。本発明の抗体は、二機能性又は多機能性の構造物の一部であってよい。
【0102】
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物クローン、原核生物クローン又はファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法は指さない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野で既知の多種多様な技術を用いて調製することができる。（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８８、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．）。
【0103】
ヒトにおける抗ＴＮＦα抗体のインビボ使用に関する実施形態を含む他の実施形態では、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を用いることができる。好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体又はヒト化抗体であり、より好ましくはモノクローナルヒト抗体又はモノクローナルヒト化抗体である。
【0104】
別の特定の実施形態では、本発明の抗体は免疫グロブリン、好ましくは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。本発明のＩｇＧのサブクラスは限定されず、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。好ましくは、本発明のＩｇＧは、サブクラス１、２又は４のものであり、すなわちそれはそれぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４分子である。最も好ましくは、本発明のＩｇＧはサブクラス１のものであり、すなわちそれはＩｇＧ１分子である。
【0105】
ＴＮＦα結合ドメイン
【0106】
本発明の抗体のＴＮＦα結合ドメインは特に限定されない。ＴＮＦαに結合することができる任意の抗体に由来することができる。
【0107】
好ましくは、本発明の抗体はＴＮＦαに特異的に結合する。本明細書で用いられる場合、抗体がヒトＴＮＦαと１つ以上の参照分子（複数可）を識別できるとき、抗体はヒトＴＮＦαを「特異的に認識する」、又はヒトＴＮＦαに「特異的に結合する」。好ましくは、参照分子の各々に結合するためのＩＣ５０値は、ＴＮＦαへの結合のＩＣ５０値よりも少なくとも１，０００倍大きい。その最も一般的な形態において（且つ定められた参照が言及されないとき）、「特異的結合」は、当技術分野で既知の特異性アッセイ方法に従って決定されるような、ヒトＴＮＦαと無関係の生体分子とを識別する抗体の能力を指している。そのような方法は、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡ試験を含むが、これらに限定されない。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照生体分子ではなく、粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリンなどの約３～５つの無関係の生体分子のセットを用いて行われる。一実施形態では、特異的結合とは、ヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦβとを識別する抗体の能力を指す。
【0108】
本発明の抗体は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを備える。ＶＬドメインは、ＣＤＲ１領域（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ２領域（ＣＤＲＬ２）、ＣＤＲ３領域（ＣＤＲＬ３）及びフレームワーク領域を有する。ＶＨドメインは、ＣＤＲ１領域（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ２領域（ＣＤＲＨ２）、ＣＤＲ３領域（ＣＤＲＨ３）及びフレームワーク領域を有する。
【0109】
用語「ＣＤＲ」は、主に抗原結合に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域のうち１つを指す。６つのＣＤＲについて最も一般的に用いられる定義のひとつは、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）によって提供された。本明細書で用いられる場合、ＣＤＲのＫａｂａｔの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３又はＬ１、Ｌ２、Ｌ３）と、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２及びＣＤＲ３ （ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３又はＨ２、Ｈ３）にのみ適用される。ただし、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲ Ｈ１又はＨ１）は、本明細書で用いられる場合、以下の残基（Ｋａｂａｔナンバリング）によって定義される。すなわち、２６位で始まり、３６位の前で終了する。
【0110】
本発明の一実施形態では、本発明の抗体は、出願時のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７及びＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７のいずれか１つに開示されている抗ＴＮＦα抗体である。本発明の更に別の実施形態では、抗体は、出願時のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７及びＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７に開示されるようなアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎖可変ドメインを備える抗ＴＮＦα抗体である。
【0111】
本発明の好適な実施形態では、抗体は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７又はＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７に開示されるようなアミノ酸配列を含む１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎖可変ドメインを備える抗ＴＮＦα抗体である。本発明の別の好適な実施形態では、抗体は、出願時のＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８の請求項２、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６の請求項２、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７の請求項２又はＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７の請求項２に開示されるようなアミノ酸配列を含むＣＤＲを有する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを備える抗ＴＮＦα抗体である。本発明の更に別の好適な実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８の請求項４、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６の請求項５及び６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７の請求項５及び６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７の請求項４、並びにそれらの組み合わせに従う重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び／又は軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα抗体から成る群から選択される。国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７及びＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７のそれぞれの開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。それらは、本願の開示の一部を形成する。
【0112】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域とを有するＶＬドメイン、及び（ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域とを有するＶＨドメインを備える。
【0113】
より好適な実施形態では、本発明の本発明の抗体は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインを備える。別のより好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを備える。最も好ましくは、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを備える。
【0114】
別の特定の実施形態では、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域とを有するＶＬドメイン、及び（ｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域とを有するＶＨドメインを備える。
【0115】
より好適な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインを備える。別のより好適な実施形態では、抗体は、配列番号２１又は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを備える。最も好ましくは、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｉｉ）配列番号２１又は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを備える。
【0116】
本発明の抗体は、ヒトＴＮＦαに対して高親和性を有する。用語「ＫＤ」は、特定の抗体抗原相互作用の解離平衡定数を指す。典型的には、本発明の抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥ機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて決定した場合に、約２×１０－１０Ｍ未満、好ましくは１．５×１０－１０Ｍ未満、好ましくは１．２５×１０－１０Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１０Ｍ未満、最も好ましくは７．５×１０－１１Ｍ未満、又は更に５×１０－１１Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）で、ヒトＴＮＦαに結合する。特に、ＫＤの決定は実施例１に記載のとおり実施される。
【0117】
ＦｃＲｎに対する親和性に影響を与える修飾
【0118】
本発明の抗体は、本明細書で定義されるように、少なくとも１つの「アミノ酸修飾」により、野生型抗体のネイティブ配列とは異なるアミノ酸配列を含む。少なくとも１つのアミノ酸修飾は、ヒトＦｃＲｎに対する抗体の親和性に影響を与える。典型的には、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する抗体の親和性を増大させる。一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する抗体の親和性を増大させ、ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する親和性は実質的に変化させない。好ましくは、修飾抗体は、野生型抗体又は親抗体のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１個～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１個～約５個のアミノ酸置換を有する。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、抗体のＦｃＲｎ結合部位内にある。抗体は、例えば構造変化により、抗体のＦｃＲｎ結合部位の外側に、ＦｃＲｎ結合に影響を与える１つ以上のアミノ酸修飾を有する場合がある。アミノ酸修飾（複数可）は、それ自体が既知である方法、例えば、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｐａｔｒｉｃｋ Ｃｈａｍｅｓ、第２版、２０１２年、Ｃｈａｐｔｅｒ ３１（ＩＳＢＮ９７８－１－６１７７９－９７３－０）に記載されている部位特異的変異誘発によって生成することができる。
【0119】
本発明の抗体は、４３４位（ＥＵナンバリング）にアミノ酸トリプトファンを含む。本明細書ではこれを「４３４Ｗ」と呼ぶ。非修飾ヒトＩｇＧ抗体の４３４位の天然アミノ酸はアスパラギン（Ｎ）である。よって本発明の抗体は、変異Ｎ４３４Ｗを抗体に導入することによって得ることができる。好ましくは、本発明の抗体は、４３４位のアスパラギンをトリプトファンで置換することによって得ることができるか、又は得られる。
【0120】
本発明の抗体は、４２８位（ＥＵナンバリング）にアミノ酸グルタミン酸を含む。本明細書ではこれを「４２８Ｅ」と呼ぶ。非修飾ヒトＩｇＧ抗体の４２８位の天然アミノ酸はメチオニン（Ｍ）である。よって本発明の抗体は、変異Ｍ４２８Ｅを抗体に導入することによって得ることができる。好ましくは、本発明の抗体は、４２８位のメチオニンをグルタミン酸で置換することによって得ることができるか、又は得られる。
【0121】
好ましくは、本発明の抗体は更に、３１１位（ＥＵナンバリング）にアミノ酸アルギニンを含む。本明細書ではこれを「３１１Ｒ」と呼ぶ。非修飾ヒトＩｇＧ抗体の３１１位の天然アミノ酸はグルタミン（Ｑ）である。よって本発明の抗体は、変異Ｑ３１１Ｒを抗体に導入することによって得ることができる。好ましくは、本発明の抗体は、３１１位のアルギニンをグルタミンで置換することによって得ることができるか、又は得られる。
【0122】
一実施形態では、本発明の抗体はアミノ酸４３４Ｗ及びアミノ酸４２８Ｅを含む。別の実施形態では、本発明の抗体はアミノ酸４３４Ｗ及びアミノ酸３１１Ｒを含む。本発明の好適な実施形態では、抗体はアミノ酸４３４Ｗ、４２８Ｅ及び３１１Ｒを含む。この抗体は、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｅ及びＮ４３４Ｗを抗体に導入することによって得ることができる。
【0123】
定常ドメインの残りのアミノ酸配列は、典型的なヒトＩｇＧの天然アミノ酸配列と同一であってよい。ただし、抗体がＴＮＦα結合活性及びエフェクター機能を保持する限り、抗体のアミノ酸配列は、天然抗体のＦｃ領域の天然アミノ酸配列に対する１つ以上の追加の変異又は置換を含む可能性がある。
【0124】
好ましい実施形態では、ヒンジ領域を含む本発明の抗体のＦｃ領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むか、又はそれから成る。
【0125】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本抗体は更に、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。
【0126】
別の実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本抗体は更に、配列番号２３又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。
【0127】
本発明の好適な態様において、本発明の抗体は、非フコシル化抗体又はフコシル化が低減された抗体である。
【0128】
「フコシル化が低減された抗体」という用語は、本明細書で用いられる場合、抗体のＮ－グリカンの９０％未満がフコシル化されている抗体を指す。フコシル化の割合を決定する方法は、当技術分野で既知である。好ましくは、フコシル化の割合は、本願の実施例１１に記載されるように決定される。
【0129】
一実施形態では、抗体のＮ－グリカンの７５％未満、又は５０％未満、又は２５％未満がフコシル化されている。最も好ましくは、抗体のＮ－グリカンの１５％未満がフコシル化されている。特定の実施形態では、本発明の抗体のＮ－グリカンはフコースを含まない。
【0130】
好ましくは、抗体のＮ２９７（ＥＵナンバリング）のＮ－グリカンの９０％未満がフコシル化されている。別の実施形態では、抗体のＮ２９７（ＥＵナンバリング）のＮ－グリカンの７５％未満、又は５０％未満、又は２５％未満がフコシル化されている。最も好ましくは、抗体のＮ２９７（ＥＵナンバリング）のＮ－グリカンの１５％未満がフコシル化されている。
【0131】
別の実施形態では、抗体のＮ２９７位のＮ－グリカンはフコースを含まない。
【0132】
非フコシル化抗体（時にはアフコシル化抗体とも呼ばれる）は、様々な方法で生成することができる。例えば、ＣＨＯ細胞におけるα１，６－フコース転移酵素（ＦＵＴ８）及びＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）の遺伝子の相乗的ノックダウンを用いて、完全にアフコシル化されＡＤＣＣ強化されたモノクローナル抗体変異体を産生することができる（例えばＩｍａｉ－Ｎｉｓｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７、８４を参照）。α１，６－フコース転移酵素の触媒コアをコードする領域においてＦＵＴ８遺伝子を切断し、したがってＣＨＯ細胞の対応する酵素機能を破壊するジンクフィンガーフィンガー（ＺＦＮ）を用いた方法を用いて、完全にコアフコースを欠くモノクローナル抗体を産生することができる（例えばＭａｌｐｈｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０６，７７４～７８３を参照）。
【0133】
フコシル化が低減された抗体は、２－デオキシ－２－フルオロ－２－フコースなどのおとり基質を培地に添加することによって作製することができ（例えばＤｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：３６９６４を参照）、結果としてＩｇＧ－Ｆｃグリカンにおけるフコースの取込みが減少する。
【0134】
別の実施形態では、本発明の抗体は高いシアル酸含有量を有する。シアリル化の増加は、例えばシチジン一リン酸－シアル酸シンターゼ（ＣＭＰ－ＳＡＳ）、シチジン一リン酸－シアル酸輸送体（ＣＭＰ－ＳＡＴ）及びα２，３－シアリルトランスフェラーゼの同時トランスフェクションによって達成することができる（例えばＳｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１、１０１９～１０２８を参照）。
【0135】
ＦｃＲｎに対する親和性
【0136】
本発明の抗体のヒトＦｃＲｎに対するｐＨ６での親和性は高い。ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する抗体の高親和性結合は、１００ｎＭ未満のＫＤ値を特徴とする。好ましくは、ｐＨ６での高親和性結合のＫＤ値は、７５ｎＭ未満、又は５０ｎＭ未満、又は２５ｎＭ未満、又は更に１０ｎＭ未満である。例えば、ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する親和性を特徴付けるＫＤ値は、１ｎＭ～５００ｎＭ、又は２ｎＭ～１００ｎＭ、又は３ｎＭ～５０ｎＭ、又は４ｎＭ～２５ｎＭ、又は５ｎＭ～１０ｎＭの範囲であってよい。
【0137】
好適な実施形態では、本発明の抗体のｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する親和性は、インフリキシマブのｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する親和性よりも大きい。
【0138】
本発明の抗体のヒトＦｃＲｎに対する親和性は、好ましくは、例えば本願の実施例４に記載されるように、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）によって決定される。
【0139】
本発明の抗体は、典型的には、ｐＨ７．４でヒトＦｃＲｎに対して低親和性を有する。低親和性は、１μＭよりも大きいＫＤ値を特徴とする。好ましくは、ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する低親和性は、２μＭよりも大きい、又は５μＭよりも大きい、又は１０μＭよりも大きいＫＤ値を特徴とする。
【0140】
特定の実施形態では、低親和性は、ＳＰＲによってＫＤ値を決定することができない程度に低い。
【0141】
特別な実施形態では、（ｉ）本発明の抗体のｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する結合のＫＤ値の（ｉｉ）ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する結合のＫＤ値に対する比は、少なくとも１００である。好ましくは、この比は少なくとも２００、又は少なくとも３００、又は少なくとも４００、又は少なくとも５００、又は少なくとも６００、又は少なくとも７００、又は少なくとも８００、又は少なくとも９００、又は少なくとも１０００である。
【0142】
抗体の機能特性
【0143】
本発明の抗体は、極性細胞単層を頂端側から基底側に横断して効率的に輸送される。典型的には、極性細胞単層を横断する輸送は、インフリキシマブの輸送よりも多い量である。インフリキシマブ中の抗体の量は、極性細胞単層のｃｍ２あたりの質量を指す。極性細胞単層を横断して輸送される抗体の量は、極性細胞単層を横断して輸送されるインフリキシマブの量と比較して、少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも１２５％、より好ましくは少なくとも１５０％、又は少なくとも１７５％、又は少なくとも２００％である（輸送されるインフリキシマブの量を１００％に設定する）。
【0144】
更に、抗体は、過剰な競合免疫グロブリンの存在下で、極性細胞単層を頂端側から基底側に横断して特異的に輸送される。本明細書ではこれを特異的輸送と呼ぶ。
【0145】
極性細胞単層を横断して輸送される免疫グロブリンの総質量の割合は、１０倍過剰の競合免疫グロブリンの存在下において、極性細胞単層を横断して輸送されるインフリキシマブの割合よりも大きい。１０倍過剰の無関係な免疫グロブリンの存在下で極性細胞単層を横断して輸送される本発明の抗体の割合は、１０倍過剰の無関係な抗体の存在下で極性細胞単層を横断して輸送されるインフリキシマブの割合と比較して、少なくとも１５０％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも２５０％、又は少なくとも３００％である（インフリキシマブを１００％に設定する）。
【0146】
好ましくは、極性細胞単層は極性Ｔ８４細胞の単層である。トランスサイトーシスのプロセスを模倣する輸送アッセイは、本願の実施例５に記載されるように実施することができる。
【0147】
本発明の抗体は、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ（Ｈ）、ＣＤ３２ａ（Ｒ）、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ（Ｖ）、ＣＤ１６ａ（Ｆ）及びＣＤ１６ｂ（ＮＡ２）に結合する。
【0148】
本発明の抗体は、典型的には１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤでＣＤ６４に結合する。
【0149】
本発明の抗体は、典型的には１０μＭ未満のＫＤでＣＤ３２ａ（Ｈ）に結合する。
【0150】
本発明の抗体は、典型的には１０μＭ未満のＫＤでＣＤ３２ａ（Ｒ）に結合する。
【0151】
本発明の抗体は、典型的には１０μＭ未満のＫＤでＣＤ３２ｂに結合する。
【0152】
本発明の抗体は、典型的には、例えば５００ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満のＫＤでＣＤ１６ａ（Ｖ）に結合する。
【0153】
本発明の抗体は、典型的には、例えば１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満のＫＤでＣＤ１６ａ（Ｆ）に結合する。
【0154】
本発明の抗体は、典型的には、例えば１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満のＫＤでＣＤ１６ｂ（ＮＡ２）に結合する。
【0155】
本発明の抗体は更にヒトＣ１ｑに結合する。好ましくは、この結合は、インフリキシマブのヒトＣ１ｑへの結合よりも強い。
【0156】
本発明の抗体は更に、ウサギ補体の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を有する。本発明の抗体のこのＣＤＣは、相対的ＥＣ５０及び／又は相対最大死亡率に関して、インフリキシマブのＣＤＣよりも大きい。
【0157】
本発明の抗体は更に、ＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋マクロファージを誘導することができる。誘導のレベルは、好ましくは、インフリキシマブのレベルと同等であるか、等しいか、又はそれより高い。
【0158】
本発明の抗体は更に、Ｔ細胞増殖を抑制することができる。Ｔ細胞増殖の抑制の程度は、好ましくは、インフリキシマブのそれと同等であるか、等しいか、又はそれよりも大きい。
【0159】
医薬組成物及び治療
【0160】
疾患の治療は、あらゆる臨床段階若しく経過において任意の形態の疾患を有すると既に診断されている患者の治療、疾患の症状若しくは徴候の発症又は発展又は増悪又は悪化の遅延、並びに／又は疾患の重症度の予防及び／若しくは軽減を包含する。
【0161】
抗ＴＮＦα抗体が投与される「対象」又は「患者」は、非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えばサルやヒト）などの哺乳動物とすることができる。特定の態様では、ヒトは小児患者である。他の態様では、ヒトは成人患者である。
【0162】
本明細書には、抗ＴＮＦα抗体及び任意の１つ以上の追加の治療薬（以下に記載される第２の治療薬など）を含む組成物が記載される。組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む無菌の医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）任意の適切な形態とすることができる。
【0163】
抗ＴＮＦα抗体は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、髄腔内、局所又は局在、例えば粘膜などの様々な経路で患者に投与することができる。どのようなケースにおいても投与に最も適した経路は、特定の抗体と、対象と、疾患の性質及び重症度と、対象の身体状態とに依存するものである。典型的には、抗ＴＮＦα抗体は静脈内投与される。
【0164】
特に好適な実施形態では、本発明の抗体は経口投与される。投与が経口経路を介する場合、抗体は好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１である。
【0165】
典型的な実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内投与を可能にするのに十分な濃度で、医薬組成物中に存在する。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法における使用に適切な抗体の濃度は、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、又は上記値のいずれかの間の範囲の濃度、例えば１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ～１８ｍｇ／ｋｇを含むが、これらに限定されない。
【0166】
抗ＴＮＦα抗体の有効用量は、単回（例えばボーラス）投与、複数回投与又は継続投与あたり約０．００１～約７５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、又は、単回（例えばボーラス）投与、複数回投与又は継続投与あたり０．０１～５０００μｇ／ｍｌの血清中濃度を達成することができる範囲とすることができ、又は、治療中の状態と、投与経路と、対象の年齢、体重及び状態とに応じた有効範囲又は値とすることができる。経口投与の場合、血清中濃度は非常に低くてよく、又は検出限界を下回ってもよい。特定の実施形態では、各用量は、体重１キログラムあたり約０．５ｍｇ～約５０ｍｇ、又は体重１キログラムあたり約３ｍｇ～約３０ｍｇの範囲とすることができる。抗体は水溶液として製剤化することができる。
【0167】
特に好適な実施形態では、本発明の抗体は経口投与される。投与が経口経路を介する場合、抗体は好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１である。抗体が経口投与される場合、抗体の１日用量は、典型的には約０．０１ｍｇ／体重ｋｇ～約１００ｍｇ／体重ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／体重ｋｇ～約５０ｍｇ／体重ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／体重ｋｇ～約２５ｍｇ／体重ｋｇ、又は約０．１５ｍｇ／体重ｋｇ～約１０ｍｇ／体重ｋｇ、又は約０．１６ｍｇ／体重ｋｇ～約５ｍｇ／体重ｋｇ、又は約０．２ｍｇ／体重ｋｇ～約２ｍｇ／体重ｋｇ、又は約０．２ｍｇ／体重ｋｇ～約１ｍｇ／体重ｋｇの範囲にある。一般に、有利な用量は１日あたり１～２００ｍｇ、好ましくは１日あたり５～１００ｍｇ又は１０～５０ｍｇの用量である。
【0168】
医薬組成物は、用量ごとに所定量の抗ＴＮＦα抗体を含む単位用量形態で便利に提示することができる。そのような単位は、０．５ｍｇ～５ｇ（例えば、限定ではないが、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１０００ｍｇ）、又は上記値の任意の２つの間の任意の範囲（例えば１０ｍｇ～１０００ｍｇ、２０ｍｇ～５０ｍｇ、又は３０ｍｇ～３００ｍｇ）を含むことができる。薬学的に許容される担体は、例えば治療対象の状態や投与経路に応じて、多種多様な形態をとることができる。
【0169】
その抗ＴＮＦα抗体の有効薬量、総投与数及び治療期間の決定は、十分に当業者の能力の範囲内であり、標準的な用量漸増研究を用いて決定することができる。
【0170】
本明細書に記載の方法に適した抗ＴＮＦα抗体の治療製剤は、所望の純度を有する抗体を、当業者によって典型的に採用される任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（これら全てを以下「担体」と呼ぶ）、すなわち緩衝剤、安定剤、保存料、等張剤、非イオン性洗剤、抗酸化剤及び他の種々の添加物と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として保存されるように作製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（Ｏｓｏｌ，ｅｄ．１９８０）を参照されたい。そのような添加物は、採用される薬量及び濃度においてレシピエントに対して無毒でなければならない。
【0171】
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲でｐＨを維持するのに役立つ。それらは約２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲の濃度で存在することができる。適切な緩衝剤は、クエン酸緩衝剤（例えばクエン酸ナトリウム－クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸ナトリウム混合物など）、クエン酸リン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤（例えばコハク酸－コハク酸ナトリウム混合物、コハク酸－水酸化ナトリウム混合物、コハク酸－コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸塩緩衝剤（例えば酒石酸－酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸－酒石酸カリウム混合物、酒石酸－水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例えばフマル酸－フマル酸ナトリウム混合物、フマル酸－フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸ナトリウム－フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例えばグルコン酸－グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸－水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸－グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例えばシュウ酸－シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸－水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸－シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例えば乳酸－乳酸ナトリウム混合物、乳酸－水酸化ナトリウム混合物、乳酸－乳酸カリウム混合物など）、酢酸緩衝剤（例えば酢酸－酢酸ナトリウム混合物、酢酸－水酸化ナトリウム混合物など）のような、有機酸と無機酸の両方、及びその塩を含む。更に、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、及びＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩を用いることができる。
【0172】
本発明の医薬組成物は更に、少なくとも１つの塩、例えば塩化ナトリウムを含んでよい。
塩濃度は、好ましくは１００ｍＭ～２００ｍＭの範囲であり、例えば約１５０ｍＭである。
塩濃度は、好ましくは１００ｍＭ～２００ｍＭの範囲であり、例えば約１５０ｍＭである。
【0173】
防腐剤は微生物増殖を遅らせるために添加することができ、０．２％～１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加することができる。適切な防腐剤として、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及びメチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３－ペンタノールが挙げられる。「安定剤」としても知られる等張剤は、液体組成物の等張性を確保するために添加することができ、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどの、多価糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコールを含む。安定剤とは、充填剤から、治療薬の可溶化や変性又は容器壁への付着の防止に役立つ添加物まで、様々な機能を取り得る広範なカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙）；アミノ酸（アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど）、有機糖又は糖アルコール（ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど、イノシトールなどのシクリトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤（尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなど）；低分子量ポリペプチド（例えば１０残基以下のペプチド）；タンパク質（ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；単糖類（キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなど）；二糖類（ラクトース、マルトース、スクロースなど）及び三糖類（ラフィノースなど）；多糖類（デキストランなど）とすることができる。安定剤は、活性タンパク質の重量部あたり０．１～１０，０００重量の範囲で存在することができる。
【0174】
非イオン性界面活性剤又は洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療薬の可溶化を助けたり、治療用タンパク質を撹拌誘発凝集から保護したりするために添加することができ、また、タンパク質の変性を引き起こすことなく、応力を受けたせん断面に製剤がさらされるようにすることができる。適切な非イオン性界面活性剤として、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲、又は約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在することができる。
【0175】
追加の種々の賦形剤として、充填剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、プロテアーゼ阻害剤及び共溶媒が挙げられる。
【0176】
本明細書における製剤は、その抗ＴＮＦα抗体に加えて第２の治療薬を含むこともできる。適切な第２の治療薬の例を以下に提供する。
【0177】
投薬スケジュールは、疾患の種類、疾患の重症度及び抗ＴＮＦα抗体に対する患者の感受性など、いくつかの臨床的要因に応じて、月に１回から毎日までばらつきがあってよい。特定の実施形態では、その抗ＴＮＦα抗体は、毎日、週２回、週３回、隔日、５日ごと、週１回、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと又は月１回投与され、又は前述の値のうち任意の２つの間の任意の範囲、例えば４日ごとから１か月ごと、１０日ごとから２週間ごと、又は週に２～３回などで投与される。
【0178】
投与される抗ＴＮＦα抗体の薬量は、特定の抗体と、対象と、疾患の性質及び重症度と、対象の身体状態と、治療レジメン（例えば第２の治療薬が使用されるか否か）と、選択された投与経路とに従って異なってよく、適切な薬量は当業者によって容易に決定され得る。
【0179】
当業者には、抗ＴＮＦα抗体の個々の投薬の最適な量及び間隔は、治療されている状態の性質及び程度と、投与の形態、経路及び部位と、治療されている特定の対象の年齢及び状態によって決定されるものであることが認識され、また、最終的には医師が使用される適切な薬量を決定することが認識されるであろう。この投薬は、必要に応じて何度でも繰り返すことができる。副作用が発現する場合、投薬の量及び／又は頻度は、通常の臨床慣行に従って変更又は低減することができる。
【0180】
治療対象の障害
【0181】
本発明は、対象におけるヒトＴＮＦα関連疾患を治療又は予防する方法であって、本明細書で定義される抗体を対象に投与することを含む方法に関する。「ＴＮＦα関連障害」又は「ＴＮＦα関連疾患」という用語は、その症状又は疾患状態の発症、進行又は持続にＴＮＦαの関与を必要とする任意の障害を指す。例示的なＴＮＦα関連障害として、限定ではないが、一般の慢性炎症状態及び／又は自己免疫性炎症状態、一般の免疫介在性炎症性障害、炎症性ＣＮＳ疾患、目、関節、皮膚、粘膜、中枢神経系、消化管、尿路又は肺に影響を及ぼす炎症性疾患、一般的なぶどう膜炎の状態、網膜炎、ＨＬＡ－Ｂ２７＋ぶどう膜炎、ベーチェット病、ドライアイ症候群、緑内障、シェーグレン症候群、真性糖尿病（糖尿病神経障害）、インスリン耐性、一般的な関節炎の状態、関節リウマチ、変形性関節症、反応性関節症及びライター症候群、若年性関節症、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、慢性腎疾患、膀胱炎、乾癬（乾癬性関節炎を含む）、化膿性汗腺炎、脂肪織炎、壊疽性膿皮症、ＳＡＰＨＯ症候群（滑膜炎、ざ瘡、膿疱症、過骨症及び骨炎）、ざ瘡、スイート症候群、天疱瘡、クローン病（腸管外症状を含む）、潰瘍性大腸炎、気管支喘息、過敏性肺炎、一般のアレルギー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、慢性の閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、巨細胞性動脈炎、チャーグ・ストラウス血管炎、結節性多発動脈炎、火傷、移植片対宿主病、移植片対宿主反応、臓器移植又は骨髄移植後の拒絶発症、一般的な血管炎の全身状態及び局所状態、全身性及び皮膚性のエリテマトーデス、多発性筋炎及び皮膚筋炎、皮膚硬化症、子癇前症、急性及び慢性の膵炎、ウィルス性肝炎、アルコール性肝炎、術後炎症（目の手術（例えば白内障（眼水晶体置換）又は緑内障の手術）、関節手術（関節鏡下手術を含む）、関節関連構造（例えば靱帯）の手術、口腔内手術及び／又は歯科手術、低侵襲心臓血管手術（例えばＰＴＣＡ、アテレクトミー、ステント留置）、腹腔鏡下及び／又は内視鏡下の腹腔内手術及び婦人科手術、内視鏡下泌尿器処置（例えば前立腺手術、尿管鏡検査、膀胱鏡検査、間質性膀胱炎）の後）又は一般的な手術前後の炎症（予防）、水疱性皮膚炎、好中球性皮膚症、毒性表皮壊死症、膿疱性皮膚炎、脳マラリア、溶血性尿毒症症候群、同種移植片拒絶、中耳炎、蛇にかまれた傷、結節性紅斑、骨髄異形成症候群、原発性硬化性胆管炎、血清陰性脊椎関節症、自己免疫性溶血性貧血、口腔顔面肉芽腫症、増殖性化膿性口内炎、アフタ性口内炎、地図状舌、遊走性口内炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ベル麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病及び一般的な神経変性状態が挙げられる。
【0182】
癌関連の骨溶解症、癌関連の炎症、癌関連の疼痛、癌関連の悪液質、骨転移、急性型及び慢性型の疼痛（これらがＴＮＦαの中枢効果又は末梢効果によって引き起こされたか否かに関わらず、また、それらが炎症性の、侵害受容性の、又は神経障害性の疼痛、坐骨神経痛、腰痛、手根管症候群、複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）、痛風、帯状疱疹後神経痛、線維筋痛症、局所疼痛状態、転移性腫瘍による慢性疼痛症候群、月経困難症に分類されるか否かに関わらず）。
【0183】
治療対象となる特定の障害として、一般の関節炎の状態、関節リウマチ、変形性関節症、反応性関節症、若年性関節症；乾癬性関節炎を含む乾癬；クローン病を含む炎症性腸疾患、直腸炎、Ｓ状結腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側大腸炎、広範大腸炎及び全大腸炎を含む潰瘍性大腸炎、未確定の大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎及びリンパ球性大腸炎を含む顕微鏡的大腸炎、結合組織疾患における大腸炎、空置大腸炎、憩室疾患における大腸炎、好酸球性大腸炎並びに回腸嚢炎が挙げられる。
【0184】
最も好ましくは、本発明の抗体は、炎症性腸疾患、特にクローン病、潰瘍性大腸炎又は顕微鏡的大腸炎を治療するために用いられる。クローン病は、非狭窄性／非穿通性、狭窄性、穿通性及び肛門周囲の疾患経過を含む回腸クローン病、結腸クローン病、回腸結腸クローン病又は限局性上部クローン病（胃、十二指腸及び／又は空腸）であってよく、上記のいずれかの局在及び疾患経過の任意の組み合わせが考慮される。潰瘍性大腸炎は、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側大腸炎、全潰瘍性大腸炎及び回腸嚢炎であってよい。
【0185】
併用療法及び他の態様
【0186】
好ましくは、その抗ＴＮＦα抗体で治療されている患者も別の従来の薬剤で治療される。例えば、炎症性腸疾患に罹患している患者は、特に中等度から重度の疾患を患っている場合、典型的にはメサラジン又はその誘導体若しくはプロドラッグ、コルチコステロイド（例えばブデソニド又はプレドニゾロン）（経口又は静脈内）、免疫抑制剤（例えばアザチオプリン／６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）又はメトトレキサート、シクロスポリン又はタクロリムス）でも治療されている。患者に共投与できる他の薬剤として、他の抗ＴＮＦα抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ）、インテグリン拮抗薬（例えばナタリズマブ、ベドリズマブ）、抗ＩＬ－２３抗体（例えばＭＥＤＩ２０７０））、抗β７抗体（例えばエトロリズマブ）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のＪＡＫ阻害剤（例えばトファシチニブ）及びその他が挙げられる。患者に同時投与できる更なる薬剤として、安定した長期の寛解を維持するために免疫抑制剤（例えばアザチオプリン／６－ＭＰ又はメトトレキサート又は経口シクロスポリン）が挙げられる。本発明の更に別の態様は、炎症を軽減するための上記で定義された抗ＴＮＦα抗体の使用である。
【0187】
本発明の更に別の態様は、炎症状態に罹患している患者の炎症の軽減に使用するための、上記で定義された抗ＴＮＦα抗体である。
【0188】
本発明の更なる態様は、炎症状態を治療する方法であって、上記で定義された抗ＴＮＦα抗体を、それを必要とする患者に有効量投与することを含む方法である。炎症状態は、好ましくは上記の状態のうちのひとつである。
【0189】
本発明の更なる態様は、炎症状態を予防する方法であって、上記で定義された抗ＴＮＦα抗体を、それを必要とする患者に有効量投与することを含む方法である。炎症状態は、好ましくは上記の状態のうちのひとつである。
【0190】
本発明の更に別の態様は、ＴＮＦαに対する抗体のトランスサイトーシスを改善する方法であって、トランスサイトーシスが改善された修飾抗体を得るために、抗体のアミノ酸配列に置換Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｅ及びＮ４３４Ｗを導入することを含む方法である。修飾抗体は、好ましくは上記のような抗体である。
【0191】
本発明の更に別の態様は、ＴＮＦαに対する抗体の血漿中半減期を延長する方法であって、血漿中半減期が延長された修飾抗体を得るために、抗体のアミノ酸配列に置換Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｅ及びＮ４３４Ｗを導入することを含む方法である。修飾抗体は、好ましくは上記のような抗体である。血漿中半減期は、非修飾抗体（すなわち置換Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｅ及びＮ４３４Ｗを欠く親抗体）の血漿中半減期と比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％増加し得る。
【0192】
【表1】
【0193】
実施例
【0194】
抗体変異体
【0195】
抗体アミノ酸配列のＦｃ領域に置換を導入することにより、抗ＴＮＦα抗体（以下「親抗体」又は「Ａｂ－ｗｔ」と呼ぶ）のいくつかの変異体が生成された。Ａｂ－ｗｔの軽鎖は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、Ａｂ－ｗｔの重鎖は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。変異は、確立された方法による部位特異的変異誘発によって導入された。手短に言えば、変異はＰＣＲによって導入された。フォワードプライマーは目的の変異を含むように設計され、リバースプライマーは２つのプライマーの５’末端が連続してアニールする（ただし重複しない）ように設計された（図９）。ＰＣＲを２５サイクル実行した（９８℃で１０秒間、６４℃で３０秒間、７２℃で３分間）。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動する前に、制限酵素ＤｐｎＩを用いてＰＣＲ産物プールから非変異ＰＣＲテンプレートを除去した。ＰＣＲ産物のゲル精製に続いて、平滑末端をライゲーションして、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換された環状化プラスミドを得た。一晩インキュベートした後、いくつかのコロニーを採取し、プラスミドＤＮＡを単離して配列決定して、変異が組み込まれたことを確認した。
【0196】
非フコシル化変異体は、０．１５ｍＭのおとり基質２－デオキシ－２－フルオロ－２－フコースを培地に添加することによって生成した（Ｄｅｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：３６９６４）。これにより、以下の実施例１１に示されるように、ＩｇＧ－Ｆｃグリアンへのフコースの取込みが著しく減少した。
【0197】
【表2】
【0198】
抗体Ａｂ－ＲＥＷ及びＡｂ－ＲＥＷ－２ＦＦは、本発明による抗体である。
【0199】
実施例１．ＴＮＦαに対する親和性
【0200】
方法：
【0201】
ＴＮＦαに対する親和性はＢｉａｃｏｒｅによって測定した。標準的なアミン固定化Ｂｉａｃｏｒｅ手順を用いてＣＭ５チップを準備した。ＣＭ５チップを挿入すると、システムが準備され、ＢＩＡ正規化ソリューション（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｋｉｔ ２）によって正規化された。チップは、ＰＢＳ－Ｔランニングバッファーと共にシステムに追加された。固定化の前に、チップ表面に５０ｍＭのＮａＯＨを３回注入した。タンパク質Ａをチップ表面に固定した。このために、タンパク質をｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸緩衝剤で５μｇ／ｍＬまで希釈し、４つのフローセル全てにおいて約１０００ＲＵの結合応答を起こすように注入した。全てのチップフローセルから非共有結合物質を除去するために、１５秒間の５０ｍＭ ＮａＯＨでの洗浄を３回行った。タンパク質Ａチップ上では、フローセル２及び４において抗体を捕捉し、フローセル１及び３を参照減算に用いた。試験抗体をＰＢＳ－Ｔで１０ｎＭまで希釈し、２．５～７．５ｕＬを注入して１２０ＲＵの捕捉抗体を得た。検体ＴＮＦαを、供給者の指示に従って水で５００μｇ／ｍＬに調製し、ランニングバッファーＰＢＳ－Ｔで更に希釈した。シングル・サイクル・カイネティクスを用いて、定常状態の親和性を推定した。シングルサイクルの分析サイクルごとに、５通りの検体濃度の滴定をリガンドに注入し、複合体の解離を測定した。グリシンｐＨ１．７を用いて表面を再生した。二重参照法を採用し、リガンド結合捕捉表面（ｆｃ２とｆｃ４）からのデータを、リガンド捕捉のない参照表面（それぞれｆｃ１とｆｃ３）から差し引いた。バッファーのブランク注入を３～４サイクルごとに実行し、その後、検体注入サイクルから差し引いて、リガンド捕捉表面の小さな変化について補正した。各分析実施の開始時と終了時に検体の繰り返し注入を用いて、サンプルの劣化又は機器性能の変化を確認した。全ての分析を２５℃で実施し、サンプルラックは実験中１０℃でインキュベートした。各実験を少なくとも３回実施した。１対１の結合モデルを用いて、結果として得られた動力学データを適合させた。
【0202】
結果：
【0203】
全ての抗体はＴＮＦαと同様の結合動態を示し、これは導入された修飾が抗原結合領域に有意な変化をもたらさなかったことを示す。抗体Ａｂ－ＲＥＷ－２ＦＦの場合、解離速度を測定することができなかったので、親和性（ＫＤ）を決定することができなかった。しかしながら、結合率は他の抗体と同等であり、これは変異の導入が結合に有意な影響を与えないことを示す。
【0204】
【表3】
【0205】
実施例２．効力
【0206】
方法：
【0207】
連続希釈の抗ＴＮＦα抗体変異体の存在下で、Ｌ９２９細胞を０．２５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαと１μｇ／ウェルのアクチノマイシンＤと共にインキュベートした。３７℃／５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした後、ＭＴＳ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム及び電子結合試薬（フェナジンエトスルファート、ＰＥＳ）を用いて、増殖応答を測定した。ＭＴＳは、代謝的に活性な細胞に存在するデヒドロゲナーゼ酵素によって、ホルマザン産物に変換された。４９２ｎｍの吸光度で測定したホルマザン産物の量は、培養中の生細胞の数に正比例した。
【0208】
結果：
【0209】
結果を図１に示す。抗ＴＮＦα抗体のＦｃ領域への変異の導入は、効力に影響を与えなかった。
【0210】
実施例３．Ｆｃγ受容体（ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）に対する親和性
【0211】
方法：
【0212】
ＦｃγＲに対する親和性はＢｉａｃｏｒｅによって測定した。ＣＭ５チップは、標準的なアミン固定化Ｂｉａｃｏｒｅ手順を用いて準備した。ＣＭ５チップを挿入すると、システムが準備され、ＢＩＡ正規化ソリューション（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｋｉｔ ２）によって正規化された。チップは、リン酸緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）ランニングバッファーと共にシステムに追加された。固定化の前に、チップ表面に５０ｍＭのＮａＯＨを３回注入した。Ｈｉｓタグ捕捉システムを用いて、ＦｃγＲをチップ表面に固定化した。抗Ｈｉｓタグチップは、Ｂｉａｃｏｒｅキットの説明書に従って準備し、４つのフローセル全てに約１２０００ＲＵの抗体を沈着させた。全てのチップフローセルから非共有結合物質を除去するために、３０秒間の１０ｍＭグリシンｐＨ１．５での洗浄を３回行った。Ｆｃγ受容体をＰＢＳ－Ｔで０．５～２μｇ／ｍＬの範囲に希釈し、２．５～５．０μＬをチップに注入して、６０～２００ＲＵの捕捉レベルを生み出した。分析の前に、抗体をＰＢＳ－Ｔで希釈した。シングル・サイクル・カイネティクスを用いて、定常状態の親和性を推定した。シングルサイクルの分析サイクルごとに、５通りの抗体濃度の滴定をＦｃγＲリガンドに注入し、複合体の解離を測定した。抗Ｈｉｓ捕捉表面に対して推奨される溶液１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を用いて、表面を再生した。二重参照法を採用し、リガンド結合捕捉表面（ｆｃ２とｆｃ４）からのデータを、リガンド捕捉のない参照表面（それぞれｆｃとｆｃ３）から差し引いた。バッファーのブランク注入を抗体滴定サイクルごとに実行し、その後、検体注入サイクルから差し引いて、リガンド捕捉表面の小さな変化について補正した。全ての分析を２５℃で実施し、サンプルラックは実験中１０℃でインキュベートした。各実験を少なくとも３回実施した。
【0213】
結果：
【0214】
ＣＤ６４への結合は、操作された抗ＴＮＦα抗体では影響を受けなかった。変異の導入は、ＣＤ３２ａ（Ｈ）、ＣＤ３２ａ（Ｒ）及びＣＤ３２ｂに対する親和性に影響を与えなかった。ただし、Ａｂ－ＲＥＷ－２ＦＦは、ＣＤ１６ａ（Ｖ）に対する親和性において５．５倍の増大を示した。非フコシル化抗体Ａｂ－ＲＥＷ－２ＦＦも、低親和性ＣＤ１６ａ受容体及びＣＤ１６ｂへの結合が改善された。
【0215】
【表4】
【0216】
【表5】
【0217】
実施例４．ＦｃＲｎに対する親和性
【0218】
方法：
【0219】
ＳＰＲは、製造元によって説明されたアミンカップリング化学を用いて、抗ＴＮＦα ＩｇＧ１抗体（約５００共鳴ユニット（ＲＵ））と結合したＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ３０００機器を使用して実施した。カップリングは、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に各タンパク質２．０ｕｇ／ｍＬを注入することによって行った。ランニングバッファー及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－ＰバッファーｐＨ７．４（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）又はリン酸バッファーｐＨ６．０（６７ｎＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）を使用した。結合動態は、ｐＨ７．４又はｐＨ６．０の固定化抗体に滴定量（１０００～３１．２ｎＭ）の単量体Ｈｉｓタグ付きヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）を注入することによって決定した。全てのＳＰＲ実験は、２５℃、流量４０ｕｌ／分で実施した。結合データをゼロ調整し、参照セル値を差し引いた。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１）によって提供されるラングミュア１：１リガンド結合モデルを用いて、結合動態を決定した。
【0220】
結果：
【0221】
結果は、野生型抗体Ａｂ－ｗｔが厳密にｐＨ依存的にｈＦｃＲｎに結合することを示した。全ての操作された抗体変異体は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対する親和性が高かったが、ｐＨ７．４ではｐＨ依存性を維持し、受容体に結合しなかった。驚くべきことに、ＲＥＷを含む変異体は酸性ｐＨで１６０倍超の強い結合を示したが、中性ｐＨで試験した条件下ではまだ検出可能な結合はなかった。抗体変異体は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有するインフリキシマブと比較して、ＦｃＲｎに対する改善された結合を示した。
【0222】
【表6】
【0223】
実施例５．トランスサイトーシス
【0224】
方法：
【0225】
０．４μｍ孔径のコラーゲンコーティングポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜を備えたトランスウェルフィルター（１．１２ｃｍ２）を完全増殖培地で一晩インキュベートした後、ウェルあたり１．０×１０６個のＴ８４細胞を播種した。ＭｉｌｌｉｃｅｌｌのＥＲＳ－２電圧抵抗計を使用して、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を毎日モニタリングした。ＴＥＥＲ値が約１０００～１３００Ω×ｃｍ２のコンフルエンスに達するまで、培養物を４～５日間培養した。実験の前に、単層をハンク平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で１時間飢餓状態にした。次に、４００ｎＭの抗体変異体又はＩＦＸを単独で、又は無関係の特異性を有する４０００ｎＭのヒト骨髄腫ＩｇＧと共に、頂端側トランズウェルチャンバーに加えた。添加後０時間及び添加後４時間に、サンプルを基底側リザーバーから回収した。基底側リザーバーの抗体濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。手短に言うと、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートに、組換え体ＴＮＦα又はヤギ由来の抗ヒトＦｃ特異抗体のいずれかをＯ／Ｎでコーティングし、両方ともＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した。続いて、室温で２時間、４％脱脂乳を含むＰＢＳでプレートをブロックした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。トランスサイトーシス実験中に回収したサンプルをウェルに加え、上記のように洗浄する前に室温で２時間インキュベートした。捕捉された抗体変異体、ＩＦＸ又は総ＩｇＧは、ヤギ由来のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）共役抗ヒトＦｃ特異的抗体を用いて検出した。１００μｌのＡＬＰ基質の添加により結合を視覚化し、４０５ｎｍの吸収スペクトルを記録した。輸送された抗体変異体、ＩＦＸ及び総ＩｇＧの量は、個々の抗体変異体のそれぞれの標準曲線から計算した。
【0226】
極性ヒト上皮細胞を横断する抗体変異体のトランスサイトーシス
【0227】
結果：
【0228】
操作された抗ＴＮＦα抗体変異体を、細胞単層を横断するトランスサイトーシスについて試験し、別のヒトＩｇＧ１抗ＴＮＦα抗体としてのｗｔ抗体又はＩＦＸと比較した。結果を図２に示す。ｗｔ抗ＴＮＦα抗体は、頂端側から基底側リザーバーに輸送された。ｗｔ Ｆｃ領域を有する別のＩｇＧ１抗体であるＩＦＸと比較して、Ａｂ－ＲＥＷは２．８倍多く輸送され、これはＡｂ－ＲＥＷ－２ＦＦの場合も同様であった。
【0229】
競合ＩｇＧの存在下における極性ヒト上皮細胞を横断する抗体変異体のトランスサイトーシス
【0230】
結果：
【0231】
添加後４時間で抗ＴＮＦα抗体変異体を１０倍過剰のヒト骨髄腫ＩｇＧと共にインキュベートした場合、極性Ｔ８４細胞単層を頂端側から基底側リザーバーに横断して輸送された免疫グロブリンの総量は、全ての抗体で同程度であった。ただし、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対する親和性の増加により、無関係な特異性をもつ競合ヒトＩｇＧの過剰量の存在下においても、細胞単層を横断する特異的抗ＴＮＦα輸送の割合が有意に高くなった。結果を図３に示す。
【0232】
実施例６．ＡＤＣＣ
【0233】
方法：
【0234】
ＰｒｏｍｅｇａのＡＤＣＣレポーターバイオアッセイコアキットを使用した。手短に言えば、１×１０５個／ｍＬのｍＴＮＦαＣＨＯ－Ｋ１標的細胞を、白色（透明底）組織培養プレートにウェルあたり１００μＬで播種した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。２日目、９５μＬのアッセイ培地を除去し、３×１０６個／ｍＬの操作されたジャーカットエフェクター細胞２５μＬで交換した。次にプレートを３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。インキュベーションの終わり頃にＢｉｏＧｌｏ（商標）試薬を調製した。ウェルあたり７５μＬのＢｉｏＧｌｏ（商標）試薬を加える前に、プレートを１０～２０分間室温で平衡化した。暗所で５～１０分間インキュベートした後、発光を測定した。４－ＰＬモデルを用いてデータを適合させた。
【0235】
結果：
【0236】
結果（図４を参照）は、全ての抗ＴＮＦα抗体がＡＤＣＣを誘導したが、強度が異なることを示した。野生型抗体Ａｂ－ｗｔと比較して、抗体変異体はＡＤＣＣの増加を示した。特に、非フコシル化抗体変異体Ａｂ－ＲＥＷ－２ＦＦはＡＤＣＣを有意に改善した。
【0237】
実施例７．Ｃ１ｑ結合
【0238】
方法：
【0239】
ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したヒトＴＮＦαでウェルをコーティングした９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した。４℃で一晩インキュベートした後、４％脱脂乳を含むＰＢＳでプレートを１時間ブロックし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で４回洗浄した。次に、滴定量の抗ＴＮＦαＩｇＧ抗体をＰＢＳ－Ｔで希釈し、添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔを用いて洗浄した後、ヒトＣ１ｑ（０．５μｇ／ｍＬ）を０．１Ｍ Ｖｅｒｏｎａｌバッファー（０．２５ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２ ｐＨ７．２）で希釈し、ウェルに添加して１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ－Ｔで１：５０００に希釈したウサギ抗ヒトＣ１ｑをウェルに加える前にウェルを上記のように洗浄し、１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ－Ｔで１：５０００に希釈したロバ由来ＨＲＰ共役抗ウサギＩｇＧを添加した。続いてウェルを洗浄し、１００μＬの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン基質を各ウェルに添加した。Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計を用いて、６２０ｎｍで吸光度を測定した。
【0240】
結果：
【0241】
抗ＴＮＦα抗体変異体は、ヒトＣ１ｑが加えられる前にヒトＴＮＦαで捕捉された。結果（図５を参照）は、抗体がＣ１ｑに結合したが、異なる結合強度をもつことを示した。具体的には、Ａｂ－ＲＥＷ及びＡｂ－ＲＥＷ－２ＦＦは、ＩＦＸよりもやや強く結合した。Ｎ２９７に付着した二分岐Ｎ－グルカンでのフコースの存在は、結合に全く影響を及ぼさなかったか、又はわずかな影響しか与えなかった。最強から最弱への結合階層は次のとおりであった：Ａｂ－ＲＥＷ＞Ａｂ－ＲＥＷ－２ＦＦ＞ＩＦＸ。
【0242】
実施例８．ＣＤＣ
【0243】
方法：
【0244】
抗ＴＮＦαＣＤＣアッセイにより、ウサギ補体の抗体依存性細胞毒性を測定した。ｍＴＮＦαを発現する標的細胞を、補体の細胞障害能を促進する抗ＴＮＦα抗体の存在下でマイクロプレートに播種した。サンプル（抗ＴＮＦα抗体変異体）の６つの独立した複製と、参照基準（ＩＦＸ）の４つの複製を６０μｇ／ｍＬで調製し、連続希釈（１．３倍希釈ステップ）し、使用するまで希釈プレートを密封した。ＬＵＣ生存率レポーターを含む標的細胞を１．５×１０５個／ｍＬに調製し、３７℃の水浴で保存した。ウサギ補体をＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅで３倍の最終アッセイ濃度に希釈した。調製直後に、補体を標的細胞と１：１の比率（ｖ／ｖ）で組み合わせた。４０μＬの補体／標的細胞調製物をアッセイプレートの各ウェルに移した。希釈プレートで調製した抗体を細胞に移し（２０μＬ／ウェル）、次にプレートを３６℃／１％ＣＯ２で３．５時間インキュベートした。アッセイプレートを暗所で３５分間、室温まで平衡化した。使用前に１２０分間周囲温度に平衡化したＳｔｅａｄｙ Ｇｌｏをアッセイプレートに加え（２０μＬ／ウェル）、発光を測定する前に室温で３５分間、暗所で保存した。次に各サンプルの各濃度について細胞死の割合を計算し、４－ＰＬモデルを用いてデータを適合させた。
【0245】
結果：
【0246】
結果を図６及び表７に示す。ＣＤＣアッセイにおける試験サンプル性能に関する相対ＥＣ５０及び相対最大死亡率の結果により、両方の活性測定で一貫した明確な活性ランキングが得られた。フコース含量に関係なく、Ａｂ－ＲＥＷはＩＦＸよりも大きなＣＤＣ活性を示した。ＣＤＣ活性に対するフコース含量の影響をより良く理解するために、フコース変異体サンプル間の直接比較を行うと、Ａｂ－ＲＥＷとの比較においてＡｂ－ＲＥＷ－２ＦＦは同様のＣＤＣ活性応答を提供した。比較では、９７．１％の相対ＥＣ５０応答と、１００．４％の相対最大死亡率応答が示された。
【0247】
【表7】
【0248】
実施例９．制御性マクロファージの誘導
【0249】
方法：
【0250】
健康なバフィコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心により細胞を単離した。２つの個々のドナーの細胞を同数混合し、混合物の２×１０５個の細胞を９６ウェルプレートに総量１００μＬ／ウェルで播種した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。４８時間後、抗ＴＮＦα抗体変異体又はＩＦＸを最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように加えた。各化合物を５回又は６回繰り返して添加した。最終量は１５０μＬ／ウェルであった。ヒト血清ＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ＃Ｉ５１５４）を対照として使用した。化合物の添加後、混合リンパ球反応物（ＭＬＲ）を３７℃／５％ＣＯ２で更に４日間培養した。その後、ＰＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）を用いてプレートを洗浄し、室温で２０分間、５０μＬ／ウェルのＰＢＳ／ＥＤＴＡでインキュベートした。プレートを遠心分離し、液体を飛ばした。抗体をＰＢＳ／ＥＤＴＡで希釈した（抗ＣＤ１４－ＰＥ、抗ＣＤ２０６－ＡＰＣ、両方とも１：１０に希釈）。細胞を５０μＬの抗体溶液に再懸濁し、室温で２０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ／ＥＤＴＡで洗浄し、５０μＬのＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁した。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで染色サンプルを分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を実施した。
【0251】
結果：
【0252】
４つの独立したＭＬＲで制御性マクロファージの誘導を分析し、全ての実験で成功した（ＩＦＸをＩｇＧ対照と比較すると）。結果を図７に示す。各実験が個人間変動のある異なるドナーを使用して実施されたという事実を理由に、ＩＦＸによる誘導のレベルは実験間で異なる可能性がある。試験した全ての抗ＴＮＦα抗体変異体はＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋制御性マクロファージを誘導したが、化合物間でわずかな変動があった。Ａｂ－ＲＥＷ及びＡｂ－ＲＥＷ－２ＦＦは、ＩＦＸよりもわずかに多く制御性マクロファージを誘導したが、Ａｂ－ＲＥＷ－２ＦＦの場合にのみ増加が顕著であった。
【0253】
実施例１０．Ｔ細胞増殖の阻害
【0254】
方法：
【0255】
健康なバフィコートからＰＢＭＣを単離した。Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心により細胞を単離した。２つの個々のドナーの細胞を同数混合し、混合物の２×１０５個の細胞を９６ウェルプレートに総量１００μＬ／ｍＬで播種した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。４８時間後、抗ＴＮＦα抗体変異体又はＩＦＸを最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように加えた。各化合物は５回又は６回繰り返して添加した。最終量は１５０μＬ／ウェルであった。ヒト血清ＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ＃Ｉ５１５４）を対照として使用した。化合物の添加後、混合リンパ球反応物（ＭＬＲ）を３７℃／５％ＣＯ２で更に２日間培養した。その後、トリチウム化チミジン（３Ｈチミジン、０．５マイクロキュリー／ウェル）を培養物に添加した。培養物を３７℃／５％ＣＯ２で１８時間、更にインキュベートした。Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ ９６細胞ハーベスターを使用してサンプルを回収し、単一の検出器を備えたＭｉｃｒｏｂｅｔａ ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＣｏｕｎｔｅｒを使用して分析した。サンプルを１０秒／ウェルでカウントし、１分あたりのカウント数（ｃｐｍ）に変換した。
【0256】
結果：
【0257】
３つの独立したＭＬＲにおいてＴ細胞増殖の阻害を測定し、陽性対照としてのＩＦＸが抑制を誘導した場合を成功と定義した。個々の実験におけるＩＦＸによる抑制のレベルは、おそらく制御性マクロファージの誘導の相違を理由に、異なる可能性がある。各実験において、Ｔ細胞増殖を抑制する抗ＴＮＦα抗体変異体の能力を、陽性対照ＩＦＸと比較して計算した。抗体Ａｂ－ＲＥＷ－２ＦＦはＩＦＸと比較して有意に増強された抑制を示したが、Ａｂ－ＲＥＷによる抑制はＩＦＸと同程度であった（図８を参照）。
【0258】
実施例１１．Ｎ－グリカンの分析
【0259】
方法：
【0260】
各ＩｇＧ変異体（１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを１３，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、１００μｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）に溶解したトリプシン１μｇを添加し、３７℃で一晩インキュベートした。遠心装置を１３，０００×ｇで１０分間スピンダウンし、フロースルーをエッペンドルフチューブに移し、ＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｈｅｔｏ Ｍａｘｉ ｄｒｙ）で乾燥させた。乾燥したサンプルを２０μｌの１％ギ酸に溶解し、３０秒間超音波処理し、１６，１００×ｇで１０分間遠心分離した。続いて、各サンプルを新しいバイアルに移し、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、タンパク質分解ペプチドの逆相（Ｃ１８）ナノオンライン液体クロマトグラフィー－タンデム質量分光分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析を実施した。５μｌのペプチド溶液を抽出カラムに注入し、ペプチドを抽出カラムから分析カラムにバックフラッシュモードで溶出した。移動相は、アセトニトリルと質量分析用水から成り、両方に０．１％のギ酸が含まれる。クロマトグラフ分離は、０．３μｌ／分の流量で６０分間、水中アセトニトリルの３～５０％のバイナリ勾配を使用して達成された。ＬＣシステムは、ナノエレクトロスプレーイオン源を介して、Ｑ ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に結合した。ペプチドサンプルは、正規化衝突エネルギー２０で高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメント化方法を用いて分析され、ｍ／ｚ３００～２０００の質量範囲で１つのＯｒｂｉｔｒａｐサーベイスキャンを取得し、オービトラップにおいて１０の最も強力なイオンのＭＳ／ＭＳが続いた。
【0261】
Ｘｃａｌｉｂｕｒ ｖ２．０でデータ分析を行った。全てのＮ－グリコ－ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルは、オキソニウムイオン検索によって抽出した：２０４．０８６（Ｎ－アセチルヘキソサミン）及び３６６．１３８８（Ｎ－アセチルヘキソサミン－ヘキソース）。正規化衝突エネルギー２０でＨＣＤフラグメント化を用いることにより、ＩｇＧのグリカン構造とペプチド質量を検出した。標的グリコールペプチド（ＩｇＧ１のＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）の抽出イオンクロマトグラムを１０ｐｐｍの精度で抽出し、対応するＭＳ／ＭＳスペクトルを手動で検証した。正規化衝突エネルギー３５でＨＣＤフラグメンテーションを使用して、ペプチド配列を検出し、ペプチド質量が正しいペプチド配列に対応することを確認した。抽出された全てのグリコールペプチドの曲線下面積を計算し、各グリコフォームの割合を決定した。
【0262】
結果：
【0263】
Ａｂ－ＲＥＷの場合、２つのＮ－グリカン型、つまり４ＧｌｃＮａｃ－１Ｆｕｃ－３Ｍａｎ及び４ＧｌｃＮａｃ－１Ｆｕｃ－３Ｍａｎ－１Ｇａｌが優勢であり、総Ｎ－グリカンプールの９０％超に相当した。優勢であったＮ－グリカン型は両方ともコアフコースを含んでいた。「非フコシル化」バージョンのＡｂ－ＲＥＷ（Ａｂ－ＲＥＷ－２ＦＦ）を産生するために、おとり基質２－デオキシ－２－フルオロ－１－フコース（２ＦＦ）が用いられた。この抗体のＭＳマッピングにより、９０％超から１３％への低下が検出されたので、この戦略の結果としてフコースの取込みが首尾よく大幅に減少することが明らかとなった。処置後の優勢なＮ－グリカン型は、これらの構造がフコースを欠いたことを除いて、２ＦＦの非存在下で産生された変異体と同じであった（図１０も参照）。
【0264】
【表8】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】