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特許7402524悪液質を治療及び／又は予防する医薬品の製造におけるＡＭＤ３１００の使用、及びＡＭＤ３１００を含む医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-13
(45)【発行日】2023-12-21
(54)【発明の名称】悪液質を治療及び／又は予防する医薬品の製造におけるＡＭＤ３１００の使用、及びＡＭＤ３１００を含む医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/395 20060101AFI20231214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231214BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231214BHJP
【ＦＩ】
A61K31/395
A61P35/00
A61P43/00 101
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2020514681
(86)(22)【出願日】2017-09-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-12-03
(86)【国際出願番号】 CN2017102264
(87)【国際公開番号】W WO2019056175
(87)【国際公開日】2019-03-28
【審査請求日】2020-04-17
【審判番号】
【審判請求日】2022-02-22
(73)【特許権者】
【識別番号】503168289
【氏名又は名称】中山大学
【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮ ＹＡＴ－ＳＥＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】１３５ Ｘｉｎｇａｎｇ Ｘｉ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｚｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１０２７５， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】項 鵬
(72)【発明者】
【氏名】汪 建成
【合議体】
【審判長】前田 佳与子
【審判官】原田 隆興
【審判官】渕野 留香
(56)【参考文献】
【文献】特許第４８６２０４６号公報
【文献】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７年，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．７，ｐ．６８５－６９４
【文献】メルクマニュアル、第１８版、２００７年、１２３４頁
【文献】Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１４年，ｖｏｌ．４，Ａｒｔｉｃｌｅ１６９，ｐ．１－１１
【文献】上原記念生命科学財団研究報告集、２０１６年、３０巻、１－５頁
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K31/00-33/44
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
化合物１，１′－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］－ジ－１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン又はその薬学的に許容される塩を含み、腫瘍悪液質が発生した被験体の脂肪組織におけるＮｅｓｔｉｎ＋細胞の減少を抑制するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬分野に関し、特に腫瘍悪液質を治療及び／又は予防する医薬品の製造におけるＡＭＤ３１００又はその薬学的に許容される塩の使用、ＡＭＤ３１００又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、及びＡＭＤ３１００又はその薬学的に許容される塩を用いる悪液質を治療及び／又は予防する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍悪液質は、がん患者に多くみられる合併症の一つである。主な症状は、不本意な体重減少及び食欲不振である。がん患者の少なくとも３０％は悪液質で死亡し、少なくとも５０％は死亡時に悪液質を伴っている。エディンバラ大学の臨床科学及び地域保健学部のＦｅａｒｏｎ教授らにより起草された腫瘍悪液質の定義については、基本的にコンセンサスに達している。悪液質は、患者の骨格筋量の減少（脂肪量減少の有無を問わない）を特徴とし、通常の栄養サポートでは完全に回復することができず、進行性の機能障害に至る多因子性の症候群である。腫瘍悪液質は、患者の生活の質を低下させるだけでなく、腫瘍治療に対する耐性をもたらし、治療効果を低下させる。そのため、腫瘍悪液質の治療は、腫瘍の治療及び患者の生活の質の向上に対して非常に重要な役割を果たす。
【0003】
多くの研究により、悪液質のメカニズムについての理解が深まっている。腫瘍悪液質は、病態生理学的には食物摂取の減少と代謝異常によるタンパク質とエネルギーの負のバランスを特徴とする。現在、多くの臨床研究は腫瘍悪液質が発生した動物モデルにおいて進歩を遂げたが、臨床には腫瘍悪液質の予防と治療に用いられる承認薬がない。臨床では、主に栄養サポートと運動により腫瘍悪液質の発症を遅らせている。
【0004】
そのため、より良い治療結果を達成するために、腫瘍悪液質の発症メカニズムと発症の初期段階での標的介入を深く理解する必要がある。
【0005】
間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）は、骨髄で発見された最初の非造血幹細胞であり（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ，１９７４）、骨髄造血微小環境の構成に関与し、造血幹細胞の増殖と分化に対して顕著な促進作用を有する。ＭＳＣは、全身のさまざまな組織や臓器に広く分布し、骨髄に加えて、歯茎、骨格筋、脂肪、その他の組織にも存在し、組織損傷の修復と恒常性の維持に関与する。ＭＳＣは、特異的マーカーを有さず、主にＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６などの間葉系マーカーを発現し、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５などの造血に関連するマーカーを発現しない。
【0006】
ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）は、中間径フィラメントタンパク質である。胚発生過程の初期において、Ｎｅｓｔｉｎは、多能性分化能を有する神経上皮幹細胞で発現する。成体組織において、中間径フィラメントタンパク質Ｎｅｓｔｉｎは、完全に分化していない、特定の増殖を維持する成体幹細胞／前駆細胞集団でのみ発現する。従って、このようなＮｅｓｔｉｎ＋細胞は、成体幹細胞プールの重要な部分であり、生体幹細胞の恒常性維持において大きな役割を果たしている。最近、Ｍｅｎｄｅｚ－Ｆｅｒｒｅｒらは、Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスを用いて骨髄にＮｅｓｔｉｎ＋細胞集団が存在し、インビトロでクローンに増殖することができ、骨形成、脂肪生成、軟骨形成の分化特性を有することを初めて実証しており、これは、中間径フィラメントタンパク質Ｎｅｓｔｉｎが骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の重要なマーカーであることを示している。本発明者らは、以前にＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスを用いて研究した結果、精巣、腎臓、心臓などの組織から選別されたＧＦＰ陽性細胞は、自己複製能及び多分化能を有するとともに、病変組織を修復する能力を有することを発見した。これらの結果は、Ｎｅｓｔｉｎ＋ＭＳＣが組織恒常性の維持に対して非常に重要な役割を果たすことを示している。
【0007】
上記より、成体幹細胞は、さまざまな臓器の寿命を伴い、自己複製機能、及び損傷組織を置換又は修復する機能を有する。ＭＳＣは、成体幹細胞のメンバーとして、インビボ組織の恒常性を維持するための重要な成分である。腫瘍発生の過程において、腫瘍は、Ｎｅｓｔｉｎ＋ ＭＳＣを腫瘍微小環境に動員する能力を有する。Ｎｅｓｔｉｎ＋ＭＳＣが腫瘍に動員されることで、組織恒常性が破壊され、臓器や組織の機能不全が引き起こされ、腫瘍悪液質を誘発する要因となる。
【0008】
ＭＳＣは、多種のケモカイン受容体及び接着分子受容体を発現し、リガンドの存在下で、損傷又は炎症の部位へのＭＳＣの遊走を媒介することができる。腫瘍発生の過程において、ＭＳＣは、腫瘍微小環境に動員されることが多く報告されている。２０１１年、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｑｕａｎｔｅらにより、胃ヘリコバクター・ピロリ誘導慢性胃がんマウスモデルにおいて、病変組織は骨髄からＮｅｓｔｉｎ＋細胞を動員することが発見された。２０１４年、Ｄｉａｎａ Ｋｌｅｉｎらにより、マウスＢ１６Ｆ１０及びＬＬＣ腫瘍は、骨髄以外の組織のＮｅｓｔｉｎ＋細胞を血管形成に関与するように動員できることが発見された。これらの結果から、腫瘍は、ＮｅｓｔｉｎをマーカーとするＭＳＣを動員する能力を有することが明らかである。しかしながら、腫瘍がＭＳＣを動員するメカニズムはまだ不明である。
【0009】
ＡＭＤ３１００は、プレリキサフォルとも呼ばれ、化学名は１，１′－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］－ジ－１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカンであり、構造式は以下の通りである。
【0010】
ＡＭＤ３１００は、１９９４年に初めて合成され、ＨＩＶ感染、炎症性疾患、幹細胞動員、白血病、固形腫瘍を治療できることが知られている。しかしながら、ＡＭＤ３１００の悪液質の予防及び治療に関する報告はない。
【発明の概要】
【0011】
本発明者らは、長期間の研究により、化合物１，１′－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］－ジ－１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン又はその薬学的に許容される塩は、悪液質を効果的に治療及び／又は予防でき、腫瘍悪液質の治療に新しいアイデアを提供し、腫瘍患者の症状を遅らせたり軽減したりするのに役立ち、治療効果の改善、生活の質の向上、生存期待の延長に有利であることを発見した。
【0012】
本発明の一態様では、悪液質を治療及び／又は予防する医薬品における化合物１，１′－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］－ジ－１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【0013】
本発明の別の態様では、化合物１，１′－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］－ジ－１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン又はその薬学的に許容される塩を含む、悪液質を治療及び／又は予防する医薬組成物が提供される。
【0014】
好ましくは、前記医薬組成物は、少なくとも１種の他の医薬品をさらに含む。
【0015】
本発明の医薬品又は医薬組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サルなど）における悪液質の治療及び／又は予防に使用できる。
【0016】
本発明の別の態様では、治療及び／又は予防を必要とする被験体に有効量の化合物１，１′－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］－ジ－１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン若しくはその薬学的に許容される塩、又はそれらを含む医薬組成物を投与することを含む、悪液質を治療及び／又は予防する方法がさらに提供される。
【0017】
本発明に記載の被験体は、任意の動物を指し、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サルなどの哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
【0018】
本発明の方法は、特定の有効量の他の医薬品又は医薬組成物と併用して悪液質の治療及び／又は予防に相乗的に作用することにも適している。
【0019】
本発明の医薬品又は医薬組成物は、任意の生理学的に許容される経路により投与され得る。投与経路は、例えば、経口、注射などである。本発明の実施例において、ＡＭＤ３１００の剤形は注射剤である。
【0020】
前記治療及び／又は予防或いは他の治療及び／又は予防に使用される場合には、本発明の化合物及び組成物の１日の総投与量は、合理的な医学的判断の範囲内で担当医によって決定される必要がある。患者に対する具体的な治療有効量のレベルは、多くの要因に応じて決定される必要がある。前記要因は、治療される障害及び障害の重症度、使用される具体的な化合物の活性、使用される具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状況、性別及び飲食、使用される具体的な化合物の投与時間、投与経路及び排泄率、治療持続時間、使用される具体的な化合物と組み合わせて使用される又は同時に使用される医薬品、並びに医療分野で知られている類似の要因を含む。例えば、当分野では、化合物の投与量を所望の治療効果を得るために必要なレベルよりも低いレベルから、所望の効果が得られるまで徐々に増加させる。
【0021】
本発明の医薬品又は医薬組成物は、薬学的に許容される剤形に製剤化することができる。一般的には、医薬品の有効成分は、治療的投与の総質量の１～９５％を占める。医薬品の剤形は、様々な投与形態に適する必要があり、例えば、経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤、溶液又は懸濁液）、注射可能な製剤（注射可能な溶液若しくは懸濁液、又は注射可能な乾燥粉末（使用前に滅菌水又は無菌注射用媒体に溶解又は分散すれば直ちに使用することができる））などであってもよい。製剤の調製は、従来のプロセスを使用することができる。
【0022】
本発明の医薬品又は医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤又は担体をさらに含んでもよい。必要に応じて薬学的に許容される添加剤又は担体を任意に選択することができる。これらの添加剤又は担体は、当分野で広く知られているものであり、経口剤に使用されるバインダー（例えば、澱粉、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドン）、希釈剤（例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリセリン）、潤滑剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸又はその塩（通常、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム）及び／又はポリエチレングリコール）、必要に応じて崩壊剤（例えば、澱粉、寒天、アルギン酸又はその塩（通常、アルギン酸ナトリウム）及び／又は発泡性混合物）、共溶媒、安定剤、懸濁剤、色素、香味料など；注射可能な製剤に使用される防腐剤、可溶化剤、安定剤など；局所製剤に使用される基質、希釈剤、潤滑剤、防腐剤などを含む。
【0023】
本発明に記載の「薬学的に許容される」という用語は、添加剤又は担体が薬効成分と適合性があり、好ましくは薬効成分を安定化することができ、治療される個体に有害ではないことをいう。
【0024】
本発明に記載の悪液質は、悪性腫瘍、結核、糖尿病、血液疾患、内分泌疾患、感染症、後天性免疫不全症候群などの慢性疾患のうち、著しい体重減少、食欲不振などを主症状とする全身症候群であり、例えば、がん悪液質、結核性悪液質、糖尿病性悪液質、血液疾患性悪液質、内分泌疾患性悪液質、感染症性悪液質、後天性免疫不全症候群による悪液質である。
【0025】
好ましくは、前記悪液質は腫瘍悪液質（即ち、腫瘍による悪液質）である。
【0026】
好ましくは、前記悪液質の治療及び／又は予防は、腫瘍悪液質の症状を軽減又は改善することを含む。
【0027】
好ましくは、前記悪液質の治療及び／又は予防は、悪液質の病状である筋肉減少及び脂肪減少を軽減又は改善することを含む。
【0028】
本明細書で使用される悪液質の治療及び／又は予防は、患者の悪液質症状を軽減又は改善することを含み、前記症状は、筋肉減少及び脂肪減少を含むが、これらに限定されない。
【0029】
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、元の生物活性を維持でき、医療用途に適した特定の塩を指す。化合物１，１′－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］－ジ－１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカンは、様々な無機酸及び有機酸と多くの異なる塩を生成することができる。前記塩を調製可能な酸は、無毒の酸付加塩を生成する酸である。前記塩は、クエン酸塩、マレイン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩などを含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記塩は、臭化水素酸塩及び塩酸塩から選択される。
【0030】
本明細書で使用される「治療」という用語は、病状を軽減又は改善すること、即ち、病症又は少なくとも１種の臨床症状の進行を遅延又は抑制することをいう。
【0031】
本明細書で使用される「予防」という用語は、前記病症の症状が出る前に、被験体に本発明の化合物を投与することをいう。
【0032】
本明細書で使用されるように、被験体が生物学的、医学的又は生活の質に治療から恩恵を受ける場合、被験体はこのような治療を「必要」とする。
【0033】
本発明者らは、生体の間葉系幹細胞の欠如が腫瘍悪液質の発生の原因であることを指摘し、長期的研究により、化合物１，１′－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］－ジ－１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン又はその薬学的に許容される塩が悪液質を効果的に治療及び／又は予防できることを発見し、悪液質の治療に新しいアイデアを提供した。前記化合物及びその塩は、主に筋肉、脂肪など多くの組織の間葉系幹細胞に対する腫瘍の動員を遮断することにより、生体組織の恒常性が維持され、悪液質の発生が遅延されるとともに、患者の悪液質の症状が軽減又は緩和され、治療効果が改善され、生活の質が向上し、患者の生存期待が延長する。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】図１Ａ－１Ｄは、それぞれＣ５７ ＢＬ／６悪液質群マウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後の状況及び対照群の状況を示す。図１Ａはマウス摂食状況、図１Ｂはマウスの体重状況、図１Ｃ及び１Ｄはそれぞれ脂肪組織及び筋肉組織の重量状況を示す。
【図2】図２Ａ－２Ｄは、それぞれＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウス対照群及び悪液質群を示す。図２Ａ及び２Ｂはそれぞれマウス脂肪組織切片の免疫蛍光染色、切片におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の統計を示す。図２Ｃは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）により脂肪組織におけるＮｅｓｔｉｎ発現を検出した結果を示す。図２Ｄ及び２Ｅはそれぞれマウス筋肉組織切片の免疫蛍光染色、切片におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の統計を示す。図２Ｆは定量的リアルタイムＰＣＲにより筋肉組織におけるＮｅｓｔｉｎ発現を検出した結果を示す。
【図3】Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後の状況を示す。図３Ａはマウス腫瘍組織切片の免疫蛍光染色、及び切片におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の統計を示す。図３Ｂは定量的リアルタイムＰＣＲにより腫瘍組織におけるＧＦＰ発現を検出した結果を示す。図３Ｃ及び３Ｄは、フローサイトメトリーにより末梢血中のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞を検出した結果を示す。
【図4】腫瘍ケモカイン発現の定量的リアルタイムＰＣＲの検出結果を示す。
【図5】マウスの筋肉及び脂肪組織におけるＮｅｓｔｉｎ陽性細胞でのケモカイン受容体の発現の検出結果を示す。
【図6】Ｃｘｃｌ １２によりマウスＮｅｓｔｉｎ＋細胞の遊走を促進する実験の結果を示す。
【図7】ＡＭＤ３１００によりインビボでＮｅｓｔｉｎ＋細胞の遊走を抑制する実験の結果を示す。
【図8】インビボでＡＭＤ３１００を使用した後、マウス腫瘍悪液質症状のモニタリング結果を示す。
【図9】インビボでＡＭＤ３１００を使用した担がんマウスの生存期間の実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0035】
以下、図面を参照しながら本発明をさらに説明する。
ＡＭＤ３１００は、米国ＡｐｅｘＢｉｏ社から購入し、医薬品番号はＡ２０２５である。
特に明記しない限り、実施例で使用される試薬は、当該技術分野における従来の試薬であり、商業的に購入することができる。実施例に具体的に記載されていない実験操作は、当分野におけるすべての通常操作であるか、又は従来技術又は共通の一般知識に基づいて当業者によって理解され又は知られ得る。
ＡＭＤ３１００は、米国ＡｐｅｘＢｉｏ社から購入し、医薬品番号はＡ２０２５である。
特に明記しない限り、実施例で使用される試薬は、当該技術分野における従来の試薬であり、商業的に購入することができる。実施例に具体的に記載されていない実験操作は、当分野におけるすべての通常操作であるか、又は従来技術又は共通の一般知識に基づいて当業者によって理解され又は知られ得る。
【0036】
実施例１：ルイス肺がんＬＬＣの培養、マウスＮｅｓｔｉｎ＋細胞の分離及び培養
１．１ ＬＬＣ細胞培養：ＤＭＥＭ基礎培地（１０％ウシ胎児血清含有）でＬＬＣ細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－１６４２）を培養し、使用に備えた。
１．１ ＬＬＣ細胞培養：ＤＭＥＭ基礎培地（１０％ウシ胎児血清含有）でＬＬＣ細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－１６４２）を培養し、使用に備えた。
【0037】
１．２ マウス筋肉Ｎｅｓｔｉｎ＋細胞の分離
成体Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニック雄マウス（Ｄｒ Ｍａｓａｈｉｒｏ Ｙａｍａｇｕｃｈｉにより提供されたが、商業的に購入してもよい）を取り、無菌条件下で両側腓腹筋を完全に切り取った直後、ＰＢＳを含むペトリ皿に置いた。筋肉ブロックをＰＢＳで３回リンスし、筋肉組織に切断し、血管、神経、結合組織をできるだけ取り除いた。Ｉ型コラゲナーゼで筋細胞を消化分離した。具体的には、筋肉組織を遠沈管に移し、Ｉ型コラゲナーゼを加えた後、３７℃の恒温振盪水浴タンクに入れ、３０分間消化した。血清を加えて消化を停止し、消化液を１，１００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を吸引除去し、沈殿をＰＢＳで再懸濁し、２００メッシュの濾過網で濾過した。濾液を収集し、４分間遠心分離し、上清を取り除き、沈殿をＰＢＳに加えて再懸濁し、フローサイトメーターによりＮｅｓｔｉｎ＋細胞を選別した。
成体Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニック雄マウス（Ｄｒ Ｍａｓａｈｉｒｏ Ｙａｍａｇｕｃｈｉにより提供されたが、商業的に購入してもよい）を取り、無菌条件下で両側腓腹筋を完全に切り取った直後、ＰＢＳを含むペトリ皿に置いた。筋肉ブロックをＰＢＳで３回リンスし、筋肉組織に切断し、血管、神経、結合組織をできるだけ取り除いた。Ｉ型コラゲナーゼで筋細胞を消化分離した。具体的には、筋肉組織を遠沈管に移し、Ｉ型コラゲナーゼを加えた後、３７℃の恒温振盪水浴タンクに入れ、３０分間消化した。血清を加えて消化を停止し、消化液を１，１００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を吸引除去し、沈殿をＰＢＳで再懸濁し、２００メッシュの濾過網で濾過した。濾液を収集し、４分間遠心分離し、上清を取り除き、沈殿をＰＢＳに加えて再懸濁し、フローサイトメーターによりＮｅｓｔｉｎ＋細胞を選別した。
【0038】
１．３ マウス脂肪Ｎｅｓｔｉｎ＋細胞の分離
雄Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウス（約６週齢）を選択し、無菌条件下でマウスの鼠径部の脂肪組織を分離し、ＰＢＳで十分に（少なくとも６回）洗浄した後、ハサミで脂肪組織を十分に細断し、０．１％コラゲナーゼＩＶ＋０．０５％トリプシン＋０．１％ＤｉｓｐａｓｅＩＩ混合液を１０ｍｌ加え、３７℃で６０分間撹拌した。その後、１０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ培地に加えて消化を停止し、１００メッシュ及び２００メッシュの篩で濾過し、８００ｇで５分間遠心分離し、上清を取り除き、培地を加え、軽くピペッティングして均一に混合することで細胞懸濁液を調製し、フローサイトメーターによりＮｅｓｔｉｎ＋細胞を選別した。
雄Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウス（約６週齢）を選択し、無菌条件下でマウスの鼠径部の脂肪組織を分離し、ＰＢＳで十分に（少なくとも６回）洗浄した後、ハサミで脂肪組織を十分に細断し、０．１％コラゲナーゼＩＶ＋０．０５％トリプシン＋０．１％ＤｉｓｐａｓｅＩＩ混合液を１０ｍｌ加え、３７℃で６０分間撹拌した。その後、１０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ培地に加えて消化を停止し、１００メッシュ及び２００メッシュの篩で濾過し、８００ｇで５分間遠心分離し、上清を取り除き、培地を加え、軽くピペッティングして均一に混合することで細胞懸濁液を調製し、フローサイトメーターによりＮｅｓｔｉｎ＋細胞を選別した。
【0039】
１．４ マウス筋肉及び脂肪由来のＮｅｓｔｉｎ＋細胞の培養
前記１．２、１．３で筋肉、脂肪組織から得られたＮｅｓｔｉｎ＋細胞をＤＭＥＭ／低糖（１０％ウシ胎児血清）培地で接着培養した。
前記１．２、１．３で筋肉、脂肪組織から得られたＮｅｓｔｉｎ＋細胞をＤＭＥＭ／低糖（１０％ウシ胎児血清）培地で接着培養した。
【0040】
実施例２：マウスの飼育及び腫瘍悪液質モデルの構築
２．１ マウス飼育方法：通常のマウス飼料（タンパク質の含有量：２０－２５ｗｔ％、脂肪の含有量：５％－１０ｗｔ％、粗繊維の含有量：３－５ｗｔ％）でマウスを飼育した。
２．１ マウス飼育方法：通常のマウス飼料（タンパク質の含有量：２０－２５ｗｔ％、脂肪の含有量：５％－１０ｗｔ％、粗繊維の含有量：３－５ｗｔ％）でマウスを飼育した。
【0041】
２．２ マウス腫瘍悪液質モデルの構築
体重差が２ｇ以下の雄Ｃ５７ ＢＬ／６マウス（８週齢；南京大学モデル動物学研究所から購入）又はＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスを取り、マウスをランダムに対照群と悪液質群に分けた。悪液質群の各マウスの鼠径部に約４×１０６個のルイス肺がんＬＬＣ細胞を皮下注射し、実験はクリーンベンチ内で行った（無菌操作）。接種の当日を０日目とし、次いで１日目、２日目・・・とした。腫瘍接種後の７日目に、担がんマウスの体重が減少し始め、腫瘍悪液質が既に発生しており、２１日目に、マウスの体重が著しく減少し、悪液質の症候が顕著になった。
体重差が２ｇ以下の雄Ｃ５７ ＢＬ／６マウス（８週齢；南京大学モデル動物学研究所から購入）又はＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスを取り、マウスをランダムに対照群と悪液質群に分けた。悪液質群の各マウスの鼠径部に約４×１０６個のルイス肺がんＬＬＣ細胞を皮下注射し、実験はクリーンベンチ内で行った（無菌操作）。接種の当日を０日目とし、次いで１日目、２日目・・・とした。腫瘍接種後の７日目に、担がんマウスの体重が減少し始め、腫瘍悪液質が既に発生しており、２１日目に、マウスの体重が著しく減少し、悪液質の症候が顕著になった。
【0042】
実施例３：マウス腫瘍悪液質の評価
実施例２の悪液質群マウスに腫瘍を接種した後、毎日同じ時刻にマウスの毛色、活動状況、体重、摂食量及び腫瘍のサイズを観察し、対照群と比較した。腫瘍を接種した後、２日ごとに２１日目まで、或いは７日目、１４日目、２１日目に麻酔薬の過剰摂取でマウスを安楽死させ、腫瘍組織を摘出し、全ての動物に対して腫瘍を除去した後の体重を測った。大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）、腓腹筋（ＧＡＳＴ）、前脛骨筋（ＴＡ）、精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）、肩甲骨間褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）を分離してそれぞれ重量を測った。
実施例２の悪液質群マウスに腫瘍を接種した後、毎日同じ時刻にマウスの毛色、活動状況、体重、摂食量及び腫瘍のサイズを観察し、対照群と比較した。腫瘍を接種した後、２日ごとに２１日目まで、或いは７日目、１４日目、２１日目に麻酔薬の過剰摂取でマウスを安楽死させ、腫瘍組織を摘出し、全ての動物に対して腫瘍を除去した後の体重を測った。大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）、腓腹筋（ＧＡＳＴ）、前脛骨筋（ＴＡ）、精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）、肩甲骨間褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）を分離してそれぞれ重量を測った。
【0043】
図１Ａは、対照群と悪液質群Ｃ５７ ＢＬ／６マウスの毎日の摂食検出結果を示す。図１Ｂは、対照群と悪液質群マウスの体重測定結果を示す。図１Ｃ及び１Ｄは、それぞれ脂肪組織及び筋肉組織の重量測定結果を示す。図１から分かるように、Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後、マウスには腫瘍悪液質が発生した。
【0044】
実施例４：マウス骨格筋、脂肪組織、腫瘍におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の検出
４．１ 免疫蛍光染色
対照群及び悪液質群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスに対してそれぞれ大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）、腓腹筋（ＧＡＳＴ）、前脛骨筋（ＴＡ）を分離し、４％ＰＦＡで８時間固定した後、３０％濃度（質量）のショ糖に変更して４８時間脱水し、凍結切片を作製した。Ｌａｍｉｎｉｎ抗体で基底膜を標識した後、蛍光二次抗体をインキュベートし、０．２％の１ｇ／ｍＬ ＤＡＰＩで細胞核を５分間対比染色した後、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡で観察した。
４．１ 免疫蛍光染色
対照群及び悪液質群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスに対してそれぞれ大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）、腓腹筋（ＧＡＳＴ）、前脛骨筋（ＴＡ）を分離し、４％ＰＦＡで８時間固定した後、３０％濃度（質量）のショ糖に変更して４８時間脱水し、凍結切片を作製した。Ｌａｍｉｎｉｎ抗体で基底膜を標識した後、蛍光二次抗体をインキュベートし、０．２％の１ｇ／ｍＬ ＤＡＰＩで細胞核を５分間対比染色した後、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡で観察した。
【0045】
対照群及び悪液質群のＣ５７ ＢＬ／６マウスに対してそれぞれ精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）、肩甲骨間褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）を分離し、４％ＰＦＡで８時間固定した後、アルコールで段階的に脱水した後、パラフィン切片を作製した。キシレン、アルコールで段階的に脱パラフィンした後、上述した骨格筋の染色法に従ってＮｅｓｔｉｎ抗体で染色し、顕微鏡で観察した。
【0046】
悪液質群Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスの腫瘍組織は、筋肉組織と同様に処理した。凍結切片を作製した後、０．２％の１ｇ／ｍＬ ＤＡＰＩで細胞核を５分間対比染色し、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡で観察した。
【0047】
図２Ａは、悪液質群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後の７日目、１４日目、２１日目、及び対照群マウスの脂肪組織切片の免疫蛍光染色の観察結果を示す。図２Ｂは、悪液質群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後の７日目、１４日目、２１日目のマウス脂肪組織切片におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の統計、及び対照群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の統計結果を示す。
【0048】
図２Ｄは、悪液質群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後の７日目、１４日目、２１日目、及び対照群を２１日間培養した後のマウス筋肉組織切片の免疫蛍光染色の観察結果を示す。図２Ｅは、悪液質群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後の７日目、１４日目、２１日目、及び対照群を２１日間培養した後のマウス筋肉組織切片におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の統計結果を示す。
【0049】
図３Ａは、悪液質群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後の７日目、１４日目、２１日目の腫瘍組織切片の免疫蛍光染色の観察結果を示す。図３Ｃ及び３Ｄは、フローサイトメトリーにより対照群及び悪液質群のマウス末梢血中のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞を検出した結果を示す図である。
【0050】
４．２ 定量的リアルタイムＰＣＲ
定量ＰＣＲによりＮｅｓｔｉｎ遺伝子発現を分析する具体的なステップは、具体的に以下の通りである。実施例２の各実験群のマウスから筋肉（ＱＵＡＤ、ＧＡＳＴ、ＴＡ）及び脂肪（ｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｉＢＡＴ）を取り、悪液質群のマウスから腫瘍組織を取り、液体窒素で組織を粉砕した後、Ｔｒｉｚｏｌ法により総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを逆転写し、一本鎖ｃＤＮＡを得た後、Ｒｏｃｈｅ社のＬＣ４８０システムを用いて定量的リアルタイムＰＣＲによりＮｅｓｔｉｎ又はＧＦＰ遺伝子発現の状況を検出した。用いたＮｅｓｔｉｎプライマーは、５’－ＧＧＣＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧ－３’（Ｆ）及び５’－ＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＴ－３’（Ｒ）であり、用いたＧＦＰプライマーは５’－ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＣＡ ＴＴＧＣＣ－３’（Ｆ）及び５’－ＧＡＴ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＧＧ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＡＧＣ－３’（Ｆ）であった。
定量ＰＣＲによりＮｅｓｔｉｎ遺伝子発現を分析する具体的なステップは、具体的に以下の通りである。実施例２の各実験群のマウスから筋肉（ＱＵＡＤ、ＧＡＳＴ、ＴＡ）及び脂肪（ｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｉＢＡＴ）を取り、悪液質群のマウスから腫瘍組織を取り、液体窒素で組織を粉砕した後、Ｔｒｉｚｏｌ法により総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを逆転写し、一本鎖ｃＤＮＡを得た後、Ｒｏｃｈｅ社のＬＣ４８０システムを用いて定量的リアルタイムＰＣＲによりＮｅｓｔｉｎ又はＧＦＰ遺伝子発現の状況を検出した。用いたＮｅｓｔｉｎプライマーは、５’－ＧＧＣＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧ－３’（Ｆ）及び５’－ＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＴ－３’（Ｒ）であり、用いたＧＦＰプライマーは５’－ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＣＡ ＴＴＧＣＣ－３’（Ｆ）及び５’－ＧＡＴ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＧＧ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＡＧＣ－３’（Ｆ）であった。
【0051】
検出結果を図２Ｃ、２Ｆに示す。図２Ｃは、Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後、定量的リアルタイムＰＣＲにより脂肪組織におけるＮｅｓｔｉｎ発現を検出した結果を示す。図２Ｆは、Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後、定量的リアルタイムＰＣＲにより筋肉組織におけるＮｅｓｔｉｎ発現を検出した結果を示す。
【0052】
図３Ｂは、Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後、定量的リアルタイムＰＣＲにより腫瘍組織におけるＧＦＰ発現を検出した結果を示す。
【0053】
実施例４の検出結果から分かるように、Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植した後、骨格筋及び脂肪組織におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞は減少し続け、腫瘍におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞は増加し続けた。
【0054】
実施例５：腫瘍ケモカイン発現の検出、及びマウスＭＳＣケモカイン受容体発現の検出
５．１ 定量的リアルタイムＰＣＲによる腫瘍ケモカイン発現の検出
４．２に記載の腫瘍組織の処理方法に従って一本鎖ｃＤＮＡを得た後、Ｒｏｃｈｅ社のＬＣ４８０システムを用いて定量的リアルタイムＰＣＲにより各ケモカイン遺伝子の発現状況を検出した。
定量的リアルタイムＰＣＲに用いた各プライマーは以下の通りである。
（１）マウスＣｃｌ２プライマー：
５’－ＴＧＴＣＡＴＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＴ－３’（Ｒ）
（２）マウスＣｃｌ３プライマー：
５’－ＧＧＴＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＴＴ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣ－３’（Ｒ）
（３）Ｃｃｌ５プライマー：
５’－ＡＴＡＴＧＧＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＡＣＴＣ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＡＣＡＣＧ－３’（Ｒ）
（４）Ｃｃｌ７プライマー：
５’－ＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡ－３’（Ｆ）及び５’－ＣＴＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＣＡ－３’（Ｒ）
（５）Ｃｃｌ８プライマー：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣ－３’（Ｒ）
（６）Ｃｘｃｌ１プライマー：
５’－ＧＣＴＧＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡ－３’（Ｆ）及び５’－ＡＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ－３’（Ｒ）
（７）Ｃｘｃｌ２プライマー：
５’－ＧＣＣＡＡＧＧＧＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＡＡＣＴＴ－３’（Ｒ）
（８）Ｃｘｃｌ３プライマー：
５’－ＴＴＣＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＧＡＴ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＡＧＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＣＣＣＧＴＡＧ－３’（Ｒ）
（９）Ｃｘｃｌ１１プライマー：
５’－ＴＧＴＡＡＴＴＴＡＣＣＣＧＡＧＴＡＡＣＧＧＣ－３’（Ｆ）及び５’－ＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＡＴＧＡＧＣＣＴＴ－３’（Ｒ）
（１０）Ｃｘｃｌ１２プライマー：
５’－ＴＧＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＣＣＡ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＴＣＴＴＣＡＧＣＣＧＴＧＣＡＡＣＡＡＴＣ－３’（Ｒ）
（１１）ＨＧＦプライマー：
５’－ＴＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＴＣＣＣ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡＣＴＣＣＣ－３’（Ｒ）
定量的リアルタイムＰＣＲの結果を図４に示す。図４から分かるように、マウス腫瘍ではケモカインＣｘｃｌ１２が高度に発現した。
５．１ 定量的リアルタイムＰＣＲによる腫瘍ケモカイン発現の検出
４．２に記載の腫瘍組織の処理方法に従って一本鎖ｃＤＮＡを得た後、Ｒｏｃｈｅ社のＬＣ４８０システムを用いて定量的リアルタイムＰＣＲにより各ケモカイン遺伝子の発現状況を検出した。
定量的リアルタイムＰＣＲに用いた各プライマーは以下の通りである。
（１）マウスＣｃｌ２プライマー：
５’－ＴＧＴＣＡＴＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＴ－３’（Ｒ）
（２）マウスＣｃｌ３プライマー：
５’－ＧＧＴＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＴＴ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣ－３’（Ｒ）
（３）Ｃｃｌ５プライマー：
５’－ＡＴＡＴＧＧＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＡＣＴＣ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＡＣＡＣＧ－３’（Ｒ）
（４）Ｃｃｌ７プライマー：
５’－ＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡ－３’（Ｆ）及び５’－ＣＴＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＣＡ－３’（Ｒ）
（５）Ｃｃｌ８プライマー：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣ－３’（Ｒ）
（６）Ｃｘｃｌ１プライマー：
５’－ＧＣＴＧＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡ－３’（Ｆ）及び５’－ＡＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ－３’（Ｒ）
（７）Ｃｘｃｌ２プライマー：
５’－ＧＣＣＡＡＧＧＧＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＡＡＣＴＴ－３’（Ｒ）
（８）Ｃｘｃｌ３プライマー：
５’－ＴＴＣＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＧＡＴ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＡＧＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＣＣＣＧＴＡＧ－３’（Ｒ）
（９）Ｃｘｃｌ１１プライマー：
５’－ＴＧＴＡＡＴＴＴＡＣＣＣＧＡＧＴＡＡＣＧＧＣ－３’（Ｆ）及び５’－ＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＡＴＧＡＧＣＣＴＴ－３’（Ｒ）
（１０）Ｃｘｃｌ１２プライマー：
５’－ＴＧＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＣＣＡ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＴＣＴＴＣＡＧＣＣＧＴＧＣＡＡＣＡＡＴＣ－３’（Ｒ）
（１１）ＨＧＦプライマー：
５’－ＴＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＴＣＣＣ－３’（Ｆ）及び５’－ＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡＣＴＣＣＣ－３’（Ｒ）
定量的リアルタイムＰＣＲの結果を図４に示す。図４から分かるように、マウス腫瘍ではケモカインＣｘｃｌ１２が高度に発現した。
【0055】
５．２ マウスＭＳＣケモカイン受容体Ｃｘｃｒ４発現の検出
マウス脂肪及び筋肉由来の細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定した後、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎで１５分間浸透し、さらに１％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした。１：１００で希釈したＮｅｓｔｉｎ抗体（マウスに由来）及び１：１００で希釈したＣｘｃｒ４抗体（ウサギに由来）を４℃で１４時間インキュベートした。ＰＢＳで１０分間かけて３回洗浄した後、３７℃で緑色マウス蛍光二次抗体（１：５００）及び赤色ウサギ蛍光二次抗体（１：５００）を３０分間インキュベートした。ＰＢＳで１０分間かけて３回洗浄した後、０．２％ １ｇ／ｍＬＤＡＰＩで細胞核を５分間対比染色し、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡で観察した。結果から分かるように、マウス筋肉及び脂肪組織から分離されたＮｅｓｔｉｎ＋細胞はＣｘｃｒ４を発現した。
マウス脂肪及び筋肉由来の細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定した後、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎで１５分間浸透し、さらに１％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした。１：１００で希釈したＮｅｓｔｉｎ抗体（マウスに由来）及び１：１００で希釈したＣｘｃｒ４抗体（ウサギに由来）を４℃で１４時間インキュベートした。ＰＢＳで１０分間かけて３回洗浄した後、３７℃で緑色マウス蛍光二次抗体（１：５００）及び赤色ウサギ蛍光二次抗体（１：５００）を３０分間インキュベートした。ＰＢＳで１０分間かけて３回洗浄した後、０．２％ １ｇ／ｍＬＤＡＰＩで細胞核を５分間対比染色し、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡で観察した。結果から分かるように、マウス筋肉及び脂肪組織から分離されたＮｅｓｔｉｎ＋細胞はＣｘｃｒ４を発現した。
【0056】
実施例６：Ｃｘｃｌ １２によりマウスＮｅｓｔｉｎ＋細胞の遊走を促進する実験
Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー（８μｍ孔径）を２４ウェルプレート上に置き、インビトロで培養された筋肉及び脂肪由来のＮｅｓｔｉｎ＋細胞（実施例１を参照）を２Ｘ１０４個／ウェルでＴｒａｎｓｗｅｌｌのチャンバーに接種し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター内で培養した。各ウェルから５００μｌのＤＭＥＭ／低糖をＴｒａｎｓｗｅｌｌ下部チャンバーに加えた。ここで、実験群には１μｍｏｌ／ｍＬのＣｘｃｌ１２因子が含まれ、対照群にはＣｘｃｌ１２因子が添加されなかった。２４時間後にチャンバーを取り出し、綿棒でチャンバー内側の細胞を拭き取り、軽くリンスした後、無水エタノールで固定して２回洗浄した。各群のチャンバーにマークしてそれぞれ廃棄されたウェルプレート上に置き、各ウェルにクリスタルバイオレット染色液を加え、室温で１５分間インキュベートした後、過剰な染色液を洗い流した。倒立顕微鏡で各群の遊走細胞の数を検出し、ランダムに５つの視野（４００倍）を選択し、各群の顕微鏡下の遊走細胞の数を計算し、各群に３つの重複ウェルで測定し、得られた結果の平均値を算出した。結果を図６に示す。図６から分かるように、Ｃｘｃｌ １２は、マウスＮｅｓｔｉｎ＋細胞の遊走を促進することができる。
Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー（８μｍ孔径）を２４ウェルプレート上に置き、インビトロで培養された筋肉及び脂肪由来のＮｅｓｔｉｎ＋細胞（実施例１を参照）を２Ｘ１０４個／ウェルでＴｒａｎｓｗｅｌｌのチャンバーに接種し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター内で培養した。各ウェルから５００μｌのＤＭＥＭ／低糖をＴｒａｎｓｗｅｌｌ下部チャンバーに加えた。ここで、実験群には１μｍｏｌ／ｍＬのＣｘｃｌ１２因子が含まれ、対照群にはＣｘｃｌ１２因子が添加されなかった。２４時間後にチャンバーを取り出し、綿棒でチャンバー内側の細胞を拭き取り、軽くリンスした後、無水エタノールで固定して２回洗浄した。各群のチャンバーにマークしてそれぞれ廃棄されたウェルプレート上に置き、各ウェルにクリスタルバイオレット染色液を加え、室温で１５分間インキュベートした後、過剰な染色液を洗い流した。倒立顕微鏡で各群の遊走細胞の数を検出し、ランダムに５つの視野（４００倍）を選択し、各群の顕微鏡下の遊走細胞の数を計算し、各群に３つの重複ウェルで測定し、得られた結果の平均値を算出した。結果を図６に示す。図６から分かるように、Ｃｘｃｌ １２は、マウスＮｅｓｔｉｎ＋細胞の遊走を促進することができる。
【0057】
実施例７：ＡＭＤ３１００によりインビボでＮｅｓｔｉｎ＋細胞の遊走を抑制する実験
体重差が２ｇ以下の雄Ｃ５７ ＢＬ／６マウス（８週齢）を選択し、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、悪液質群（ＬＬＣ）及びＡＭＤ３１００群（ＬＬＣ＋ＡＭＤ３１００）に分けた。
対照群：処理しなかった。
悪液質群：４Ｘ１０６個のＬＬＣをマウスの鼠径部に皮下移植した。７日後、１００μｌの１０％抱水クロラールでマウスを麻酔し、その背部の皮下に生理食塩水を含有するＡｌｚｅｔ徐放性ポンプ（型番：１００４）を埋め込んだ。
ＡＭＤ３１００群：４Ｘ１０６個のＬＬＣをマウスの鼠径部に皮下移植した。７日後、１００μｌの１０％抱水クロラールでマウスを麻酔し、その背部の皮下にＡＭＤ３１００を含有するＡｌｚｅｔ徐放性ポンプ（型番：１００４）を埋め込んだ。マウスＡＭＤ３１００の用量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重／日であった。徐放性ポンプを埋め込んだ１４日後にマウスを安楽死させ、筋肉及び脂肪組織を取り、切片を作製し、免疫蛍光染色を行い、又はＲＮＡを抽出して逆転写し、定量的リアルタイムＰＣＲによりＮｅｓｔｉｎの発現を検出した。
体重差が２ｇ以下の雄Ｃ５７ ＢＬ／６マウス（８週齢）を選択し、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、悪液質群（ＬＬＣ）及びＡＭＤ３１００群（ＬＬＣ＋ＡＭＤ３１００）に分けた。
対照群：処理しなかった。
悪液質群：４Ｘ１０６個のＬＬＣをマウスの鼠径部に皮下移植した。７日後、１００μｌの１０％抱水クロラールでマウスを麻酔し、その背部の皮下に生理食塩水を含有するＡｌｚｅｔ徐放性ポンプ（型番：１００４）を埋め込んだ。
ＡＭＤ３１００群：４Ｘ１０６個のＬＬＣをマウスの鼠径部に皮下移植した。７日後、１００μｌの１０％抱水クロラールでマウスを麻酔し、その背部の皮下にＡＭＤ３１００を含有するＡｌｚｅｔ徐放性ポンプ（型番：１００４）を埋め込んだ。マウスＡＭＤ３１００の用量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重／日であった。徐放性ポンプを埋め込んだ１４日後にマウスを安楽死させ、筋肉及び脂肪組織を取り、切片を作製し、免疫蛍光染色を行い、又はＲＮＡを抽出して逆転写し、定量的リアルタイムＰＣＲによりＮｅｓｔｉｎの発現を検出した。
【0058】
免疫蛍光染色の結果を図７Ａ、７Ｂに示す。図７Ａは、悪液質群及びＡＭＤ３１００群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植してから２１日後、並びに対照群マウスを２１日培養した後のマウス脂肪組織切片の免疫蛍光染色の観察結果を示す。図７Ｂは、悪液質群及びＡＭＤ３１００群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植してから２１日後、並びに対照群マウスを２１日培養した後のマウス脂肪組織切片におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の統計結果を示す。
【0059】
図７Ｃは、悪液質群及びＡＭＤ３１００群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植してから２１日後、並びに対照群マウスを２１日培養した後のマウス筋肉組織切片の免疫蛍光染色の観察結果を示す。図７Ｄは、悪液質群及びＡＭＤ３１００群のＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を皮下移植してから２１日後、並びに対照群マウスを２１日培養した後のマウス筋肉組織切片におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の統計結果を示す。
【0060】
実験の結果から分かるように、インビボでＡＭＤ３１００を使用した後、担がんマウスの骨格筋及び脂肪組織におけるＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞は増加した。
【0061】
実施例８：ＡＭＤ３１００により担がんマウスの生存期間を延長する実施例
体重差が２ｇ以下の雄Ｃ５７ ＢＬ／６マウス（８週齢）を選択し、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、悪液質群（ＬＬＣ）、及びＡＭＤ３１００群（ＬＬＣ＋ＡＭＤ３１００）に分けた。
対照群：処理しなかった。
悪液質群：４Ｘ１０６個のＬＬＣをマウス鼠径部に皮下移植した。７日後、１００μｌの１０％抱水クロラールでマウスを麻酔し、その背部の皮下に生理食塩水を含有するＡｌｚｅｔ徐放性ポンプ（型番：１００４）を埋め込んだ。
ＡＭＤ３１００群：４Ｘ１０６個のＬＬＣをマウス鼠径部に皮下移植した。７日後、１００μｌの１０％抱水クロラールでマウスを麻酔し、その背部の皮下にＡＭＤ３１００を含有するＡｌｚｅｔ徐放性ポンプ（型号：１００４）を埋め込んだ。マウスＡＭＤ３１００の使用量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重／日であった。腫瘍細胞を接種してから３５日後までマウス状態を継続的に観察した。
体重差が２ｇ以下の雄Ｃ５７ ＢＬ／６マウス（８週齢）を選択し、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、悪液質群（ＬＬＣ）、及びＡＭＤ３１００群（ＬＬＣ＋ＡＭＤ３１００）に分けた。
対照群：処理しなかった。
悪液質群：４Ｘ１０６個のＬＬＣをマウス鼠径部に皮下移植した。７日後、１００μｌの１０％抱水クロラールでマウスを麻酔し、その背部の皮下に生理食塩水を含有するＡｌｚｅｔ徐放性ポンプ（型番：１００４）を埋め込んだ。
ＡＭＤ３１００群：４Ｘ１０６個のＬＬＣをマウス鼠径部に皮下移植した。７日後、１００μｌの１０％抱水クロラールでマウスを麻酔し、その背部の皮下にＡＭＤ３１００を含有するＡｌｚｅｔ徐放性ポンプ（型号：１００４）を埋め込んだ。マウスＡＭＤ３１００の使用量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重／日であった。腫瘍細胞を接種してから３５日後までマウス状態を継続的に観察した。
【0062】
【0063】
図８Ａは、各実験群マウスの体重状況を示す。図８Ｂは、各実験群マウスの脂肪及び筋肉組織が萎縮した状況を示す。図８Ｃは、各実験群マウスの脂肪及び筋肉の重量の状況を示す。図８の実験結果から分かるように、インビボでＡＭＤ３１００を使用した後、マウス腫瘍悪液質の症状が緩和された。
【0064】
図９は、各実験群マウスの生存期間の比較図である。同図から分かるように、インビボでＡＭＤ３１００を使用することにより、担がんマウスの生存期間を延長することができる。
【0065】
本発明では、上記実験により、腫瘍悪液質の発生が間葉系幹細胞に関係があることを実証し、腫瘍悪液質が発生したマウス筋肉及び脂肪組織におけるＮｅｓｔｉｎ＋間葉系幹細胞の含有量を評価した。マウス筋肉及び脂肪に対して切片及び免疫蛍光染色を行い、Ｎｅｓｔｉｎ＋細胞の数を統計した結果、腫瘍悪液質が発生したマウスは正常マウスより少ないＮｅｓｔｉｎ＋細胞を有することが発見された。また、定量的リアルタイムＰＣＲにより、腫瘍悪液質が発生したマウス筋肉及び脂肪においてＮｅｓｔｉｎの発現が低下したことが分かった。以上の結果は、腫瘍悪液質の発生が筋肉及び脂肪組織における間葉系幹細胞の減少を伴うことを示している。
【0066】
本発明者らは、Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰトランスジェニックマウスを使用し、マウスに腫瘍を与えた後、腫瘍切片にＮｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞を観察し、腫瘍悪液質の発生に伴い、Ｎｅｓｔｉｎ－ＧＦＰ＋細胞の数が多くなることを発見した。以上の結果は、生体内のＮｅｓｔｉｎ＋細胞が腫瘍への遊走のため減少することを示しており、生体の間葉系幹細胞が腫瘍への遊走のため減少することを実証した。
【0067】
本発明者らは、初めて定量的リアルタイムＰＣＲにより腫瘍においてＣｘｃｌ１２の高発現を検出し、免疫蛍光染色によりマウス筋肉及び脂肪組織から分離されたＮｅｓｔｉｎ＋細胞がＣｘｃｒ４を発現することを発見した。本発明者らは、インビトロでＣｘｃｌ１２を使用することにより筋肉及び脂肪由来のＮｅｓｔｉｎ＋細胞のＴｒａｎｓｗｅｌｌ遊走を促進できることを発見した。マウスの体内でＡｌｚｅｔ徐放性ポンプを埋め込んで担がんマウスに０．１５ｍｇ／ｋｇ体重／日でＡＭＤ３１００を投与することにより、筋肉及び脂肪Ｎｅｓｔｉｎ＋細胞の腫瘍への遊走が効果的に抑制され、筋肉、脂肪内のＮｅｓｔｉｎ＋細胞は、ＡＭＤ３１００非投与群に比べて著しく回復した。以上の結果は、腫瘍悪液質の場合、Ｃｘｃｌ１２－Ｃｘｃｒ４軸がマウス筋肉及び脂肪由来のＮｅｓｔｉｎ＋細胞の遊走を媒介することを実証した。
【0068】
本発明者らは、マウスの体重及び筋肉、脂肪の重量を測ることにより、腫瘍を与えた日数が同じ場合、ＡＭＤ３１００投与マウスの悪液質症状がＡＭＤ３１００非投与マウスよりも軽いことを発見した。担がんマウスの生存期間を観察した結果、ＡＭＤ３１００投与マウスの生存期間がＡＭＤ３１００非投与マウスよりも長いことを発見した。
【0069】
以上の実験結果から明らかなように、ＡＭＤ３１００は、腫瘍悪液質の予防及び治療に対して顕著な効果を有し、腫瘍患者にＡＭＤ３１００を使用することにより、筋肉、脂肪、骨髄など多くの組織の間葉系幹細胞に対する腫瘍の動員を遮断することができ、生体組織恒常性の維持、腫瘍悪液質発生の遅延に有利であるとともに、腫瘍患者の悪液質症状の軽減、腫瘍治療効果の改善、生活の質の向上、及び生存期待の延長に有利である。
【0070】
以上の説明は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を形式的に制限するものではない。よって、本発明の技術内容を逸脱しない限り、本発明の技術に基づいて以上の実施例に加える簡単な修正、同等の変更及び修飾は、いずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】