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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-15
(45)【発行日】2023-12-25
(54)【発明の名称】ウイルス感染及び活性抑制方法
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20231218BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20231218BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231218BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20231218BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20231218BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61K31/713
A61K39/395 N
A61P31/22
C12N15/113 Z ZNA
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2021571026
(86)(22)【出願日】2020-06-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-01
(86)【国際出願番号】 KR2020007100
(87)【国際公開番号】W WO2020242278
(87)【国際公開日】2020-12-03
【審査請求日】2021-11-29
(31)【優先権主張番号】10-2019-0064129
(32)【優先日】2019-05-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】509329800
【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団
【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(73)【特許権者】
【識別番号】521371991
【氏名又は名称】インスティチュート フォア ベーシック サイエンス
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ビッ．ネリ
(72)【発明者】
【氏名】ヨ，ジンア
(72)【発明者】
【氏名】キム，ドンワン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ヨン－ソク
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ス－ジン
【審査官】山村 祥子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／２１６３９０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／００８１６６４（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ３１／７１３
Ａ６１Ｋ ３１／７１０５
Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス感染予防又はウイルス感染症治療用薬剤学的組成物であって、（ａ）ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂの一つ以上の抑制剤；
（ｂ）ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ及びＺＣＣＨＣ１４の抑制剤；又は、
（ｃ）ＺＣＣＨＣ１４の抑制剤
を含み、
前記抑制剤は、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ；ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ及びＺＣＣＨＣ１４；又は、ＺＣＣＨＣ１４の発現を抑制するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、又はＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ；ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ及びＺＣＣＨＣ１４；又は、ＺＣＣＨＣ１４の混合テーリング誘導活性を抑制する抗体又はその抗原結合断片であり、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科に属するウイルスである、薬剤学的組成物。
【請求項2】
前記ヘルペスウイルス科に属するウイルスは、イルトウイルス（Ｉｌｔｏｖｉｒｕｓ）、マルディウイルス（Ｍａｒｄｉｖｉｒｕｓ）、スクータウイルス（Ｓｃｕｔａｖｉｒｕｓ）、単純ウイルス（Ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）、バリセロウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、巨大細胞ウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ムロメガロウイルス（Ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、プロボスシウイルス（Ｐｒｏｂｏｓｃｉｖｉｒｕｓ）、ロゼオロウイルス（Ｒｏｓｅｏｌｏｖｉｒｕｓ）、リンフォクリプトウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、マカウイルス（Ｍａｃａｖｉｒｕｓ）、ペルカウイルス（Ｐｅｒｃａｖｉｒｕｓ）及びラディノウイルス（Ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つである、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、大韓民国科学技術情報通信部の支援下に、課題番号１７１１０７９０９８によってなされたものであり、当該課題の研究管理専門機関は基礎科学研究院、研究事業名は「基礎科学研究院研究運営費支援」、研究課題名は「ＲＮＡによる細胞運命調節研究」、主管機関は基礎科学研究院、研究期間は２０１８．０１．０１．～２０１８．１２．３１．である。
本発明は、大韓民国科学技術情報通信部の支援下に、課題番号１７１１０７９０９８によってなされたものであり、当該課題の研究管理専門機関は基礎科学研究院、研究事業名は「基礎科学研究院研究運営費支援」、研究課題名は「ＲＮＡによる細胞運命調節研究」、主管機関は基礎科学研究院、研究期間は２０１８．０１．０１．～２０１８．１２．３１．である。
【0002】
本特許出願は、２０１９年５月３０日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００６４１２９号に対して優先権を主張し、該特許出願の開示事項は本明細書に援用により組み込まれる。
【0003】
本発明は、ウイルスＲＮＡに対する混合されたテーリングを誘導することにより、ウイルス感染及び感染症を予防又は治療する技術に関する。
【0004】
〔背景技術〕
Ｂ型肝炎は、血液及び血液生成物、汚染した針のような汚染した材料によって腸管外に、感染した又は媒介体（ｃａｒｒｉｅｒ）母体から性的にそして垂直的にそれらの子女から伝染されたウイルス性疾患である。世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によれば、２０億以上の人々が全世界的に感染しており、毎年約４百万人が急性であり、毎年百万人が死亡し、そして３５０～４００百万が慢性媒介体として推定される（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，２００４．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｖａｃｃｉｎｅｓ－ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ／ｇｒａｐｈｉｃｓ／ｈｔｍｌｓ／ｈｅｐｂｐｒｅｖ．ｈｔｍ）。
Ｂ型肝炎は、血液及び血液生成物、汚染した針のような汚染した材料によって腸管外に、感染した又は媒介体（ｃａｒｒｉｅｒ）母体から性的にそして垂直的にそれらの子女から伝染されたウイルス性疾患である。世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によれば、２０億以上の人々が全世界的に感染しており、毎年約４百万人が急性であり、毎年百万人が死亡し、そして３５０～４００百万が慢性媒介体として推定される（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，２００４．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｖａｃｃｉｎｅｓ－ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ／ｇｒａｐｈｉｃｓ／ｈｔｍｌｓ／ｈｅｐｂｐｒｅｖ．ｈｔｍ）。
【0005】
このウイルス、ＨＢＶは、二重鎖からなる肝親和性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスであり、人及び人以外の霊長類のみを感染させる。ウイルス複製は主に肝で発生し、そして、これよりは少ないが、腎臓、膵臓、骨髄及び脾臓で起きる（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．６４：２０００；５１－６８．）。ウイルス及び免疫標識は血液から探知可能であり、そして、特徴的な抗原－抗体パターンは、経時的に進化する。初めて探知可能なウイルス性標識はＨＢｓＡｇであり、その次はＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）及びＨＢＶ ＤＮＡである。潜伏期（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ）において力価は高いことがあるが、しかし、ＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｅＡｇレベルは疾病の開始時期に低下し始め、臨床的に疾病の絶頂時期には探知不可であり得る（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．．３５０：２００４；１１１８－１１２９）。ＨＢｅＡｇは、血液内探知可能なウイルス性標識であり、そして活性ウイルス性複製と関連し、そのため、ウイルスロード（ｌｏａｄ）及び感染性が高い（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｅ ａｎｔｉｇｅｎｔｈｅ ｄａｎｇｅｒｏｕｓ ｅｎｄ ｇａｍｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３４７：２００２；２０８－２１０）。抗ＨＢｓＡｂ及び抗ＨＢｃＡｂ（ＩｇＧ）の存在は、既に感染した個体において回復及び免疫性を示す。
【0006】
ＡＡＳＬＤ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）及びＥＡＳＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ）によれば、ＨＢＶ慢性感染の現在推奨治療法は、インターフェロンアルファ（ＩＮＦα）、ＰＥＧ化されたインターフェロンアルファ－２ａ（Ｐｅｇ－ＩＦＮ２ａ）、エンテカビル（ｅｎｔｅｃａｖｉｒ）、及びテノホビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチド治療剤（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）、エンテカビル及びテノホビルは、ウイルスロードを減少させるのには成功的であるが、ＨＢｅＡｇ血清変換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）及びＨＢｓＡｇ損失率は、ＩＦＮα治療剤を用いて得られたそれによりは遥かに低い。ラミブジン（３ＴＣ）、テルビブジン（ＬｄＴ）、及びアデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）を含む類似のその他治療剤も利用されるが、全般的にヌクレオシド／ヌクレオチド治療剤では、抵抗の発生が治療効果を制限する。
【0007】
したがって、新しい抗ウイルス性治療剤を発見し開発することが当分野で必要である。
【0008】
一方、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ヘルペスウイルスファミリーに属する偏在するウイルスである。前記ウイルスは、外皮（ｔｅｇｕｍｅｎｔ）で囲まれたカプシドに含まれ、その表面上に糖タンパク質スパイクを伴う脂質二重層に囲まれた線形二重鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）で構成される。このファミリーの他の構成員と同様に、ＨＣＭＶは、潜伏期及び再活性化の特性を有する。ＨＣＭＶは、多くの細胞で感染し、潜伏する能力を有する。
【0009】
免疫適格宿主において、大部分のＨＣＭＶ感染は、少しの非特異的症状、例えば、疲労、倦怠感、中等度の熱、リンパ節病症、肝肥大又は肝酵素の若干の増加であって、無症状又はごく軽症である。しかしながら、異種親和性陰性単核球症は、以前に健康な個人の略１０％で観察される。
【0010】
ＨＣＭＶ治療にも新しい戦略が要求されている。
【0011】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは、ＴＥＮＴ４Ａ／ＢがウイルスＲＮＡ、より具体的にｍＲＮＡの混合されたテーリング（ｍｉｘｅｄ ｔａｉｌｉｎｇ）に関与して、宿主細胞内におけるウイルスｍＲＮＡの分解を抑制するのに役立てるという事実を明らかにしたし、宿主細胞としての対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）のＴＥＮＴ４Ａ／Ｂ発現及び活性を抑制する場合に、混合されたテーリングを抑制することにより、ウイルスＲＮＡのデアデニル化を促進し、ウイルスＲＮＡの速い分解を促進できることを究明し、本発明を完成するに至った。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは、ＴＥＮＴ４Ａ／ＢがウイルスＲＮＡ、より具体的にｍＲＮＡの混合されたテーリング（ｍｉｘｅｄ ｔａｉｌｉｎｇ）に関与して、宿主細胞内におけるウイルスｍＲＮＡの分解を抑制するのに役立てるという事実を明らかにしたし、宿主細胞としての対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）のＴＥＮＴ４Ａ／Ｂ発現及び活性を抑制する場合に、混合されたテーリングを抑制することにより、ウイルスＲＮＡのデアデニル化を促進し、ウイルスＲＮＡの速い分解を促進できることを究明し、本発明を完成するに至った。
【0012】
したがって、本発明の目的は、ウイルス感染予防又はウイルス感染症治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【0013】
本発明の他の目的は、ウイルス感染予防又はウイルス感染症治療用薬剤学的組成物のスクリーニング方法を提供することにある。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、ウイルス耐性細胞製造方法を提供することにある。
【0015】
本発明のさらに他の目的は、ＲＮＡ配列安定化方法を提供することにある。
【0016】
〔課題を解決するための手段〕
本発明の一態様によれば、本発明は、ウイルスＲＮＡの混合されたテーリング（Ｍｉｘｅｄ ｔａｉｌｉｎｇ）に関与するＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのいずれか一つ以上の抑制剤を含むウイルス感染予防又はウイルス感染症治療用薬剤学的組成物であって、前記抑制剤は、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのいずれか一つ以上の発現を抑制するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、又はＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのいずれか一つ以上の活性を抑制する抗体又はその抗原結合断片である、薬剤学的組成物を提供する。
本発明の一態様によれば、本発明は、ウイルスＲＮＡの混合されたテーリング（Ｍｉｘｅｄ ｔａｉｌｉｎｇ）に関与するＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのいずれか一つ以上の抑制剤を含むウイルス感染予防又はウイルス感染症治療用薬剤学的組成物であって、前記抑制剤は、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのいずれか一つ以上の発現を抑制するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、又はＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのいずれか一つ以上の活性を抑制する抗体又はその抗原結合断片である、薬剤学的組成物を提供する。
【0017】
本発明者らは、ＴＥＮＴ４Ａ／ＢがウイルスＲＮＡ、より具体的にｍＲＮＡの混合されたテーリング（ｍｉｘｅｄ ｔａｉｌｉｎｇ）に関与して、宿主細胞内におけるウイルスｍＲＮＡの分解を抑制するのに役立てるという事実を明らかにしたし、宿主細胞としての対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）のＴＥＮＴ４Ａ／Ｂ発現及び活性を抑制する場合に、混合されたテーリングを抑制することによって、ウイルスＲＮＡのデアデニル化を促進し、ウイルスＲＮＡの速い分解を促進できることを究明した。
【0018】
ＲＮＡテーリング（３’末端に非テンプレート化されたヌクレオチド添加）は、最も広範囲で且つ保存された類型のＲＮＡ修飾である。末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ； ＴＥＮＴ）とも知られた非カノニカル（Ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、転写後ＲＮＡの３’末端にヌクレオチドを統合して成熟、安定性及び活性を調節する。従来、本発明者らは、ＲＮＡ３’末端を探索し、ポリ（Ａ）テール長を測定するためのＴＡＩＬ－ｓｅｑという方法を開発した。ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験において脊椎動物ｍＲＮＡｓに対するウリジル化（ｕｒｉｄｙｌａｔｉｏｎ）及びグアニル化（ｇｕａｎｙｌａｔｉｏｎ）のような非カノニカルなテーリングイベントを発見した。末端ウリジリルトランスフェラーゼ（ＴＵＴ４及びＴＵＴ７）は、ＰＡＢＰＣ除去後にデアデニル化されたポリ（Ａ）テール（～２５ヌクレオチドよりも短い）をウリジル化させた。Ｕテール、特に、オリゴ－Ｕテールは、ｍＲＮＡ崩壊を促進する。逆に、グアニル化は、長いポリ（Ａ）テールに対して発生し、ｍＲＮＡを速いデアデニル化から保護する。２つの関連酵素ＴＥＮＴ４Ａ（ＰＡＰＤ７又はＴＵＴ５ともいう。）及びＴＥＮＴ４Ｂ（ＰＡＰＤ５又はＴＵＴ３ともいう。）は、間欠的な非アデノシン残基（最も一般にグアノシン）でｍＲＮＡポリ（Ａ）テールを拡張し、‘混合されたテール（Ｍｉｘｅｄ ｔａｉｌｓ）’を生成する。この純粋でないポリ（Ａ）テールは、ＣＣＲ４－ＮＯＴ（ＣＮＯＴ）複合体によるデアデニル化を妨害し、ｍＲＮＡの安定性を向上させる。混合されたテーリング（Ｍｉｘｅｄ ｔａｉｌｉｎｇ）は、新しい類型の転写後調節（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）として作用するように提案された。
【0019】
本明細書における用語、“混合されたテーリング”は、ウイルス性ＲＮＡ、より具体的にウイルス性ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テール配列部分の一つ以上の配列が、グアニル化又はウリジル化され、グアニン又はウリジンのような他の核酸配列に置換される作用を意味する。本明細書において、上述の“混合されたテーリング”は、“混合テーリング”、“テーリング”などと簡略に記載されてよい。ウイルス性ＲＮＡのポリ（Ａ）テール配列にグアニル化又はウリジル化が起きると、当該ポリ（Ａ）テールのデアデニル化が抑制され、ｍＲＮＡの分解は遅延される。
【0020】
本発明のＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂは、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）に属するノンカノニカルポリ（Ａ）ポリメラーゼであり、本発明者らは、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４ＢがウイルスｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールの混合されたテーリングに関与するということを初めて究明した。
【0021】
本発明の一具現例において、本発明のＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂは、ウイルス感染危険があるか、ウイルスに感染した状態である対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）から由来したものである。本発明者らは、対象内に感染したウイルスｍＲＮＡは、対象から由来したＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂによって混合されたテーリングが誘導され得るということを究明した。
【0022】
本発明の一具現例において、本発明のウイルスは、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのいずれか一つ以上によってＲＮＡテーリングが誘発されるウイルスである。より具体的に、本発明者らは、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ依存的調節のために、転写後調節要素（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＰＲＥ）、より具体的にＣＮＧＧＮタイプのペンタループ（ｐｅｎｔａｌｏｏｐ）が重要な役割を果たすことを究明した。また、本発明者らは、ＨＢＶ及びＨＣＭＶがいずれもペンタループを利用する類似の方式で作用し、ＴＥＮＴ４Ａ／Ｂを募集し、混合されたテーリングを誘発するということを究明した。本発明のＨＢＶ及びＨＣＭＶは、非常に異なる寿命周期と組織特異性を持つ別個のウイルス（ヘパドナウイルス科に属するウイルスとヘルペスウイルス科に属するウイルス）であって、遺伝子発現の利点のための同一の戦略を使用し、このような収斂進化とこのシス作用（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ）要素の単純性は、このメカニズムが他のウイルスにおいて使用可能であるということを示す。
【0023】
本発明の一具体例において、本発明のウイルスは、ヘパドナウイルス科又はヘルペスウイルス科に属するウイルスである。
【0024】
本発明の一具現例において、本発明のヘパドナウイルス科に属するウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）、地リスＢ型肝炎ウイルス（Ｇｒｏｕｎｄ Ｓｑｕｉｒｒｅｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ）、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ）、アヒルＢ型肝炎ウイルス（Ｄｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ）及びサギＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｒｏｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ）からなる群から選ばれるいずれか一つである。
【0025】
本発明の一具現例において、本発明のヘルペスウイルス科に属するウイルスは、イルトウイルス（Ｉｌｔｏｖｉｒｕｓ）、マルディウイルス（Ｍａｒｄｉｖｉｒｕｓ）、スクータウイルス（Ｓｃｕｔａｖｉｒｕｓ）、単純ウイルス（Ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）、バリセロウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、巨大細胞ウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ムロメガロウイルス（Ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、プロボスシウイルス（Ｐｒｏｂｏｓｃｉｖｉｒｕｓ）、ロゼオロウイルス（Ｒｏｓｅｏｌｏｖｉｒｕｓ）、リンフォクリプトウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、マカウイルス（Ｍａｃａｖｉｒｕｓ）、ペルカウイルス（Ｐｅｒｃａｖｉｒｕｓ）及びラディノウイルス（Ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つである。
【0026】
本発明で使われる用語、“ｓｉＲＮＡ”は、特定のｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）によってＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）現象を誘導し得る短い二重鎖ＲＮＡを意味する。標的遺伝子のｍＲＮＡと相同の配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖とで構成される。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できるので、効率的な遺伝子ノックダウン方法として又は遺伝子治療の方法として提供可能である。
【0027】
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ同士が対をなす二重鎖ＲＮＡ部分が完全に対をなすものに限定されず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより、対をなしていない部分が含まれてもよい。全体長は１０～１００塩基、好ましくは１５～８０塩基、より好ましくは２０～７０塩基である。ｓｉＲＮＡ末端構造は、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果によって抑制できるものであれば、平滑（ｂｌｕｎｔ）末端又は粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のいずれであってもよい。粘着末端構造は、３’末端が突出した構造も、５’末端側が突出した構造も可能である。突出する塩基数は限定されない。また、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制効果を維持できる範囲において、例えば、片側末端の突出部分に低分子ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子又は人工のＲＮＡ分子）を含むことができる。ｓｉＲＮＡ末端構造は、両側に全て切断構造を有する必要はなく、二重鎖ＲＮＡ一般の末端部位がリンカーＲＮＡによって接続されたステップループ形の構造であってもよい。
【0028】
本発明で用いられるｓｉＲＮＡは、それ自体でポリヌクレオチドペアリングを有する完全な形態、すなわち、試験管でｓｉＲＮＡを直接合成した２形質転換過程を経て細胞中に導入される形態であるか、生体内に投与された後に、このような形態を有するように一つの単一鎖オリゴヌクレオチド断片とそれの逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）相補物とがスぺーサーによって分離された単一鎖ポリヌクレオチドから誘導され得る形態、例えば、ｓｉＲＮＡが細胞内で発現するように製造されたｓｉＲＮＡ発現ベクター又はＰＣＲ誘導されたｓｉＲＮＡ発現カセットが形質転換又は感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）過程を経て細胞中に導入される形態であってよい。ｓｉＲＮＡを製造し、細胞又は動物に導入する方法の決定は、目的及び標的遺伝子産物の細胞生物学的機能によって変わってよい。
【0029】
本発明で使われる用語、“ｓｈＲＮＡ”は、ｓｉＲＮＡの高価の生合成費用、低い細胞形質感染効率によるＲＮＡ干渉効果の短時間維持などの短所を克服するためのものであり、ＲＮＡ重合酵素ＩＩＩのプロモーターからアデノウイルス、レンチウイルス及びプラスミド発現ベクターシステムを用いてこれを細胞内に導入して発現させることができ、このようなｓｈＲＮＡは、細胞内に存在するｓｉＲＮＡプロセシング酵素（Ｄｉｃｅｒ ｏｒ Ｒｎａｓｅ ＩＩＩ）によって正確な構造を有するｓｉＲＮＡに転換され、目的遺伝子のサイレンシングを誘導することが広く知られている。
【0030】
本発明の一具現例において、本発明のｓｉＲＮＡは、表１に例示的に示されているが、これに制限されるものではない。
【0031】
本発明のＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのいずれか一つ以上の活性を抑制する抗体は、単一クローン抗体及びこれに対するキメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を全て含むものであり、新規な抗体の他に、既に当該技術分野で公知された抗体も含まれてよい。前記抗体は、ＴＥＮＴ４Ａ及び／又はＴＥＮＴ４Ｂに特異的に結合する限り、２個の重鎖と２個の軽鎖の全長を有する完全な形態の他、抗体分子の機能的な断片も含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどがある。
【0032】
本発明の実施例では次の抗体を用いているが、これに制限されるものではない：
抗ＴＥＮＴ４Ａ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－６１３０２）、抗ＴＥＮＴ４Ａ抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＰＡ０４５４８７）、抗ＴＥＮＴ４Ａマウス抗体（ｌａｂｍａｄｅ）、抗ＴＥＮＴ４Ｂ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－６０１７７）、抗ＴＥＮＴ４Ｂ抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＰＡ０４２９６８）、抗ＴＥＮＴ４Ｂマウス抗体（ｌａｂｍａｄｅ）。
抗ＴＥＮＴ４Ａ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－６１３０２）、抗ＴＥＮＴ４Ａ抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＰＡ０４５４８７）、抗ＴＥＮＴ４Ａマウス抗体（ｌａｂｍａｄｅ）、抗ＴＥＮＴ４Ｂ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－６０１７７）、抗ＴＥＮＴ４Ｂ抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＰＡ０４２９６８）、抗ＴＥＮＴ４Ｂマウス抗体（ｌａｂｍａｄｅ）。
【0033】
本発明の組成物が薬剤学的組成物として使用される場合に、前記組成物中の有効成分の含有量は、疾患の症状、症状の進行程度、患者の状態などに応じて適切に調節可能であり、例えば、全組成物重量を基準に０．０００１～９９．９重量％含まれてよいが、これに限定されるものではない。前記含有量比は、溶媒を除去した乾燥量を基準にした値である。
【0034】
前記薬剤学的組成物は、薬学組成物の製造に一般に使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができ、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口用剤形、外用剤、坐剤又は滅菌注射溶液などの形態に剤形化して使用可能である。
【0035】
前記薬剤学的組成物を製剤化する場合には、通常の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製する。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つの賦形剤及び／又は潤滑剤などを含むことができる。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他にも、種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれてよい。
【0036】
前記薬学組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適宜に選択されてよい。より好ましい効果のために、本発明の組成物の投与量は、有効成分を基準に１日０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇとすればよいが、これに制限されるものではない。投与は、１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。本発明の組成物は、動物、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物に様々な経路で投与されてもよい。投与の全ての方式は予想可能であり、例えば、経口、静脈、筋肉、皮下注射などによって投与されてよい。本発明の組成物の薬学的投与形態は、有効成分の薬学的許容可能な塩の形態で使用されてもよく、また、単独で或いは他の薬学的活性化合物との結合の他に適宜の組合せでも使用可能である。
【0037】
本発明の他の態様によれば、本発明は、次の段階を含むウイルス感染予防又はウイルス感染症治療用薬剤学的組成物のスクリーニング方法を提供する：
（ａ）宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）にウイルスを形質感染させる段階；
（ｂ）薬物候補物質を宿主細胞に処理する段階；及び、
（ｃ）薬物候補物質を処理した実験群からのＲＮＡテーリングレベルを分析し、薬物候補物質無処理対照群からのＲＮＡテーリングレベルと比較する段階；実験群からのＲＮＡテーリングレベルが無処理対照群に比べて相対的に減少している場合に、有効な薬物候補物質として選定する。
（ａ）宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）にウイルスを形質感染させる段階；
（ｂ）薬物候補物質を宿主細胞に処理する段階；及び、
（ｃ）薬物候補物質を処理した実験群からのＲＮＡテーリングレベルを分析し、薬物候補物質無処理対照群からのＲＮＡテーリングレベルと比較する段階；実験群からのＲＮＡテーリングレベルが無処理対照群に比べて相対的に減少している場合に、有効な薬物候補物質として選定する。
【0038】
ＲＮＡテーリングレベルは、グアニル化又はウリジル化によってポリ（Ａ）テールに含まれたアデニンがグアニン又はウリジンのような他の核酸に置換された回数によって決定される。
【0039】
本発明における段階（ａ）及び（ｂ）は、実行順序がいくら変わってもよい。
【0040】
試料をウイルス感染の宿主細胞に処理し、混合されたテーリングが抑制される場合に、当該試料を有効な薬物候補物質として選定することができる。
【0041】
本発明の薬物スクリーニング方法は、ＴＥＮＴ４Ａ／Ｂによる混合されたテーリング作動原理を利用するという点で、本発明の他の態様である薬剤学的組成物と共通する特性を有するので、薬剤学的組成物の詳細な説明記載内容を援用し、本明細書記載の過度な複雑性を避けるために重複記載を省略する。
【0042】
本発明の他の態様によれば、本発明は、生体から分離された細胞のＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのいずれか一つ以上の発現をノックアウト（Ｋnｏｃｋ－ｏｕｔ）させる段階を含むウイルス耐性細胞製造方法を提供する。
【0043】
本発明のノックアウトは、従来知られた様々な遺伝子編集技術を様々に活用して導入でき、本明細書における実施例では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集方法を用いたが（実施例６参照）、これに制限されるものではない。
【0044】
本発明の他の態様によれば、本発明は、次の一般式で表されたＲＮＡ配列で構成されたペンタループ構造を含むステムループ配列を、ターゲットＲＮＡ配列に挿入する段階を含む、ＲＮＡ配列安定化方法を提供する：
［一般式］
５’－ＣＮＧＧＮ－３’
前記Ｎは、それぞれ独立して、アデノシン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）から選択されるいずれか一つである。
［一般式］
５’－ＣＮＧＧＮ－３’
前記Ｎは、それぞれ独立して、アデノシン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）から選択されるいずれか一つである。
【0045】
本明細書における用語“ステムループ（Ｓｔｅｍ－Ｌｏｏｐ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）”構造は、単一鎖ＤＮＡ又はＲＮＡで起きる塩基対間の結合である。この構造をヘアピン（Ｈａｉｒｐｉｎ）又はヘアピン構造（Ｈａｉｒｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）ともいう。１本の２領域が互いに反対方向に読まれる時に塩基対が相互相補的であれば発生する。ステムループ構造の例は、図１２ｂに示したが、これに制限されるものではない。
【0046】
本発明の用語“ペンタ－ループ”とは、ステムループ構造上の塩基対間の結合を形成しない連結部位に５個の塩基が存在する単一鎖配列部位を意味する。本発明のステムループ構造はペンタ－ループ構造を含み、例示図は、図１３に示した。
【0047】
本発明の一具現例において、本発明のステムループ構造は、２－１５塩基対間の結合を含む。より具体的に、例えば、２－１４塩基対結合、２－１３塩基対結合、２－１２塩基対結合、２－１１塩基対結合、２－１０塩基対結合、３－１０塩基対結合、３－９塩基対結合を含むが、これに制限されるものではない。塩基対間の結合は、アデニン－ウラシル結合又はシトシン－グアニン結合でよく、結合の種類が制限されない。
【0048】
本発明のステムループ構造をターゲットＲＮＡ配列に挿入することによって、ターゲットＲＮＡ配列がＴＥＮＴ４Ａ／Ｂを用いて、混合されたテーリングを誘発する頻度を上げ、当該ＲＮＡ配列の安定化を期することができる。
【0049】
本発明の具体的な具現例は、図１３に示した。
【0050】
〔発明の効果〕
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）本発明は、ウイルス感染予防又はウイルス感染症治療用薬剤学的組成物を提供する。
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）本発明は、ウイルス感染予防又はウイルス感染症治療用薬剤学的組成物を提供する。
【0051】
（ｂ）本発明は、ウイルス感染予防又はウイルス感染症治療用薬剤学的組成物のスクリーニング方法を提供する。
【0052】
（ｃ）本発明は、ウイルス耐性細胞製造方法を提供する。
【0053】
（ｄ）本発明は、所定のステムループ構造配列の導入によってＲＮＡ配列を安定化させる方法を提供する。
【0054】
（ｅ）本発明の薬剤学的組成物を用いる場合に、ウイルス感染を効果的に予防及び治療することができる。
【0055】
（ｆ）本発明のＲＮＡ配列安定化方法を用いる場合に、所望のＲＮＡ配列に対して混合されたテーリングを誘導して配列安定化を誘導することができる。
【0056】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ウイルスＲＮＡの広範囲な混合されたテールを示す。ａ，細胞及びウイルスｍＲＮＡのグアニル化テールの分率は、ポリ（Ａ）テール長が２５ｎｔ以上であるｍＲＮＡに対して計算された（ｎ＝２ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｂ，細胞ＲＮＡ、ＨＣＭＶ ＲＮＡ及びＲＮＡ２．７（ＶＲＮＡ２．７）のグアニル化テールの分率は、ポリ（Ａ）テール長が２５ｎｔ以上であるＲＮＡに対して計算された（ｎ＝１ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｃ，細胞（灰色）及びＨＢＶ（黄色）ｍＲＮＡの全体ポリ（Ａ）テール長の分布。中央値は垂直の点線で表示され、中央値の長さは括弧中に示されている。ｄ，細胞（灰色）、ＨＣＭＶ（黄色）及びＶＲＮＡ２．７（橙色）ＲＮＡの全体ポリ（Ａ）テール長の分布。中央値は垂直の点線で表示され、中央値の長さは括弧中に表されている。ｅ，ＴＥＮＴ４枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞において２５ｎｔ以上のポリ（Ａ）テール長を有するＨＢＶ ｍＲＮＡのグアニル化されたテールの分率（ｎ＝１ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｆ，ＴＥＮＴ４枯渇した、ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞においてポリ（Ａ）テール長が２５ｎｔ以上であるＨＣＭＶ ＲＮＡのグアニル化されたテールの分率（ｎ＝１ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｇ，ＴＥＮＴ４枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞でＨＢＶ ｍＲＮＡレベルは、２個の個別プライマーセットを使用したＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝３独立実験）。＊＊Ｐ＜０．０１；両側学生のｔ－検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）。ｈ，ＨＢＶ ｍＲＮＡの半減期は、２個の個別プライマーセットを使用したＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝３独立実験）。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡは、正規化に使用された。
〔図１〕ウイルスＲＮＡの広範囲な混合されたテールを示す。ａ，細胞及びウイルスｍＲＮＡのグアニル化テールの分率は、ポリ（Ａ）テール長が２５ｎｔ以上であるｍＲＮＡに対して計算された（ｎ＝２ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｂ，細胞ＲＮＡ、ＨＣＭＶ ＲＮＡ及びＲＮＡ２．７（ＶＲＮＡ２．７）のグアニル化テールの分率は、ポリ（Ａ）テール長が２５ｎｔ以上であるＲＮＡに対して計算された（ｎ＝１ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｃ，細胞（灰色）及びＨＢＶ（黄色）ｍＲＮＡの全体ポリ（Ａ）テール長の分布。中央値は垂直の点線で表示され、中央値の長さは括弧中に示されている。ｄ，細胞（灰色）、ＨＣＭＶ（黄色）及びＶＲＮＡ２．７（橙色）ＲＮＡの全体ポリ（Ａ）テール長の分布。中央値は垂直の点線で表示され、中央値の長さは括弧中に表されている。ｅ，ＴＥＮＴ４枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞において２５ｎｔ以上のポリ（Ａ）テール長を有するＨＢＶ ｍＲＮＡのグアニル化されたテールの分率（ｎ＝１ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｆ，ＴＥＮＴ４枯渇した、ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞においてポリ（Ａ）テール長が２５ｎｔ以上であるＨＣＭＶ ＲＮＡのグアニル化されたテールの分率（ｎ＝１ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｇ，ＴＥＮＴ４枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞でＨＢＶ ｍＲＮＡレベルは、２個の個別プライマーセットを使用したＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝３独立実験）。＊＊Ｐ＜０．０１；両側学生のｔ－検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）。ｈ，ＨＢＶ ｍＲＮＡの半減期は、２個の個別プライマーセットを使用したＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝３独立実験）。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡは、正規化に使用された。
【0057】
〔図２〕ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢＶのＰＲＥを通じたＴＥＮＴ４の主要ｍＲＮＡ基質であることを裏付ける実験結果を示す。ａ，ＨＢＶゲノム（ＮＣＢＩ Ｕ９５５５１．１）にわたるｆＣＬＩＰ－ｓｅｑライブラリーの標準化された判読範囲。ＨＢＶのＰＲＥ領域は黄色で強調表示されている。ＨＢＶ転写体及びそのそれぞれのコーディング配列領域は下に参考として示されている。入力（ｉｎｐｕｔ）及びＮＭＧライブラリーは、陰性対照群として用いられた。ｂ，ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑピーククラスターの豊富度（ａｂｕｎｄａｎｃｅ，ｘ軸）及び濃縮点数（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ，ｙ軸）の散布図（ｓｃａｔｔｅｒ ｐｌｏｔ）。ＨＢＶ ＰＲＥは赤色点で表されている。この分析では、サイズ一致の入力ライブラリー（ｓｉｚｅ－ｍａｔｃｈｅｄ ｉｎｐｕｔ ｌｉｂｒａｒｙ）が陰性対照群として用いられた。
【0058】
〔図３〕ＰＲＥのステムループ構造は必須であるが、ＨＢＶ ｍＲＮＡのＴＥＮＴ４－依存性ＲＮＡテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）には十分でないことを示す図である。ａ，３’ＵＴＲにおいてＰＲＥの突然変異及び下位領域を保有するファイアフライルシフェラーゼレポーターコンストラクトの概略図。青色，Ｌａ－結合モチーフ（ｍｏｔｉｆ）；黄緑，ステムループアルファ；及び赤色＊，点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）の領域。ｂ，親（ｐａｒｅｎｔａｌ）ＨｅＬａＴ（灰色）及びＴＥＮＴ４ ＫＯ（赤色）細胞においてＰＲＥの下位領域を含有するレポーターのファイアフライルシフェラーゼ活性。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝７ ＰＲＥ、ＰＲＥα及びＰＲＥβに対する独立実験、ｎ＝６ 他の全てのものに対する独立実験）。レニラ及び対照群ベクターの両方のルシファーレイズ活性とも正規化に用いられた。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１；両側ｔ－検定（ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）。ｃ，Ｈｉｒｅ－ＰＡＴ分析によって測定されたレポーターＲＮＡのポリ（Ａ）テール長の分布。ＰＲＥα及びＰＲＥβ配列を含有するレポーターコンストラクトは、ＴＥＮＴ４枯渇後にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質感染した。ｄ，異所的に（ｅｃｔｏｐｉｃａｌｌｙ）発現した野生型ＴＥＮＴ４又は触媒的に不活性である突然変異を有する親細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ）又はＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞においてＰＲＥレポーターコンストラクトのファイアフライルシフェラーゼ活性。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝３独立実験）。レニラ及び対照群ベクターの両方とも正規化に用いられた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側学生のｔ－検定（ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）。ｅ，３’ＵＴＲにおいてＷＰＲＥの下位領域を保有するファイアフライルシフェラーゼレポーターコンストラクトの概略図。ｆ，ＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞においてＷＰＲＥレポーターコンストラクトのファイアフライルシフェラーゼ活性。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝３Ｗβに対する独立実験、ｎ＝７ 他の全てのものに対する独立実験）。レニラ及び対照群ベクターの両方のルシファーレイズ活性とも正規化に用いられた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；両側学生のｔ－検定。ｇ，ＨＢＶ ＰＲＥ、突然変異ＨＢＶ ＰＲＥ及びＷＰＲＥのステムループ構造。ｈ，ＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞においてａに示された突然変異ＰＲＥレポーターコンストラクトのファイアフライルシフェラーゼ活性。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝４独立実験）。レニラ及び対照群ベクターの両方のルシファーレイズ活性とも正規化に用いられた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；両側学生のｔ－検定。
【0059】
〔図４〕ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７のステムループ構造は、ＴＥＮＴ４依存的調節の原因となるｃｉｓ－作用（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ）ＲＮＡ要素であることを示す図である。ａ，ＲＮＡ２．７形質感染したＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてフォルムアルデヒド架橋結合（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）及び抗ＴＥＮＴ４Ａ抗体による免疫沈殿後に表示されたＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝３独立実験）。ＮＭＧによる免疫沈殿は標準化に用いられた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側学生のｔ－検定。ｂ，３’ＵＴＲにおいてＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７の下位領域及び突然変異を保有するファイアフライルシフェラーゼレポーターコンストラクトの概略図。黄緑はステムループ、赤色＊は点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）。ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７のステムループ構造及び突然変異は左側に示されている。１Ｅ ｍｕｔ（１Ｅ突然変異）コンストラクトにおいて、ループでは赤色ヌクレオチド及びループ基底のＣは、表示された通りに突然変異される。ＦＲＧ、断片。ｃ～ｅ，親細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ）及びＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞においてレポーターのファイアフライルシフェラーゼ活性。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される。ＲＮＡ２．７の下位領域を有するレポーター（ｎ＝３独立実験）（ｃ）、ＲＮＡ２．７の断片１（１－５１３）の部分欠失突然変異（ｎ＝３独立実験）（ｄ）、及びコンストラクト１Ｄ、１Ｅ及び１Ｅのステムループ突然変異（ｎ＝３独立実験）（ｅ）。レニラ及び対照群ベクターの両方のルシファーレイズ活性とも正規化に用いられた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；両側学生のｔ－検定。
【0060】
〔図５〕ＺＣＣＨＣ１４を含む、ＳＡＭドメイン含有タンパク質は、ステムループ構造に結合し、ＨＢＶ ｍＲＮＡを調節するということを示す図である。ａ，ＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）からＳＬ２．７ＲＮＡプルダウン（ｐｕｌｌｄｏｗｎ）の質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ｎ＝２質量分析実験）。ＳＬ２．７突然変異及び‘ビーズオンリー（ｂｅａｄ ｏｎｌｙ）’サンプルが陰性対照群として用いられた。タンパク質濃縮点数（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）は、突然変異データに対するＳＬ２．７サンプルからのＬＦＱ（ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、非標識定量）強度のｌｏｇ２倍変化として計算された。スペクトル計数は、濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）候補を濾過するために用いられた。ｂ、上端（ｔｏｐ）、推定上のＲＮＡ結合ＳＡＭドメインを有するタンパク質の系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）。Ｓｃ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓｐ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｃａ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃｅ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｄｍ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、Ｄｒ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、Ｘｌ（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、Ｍｍ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）及びＨｓ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）。＊は、系統樹に基づく手動の遺伝子名の割り当てを示す。ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤは、方法セクションに羅列されている。下端（ｂｏｔｔｏｍ）、ＳＡＭドメインを持つ３個のヒトタンパク質のドメイン構造。橙色、ＳＡＭドメイン；紫朱色、ＣＣＨＣジンクフィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ，ＺｎＦ）ドメイン。ｃ，表示された抗体を用いたウェスタンブロット後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からビオチン化されたＳＬ２．７のプルダウン。＊は、交差反応バンドを示す。ｄ，ＺＣＣＨＣ１４枯渇した及びＳＡＭＤ４Ａ／Ｂ枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてＨＢＶ ｍＲＮＡレベルは、２セットのプライマーを用いたＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝４独立実験）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側ｔ－検定。ｃに対する切っていないプロット及びｄのグラフに対するソースデータはオンラインで利用可能である。
【0061】
〔図６〕細胞質ＺＣＣＨＣ１４は、ステムループ構造でＲＮＡを保護するためにＴＥＮＴ４を募集（ｒｅｃｒｕｉｔ）することを示す図である。ａ，ＨＢＶ ｍＲＮＡのグアニル化されたテールの分率は、ＺＢＨＣ１４枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞において２５ｎｔ以上のポリ（Ａ）テール長を有するｍＲＮＡに対して計算された。ｂ、対照群（灰色）及びＺＣＣＨＣ１４枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞（赤色）においてＨＢＶ ｍＲＮＡの全体ポリ（Ａ）テール長の分布。中央値は垂直の点線で表示され、中央値は括弧中に示されている。ｃ，ＺＣＣＨＣ１４枯渇したＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７ １Ｅ、ＨＢＶ ＰＲＥα、ＷＨＶ ＷＰＲＥ（Ｗγ＋Ｗα）及びそのそれぞれの突然変異（１Ｅ ｍｕｔ、α ｍｕｔ２及びＷγ＋Ｗα ｍｕｔ）を保有するレポーターのファイアフライルシフェラーゼ活性。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝４ＰＲＥα及びα ｍｕｔ２に対する独立実験、ｎ＝３ 他の全てのものに対する独立実験）。重要なことには、ＷＰＲＥ突然変異レポーター（Ｗγ＋Ｗα ｍｕｔ）は、ＷＰＲＥαステムループ構造の全てにおいて点突然変異で構成される（補助図６ｂ）。レニラ及び対照群ベクターの両方のルシファーレイズ活性とも正規化に用いられた。＊Ｐ＜０．０５；両側学生のｔ－検定。ｄ，ＨｅｐＧ２．２．１５細胞において抗ＺＣＣＨＣ１４抗体で免疫沈殿後に指示されたＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表示される（ｎ＝３独立実験）。正常ウサギＩｇＧを使用した免疫沈殿は、標準化に使用された。＊Ｐ＜０．０５；両側学生のｔ－検定。ｅ，ＺＣＣＨＣ１４タンパク質の局所化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、超遠心細胞分画法（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）及びウェスタンブロッティングによりＨｅＬａＴ細胞において検査された：細胞質（Ｃｙｔｏ）、膜（Ｍｅｍｂ）及び核（Ｎｕｃ）。ＧＡＰＤＨ（細胞質）、ＧＭ１３０（ゴルジ）及びヒストンＨ３（核）は、分画マーカーとして用いられた。ｆ，抗ＴＥＮＴ４Ａ及び抗ＴＥＮＴ４Ｂによる免疫沈殿後にウェスタンブロットは、ＨｅＬａＴ細胞質抽出物においてＴＥＮＴ４Ａ／ＢとＺＣＣＨＣ１４との物理的相互作用を測定するために用いられた。細胞抽出物はＲＮａｓｅ Ａで処理された。ＧＡＰＤＨはローディング対照群として用いられた。ｇ，提案されたモデル。ＨＢＶ ｍＲＮＡ及びＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７は、標的混合テーリング（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｉｘｅｄ ｔａｉｌｉｎｇ）を誘導するために、ＣＮＧＧＮペンタループを用いてＴＥＮＴ４－ＺＣＣＨＣ１４複合体を募集し（ｒｅｃｒｕｉｔ）、これは、後でウイルスＲＮＡを細胞崩壊因子から保護する。
【0062】
〔図７〕ウイルスＲＮＡの広範囲な３’末端テール（３’ ｅｎｄ ｔａｉｌ）変形を示す図である。ａ，ＨＢＶ ｍＲＮＡは、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞で高度に混合されたテール（Ｇ：グアニル化（ｇｕａｎｙｌａｔｉｏｎ）Ｕ：ウリジル化（ｕｒｉｄｙｌａｔｉｏｎ）、Ｃ：シチジル化（ｃｙｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ））である。各変形の分率は、その該当の末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）及び内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）変形が含まれる。シチジル化及びウリジル化テールとウイルスｍＲＮＡの分率は、ポリ（Ａ）テール長が２５ｎｔ以上であるものに対して計算された（ｎ＝２ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｂ，ＨＣＭＶ ＲＮＡは、また、ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞において高度に混合されたテールである。ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７（ＶＲＮＡ２．７）は、特に、実質的に混合されたテールである（ｎ＝１ ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験）。ｃ，ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞において細胞（灰色）及びウイルス（黄色）ｍＲＮＡのグアニル化テールの遺伝子レベル分析。ｄ，ＲＴ－ｑＰＣＲによるｓｉＲＮＡノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）確認。ｅ，ＴＥＮＴ４枯渇した（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてＨＢＶ ｍＲＮＡの混合されたテールの分率減少。ｆ，ＴＥＮＴ４Ａ／Ｂ発現は、ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞で誘導される。ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞において、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ ＲＮＡレベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲ（ｎ＝１）によって測定された。ｇ，ＴＥＮＴ４枯渇したＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞において、ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７の混合されたテールの分率における減少。ｈ，ＨＢＶ ｍＲＮＡは、ＴＥＮＴ４枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてより短いポリ（Ａ）テール長を示す。中央値は、垂直の点線で表示され、括弧中に示されている。ｉ，ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞においてＴＥＮＴ４枯渇後のウイルスｍＲＮＡの全体ポリ（Ａ）テール長の分布。ｊ，ＴＥＮＴ４枯渇後のＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７のポリ（Ａ）テール長の分布。ｋ，ＨＢＶ転写体及びその該当ＣＤＳ領域が示されている。棒は、ＲＴ－ｑＰＣＲアンプリコン（＃１～３）の位置を示す。ｌ，ＴＥＮＴ４枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてポリ（Ａ）テール長にわたるＨＢＶ ｍＲＮＡのテール変形。ｍ，ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７の半減期は、ＴＥＮＴ４枯渇後に、ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞においてＲＴ－ｑＰＣＲ（ｎ＝３独立実験）によって測定された。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡは、正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）に用いられた。平均が計算された。ａ～ｂ、ｄ～ｇ、ｍのグラフデータは、ソースデータとして利用可能である。
【0063】
〔図８〕ＴＥＮＴ４Ａ／Ｂ及びＨＢＶ ｍＲＮＡ相互作用の分析及び確認結果を示す図である。ａ，ＴＥＮＴ４Ｂ結合ＲＮＡ断片がＨＢＶのＰＲＥ領域内（黄色で強調表示される。）で再び濃縮される（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）。ＨＢＶゲノム（ＮＣＢＩ：Ｕ９５５５１．１）にわたるｆＣＬＩＰ－ｓｅｑライブラリーの標準化された判読範囲（ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｒｅａｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ）。Ｘ－軸スケールは、図２ａと同一である。ｂ，抗ＴＥＮＴ４Ａ及び抗ＴＥＮＴ４Ｂによる免疫沈殿（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）後、ＲＴ－ｑＰＣＲはＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてＴＥＮＴ４結合ＲＮＡの濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を測定するために用いられた（ｎ＝３独立実験）。正常マウスＩｇＧを用いた免疫沈殿は、正規化に用いられた。平均は計算され、誤差棒はＳＥＭを示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；両側ｔ検定（ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｔ ｔｅｓｔ）。ｂのグラフデータはソースデータとして利用可能である。
【0064】
〔図９〕ＰＲＥレポーターのＴＥＮＴ４依存的調節を確認した結果を示す図である。ａ，ウェスタンブロッティングによるノックアウト（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ）確認。ＧＡＰＤＨはローディング対照群として用いられた。ｂ，ＰＲＥの下位領域を保有するファイアフライ（ｆｉｒｅｆｌｙ）レポーターのＲＮＡレベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された（ＰＲＥ：ＰＲＥα：ＰＲＥβ、ｎ＝４；αΔ１、ｎ＝２；αΔ２、ｎ＝１独立実験）。レニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）及び対照群ベクター両方のｍＲＮＡレベルとも正規化に用いられた。平均は計算され、誤差棒はＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５；両側ｔ検定（ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｔ ｔｅｓｔ）。ｃ，ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてウェスタンブロッティングによるｓｉＲＮＡノックダウン確認。ＧＡＰＤＨはローディング対照群として用いられた。ｄ，ＴＥＮＴ４枯渇したＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＰＲＥレポーターコンストラクトのファイアフライルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性（ＰＲＥ：ＰＲＥα：ＰＲＥβ、ｎ＝７；αΔ１、ｎ＝６；αΔ２、ｎ＝５独立的実験）。レニラ及び対照群ベクターの両方のルシファーレイズ活性とも正規化に用いられた。平均は計算され、誤差棒はＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側ｔ検定。ｅ，ＫＯ細胞においてウェスタンブロッティングによる過発現確認。ＧＡＰＤＨはローディング対照群として用いられた。ｆ，異所的に（ｅｃｔｏｐｉｃａｌｌｙ）発現したＴＥＮＴ４野生型又は突然変異型を有するＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞においてレスキュー実験（ｒｅｓｃｕｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）に用いられたファイアフライレポーターのＲＮＡレベル（ｎ＝３独立実験）は、ＲＴ－ｑＰＣＲ（ｎ＝３独立実験）によって測定された。レニラ及び対照群ベクターの両方のｍＲＮＡレベルとも正規化に用いられた。平均は計算され、誤差棒はＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；両側ｔ検定。パネルａ、ｃ、ｅに対する切っていないブロット及びｂ、ｄ、ｆにおけるグラフに対するデータは、ソースデータとして利用可能である。
【0065】
〔図１０〕ＲＮＡ２．７レポーターのＴＥＮＴ４依存的調節の確認結果を示す。ａ，抗ＴＥＮＴ４Ａを用いた免疫沈殿は、ＲＮＡ２．７形質感染したＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてウェスタンブロッティングにより確認された。正常マウスＩｇＧ（Ｎｏｒｍａｌ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，ＮＭＧ）は、陰性対照群として用いられた。ＲＮＡ２．７転写体は、ＲＴ－ｑＰＣＲアンプリコンの位置を示す棒と共に示されている。ｂ～ｅ，次を保有するファイアフライレポーターのＲＮＡレベル。ｂ，ＲＮＡ２．７の下位領域（ｎ＝３独立実験）、ｃ，ＲＮＡ２．７の断片１（１～５１３）の欠失コンストラクト（ｎ＝３独立実験）、ｄ，コンストラクト１Ｄ（３１４～４１３）、１Ｅ（４１４～５１３）及びステムループ（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）突然変異１Ｅ（ｎ＝３独立実験）、及びｅ，親細胞及びＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞においてコンストラクト ＳＬ２．７（４１４～４６３）及び対照群（ｎ＝３独立実験）。レニラ及び対照群ベクターの両方のｍＲＮＡレベルとも正規化に用いられた。平均は計算され、誤差棒はＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００．０；両側ｔ検定。パネルａに対する切っていないブロット及びｂ～ｅにおけるグラフに対するデータは、ソースデータとして利用可能である。
【0066】
〔図１１〕ＺＣＣＨＣ１４及びＳＡＭＤ４Ａ／Ｂノックダウンを確認した図である。ＲＴ－ｑＰＣＲ（ｎ＝４独立実験）及びＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるウェスタンブロッティングによるｓｉＲＮＡノックダウン確認。平均は計算され、誤差棒はＳＥＭを示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；両側ｔ検定。ＧＡＰＤＨはローディング対照群として使用される。
【0067】
〔図１２〕ＺＣＣＨＣ１４ノックダウン、ステムループ依存的テール調節、及び免疫沈殿の確認結果を示す図である。ａ，ＺＣＣＨＣ１４枯渇したＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてウェスタンブロッティングによるｓｉＲＮＡノックダウン確認。ＧＡＰＤＨはローディング対照群として用いられた。点線は、同一ゲル（ｇｅｌ）において不連続的なレーン（ｌａｎｅ）を示す。ｂ，ＷＰＲＥαのステムループ構造及びそのそれぞれの突然変異。ｃ，Ｈｉｒｅ－ＰＡＴ分析によって測定されたレポーターＲＮＡのポリ（Ａ）テール長の分布。レポーターコンストラクトは、ＺＣＣＨＣ１４枯渇後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に形質感染した。ｄ，抗ＺＣＣＨＣ１４を用いた免疫沈殿は、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてウェスタンブロッティングにより確認された。正常ウサギＩｇＧ（Ｎｏｒｍａｌ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ＮＲＧ）は、陰性対照群として用いられた。ｅ，抗ＴＥＮＴ４Ａ及び抗ＴＥＮＴ４Ｂを用いた免疫沈殿後のウェスタンブロッティングは、ＨｅｐＧ２．２．１５及び一次（ｐｒｉｍａｒｙ）ＨＦＦ細胞においてＴＥＮＴ４Ａ／ＢとＺＣＣＨＣ１４との物理的相互作用を測定するために用いられた。細胞抽出物は、ＲＮａｓｅ Ａで処理された。正常マウスＩｇＧ（ＮＭＧ）は陰性対照群として用いられた。＊は、交差反応バンド（ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｎｇ ｂａｎｄ）を示す。パネルａ、ｄ～ｅに対する切っていないブロットは、ソースデータとして利用可能である。
【0068】
〔図１３〕ペンタループを含むステムループ（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）構造を示す。
【0069】
本発明のステムループ構造をターゲットＲＮＡ配列に挿入する方法は、従来に公知の様々な方法によって行うことができ、特に制限されるものではない。
【0070】
〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0071】
〔実施例〕
＜実験方法＞
＜実施例１：ＴＡＩＬ－ｓｅｑライブラリー準備及びデータ処理＞
ＴＡＩＬ－ｓｅｑは、従来公知の通りに行われた［３］。要約すると、～５０μｇのＤＮａｓｅＩ（Ｔａｋａｒａ，２２７０Ａ）処理さた全ＲＮＡ（＞２００ｎｔ）を使用し、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，ＭＲＺＨ１１１２４（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｅｄ）ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ＨＦＦ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ，２００２０５９６ ｆｏｒ ＨｅｐＧ２．２．１５ｌｉｂｒａｒｙ）によってリボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ）を２回枯渇させた。ｒＲＮＡ枯渇したＲＮＡを３’アダプターに連結させ、ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ａｍｂｉｏｎ）によって部分的に断片化させた。断片化したＲＮＡを、ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプルダウンし、５’リン酸化させ、６％ウレア－ＰＡＧＥゲル（５００～１，０００ｎｔ）で精製した。精製されたＲＮＡを５’アダプターに連結させ、逆転写させＰＣＲで増幅させた。ライブラリーをＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及びスパイクイン混合物と共にＩｌｌｕｍｉｎａプラットホーム（ＭｉＳｅｑ）でペアエンドラン（ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｒｕｎ）（５１×２５１サイクル）によってシーケンシングした。ＴＡＩＬ－ｓｅｑシーケンシングデータは、受託番号ＧＳＥ１４６６００で国立生命工学情報センター（ＮＣＢＩ）遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）データベースに寄託された。ＴＡＩＬ－ｓｅｑ分析は、Ｔａｉｌｓｅｅｋｅｒ ｖ．３．１．５［９］を用いて行われた。簡略に、Ｒｅａｄ １を遺伝子識別に使用し、Ｒｅａｄ ２を使用して３’末端変形を検出し、ポリ（Ａ）テールの長さを測定した。それぞれのＴＡＩＬ－ｓｅｑライブラリーに対して、Ｒｅａｄ １はＳＴＡＲ２．５．２ｂ［００５０］を有するヒトゲノムＧＲＣｈ３８及びｂｏｗｔｉｅ２．２．６［５１］を有するＨＢＶゲノムＮＣＢＩ Ｕ９５５５１．１又はＨＣＭＶゲノムＮＣＢＩ ＧＵ９３７７４２．２にマップされた。ポリ（Ａ）テール長が２５ｎｔ以上であるＴＡＩＬ－ｓｅｑ断片のみが、以前と同様に［６］用いられた。Ｒｅａｄ ２のうち、末端又は内部モノ－グアニル化（又は－シチジル化、－ウリジル化）を有する３’末端１０－ｍｅｒ配列を調査し、ポリ（Ａ）テールの非アデノシン混入の分率（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を推定した。
＜実験方法＞
＜実施例１：ＴＡＩＬ－ｓｅｑライブラリー準備及びデータ処理＞
ＴＡＩＬ－ｓｅｑは、従来公知の通りに行われた［３］。要約すると、～５０μｇのＤＮａｓｅＩ（Ｔａｋａｒａ，２２７０Ａ）処理さた全ＲＮＡ（＞２００ｎｔ）を使用し、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，ＭＲＺＨ１１１２４（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｅｄ）ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ＨＦＦ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ，２００２０５９６ ｆｏｒ ＨｅｐＧ２．２．１５ｌｉｂｒａｒｙ）によってリボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ）を２回枯渇させた。ｒＲＮＡ枯渇したＲＮＡを３’アダプターに連結させ、ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ａｍｂｉｏｎ）によって部分的に断片化させた。断片化したＲＮＡを、ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプルダウンし、５’リン酸化させ、６％ウレア－ＰＡＧＥゲル（５００～１，０００ｎｔ）で精製した。精製されたＲＮＡを５’アダプターに連結させ、逆転写させＰＣＲで増幅させた。ライブラリーをＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及びスパイクイン混合物と共にＩｌｌｕｍｉｎａプラットホーム（ＭｉＳｅｑ）でペアエンドラン（ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｒｕｎ）（５１×２５１サイクル）によってシーケンシングした。ＴＡＩＬ－ｓｅｑシーケンシングデータは、受託番号ＧＳＥ１４６６００で国立生命工学情報センター（ＮＣＢＩ）遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）データベースに寄託された。ＴＡＩＬ－ｓｅｑ分析は、Ｔａｉｌｓｅｅｋｅｒ ｖ．３．１．５［９］を用いて行われた。簡略に、Ｒｅａｄ １を遺伝子識別に使用し、Ｒｅａｄ ２を使用して３’末端変形を検出し、ポリ（Ａ）テールの長さを測定した。それぞれのＴＡＩＬ－ｓｅｑライブラリーに対して、Ｒｅａｄ １はＳＴＡＲ２．５．２ｂ［００５０］を有するヒトゲノムＧＲＣｈ３８及びｂｏｗｔｉｅ２．２．６［５１］を有するＨＢＶゲノムＮＣＢＩ Ｕ９５５５１．１又はＨＣＭＶゲノムＮＣＢＩ ＧＵ９３７７４２．２にマップされた。ポリ（Ａ）テール長が２５ｎｔ以上であるＴＡＩＬ－ｓｅｑ断片のみが、以前と同様に［６］用いられた。Ｒｅａｄ ２のうち、末端又は内部モノ－グアニル化（又は－シチジル化、－ウリジル化）を有する３’末端１０－ｍｅｒ配列を調査し、ポリ（Ａ）テールの非アデノシン混入の分率（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を推定した。
【0072】
＜実施例２：ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑライブラリー準備及びデータ処理＞
ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑは、やや調整し、以前に説明の通りに行われた［１６、５２］。簡単にいうと、２個の１５０ｍｍディッシュ上のＨｅｐＧ２．２．１５細胞を０．１％パラホルムアルデヒド（Ｐｉｅｒｃｅ，２８９０６）で架橋させ、収集し、溶解させた。それぞれの１５μｇの抗体（ＮＭＧ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－２０２５；ＴＥＮＴ４Ａ，実験室作製；ＴＥＮＴ４Ｂ，実験室作製）をタンパク質Ａ及びＧセファロースビーズ（１：１混合、総２０μｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－５１３８－０１及び１７－０６１８－０１のそれぞれ）にコンジュゲートさせた。溶解物を抗体接合されたビーズと共に培養し、溶離液からＲＮＡを精製した後、ＤＮａｓｅＩ処理及び洗浄を行った。その後、１μｇの入力（ｉｎｐｕｔ）ＲＮＡ又は各サンプルからのＲＮＡをライブラリーに対して製造した。ｒＲＮＡは、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ，２００２０５９６）によって２回枯渇させた。ｒＲＮＡ枯渇したＲＮＡを３’アダプターに連結させ、６％ウレア－ＰＡＧＥゲル（８０～５００ｎｔ、超音波処理によって断片化された５０～４７０ｎｔ ＲＮＡに相応する。）によって精製させ、次いで５’リン酸化、５’アダプター連結、逆転写及びＰＣＲ増幅を行った。ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑライブラリーは、ＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａプラットホーム（ＭｉＳｅｑ）上でペアエンドラン（１５１×１５１サイクル）でシーケンシングした。ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑシーケンシングデータは、受託番号ＧＳＥ１４６５９７でＮＣＢＩ ＧＥＯデータベースに保存された。
ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑは、やや調整し、以前に説明の通りに行われた［１６、５２］。簡単にいうと、２個の１５０ｍｍディッシュ上のＨｅｐＧ２．２．１５細胞を０．１％パラホルムアルデヒド（Ｐｉｅｒｃｅ，２８９０６）で架橋させ、収集し、溶解させた。それぞれの１５μｇの抗体（ＮＭＧ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－２０２５；ＴＥＮＴ４Ａ，実験室作製；ＴＥＮＴ４Ｂ，実験室作製）をタンパク質Ａ及びＧセファロースビーズ（１：１混合、総２０μｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－５１３８－０１及び１７－０６１８－０１のそれぞれ）にコンジュゲートさせた。溶解物を抗体接合されたビーズと共に培養し、溶離液からＲＮＡを精製した後、ＤＮａｓｅＩ処理及び洗浄を行った。その後、１μｇの入力（ｉｎｐｕｔ）ＲＮＡ又は各サンプルからのＲＮＡをライブラリーに対して製造した。ｒＲＮＡは、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ，２００２０５９６）によって２回枯渇させた。ｒＲＮＡ枯渇したＲＮＡを３’アダプターに連結させ、６％ウレア－ＰＡＧＥゲル（８０～５００ｎｔ、超音波処理によって断片化された５０～４７０ｎｔ ＲＮＡに相応する。）によって精製させ、次いで５’リン酸化、５’アダプター連結、逆転写及びＰＣＲ増幅を行った。ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑライブラリーは、ＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａプラットホーム（ＭｉＳｅｑ）上でペアエンドラン（１５１×１５１サイクル）でシーケンシングした。ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑシーケンシングデータは、受託番号ＧＳＥ１４６５９７でＮＣＢＩ ＧＥＯデータベースに保存された。
【0073】
各ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑライブラリーに対してペアエンド判読値をｐｅａｒ ｖ．０．９．１０［５３］で組み立て、ＳＴＡＲ２．５．２ｂ［５０］によってヒトゲノムＧＲＣｈ３８を、ｂｏｗｔｉｅ２．２．６［５１］によってＨＢＶゲノムＮＣＢＩ Ｕ９５５５１．１をアラインした。ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑライブラリーの原始判読カバレッジＲａｗ ｒｅａｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ）をｂｅｄｔｏｏｌｓ ｖ．２．２６．０で計算した。細胞ｍＲＮＡのｆＣＬＩＰ－ｓｅｑピーククラスターは、共変量として、２００ｎｔ（－ｚ ２００）のクラスターサイズ、内部正規化（－ｎ）、ログ変換（－ｌ）及びＮＭＧライブラリーを有するＰｉｒａｎｈａ ｖ１．２．１［５４］を用いて推定した。参考として、ＨＢＶ ＰＲＥは、約４００ｎｔにわたっている。ピーククラスターの濃縮スコアは、ＴＥＮＴ４ ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑライブラリー及びＮＭＧライブラリーの判読値のｌｏｇ２比によって計算された。入力ライブラリーは、この分析の陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いられた［５５］。判読範囲の技術的背景を説明するために、ＨＢＶゲノムに対するＨｏｄｇｅｓ－Ｌｅｈｍａｎｎ推定が用いられた。具体的に、長さｎのＨＢＶゲノムが与えられると、次のセットの中央値（ｍｅｄｉａｎ）を計算する。
【0074】
｛（Ｘｉ＋Ｘｊ）／２：１≦ｉ≦ｊ≦ｎ｝
ここで、ＸｉとＸｊはそれぞれ、位置ｉとｊにおける原始判読カバレッジ（ｒａｗ ｒｅａｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ）である。その後、このＨｏｄｇｅｓ－Ｌｅｈｍａｎｎ推定により原始判読カバレッジを正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）し、ｇｇｐｌｏｔ２ Ｒパッケージを用いて視覚化した。
ここで、ＸｉとＸｊはそれぞれ、位置ｉとｊにおける原始判読カバレッジ（ｒａｗ ｒｅａｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ）である。その後、このＨｏｄｇｅｓ－Ｌｅｈｍａｎｎ推定により原始判読カバレッジを正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）し、ｇｇｐｌｏｔ２ Ｒパッケージを用いて視覚化した。
【0075】
＜実施例３：細胞培養、形質感染及びアクチノマイシンＤ処理＞
この研究に使用された全ての細胞株は、マイコプラズマ陰性を試験した。ＨｅＬａＴはＴＵＴ４遺伝子においてヌル（ｎｕｌｌ）突然変異を有するＨｅＬａ（ソウル大学Ｃ．－Ｈ．Ｃｈｕｎｇから提供される。）から由来した。ＨｅＬａＴ及びＨＥＫ２９３Ｔ（ソウル大学校Ｓ．Ｋｉｍから提供される。）細胞は、ＡＴＣＣ（ＳＴＲプロファイリング）によって認証された。ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨｅＬａＴ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ ＦＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｓ００１－０１）を含有するＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ，ＬＭ００１－０５）で成長させた。プライマリＨＦＦ（ＡＴＣＣ ＳＣＲＣ－１０４１）細胞を１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ－１（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）で成長させた。形質感染前に、プライマリＨＦＦを抗生剤のない培地で成長させた。
この研究に使用された全ての細胞株は、マイコプラズマ陰性を試験した。ＨｅＬａＴはＴＵＴ４遺伝子においてヌル（ｎｕｌｌ）突然変異を有するＨｅＬａ（ソウル大学Ｃ．－Ｈ．Ｃｈｕｎｇから提供される。）から由来した。ＨｅＬａＴ及びＨＥＫ２９３Ｔ（ソウル大学校Ｓ．Ｋｉｍから提供される。）細胞は、ＡＴＣＣ（ＳＴＲプロファイリング）によって認証された。ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨｅＬａＴ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ ＦＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｓ００１－０１）を含有するＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ，ＬＭ００１－０５）で成長させた。プライマリＨＦＦ（ＡＴＣＣ ＳＣＲＣ－１０４１）細胞を１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ－１（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）で成長させた。形質感染前に、プライマリＨＦＦを抗生剤のない培地で成長させた。
【0076】
組合せノックダウン（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）の場合に、標的遺伝子に対して同一量の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）又はＧＡＰｍｅｒを混合し、最終濃度を、次に説明の通りにした。ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂノックダウンの場合に、０、２及び４日にリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＨｅｐＧ２．２．１５細胞を１００ｎＭ ｓｉＲＮＡで形質感染させ、６日に収集した。ＺＣＣＨＣ１４、ＳＡＭＤ４Ａ及びＳＡＭＤ４Ｂノックダウンに対しては、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を０日及び２日にリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による１００ｎＭ ｓｉＲＮＡ又はＧＡＰｍｅｒによって形質感染させ、４日に収集した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、０日に、リポフェクタミン３０００によってＲＮＡ免疫沈殿のためのＲＮＡ２．７発現ｐＣＫベクターで形質感染させ、２日に収集した。プライマリＨＦＦ細胞は、０日及び２日にＤｈａｒｍａＦＥＣＴ １（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）によって２０ｎＭ ｓｉＲＮＡで形質感染させ、５日に収集した。ｓｉＲＮＡの配列情報は表１に提示されている。
【0077】
【表1】
【0078】
本発明者らは、ＨｅｐＧ２．２．１５におけるより良いノックダウン効率のために、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）からＴＥＮＴ４Ａに対するｓｉＲＮＡとＡｎｔｉｓｅｎｓｅ ＬＮＡ ＧａｐｍｅＲ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｑｉａｇｅｎ，３３９５１１ ＬＧ００２３６０４６－ＤＤＡ）からのＳＡＭＤ４Ａに対するＧＡＰｍｅｒを購入した。アクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ，Ａ９４１５、４μｇ ｍｌ－１）をＨｅｐＧ２．２．１５細胞に添加して転写を遮断し、表示された時間に細胞を収集した。
【0079】
＜実施例４：ＨＣＭＶ感染＞
感染性ＨＣＭＶ粒子は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｅｏｎ）によってＨＣＭＶ Ｔｏｌｅｄｏ ＢＡＣ ＤＮＡ（プリンストン大学Ｔ．Ｓｈｅｎｋから提供される。）を、プライマリＨＦＦ細胞内に形質感染させることによって製造した。１００％細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が観察される時に、細胞培養上澄液を収集し、遠心分離して細胞残骸物を除去し、－８０℃で１ｍｌ分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）で保存した。ウイルスストックを滴定するために、カバーガラスで成長したプライマリＨＦＦに、希釈されたウイルスストックを１時間間接種し、接種２４時間後に３．７％ホルムアルデヒドで固定させた。細胞を０．１％トリトンＸ－１００を用いて透過化させ（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）、ブロッキングバッファー（リン酸緩衝食塩水中２％ウシ血清アルブミン）と共に培養し、ＨＣＭＶ ＩＥ１抗体（ＭＡＢ８１０Ｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色した後、ＦＩＴＣ接合された抗マウス抗体（１１５－０９５－１４６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＤＡＰＩ含有溶液（Ｈ１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でマウンティングした。ＨＣＭＶ ＩＥ１陽性細胞の数を数え、総細胞に対するＩＥ１陽性細胞の比を計算することによってＭＯＩ（ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を決定した。ＨＣＭＶ感染の場合、プライマリＨＦＦ細胞を、１時間、無血清ＤＭＥＭに希釈されたＨＣＭＶ（ＭＯＩ，２）と共に培養し、ＰＢＳで洗浄し、追加培養のためにＤＭＥＭで培養した。
感染性ＨＣＭＶ粒子は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｅｏｎ）によってＨＣＭＶ Ｔｏｌｅｄｏ ＢＡＣ ＤＮＡ（プリンストン大学Ｔ．Ｓｈｅｎｋから提供される。）を、プライマリＨＦＦ細胞内に形質感染させることによって製造した。１００％細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が観察される時に、細胞培養上澄液を収集し、遠心分離して細胞残骸物を除去し、－８０℃で１ｍｌ分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）で保存した。ウイルスストックを滴定するために、カバーガラスで成長したプライマリＨＦＦに、希釈されたウイルスストックを１時間間接種し、接種２４時間後に３．７％ホルムアルデヒドで固定させた。細胞を０．１％トリトンＸ－１００を用いて透過化させ（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）、ブロッキングバッファー（リン酸緩衝食塩水中２％ウシ血清アルブミン）と共に培養し、ＨＣＭＶ ＩＥ１抗体（ＭＡＢ８１０Ｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色した後、ＦＩＴＣ接合された抗マウス抗体（１１５－０９５－１４６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＤＡＰＩ含有溶液（Ｈ１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でマウンティングした。ＨＣＭＶ ＩＥ１陽性細胞の数を数え、総細胞に対するＩＥ１陽性細胞の比を計算することによってＭＯＩ（ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を決定した。ＨＣＭＶ感染の場合、プライマリＨＦＦ細胞を、１時間、無血清ＤＭＥＭに希釈されたＨＣＭＶ（ＭＯＩ，２）と共に培養し、ＰＢＳで洗浄し、追加培養のためにＤＭＥＭで培養した。
【0080】
＜実施例５：プラスミド構築＞
ＦＬＡＧタグ以外は、前述した野生型ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ異型体（それぞれ７９２及び６６６ａａ）［６］を使用した。触媒死滅突然変異体に対する点突然変異が導入された（それぞれ、ＴＥＮＴ４Ａの場合にＤ３５２Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂの場合にＤ３２６Ａ）。ＰＲＥレポーターコンストラクトでは、ＰＲＥ（１，１５４－１，６８７ｂｐ）、ＰＲＥα（１，１５４－１，３５１ｂｐ）、ＰＲＥβ（１，３５２－１，６８７ｂｐ）、αΔ１（１，２７６－１，３５１ｂｐ）及びαΔ２（１，１５４－１，２７５ｂｐ）がＨｅｐＧ２．２．１５相補的ＤＮＡで増幅され、ｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ベクター［６］においてファイアフライルシフェラーゼｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲ領域に導入された。Ｌａ結合モチーフ及びステムループαに対する点突然変異は、以前に記載された突然変異体［３０］と同一であった。α－ｍｕｔ１、α－ｍｕｔ２及びα－ｍｕｔ３は、ＰＣＲ指定突然変異誘発によって生成された。ＷＰＲＥレポーターコンストラクトでは、ＷＰＲＥ（１，０９５－１，６７０ｂｐ）、Ｗγ＋Ｗα（１，０９５－１，５０７ｂｐ）、Ｗα＋Ｗβ（１，３００－１，６７０ｂｐ）、Ｗγ（１，０９３－１，２９９ｂｐ）、Ｗα（１，３００－１，５０７ｂｐ）、Ｗβ（１，５０８－１，６７０ｂｐ）は、ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ，１７４９２）から増幅され、ｐｍｉｒＧＬＯ－３Ｘｍｉｒ－１ベクターにおいてファイアフライルシフェラーゼの３’ＵＴＲに導入された。ＷＰＲＥαのＣＮＧＧＮペンタループに対する点突然変異は、ＰＲＥ突然変異体と類似の方式でデザインされた。ＲＮＡ２．７コンストラクトでは、ＦＲＧ１（１－５１３ｂｐ）、ＦＲＧ２（４１４－９１３ｂｐ）、ＦＲＧ３（８１４－１，３１３ｂｐ）、ＦＲＧ４（１，２１４－１，７１３ｂｐ）、ＦＲＧ５（１，６１４－２，１１３ｂｐ）、ＦＲＧ６（２，０１４－２，５１３ｂｐ）、１ΔＡ（１－５１３ｂｐ，Δ１－１００ｂｐ）、１ΔＢ（１－５１３ｂｐ，Δ１０１－２００ｂｐ）、１ΔＣ（１－５１３ｂｐ，Δ２０１－３００ｂｐ）、１ΔＤ（１－５１３ｂｐ，Δ３０１－４００ｂｐ）、１ΔＥ（１－５１３ｂｐ，Δ４０１－５１３ｂｐ）、１Ｄ（３０１－４００ｂｐ）、１Ｅ（４０１－５１３ｂｐ）及びＳＬ２．７（４１４－４６３ｂｐ）は、ＨＣＭＶ感染したプライマリＨＦＦ ｃＤＮＡから増幅され、ｐｍｉｒＧＬＯ－３Ｘｍｉｒ－１ベクターから３’ＵＴＲ領域に導入された。１Ｅ及びＳＬ２．７突然変異コンストラクトは、ＰＲＥ突然変異体と同じ方式で生成された。ＲＮＡ免疫沈殿のために、ＲＮＡ２．７（１－２，５１３ｂｐ）をｐｍｉｒＧＬＯ－３Ｘｍｉｒ－１ベクターから増幅させ、ｐＣＫベクターでサブクローニングした。
ＦＬＡＧタグ以外は、前述した野生型ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ異型体（それぞれ７９２及び６６６ａａ）［６］を使用した。触媒死滅突然変異体に対する点突然変異が導入された（それぞれ、ＴＥＮＴ４Ａの場合にＤ３５２Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂの場合にＤ３２６Ａ）。ＰＲＥレポーターコンストラクトでは、ＰＲＥ（１，１５４－１，６８７ｂｐ）、ＰＲＥα（１，１５４－１，３５１ｂｐ）、ＰＲＥβ（１，３５２－１，６８７ｂｐ）、αΔ１（１，２７６－１，３５１ｂｐ）及びαΔ２（１，１５４－１，２７５ｂｐ）がＨｅｐＧ２．２．１５相補的ＤＮＡで増幅され、ｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ベクター［６］においてファイアフライルシフェラーゼｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲ領域に導入された。Ｌａ結合モチーフ及びステムループαに対する点突然変異は、以前に記載された突然変異体［３０］と同一であった。α－ｍｕｔ１、α－ｍｕｔ２及びα－ｍｕｔ３は、ＰＣＲ指定突然変異誘発によって生成された。ＷＰＲＥレポーターコンストラクトでは、ＷＰＲＥ（１，０９５－１，６７０ｂｐ）、Ｗγ＋Ｗα（１，０９５－１，５０７ｂｐ）、Ｗα＋Ｗβ（１，３００－１，６７０ｂｐ）、Ｗγ（１，０９３－１，２９９ｂｐ）、Ｗα（１，３００－１，５０７ｂｐ）、Ｗβ（１，５０８－１，６７０ｂｐ）は、ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ，１７４９２）から増幅され、ｐｍｉｒＧＬＯ－３Ｘｍｉｒ－１ベクターにおいてファイアフライルシフェラーゼの３’ＵＴＲに導入された。ＷＰＲＥαのＣＮＧＧＮペンタループに対する点突然変異は、ＰＲＥ突然変異体と類似の方式でデザインされた。ＲＮＡ２．７コンストラクトでは、ＦＲＧ１（１－５１３ｂｐ）、ＦＲＧ２（４１４－９１３ｂｐ）、ＦＲＧ３（８１４－１，３１３ｂｐ）、ＦＲＧ４（１，２１４－１，７１３ｂｐ）、ＦＲＧ５（１，６１４－２，１１３ｂｐ）、ＦＲＧ６（２，０１４－２，５１３ｂｐ）、１ΔＡ（１－５１３ｂｐ，Δ１－１００ｂｐ）、１ΔＢ（１－５１３ｂｐ，Δ１０１－２００ｂｐ）、１ΔＣ（１－５１３ｂｐ，Δ２０１－３００ｂｐ）、１ΔＤ（１－５１３ｂｐ，Δ３０１－４００ｂｐ）、１ΔＥ（１－５１３ｂｐ，Δ４０１－５１３ｂｐ）、１Ｄ（３０１－４００ｂｐ）、１Ｅ（４０１－５１３ｂｐ）及びＳＬ２．７（４１４－４６３ｂｐ）は、ＨＣＭＶ感染したプライマリＨＦＦ ｃＤＮＡから増幅され、ｐｍｉｒＧＬＯ－３Ｘｍｉｒ－１ベクターから３’ＵＴＲ領域に導入された。１Ｅ及びＳＬ２．７突然変異コンストラクトは、ＰＲＥ突然変異体と同じ方式で生成された。ＲＮＡ免疫沈殿のために、ＲＮＡ２．７（１－２，５１３ｂｐ）をｐｍｉｒＧＬＯ－３Ｘｍｉｒ－１ベクターから増幅させ、ｐＣＫベクターでサブクローニングした。
【0081】
＜実施例６：ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂノックアウト細胞製造＞
ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂの除去のために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ，Ｍ０３０２）がＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼの代わりに用いられたマイナー適用により、以前に記述された通り［５６］に行われた。２４ウェルプレート上の６Ｅ４ＨｅＬａＴ細胞を、まず、ＴＥＮＴ４Ａに対し、シングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）（ａｇｃｃａｃｇｔｔｇｔｇｃｔｔｃｃｇｃｇ，ＰＡＭ配列はＧＧＧ）を有する３００ｎｇ ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ－ｐｘ４５８プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ｎｏ．４８１３８）と共に、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（Ｂｉｏｎｔｅｘ，Ｔ０２０）を用いて形質感染させた。このＨｅＬａＴ親細胞はＨｅＬａから由来し、ＴＵＴ４遺伝子にヌル突然変異を含有する。ノックアウトを確認するための単一細胞スクリーニング及びサンガーシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）後に、親体及び変更されたゲノム配列が表２に列挙され、挿入された配列は、太字及び下線で表示した。
ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂの除去のために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ，Ｍ０３０２）がＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼの代わりに用いられたマイナー適用により、以前に記述された通り［５６］に行われた。２４ウェルプレート上の６Ｅ４ＨｅＬａＴ細胞を、まず、ＴＥＮＴ４Ａに対し、シングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）（ａｇｃｃａｃｇｔｔｇｔｇｃｔｔｃｃｇｃｇ，ＰＡＭ配列はＧＧＧ）を有する３００ｎｇ ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ－ｐｘ４５８プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ｎｏ．４８１３８）と共に、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（Ｂｉｏｎｔｅｘ，Ｔ０２０）を用いて形質感染させた。このＨｅＬａＴ親細胞はＨｅＬａから由来し、ＴＵＴ４遺伝子にヌル突然変異を含有する。ノックアウトを確認するための単一細胞スクリーニング及びサンガーシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）後に、親体及び変更されたゲノム配列が表２に列挙され、挿入された配列は、太字及び下線で表示した。
【0082】
【表2】
【0083】
ＴＥＮＴ４Ａノックアウト細胞を用いて、ＴＥＮＴ４ＢをＴＥＮＴ４Ｂに対してｓｇＲＮＡ（ｇａｃａｔｃｇａｃｃｔａｇｔｇｇｔｇｔｔ，ＰＡＭ配列はＴＧＧ）でさらに除去した。変更されたゲノム配列は、表２にさらに列挙されており、挿入及び欠失した配列はそれぞれ、赤色及び点線で表示した。
【0084】
＜実施例７：ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ抗体準備＞
マウスをＴＥＮＴ４Ａ抗原（７９２ａａ異型体からの１２６－５７１ａａ，ＮＣＢＩ ＮＰ＿００８９３０．２）又はＴＥＮＴ４Ｂ抗原（６６６ａａ異型体からの１０６－５３３ａａ，ＮＣＢＩ ＸＰ＿００６７２１３０８．１）で兔役させ、死滅させた。収集された脾臓細胞をＳｐ２／Ｏ骨髄腫と融合させ、高親和度抗体を生成するハイブリドーマ細胞を選択した。マウスにハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した後、腹水を得（Ｙｏｕｎｇｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｉｎｃ．）、免疫沈殿実験に使用した。
マウスをＴＥＮＴ４Ａ抗原（７９２ａａ異型体からの１２６－５７１ａａ，ＮＣＢＩ ＮＰ＿００８９３０．２）又はＴＥＮＴ４Ｂ抗原（６６６ａａ異型体からの１０６－５３３ａａ，ＮＣＢＩ ＸＰ＿００６７２１３０８．１）で兔役させ、死滅させた。収集された脾臓細胞をＳｐ２／Ｏ骨髄腫と融合させ、高親和度抗体を生成するハイブリドーマ細胞を選択した。マウスにハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した後、腹水を得（Ｙｏｕｎｇｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｉｎｃ．）、免疫沈殿実験に使用した。
【0085】
＜実施例８：ウェスタンブロット＞
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞をＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ＮＰ－４０（Ｓｉｇｍａ，７４３８５）、１％ナトリウムデオキシコレート（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６７５０）、１％ ＳＤＳ（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ９８２３））に溶解させた。他の細胞を緩衝液Ｄ（２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ－１００（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｈ５１４２）に溶解させた。略６０μｇの溶解物をｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ，２６６１６及び２６６１９）と共に１０％又は８～１６％（Ｎｏｖｅｘ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。メタノール活性化ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した後、膜を、５％脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を含有するＰＢＳ－Ｔでブロッキングし、一次抗体で標識し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。抗マウス又は抗ウサギＨＲＰ接合された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を培養し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。化学発光は、Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ又はＦｅｍｔｏ Ｌｕｍｉｎｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）で行われ、信号は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）によって検出された。抗ＴＥＮＴ４Ａ（１：５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－６１３０２；１：２５０－５００，Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＰＡ０４５４８７）、抗ＴＥＮＴ４Ｂ（１：５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－６０１７７；１：５００，Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨＰＡ０４２９６８；１：５００、実験室作製）、抗ＺＣＣＨＣ１４（１：１，０００－２，０００，Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａ３０３－０９６Ａ）、抗ＧＡＰＤＨ（１：１，０００－２，０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ３２２３３）、抗ＳＡＭＤ４Ｂ（１：５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－５３４９０）、抗ＧＭ１３０（１：５００，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，６１０８２２）及び抗ヒストンＨ３（１：２，０００，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４４９９）を１次抗体として使用した。
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞をＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ＮＰ－４０（Ｓｉｇｍａ，７４３８５）、１％ナトリウムデオキシコレート（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６７５０）、１％ ＳＤＳ（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ９８２３））に溶解させた。他の細胞を緩衝液Ｄ（２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ－１００（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｈ５１４２）に溶解させた。略６０μｇの溶解物をｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ，２６６１６及び２６６１９）と共に１０％又は８～１６％（Ｎｏｖｅｘ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。メタノール活性化ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した後、膜を、５％脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を含有するＰＢＳ－Ｔでブロッキングし、一次抗体で標識し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。抗マウス又は抗ウサギＨＲＰ接合された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を培養し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。化学発光は、Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ又はＦｅｍｔｏ Ｌｕｍｉｎｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）で行われ、信号は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）によって検出された。抗ＴＥＮＴ４Ａ（１：５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－６１３０２；１：２５０－５００，Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＰＡ０４５４８７）、抗ＴＥＮＴ４Ｂ（１：５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－６０１７７；１：５００，Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨＰＡ０４２９６８；１：５００、実験室作製）、抗ＺＣＣＨＣ１４（１：１，０００－２，０００，Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａ３０３－０９６Ａ）、抗ＧＡＰＤＨ（１：１，０００－２，０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ３２２３３）、抗ＳＡＭＤ４Ｂ（１：５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－５３４９０）、抗ＧＭ１３０（１：５００，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，６１０８２２）及び抗ヒストンＨ３（１：２，０００，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４４９９）を１次抗体として使用した。
【0086】
＜実施例９：ＲＴ－ｑＰＣＲ＞
全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６０１８）又はＭａｘｗｅｌｌ１６ＬＥＶ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＡＳ１２８０）を用いて抽出し、ＤＮａｓｅＩで処理し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ）及びルシフェラーゼ検定サンプルに対するｏｌｉｇｏ ｄＴ、又は他のサンプルに対するランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写した。ｍＲＮＡレベルは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ分析（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ実時間ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）又はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。ＲＴ－ｑＰＣＲプライマーの目録は、表３に提示されている。
全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６０１８）又はＭａｘｗｅｌｌ１６ＬＥＶ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＡＳ１２８０）を用いて抽出し、ＤＮａｓｅＩで処理し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ）及びルシフェラーゼ検定サンプルに対するｏｌｉｇｏ ｄＴ、又は他のサンプルに対するランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写した。ｍＲＮＡレベルは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ分析（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ実時間ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）又はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。ＲＴ－ｑＰＣＲプライマーの目録は、表３に提示されている。
【0087】
【表3】
【0088】
＜実施例１０：ＲＮＡ免疫沈殿＞
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を使用したＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ免疫沈殿では、１枚の１５０ｍｍ皿からの細胞を収集し、溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０～７．６）（Ｓｉｇｍａ，Ｈ０８８７）、４％ ＮＰ－４０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、２０Ｕｍｌ－１ ＲＮａｓｅ抑制剤（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ２６９６）、１ｘプロテアーゼ抑制剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，５３５１４０）で氷上で溶解させ、遠心分離した。それぞれの０．３７５μｇの抗体（ＮＭＧ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－２０２５；抗ＴＥＮＴ４Ａ，実験室作製；抗ＴＥＮＴ４Ｂ，実験室作製）をタンパク質Ａ及びＧセファロースビーズに接合させた（１：１混合、総１０μｌ）。溶解物を、抗体接合されたビーズと共にインキュベーションした後、洗浄緩衝剤（２％ ＮＰ－４０の他に同一の溶解緩衝剤）で洗浄した。正規化に使用されるスパイクインとして１０ｎｇのファイアフライルシフェラーゼｍＲＮＡをサンプルに添加した後、ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬で精製し、ＤＮａｓｅＩで処理し、ＲＴ－ｑＰＣＲに使用した。類似の方法が、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を使用したＺＣＣＨＣ１４免疫沈殿のために用いられ、また、溶解中にＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ２２３９）で処理し、それぞれ１０μｇの抗体（一般ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２７２９Ｓ）及び抗ＺＣＣＨＣ１４（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａ３０３－０９６Ａ））を使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１枚の１００ｍｍ皿）を用いたＴＥＮＴ４Ａ免疫沈殿では、類似の方法が、それぞれの６μｇの抗体（ＮＭＧ及び抗ＴＥＮＴ４Ａ）と共に使用され、また、細胞は収集前に架橋結合した（０．１％パラホルムアルデヒド）。
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を使用したＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ免疫沈殿では、１枚の１５０ｍｍ皿からの細胞を収集し、溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０～７．６）（Ｓｉｇｍａ，Ｈ０８８７）、４％ ＮＰ－４０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、２０Ｕｍｌ－１ ＲＮａｓｅ抑制剤（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ２６９６）、１ｘプロテアーゼ抑制剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，５３５１４０）で氷上で溶解させ、遠心分離した。それぞれの０．３７５μｇの抗体（ＮＭＧ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－２０２５；抗ＴＥＮＴ４Ａ，実験室作製；抗ＴＥＮＴ４Ｂ，実験室作製）をタンパク質Ａ及びＧセファロースビーズに接合させた（１：１混合、総１０μｌ）。溶解物を、抗体接合されたビーズと共にインキュベーションした後、洗浄緩衝剤（２％ ＮＰ－４０の他に同一の溶解緩衝剤）で洗浄した。正規化に使用されるスパイクインとして１０ｎｇのファイアフライルシフェラーゼｍＲＮＡをサンプルに添加した後、ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬で精製し、ＤＮａｓｅＩで処理し、ＲＴ－ｑＰＣＲに使用した。類似の方法が、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を使用したＺＣＣＨＣ１４免疫沈殿のために用いられ、また、溶解中にＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ２２３９）で処理し、それぞれ１０μｇの抗体（一般ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２７２９Ｓ）及び抗ＺＣＣＨＣ１４（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａ３０３－０９６Ａ））を使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１枚の１００ｍｍ皿）を用いたＴＥＮＴ４Ａ免疫沈殿では、類似の方法が、それぞれの６μｇの抗体（ＮＭＧ及び抗ＴＥＮＴ４Ａ）と共に使用され、また、細胞は収集前に架橋結合した（０．１％パラホルムアルデヒド）。
【0089】
＜実施例１１：共同免疫沈降＞
類似の段階がＲＮＡ免疫沈殿におけると同様に用いられたが、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅＩ及びＲＮａｓｅ Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＥＮ０５３１）が添加された。簡単にいうと、５個の１５０ｍｍ皿からのＨｅｐＧ２．２．１５細胞を溶解させ、それぞれの１７．５μｇの抗体（ＮＭＧ、抗ＴＥＮＴ４Ａ、抗ＴＥＮＴ４Ｂ）を免疫沈殿に使用し、これはタンパク質Ａ及びＧセファロースビーズ（１：１混合、総２５μｌ）にコンジュゲーションされた。２枚の１５０ｍｍディッシュからのプライマリＨＦＦ細胞を溶解させ、それぞれ６μｇの抗体（ＮＭＧ、抗ＴＥＮＴ４Ａ、抗ＴＥＮＴ４Ｂ）を免疫沈殿に使用し、これはタンパク質Ａ及びＧセファロースビーズ（１：１混合、総２０μｌ）に接合された。ＲＮａｓｅ Ａを溶解物に添加して０．２～０．３μｇ／μｌの最終濃度にした。共免疫沈降実験のために、ＨｅＬａＴ細胞の１及び１／３ １５０ｍｍディッシュからの細胞質抽出物を、次に説明する通りに細胞外分別法によって得た後、それぞれの１８μｇの抗体（ＮＭＧ、抗ＴＥＮＴ４Ａ、抗ＴＥＮＴ４Ｂ）と共に免疫沈殿に使用した。
類似の段階がＲＮＡ免疫沈殿におけると同様に用いられたが、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅＩ及びＲＮａｓｅ Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＥＮ０５３１）が添加された。簡単にいうと、５個の１５０ｍｍ皿からのＨｅｐＧ２．２．１５細胞を溶解させ、それぞれの１７．５μｇの抗体（ＮＭＧ、抗ＴＥＮＴ４Ａ、抗ＴＥＮＴ４Ｂ）を免疫沈殿に使用し、これはタンパク質Ａ及びＧセファロースビーズ（１：１混合、総２５μｌ）にコンジュゲーションされた。２枚の１５０ｍｍディッシュからのプライマリＨＦＦ細胞を溶解させ、それぞれ６μｇの抗体（ＮＭＧ、抗ＴＥＮＴ４Ａ、抗ＴＥＮＴ４Ｂ）を免疫沈殿に使用し、これはタンパク質Ａ及びＧセファロースビーズ（１：１混合、総２０μｌ）に接合された。ＲＮａｓｅ Ａを溶解物に添加して０．２～０．３μｇ／μｌの最終濃度にした。共免疫沈降実験のために、ＨｅＬａＴ細胞の１及び１／３ １５０ｍｍディッシュからの細胞質抽出物を、次に説明する通りに細胞外分別法によって得た後、それぞれの１８μｇの抗体（ＮＭＧ、抗ＴＥＮＴ４Ａ、抗ＴＥＮＴ４Ｂ）と共に免疫沈殿に使用した。
【0090】
＜実施例１２：ルシフェラーゼ分析及び形質感染＞
２４ウェルプレート上の１Ｅ５ＨｅＬａＴ細胞を０日にリポフェクタミン３０００によってルシフェラーゼレポーター分析のために２００ｎｇ ｐｍｉｒＧＬＯプラスミドで形質感染させ、２日に収集した。回復実験のために、２４ウェルプレート上の１．５Ｅ５ＨｅＬａＴ親細胞及びＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞を５０ｎｇのｐｍｉｒＧＬＯプラスミドと共に２０ｎｇのヌルベクター又はＴＥＮＴ４Ａ／Ｂ（１：１混合）プラスミドでリポフェクタミン３０００によって０日に形質感染させ、２日に収集した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は０日に１００ｎＭ ｓｉＲＮＡで形質感染させ、２４ウェルプレート上の１．５Ｅ５細胞をリポフェクタミン３０００によって１００又は２００ｎｇのｐｍｉｒＧＬＯプラスミドと共に２日に１００ｎＭ ｓｉＲＮＡでさらに形質感染させた。４日にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を収集した。ルシフェラーゼ分析のために、細胞を溶解させ、メーカーの指示に従ってデュアルルシフェラーゼレポーター分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。
２４ウェルプレート上の１Ｅ５ＨｅＬａＴ細胞を０日にリポフェクタミン３０００によってルシフェラーゼレポーター分析のために２００ｎｇ ｐｍｉｒＧＬＯプラスミドで形質感染させ、２日に収集した。回復実験のために、２４ウェルプレート上の１．５Ｅ５ＨｅＬａＴ親細胞及びＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞を５０ｎｇのｐｍｉｒＧＬＯプラスミドと共に２０ｎｇのヌルベクター又はＴＥＮＴ４Ａ／Ｂ（１：１混合）プラスミドでリポフェクタミン３０００によって０日に形質感染させ、２日に収集した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は０日に１００ｎＭ ｓｉＲＮＡで形質感染させ、２４ウェルプレート上の１．５Ｅ５細胞をリポフェクタミン３０００によって１００又は２００ｎｇのｐｍｉｒＧＬＯプラスミドと共に２日に１００ｎＭ ｓｉＲＮＡでさらに形質感染させた。４日にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を収集した。ルシフェラーゼ分析のために、細胞を溶解させ、メーカーの指示に従ってデュアルルシフェラーゼレポーター分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。
【0091】
＜実施例１３：細胞内分画＞
２Ｅ６ＨｅＬａＴ細胞を収集し、冷たいＰＢＳで洗浄した。細胞質分画を得るために、細胞を２００μｌの細胞質溶解緩衝剤（０．２μｇ／μｌ ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ１４１）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０～７．６）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２０Ｕ ｍｌ－１ ＲＮａｓｅ抑制剤、１ｘプロテアーゼ抑制剤、１ｘホスファターゼ抑制剤）で溶解させた。２，０００相対遠心力（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｎｔｉｆｕｇａｌ ｆｏｒｃｅ）で遠心分離後に、４℃で５分間、上澄液を収集し、細胞質分画として使用した。膜及び核分画では、細胞内タンパク質分別キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，７８８４０）をメーカーの指針に従って使用した。
２Ｅ６ＨｅＬａＴ細胞を収集し、冷たいＰＢＳで洗浄した。細胞質分画を得るために、細胞を２００μｌの細胞質溶解緩衝剤（０．２μｇ／μｌ ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ１４１）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０～７．６）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２０Ｕ ｍｌ－１ ＲＮａｓｅ抑制剤、１ｘプロテアーゼ抑制剤、１ｘホスファターゼ抑制剤）で溶解させた。２，０００相対遠心力（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｎｔｉｆｕｇａｌ ｆｏｒｃｅ）で遠心分離後に、４℃で５分間、上澄液を収集し、細胞質分画として使用した。膜及び核分画では、細胞内タンパク質分別キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，７８８４０）をメーカーの指針に従って使用した。
【0092】
＜実施例１４：Ｈｉｒｅ－ＰＡＴ分析＞
毛細管電気泳動データのＨｉｒｅ－ＰＡＴ分析及び信号処理は、以前に記載された通り［３，５７］、全ＲＮＡが酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，７４２２５Ｚ２５ＫＵ）によってＧ／Ｉテールになるようにマイナーアダプテーションで行われた。ファイアフライルシフェラーゼ遺伝子のポリ（Ａ）部位は、サンガーシーケンシングにより確認され、フォワードＰＣＲプライマーは表４に表した。
毛細管電気泳動データのＨｉｒｅ－ＰＡＴ分析及び信号処理は、以前に記載された通り［３，５７］、全ＲＮＡが酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，７４２２５Ｚ２５ＫＵ）によってＧ／Ｉテールになるようにマイナーアダプテーションで行われた。ファイアフライルシフェラーゼ遺伝子のポリ（Ａ）部位は、サンガーシーケンシングにより確認され、フォワードＰＣＲプライマーは表４に表した。
【0093】
【表4】
【0094】
＜実施例１５：系統発生学的分析＞
推定ステムループ結合タンパク質を確認するために、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｍａｕｇ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２３９７２）及びヒトＳＡＭＤ４Ａ／Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＵＰＵ９及びＱ５ＰＲＦ９）のＲＮＡ結合ＳＡＭドメインの相同体は、１０のＥ値臨界値と一緒にＵｎｉＰｒｏｔ ＢＬＡＳＴを用いてサーチし、ギャッピングされなかった［５８］。分析に用いられたタンパク質配列：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ０８８３１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９Ｐ６Ｒ７（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ５ＡＩ８０（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ７６６９９（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２３９７２（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｅ７Ｆ８５Ｅ７ＦＢＡ１、Ａ０Ａ０Ｒ４ＩＵＭ４（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ６ＧＬＴ９、Ｑ５ＦＷＰ２、Ａ０Ａ１Ｌ８ＧＬ３６（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ８ＣＢＹ１、Ｑ８０ＸＳ６、Ｑ８ＶＩＧ０（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＵＰＵ９、Ｑ５ＰＲＦ９、Ｑ８ＷＹＱ９（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）。基本パラメータを有するＭＵＳＣＬＥ ｖ．３．８．３１［５９］を、生成された１７個のタンパク質配列の多重配列整列に使用した。系統発生樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）は、ＰｈｙＭＬ ｖ．３．１／３．０ａＬＲＴ［６０］を用いて再構成し、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｆｒプラットホーム［６２］においてＴｒｅｅＤｙｎ ｖ．１９８．３［６１］を用いて視覚化した。再構成された系統発生樹の縁と葉は再調整され、視覚化のために手動でルーティングされた（ｒｏｏｔｅｄ）。
推定ステムループ結合タンパク質を確認するために、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｍａｕｇ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２３９７２）及びヒトＳＡＭＤ４Ａ／Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＵＰＵ９及びＱ５ＰＲＦ９）のＲＮＡ結合ＳＡＭドメインの相同体は、１０のＥ値臨界値と一緒にＵｎｉＰｒｏｔ ＢＬＡＳＴを用いてサーチし、ギャッピングされなかった［５８］。分析に用いられたタンパク質配列：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ０８８３１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９Ｐ６Ｒ７（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ５ＡＩ８０（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ７６６９９（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２３９７２（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｅ７Ｆ８５Ｅ７ＦＢＡ１、Ａ０Ａ０Ｒ４ＩＵＭ４（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ６ＧＬＴ９、Ｑ５ＦＷＰ２、Ａ０Ａ１Ｌ８ＧＬ３６（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ８ＣＢＹ１、Ｑ８０ＸＳ６、Ｑ８ＶＩＧ０（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＵＰＵ９、Ｑ５ＰＲＦ９、Ｑ８ＷＹＱ９（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）。基本パラメータを有するＭＵＳＣＬＥ ｖ．３．８．３１［５９］を、生成された１７個のタンパク質配列の多重配列整列に使用した。系統発生樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）は、ＰｈｙＭＬ ｖ．３．１／３．０ａＬＲＴ［６０］を用いて再構成し、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｆｒプラットホーム［６２］においてＴｒｅｅＤｙｎ ｖ．１９８．３［６１］を用いて視覚化した。再構成された系統発生樹の縁と葉は再調整され、視覚化のために手動でルーティングされた（ｒｏｏｔｅｄ）。
【0095】
＜実施例１６：ＲＮＡプルダウン分析＞
ＲＮＡ２．７ステムループ（ＳＬ２．７）及びステムループ突然変異体（ＳＬ２．７突然変異）の３’ＴＥＧ（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｐａｃｅｒ）－ビオチン化ＲＮＡを合成し（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｉｎｃ．）、配列は表５に記載した。
ＲＮＡ２．７ステムループ（ＳＬ２．７）及びステムループ突然変異体（ＳＬ２．７突然変異）の３’ＴＥＧ（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｐａｃｅｒ）－ビオチン化ＲＮＡを合成し（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｉｎｃ．）、配列は表５に記載した。
【0096】
【表5】
【0097】
セット１に対するストレプトアビジンＭ－２７０ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，６５３０５）及びセット２に対するストレプトアビジン磁性ビーズ（ＮＥＢ，Ｓ１４２０Ｓ）をプルダウンバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１００Ｕ ｍｌ－１ ＲＮａｓｅ抑制剤、１ｘプロテアーゼ抑制剤）で２回洗浄した。次いで、ＳＬ２．７の１０μｇのオリゴヌクレオチド又はその突然変異体を、４℃で一晩、プルダウン緩衝剤中のストレプトアビジンビーズにコンジュゲーションさせた後、プルダウン緩衝剤で洗浄した。４枚の１５０ｍｍ皿からのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を収集し、１．５ｍｌプルダウン緩衝液で溶解させた後、超音波処理した。遠心分離後に、上澄液をビーズと共にインキュベーションし、洗浄バッファーＮｏ．１（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）、洗浄緩衝液番号２（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．１％トリトンＸ－１００）及びプルダウン緩衝剤で洗浄した。溶離のために、ビーズを１，６００ｒ．ｐ．ｍで６０μｌの溶離緩衝剤（１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、４％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ＤＴＴ）と共に６５℃で１０分間に熱混合器で培養した。次いで、１０及び５０μｌの溶出液を、それぞれ、ウェスタンブロッティング及び質量分析に使用した。
【0098】
＜実施例１７：液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析機（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析＞
ＳＤＳを含有する免疫沈殿されたタンパク質サンプルは、濾過補助サンプル製造消化に適用された。簡略に、タンパク質サンプルをまず還元させ、変性ＡＢＣ緩衝剤（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）中８Ｍウレア）でアルキル化させた。アルキル化したサンプルを、あらかじめ調整された３０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコンフィルター（ミリポア、ＵＦＣ５０３０）に入れ、１４，０００ｇで３０分間遠心分離した。２００μｌの８Ｍウレア又は５０ｍＭ ＡＢＣ緩衝液で連続洗浄を行い、１４，０００ｇで１５分間遠心分離してフィルターユニットからＳＤＳを除去した。次いで、タンパク質サンプルを３７℃で２％（ｗ／ｗ）トリプシンで一晩消化させた。生成されたペプチドサンプルを、Ｃ１８ジッパーティップ洗浄（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｚ７２００７０）及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に適用した。３μｍ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８粒子（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）が内蔵された自体包装された長い毛細管カラム（内径１００ｃｍ×７５μｍ）及びトラップカラム（内径３ｃｍ×１５０μｍ）をペプチド分離に使用した。３００ｎｌ／ｍｉｎの流速及び１００分間に、９５％溶媒Ａ（０．１％ギ酸含有水）～４０％の溶媒Ｂ（０．１％ギ酸含有アセトニトリル）の範囲の線形勾配を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合しているｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）上に適用し、これは、次のパラメータを用いて作用された：前駆体スキャン範囲のｍ／ｚ３００～１，８００、前駆体隔離ウィンドウ１．４Ｔｈ、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）に対する正規化した衝突エネルギーの３０％、動的排除期間３０秒、及びｆｕｌｌ ＭＳ又はＭＳ／ＭＳスキャンｄｐに対するｍ／ｚ２００における６０，０００又は７５，０００解像度、それぞれ。
ＳＤＳを含有する免疫沈殿されたタンパク質サンプルは、濾過補助サンプル製造消化に適用された。簡略に、タンパク質サンプルをまず還元させ、変性ＡＢＣ緩衝剤（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）中８Ｍウレア）でアルキル化させた。アルキル化したサンプルを、あらかじめ調整された３０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコンフィルター（ミリポア、ＵＦＣ５０３０）に入れ、１４，０００ｇで３０分間遠心分離した。２００μｌの８Ｍウレア又は５０ｍＭ ＡＢＣ緩衝液で連続洗浄を行い、１４，０００ｇで１５分間遠心分離してフィルターユニットからＳＤＳを除去した。次いで、タンパク質サンプルを３７℃で２％（ｗ／ｗ）トリプシンで一晩消化させた。生成されたペプチドサンプルを、Ｃ１８ジッパーティップ洗浄（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｚ７２００７０）及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に適用した。３μｍ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８粒子（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）が内蔵された自体包装された長い毛細管カラム（内径１００ｃｍ×７５μｍ）及びトラップカラム（内径３ｃｍ×１５０μｍ）をペプチド分離に使用した。３００ｎｌ／ｍｉｎの流速及び１００分間に、９５％溶媒Ａ（０．１％ギ酸含有水）～４０％の溶媒Ｂ（０．１％ギ酸含有アセトニトリル）の範囲の線形勾配を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合しているｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）上に適用し、これは、次のパラメータを用いて作用された：前駆体スキャン範囲のｍ／ｚ３００～１，８００、前駆体隔離ウィンドウ１．４Ｔｈ、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）に対する正規化した衝突エネルギーの３０％、動的排除期間３０秒、及びｆｕｌｌ ＭＳ又はＭＳ／ＭＳスキャンｄｐに対するｍ／ｚ２００における６０，０００又は７５，０００解像度、それぞれ。
【0099】
質量分析原始データファイルは、基本設定（初期又はメインサーチのそれぞれに対する前駆体イオン質量公差の２０又は６ｐｐｍ、及び切片イオン質量に対する０．５Ｄａ）においてヒトＵｎｉｐｒｏｔデータベース［５８］（ｖ．１２／５／２０１８）に対してＭａｘＱｕａｎｔの内蔵Ａｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジン［６５］を用いてＭａｘＱｕａｎｔ（ｖ．１．５．３．３０）で処理した。酵素特異性は、トリプシン／Ｐに設定され、最大で２個の欠落した分裂が許容された。システインカルバミドメチル化及びメチオニン酸化はそれぞれ、固定及び可変変形として選択された。タンパク質及びペプチドレベルの両方において１％ ＦＤＲが要求された。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子ＰＸＤ０１８０６１及び１０．６０１９／ＰＸＤ０１８０６１と共に、ＰＲＩＤＥ［６６］パートナー保存所を通じてＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅコンソーシアムに保存された。ＳＬ２．７コンストラクトに対するスプリアス又は非特異的結合を説明するために‘ビーズオンリー（ｏｎｌｙ）’及び突然変異コンストラクトから得た結果を技術的背景と見なし、タンパク質スペクトル数増加のためのカストマイズされた統計テストをデザインした。ＳＬ２．７コンストラクトからタンパク質ｐに対して確認されたスペクトル個数の数をＮｐにし、背景構築物からの個数をＭｐにする。Ｎｐ≧１である各タンパク質ｐに対して、濃縮の統計的有意性（又は、Ｐ値）が計算された：
【0100】
【化1】
【0101】
ここで、
【0102】
【化2】
【0103】
であり、Ｂ（ｋ；ｎ，ｐ）は、Ｐの成功確率であって、ｎ回の試みでｋ個の成功を得る二項分布である。最後に、Ｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法で調整された。技術的背景（‘ビーズオンリー’又は突然変異体）を使用する時に、調整されたＰ＜０．０１であるタンパク質は統計的に有意であると見なされた。セット１又はセット２データセットにおいて統計的に有意なタンパク質が、後続タンパク質強度分析のために考慮された。結測値を処理するために、データセットの最小０でない強度値が代置された。次いで、タンパク質濃縮点数を突然変異データに対するＳＬ２．７のタンパク質強度のｌｏｇ２倍変化として計算した。
【0104】
＜結果＞
＜１．ＨＢＶとＨＣＭＶは、混合されたテーリング道具を逆利用する。＞
ウイルスＲＮＡテーリングを調査し特性化するために、まず、ＴＡＩＬ－ｓｅｑを２種のウイルス感染モデルに適用した：ＨＢＶ ＤＮＡと統合されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞及びＨＣＭＶに感染したプライマリヒト包皮繊維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＨＦＦ）。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は、肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２から由来し、ＨＢＶ粒子の生産及び組立を支援するときに、ＨＢＶの寿命周期を研究するのに使用した。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞に対するＴＡＩＬ－ｓｅｑデータは、ウイルスＲＮＡに対して非常に高いグアニル化頻度を示した（図１ａ、図７ａ）。混合テーリング頻度（Ｇ、Ｕ及びＣ計数）は、また、細胞ＲＮＡよりもウイルスＲＮＡにおいて実質的により高かった（図７ａ）。また、ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞に対するＴＡＩＬ－ｓｅｑデータは、ＨＣＭＶ ＲＮＡに対して高いグアニル化及び混合テーリング頻度を示した（図１ｂ及び図７ｂ）。変形は、主に、ＨＣＭＶの４個の豊富で且つ保存された長い非コーディングＲＮＡの一つであるＲＮＡ２．７（図７ｃ，ＶＲＮＡ２．７）に起因した。ＨＢＶ及びＨＣＭＶ ＲＮＡはいずれも細胞ｍＲＮＡよりもテールが非常に長く（図１ｃ、図１ｄ）、これは、このようなウイルスＲＮＡは細胞ｍＲＮＡに比べて、遅い全体（ｎｅｔ）デアデニル化を経由し得ることを示す。
＜１．ＨＢＶとＨＣＭＶは、混合されたテーリング道具を逆利用する。＞
ウイルスＲＮＡテーリングを調査し特性化するために、まず、ＴＡＩＬ－ｓｅｑを２種のウイルス感染モデルに適用した：ＨＢＶ ＤＮＡと統合されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞及びＨＣＭＶに感染したプライマリヒト包皮繊維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＨＦＦ）。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は、肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２から由来し、ＨＢＶ粒子の生産及び組立を支援するときに、ＨＢＶの寿命周期を研究するのに使用した。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞に対するＴＡＩＬ－ｓｅｑデータは、ウイルスＲＮＡに対して非常に高いグアニル化頻度を示した（図１ａ、図７ａ）。混合テーリング頻度（Ｇ、Ｕ及びＣ計数）は、また、細胞ＲＮＡよりもウイルスＲＮＡにおいて実質的により高かった（図７ａ）。また、ＨＣＭＶ感染したＨＦＦ細胞に対するＴＡＩＬ－ｓｅｑデータは、ＨＣＭＶ ＲＮＡに対して高いグアニル化及び混合テーリング頻度を示した（図１ｂ及び図７ｂ）。変形は、主に、ＨＣＭＶの４個の豊富で且つ保存された長い非コーディングＲＮＡの一つであるＲＮＡ２．７（図７ｃ，ＶＲＮＡ２．７）に起因した。ＨＢＶ及びＨＣＭＶ ＲＮＡはいずれも細胞ｍＲＮＡよりもテールが非常に長く（図１ｃ、図１ｄ）、これは、このようなウイルスＲＮＡは細胞ｍＲＮＡに比べて、遅い全体（ｎｅｔ）デアデニル化を経由し得ることを示す。
【0105】
ウイルス混合テーリングが宿主対応物と同じ酵素によって媒介されかを調べるために、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂを枯渇させた。ＨＢＶ ｍＲＮＡ及びＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７のグアニル化及び混合されたテーリング頻度は、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ枯渇した細胞において減少した（図１ｅ、図１ｆ及び図７ｄ～図７ｇ）。ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂのノックダウンは、また、ウイルスＲＮＡのポリ（Ａ）テールが短くなり（図７ｈ～図７ｊ）、ＴＥＮＴ４酵素がウイルスＲＮＡテールの延長に寄与するということを示した。一様に、ＨＢＶ ｍＲＮＡは、ＴＥＮＴ４枯渇後に下向き調節及び不安定化され（図１ｇ、図１ｈ及び図７ｋ）、これは、ＨＢＶがＴＥＮＴ４を使用してｍＲＮＡを安定化させることを示す。注目すべき点は、ＴＥＮＴ４がない時に補償メカニズムの可能性を除いて、オリゴ－ウリジル化（図７ｌ）のようなテール変形が増加しないという点である。高度に安定したＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７は、実験時間ウィンドウ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｉｍｅ ｗｉｎｄｏｗ）範囲内でＲＮＡ半減期において有意の変化を示しておらず（図７ｍ、Ｐ＞０．０５；両側学生のｔ検定）、これは、デアデニル化に続く追加のダウンストリームメカニズムを示唆し、これはＲＮＡ２．７崩壊を遮断する。
【0106】
＜２．ＨＢＶ ＲＮＡはＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてＴＥＮＴ４の主要基質である。＞
ＴＥＮＴ４募集のメカニズムを説明するために、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてフォルムアルデヒド媒介架橋結合及び免疫沈殿シーケンシング（ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑ）を行った（図２）。フォルムアルデヒドベースの架橋は、ＲＮＡ－タンパク質相互作用が一時的で且つ構造依存的である時にも、ＲＮＡ－タンパク質相互作用を効果的で且つ強力にキャプチャーする。正常マウスＩｇＧ（ＮＭＧ）、ＴＥＮＴ４Ａ抗体又はＴＥＮＴ４Ｂ抗体を使用して入力（ｉｎｐｕｔ）溶解物及び免疫沈殿物で４個のライブラリーを製造した。入力及びＮＭＧライブラリーは、背景を推定するためのサイズマッチングされた対照群として用いられた。ＨＢＶゲノムにわたって標準化された判読範囲は、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ抗体の両方を使用してＨＢＶゲノムから実質的に豊富なピークを確認した（図２ａ）が、これは、ＨＢＶ ＲＮＡ上のＴＥＮＴ４の相互作用部位を示す。ＴＥＮＴ４Ｂ抗体に対する独立した実験は、類似の結果を示した（図８ａ）。
ＴＥＮＴ４募集のメカニズムを説明するために、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてフォルムアルデヒド媒介架橋結合及び免疫沈殿シーケンシング（ｆＣＬＩＰ－ｓｅｑ）を行った（図２）。フォルムアルデヒドベースの架橋は、ＲＮＡ－タンパク質相互作用が一時的で且つ構造依存的である時にも、ＲＮＡ－タンパク質相互作用を効果的で且つ強力にキャプチャーする。正常マウスＩｇＧ（ＮＭＧ）、ＴＥＮＴ４Ａ抗体又はＴＥＮＴ４Ｂ抗体を使用して入力（ｉｎｐｕｔ）溶解物及び免疫沈殿物で４個のライブラリーを製造した。入力及びＮＭＧライブラリーは、背景を推定するためのサイズマッチングされた対照群として用いられた。ＨＢＶゲノムにわたって標準化された判読範囲は、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ抗体の両方を使用してＨＢＶゲノムから実質的に豊富なピークを確認した（図２ａ）が、これは、ＨＢＶ ＲＮＡ上のＴＥＮＴ４の相互作用部位を示す。ＴＥＮＴ４Ｂ抗体に対する独立した実験は、類似の結果を示した（図８ａ）。
【0107】
ＨＢＶ ＲＮＡは、３．２キロベースの円形（ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡゲノムから生成される。５個の重複ウイルス転写体は、共通３’末端配列（～７００塩基対）と単一ポリアデニル化部位を共有する（図２ａ）。ＴＥＮＴ４結合判読値は、１，１５４～１，６８７に達する３’末端領域が豊富である（図２ａ）。この領域は、転写後調節要素（ＰＲＥ）に該当し、ＲＮＡ核放出及び安定化を向上させるものとよく知られている。ＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）のＰＲＥは、異所性遺伝子発現及びレンチウイルス遺伝子伝達を増加させるのに広く用いられてきた。Ｌａ、ＰＴＢ、ＧＡＰＤＨ及びＺＣ３Ｈ１８のようないくつかのＲＮＡ結合タンパク質がＰＲＥと相互作用すると報告されているが、それらの相互作用の機能的重要性は不明である。本発明のｆＣＬＩＰ－ｓｅｑ実験においてＨＢＶのＰＲＥは、ヒト転写体の他の推定されたピーククラスターと比較して最も高い濃縮点数を示した（図２ｂ）。免疫沈殿及び以降の逆転写（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を用いた定量的ＰＣＲによって、ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ及びＨＢＶ ｍＲＮＡ間の相互作用を確認した（図８ｂ）。要するに、これらの結果は、ＨＢＶ ｍＲＮＡがＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてＴＥＮＴ４の主要基質であり、ＴＥＮＴ４がＨＢＶ ｍＲＮＡとＰＲＥ領域を通じて相互作用するということを立証する。
【0108】
＜３．ＨＢＶ ＲＮＡのステムループαは、ＴＥＮＴ４依存的テール調節に必要である。＞
ＴＥＮＴ４によって認識されるｃｉｓ作用ＲＮＡ要素を確認するために、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）においてＰＲＥの異なる下位領域を有するレポーターを生成した（図３ａ）。ＰＲＥは、ＰＲＥα（１１５４－１３５１）とＰＲＥβ（１３５２－１６８７）の２種の下位要素で構成される（図３ａ）。また、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ依存性をテストするために、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂノックアウト（ＫＯ）細胞を生成した（図９ａ）。
ＴＥＮＴ４によって認識されるｃｉｓ作用ＲＮＡ要素を確認するために、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）においてＰＲＥの異なる下位領域を有するレポーターを生成した（図３ａ）。ＰＲＥは、ＰＲＥα（１１５４－１３５１）とＰＲＥβ（１３５２－１６８７）の２種の下位要素で構成される（図３ａ）。また、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ依存性をテストするために、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂノックアウト（ＫＯ）細胞を生成した（図９ａ）。
【0109】
ルシフェラーゼタンパク質及びＲＮＡレベルは、レポーターに完全なＰＲＥ又はＰＲＥαが装着された場合にのみ、ＴＥＮＴ４依存的方式で有意に上向き調節された（図３ｂ及び図９ｂ）。ＴＥＮＴ４が枯渇したヒト胚腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞において類似の結果が得られ（図９ｃ、図９ｄ）、ＰＲＥαがＴＥＮＴ４依存的安定化に必要であるということを確認した。Ｈｉｅｒ－ＰＡＴ分析によるポリ（Ａ）テール長測定の結果、ＴＥＮＴ４枯渇がＰＲＥα構造物においてポリ（Ａ）テールを短縮させたが、ＰＲＥβ構造物ではそうでなかった（図３ｃ）。
【0110】
ＴＥＮＴ４がＰＲＥα－依存的方式でテール変形を通じて直接作用するということを表示す。また、ノックアウト細胞において、タンパク質及びＲＮＡレベルの両方においてＰＲＥ及びＰＲＥαレポーター発現は異所的に（ｅｃｔｏｐｉｃａｌｌｙ）発現したＴＥＮＴ４によってレスキューされた（図３ｄ、図９ｅ及び図９ｆ）。触媒的に非活性である突然変異体が活性を復元できなかった。したがって、ＰＲＥαを含有するｍＲＮＡの上向き調節にはＴＥＮＴ４の触媒活性が必要である。
【0111】
ＰＲＥの機械的な保存を調べるために、ＨＢＶのＰＲＥと同種であるＷＨＶ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）セグメント（ＷＰＲＥ）を使用した（図３ｅ）。ＨＢＶのＰＲＥとは違い、ＷＰＲＥは次の３つの下位要素で構成される：ＷＰＲＥγ、ＷＰＲＥα及びＷＰＲＥβ。ＷＰＲＥα及びＷＰＲＥβは、ＷＨＶとＨＢＶとの間に保存されるのに対し、ＷＰＲＥγは、独特で且つＨＢＶのＰＲＥに比べてＷＰＲＥのより大きい活性を担当するものと考えられる。ＷＰＲＥα（Ｗα）を有する全てのコンストラクトは、ＴＥＮＴ４依存的上向き調節を示した（図３ｆ）が、これは、ＴＥＮＴ４媒介メカニズムはＷＨＶで保存されることを提案する。
【0112】
ＷＰＲＥγ（Ｗγ）とＷＰＲＥα（Ｗα）の組合せは、シナジー効果（図３ｆ）を導出し、これはＷＰＲＥγがＷＨＶのＴＥＮＴ４媒介調節に対するエンハンサーとして作用できることを示唆する。
【0113】
ＰＲＥαにおいて核心モチーフを特定するために追加の点突然変異が導入された（図３ａ）。ＰＲＥαは、Ｌａ結合モチーフ及びステムループアルファ（ＳＬα）を含有し、両方ともＲＮＡ放出及び安定性に必要なものとして報告された。最近の突然変異誘発研究は、ＳＬαのＬａ結合部位及び頂端（ａｐｉｃａｌ）ループ配列がＤＨＱ－１媒介ＨＢＶ遺伝子発現に必須であることを示した。注目すべき点は、ＳＬαは、Ａ螺旋領域が側面にある単一突出Ｇ残基としてＣＮＧＧ（Ｎ）ファミリーループ構造を本質的に採択するＣＡＧＧＵペンタループを含んでいるという点である（図３ｇ、左側）。ＳＬαの構造は、ＷＨＶにおいても進化的に保存されている（図３ｇ、右側）。このような要素がＴＥＮＴ４依存的調節に必要か否かをテストするために、ＳＬαの頂点シーケンスとモチーフを妨害するＰＲＥα突然変異体レポーター（図３ａ）を生成した（図３ｇ、矢印）。Ｌａ結合モチーフ（α ｍｕｔ１）の突然変異誘発は、ＴＥＮＴ４依存性に影響を及ぼさなかったし、ＳＬα突然変異（α ｍｕｔ２）と二重突然変異（α ｍｕｔ３）はＰＲＥα機能を中断させた（図３ｈ）。したがって、ＰＲＥαのステムループ（ＳＬα）は、ＴＥＮＴ４による転写後調節に必須な要素である。
【0114】
＜４．ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７はＴＥＮＴ４依存的調節のための類似のステムループを保有する。＞
ＨＢＶ ｍＲＮＡに加え、ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７（ＶＲＮＡ２．７）は、また、混合されたテーリングを進行する（図１ｂ、図１ｄ及び図７ｂ）。ＴＥＮＴ４Ａ抗体を使用したＲＮＡ免疫沈殿実験に続いてＲＴ－ｑＰＣＲは、ＴＥＮＴ４ＡがＨＥＫ２９３Ｔ細胞において異所的に発現するＲＮＡ２．７と相互作用することを示し（図４ａ及び図１０ａ）、ＴＥＮＴ４ＡとＲＮＡ２．７間の相互作用にウイルス因子が必要でないということを示唆する。ＴＥＮＴ４相互作用を担当するＲＮＡ２．７の機能的ドメインを確認するために、ＲＮＡ２．７の部分的に重なる断片を含むレポーターを生成した（図４ｂ，ＦＲＧ１－６）。初めの２つのレポーター（ＦＲＧ１及びＦＲＧ２）のタンパク質及びＲＮＡレベルは、ＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞と比較して、親細胞において有意に高かった（図４ｃ及び図１０ｂ）。したがって、ｃｉｓ要素は５’末端近傍に存在する。ＦＲＧ１の部分的欠失は、１Ｅ断片（４１４－５１３）のみがＴＥＮＴ４依存的強化効果を付与することが明らかにされた（図４ｄ、図４ｅ、図１０ｃ、及び図１０ｄ）。１Ｅドメインは、ＰＲＥα及びＷＰＲＥαのＳＬαのＣＮＧＧ（Ｎ）ファミリーループ形態と類似のステムループ構造（図４ｂ、右側下端）を保有する（図３ｇ）。１Ｅのステムループに対する点突然変異（１Ｅ ｍｕｔ）は、ＴＥＮＴ４の調節を中断させた（図４ｅ及び図１０ｄ）。ステムループ（以降、Ｌ２．７と称される４１４－４６３）を含む、より小さい５０ｎｔ切断断片は、ＦＲＧ１及び１Ｅと類似の活性を有する（図１０ｅ）。ＨＢＶ ＰＲＥ及びＷＰＲＥのＳＬαは、ＲＮＡの３’末端近傍にあるが、ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７のＳＬ２．７は５’末端近傍にあり、これは、ペンタループが位置独立的方式で機能し得ることを示唆する。
ＨＢＶ ｍＲＮＡに加え、ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７（ＶＲＮＡ２．７）は、また、混合されたテーリングを進行する（図１ｂ、図１ｄ及び図７ｂ）。ＴＥＮＴ４Ａ抗体を使用したＲＮＡ免疫沈殿実験に続いてＲＴ－ｑＰＣＲは、ＴＥＮＴ４ＡがＨＥＫ２９３Ｔ細胞において異所的に発現するＲＮＡ２．７と相互作用することを示し（図４ａ及び図１０ａ）、ＴＥＮＴ４ＡとＲＮＡ２．７間の相互作用にウイルス因子が必要でないということを示唆する。ＴＥＮＴ４相互作用を担当するＲＮＡ２．７の機能的ドメインを確認するために、ＲＮＡ２．７の部分的に重なる断片を含むレポーターを生成した（図４ｂ，ＦＲＧ１－６）。初めの２つのレポーター（ＦＲＧ１及びＦＲＧ２）のタンパク質及びＲＮＡレベルは、ＴＥＮＴ４ ＫＯ細胞と比較して、親細胞において有意に高かった（図４ｃ及び図１０ｂ）。したがって、ｃｉｓ要素は５’末端近傍に存在する。ＦＲＧ１の部分的欠失は、１Ｅ断片（４１４－５１３）のみがＴＥＮＴ４依存的強化効果を付与することが明らかにされた（図４ｄ、図４ｅ、図１０ｃ、及び図１０ｄ）。１Ｅドメインは、ＰＲＥα及びＷＰＲＥαのＳＬαのＣＮＧＧ（Ｎ）ファミリーループ形態と類似のステムループ構造（図４ｂ、右側下端）を保有する（図３ｇ）。１Ｅのステムループに対する点突然変異（１Ｅ ｍｕｔ）は、ＴＥＮＴ４の調節を中断させた（図４ｅ及び図１０ｄ）。ステムループ（以降、Ｌ２．７と称される４１４－４６３）を含む、より小さい５０ｎｔ切断断片は、ＦＲＧ１及び１Ｅと類似の活性を有する（図１０ｅ）。ＨＢＶ ＰＲＥ及びＷＰＲＥのＳＬαは、ＲＮＡの３’末端近傍にあるが、ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７のＳＬ２．７は５’末端近傍にあり、これは、ペンタループが位置独立的方式で機能し得ることを示唆する。
【0115】
要するに、本発明は、ＴＥＮＴ４依存的調節におけるＳＬα類似構造の機能的重要性を立証する。
【0116】
＜５．細胞質ＺＣＣＨＣ１４はステムループ構造に結合し、ＴＥＮＴ４と相互作用する。＞
ＣＮＧＧＮペンタループは、初めに酵母Ｖｔｓ１ｐの滅菌アルファモチーフ（ＳＡＭ）ドメインに結合するＳｍａｕｇ認識要素として特性化されたし、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｍａｕｇは転写後抑制を仲裁する［３２－３６］。Ｓｃｈｗａｌｂｅらは、構造的類似性に基づいてＨＢＶ ＳＬαペンタループがＳＡＭドメインとタンパク質の結合部位の役割を担うことができると提案した。しかし、ＴＥＮＴ４はＳＡＭドメイン［３１］を含有しなく、組換えＴＥＮＴ４を使用した我らのテーリング分析は、ＰＲＥ－インビトロに対する注目すべき親和力を検出できなかったが、これはＲＮＡ相互作用補助因子を示す。
ＣＮＧＧＮペンタループは、初めに酵母Ｖｔｓ１ｐの滅菌アルファモチーフ（ＳＡＭ）ドメインに結合するＳｍａｕｇ認識要素として特性化されたし、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｍａｕｇは転写後抑制を仲裁する［３２－３６］。Ｓｃｈｗａｌｂｅらは、構造的類似性に基づいてＨＢＶ ＳＬαペンタループがＳＡＭドメインとタンパク質の結合部位の役割を担うことができると提案した。しかし、ＴＥＮＴ４はＳＡＭドメイン［３１］を含有しなく、組換えＴＥＮＴ４を使用した我らのテーリング分析は、ＰＲＥ－インビトロに対する注目すべき親和力を検出できなかったが、これはＲＮＡ相互作用補助因子を示す。
【0117】
ＳＬα及びＳＬ２．７を認識する潜在的な補助因子を探すために、ビオチン化された合成ＳＬ２．７及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出物でＲＮＡプルダウンを行った（図５ａ）。ループ突然変異体を陰性対照群とした。質量分析法は、顕著に濃縮された６個のタンパク質、すなわち、ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ、Ｋ０３５５、ＳＡＭＤ４Ａ、ＳＡＭＤ４Ｂ及びＺＣＣＨＣ１４を示した（図５ａ）。特に、Ｓｍａｕｇ類似ＳＡＭドメインを有する３種のヒトタンパク質がこの目録に含まれている：Ｓｍａｕｇの２個の相同体（ＳＡＭＤ４Ａ及びＳＡＭＤ４Ｂ）及びＺＣＣＨＣ１４（図５ｂ）。ＺＣＣＨＣ１４の特異的濃縮はＲＮＡプルダウン及びウェスタンブロッティングによりさらに確認された（図５ｃ）。Ｋ０３５５（又はＫＩＡＡ０３５５）にはＳＡＭドメインがなく、ＳＡＭＤ４Ｂ３７と相互作用することが報告され、Ｋ０３５５がペンタループと直接相互作用しなく済むことを示す。どのＳＡＭドメインタンパク質がＴＥＮＴ４依存的調節を担当するかを確認するために、ＨＢＶ生成ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を再検討した。ＺＣＣＨＣ１４のノックダウンは、ＳＡＭＤ４タンパク質のノックダウンにおいてＨＢＶ ＲＮＡレベルを減少させなかった（図５ｄ及び図１１）。一様に、最近、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＺＣＣＨＣ１４をＨＢＶの表面抗原生産のための必須宿主因子として報告した。
【0118】
ＺＣＣＨＣ１４の作用メカニズムを理解するために、ＺＣＣＨＣ１４枯渇したＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験を行った。ＨＢＶ ｍＲＮＡのグアニル化頻度が減少し（図６ａ）、ポリ（Ａ）テールはＺＣＣＨＣ１４ノックダウンにおいて実質的に短縮され（図６ｂ）、ＨＢＶ ＲＮＡ混合されたテールにおいてＺＣＣＨＣ１４の重要な役割を立証した。一様に、ＺＣＣＨＣ１４枯渇は、ＣＮＧＧＮステムループ（ＲＮＡ２．７ １Ｅ、ＰＲＥα、Ｗγ＋Ｗα）を保有しているレポーターからルシフェラーゼ発現を減少させた（図６ｃ）。対照的に、それぞれのペンタループ突然変異体（１Ｅ ｍｕｔ、α ｍｕｔ２、Ｗγ＋Ｗα ｍｕｔ）は、ＺＣＣＨＣ１４ノックダウン後に有意の変化を示さず（Ｐ＞０．０５；両側学生のｔ検定）（図６ｃ）、これは、ＺＣＣＨＣ１４の機能がＣＮＧＧＮモチーフに依存するということを示す。本発明者らは、また、Ｈｉｒｅ－ＰＡＴ分析を行い、レポーターｍＲＮＡｓのポリ（Ａ）テール長がＣＮＧＧＮモチーフ依存した方式でＺＣＣＨＣ１４枯渇細胞において減少することを確認した（図１２ａ～図１２ｃ）。
【0119】
ＺＣＣＨＣ１４抗体を使用したＲＮＡ免疫沈殿は、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてＺＣＣＨＣ１４とＨＢＶ転写体間の相互作用を裏付けた（図６ｄ及び図１２ｄ）。さらに、ＨｅｐＧ２．２．１５及びプライマリＨＦＦ細胞の両方において、ＺＣＣＨＣ１４はＲＮａｓｅ処理に関係なくＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂと共同免疫沈殿され（図１２ｅ）、これは、ＺＣＣＨＣ１４とＴＥＮＴ４間のＲＮＡ非依存的相互作用を示す。最後に、本発明者らは、ＺＣＣＨＣ１４が主として細胞質に限定され（図６ｅ）、ＺＣＣＨＣ１４がＨｅＬａＴ細胞の細胞質分画を使用してＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂと共同免疫沈殿するということを発見した（図６ｆ）。要するに、本発明は、ＺＣＣＨＣ１４が主に細胞質においてＴＥＮＴ４と相互作用してデアデニル化からＳＬα類似要素を含むウイルス転写体を不注意して保護することを示す。
【0120】
本発明者らは、ウイルス性遺伝子発現においてターゲッティングされ混合されたテーリングのメカニズムを明らかにした（図６ｇ）。ＨＢＶ ｍＲＮＡ及びＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７は、ＺＣＣＨＣ１４及びＴＥＮＴ４を募集するのに重要なＣＮＧＧＮペンタループと共にｃｉｓ作用要素を含む。ＴＥＮＴ４による混合テールは、ＣＮＯＴデアデニラーゼ複合体に対抗してウイルスＲＮＡを保護する。極めて異なる寿命周期と組織特異性を有するこれら２つの別個のウイルス（ヘパドナウイルス科に属するウイルスとヘルペスウイルス科に属するウイルス）は、遺伝子発現の利点のための同一戦略を提示したことが興味深い。このような収斂進化とこのｃｉｓ作用要素の単純性は、このメカニズムが別のウイルスにおいても利用可能であることを示唆する。
【0121】
混合されたテーリング作動方式の他に、ＴＥＮＴ４Ｂは、核ＴＲＡＭＰ複合体（酵母においてＴｒｆ４－Ａｉｒ１／２－Ｍｔｒ４及びヒトにおいてＴＥＮＴ４Ｂ－ＺＣＣＨＣ７－ｈＭＴＲ４）の成分として作用し、異常転写体の分解又は切断及び成熟に関与するか、核におけるスモールノンコーディングＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ）のトリミング及び成熟に関与する［５，３９－４３］。本発明者らは、混合テーリングがＴＲＡＭＰコンプレックスと区別されるモジュールとしてｍＲＮＡ安定性に寄与するということを、以前に示した。ｈＭＴＲ４及びＺＣＣＨＣ７のノックダウンがＨＢＶタンパク質及びｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさないということを考慮すれば、ＴＥＮＴ４はＨＢＶ調節においてＴＲＡＭＰ複合体と独立して作用するものと考えられる。ＺＣＣＨＣ１４の細胞質局在化（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、また、ＴＥＮＴ４－ＺＣＣＨＣ１４複合体が核ＴＲＡＭＰ複合体と別個のサブセルラー区画において作動するということを示唆するが、たとえＴＥＮＴ４－ＺＣＣＨＣ１４複合体のマイナーフラクションが核において作動する可能性を排除しない。
【0122】
混合されたテーリングは、ＨＢＶ遺伝子発現に特に重要であると考えられる。５つのｍＲＮＡ種のうち４種（Ｘ以外のｐｇＲＮＡ、Ｐｒｅｃｏｒｅ、ＰｒｅＳ１及びＰｒｅＳ２／Ｓ）は、ＳＬαステムループを含み、ＴＥＮＴ４酵素が枯渇すれば半減期が実質的に減少する。現在の治療オプションにはｎｕｃｌｅｏｓ（ｔ）ｉｄｅ類似体とインターフェロンアルファが含まれるが、治療効果が少なく、しばしば非効率的であるため、ＨＢＶ感染は毎年全世界的に約８千万人が死亡する主要医療負担として残っている。ウイルス性タンパク質、特に、免疫回避を誘導するウイルス性Ｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）の生産を遮断することによって機能的治療を達成することができる。ウイルス性混合テールの発見及びウイルス遺伝子発現にＴＥＮＴ４及びＺＣＣＨＣ１４の関与は、新しい部類の抗ＨＢＶ薬物の発達に対するメカニズム的な洞察力を提供することができる。ＴＥＮＴ４作動方式をターゲッティングする潜在的副作用を避けるために、ＴＥＮＴ４タンパク質とそのパートナーの内因性機能と作用メカニズムを理解することが重要である。
【0123】
ＣＮＧＧＮペンタループとＲＮＡ結合ＳＡＭタンパク質間の物理的相互作用は、高度に保存され広く使用される機能的モジュールであると確認された。ミバエ（ｆｒｕｉｔ ｆｌｙ）おいてＳｍａｕｇはｎａｎｏｓ ｍＲＮＡのＣＵＧＧＣループでヘアピンを認識して適時のｍＲＮＡ分解を誘導する。これは、前後軸（ａｎｔｅｒｉｏｒ－ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉｓ）の設定に必須である。酵母において、Ｖｔｓ１ｐは、標的化されたｍＲＮＡ分解のためにＣＮＧＧ（Ｎ）ペンタループを有するｍＲＮＡに結合する。脊椎動物は、３個のＲＮＡ結合ＳＡＭタンパク質を有し、この相互作用モジュールの使用を拡張したものと見なされる。Ｓｍａｕｇの脊椎動物オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）の一つであるＳＡＭＤ４Ｂは、ｎａｎｏｓ１ ｍＲＮＡを標的とし、哺乳類神経発達過程において必須である。Ｓｍａｕｇの他の脊椎動物オルソログであるＳＡＭＤ４Ａは、ペンタループ含有レポーターの翻訳を抑制し、細胞質病巣の形成と関連がある。ここで、本発明者らは、同一のメカニズムを、特にウイルス性ＲＮＡの利益のために、脊椎動物特異的タンパク質ＺＣＣＨＣ１４を通じて反対目的に利用可能であることを示した。
【図面の簡単な説明】
【0124】
【図1】ウイルスＲＮＡの広範囲な混合されたテールを示す。
【図2】ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢＶのＰＲＥを通じたＴＥＮＴ４の主要ｍＲＮＡ基質であることを裏付ける実験結果を示す。
【図3】ＰＲＥのステムループ構造は必須であるが、ＨＢＶ ｍＲＮＡのＴＥＮＴ４－依存性ＲＮＡテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）には十分でないことを示す図である。
【図4】ＨＣＭＶ ＲＮＡ２．７のステムループ構造は、ＴＥＮＴ４依存的調節の原因となるｃｉｓ－作用（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ）ＲＮＡ要素であることを示す図である。
【図5】ＺＣＣＨＣ１４を含む、ＳＡＭドメイン含有タンパク質は、ステムループ構造に結合し、ＨＢＶ ｍＲＮＡを調節するということを示す図である。
【図6】細胞質ＺＣＣＨＣ１４は、ステムループ構造でＲＮＡを保護するためにＴＥＮＴ４を募集（ｒｅｃｒｕｉｔ）することを示す図である。
【図7】ウイルスＲＮＡの広範囲な３’末端テール（３’ ｅｎｄ ｔａｉｌ）変形を示す図である。
【図8】ＴＥＮＴ４Ａ／Ｂ及びＨＢＶ ｍＲＮＡ相互作用の分析及び確認結果を示す図である。
【図9】ＰＲＥレポーターのＴＥＮＴ４依存的調節を確認した結果を示す図である。
【図10】ＲＮＡ２．７レポーターのＴＥＮＴ４依存的調節の確認結果を示す。
【図11】ＺＣＣＨＣ１４及びＳＡＭＤ４Ａ／Ｂノックダウンを確認した図である。
【図12】ＺＣＣＨＣ１４ノックダウン、ステムループ依存的テール調節、及び免疫沈殿の確認結果を示す図である。
【図13】ペンタループを含むステムループ（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）構造を示す。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図1g】
【図1h】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図3g】
【図3h】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図4e】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図6e】
【図6f】
【図6g】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図7f】
【図7g】
【図7h】
【図7i】
【図7j】
【図7k】
【図7l】
【図7m】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図9e】
【図9f】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図10e】
【図11】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図12d】
【図12e】
【図13】
【配列表】