特許 7404068 レバウジオシドの高効率の産生のためのＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-15

(45)【発行日】2023-12-25

(54)【発明の名称】レバウジオシドの高効率の産生のためのＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20231218BHJP

   A23L 27/00 20160101ALI20231218BHJP

   A23L 27/20 20160101ALI20231218BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20231218BHJP

   C12P 19/04 20060101ALI20231218BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54

A23L27/00 F

A23L27/20 E

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N9/10

C12P19/04 Z

【請求項の数】 27

(21)【出願番号】P 2019507224

(86)(22)【出願日】2017-08-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-09-05

(86)【国際出願番号】 US2017046637

(87)【国際公開番号】W WO2018031955

(87)【国際公開日】2018-02-15

【審査請求日】2020-08-06

【審判番号】

【審判請求日】2022-06-17

(31)【優先権主張番号】62/374,408

(32)【優先日】2016-08-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審理対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】511289736

【氏名又は名称】アミリス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ジャオ，リシャン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ウェンゾン

(72)【発明者】

【氏名】ウィックマン，ゲイル

(72)【発明者】

【氏名】カーンコージ，アディティ

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア デ ゴンザロ，シャンタル

(72)【発明者】

【氏名】マハデジュクル－メドーズ，ティナ

(72)【発明者】

【氏名】ジャクソン，シャイナ

(72)【発明者】

【氏名】リーヴェル，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】プラット，ダレン

【合議体】

【審判長】福井 悟

【審判官】鶴 剛史

【審判官】田中 耕一郎

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０７３７４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５２４２４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ： Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ ＵＤＰ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９１Ａ１－ｌｉｋｅ （ＬＯＣ１０１７８２５２７）， ｍＲＮＡ ［３０－ＮＯＶ－２０１５］ Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ ［ｏｎｌｉｎｅ］ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＸＭ＿００４９８２００２．３ ［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｏｎ ０１ Ｊｕｎ ２０２１］ ＵＲＬ：［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／９５５７２３８７１？ｓａｔ＝４６＆ｓａｔｋｅｙ＝８２５４７７２３］

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N15/00-15/90

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１または配列番号１１と、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む遺伝子改変された宿主細胞であって、
９０％、９５％、９６％、または９７％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である、遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項2】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１の配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項3】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、ステビオール配糖体の１９－ＯグルコースのＣ２’位をベータ１，２グリコシル化することが可能である、請求項１または２に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項4】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、異種核酸によってコードされ、異種核酸は、配列番号１３と、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項5】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１３の配列を有する異種核酸によってコードされる、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項6】

９０％、９５％、９６％、または９７％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能であり、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項7】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１の機能性ドメインと、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有する機能性ドメインを有するポリペプチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項8】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１の糖アクセプタードメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項9】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、糖アクセプタードメインを含み、糖アクセプタードメインのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号１１の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項10】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、
（ａ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ１のアミノ酸配列、配列番号２８の配列、またはバリアントループ１のアミノ酸配列；
（ｂ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ２のアミノ酸配列、またはバリアントループ２のアミノ酸配列；
（ｃ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ３＿１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ３＿１のアミノ酸配列、またはバリアントループ３＿１のアミノ酸配列；
（ｄ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ３＿２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ３＿２のアミノ酸配列、またはバリアントループ３＿２のアミノ酸配列；
（ｅ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ４＿１の箇所に対応する箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列、またはバリアントループ４＿１のアミノ酸配列；
（ｆ）それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿２の箇所に対応する箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ４＿２のアミノ酸配列；または
（ｇ）（ａ）から（ｆ）の任意の組合せ
を含む、請求項９に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項11】

バリアントループ１のアミノ酸配列、バリアントループ２のアミノ酸配列、バリアントループ３＿１のアミノ酸配列、バリアントループ３＿２のアミノ酸配列、およびバリアントループ４＿１のアミノ酸配列のいずれかが、配列番号１または配列番号１１と異なる別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのそれらそれぞれの対応するループ箇所から得られ、別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号１または配列番号１１と、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項12】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、
（ａ）配列番号１または配列番号１１の糖アクセプタードメインと、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの糖アクセプタードメイン；および
（ｂ）それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿１の箇所に対応する別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列
を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項13】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１と、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿１の箇所に対応する箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項14】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸残基：
（ａ）配列番号１１のアミノ酸位置１１に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸位置１２に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるイソロイシン；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸位置５５に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるプロリン；
（ｄ）配列番号１１のアミノ酸位置９０に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるグルタミン酸；
（ｅ）配列番号１１のアミノ酸位置２０３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるセリン；
（ｆ）配列番号１１のアミノ酸位置２２３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるグルタミン酸；または
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸位置４１３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン
の１つまたは複数を含み、配列番号１１のアミノ酸位置に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置は、配列アライメントによって決定される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項15】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号２４を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項16】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、糖ドナードメインを含み、糖ドナードメインは、配列番号１または配列番号１１の糖ドナードメインのアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項17】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１と、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項18】

ＲｅｂＭを産生することが可能である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項19】

ステビオールを生成するための経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項20】

ステビオール配糖体を生成するための経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項21】

前記経路の１つまたは複数の酵素が、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ｅｎｔ－カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、およびＵＧＴ９１Ｄを含む、請求項１９または２０に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項22】

細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項23】

真菌細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２２に記載の遺伝子改変された宿主細胞。

【請求項24】

ＲｅｂＭを産生するための方法であって、
（ａ）ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、請求項１～２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および
（ｂ）培地から前記ＲｅｂＭ化合物を回収すること
を含む方法。

【請求項25】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞、および当該宿主細胞によって産生されたステビオール配糖体を含む発酵組成物であって、ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭを、１：７：５０～１：１００：１０００のＲｅｂＡ：ＲｅｂＤ：ＲｅｂＭの比率で含む、発酵組成物。

【請求項26】

配列番号１または配列番号１１と、少なくとも９０％、９５％の配列同一性を有する、天然に存在しないＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼであって、宿主細胞において、９０％、９５％、９６％、または９７％より高い効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能な天然に存在しないＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ。

【請求項27】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸残基：
（ａ）配列番号１１のアミノ酸位置１１に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸位置１２に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるイソロイシン；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸位置５５に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるプロリン；
（ｄ）配列番号１１のアミノ酸位置９０に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるグルタミン酸；
（ｅ）配列番号１１のアミノ酸位置２０３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるセリン；
（ｆ）配列番号１１のアミノ酸位置２２３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるグルタミン酸；または
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸位置４１３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン
の１つまたは複数を含み、配列番号１１のアミノ酸位置に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置は、配列アライメントによって決定される、請求項２６に記載の天然に存在しないＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１．関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、２０１６年８月１２日付けで出願された米国仮出願第６２／３７４，４０８号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0002】

２．発明の分野
[0002] 本発明の開示は、ある特定のウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（UGT）、それを含む組成物、それを含む宿主細胞、ならびにレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭなどのレバウジオシドの産生のためのそれらの使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

３．背景
[0003] 糖の高摂取の悪影響（例えば、糖尿病および肥満症）を制限するためには、自然源由来のゼロカロリー甘味料が望ましい。レバウジオシドＭ（RebM）は、ステビア植物（Stevia rebaudiana Bertoni）によって産生された多くの甘味化合物の１つである。全てのレバウジオシドのなかでも、ＲｅｂＭは、最大の効力を有し（スクロースより約２００～３００倍甘い）、最もすっきりとした味である。しかしながら、ＲｅｂＭは、ステビア植物からわずかな量しか産生されず、その割合は、全ステビオール配糖体含量のうちごくわずかである（＜１．０％）。Ｏｈｔａら、２０１０、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．、５７、１９９～２０９（２０１０）。したがって、大量かつ高純度での産生を可能にする生物工学的な経路を使用してＲｅｂＭを産生することが望ましい。

【0004】

[0004] 生物工学を使用して生成物を経済的に産生するために、供給材料からの生成物への生物変換反応における各工程が、高い変換効率（理想的には＞９０％）を有することが有利である。ＲｅｂＭを産生させるための酵母の操作において、最後から２番目の生合成工程、すなわちレバウジオシドＡ（RebA）からレバウジオシドＤ（RebD）への変換が律速になっていることが明らかになった。図１Ａを参照されたい。生来的な酵素（Ono、ＥＰ２８２６８６１Ａ１、UGT91D_like3、または近い相同体）は、ＲｅｂＡの約３％をＲｅｂＤに変換することが観察された。２つの他のＵＧＴ酵素も、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能なことが確認されている。一方は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１であり（Houghton-Larsenら、ＷＯ２０１３／０２２９８９Ａ２ではEUGT11とも称される）、他方は、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来のＳｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１である（Markosyanら、ＷＯ２０１４／１９３８８８Ａ１ではUGTSL2とも称される）。しかしながら、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１およびＳｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１はどちらも、それぞれ約５３％および７０％の、望ましい変換効率より低い変換効率を有することが本発明者らによって初期に観察された。これらの酵素のうち３つ全て、すなわちＵＧＴ９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１、およびＳＬ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１は、ベータ（１→２）連結の形成を介してグルコース部分を１９－Ｏ－グルコース残基のＣ－２’位に転移するウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（UGT）である（図１Ａ）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

[0005] ＲｅｂＭを効率的に高い純度で産生するために、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに高効率で変換することが可能な改善された酵素が必要である。本明細書で提供される組成物および方法は、この必要性に取り組み、同様に関連する利点を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

４．発明の要約
[0006] 改善されたＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換のための、さらに、改善されたＲｅｂＤおよび／またはＲｅｂＭ産生のための、組成物および方法が本明細書で提供される。これらの組成物および方法は、ある特定のウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（UGT）が顕著に高い効率でＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換できるという驚くべき発見に一部基づく。新しいＵＧＴによる株性能の改善がそれほど大きくなくても（例えば１０パーセント）、ＲｅｂＭに対する市場の需要が年間５０億トンであると仮定すれば、将来的に生産コストを、１０００万ドルを超えて節約する可能性がある。

【0007】

[0007] 本明細書に記載されるある特定のＵＧＴはまた、ＲｅｂＭ２副産物（すなわちRebMの異性体）などの非天然配糖体をほとんどまたは全く伴わずにＲｅｂＭを産生することも可能である。現在公知のステビア配糖体の列挙については、Ｃｅｕｎｅｎ Ｓ．ら、Ｓｔｅｖｉｏｌ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．、７６、１２０１～１２２８（２０１３）を参照されたい。したがって、ある特定の実施態様において、本明細書に記載される組成物および方法は、高い純度のＲｅｂＭを含む組成物を得るための下流処理のコストを低減することができる。

【0008】

[0008] また、これまでに公知のＵＧＴとは異なる基質特異性でステビオール配糖体を産生することが可能な代替酵素に関する組成物および方法も本明細書で提供される。新しい代替酵素は、他の公知の酵素によって産生されたものと比較して異なるステビオール配糖体の混合物または比率を産生する可能性を有する。ステビオール配糖体の異なる混合物または比率を有する組成物は、様々な消費製品または食品の配合において有用であり得る代替の甘味プロファイルを付与する可能性がある。

【0009】

[0009] したがって、工業的に有用な化合物を産生するための、遺伝子改変された宿主細胞およびその使用方法が本明細書で提供される。一態様において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（UGT40087、これは、Si_UGT_40087とも称される）をコードする異種核酸を含む遺伝子改変された宿主細胞が本明細書で提供される。一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体を産生することが可能な１つまたは複数の酵素経路をさらに含む。

【0010】

[0010] ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７（例えば、配列番号１または配列番号１１）の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む遺伝子改変された宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、９０％、９５％、９６％、または９７％より高い効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、糖アクセプタードメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含み、糖アクセプタードメインのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号１１の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ループ１のアミノ酸配列、バリアントループ１のアミノ酸配列、ループ２のアミノ酸配列、バリアントループ２のアミノ酸配列、ループ３＿１のアミノ酸配列、バリアントループ３＿１のアミノ酸配列、ループ３＿２のアミノ酸配列、バリアントループ３＿２のアミノ酸配列、ループ４＿１のアミノ酸配列、バリアントループ４＿１のアミノ酸配列、ループ４＿２のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、配列番号１または配列番号１１の糖アクセプタードメインと、少なくとも６１％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列をさらに含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む。

【0011】

[0011] ある特定の実施形態において、配列番号２、５、または６の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む遺伝子改変された宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、または９７％より高い効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、糖アクセプタードメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含み、糖アクセプタードメインのアミノ酸配列は、配列番号２、５、または６の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ループ１のアミノ酸配列、バリアントループ１のアミノ酸配列、ループ２のアミノ酸配列、バリアントループ２のアミノ酸配列、ループ３＿１のアミノ酸配列、バリアントループ３＿１のアミノ酸配列、ループ３＿２のアミノ酸配列、バリアントループ３＿２のアミノ酸配列、ループ４＿１のアミノ酸配列、バリアントループ４＿１のアミノ酸配列、ループ４＿２のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、配列番号２、５、または６の糖アクセプタードメインと、少なくとも６１％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含み、配列番号２、５、または６のループ４＿１のアミノ酸配列をさらに含む。

【0012】

[0012] 別の態様において、異種ステビオール配糖体を産生するための方法であって、前記ステビオール配糖体化合物の生成に好適な条件下で、本明細書に記載されるステビオール配糖体を産生することが可能な本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ステビオール配糖体を回収することを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種ステビオール配糖体は、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭからなる群から選択される。

【0013】

[0013] 別の態様において、宿主細胞におけるステビオール配糖体化合物の産生を増加させるための方法であって、宿主細胞中で、ＵＧＴ４００８７をコードする異種核酸を発現させること；およびステビオール配糖体の産生に好適な条件下で、宿主細胞を培養することを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＵＧＴ９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３酵素、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１酵素、またはＳｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１酵素を含まない。

【0014】

[0014] 別の態様において、ＲｅｂＤを産生するための方法であって、前記ＲｅｂＤの生成に好適な条件下で、本明細書に記載されるＲｅｂＤを産生することが可能な本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ＲｅｂＤを回収することを含む方法が本明細書で提供される。

【0015】

[0015] 別の態様において、ＲｅｂＭを産生するための方法であって、前記ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、本明細書に記載されるＲｅｂＭを産生することが可能な本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ＲｅｂＭを回収することを含む方法が本明細書で提供される。

【0016】

[0016] 別の態様において、ＲｅｂＤを産生するための方法であって、ＲｅｂＤを形成するのに好適な条件下で、ＲｅｂＡを、グルコース、およびＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能な本明細書に記載されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼと接触させることを含む方法が本明細書で提供される。

【0017】

[0017] 別の態様において、ＲｅｂＭを産生するための方法であって、ＲｅｂＤを形成するのに好適な条件下で、ＲｅｂＡを、グルコース、およびＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能な本明細書に記載されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼと接触させ、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することが可能な本明細書に記載されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼと接触させることを含む方法が本明細書で提供される。

【0018】

[0018] 一部の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態において、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭを高効率で産生する。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＵＧＴ４００８７酵素を含まない酵母細胞と比較して、増加した量のＲｅｂＤまたはＲｅｂＭを産生する。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＵＧＴ４００８７酵素を含まない酵母細胞と比較して、ＲｅｂＭ２に対して増加した量のＲｅｂＭを産生する。

【0019】

[0019] 別の態様において、本明細書で提供される他のＵＤＧ－グリコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ４００８７に加えて、またはその代わりに使用することができる。これらの例としては、例えば、ｓｒ．ＵＧＴ＿９２５２７７８、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０、およびＯｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅが挙げられる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A】[0020]ＲｅｂＡからＲｅｂＤからＲｅｂＭへの変換の概略図を提供する図である。

【図1B】[0021]ＲｅｂＭ２の構造を提供する図である。

【図1C】[0022]メバロン酸経路の概略図を提供する図である。

【図2A】[0023]ファルネシルピロリン酸（FPP）からステビオールへの例示的な経路を提供する図である。

【図2B-1】[0024]ステビオールからＲｅｂＭへの例示的な経路を提供する図である。

【図2B-2】図２Ｂ－１の続きである。

【図2C】[0025]ＲｅｂＭの酵素による産生に関する例示的な経路を提供する。

【図3】[0026]Ｒｅｂ（Ｄ＋Ｍ）のマイクロモル／Ｒｅｂ（Ａ＋Ｄ＋Ｍ）のマイクロモルによって測定した場合の、インビボにおけるＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換の比率を提供する図である。親対照株は、標識された９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３（Stevia rebaudiana由来；この株は、空のランディングパッドに加えて、ＵＧＴ：８５Ｃ２、７４Ｇ１、９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３、および７６Ｇ１のみを含有する。９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３のＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換は極めて低い（約３％、表５を参照）ことに留意する。各ＵＧＴ酵素の単一のコピーを親対照株に挿入し、改善されたＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換に関してスクリーニングした。６つのＵＧＴ酵素では、以前の公知の酵素であるＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１およびＳｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１と少なくとも同等であるかまたはそれより優れたＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換が起きることが示される。３つのＵＧＴ酵素（Si_UGT_40087、Ob_UGT91B1_like、およびHv_UGT_V1は、RebAをRebDに変換することにおいて、これまでに同定されたＵＧＴ酵素の両方より優れている。エラーバーは、標準誤差である。

【図4】[0027]酵母におけるＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換に関してスクリーニングするための、個々のＵＧＴ酵素を挿入するのに使用される「ランディングパッド」設計の概略図を提供する図である。

【図5A-1】[0028]図５Ａ～Ｈは、表５および図３に記載のデータを作成するのに使用された、各ＵＧＴ遺伝子のインビボで産生されたＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＭ２のクロマトグラムを例示する。ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、およびＲｅｂＭ２に関連するピークを示すクロマトグラムピークが選択される。各図は、信頼できる標準、対照親株Ｙ３１０６２、および追加のＵＧＴ酵素を用いたＹ３１０６２の保持時間対強度％を示す。Ｙ３１０６２は親対照株であり、空のランディングパッドと共に、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３、およびＵＧＴ７６Ｇ１を含有する。図５Ａ：Ｓｉ＿ＵＧＴ＿４００８７に関するデータを示す図である。この図はまた、ＲｅｂＥの信頼できる標準であるクロマトグラムも包含する。

【図5A-2】図５Ａ－１の続きである。

【図5B】Ｏｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅに関するデータを示す図である。

【図5C】Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１に関するデータを示す図である。

【図5D-1】Ｓｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１に関するデータを示す図である。

【図5D-2】図５Ｄ－１の続きである。

【図5E】ＵＧＴ＿ｇ２５２７７８に関するデータを示す図である。

【図5F】Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１に関するデータを示す図である。

【図5G】Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０に関するデータを示す図である。

【図5H】Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０に関するデータを示す図である。

【図5I】このピークがＲｅｂＥであることを確認するための信頼できる標準に対するＳｉ＿ＵＧＴ＿４００８７のちょうどＲｅｂＥピークの部分のクロマトグラムの拡大図を示す図である。

【図6】[0029]ＵＧＴ４００８７構造の相同性モデルを例示する図である。そのＮおよびＣ末端ドメインは、薄いおよび暗い灰色で示され、ループ交換実験に使用される４つのループも構造上に標識される。

【図7】[0030]ＵＧＴドメイン交換コンストラクトの概略図を例示する図である。

【図8】[0031]４つのＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（UGT40087（配列番号１）；Os_UGT_91C1（配列番号８）；91Dlike3（配列番号７）；Si91Dlike（配列番号１２））の配列アライメントを例示する図である。

【図9A】[0032]親対照細胞（UGT74G1、UT85C2、UGT76G1、およびUGT91D_like3を含む）のインビボで産生されたステビオール配糖体のクロマトグラムを例示する図である。

【図9B】ＵＧＴ４００８７を含む親対照株のインビボで産生されたステビオール配糖体のクロマトグラムを例示する。

【図9C】Ｏｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅを含む親対照株のインビボで産生されたステビオール配糖体のクロマトグラムを例示する。

【発明を実施するための形態】

【0021】

６．実施形態の詳細な説明
６．１ 用語
[0033] 本明細書で使用される場合、用語「異種」は、通常は天然に見出されないものを指す。用語「異種ヌクレオチド配列」は、所与の細胞において通常は天然に見出されないヌクレオチド配列を指す。したがって、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞にとって外来であるもの（すなわち細胞にとって「外因性」であるもの）であってもよいし；（ｂ）宿主細胞において天然に見出されるもの（すなわち「内因性」）であるが細胞中に天然にはない量で（すなわち、宿主細胞において天然に見出される量より多いまたは少ない量で）存在していてもよいし；または（ｃ）宿主細胞において天然に見出されるが、その天然の遺伝子座の外側に位置するものであってもよい。用語「異種酵素」は、所与の細胞において通常は天然に見出されない酵素を指す。この用語は、（ａ）所与の細胞にとって外因性である酵素（すなわち、宿主細胞において天然に存在しないかまたは宿主細胞中の所与のコンテクストにおいて天然に存在しないヌクレオチド配列によってコードされる酵素）；および（ｂ）宿主細胞において天然に見出されるが（例えば、酵素が細胞にとって内因性のヌクレオチド配列によってコードされる）、宿主細胞において天然にはない量（例えば、天然に見出される量より多いまたは少ない量）で産生される酵素を包含する。

【0022】

[0034] 一方で、用語「生来的な」または「内因性」は、本明細書において分子、特定には酵素および核酸に対して使用される場合、その起源になっているかまたはそれが天然に見出される生物で発現される分子を示し、その発現レベルが、生来的な微生物におけるその分子の発現レベルより低いか、それに等しいか、またはそれより高いものであり得るかどうかとは無関係である。組換え微生物では、生来的な酵素またはポリヌクレオチドの発現が改変される場合があることが理解される。

【0023】

[0035] 本明細書で使用される場合、用語「親細胞」は、本明細書で開示された遺伝子改変された宿主細胞と同一な遺伝的背景を有する細胞であるが、ただし、改変された宿主細胞に操作された１つまたは複数の特定の遺伝学的改変、例えば、ステビオール経路の酵素の異種発現、ステビオール配糖体経路の酵素の異種発現、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼの異種発現、コパリル二リン酸シンターゼの異種発現、カウレンシンターゼの異種発現、カウレンオキシダーゼの異種発現、ステビオールシンターゼ（カウレン酸ヒドロキシラーゼ）の異種発現、シトクロムＰ４５０レダクターゼの異種発現、ＵＧＴ７４Ｇ１の異種発現、ＵＧＴ７６Ｇ１の異種発現、ＵＧＴ８５Ｃ２の異種発現、ＵＧＴ９１Ｄの異種発現、およびＵＧＴ４００８７の異種発現からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含まない細胞を指す。

【0024】

[0036] 本明細書で使用される場合、用語「天然に存在する」は、天然に見出されるものを指す。例えば、天然の源から単離できる生物中に存在するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、および実験室でヒトによって意図的に改変されていないＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、天然に存在するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼである。逆に言えば、本明細書で使用される場合、用語「天然に存在しない」は、天然に見出されないがヒトの介入により作り出されたものを指す。

【0025】

[0037] 用語「培地」は、培養培地および／または発酵培地を指す。

【0026】

[0038] 用語「発酵組成物」は、遺伝子改変された宿主細胞および遺伝子改変された宿主細胞によって産生された生成物または代謝生成物を含む組成物を指す。発酵組成物の例は、全細胞液体培地であり、これは、細胞、水相、および遺伝子改変された宿主細胞から産生された化合物を包含する容器（例えば、フラスコ、プレート、または発酵槽）の内容物全体であり得る。

【0027】

[0039] 本明細書で使用される場合、用語「産生量」は、一般的に、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞によって産生されたステビオールまたはステビオール配糖体の量を指す。一部の実施形態において、産生量は、宿主細胞によるステビオールまたはステビオール配糖体の収量として表される。他の実施形態において、産生量は、ステビオールまたはステビオール配糖体の産生における宿主細胞の産生能として表される。

【0028】

[0040] 本明細書で使用される場合、用語「産生能」は、宿主細胞によるステビオールまたはステビオール配糖体の産生量を指し、経時的な（１時間当たりの）宿主細胞が培養される発酵ブロスの所定量当たりの（体積当たりの）産生されたステビオールまたはステビオール配糖体の量（重量による）として表される。

【0029】

[0041] 本明細書で使用される場合、用語「収量」は、宿主細胞によるステビオールまたはステビオール配糖体の産生量を指し、宿主細胞により消費された炭素源の所定量当たりの産生されたステビオールまたはステビオール配糖体の重量による量として表される。

【0030】

[0042] 化合物（例えば、RebM2、ステビオール配糖体、または他の化合物）の「検出不可能なレベル」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物のレベルが、化合物を測定するための標準的な技術によって測定および／または分析するには低すぎることを意味する。例えば、この用語は、実施例７に記載される分析方法では検出不可能な化合物のレベルを包含する。

【0031】

[0043] 用語「ステビオール配糖体」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の糖部分の付加によって酵素的に変更されたステビオールを指し、このようなものとしては、例えばステビオールの配糖体、例えば、これらに限定されないが、天然に存在するステビオール配糖体、例えばステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシド（dulcoside）Ｂ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、合成ステビオール配糖体、例えば酵素的にグルコシル化されたステビオール配糖体およびそれらの組合せなどの付加によって酵素的に変更されたステビオールが挙げられる。

【0032】

[0044] 用語「ウリジン二リン酸（UDP）グリコシルトランスフェラーゼ」または「ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ」は、本明細書で使用される場合、単糖類部分をグリコシルドナーからグリコシルアクセプターに転移する活性を有する酵素、特定には、グリコシルドナーとしてＵＤＰ－糖を利用する酵素を指す。用語「ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ」は、「ＵＧＴ」と同義的に使用することができる。

【0033】

[0045] 本明細書で使用される場合、用語「機能性ドメイン」は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの「糖アクセプタードメイン」または「糖ドナードメイン」のいずれかを意味する。植物のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（UGT）は、グリコシルトランスフェラーゼスーパーファミリーのファミリー１に属する。これらは、ＧＴ－Ｂ構造的フォールドを受け入れる。このＵＧＴに共通する構造的な特徴は、２つのドメイン、すなわちドメイン間リンカーで隔てられた類似のロスマンフォールドを有するＣ末端およびＮ末端ドメインからなる。Ｃ末端ドメインは、ＵＤＰ－グルコース（「糖ドナー」）に結合することから、糖ドナードメインとも称され、一方でＮ末端ドメインは、糖ではない基質（「アクセプター」）と結合することから、アクセプタードメインとも称される。

【0034】

[0046] 本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および／または置換によって具体的に列挙した「参照」ポリペプチド（例えば野生型配列）と異なるが、実質的に参照ポリペプチドに類似した活性を保持するポリペプチドを指す。例えば、バリアントＵＧＴ４００８７は、やはりＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する反応および／またはステビオシドをＲｅｂＥに変換する反応を触媒することが可能であるという点で、配列番号１１を有する参照ＵＧＴ４００８７に実質的に類似した活性を保持する。一部の実施形態において、バリアントは、組換えＤＮＡ技術、例えば変異誘発によって作り出される。一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは、ある塩基性残基の別の残基での置換（すなわちArgのLysでの置換）、ある疎水性残基の別の残基での置換（すなわちLeuのIleでの置換）、またはある芳香族残基の別の残基での置換（すなわちPheのTyrでの置換）などによってその参照ポリペプチドとは異なる。一部の実施形態において、バリアントは、参照配列との実質的な構造的類似をもたらす保存的置換が達成されている類似体を包含する。このような保存的置換の例としては、これらに限定されないが、グルタミン酸のアスパラギン酸での置換およびその逆；グルタミンのアスパラギンでの置換およびその逆；セリンのスレオニンでの置換およびその逆；リシンのアルギニンでの置換およびその逆；またはイソロイシン、バリンもしくはロイシンのいずれかの互いの置換が挙げられる。

【0035】

[0047] 本明細書で使用される場合、用語「バリアントループ１」のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号１１の参照ループ１のアミノ酸配列（または配列番号２８の配列を有するUGT40087の改変されたループ１配列）とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および／または置換によって異なるアミノ酸配列であるが、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ１のアミノ酸配列箇所に対応する箇所に挿入されたバリアントループ１のアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換および／またはステビオシドからＲｅｂＥへの変換を触媒することが可能であるアミノ酸配列を指す。

【0036】

[0048] 本明細書で使用される場合、用語「バリアントループ２」のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号１１の参照ループ２のアミノ酸配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および／または置換によって異なるアミノ酸配列であるが、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ２のアミノ酸配列箇所に対応する箇所に挿入されたバリアントループ２のアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換および／またはステビオシドからＲｅｂＥへの変換を触媒することが可能であるアミノ酸配列を指す。

【0037】

[0049] 本明細書で使用される場合、用語「バリアントループ３＿１」のアミノ酸配列は、参照配列番号１または配列番号１１のループ３＿１のアミノ酸配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および／または置換によって異なるアミノ酸配列であるが、ループ３＿１のアミノ酸配列箇所の配列番号１または配列番号１１に対応する箇所に挿入されたバリアントループ３＿１のアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換および／またはステビオシドからＲｅｂＥへの変換を触媒することが可能であるアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される場合、用語「バリアントループ３＿２」のアミノ酸配列は、参照配列番号１または配列番号１１のループ３＿２のアミノ酸配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および／または置換によって異なるアミノ酸配列であるが、それぞれループ３＿２のアミノ酸配列箇所の配列番号１または配列番号１１に対応する箇所に挿入されたバリアントループ３＿２のアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換および／またはステビオシドからＲｅｂＥへの変換を触媒することが可能であるアミノ酸配列を指す。ある特定の実施形態において、バリアントループ３＿２のアミノ酸配列は、参照ループ３＿２のアミノ酸配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の、または３０個までのアミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および／または置換によって異なる。

【0038】

[0050] 本明細書で使用される場合、用語「バリアントループ４＿１」アミノ酸配列は、参照配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の、または３０個までのアミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および／または置換によって異なるアミノ酸配列であるが、配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸箇所に対応する箇所に挿入されたバリアントループ４＿１配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換および／またはステビオシドからＲｅｂＥへの変換を触媒することが可能であるアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」または「同一性パーセント」は、構造中、または２つ以上の核酸またはタンパク質配列において、同一であるか、または特定されたパーセンテージの同一なアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。例えば、配列は、比較ウィンドウにわたり、または配列比較アルゴリズムを使用するかまたは手作業によるアライメントおよび目視検査によって測定して指示された領域にわたり比較して最大限一致するように並べた場合、特定された領域にわたり、参照配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性パーセント、またはそれより高い同一性を有していてもよい。例えば、同一性のパーセントは、総ヌクレオチド（またはアミノ酸残基）の長さから全てのギャップの長さを引いた値で、配列中の同一なヌクレオチド（またはアミノ酸残基）の数を割った比率を計算することによって決定される。

【0039】

[0051] 便宜上、２つの配列間の同一性の程度は、当業界において公知のコンピュータープログラムや数学的なアルゴリズムを使用して確認することができる。このような配列同一性パーセントを計算するアルゴリズムは、一般的に、比較領域にわたり配列ギャップおよびミスマッチを考慮に入れる。配列を比較し並べるプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680)、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ (Sievers et al., (2011) Molecular Systems Biology., 7:539),、ＡＬＩＧＮ(Myers et al., (1988) CABIOS, 4: 11-17)、ＦＡＳＴＡ(Pearson et al., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 63-98)およびギャップ有りＢＬＡＳＴ（Altschulら、（1997）Nucleic Acids Res., 25：3389-3402） は、この目的にとって有用である。配列分析プログラムＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、およびＴＢＬＡＳＴＸと併用するための、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215：403-10, 1990）は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biological Information：NCBI）などの数種の供給元やインターネットより入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトで見出すことができる。

【0040】

[0052] ある特定の実施形態において、配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、その標準的なデフォルトパラメーターを使用したＢＬＡＳＴプログラムを使用して決定することができる。ヌクレオチド配列アライメントおよび配列同一性の計算のために、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、そのデフォルトパラメーター（ギャップ開始ペナルティー＝５、ＧＡＰ伸長ペナルティー＝２、核酸マッチ＝２、核酸ミスマッチ＝－３、期待値＝１０．０、文字サイズ＝１１、クエリー範囲における最大マッチ＝０）で使用される。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列アライメントおよび配列同一性の計算のために、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、これらのパラメーター（ギャップ開始ペナルティー＝５、ギャップ伸長ペナルティー＝２、核酸マッチ＝１、核酸ミスマッチ＝－３、期待値＝１０．０、文字サイズ＝１１）で使用される。ポリペプチド配列アライメントおよび配列同一性の計算のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、そのデフォルトパラメーター（アライメントマトリックス＝BLOSUM62；ギャップコスト：存在＝１１、伸長＝１；組成調整＝条件付きの組成スコア、マトリックス調整；期待値＝１０．０；文字サイズ＝６；クエリー範囲における最大マッチ＝０で使用される。代替として、以下のプログラムおよびパラメーター：Clone Manager SuiteのAlign Plusソフトウェア、バージョン５（Sci-Ed Software）；ＤＮＡ比較：グローバル比較、標準的な直線のスコア行列、ミスマッチペナルティー＝２、オープンギャップペナルティー＝４、伸長ギャップペナルティー＝１が使用される。本明細書に記載の実施形態において、配列同一性は、デフォルトパラメーターを使用したＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して計算される。本明細書に記載の実施形態において、２つ以上の配列の配列アライメントは、示唆されたデフォルトパラメーター（Dealign入力配列：なし；Mbed様クラスタリングガイドツリー：あり；Mbed様クラスタリング反復：あり；組み合わされた反復の数：デフォルト（０）；最大ガイドツリー反復：デフォルト；最大HMM反復：デフォルト；順番：アライメント済み）を使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して実行される。

【0041】

６．２ 宿主細胞
[0053] 高効率でレバウジオシドＡ（RebA）からレバウジオシドＤ（RebD）を産生することが可能な宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、出発原料としてのＲｅｂＡからＲｅｂＤを産生することができる。好ましい実施形態において、宿主細胞は、培養培地中の炭素源からＲｅｂＡを産生することができ、さらにＲｅｂＡからＲｅｂＤを産生することができる。特定の実施形態において、宿主細胞はさらに、ＲｅｂＤからレバウジオシドＭ（RebM）を産生することができる。

【0042】

[0054] 特定の実施形態において、宿主細胞は、ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ８７（UGT40087）の酵素活性を含む。ＵＧＴ４００８７酵素は、高効率でＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７酵素は、８０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７酵素は、８５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７酵素は、９０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７酵素は、９５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７酵素は、９６％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７酵素は、約９７％の効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７酵素は、ステビオシドをＲｅｂＥに変換することが可能である。

【0043】

[0055] ある特定の実施形態において、宿主細胞は、８０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、８５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、９０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、９５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、９６％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、約９７％の効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ステビオシドをＲｅｂＥに変換することが可能である。

【0044】

[0056] 変換の効率は、当業者に明らかな任意の技術によって測定することができる。ある特定の実施形態において、変換の効率は、ＲｅｂＤを形成するのに好適な条件下でＲｅｂＡを酵素または宿主細胞と接触させることによって測定することができる。効率は、得られた組成物中のＲｅｂＡおよびＲｅｂＤの総量と、産生されたＲｅｂＤのモル量を比較することによって測定することができる。また効率は、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＤの下流生成物の総量を、得られた組成物中のＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＤの下流生成物の総量と比較することによっても測定することができる。例えば、効率はまた、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、およびＲｅｂＭ２の総量を、得られた組成物中のＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、およびＲｅｂＭ２の総量と比較することによっても測定することができる。

【0045】

[0057] ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも６５％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも９９％、または少なくとも６０％から９９％までの間の任意のパーセンテージで同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0046】

[0058] ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含み、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含み、ステビオール配糖体の１９－ＯグルコースのＣ２’位をベータ１，２グリコシル化することが可能である宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、９０％、９５％、９６％、または９７％より高い効率でＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能なＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞であって、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、宿主細胞が本明細書で提供される。

【0047】

[0059] ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７をコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも６５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも９９％、または６０％から９９％までの間の任意のパーセンテージで同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0048】

[0060] ある特定の実施形態において、配列番号１１の配列を有するＵＧＴ４００８７をコードする配列番号１３のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１３のヌクレオチド配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１１のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、少なくとも９９％、または６０％から９９％までの間の任意のパーセンテージで同一なヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0049】

[0061] ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７の機能性ドメインを含む宿主細胞であって、ＵＧＴ４００８７は、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列を含む、宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７のＮ末端糖アクセプタードメインを含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７のＣ末端の糖ドナードメインを含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７の糖アクセプタードメインは、配列番号１１のおよそのアミノ酸位置１～２１４を含む（配列番号１のアミノ酸位置１～２１５に対応する）。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７の糖ドナードメインは、配列番号１１のおよそのアミノ酸位置２１５～４３５（配列番号１のアミノ酸位置２１６～４３６に対応する）を含む。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７の糖アクセプタードメインは、配列番号１のおよそのアミノ酸位置１～２１５を含む。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７の糖ドナードメインは、配列番号１のおよそのアミノ酸位置２１６～４３６を含む。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７の糖アクセプタードメインおよび糖ドナードメインは、配列番号１１に関して、それぞれ１～２１４または２１５～４３５より狭い範囲のアミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７の糖アクセプタードメインおよび糖ドナードメインは、配列番号１に関して、それぞれ１～２１５または２１６～４３６より狭い範囲のアミノ酸残基を含む。

【0050】

[0062] ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも６５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも９９％、または６０％～９９％の間の任意のパーセント、同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0051】

[0063] ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７をコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも６５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0052】

[0064] ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７および別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの３次元モデル化構造を比較し分析したところ、Ｎ末端の糖アクセプタードメインにおいて有意なコンフォメーションの差を有する４つのループ（すなわち、ループ１、ループ２、ループ３、およびループ４）が解明された。図６および実施例１２を参照されたい。２つのＵＧＴ間での対応するループ配列の交換による実験結果から、ＵＧＴ４００８７のループ１、ループ２、ループ３＿１、ループ３＿２、およびループ４＿１は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能な他のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ由来のそれらそれぞれの対応するループ配列で置換できることが示された。これらの実施形態において、ループ３の２つのバージョン（すなわち、ループ３＿１およびループ３＿２）およびループ＿４の２つのバージョン（すなわち、ループ４＿１およびループ４＿２）を、２つの可能性のあるループ長を構成するように設計した。

【0053】

[0065] したがって、ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、ＵＧＴ４００８７（すなわち配列番号１または配列番号１１）のループ１のアミノ酸配列をさらに含む。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のループ１のアミノ酸配列は、配列番号３０のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、ループ１のアミノ酸配列は、配列番号２８の配列を有する。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、バリアントループ１のアミノ酸配列をさらに含む。バリアントループ１のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号１１の参照ループ１のアミノ酸配列または配列番号２８を有するループ１のアミノ酸配列とは異なるが、バリアントループ１のアミノ酸を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、そのＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するおよび／またはステビオシドをＲｅｂＥに変換する活性を保持することができるアミノ酸配列を指す。

【0054】

[0066] ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、ＵＧＴ４００８７のループ２のアミノ酸配列（すなわち配列番号１または配列番号１１）をさらに含む。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１のループ２のアミノ酸配列は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、バリアントループ２のアミノ酸配列をさらに含む。バリアントループ２のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号１１の参照ループ２のアミノ酸配列とは異なるが、バリアントループ２のアミノ酸を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、そのＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するおよび／またはステビオシドをＲｅｂＥに変換する活性を保持することができるアミノ酸配列を指す。

【0055】

[0067] ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ３＿１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、ＵＧＴ４００８７のループ３＿１のアミノ酸配列（すなわち配列番号１または配列番号１１）をさらに含む。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のループ３＿１のアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ３＿１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、バリアントループ３＿１のアミノ酸配列をさらに含む。バリアントループ３＿１のアミノ酸配列は、参照配列番号１または配列番号１１のループ３＿１のアミノ酸配列とは異なるが、バリアントループ３＿１のアミノ酸を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、そのＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するおよび／またはステビオシドをＲｅｂＥに変換する活性を保持することができるアミノ酸配列を指す。

【0056】

[0068] ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ３＿２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、ＵＧＴ４００８７のループ３＿２のアミノ酸配列（すなわち配列番号１または配列番号１１）をさらに含む。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のループ３＿２のアミノ酸配列は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ３＿２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、バリアントループ３＿２のアミノ酸配列をさらに含む。バリアントループ３＿２のアミノ酸配列は、参照配列番号１または配列番号１１のループ３＿２のアミノ酸配列とは異なるが、バリアントループ３＿２のアミノ酸を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、そのＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するおよび／またはステビオシドをＲｅｂＥに変換する活性を保持することができるアミノ酸配列を指す。

【0057】

[0069] ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、ＵＧＴ４００８７のループ４＿１のアミノ酸配列（すなわち配列番号１または配列番号１１）をさらに含む。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、バリアントループ４＿１のアミノ酸配列をさらに含む。バリアントループ４＿１のアミノ酸配列は、参照配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列とは異なるが、バリアントループ４＿１のアミノ酸を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、そのＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するおよび／またはステビオシドをＲｅｂＥに変換する活性を保持することができるアミノ酸配列を指す。

【0058】

[0070] ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、ＵＧＴ４００８７のループ４＿２のアミノ酸配列（すなわち配列番号１または配列番号１１）をさらに含む。配列番号１または配列番号１１のループ４＿２のアミノ酸配列は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する。

【0059】

[0071] ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞、またはそれらのＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼをコードし、以下：
（ａ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ１のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列、またはバリアントループ１のアミノ酸配列；
（ｂ）それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ２のアミノ酸配列、またはバリアントループ２のアミノ酸配列、；
（ｃ）それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ３＿１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ３＿１のアミノ酸配列、またはバリアントループ３＿１のアミノ酸配列；
（ｄ）それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ３＿２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ３＿２のアミノ酸配列、またはバリアントループ３＿２のアミノ酸配列；
（ｅ）それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列、またはバリアントループ４＿１のアミノ酸配列；および
（ｆ）それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ４＿２のアミノ酸配列
の任意の組合せをさらに含む異種核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0060】

[0072] ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能なＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの３次元モデル化構造を比較し分析したところ、ＵＧＴ４００８７のループ４＿１は、別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの対応するループ４＿１の箇所に取り込まれると（さらにその生来的なループ4_1のアミノ酸配列を置き換えると）、そのＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する能力に関してバリアントＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの優れた活性をもたらしたことが発見された。実施例１２を参照されたい。これらの結果から、任意の好適なＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのループ４＿１のアミノ酸配列を、配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列で置換して、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換できることが示される。

【0061】

[0073] それゆえに、ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも６１％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一なアミノ酸配列を含み、ＵＧＴ４００８７（すなわち配列番号１または配列番号１１）のループ４＿１のアミノ酸配列（すなわち配列番号２２）をさらに含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも６１％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一なアミノ酸配列を含み、配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列（例えば配列番号２２）をさらに含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％であるアミノ酸配列を含む任意の好適なＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号１または配列番号１１由来のループ４＿１のアミノ酸配列をその対応するループ４＿１箇所に組み込む（その生来的なループ4_1のアミノ酸配列を置き換える）のに使用することができる。例えば、Ｏｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ＿ｌｉｋｅ、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、Ｓｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１、Ｓｒ．ＵＧＴ＿ｇ２５２７７８、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０、またはＳｉ９１Ｄｌｉｋｅが、配列番号１または配列番号１１由来のループ４＿１のアミノ酸配列をその対応するループ４＿１箇所に組み込むためのベースとして使用することができる。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。

【0062】

[0074] ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも６５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0063】

[0075] ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７をコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも６５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0064】

[0076] ある特定の実施形態において、Ｎ末端の糖アクセプタードメインおよびＣ末端の糖ドナードメインを組み換えて、基質特異性または触媒活性のいずれかを変更した。実施例１１で詳細に説明されるように、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能な別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ由来の糖ドナードメインを配列番号１または配列番号１１の糖アクセプタードメインと組み換えたところ、キメラＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、そのＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する能力を保持したことが決定された。

【0065】

[0077] したがって、ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号１または配列番号１１のＣ末端の糖ドナードメインのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一なアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。実施例１１で示されるように、Ｃ末端の糖ドナードメインは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を含む他のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼと相対的に交換可能である。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、他のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ由来のＣ末端の糖ドナードメインをさらに含む。好適なＣ末端の糖ドナードメインを有する他のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの例としては、Ｏｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ＿ｌｉｋｅ、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、ＳＩ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１、Ｓｒ．ＵＧＴ＿ｇ２５２７７８、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０、またはＳｉ９１Ｄｌｉｋｅが挙げられる。

【0066】

[0078] ある特定の実施形態において、Ｎ末端の糖アクセプタードメインにおけるある特定のアミノ酸残基は、機能しない推定上のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性を活性なＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼに回復させることができることが発見された。それゆえに、配列番号１または配列番号１１のＮ末端の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、以下のアミノ酸残基の１つまたは複数：
（ａ）配列番号１１のアミノ酸位置１１に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸位置１２に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸位置５５に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｄ）配列番号１１のアミノ酸位置９０に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｅ）配列番号１１のアミノ酸位置２０３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｆ）配列番号１１のアミノ酸位置２２３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸位置４１３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
をさらに含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供され、ここで配列番号１１のアミノ酸位置に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置は、配列アライメントによって決定される。

【0067】

[0079] ある特定の実施形態において、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0068】

[0080] ある特定の実施形態において、宿主細胞は、上述されるＵＧＴ４００８７ポリペプチドのバリアントを含む。ある特定の実施形態において、バリアントは、ＵＧＴ４００８７ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、バリアントは、ＵＧＴ４００８７ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される核酸のいずれも、宿主細胞に最適化することができ、例えばコドン最適化することができる。

【0069】

[0081] 本明細書に記載される実施形態において、２つのポリペプチドの対応するアミノ酸位置または対応するループ箇所を決定するのに、任意の好適な方法を使用することができる。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの配列および配列番号１１の参照配列は、そのデフォルトパラメーターを使用したＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して並べることができる。他の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの配列および配列番号１１の参照配列は、構造的なアライメント、例えばＥｘＰＡＳｙウェブサーバーを介して、またはＤｅｅｐＶｉｅｗプログラム（スイスのPdb-ビューワー）からアクセス可能なタンパク質構造の相同性モデル化サーバーであるスイスモデルを使用して並べることができる。

【0070】

[0082] ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの対応するアミノ酸位置またはループ箇所を決定することに関して配列番号１１は参照配列と称されるが、ある特定の実施形態において、配列番号１もまた、配列アライメントのための参照配列として使用することができる。

【0071】

[0083] ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡは、図１Ａで示される通りである。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７またはバリアントＵＧＴ４００８７は、図１Ａで示されるように、ＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位へのβ連結を形成して、ＲｅｂＤを産生する糖残基の反応を触媒することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７またはバリアントＵＧＴ４００８７は、ＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’へのβ形成におけるヘキソース残基の反応を触媒することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７は、ＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’へのβ形成におけるグルコース残基の反応を触媒することが可能である。

【0072】

[0084] ある特定の実施形態において、ＲｅｂＥは、図２Ｂで示される通りである。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７またはバリアントＵＧＴ４００８７は、図２Ｂで示されるように、ステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位へのβ連結を形成して、ＲｅｂＥを産生する糖残基の反応を触媒することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７またはバリアントＵＧＴ４００８７は、ステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’へのβ形成におけるヘキソース残基の反応を触媒することが可能である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７またはバリアントＵＧＴ４００８７は、ステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’へのβ形成におけるグルコース残基の反応を触媒することが可能である。

【0073】

[0085] ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７またはバリアントＵＧＴ４００８７は、第２の糖部分を、ステビオールモノシド（すなわち13-O-ステビオール配糖体）に付加する反応を検出可能なレベルで触媒しない。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７またはバリアントＵＧＴ４００８７は、第２の糖部分を、ルブソシド（すなわち19-O-ステビオール配糖体）に付加する反応を検出可能なレベルで触媒しない。

【0074】

[0086] ある特定の実施形態において、ＲｅｂＤは、図１Ａで示される通りである。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換のためのＵＧＴ４００８７および／またはバリアントＵＧＴ４００８７を含む。

【0075】

[0087] ある特定の実施形態において、ＵＧＴ７６Ｇ１は、図１Ａで示されるように、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換する糖残基の反応を触媒することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することが可能なＵＧＴ７６Ｇ１をさらに含む。

【0076】

[0088] ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭ２は、図１Ｂに示される。ＲｅｂＭ２は、図１Ｂで示されるように、単一の間違ったグルコース連結を有するＲｅｂＭの異性体である。ＲｅｂＭ２は、ＲｅｂＭにとって望ましいＧｌｃβ（１－２）［Ｇｌｃβ（１－３）］Ｇｌｃβ１－の代わりに、１９炭素の位置（ＣＯＯＨ）にＧｌｃβ（１－２）［Ｇｌｃβ（１－６）］Ｇｌｃβ１－を有する。

【0077】

[0089] 当業者は、ある特定の用途において、ＲｅｂＭ２は望ましくない副産物であり得ることを認識するであろう。有利には、ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７（またはバリアントUGT40087）および本明細書で提供される宿主細胞は、ＲｅｂＭ２をほとんどまたは全く産生できない。ＲｅｂＭ２の量は、ＲｅｂＭとＲｅｂＭ２との比率として表すことができる。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭとＲｅｂＭ２との比率は、少なくとも２：１である。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭとＲｅｂＭ２との比率は、少なくとも３：１である。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭとＲｅｂＭ２との比率は、少なくとも４：１である。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭとＲｅｂＭ２との比率は、少なくとも５：１である。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭとＲｅｂＭ２との比率は、少なくとも１０：１である。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭとＲｅｂＭ２との比率は、少なくとも１００：１である。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭとＲｅｂＭ２との比率は、少なくとも１０００：１である。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭとＲｅｂＭ２との比率は、少なくとも１００００：１である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７（またはバリアントUGT40087）および本明細書で提供される宿主細胞は、検出不可能なレベルのＲｅｂＭ２を産生する。

【0078】

[0090] 宿主細胞のＵＧＴ４００８７または任意のバリアントＵＧＴ４００８７は基質としてＲｅｂＡを受容するが、ＲｅｂＡ源は、当業者に好適であるとみなされた任意の源であってもよい。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７または任意のバリアントＵＧＴ４００８７は、ＲｅｂＡと接触させてもよい。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＡと接触させてもよい。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７またはＵＧＴ４００８７の任意のバリアントは、１つまたは複数のステビオール配糖体を含む組成物と接触させてもよい。ある特定の実施形態において、組成物は、ＲｅｂＡを含む。ある特定の実施形態において、組成物は、ステビオシドを含む。ある特定の実施形態において、組成物は、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの葉から単離された天然生成物由来である。ある特定の実施形態において、組成物は、微生物由来である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、１つまたは複数のステビオール配糖体を含む組成物と接触させてもよい。

【0079】

[0091] ある特定の実施形態において、望ましい反応を触媒するのに好適な任意のバリアントＵＧＴ４００８７は、当業界において公知の任意の好適な方法のためにスクリーニングすることができる。例えば、好適なバリアントＵＧＴ４００８７は、バリアントＵＧＴ４００８７をコードする異種核酸を発現させ、基質の望ましい箇所（例えば、ステビオール配糖体または他の基質の19-O-グルコースのC2'位）に糖を付加することが可能な機能的なバリアントＵＧＴ４００８７を産生する細胞をスクリーニングすることによって、インビボでアッセイすることができる。例示的なスクリーニング方法は、以下の実施例３～７に記載される。別の例において、好適なバリアントＵＧＴ４００８７は、バリアントＵＧＴ４００８７をＲｅｂＡなどの基質と接触させることによって、インビトロでスクリーニングすることができる。この実施例において、ＲｅｂＤの存在についてのアッセイは、バリアントＵＧＴ４００８７が好適な酵素であるかどうかを決定するための試験として使用することができる。この反応は、ＬＣ－ＭＳまたは他の当業界公知の方法によって分析することができる。例えばＷＯ２０１３／０２２９８９を参照されたい。

【0080】

[0092] ある特定の実施形態において、バリアントＵＧＴ４００８７は、インビボで、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、または９７％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である場合、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換すること（またはグリコシル化により任意の好適な基質からその生成物へ変換すること）において好適とみなされる。

【0081】

[0093] 一部の実施形態において、本出願で発見された他の好適なＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ４００８７に加えて、またはその代わりに使用することができる。これらの例としては、例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼである、ｓｒ．ＵＧＴ＿９２５２７７８、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０、およびＯｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅが挙げられる。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼであるｓｒ．ＵＧＴ＿９２５２７７８は、配列番号２を含む。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼであるＢｄ＿ＵＧＴ１０８４０は、配列番号３を含む。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼであるＨｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１は、配列番号４を含む。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼであるＢｄ＿ＵＧＴ１０８５０は、配列番号５を含む。ある特定の実施形態において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼであるＯｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅは、配列番号６を含む。本明細書に記載されるＵＧＴ４００８７に関連する組成物および方法に関するあらゆる議論は、これらの他のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼにも適用することができる。

【0082】

[0094] 例えば、一部の実施形態において、宿主細胞は、ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼであるｓｒ．ＵＧＴ＿９２５２７７８、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０、および／またはＯｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅの酵素活性を含む。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、４０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、４５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、５０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、５５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、６０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、６５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、７０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、７５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、８０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、８５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、９０％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、これらの酵素の１つまたは複数は、９５％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である。

【0083】

[0095] ある特定の実施形態において、それぞれ配列番号２、３、４、５、または６のアミノ酸配列を含むｓｒ．ＵＧＴ＿９２５２７７８、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０、および／またはＯｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅのいずれか１つまたは複数を含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、配列番号２、３、４、５、または６のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。

【0084】

[0096] 有利な実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＡを生成することが可能な１つまたは複数の酵素経路を含んでいてもよく、前記経路は、個別になっていてもよいし、または一緒になっていてもよい。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸をＲｅｂＡに変換することが可能な１つまたは複数の酵素を含む。有用な酵素およびその酵素をコードする核酸は、当業者公知である。特に有用である酵素および核酸は、以下の章に記載され、さらに例えば、ＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１５９１８８、ＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２、およびＵＳ２０１６／０１９８７４８Ａ１に記載される。

【0085】

[0097] さらなる実施形態において、宿主細胞は、炭素源からゲラニルゲラニル二リン酸を生成することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。これらは、ＤＸＰ経路の酵素およびＭＥＶ経路の酵素を包含する。有用な酵素およびその酵素をコードする核酸は、当業者公知である。各経路の例示的な酵素は、後述され、さらに例えばＵＳ２０１６／０１７７３４１Ａ１に記載される。またＭＥＶ経路は図１Ｃにも示される。

【0086】

[0098] ある特定の実施形態において、追加の酵素は、生来的である。有利な実施形態において、追加の酵素は、異種である。ある特定の実施形態において、２つの酵素は、１つのポリペプチド中に組み合わせることができる。

【0087】

６．３ 天然に存在しないＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよび核酸
[0099] 別の態様において、参照配列（例えば配列番号１）と比較してアミノ酸残基の改変を包含するが、それでもなおＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するおよび／またはステビオシドからＲｅｂＥに変換するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼとしての活性を保持する天然に存在しないバリアントＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、天然に存在しないバリアントＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、参照配列（例えば配列番号１または配列番号１１）と比較して、ある特定のアミノ酸位置または箇所に、最大３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入を包含していてもよい。ある特定の実施形態において、天然に存在しないバリアントＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、本明細書に記載されるバリアントＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのいずれか、特定には６．２章に記載されるものを含む。

【0088】

[00100] 別の態様において、参照配列（例えば配列番号２６）と比較して核酸残基の改変を包含するが、それでもタンパク質に翻訳されると、タンパク質はＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するおよび／またはステビオシドをＲｅｂＥに変換するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼとしての活性を保持する、天然に存在しないバリアントＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、天然に存在しないバリアントＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、本明細書に記載されるバリアントＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのいずれか、特定には６．２章に記載されるものをコードしていてもよい。

【0089】

６．４ 細胞株
[00101] 本明細書で提供される組成物および方法に有用な宿主細胞としては、古細菌細胞、原核細胞または真核細胞が挙げられる。

【0090】

[00102] 好適な原核宿主としては、これらに限定されないが、様々なグラム陽性、グラム陰性、またはグラム不定細菌の任意のものが挙げられる。例としては、これらに限定されないが、以下の属：アグロバクテリウム属、アリシクロバチルス属、アナベナ属、アナシスティス属、アルトロバクター属、アゾトバクター属（Azobacter）、バチルス属、ブレビバクテリウム属、クロマチウム属、クロストリジウム、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エルウィニア属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、メソリゾビウム属、メチロバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、フォルミジウム属、シュードモナス属、ロドバクター属、ロドシュードモナス属、ロドスピリルム属、ロドコッカス属、サルモネラ属、セネデスムス属（Scenedesmun）、セラチア属、シゲラ属、スタフィロコッカス属（Staphlococcus）、ストレプトマイセス属（Strepromyces）、シネココッカス属（Synnecoccus）、およびジモモナス属に属する細胞が挙げられる。原核株の例としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｇｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓが挙げられる。特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。

【0091】

[00103] 好適な古細菌宿主としては、これらに限定されないが、アエロピルム属、アーケオグロブス属（Archaeglobus）、ハロバクテリウム属、メタノコッカス属、メタノバクテリウム属、パイロコッカス属、スルフォロブス属、およびサーモプラスマ属に属する細胞が挙げられる。古細菌株の例としては、これらに限定されないが、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの種、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、およびＡｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘが挙げられる。

【0092】

[00104] 好適な真核宿主としては、これらに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられる。一部の実施形態において、本発明の方法において有用な酵母としては、微生物受託機関（例えばIFO、ATCCなど）に寄託された酵母であって、なかでも、アシクロコニジウム属（Aciculoconidium）、アンブロシオジマ属（Ambrosiozyma）、アントロアスカス属（Arthroascus）、アルキシオジマ属（Arxiozyma）、アシュビア属、バブジェビア属（Babjevia）、ベンシングトニア属（Bensingtonia）、ボトリオアスカス属（Botryoascus）、ボトリオザイマ属（Botryozyma）、ブレッタノマイセス属（Brettanomyces）、ビュレラ属（Bullera）、ビュレロマイセス属（Bulleromyces）、カンジダ属、シテロミセス属（Citeromyces）、クラビスポラ属（Clavispora）、クリプトコックス属、シストフィロバシディウム属（Cystofilobasidium）、デバリオマイセス属、デッカラ属（Dekkara）、ディポダスコプシス属（Dipodascopsis）、ディポダスカス属（Dipodascus）、エニエラ属（Eeniella）、エンドマイコプセラ属（Endomycopsella）、エレマスカス属（Eremascus）、エレモテシウム属（Eremothecium）、エリスロバシディウム属（Erythrobasidium）、フェロマイセス属（Fellomyces）、フィロバシディウム属（Filobasidium）、ガラクトマイセス属（Galactomyces）、ゲオトリクム属（Geotrichum）、ガイラーモンデラ属（Guilliermondella）、ハンセニアスポラ属（Hanseniaspora）、ハンセヌラ属、ハセガワエア属（Hasegawaea）、ホルターマンニア属（Holtermannia）、ホルモアスカス属（Hormoascus）、ハイフォピキア属（Hyphopichia）、イッサチェンキア属（Issatchenkia）、クロエケラ属（Kloeckera）、クロエケラスポラ属（Kloeckeraspora）、クルイベロマイセス属、コンドア属（Kondoa）、クライシア属（Kuraishia）、クルツマノマイセス属（Kurtzmanomyces）、ロイコスポリジウム属（Leucosporidium）、リポマイセス属、ロデロマイセス属（Lodderomyces）、マラセジア属（Malassezia）、メトシュニコウィア属（Metschnikowia）、ムラキア属（Mrakia）、ミクソザイマ属（Myxozyma）、ナドソニア属（Nadsonia）、ナカザワエア属（Nakazawaea）、ネマトスポラ属（Nematospora）、オガタエア属（Ogataea）、オースポリディウム属（Oosporidium）、パチソレン属（Pachysolen）、ファチコスポラ属（Phachytichospora）、ファフィア属（Phaffia）、ピチア属、ロドスポリディウム属（Rhodosporidium）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、サッカロマイセス属、サッカロマイコーデス属、サッカロマイコプシス属（Saccharomycopsis）、サイトエラ属（Saitoella）、サカグチア属（Sakaguchia）、サターノスポラ属（Saturnospora）、シゾブラストスポリオン属（Schizoblastosporion）、シゾサッカロマイセス属、シュワニオミセス属（Schwanniomyces）、スポリディオボラス属（Sporidiobolus）、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）、スポロパキデミア属（Sporopachydermia）、ステファノアスカス属（Stephanoascus）、ステリグマトマイセス属（Sterigmatomyces）、ステリグマトスポリディウム属（Sterigmatosporidium）、シンビオタフリナ属（Symbiotaphrina）、シンポディオマイセス属（Sympodiomyces）、シンポディオマイコプシス属（Sympodiomycopsis）、トルラスポラ属、トリコスポリエラ属（Trichosporiella）、トリコスポロン属、トリゴノプシス属（Trigonopsis）、ツチヤエア属（Tsuchiyaea）、ウデニオマイセス属（Udeniomyces）、ワルトマイセス属（Waltomyces）、ウィカーハミア属（Wickerhamia）、ウィカーハミエラ属（Wickerhamiella）、ウィリオプシス属、ヤマダザイマ属（Yamadazyma）、ヤロウイア属、ザイゴアスカス属（Zygoascus）、チゴサッカロマイセス属、ザイゴウィリオプシス属（Zygowilliopsis）、およびザイゴザイマ属（Zygozyma）に属する酵母が挙げられる。

【0093】

[00105] 一部の実施形態において、宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（以前はSaccharomyces lactisと称されていた）、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在Pichia angustaとして公知）である。一部の実施形態において、宿主微生物は、カンジダ属の株、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓである。

【0094】

[00106] 特定の実施形態において、宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態において、宿主は、パン酵母、ＣＢＳ ７９５９、ＣＢＳ ７９６０、ＣＢＳ ７９６１、ＣＢＳ ７９６２、ＣＢＳ ７９６３、ＣＢＳ ７９６４、ＩＺ－１９０４、ＴＡ、ＢＧ－１、ＣＲ－１、ＳＡ－１、Ｍ－２６、Ｙ－９０４、ＰＥ－２、ＰＥ－５、ＶＲ－１、ＢＲ－１、ＢＲ－２、ＭＥ－２、ＶＲ－２、ＭＡ－３、ＭＡ－４、ＣＡＴ－１、ＣＢ－１、ＮＲ－１、ＢＴ－１およびＡＬ－１からなる群から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。一部の実施形態において、宿主微生物は、ＰＥ－２、ＣＡＴ－１、ＶＲ－１、ＢＧ－１、ＣＲ－１、およびＳＡ－１からなる群から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＰＥ－２である。他の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＣＡＴ－１である。他の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＢＧ－１である。

【0095】

[00107] 一部の実施形態において、宿主微生物は、工業的な発酵に好適な微生物である。特定の実施形態において、微生物は、工業的な発酵環境の認識されたストレス条件である、高い溶媒濃度、高温、基質利用の拡大、栄養素の制限、糖および塩による浸透圧ストレス、酸性度、亜硫酸塩ならびに細菌汚染、またはそれらの組合せのもとで生存するように調整されている。

【0096】

６．５ ステビオールおよびステビオール配糖体の生合成経路
[00108] 一部の実施形態において、ステビオールの生合成経路および／またはステビオール配糖体の生合成経路は、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞において、経路の１つまたは複数の酵素をコードするポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを発現するように細胞を操作することによって活性化される。図２Ａは、例示的なステビオールの生合成経路を例示する。図２Ｂは、ステビオールから始まり様々なステビオール配糖体に至る例示的なステビオール配糖体の生合成経路を例示する。

【0097】

[00109] したがって、一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、コパリル二リン酸シンターゼまたはｅｎｔ－コパリルピロリン酸シンターゼ（CDPS；ent-コパリルピロリン酸シンターゼまたはCPSとも称される）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、カウレンシンターゼ（KS；ent-カウレンシンターゼとも称される）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、カウレンオキシダーゼ（KO；ent-カウレン19-オキシダーゼとも称される）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ステビオールシンターゼ（ent-カウレン酸13-ヒドロキシラーゼまたはKAHとも称される）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（CPR）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。

【0098】

[00110] 一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴ７４Ｇ１活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴ７６Ｇ１活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴ８５Ｃ２活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴ９１Ｄ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴ４００８７活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。

【0099】

[00111] ある特定の実施形態において、宿主細胞は、バリアントを含む。ある特定の実施形態において、バリアントは、関連ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、バリアントは、参照ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される核酸のいずれも、宿主細胞に最適化することができ、例えばコドン最適化することができる。

【0100】

[00112] ステビオールの生合成経路および／またはステビオール配糖体の生合成経路の例示的な核酸および酵素は後述する。

【0101】

６．５．１ ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS）
[00113] ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（EC2.5.1.29）は、ファルネシルピロリン酸のゲラニルゲラニル二リン酸（ゲラニルゲラニルピロリン酸としても公知）への変換を触媒する。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（受託番号ＡＢＤ９２９２６）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素（受託番号ＣＡＡ７５５６８）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓの酵素（受託番号ＡＡＨ６９９１３）、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの酵素（受託番号ＸＰ＿００２２８８３３９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓの酵素（受託番号ＺＰ＿０５００４５７０）、Ｓｕｌｆｕｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓの酵素（受託番号ＢＡＡ４３２００）、シネココッカス属種の酵素（受託番号ＡＢＣ９８５９６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号ＮＰ＿１９５３９９）、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａの酵素（受託番号ＡＦＣ９２７９８．１）およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＧＧＰＰＳ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＧＧＰＰＳ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0102】

６．５．２ コパリル二リン酸シンターゼ（CDPS）
[00114] コパリル二リン酸シンターゼ（EC5.5.1.13）は、ゲラニルゲラニル二リン酸からコパリル二リン酸への変換を触媒する。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（受託番号ＡＡＢ８７０９１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓの酵素（受託番号ＥＤＹ５１６６７）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍの酵素（受託番号ＡＡＣ２８８９５．１）、Ｚｅａ ｍａｙｓの酵素（受託番号ＡＹ５６２４９０）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号ＮＭ＿１１６５１２）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａの酵素（受託番号Ｑ５ＭＱ８５．１）およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＰＳ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＰＳ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、９５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0103】

６．５．３ カウレンシンターゼ（KS）
[00115] カウレンシンターゼ（EC4.2.3.19）は、コパリル二リン酸のカウレンおよび二リン酸塩への変換を触媒する。酵素の説明に役立つ例としては、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍの酵素（受託番号ＡＡＣ２８８９５．１）、フェオスフェリア属（Phaeosphaeria）種の酵素（受託番号Ｏ１３２８４）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号Ｑ９ＳＡＫ２）、Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａの酵素（受託番号ＡＤＢ５５７１１．１）およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＫＳ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＫＳ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0104】

６．５．４ 二官能性コパリル二リン酸シンターゼ（CDPS）およびカウレンシンターゼ（KS）
[00116] ＣＤＰＳ－ＫＳ二官能性酵素（EC5.5.1.13およびEC4.2.3.19）も使用することができる。酵素の説明に役立つ例としては、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ａｍｙｇｄａｌｉの酵素（受託番号ＢＡＧ３０９６２）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓの酵素（受託番号ＢＡＦ６１１３５）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素（受託番号Ｑ９ＵＶＹ５．１）、ならびにＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１の酵素、ＵＳ２０１５／０１５９１８８の酵素、およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＰＳ－ＫＳ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＰＳ－ＫＳ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0105】

６．５．５ ｅｎｔ－カウレンオキシダーゼ（KO）
[00117] ｅｎｔ－カウレンオキシダーゼ（EC1.14.13.78；本明細書ではカウレンオキシダーゼとも称される）は、カウレンのカウレン酸への変換を触媒する。酵素の説明に役立つ例としては、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａの酵素（受託番号Ｑ５Ｚ５Ｒ４）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素（受託番号Ｏ９４１４２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号Ｑ９３ＺＢ２）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（受託番号ＡＡＱ６３４６４．１）、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍの酵素（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ６ＸＡＦ４）、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１の酵素、ＵＳ２０１５／０１５９１８８の酵素、およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＫＯ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＫＯ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0106】

６．５．６ ステビオールシンターゼ（KAH）
[00118] ステビオールシンターゼ、またはカウレン酸ヒドロキシラーゼ（KAH）、（EC1.14.13）は、カウレン酸のステビオールへの変換を触媒する。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（受託番号ＡＣＤ９３７２２）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（配列番号１０）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号ＮＰ＿１９７８７２）、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａの酵素（受託番号ＸＰ＿００２２８２０９１）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃｕｌａｔａの酵素（受託番号ＡＢＣ５９０７６）、ならびにＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１の酵素、ＵＳ２０１５／０１５９１８８の酵素、およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＫＡＨ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＫＡＨ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0107】

６．５．７ シトクロムＰ４５０レダクターゼ（CPR）
[00119] シトクロムＰ４５０レダクターゼ（EC1.6.2.4）は、上記のＫＯおよび／またはＫＡＨの活性を捕捉または促進することが可能である。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（受託番号ＡＢＢ８８８３９）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号ＮＰ＿１９４１８３）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素（受託番号ＣＡＥ０９０５５）、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａの酵素（受託番号ＡＢＣ４７９４６．１）、ならびにＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１の酵素、ＵＳ２０１５／０１５９１８８の酵素、およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＣＰＲ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＣＰＲ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0108】

６．５．８ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ７４Ｇ１（UGT74G1）
[00120] ＵＧＴ７４Ｇ１は、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール１９－ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして、およびウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１３－Ｏ－グルコシド１９－ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能化することが可能である。図２Ｂで示されるように、ＵＧＴ７４Ｇ１は、ステビオールを１９－配糖体に変換することが可能である。ＵＧＴ７４Ｇ１はまた、ステビオールモノシドをルブソシドに変換することも可能である。ＵＧＴ７４Ｇ１はまた、ステビオールビオシドをステビオシドに変換することが可能な場合もある。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41： 56-67ならびにＵＳ２０１４／０３２９２８１およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２および受託番号ＡＡＲ０６９２０．１の酵素）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ７４Ｇ１核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ７４Ｇ１酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0109】

６．５．９ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ７６Ｇ１（UGT76G1）
[00121] ＵＧＴ７６Ｇ１は、グルコース部分を、受容体分子であるステビオール１，２配糖体のＣ－１３－Ｏ－グルコースのＣ－３’に転移することが可能である。したがって、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール１３－Ｏ－１，２グルコシドＣ－３’グルコシルトランスフェラーゼおよびウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１９－Ｏ－グルコース、１３－Ｏ－１，２ビオシドＣ－３’グルコシルトランスフェラーゼとして機能化することが可能である。図２Ａで示されるように、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオールビオシドをＲｅｂＢに変換することが可能である。ＵＧＴ７６Ｇ１はまた、ステビオシドをＲｅｂＡに変換することも可能である。ＵＧＴ７６Ｇ１はまた、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することも可能である。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41： 56-67の酵素およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２の酵素および受託番号ＡＡＲ０６９１２．１の酵素）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ７６Ｇ１核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ７６Ｇ１酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0110】

６．５．１０ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ８５Ｃ２（UGT85C2）
[00122] ＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール１３－ＯＨトランスフェラーゼ、およびウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１９－Ｏ－グルコシド１３－ＯＨトランスフェラーゼとして機能化することが可能である。したがって、図２Ｂで示されるように、ＵＧＴ８５Ｃ２は、ステビオールをステビオールモノシドに変換することが可能であり、さらに１９－配糖体をルブソシドに変換することも可能である。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41： 56-67の酵素およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２の酵素および受託番号ＡＡＲ０６９１６．１の酵素）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ８５Ｃ２核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ８５Ｃ２酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0111】

６．５．１１ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ９１Ｄ（UGT91D）
[00123] ＵＧＴ９１Ｄは、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１３－Ｏ－グルコシドトランスフェラーゼとして機能化し、グルコース部分を、受容体分子であるステビオール－１３－Ｏ－グルコシド（ステビオールモノシド）の１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’に転移して、ステビオールビオシド（steviobioside）を産生することが可能である。ＵＧＴ９１Ｄはまた、図２Ｂで示されるように、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとして機能化し、グルコース部分を、受容体分子であるルブソシドの１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’に転移して、ステビオシドを提供することも可能である。ＵＧＴ９１Ｄはまた、図２Ｂで示されるように、グルコース部分をＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に転移して、ＲｅｂＤを産生することも可能である。ＵＧＴ９１Ｄはまた、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、またはＵＧＴ９１Ｄ－ｌｉｋｅ３とも称される。ＵＧＴ９１Ｄ酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（例えば、受託番号ＡＣＥ８７８５５．１、ＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１、ＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２、および配列番号７のＵＧＴ配列を有する酵素）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ９１Ｄ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ９１Ｄ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。

【0112】

６．５．１２ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ４００８７（UGT40087）
[00124] ＵＧＴ４００８７は、図２Ｂで示されるように、グルコース部分をＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に転移して、ＲｅｂＤを産生することが可能である。ＵＧＴ４００８７はまた、ステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位へのグルコース部分を転移して、ＲｅｂＥを産生することも可能である。ＵＧＴ４００８７の説明に役立つ例は、５．２章で上述されている。本明細書に記載される任意のＵＧＴ４００８７バリアントは、本明細書に記載される組成物および方法で使用することができる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴ４００８７酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ４００８７酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるＵＧＴ４００８７バリアントをコードする核酸が本明細書で提供される。

【0113】

６．６ ＭＥＶ経路ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰ産生
[00125] 一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰの形成に有用なＭＥＶ経路の１つまたは複数の異種酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、アセチル－ＣｏＡをマロニル－ＣｏＡと縮合させて、アセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、アセチル－ＣｏＡの２つの分子を縮合して、アセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、アセトアセチル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡと縮合させて、ＨＭＧ－ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、メバロン酸をメバロン酸５－リン酸にリン酸化する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸に変換する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む。

【0114】

[00126] 一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、アセチル－ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡシンセターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態において、アセトアセチル－ＣｏＡの形成を触媒することが可能なＭＥＶ経路の酵素に関して、遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル－ＣｏＡの２つの分子を縮合して、アセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセチル－ＣｏＡチオラーゼ；またはアセチル－ＣｏＡをマロニル－ＣｏＡと縮合させて、アセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのいずれかを含む。一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル－ＣｏＡの２つの分子を縮合して、アセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセチル－ＣｏＡチオラーゼ；およびアセチル－ＣｏＡをマロニル－ＣｏＡと縮合させて、アセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼの両方を含む。

【0115】

[00127] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の１種より多くの酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の２種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換することができる酵素、およびメバロン酸をメバロン酸５－リン酸に変換することができる酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の３種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の４種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の５種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の６種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の７種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む。

【0116】

[00128] 一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、イソペンテニルピロリン酸（IPP）をジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して、ポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾して、ファルネセンなどのイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。

【0117】

６．６．１ アセチル－ＣｏＡのアセトアセチル－ＣｏＡへの変換
[00129] 一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル補酵素Ａの２つの分子を縮合してアセトアセチル－ＣｏＡを形成することができる酵素、例えばアセチル－ＣｏＡチオラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（NC_000913領域：2324131.2325315；Escherichia coli）、（D49362；Paracoccus denitrificans）、および（L20428；Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。

【0118】

[00130] アセチル－ＣｏＡチオラーゼは、アセチル－ＣｏＡの２つの分子の可逆的な縮合を触媒して、アセトアセチル－ＣｏＡを生成するが、この反応は熱力学的に好ましくない。したがってアセトアセチル－ＣｏＡのチオール開裂は、アセトアセチル－ＣｏＡ合成より優先的になされる。アセトアセチル－ＣｏＡシンターゼ（AACS）（互換的にアセチル-CoA：マロニル-CoAアシルトランスフェラーゼと称される；EC2.3.1.194）は、アセチル－ＣｏＡをマロニル－ＣｏＡと縮合させて、アセトアセチル－ＣｏＡを形成する。アセチル－ＣｏＡチオラーゼとは対照的に、ＡＡＣＳによって触媒されるアセトアセチル－ＣｏＡ合成は、付随するマロニル－ＣｏＡの脱炭酸反応のために、本質的にエネルギー的に都合のよい反応である。加えて、ＡＡＣＳは、アセトアセチル－ＣｏＡに対するチオール開裂活性を示さないことから、この反応は、不可逆的である。

【0119】

[00131] アセチル－ＣｏＡチオラーゼならびに異種ＡＤＡおよび／またはリン酸トランスアセチラーゼ（PTA）を含む宿主細胞において、アセトアセチル－ＣｏＡのチオール開裂のほうを優先的に行うアセチル－ＣｏＡチオラーゼによって触媒される可逆反応は、大きいアセチル－ＣｏＡプールをもたらし得る。ＡＤＡの可逆的な活性を考慮して、このアセチル－ＣｏＡプールは順に、アセチル－ＣｏＡをアセトアルデヒドに変換する逆反応に向かってＡＤＡを駆動することができ、そのためアセチル－ＣｏＡ産生に対するＡＤＡによって提供される利益が減じられる。同様に、ＰＴＡの活性も可逆的であり、したがって大きいアセチル－ＣｏＡプールが、アセチル－ＣｏＡをアセチルリン酸に変換する逆反応に向かってＰＴＡを駆動し得る。それゆえに、一部の実施形態において、アセチル－ＣｏＡを強く引き寄せてＡＤＡおよびＰＴＡの正反応を駆動するために、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞のＭＥＶ経路は、アセトアセチル－ＣｏＡシンターゼを利用して、アセチル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡからアセトアセチル－ＣｏＡを形成する。

【0120】

[00132] 一部の実施形態において、ＡＡＣＳは、ストレプトマイセス属種の株ＣＬ１９０由来である（Okamura et al., Proc Natl Acad Sci USA 107（25）：11265-70（2010））。ストレプトマイセス属種の株ＣＬ１９０の代表的なＡＡＣＳヌクレオチド配列としては、受託番号ＡＢ５４０１３１．１が挙げられる。ストレプトマイセス属種の株ＣＬ１９０の代表的なＡＡＣＳタンパク質配列としては、受託番号Ｄ７ＵＲＶ０、ＢＡＪ１００４８が挙げられる。本明細書で提供される組成物および方法に有用な他のアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼとしては、これらに限定されないが、ストレプトマイセス属種（AB183750；KO-3988BAD86806）；Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ株９６６３（FN178498；CAX48662）；ストレプトマイセス属種ＫＯ－３９８８（AB212624；BAE78983）；アクチノプラネス属種Ａ４０６４４（AB113568；BAD07381）；ストレプトマイセス属種Ｃ（NZ_ACEW010000640；ZP_05511702）；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ＤＳＭ４３１１１（NZ_ABUI01000023；ZP_04335288）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ Ａｇｙ９９（NC_008611；YP_907152）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ Ｍ（NC_010612；YP_001851502）；ストレプトマイセス属種Ｍｇ１（NZ_DS570501；ZP_05002626）；ストレプトマイセス属種ＡＡ４（NZ_ACEV01000037；ZP_05478992）；Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ ＮＲＲＬ１５９９８（NZ_ABYB01000295；ZP_04696763）；ストレプトマイセス属種ＡＣＴＥ（NZ_ADFD01000030；ZP_06275834）；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ４０７３６（NZ_ACEZ01000031；ZP_05529691）；フランキア属種ＣｃＩ３（NC_007777；YP_480101）；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（NC_018681；YP_006812440.1）；およびＡｕｓｔｗｉｃｋｉａ ｃｈｅｌｏｎａｅ（NZ_BAGZ01000005；ZP_10950493.1）が挙げられる。追加の好適なアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼとしては、その内容が参照によりそれらの全体が組み入れられる米国特許出願公開公報第２０１０／０２８５５４９号および２０１１／０２８１３１５号に記載されるものが挙げられる。

【0121】

[00133] 同様に本明細書で提供される組成物および方法において有用なアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼとしてはまた、本明細書に記載されるアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのいずれかの「誘導体」と称される分子も挙げられる。このような「誘導体」は、以下の特徴：（１）本明細書に記載されるアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのいずれかと実質的な相同性を有する特徴；および（２）アセチル－ＣｏＡとマロニル－ＣｏＡとを不可逆的に縮合してアセトアセチル－ＣｏＡを形成することを触媒できる特徴を有する。アセトアセチル－ＣｏＡシンターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が、アセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である場合、アセトアセチル－ＣｏＡシンターゼと「実質的な相同性」を共有すると称される。

【0122】

６．６．２ アセトアセチル－ＣｏＡのＨＭＧ－ＣｏＡへの変換
[00134] 一部の実施形態において、宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡの別の分子と縮合させて、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ（HMG-CoA）を形成することができる酵素、例えばＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（NC_001145.相補物19061.20536；Saccharomyces cerevisiae）、（X96617；Saccharomyces cerevisiae）、（X83882；Arabidopsis thaliana）、（AB037907；Kitasatospora griseola）、（BT007302；Homo sapiens）、および（NC_002758、遺伝子座タグSAV2546、遺伝子番号1122571；Staphylococcus aureus）が挙げられる。

【0123】

６．６．３ ＨＭＧ－ＣｏＡのメバロン酸への変換
[00135] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換することができる酵素、例えばＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを使用するヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ－ＣｏＡレダクターゼである。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（EC1.1.1.34；EC1.1.1.88）は、（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡから（Ｒ）－メバロン酸への還元的な脱アシル化を触媒し、２つのクラス、すなわちクラスＩおよびクラスＩＩのＨＭＧｒに類別することができる。クラスＩは、真核生物およびほとんどの古細菌由来の酵素を包含し、クラスＩＩは、ある特定の原核生物および古細菌のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを包含する。配列の分岐に加えて、２つのクラスの酵素は、それらの補因子の特異性に関しても異なる。もっぱらＮＡＤＰＨを利用するクラスＩ酵素とは異なり、クラスＩＩのＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨとを識別する能力の点で違いがある。例えば、Ｈｅｄｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８６（７）：１９２７～１９３２（２００４）を参照されたい。選ばれたクラスＩＩのＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼに対する補因子の特異性を以下に示す。

【0124】

【表1】

【0125】

[00136] 本明細書で提供される組成物および方法にとって有用なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼとしては、補因子としてＮＡＤＨを利用できるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。特定の実施形態において、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉまたはＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、補因子としてＮＡＤＨのみを利用することが可能である。

【0126】

[00137] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ由来である。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（EC1.1.1.88）をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉの野生型ｍｖａＡ遺伝子の配列は、これまでに記載されている。ＢｅａｃｈおよびＲｏｄｗｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：２９９４～３００１（１９８９）を参照されたい。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉの代表的なｍｖａＡヌクレオチド配列としては、受託番号Ｍ２４０１５が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＡＡＡ２５８３７、Ｐ１３７０２、ＭＶＡＡ＿ＰＳＥＭＶが挙げられる。

【0127】

[00138] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉ由来である。Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＣ＿００６５６９．１が挙げられる。Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿１６４９９４が挙げられる。

【0128】

[00139] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来である。Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、ＮＣ＿０１０００２領域：相補物（319980..321269）が挙げられる。Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿００１５６１３１８が挙げられる。

【0129】

[00140] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来である（Crane et al., J. Plant Physiol. 159：1301-1307（2002））。

【0130】

[00141] 同様に本明細書で提供される組成物および方法において有用なＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼとしてはまた、本明細書に記載されるＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのいずれかの「誘導体」と称される分子、例えばＰ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉおよびＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来のものも挙げられる。このような「誘導体」は、以下の特徴を有する：（１）本明細書に記載されるＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのいずれかと実質的な相同性を共有する；および（２）補因子として優先的にＮＡＤＨを使用しながら（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡから（Ｒ）－メバロン酸への還元的な脱アシル化を触媒できる。ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である場合、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼと「実質的な相同性」を共有すると称される。

【0131】

[00142] 「ＮＡＤＨを使用する」という句は、本明細書で使用される場合、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼが、例えばＮＡＤＰＨに比べてＮＡＤＨにより特異的な活性を有することを実証することによって、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨに選択的であることを意味する。一部の実施形態において、補因子としてのＮＡＤＨへの選択性は、ｋ_ｃａｔ ^{（ＮＡＤＨ）}／ｋ_ｃａｔ ^{（ＮＡＤＰＨ）}の比率として表される。一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または２５より大きいｋ_ｃａｔ ^{（ＮＡＤＨ）}／ｋ_ｃａｔ ^{（ＮＡＤＰＨ）}の比率を有する。一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨのみを使用する。例えば、ＮＡＤＨのみを使用するＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、インビトロで単独の補因子として供給されたＮＡＤＨで一定の活性を呈示すが、単独の補因子としてＮＡＤＰＨが供給される場合、検出可能な活性を呈示しない。補因子としてＮＡＤＨを選択的に用いるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを同定するための当業界において公知の補因子の特異性を決定するための任意の方法を利用することができ、このような方法としては、Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１２２６～１２３４（２０００）；およびＷｉｌｄｉｎｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１８）：５１４７～５２（２０００）によって記載されたものが挙げられ、これらの内容は、本明細書にそれらの全体が取り入れられる。

【0132】

[00143] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、例えば補因子結合ポケットの部位特異的変異誘発を介して、ＮＡＰＤＨよりＮＡＤＨに選択的になるように操作される。ＮＡＤＨ選択性を操作するための方法は、Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５３：３０４４～３０５４（２００７）に記載されており、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの補因子の特異性を決定するための方法は、Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９：１２２６～１２３４（２０００）に記載されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

【0133】

[00144] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、生来的にメバロン酸分解経路を含む宿主種、例えば、その単独の炭素源としてメバロン酸を異化する宿主種由来である。これらの実施形態の範囲内で、通常、その生来的な宿主細胞内に内在化した（Ｒ）－メバロン酸から（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡへの酸化的アシル化を触媒するＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、メバロン酸生合成経路を含む遺伝子改変された宿主細胞において、逆反応、すなわち（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡから（Ｒ）－メバロン酸の還元的な脱アシル化を触媒するのに利用される。単独の炭素源としてメバロン酸で増殖することが可能な原核生物は、Anderson et al., J. Bacteriol, 171(12):6468-6472 (1989); Beach et al., J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989); Bensch et al., J. Biol. Chem. 245:3755-3762; Fimongnari et al., Biochemistry 4:2086-2090 (1965); Siddiqi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 8:110-113 (1962); Siddiqi et al., J. Bacteriol. 93:207-214 (1967);およびTakatsuji et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.110:187-193 (1983)に記載されており、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

【0134】

[00145] 本明細書で提供される組成物および方法の一部の実施形態において、宿主細胞は、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧｒとＮＡＤＰＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの両方を含む。ＮＡＤＰＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（NM_206548；Drosophila melanogaster）、（NC_002758、遺伝子座タグSAV2545、遺伝子番号1122570；Staphylococcus aureus）、（AB015627；ストレプトマイセス属種KO3988）、（短縮型HMG-CoAレダクターゼをコードする配列を提供するAX128213；Saccharomyces cerevisiae）、および（NC_001145：相補物（115734.118898；Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。

【0135】

６．６．４ メバロン酸のメバロン酸－５－リン酸への変換
[00146] 一部の実施形態において、宿主細胞は、メバロン酸をメバロン酸５－リン酸に変換することができる酵素、例えばメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（L77688；Arabidopsis thaliana）、および（X55875；Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。

【0136】

６．６．５ メバロン酸－５－リン酸のメバロン酸－５－ピロリン酸への変換
[00147] 一部の実施形態において、宿主細胞は、メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸に変換することができる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（AF429385；Hevea brasiliensis）、（NM_006556；Homo sapiens）、および（NC_001145.相補物712315.713670；Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。

【0137】

６．６．６ メバロン酸－５－ピロリン酸のＩＰＰへの変換
[00148] 一部の実施形態において、宿主細胞は、メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（IPP）に変換することができる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（X97557；Saccharomyces cerevisiae）、（AF290095；Enterococcus faecium）、および（U49260；Homo sapiens）が挙げられる。

【0138】

６．６．７ ＩＰＰのＤＭＡＰＰへの変換
[00149] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路を介して生成したＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）に変換することができる酵素、例えばＩＰＰイソメラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（NC_000913、3031087.3031635；Escherichia coli）、および（AF082326；Haematococcus pluvialis）が挙げられる。

【0139】

６．６．８ ポリプレニルシンターゼ
[00150] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して５個より多くの炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。

【0140】

[00151] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰの１つの分子をＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合してゲラニルピロリン酸（「GPP」）の１つの分子を形成することができる酵素、例えばＧＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（AF513111；Abies grandis）、（AF513112；Abies grandis）、（AF513113；Abies grandis）、（AY534686；Antirrhinum majus）、（AY534687；Antirrhinum majus）、（Y17376；Arabidopsis thaliana）、（AE016877、遺伝子座AP11092；Bacillus cereus；ATCC14579）、（AJ243739；Citrus sinensis）、（AY534745；Clarkia breweri）、（AY953508；Ips pini）、（DQ286930；Lycopersicon esculentum）、（AF182828；Mentha x piperita）、（AF182827；Mentha x piperita）、（MPI249453；Mentha x piperita）、（PZE431697、遺伝子座CAD24425；Paracoccus zeaxanthinifaciens）、（AY866498；Picrorhiza kurrooa）、（AY351862；Vitis vinifera）、および（AF203881、遺伝子座AAF12843；Zymomonas mobilis）が挙げられる。

【0141】

[00152] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰの２つの分子をＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合する、またはＩＰＰの分子をＧＰＰの分子に付加して、ファルネシルピロリン酸（「FPP」）の分子を形成することができる酵素、例えばＦＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（ATU80605；Arabidopsis thaliana）、（ATHFPS2R；Arabidopsis thaliana）、（AAU36376；Artemisia annua）、（AF461050；Bos taurus）、（D00694；Escherichia coli K-12）、（AE009951、遺伝子座AAL95523；Fusobacterium nucleatum亜種nucleatum ATCC25586）、（GFFPPSGEN；Gibberella fujikuroi）、（CP000009、遺伝子座AAW60034；Gluconobacter oxydans 621H）、（AF019892；Helianthus annuus）、（HUMFAPS；Homo sapiens）、（KLPFPSQCR；Kluyveromyces lactis）、（LAU15777；Lupinus albus）、（LAU20771；Lupinus albus）、（AF309508；Mus musculus）、（NCFPPSGEN；Neurospora crassa）、（PAFPS1；Parthenium argentatum）、（PAFPS2；Parthenium argentatum）、（RATFAPS；Rattus norvegicus）、（YSCFPP；Saccharomyces cerevisiae）、（D89104；Schizosaccharomyces pombe）、（CP000003、遺伝子座AAT87386；Streptococcus pyogenes）、（CP000017、遺伝子座AAZ51849；Streptococcus pyogenes）、（NC_008022、遺伝子座YP_598856；Streptococcus pyogenes MGAS10270）、（NC_008023、遺伝子座YP_600845；Streptococcus pyogenes MGAS2096）、（NC_008024、遺伝子座YP_602832；Streptococcus pyogenes MGAS10750）、（MZEFPS；Zea mays）、（AE000657、遺伝子座AAC06913；Aquifex aeolicus VF5）、（NM_202836；Arabidopsis thaliana）、（D84432、遺伝子座BAA12575；Bacillus subtilis）、（U12678、遺伝子座AAC28894；Bradyrhizobium japonicum USDA 110）、（BACFDPS；Geobacillus stearothermophilus）、（NC_002940、遺伝子座NP_873754；Haemophilus ducreyi 35000HP）、（L42023、遺伝子座AAC23087；Haemophilus influenzae Rd KW20）、（J05262；Homo sapiens）、（YP_395294；Lactobacillus sakei亜種sakei 23K）、（NC_005823、遺伝子座YP_000273；Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130）、（AB003187；Micrococcus luteus）、（NC_002946、遺伝子座YP_208768；Neisseria gonorrhoeae FA1090）、（U00090、遺伝子座AAB91752；リゾビウム属種NGR234）、（J05091；Saccharomyces cerevisae）、（CP000031、遺伝子座AAV93568；Silicibacter pomeroyi DSS-3）、（AE008481、遺伝子座AAK99890；Streptococcus pneumoniae R6）、および（NC_004556、遺伝子座NP779706；Xylella fastidiosa Temecula1）が挙げられる。

【0142】

[00153] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰまたはＩＰＰとＦＰＰを化合させてゲラニルゲラニルピロリン酸（「GGPP」）を形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（ATHGERPYRS；Arabidopsis thaliana）、（BT005328；Arabidopsis thaliana）、（NM_119845；Arabidopsis thaliana）、（NZ_AAJM01000380、遺伝子座ZP_00743052；Bacillus thuringiensis serovar israelensis、ATCC35646sq1563）、（CRGGPPS；Catharanthus roseus）、（NZ_AABF02000074、遺伝子座ZP_00144509；Fusobacterium nucleatum亜種vincentii、ATCC49256）、（GFGGPPSGN；Gibberella fujikuroi）、（AY371321；Ginkgo biloba）、（AB055496；Hevea brasiliensis）、（AB017971；Homo sapiens）、（MCI276129；Mucor circinelloides f. lusitanicus）、（AB016044；Mus musculus）、（AABX01000298、遺伝子座NCU01427；Neurospora crassa）、（NCU20940；Neurospora crassa）、（NZ_AAKL01000008、遺伝子座ZP_00943566；Ralstonia solanacearum UW551）、（AB118238；Rattus norvegicus）、（SCU31632；Saccharomyces cerevisiae）、（AB016095；Synechococcus elongates）、（SAGGPS；Sinapis alba）、（SSOGDS；Sulfolobus acidocaldarius）、（NC_007759、遺伝子座YP_461832；Syntrophus aciditrophicus SB）、（NC_006840、遺伝子座YP_204095；Vibrio fischeri ES114）、（NM_112315；Arabidopsis thaliana）、（ERWCRTE；Pantoea agglomerans）、（D90087、遺伝子座BAA14124；Pantoea ananatis）、（X52291、遺伝子座CAA36538；Rhodobacter capsulatus）、（AF195122、遺伝子座AAF24294；Rhodobacter sphaeroides）、および（NC_004350、遺伝子座NP_721015；Streptococcus mutans UA159）が挙げられる。

【0143】

[00154] メバロン酸経路の酵素の例は上述した通りであるが、ある特定の実施形態において、ＤＸＰ経路の酵素は、本明細書に記載される宿主細胞、組成物および方法においてＤＭＡＰＰおよびＩＰＰを産生するための代替または追加の経路として使用することができる。ＤＸＰ経路の酵素およびその酵素をコードする核酸は周知であり、当業界において特徴づけられている。ＷＯ２０１２／１３５５９１Ａ２。

【0144】

６．７ ステビオール配糖体を産生する方法
[00155] 別の態様において、本明細書に記載されるいずれかのＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、UGT40087または任意のバリアントUGT40087）を使用してあるステビオール配糖体を別のステビオール配糖体に変換することによる、ステビオール配糖体を産生するための方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能な本明細書に記載されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのいずれかを使用して、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することを含む、ＲｅｂＤを産生するための方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＭを産生するための方法であって、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能な本明細書に記載されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのいずれかを使用して、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換すること；およびＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することが可能なＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを使用して、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することを含む方法が本明細書で提供される。

【0145】

[00156] ある特定の実施形態において、ステビオール配糖体（例えばRebAまたはRebD）またはステビオール配糖体を含む組成物は、好適な条件下で、本明細書に記載されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ－糖のいずれかと接触させて、望ましいステビオール配糖体（例えば、RebM）を産生することができる。このような方法は、インビボで実行してもよいし、またはインビトロで実行してもよい。例示的なＵＤＰ－糖としては、ＵＤＰ－単糖、ＵＤＰ－キシロースまたはＵＤＰ－ラムノースが挙げられる。

【0146】

[00157] 別の態様において、ステビオール配糖体を産生するための方法であって、（ａ）ステビオール配糖体化合物の生成に好適な条件下で、ステビオール配糖体を産生することが可能な本明細書に記載される遺伝子改変された宿主細胞のいずれかの集団を、炭素源を含む培地中で培養する工程；および（ｂ）培地から前記ステビオール配糖体化合物を回収する工程を含む方法が本明細書で提供される。

【0147】

[00158] 一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、１つまたは複数の改変を含まない親細胞、または遺伝子改変された宿主細胞の１つまたは複数の改変の一部分のみを含むがそれ以外の点で遺伝学的に同一な親細胞と比較して、増加した量のステビオール配糖体を産生する。一部の実施形態において、増加した量は、例えば、細胞培養液１リットル当たりのグラムで、乾燥細胞重量１グラム当たりのミリグラムで、細胞培養液の単位体積当たり、単位乾燥細胞重量当たり、単位時間当たりの細胞培養液の単位体積当たり、または単位時間当たりの単位乾燥細胞重量当たりの、収量、産生量、産生能で測定した場合、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％より大きい。

【0148】

[00159] 一部の実施形態において、宿主細胞は、発酵培地１リットル当たり約１０グラムより多くの上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。一部のこのような実施形態において、ステビオール配糖体は、細胞培養液１リットル当たり約１０～約５０グラム、細胞培養液１リットル当たり約１５グラムより多く、細胞培養液１リットル当たり約２０グラムより多く、細胞培養液１リットル当たり約２５グラムより多く、細胞培養液１リットル当たり約３０グラムより多く、細胞培養液１リットル当たり約３５グラムより多く、細胞培養液１リットル当たり約４０グラムより多く、細胞培養液１リットル当たり約４５グラムより多く、または細胞培養液１リットル当たり約５０グラムより多くの量で産生される。

【0149】

[00160] 一部の実施形態において、宿主細胞は、乾燥細胞重量１グラム当たり約５０ミリグラムより多くの上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。一部のこのような実施形態において、ステビオール配糖体は、乾燥細胞重量１グラム当たり、約５０～約１５００ミリグラム、約１００ミリグラムより多く、約１５０ミリグラムより多く、約２００ミリグラムより多く、約２５０ミリグラムより多く、約５００ミリグラムより多く、約７５０ミリグラムより多く、または約１０００ミリグラムより多くの量で産生される。

【0150】

[00161] 一部の実施形態において、宿主細胞は、細胞培養液の単位体積当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、またはそれより高い倍率で、親細胞によって産生されたステビオール配糖体のレベルより高く上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。

【0151】

[00162] 一部の実施形態において、宿主細胞は、単位乾燥細胞重量当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、またはそれより高い倍率で、親細胞によって産生されたステビオール配糖体のレベルより高く上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。

【0152】

[00163] 一部の実施形態において、宿主細胞は、単位時間当たりの細胞培養液の単位体積当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、またはそれより高い倍率で、親細胞によって産生されたステビオール配糖体のレベルより高く上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。

【0153】

[00164] 一部の実施形態において、宿主細胞は、単位時間当たりの単位乾燥細胞重量当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、もしくは少なくとも約１，０００倍、またはそれより高い倍率で、親細胞によって産生されたステビオール配糖体のレベルより高く上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。

【0154】

[00165] ほとんどの実施形態において、宿主細胞によるステビオール配糖体の上昇したレベルの産生は、抑制化合物（repressing compound）によって制御される。このような宿主細胞は、抑制化合物の存在下で容易に操作することができる。次いで抑制化合物を除去して、宿主細胞によるステビオール配糖体の上昇したレベルの産生を誘導する。他の実施形態において、宿主細胞によるステビオール配糖体の上昇したレベルの産生は、例えば増殖温度、培地成分などの培養条件を変化させることによって誘導することができる。

【0155】

６．８ 培養培地および条件
[00166] 微生物培養物の維持および増殖のための材料および方法は、微生物学 または発酵科学分野の当業者に周知である（例えば、Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, 第2版, McGraw Hill, New York, 1986を参照されたい）。宿主細胞、発酵、およびプロセスの具体的な必要条件に応じて、好気性、微好気性、または嫌気性条件にとって適切な培養培地、ｐＨ、温度、および必要条件の検討が必要である。

【0156】

[00167] 本明細書で提供されるステビオール配糖体を産生する方法は、これらに限定されないが、細胞培養プレート、フラスコ、または発酵槽などの好適な容器中で、好適な培養培地（例えば、パントテン酸補充有りまたは無し）で実行することができる。さらに本方法は、微生物生成物の工業的産生を維持するために、当業界において公知の任意の発酵規模で実行することができる。撹拌タンク発酵槽、エアリフト式発酵槽、気泡式発酵槽、またはそれらの任意の組合せなどの任意の好適な発酵槽を使用することができる。宿主細胞としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを利用する特定の実施形態において、ＫｏｓａｒｉｃらによりＵｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６版、１２巻、３９８～４７３頁、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＤａＡ、ヴァインハイム、ドイツで詳細に説明されるようにして、株を発酵槽中で増殖させることができる。

【0157】

[00168] 一部の実施形態において、培養培地は、ステビオール配糖体を産生することが可能な遺伝子改変された微生物が生存できる、すなわち増殖および生存を維持することができる任意の培養培地である。一部の実施形態において、培養培地は、消化可能な炭素、窒素およびホスフェート源を含む水性培地である。このような培地はまた、適切な塩、無機物質、金属および他の栄養素を包含していてもよい。一部の実施形態において、炭素源および必須の細胞栄養素のそれぞれは、少しずつ量を増やして、または連続的に発酵培地に添加され、それぞれの必要な栄養素は、例えば、炭素源をバイオマスに変換する細胞の代謝または呼吸機能に基づき予め決定された細胞増殖曲線に従って、増殖中の細胞による効率的な同化に必要な本質的に最小限のレベルで維持される。

【0158】

[00169] 微生物の培養に好適な条件および好適な培地は当業界において周知である。一部の実施形態において、好適な培地には、１種または複数の追加の物質、例えば、誘導物質（例えば、遺伝子産物をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）、抑制因子（例えば、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が抑制性プロモーターの制御下にある場合）、または選択物質（例えば、遺伝学的改変を含む微生物を選択するための抗生物質）などが補充される。

【0159】

[00170] 一部の実施形態において、炭素源は、単糖類（単糖）、二糖類、多糖類、非発酵性の炭素源、またはそれらの１種または複数の組合せである。好適な単糖類の非限定的な例としては、グルコース、マンノース、フルクトース、キシロース、リボース、およびそれらの組合せが挙げられる。好適な二糖類の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、ガラクトース、トレハロース、セロビオース、およびそれらの組合せが挙げられる。好適な多糖類の非限定的な例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、およびそれらの組合せが挙げられる。好適な非発酵性の炭素源の非限定的な例としては、アセテートおよびグリセロールが挙げられる。

【0160】

[00171] 培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、細胞増殖を促進するが、使用される微生物の増殖を抑制するほど高くするべきではない。典型的には、発酵培養は、グルコースなどの炭素源を用いて行われ、このような炭素源は、増殖およびバイオマスの望ましいレベルを達成するレベルであるが、検出不可能なレベルで添加される（検出限界は約＜０．１ｇ／ｌである）。他の実施形態において、培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、約１ｇ／Ｌより高く、好ましくは約２ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約５ｇ／Ｌより高い。加えて、培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、典型的には約１００ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２０ｇ／Ｌ未満である。培養成分の濃度への言及は、最初のおよび／または進行中の成分濃度の両方を指す可能性があることに留意されたい。一部のケースにおいて、培養中に培養培地の炭素源を枯渇させることが望ましい場合がある。

【0161】

[00172] 好適な培養培地で使用できる消化可能な窒素源としては、これらに限定されないが、単純な窒素源、有機窒素源および複合的な窒素源が挙げられる。このような窒素源としては、無水アンモニア、アンモニウム塩、ならびに動物性、植物性および／または微生物起源の物質が挙げられる。好適な窒素源としては、これらに限定されないが、タンパク質加水分解物、微生物のバイオマス加水分解物、ペプトン、酵母抽出物、硫酸アンモニウム、尿素、およびアミノ酸が挙げられる。培養培地中の窒素源の濃度は、典型的には約０．１ｇ／Ｌより高く、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約１．０ｇ／Ｌより高い。しかしながら、培養培地への窒素源の添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。結果として、培養培地中の窒素源の濃度は、約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約５ｇ／Ｌ未満である。さらに、一部の場合において、培養中に培養培地の窒素源を枯渇させることが望ましい場合がある。

【0162】

[00173] 有効な培養培地は、無機塩、ビタミン、微量金属または増殖促進物質などの他の化合物を含有していてもよい。このような他の化合物はまた、有効な培地中の炭素、窒素または無機物質源中に存在するものでもよいし、または具体的に培地に添加されてもよい。

【0163】

[00174] 培養培地はまた、好適なホスフェート源を含有していてもよい。このようなホスフェート源としては、無機および有機ホスフェート源の両方が挙げられる。好ましいホスフェート源としては、これらに限定されないが、リン酸塩、例えば一または二塩基性のリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、リン酸アンモニウムならびにそれらの混合物が挙げられる。培養培地中のホスフェート濃度は、典型的には約１．０ｇ／Ｌより高く、好ましくは約２．０ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約５．０ｇ／Ｌより高い。しかしながら、培養培地へのホスフェートの添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培養培地中のホスフェート濃度は、典型的には約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満である。

【0164】

[00175] 好適な培養培地はまた、マグネシウム源を、好ましくは生理学的に許容される塩、例えば硫酸マグネシウム七水和物の形態で包含していてもよいが、他のマグネシウム源も類似の量のマグネシウムを付与する濃度で使用することができる。培養培地中のマグネシウムの濃度は、典型的には約０．５ｇ／Ｌより高く、好ましくは約１．０ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約２．０ｇ／Ｌより高い。しかしながら、培養培地へのマグネシウムの添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培養培地中のマグネシウムの濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約３ｇ／Ｌ未満である。さらに、一部の場合において、培養中に培養培地のマグネシウム源を枯渇させることが望ましい場合がある。

【0165】

[00176] 一部の実施形態において、培養培地はまた、生物学的に許容できるキレート剤、例えばクエン酸三ナトリウムの二水和物を包含していてもよい。このような例において、培養培地中のキレート剤の濃度は、約０．２ｇ／Ｌより高く、好ましくは約０．５ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約１ｇ／Ｌより高い。しかしながら、培養培地へのキレート剤の添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培養培地中のキレート剤の濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２ｇ／Ｌ未満である。

【0166】

[00177] 培養培地はまた、最初のうちは、培養培地の望ましいｐＨを維持するために、生物学的に許容できる酸または塩基を包含していてもよい。生物学的に許容できる酸としては、これらに限定されないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸およびそれらの混合物が挙げられる。生物学的に許容できる塩基としては、これらに限定されないが、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよびそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態において、使用される塩基は、水酸化アンモニウムである。

【0167】

[00178] 培養培地はまた、これらに限定されないが、塩化カルシウムなどの生物学的に許容できるカルシウム源を包含していてもよい。培養培地中のカルシウム源、例えば塩化カルシウム二水和物の濃度は、典型的には、約５ｍｇ／Ｌ～約２０００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約５０ｍｇ／Ｌ～約５００ｍｇ／Ｌの範囲内である。

【0168】

[00179] 培養培地はまた、塩化ナトリウムを包含していてもよい。培養培地中の塩化ナトリウムの濃度は、典型的には約０．１ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約２ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの範囲内である。

【0169】

[00180] 一部の実施形態において、培養培地はまた、微量金属を包含していてもよい。このような微量金属は、便宜上培養培地の残りから別々に調製することができるストック溶液として培養培地に添加することができる。典型的には、このような培養培地に添加される微量金属溶液の量は、約１ｍｌ／Ｌより多く、好ましくは約５ｍＬ／Ｌより多く、より好ましくは約１０ｍＬ／Ｌより多い。しかしながら、培養培地への微量金属の添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。したがって、このような培養培地に添加される微量金属溶液の量は、典型的には約１００ｍＬ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌ未満、より好ましくは約３０ｍＬ／Ｌ未満である。微量金属をストック溶液で添加することに加えて、個々の成分を、それぞれ上記した微量金属溶液の範囲によって決定された成分の量に個別に対応する範囲内で別々に添加してもよいことに留意されたい。

【0170】

[00181] 培養培地は、他のビタミン、例えばパントテン酸塩、ビオチン、カルシウム、パントテン酸塩、イノシトール、ピリドキシン－ＨＣｌ、およびチアミン－ＨＣｌを包含していてもよい。このようなビタミンは、便宜上培養培地の残りから別々に調製することができるストック溶液として培養培地に添加することができる。しかしながら、培養培地へのビタミンの添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。

【0171】

[00182] 本明細書に記載される発酵方法は、従来の培養様式で実行することができ、このような様式としては、これらに限定されないが、バッチ、流加培養、細胞再循環、連続および半連続様式が挙げられる。一部の実施形態において、発酵は、流加培養様式で行われる。このようなケースにおいて、例えば発酵産生段階中のパントテン酸塩など、培養中に培地の成分の一部を枯渇させる。一部の実施形態において、開始時には、例えば産生段階の開始時には、添加が必要になる前の期間にわたり増殖および／またはステビオール配糖体産生が続くように、このような成分が比較的高い濃度で培養物に補充されていてもよい。これらの成分の好ましい範囲は、培養によってレベルが下がったときに添加を行うことによって培養中にわたり維持される。培養培地中の成分のレベルは、例えば培養培地を定期的にサンプリングし濃度をアッセイすることによってモニターすることができる。代替として、標準的な培養手順が一旦開発されたら、培養中にわたり特定の時間で、公知のレベルに対応する時間を定められたインターバルで添加を行うことができる。これは当業者には認識されるであろうが、栄養素の消費速度は、培養中、培地の細胞密度が増加するにつれて増加する。さらに、培養培地への外来微生物の導入を回避するために、添加は、当業界において公知のように、無菌の添加方法を使用して実行される。加えて、培養中に少量の消泡剤が添加されていてもよい。

【0172】

[00183] 培養培地の温度は、遺伝子改変された細胞の増殖および／またはステビオール配糖体の産生に好適な任意の温度であり得る。例えば、培養培地に接種材料を植え付ける前に、培養培地は、約２０℃～約４５℃の範囲の温度、好ましくは約２５℃～約４０℃の範囲、より好ましくは約２８℃～約３２℃の範囲の温度にして、その温度を維持してもよい。

【0173】

[00184] 培養培地のｐＨは、培養培地への酸または塩基の添加によって制御することができる。このようなケースにおいて、ｐＨを制御するのにアンモニアが使用される場合、アンモニアも、培養培地中の窒素源として好都合に役立つ。好ましくは、ｐＨは、約３．０～約８．０、より好ましくは約３．５～約７．０、最も好ましくは約４．０～約６．５に維持される。

【0174】

[00185] 一部の実施形態において、培養培地の炭素源濃度、例えばグルコース濃度は、培養中にモニターされる。培養培地のグルコース濃度は、上清中のグルコース濃度、例えば培養培地の無細胞成分をモニターするのに使用することができる、例えばグルコースオキシダーゼ酵素試験または高圧液体クロマトグラフィーの使用などの公知の技術を使用して、モニターすることができる。これまでに述べたように、炭素源濃度は、細胞増殖の阻害が起こるレベル未満に維持するべきである。炭素源としてのグルコースに関してこのような濃度は生物ごとに変更できるが、細胞増殖の阻害は、約６０ｇ／Ｌより高いグルコース濃度で起こり、試験によって容易に決定することができる。したがって、グルコースが炭素源として使用される場合、好ましくは、グルコースは発酵槽にフィードされ、検出限界未満で維持される。代替として、培養培地中のグルコース濃度は、約１ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌの範囲、より好ましくは約２ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの範囲、その上さらにより好ましくは約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌの範囲で維持される。炭素源の濃度は、例えば実質的に純粋なグルコース溶液の添加によって望ましいレベル内に維持できるが、元の培養培地のアリコートの添加によって培養培地の炭素源の濃度を維持することが許容でき、好ましい場合がある。元の培養培地のアリコートの使用は、培地中の他の栄養素（例えば窒素およびリン酸源）の濃度も同時に維持できるため望ましい。同様に、微量金属の濃度は、微量金属溶液のアリコートの添加によって培養培地中で維持することができる。

【0175】

[00186] 他の好適な発酵培地および方法は、例えば、ＷＯ２０１６／１９６３２１に記載されている。

【0176】

６．９ 発酵組成物
[00187] 別の態様において、本明細書に記載される遺伝子改変された宿主細胞および遺伝子改変された宿主細胞から産生されたステビオール配糖体を含む発酵組成物が本明細書で提供される。発酵組成物は、培地をさらに含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、遺伝子改変された宿主細胞を含み、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭをさらに含む。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される発酵組成物は、遺伝子改変された宿主細胞から産生されたステビオール配糖体の主成分として、ＲｅｂＭを含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭを、少なくとも１：７：５０の比率で含む。他の実施形態において、発酵組成物は、（RebA+RebD）およびＲｅｂＭを、少なくとも８：５０の比率で含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭを、少なくとも１：７：５０～１：１００：１０００の比率で含む。他の実施形態において、発酵組成物は、（RebA+RebD）およびＲｅｂＭを、少なくとも８：５０～１０１：１０００の比率で含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、少なくとも１：７：５０～１：２００：２０００の比率を含む。他の実施形態において、発酵組成物は、（RebA+RebD）およびＲｅｂＭを、少なくとも８：５０～２０１：２０００の比率で含む。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭの比率は、遺伝子改変された宿主細胞および培地に付随するこれら３種のステビオール配糖体の総含量に基づく。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭの比率は、培地中のこれら３種のステビオール配糖体の総含量に基づく。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭの比率は、遺伝子改変された宿主細胞に付随するこれら３種のステビオール配糖体の総含量に基づく。

【0177】

[00188] 他の実施形態において、発酵組成物は、遺伝子改変された宿主細胞を含み、ＲｅｂＡおよびＲｅｂＭをさらに含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＡおよびＲｅｂＭを、少なくとも１：５０のＲｅｂＡ：ＲｅｂＭの比率で含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＡおよびＲｅｂＭを、少なくとも１：５０～１：１０００のＲｅｂＡ：ＲｅｂＭの比率で含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＡおよびＲｅｂＭを、少なくとも１：５０～１：２０００のＲｅｂＡ：ＲｅｂＭの比率で含む。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡとＲｅｂＭとの比率は、遺伝子改変された宿主細胞および培地に付随するこれらの２種のステビオール配糖体の総含量に基づく。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡとＲｅｂＭとの比率は、培地中のこれらの２種のステビオール配糖体の総含量に基づく。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡとＲｅｂＭとの比率は、遺伝子改変された宿主細胞に付随するこれらの２種のステビオール配糖体の総含量に基づく。

【0178】

[00189] さらなる実施形態において、発酵組成物は、遺伝子改変された宿主細胞を含み、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭをさらに含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭを、少なくとも７：５０のＲｅｂＤ：ＲｅｂＭの比率で含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭを、少なくとも７：５０～７：１００のＲｅｂＤ：ＲｅｂＭの比率で含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭを、少なくとも７：５０～７：２００のＲｅｂＤ：ＲｅｂＭの比率で含む。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭの比率は、遺伝子改変された宿主細胞および培地に付随するこれらの２種のステビオール配糖体の総含量に基づく。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの比率は、培地中のこれらの２種のステビオール配糖体の総含量に基づく。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの比率は、遺伝子改変された宿主細胞に付随するこれらの２種のステビオール配糖体の総含量に基づく。

【0179】

[00190] ある特定の実施形態において、本明細書で提供される発酵組成物は、ＲｅｂＭ２を検出不可能なレベルで含有する。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される発酵組成物は、天然に存在しないステビオール配糖体を検出不可能なレベルで含有する。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される発酵組成物は、ＧＣ－クロマトグラフィーに供される場合、ＲｅｂＡのピークとＲｅｂＢとの間に検出可能なレベルで「ステビオール＋２種のグルコース」ピークを生じない。

【0180】

６．１０ ステビオール配糖体の回収
[00191] ステビオール配糖体が宿主細胞によって産生されたら、それを、当業界において公知の任意の好適なステビオール配糖体の分離および精製方法などの任意の好適な分離および精製方法を使用して、それに続く使用のために回収または単離することができる。好適な方法は、例えば、米国特許第７，８３８，０４４号および８，９８１，０８１号；米国特許出願第１４／６０３，９４１号、１４／０３３，５６３号、１４／３６２，２７５号、１４／６１３，６１５号、１４／６１５，８８８号；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／０７０５６２号、およびＰＣＴ／ＵＳ１４／０３１１２９号に記載されている。これらの文書の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に包含される。一部の実施形態において、ステビオール配糖体を含む水相は、遠心分離によって発酵物から分離される。他の実施形態において、ステビオール配糖体を含む水相は、発酵物から自発的に分離する。他の実施形態において、ステビオール配糖体を含む水相は、発酵反応物に解乳化剤および／または造核剤を添加することによって発酵物から分離される。解乳化剤の説明に役立つ例としては、凝集剤および凝固剤が挙げられる。造核剤の説明に役立つ例としては、ステビオール配糖体それ自体の液滴、ならびにドデカン、ミリスチン酸イソプロピル（isopropyl myristrate）、およびオレイン酸メチルなどの有機溶媒が挙げられる。

【0181】

[00192] これらの細胞で産生されたステビオール配糖体は、培養上清中に、および／または宿主細胞に付随して存在していてもよい。ステビオール配糖体が宿主細胞に付随する実施形態において、ステビオール配糖体の回収は、細胞を透過化するかまたは溶解させる方法を含んでいてもよい。代替として、または同時に、培養培地中のステビオール配糖体は、これらに限定されないが、クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、抽出、溶媒抽出、膜分離、電気透析、逆浸透、蒸留、化学的な誘導体化および結晶化などの回収プロセスを使用して回収することができる。

【0182】

[00193] 一部の実施形態において、ステビオール配糖体は、水相中に存在し得る他の生成物から分離される。一部の実施形態において、分離は、吸着、蒸留、気液抽出（ストリッピング）、液液抽出（溶媒抽出）、真空抽出、蒸発、限外ろ過、および標準的なクロマトグラフ技術を使用して達成される。他の好適な発酵培地および方法は、例えば、米国特許出願公開公報第２０１６／０１８５８１３号、２０１７／０１９０７２８号、ＷＯ／２０１７／０９３８９５に記載されている。他の好適な方法は、例えば、米国特許第７，８３８，０４４号および８，９８１，０８１号；米国特許出願第１４／６０３，９４１号、１４／０３３，５６３号、１４／３６２，２７５号、１４／６１３，６１５号および１４／６１５，８８８号；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／０７０５６２号、およびＰＣＴ／ＵＳ１４／０３１１２９号に記載されている。これらの文書の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に包含される。

【0183】

[00194] ある特定の実施形態において、回収されたステビオール配糖体は、様々な最終製品で使用することができる。例えば、精製されたＲｅｂＭ化合物またはＲｅｂＭを含む組成物は、任意の消耗製品、例えば食品、医薬品、栄養補助サプリメント、または栄養補給サプリメントで使用することができる。特定の実施形態において、ＲｅｂＭを含む消耗品は、ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、前記請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ＲｅｂＭ化合物を回収すること、のプロセスによって生成される。

【0184】

[0195] 甘味料組成物は、本明細書で使用される場合、少なくとも１種の甘味成分を、例えば別の甘味料または添加剤などの少なくとも１つの他の物質と組み合わせて含有する組成物を意味する。

【0185】

[0196] 甘味付与可能な組成物は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは動物の口と接触する物質、例えば、口に入りその後口から排出される物質、および飲む、食べる、嚥下する、またはそれ以外の方法で摂取される物質などを意味し、一般的に許容できる範囲で使用される場合、ヒトまたは動物の摂取にとって安全である。

【0186】

[0197] 甘味付与組成物（sweetened composition）は、本明細書で使用される場合、甘味付与可能な組成物と甘味料または甘味料組成物の両方を含有する物質を意味する。例えば、甘味料成分を含まない飲料は、一種の甘味付与可能な組成物である。本発明の方法によって産生されたＲｅｂＭおよびエリスリトールを含む甘味料組成物を、甘味付与されていない飲料に添加することによって、甘味付与飲料を提供することができる。甘味付与飲料は、一種の甘味付与組成物である。好適な甘味料組成物、甘味付与組成物およびそれらの生成方法は、例えばＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／０７０５６２に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に包含される。

【0187】

[0198] 一実施形態において、ＲｅｂＭを含む甘味料は、ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、前記請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ＲｅｂＭ化合物を回収すること、のプロセスによって生成される。別の実施形態において、少なくとも１つの他の物質およびＲｅｂＭを含む甘味料組成物は、ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、前記請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すし；培地から前記ＲｅｂＭ化合物を回収するプロセスによって生成される。別の実施形態において、ＲｅｂＭを含む甘味付与組成物は、ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、前記請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ＲｅｂＭ化合物を回収すること、のプロセスによって生成される。一実施形態は、甘味料組成物を生成する方法であって、ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、前記請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ＲｅｂＭ化合物を回収すること、のプロセスによって生成されるＲｅｂＭと、少なくとも１つの他の物質を組み合わせることを含む方法を含む。別の実施形態は、甘味付与組成物を生成する方法であって、ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、前記請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ＲｅｂＭ化合物を回収すること、のプロセスによって生成されるＲｅｂＭと、少なくとも１つの甘味付与可能な組成物を組み合わせることを含む方法を含む。

【0188】

６．１１ 遺伝子改変された細胞の生成方法
[00199] また、例えばＵＧＴ４００８７および／または例えばステビオール配糖体化合物のための生合成経路酵素をコードする１つまたは複数の異種核酸などの、上述した改変の１つまたは複数を含むように遺伝子操作された宿主細胞を産生するための方法も本明細書で提供される。宿主細胞における異種酵素の発現は、宿主細胞中での発現を許容する調節エレメントの制御下に、酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入することによって達成することができる。一部の実施形態において、核酸は、染色体外プラスミドである。他の実施形態において、核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれる。

【0189】

[00200] タンパク質をコードする核酸は、限定されない当業者公知の任意の方法によって宿主細胞に導入することができる（例えば、Hinnen et al.（1978）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75：1292-3；Cregg et al.（1985） Mol. Cell. Biol. 5：3376-3385；Goeddel et al. eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA；Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY；およびAusubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照）。例示的な技術としては、これらに限定されないが、スフェロプラスト化、エレクトロポレーション、ＰＥＧ１０００が媒介する形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウムが媒介する形質転換が挙げられる。

【0190】

[00201] 宿主細胞における酵素の活性は、酵素をコードする遺伝子の転写を改変することによって変更されてもよい。これは、例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を改変することによって（例えば、ヌクレオチド配列を含む発現ベクターのより多くのまたはより少ないコピー数を使用することによって、または宿主細胞のゲノムにヌクレオチド配列の追加のコピーを導入することによって、または宿主細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を欠失させるもしくは破壊することによって）、オペロンの多シストロン性ｍＲＮＡにおけるコード配列の順番を変化させるか、またはそれぞれそれ自身の制御エレメントを有する個々の遺伝子にオペロンを分解することによって、またはヌクレオチド配列が作動可能に連結するプロモーターまたはオペレーターの強度を増加させることによって達成することができる。代替として、または加えて、宿主細胞における酵素の活性は、酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳のレベルを改変することによって変更されてもよい。これは、例えば、ｍＲＮＡの安定性を改変すること、リボソーム結合部位の配列を改変すること、リボソーム結合部位と酵素コード配列の開始コドンとの間の距離または配列を改変すること、酵素コード領域の開始コドンの５’側の「上流」またはそれに隣接して配置された全体のシストロン間領域を改変すること、ヘアピンおよび特殊化した配列を使用してｍＲＮＡ転写の３’末端を安定化すること、酵素のコドン使用頻度を改変すること、酵素の生合成に使用されるまれなコドンのｔＲＮＡの発現を変更すること、および／または例えばそのコード配列の突然変異を介して酵素の安定性を増加させることによって達成することができる。

【0191】

[00202] 宿主細胞における酵素の活性は、これらに限定されないが、宿主細胞において増加または減少した溶解性を呈示する酵素の改変された形態を発現すること、それを介して酵素の活性が阻害されるドメインが欠如した酵素の変更された形態を発現すること、基質に対してより高いまたはより低いＫｃａｔまたはより低いまたはより高いＫｍを有する酵素の改変された形態を発現すること、または程度の差はあるが経路中の別の分子によるフィードバックまたはフィードフォワード調節の影響を受ける酵素の変更された形態を発現することなどの多数の方法で変更することができる。

【0192】

[00203] 一部の実施形態において、宿主細胞を遺伝学的に改変するのに使用される核酸は、形質転換宿主細胞の選択に有用な、さらに、外来ＤＮＡを維持するために宿主細胞に選択圧力をかけるのに有用な１つまたは複数の選択可能マーカーを含む。

【0193】

[00204] 一部の実施形態において、選択可能マーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１－Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮ^Ｒ、およびＳＨ ＢＬＥ遺伝子産物が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢＬＡ遺伝子産物は、ベータラクタム系抗生物質（例えば、狭域スペクトルのセファロスポリン、セファマイシン、およびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、およびセフォペラゾン）およびテモシリンを除く全ての抗グラム陰性細菌のペニシリンに対する耐性を付与し；Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ由来のＮＡＴ１遺伝子産物は、ノウルセオトリシンに対する耐性を付与し；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ Ｔｕ９４由来のＰＡＴ遺伝子産物は、ビアラホス（bialophos）に対する耐性を付与し；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＵＲ１－Ｃ遺伝子産物は、オーレオバシジン（Auerobasidin）Ａ（AbA）に対する耐性を付与し；ＰＤＲ４遺伝子産物は、セルレニンに対する耐性を付与し；ＳＭＲ１遺伝子産物は、スルホメツロンメチルに対する耐性を付与し；Ｔｎ９トランスポゾン由来のＣＡＴ遺伝子産物は、クロラムフェニコールに対する耐性を付与し；マウスｄｈｆｒ遺伝子産物は、メトトレキセートに対する耐性を付与し；クレブシェラ肺炎杆菌のＨＰＨ遺伝子産物は、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与し；Ｅ．ｃｏｌｉのＤＳＤＡ遺伝子産物は、単独の窒素源としてＤ－セリンを含むプレート上での細胞の増殖を可能にし；Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮ^Ｒ遺伝子は、Ｇ４１８に対する耐性を付与し；Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来のＳＨ ＢＬＥ遺伝子産物は、ゼオシン（ブレオマイシン）に対する耐性を付与する。一部の実施形態において、抗生物質耐性マーカーは、本明細書で開示された遺伝子改変された宿主細胞を単離した後、除去される。

【0194】

[00205] 一部の実施形態において、選択可能マーカーは、遺伝子改変された微生物における要求性（例えば、栄養要求性）をレスキューする。このような実施形態において、アミノ酸またはヌクレオチド生合成経路において機能し、機能しないと、親細胞を１種または複数の栄養素が補充されていない培地中で増殖できなくする１つまたは複数の遺伝子産物における機能の破壊を、親微生物は含む。このような遺伝子産物としては、これらに限定されないが、酵母におけるＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、およびＵＲＡ３遺伝子産物が挙げられる。次いで栄養要求性表現型は、破壊した遺伝子産物の機能的なコピーをコードする発現ベクターまたは染色体組込みコンストラクトで親細胞を形質転換することによってレスキューすることができ、生成した遺伝子改変された宿主細胞は、親細胞の栄養要求性表現型の損失に基づき選択することができる。ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２遺伝子の選択可能マーカーとしての利用は、陽性および陰性選択の両方が可能になるため、特に有利である。陽性選択は、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２突然変異の栄養要求性を補うことによって行われ、それに対して陰性選択は、特異的な阻害剤に基づいており、すなわち、原栄養菌株の増殖を抑制するが、それぞれＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２突然変異体の増殖を可能にするそれぞれ５－フルオロ－オロチン酸（FOA）、５－フルオロアントラニル酸、およびアミノアジピン酸（aAA）に基づく。他の実施形態において、選択可能マーカーは、公知の選択方法によって同定できる他の非致死性の欠失または表現型をレスキューする。

【0195】

[00206] 本開示の方法、組成物および生物において有用な特異的な遺伝子およびタンパク質が本明細書に記載される。しかしながら、このような遺伝子に対する絶対的な同一性は必ずしも必要ではないことが認識されるであろう。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子またはポリヌクレオチドにおける変更を実行して、活性に関してスクリーニングすることができる。典型的には、このような変更は、保存的突然変異およびサイレント突然変異を含む。このような改変または突然変異したポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、当業界において公知の方法を使用して機能的な酵素の発現に関してスクリーニングすることができる。

【0196】

[00207] 遺伝子コードの固有の縮重のために、実質的に同じかまたは機能的に同等なポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドも、このような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニングして発現させるのに使用することができる。

【0197】

[00208] これは当業者によって理解されるであろうが、コード配列を改変して、特定の宿主におけるその発現を強化することが有利な場合がある。遺伝子コードは、冗長であり６４種の可能性のあるコドンを有するが、ほとんどの生物は、典型的にはこれらのコドンの一部を使用する。ある種でほとんどの場合に利用されるコドンは、最適なコドンと称され、めったに利用されないコドンは、まれなまたは低利用のコドンと分類される。コドンは、プロセス中の宿主における好ましいコドン使用頻度を反映するように置換されてもよく、これは、「コドン最適化」または「種のコドンバイアスの制御」と称されることもある。他の宿主細胞のためのコドン最適化は、コドン使用頻度表を使用して容易に決定することができ、または市販のソフトウェア、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｏｄｏｎＯｐ（www.idtdna.com/CodonOptfrom）を使用して実行することができる。

【0198】

[00209] 特定の原核または真核宿主に好ましいコドンを含有する最適化されたコード配列（Murray et al., 1989, Nucl Acids Res.17：477-508）は、例えば、翻訳速度を増加させるために、または望ましい特性、例えば最適化されていない配列から産生された転写物と比較してより長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するために調製することができる。翻訳終止コドンはまた、宿主にとって好ましいように改変することもできる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物のための典型的な終止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物のための典型的な終止コドンは、ＵＧＡであるが、それに対して昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは一般的に、終止コドンとしてＵＡＡを使用する（Dalphin et al., 1996, Nucl Acids Res. 24：216-8）。

【0199】

[00210] 当業者であれば、遺伝子コードの縮退の性質のために、本開示の所与の酵素をコードするのに、ヌクレオチド配列において異なる様々なＤＮＡ分子を使用できることを認識するであろう。上述した生合成酵素をコードする生来的なＤＮＡ配列は、単に本開示の実施形態を例示するために本明細書において参照されたものであり、本開示は、本開示の方法で利用される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ分子を包含する。同様に、ポリペプチドは、典型的には、望ましい活性の損失または有意な損失を起こすことなくそのアミノ酸配列中に１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および挿入を受け入れることができる。本開示は、改変されたまたはバリアントポリペプチドが酵素による参照ポリペプチドの同化または異化活性を有する限りは、本明細書に記載される具体的なタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。さらに、本明細書に示されるＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列は、単に本開示の実施形態を例示したものに過ぎない。

【0200】

[00211] 加えて、本明細書で提供される組成物および方法に有用な酵素の相同体は、本開示に包含される。一部の実施形態において、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する場合、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的で並べられる（例えば、最適なアライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよいし、比較目的のために、非相同配列を無視してもよい）。一実施形態において、比較目的で並べられた参照配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも３０％、典型的には少なくとも４０％、より典型的には少なくとも５０％、さらにより典型的には少なくとも６０％、さらにより典型的には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、その分子は、その位置において同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた配列が共通する同一な位置の数の関数である。

【0201】

[00212] タンパク質またはペプチドへの言及において「相同」が使用される場合、同一ではない残基の位置がしばしば保存的アミノ酸置換によって異なることが認識されている。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されている置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なるケースにおいて、配列同一性パーセントまたは相同性の程度は、置換の保存的性質を修正するために上方調整することができる。この調整を行うための手段は当業者周知である（例えば、Pearson W. R., 1994, Methods in Mol Biol 25：365-89を参照）。

【0202】

[00213] 以下の６つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

【0203】

[00214] ポリペプチドの配列相同性は、配列同一性パーセントとも称され、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。分子配列を異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較するのに使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴである。多数の異なる生物由来の配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが典型的である。

【0204】

[00215] さらに、前述の酵素をコードする遺伝子のいずれか（または本明細書で述べられた他の任意のもの（またはそれらの発現を制御またはモジュレートする調節エレメントのいずれか））は、遺伝学的／タンパク質工学技術、例えば当業者公知の定向進化または合理的な変異誘発によって最適化することができる。このような作用は、当業者が、酵母における発現および活性に酵素を最適化することを可能にする。

【0205】

[00216] 加えて、これらの酵素をコードする遺伝子は、他の真菌性および細菌種から同定することができ、この経路のモジュレーションのために発現させることができる。様々な生物がこれらの酵素の源として役立つことができ、このような生物としては、これらに限定されないが、サッカロマイセス属種、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．ｕｖａｒｕｍなど、クルイベロマイセス属種、例えばＫ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど、ピチア属種、ハンセヌラ属種、例えばＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなど、カンジダ属種、トリコスポロン属種、ヤマダザイマ属（Yamadazyma）種、例えばＹ．ｓｐｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓなど、シゾサッカロマイセス種、例えばＳ．ｐｏｍｂｅなど、クリプトコックス属種、アスペルギルス種、アカパンカビ属種、または黒穂菌属種が挙げられる。嫌気性真菌由来の遺伝子の源としては、これらに限定されないが、ピロミセス属種、オルピノマイセス属（Orpinomyces）種、またはネオカリマスティクス属種が挙げられる。有用な原核性酵素の源としては、これらに限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、バチルス属種、クロストリジウム属種、コリネバクテリウム属種、シュードモナス属種、ラクトコッカス属種、エンテロバクター属種、およびサルモネラ属種が挙げられる。

【0206】

[00217] 追加の相同な遺伝子および相同な酵素を同定するのに、当業者公知の技術が好適であり得る。一般的に、類似の遺伝子および／または類似の酵素は、機能的な分析によって同定することができ、機能的な類似性を有するであろう。類似の遺伝子および類似の酵素を同定するのに、当業者公知の技術が好適であり得る。例えば、相同なもしくは類似のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＰＴＡ、または任意の生合成経路の遺伝子、タンパク質、もしくは酵素を同定するための技術としては、これらに限定されないが、目的の遺伝子／酵素の公開された配列に基づくプライマーを使用したＰＣＲによって、または目的の遺伝子のなかでも保存された領域を増幅するように設計されたディジェネレートプライマーを使用したディジェネレートＰＣＲによって遺伝子をクローニングすることが挙げられる。さらに当業者は、機能的な相同性または類似性を有する相同なまたは類似の遺伝子、タンパク質、または酵素を同定するための技術を使用することができる。このような技術は、前記活性に関するインビトロでの酵素アッセイ（例えば本明細書に記載される通り、またはKiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970に記載のもの）によって、酵素の触媒活性に関し細胞または細胞培養物を検査すること、次いで前記活性を有する酵素を精製により単離すること、エドマン分解などの技術によって酵素のタンパク質配列を決定すること、可能性がある核酸配列に対してＰＣＲプライマーを設計すること、ＰＣＲによって前記ＤＮＡ配列を増幅すること、および前記核酸配列をクローニングすることを包含する。相同なまたは類似の遺伝子および／または相同なまたは類似の酵素、類似の遺伝子および／または類似の酵素もしくはタンパク質を同定するための技術としてはさらに、候補遺伝子または酵素に関するデータのＢＲＥＮＤＡ、ＫＥＧＧ、またはＭｅｔａＣＹＣなどのデータベースとの比較も挙げられる。候補遺伝子または酵素は、本明細書に記載の教示に従って上述したデータベース内で同定することができる。

【実施例】

【0207】

実施例１：ファルネシルピロリン酸（FPP）およびイソプレノイドファルネセンへの高流量が可能なベースの酵母株の生成
[00218] ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターの制御下でメバロン酸経路（図１Ｃ）の遺伝子を発現することによって、野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（CEN.PK2）からファルネセン産生株を作り出した。この株は、染色体に組み込まれたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の以下のメバロン酸経路遺伝子：アセチル－ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰ：ＤＭＡＰＰイソメラーゼを含んでいた。本明細書に記載される全ての遺伝子は、公的に利用可能なまたは他の好適なアルゴリズムを使用してコドン最適化された。加えて、この株は、同様にＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターのいずれかの制御下にＡｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ａｎｎｕａ由来のファルネセンシンターゼの６コピーを含有していた。この株はまた、ＧＡＬ８０遺伝子の欠失およびＧＡＬ４ｏｃプロモーター下にＧＡＬ４の追加のコピーも含有していた。ここでＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４の遺伝子のコード配列は、その生来的なプロモーターの「機能する構成的な」バージョン（PGAL4oc；例えば、GriggsおよびJohnston（1991）PNAS 88（19）：8597-8601を参照）の調節的制御下にある。最後にＥＲＧ９遺伝子は、スクアレンシンターゼをコードしており、生来的なプロモーターを酵母遺伝子ＭＥＴ３のプロモーターで置き換えることによって下方調節される（Westfall et al PNAS 2012）。

【0208】

実施例２．ＲｅｂＡへの高流量が可能なベースの酵母株の生成
[00219] 図２Ａは、ＦＰＰからステビオールへの例示的な生合成経路を示す。図２Ｂは、ステビオールから配糖体ＲｅｂＭへの例示的な生合成経路を示す。上述したファルネセンベース株をＣ－２０イソプレノイドカウレンへの高流量を有するように変換するために、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（GGPPS）の６コピー、それに続いてコパリル二リン酸シンターゼおよびカウレンシンターゼのそれぞれの４コピーをゲノムに組み込んだ。この時点で、ファルネセンシンターゼの６コピーが株から除去された。新しい株がｅｎｔ－カウレンを生成することを確認されたら、ｅｎｔ－カウレンをＲｅｂＡに変換することための残りの遺伝子をゲノムに挿入した。表４に、ＦＰＰをＲｅｂＡに変換するのに使用された全ての遺伝子およびプロモーターを列挙する。２コピーを有していたＳｒ．ＫＡＨ酵素を除いて、カウレンシンターゼ後の各遺伝子を、単一のコピーとして（with a single copy）組み込んだ（表４）。表１に記載される全ての遺伝子を含有する株は主としてＲｅｂＡを産生した。酵素ＵＧＴ９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３のＲｅｂＡをレバウジオシドＤ（RebD）に変換する活性は多少低い。本発明者らは、ＵＧＴ９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３の単一のコピーは、上述した酵母株において、インビボで株中のＲｅｂＡのおよそ（３％）をＲｅｂＤに変換できることを測定した（図３および表５）。次いでＵＧＴ７６Ｇ１は、ＲｅｂＤを最終産物であるＲｅｂＭに変換することができる。

【0209】

実施例３．新規のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（UGT）酵素がＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することをスクリーニングするための株の生成
[00220] インビボでのＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換に関して迅速にスクリーニングするためのスクリーニング株を生成するために、上述したＲｅｂＡ株にランディングパッドを挿入した。ランディングパッドは、コンストラクトの両末端に、ＡＬＧ１オープンリーディングフレーム下流のゲノム領域に対する５００ｂｐの遺伝子座標的化ＤＮＡ配列からなっていた（図４）。その内部に、ランディングパッドは、エンドヌクレアーゼ認識部位（F-CphI）の端部にＰＧＡＬ１プロモーターと酵母ターミネーターを含有していた。

【0210】

実施例４．インビボにおいて高効率でＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するＵＧＴ遺伝子に関してスクリーニングすること
[00221] Ｇｅｎｂａｎｋから得られた１００種を超えるＵＧＴ酵素を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの最適な発現のためにコドン最適化し、上述したランディングパッド中のＰＧＡＬ１に相同な６０ｂｐの配列およびＦ－ＣｐｈＩ配列の端部にある酵母ターミネーターで合成した。各合成ＵＧＴ遺伝子を、インビボで上述した酵母株においてＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する能力に関して、個々に単一のコピーで試験した。酵母を、ＵＧＴドナーＤＮＡおよびランディングパッド中のＤＮＡを切断するためのエンドヌクレアーゼＦ－ＣｐｈＩを含有するプラスミドで形質転換した。各形質転換における特異的なＵＧＴ遺伝子の内部のリバースプライマーおよびＡＬＧ１ＯＲＦの端部におけるユニバーサルフォワードプライマーを使用したコロニーＰＣＲによって正しい組込みを検証した。

【0211】

実施例５．酵母形質転換方法
[00222] 各ＤＮＡコンストラクトを、最適化された酢酸リチウム（LiAc）形質転換法で、標準的な分子生物学技術によりＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（CEN.PK2）に組み込んだ。簡単に言えば、細胞を、酵母抽出物であるペプトンデキストロース（YPD）の培地中、振盪しながら（２００ｒｐｍ）３０℃で一晩増殖させ、１００ｍＬのＹＰＤで０．１のＯＤ_６００に希釈し、０．６～０．８のＯＤ_６００に増殖させた。各形質転換につき、５ｍＬの培養物を遠心分離によって回収し、５ｍＬの滅菌水で洗浄し、再度遠沈させ、１ｍＬの１００ｍＭのＬｉＡｃに再懸濁し、マイクロ遠沈管に移した。細胞を３０秒間遠沈させ（１３，０００×ｇ）、上清を除去し、細胞を、２４０μＬの５０％ＰＥＧ、３６μＬの１ＭのＬｉＡｃ、沸騰により加熱処理した１０μＬのサケ精子ＤＮＡ、および７４μＬのドナーＤＮＡからなる形質転換ミックスに再懸濁した。エンドヌクレアーゼＦ－Ｃｐｈ１の発現を必要とした形質転換のために、ドナーＤＮＡは、発現のための酵母ＴＤＨ３プロモーター下で発現されたＦ－ＣｐｈＩ遺伝子を有するプラスミドを包含していた。これは、ランディングパッド中のＦ－ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼ認識部位を切断して、ＵＧＴ遺伝子の組込みを容易にするであろう。４２℃で４０分ヒートショックをかけた後、細胞を一晩でＹＰＤ培地中に回収し、その後、選択培地上で平板培養した。組込みに特異的なプライマーを用いたコロニーＰＣＲによってＤＮＡ組込みを確認した。

【0212】

実施例６．酵母培養条件
[00223] 期待されるＵＧＴ遺伝子を含有すると確認された酵母コロニーを、２０ｇ／Ｌスクロースおよび３７．５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウムを含むバードシード培地（Bird Seed Media：BSM、元はvan Hoek et al., Biotechnology and Bioengineering 68（5）, 2000, pp. 517-523に記載されている）を含有する９６－ウェルマイクロタイタープレートに採取した。１０００ｒｐｍで振盪する高容量マイクロタイタープレートインキュベーター中、３０℃、８０％湿度で３日間、培養物が炭素を消費しつくすまで細胞を培養した。増殖が飽和した培養物から１４．４μｌをとり、３６０μｌの新鮮な培地に希釈することによって、その飽和した培養物を、４０ｇ／Ｌスクロースおよび１５０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウムを含むＢＳＭを含有する新しいプレートで二次培養した。産生培地中の細胞を、抽出および分析前の追加の３日間、１０００ｒｐｍおよび８０％湿度の高容量マイクロタイタープレート振盪機で３０℃で培養した。終わったら、全細胞の液体培地を３６０ｕＬの１００％エタノールで希釈し、ホイルシールで密封し、１２５０ｒｐｍで３０分振盪して、ステビオール配糖体を抽出した。新しい１．１ｍＬのアッセイプレートに４９０ｕＬの５０：５０エタノール：水を添加し、１０ｕＬの培養物／エタノール混合物を、アッセイプレートに添加する。混合物を遠心分離して、全ての固体をペレット化し、溶液の４００ｕＬを新しい１．１ｍＬのプレートに移し、ＬＣ－ＭＳによってアッセイする。

【0213】

実施例７．分析方法
[00224] Ｓｉｇｍａ Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＳ－Ｃ１８（５ｃｍ、２．１ｍｍ、２．７ｕｍ；パート番号53301-U）を以下の勾配（移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中の０．１％ギ酸；移動相Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ギ酸）で使用したＬＣ－ＭＳ質量分析計（AB QTrap 4000）によって、サンプルを分析した。

【0214】

【表2】

【0215】

[00225] 質量分析計を陰イオン多重反応モニタリングモードで操作した。信頼できる標準、およびＭＲＭトランジションから決定された保持時間によって各レバウジオシド異性体を同定した。

【0216】

【表3】

【0217】

[00226] 質量分析計からのクロマトグラムからのピーク領域を使用して、検量線を作成した。関連化合物（すなわち、RebA、RebD、RebM）のモル比を、信頼できる標準を使用した外部補正によって量を各化合物のモルで定量すること、次いで適切な比率をとることによって決定した。

【0218】

[00227] ＮＭＲ分析を実行して、ＲｅｂＭが遺伝子改変された株から産生されたことを確認した。発酵後、株を発酵ブロスから除去した。残存する液状培地からステビオール配糖体を精製した。例えば、ＷＯ／２０１７／０９３８９５およびＷＯ／２０１６／０２８８９９に記載されるものなどの任意の好適なＮＭＲ分析ための方法を使用することができる。

【0219】

実施例８．ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する高い活性を有することが見出されたＵＧＴ酵素
[00228] ６つのＵＧＴ酵素は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する高い活性を有することが見出された（図３）。これらの酵素の性能を、同様にＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換を実行する文献に記載される他の２つのＵＧＴ酵素、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１（すなわち、ＷＯ２０１３／０２２９８９Ａ２に記載されるEUGT11）およびＳｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１（すなわち、ＷＯ２０１４／１９３８８８Ａ１に記載のUGTSL2）に対する基準とした。表５に、［Ｒｅｂ（Ｄ＋Ｍ）のマイクロモル／（Ａ＋Ｄ＋Ｍ）のマイクロモル］の比率の中央値を列挙した。インビボで、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭを上述したようにして測定した。この比率は、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換の効率の尺度である。［Ｒｅｂ（Ａ＋Ｄ＋Ｍ）］のｕＭの合計は、細胞中ですでに生成されていた総ＲｅｂＡを測定する。［Ｒｅｂ（Ｄ＋Ｍ）］のｕＭの合計は、細胞中ですでに生成されていた総ＲｅｂＤを測定する。図５Ａ～Ｉは、図３および表２における全てのＵＧＴ遺伝子のＲｅｂＥ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、およびＲｅｂＭ２のクロマトグラムを示す。ＲｅｂＭ２は、単一の間違ったグルコース連結を有するＲｅｂＭの異性体である。ＲｅｂＭ２は、ＲｅｂＭにとって望ましいＧｌｃβ（１－２）［Ｇｌｃβ（１－３）］Ｇｌｃβ１－の代わりに、１９炭素位置（ＣＯＯＨ）にＧｌｃβ（１－２）［Ｇｌｃβ（１－６）］Ｇｌｃβ１－を有する。

【0220】

[00229] 実施例７に記載されるＮＭＲ方法を使用して、ＵＧＴ４００８７を含む株から生成したサンプル生成物を、１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲ分光法によって標準ＲｅｂＭと比較した。メタノールおよびピリジン中で記録された１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲスペクトルのオーバーレイから、両方の化合物が同一であることが確認された。２Ｄ ＮＭＲデータの詳細な解釈および文献で公開されたデータとの比較から、両方のサンプルがＲｅｂＭであったことが確認された。

【0221】

[00230] ０．５または２．０リットルのいずれかの発酵容器中で、ＵＧＴ４００８７は、異なる株のバックグラウンドで発現される場合、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭを、約１：７：５０のおよそのＲｅｂＡ：ＲｅｂＤ：ＲｅｂＭの比率で産生した。

【0222】

【表4】

【0223】

【表5】

【0224】

実施例９：ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する表５に記載の酵素の特異性
[00231] 表５に列挙した酵素は、ベータ－１，２連結グリコシド結合の形成を介してＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位にグルコース糖を付加することによって、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換を触媒することができる。ある特定の実施形態において、異種宿主におけるＲｅｂＭの生物工学的な産生にとって、（１）高い純度で、（２）いかなる「非天然の」ステビオール配糖体も産生せずにＲｅｂＭを産生することが望ましい。市場で販売される任意の製品は、最良の風味のプロファイルを保証し、複数の人間用食物の規制基準を満たすために極めて高い純度を必要とするであろう。ＲｅｂＭ以外のステビオール配糖体の存在は、高度に純粋なＲｅｂＭを得るのに下流処理のコストを増加させるであろう。有意な量の非ＲｅｂＭステビオール配糖体が存在する場合、ＲｅｂＭ製品の最終純度を損なう可能性がある。ある特定の実施形態において、異種酵素が「非天然の」ステビオール配糖体を全く産生しないことが有利な可能性がある。ここで「非天然の」ステビオール配糖体は、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物において天然に存在することがわかっていない任意のステビオール配糖体と定義される。

【0225】

[00232] 上述した理由のために、表５に列挙した全ての酵素をそれらの不純物プロファイルに関して検査して、それらが図２Ｂに示されていない何らかの予想外のまたは非天然のステビオール配糖体を生成するかどうかを決定した。表２に列挙した全ての酵素についてより長い保持時間でのクロマトグラフトレースをさらに分析した。５０％を超える変換効率を有する全ての酵素のなかでも、予想外の生成物を生成しなかった酵素は、ＵＧＴ４００８７およびＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１（ＥＵＧＴ１１）のみであった。予想通りに、ＵＧＴ９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３は、クロマトグラムにおいて予想外のピークを生じなかった。

【0226】

[00233] ５０％を超える変換効率を有する酵素のなかでも、これらの酵素のクロマトグラフトレースは、天然に存在しない配糖体に関連する１つまたは複数の予想外のピークを生じた。例えば、Ｏｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅのクロマトグラフトレースは、約６．６１分の保持時間でＲｅｂＡのピークとＲｅｂＢピークとの間に予想外のピーク（ステビオール＋２種のグルコース）を生じた。Ｏｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅの予想外のピークの強度は、ＲｅｂＡのピークの強度より少なくとも３１倍大きかった。図９ｃを参照されたい。予想外のピーク（ステビオール＋２種のグルコース）は、親対照株（UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1、およびUGT91D_like3を含む）からの、またはＵＧＴ４００８７を含む株からのクロマトグラフトレースにおいて存在しない。図９ｂおよび９ｃを参照されたい。別の実施例において、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１のクロマトグラフトレースは、約６．６１分の保持時間でＲｅｂＡのピークとＲｅｂＢピークとの間に予想外のピーク（ステビオール＋２種のグルコース）を生じた。Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１の予想外のピークの強度は、ＲｅｂＡのピークの強度より０．６の係数で低かった。別の実施例において、Ｓｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１のクロマトグラフトレースは、約６．６７分の保持時間でＲｅｂＡのピークとＲｅｂＢピークとの間に予想外のピーク（ステビオール＋２種のグルコース）を生じた。Ｓｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１の予想外のピークの強度は、ＲｅｂＡのピークの強度より約１．１１倍大きかった。別の実施例において、Ｓｒ．ＵＧＴ＿ｇ２５２７７８のクロマトグラフトレースは、約６．６７分の保持時間でＲｅｂＡのピークとＲｅｂＢピークとの間に予想外のピーク（ステビオール＋２種のグルコース）を生じた。Ｓｒ．ＵＧＴ＿ｇ２５２７７８の予想外のピークの強度は、ＲｅｂＡのピークの強度より約０．９６の係数で低かった。これらの酵素の一部は、追加の予想外のピークも生成した。Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、Ｓｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１、およびＳｒ．ＵＧＴ＿ｇ２５２７７８のクロマトグラフトレースは省略する。

【0227】

[00234] これらの結果から、２つの酵素ＵＧＴ４００８７およびＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１（EUGT11）と比較して、５０％より高いＡからＤへの変換効率を有する他の３つの酵素（すなわち、Hv_UGTV1、SI_UGT_101249881、およびSr.UGT_g252778）は、通常Ｓｔｅｖｉａ Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物ではＲｅｂＭへの経路では生成されないステビオール配糖体を産生する可能性がある追加の反応を触媒できることが示される。

【0228】

【表6】

【0229】

実施例１０：ＵＧＴ４００８７の酵素活性はステビオール配糖体の１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に特異的である
[00235] ＵＧＴ４００８７は、ステビオシドまたはＲｅｂＡのいずれかの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’への第２の糖部分を付加する反応を触媒する。図５ａおよび５ｉで示されるように、ＵＧＴ４００８７を含まない親対照株（実施例２に記載した通り）は、ＲｅｂＡ生成できるが、検出可能な量のＲｅｂＥ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭを生成しない。ここで親細胞へのＵＧＴ４００８７の付加は、検出可能な量のＲｅｂＥを生じることから、ＵＧＴ４００８７は、ステビオシドのベータ－１，２連結における１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位への第２のグルコース部分の付加を触媒して、ＲｅｂＥを生成することが示される。ＵＧＴ４００８７を含有する株のクロマトグラム中にＲｅｂＤおよびＲｅｂＭに関する２つの新しいピークも出現するが、ＲｅｂＡに関するピークは、ＵＧＴ４００８７を含まない親株と比較して有意に減少する。それゆえに、ＵＧＴ４００８７は、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤへのベータ－１，２連結における１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位への第２のグルコース部分の付加を触媒することができる。次いで株におけるＵＧＴ７６Ｇ１の存在は、最終的なグルコース付加を触媒して、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換する。

【0230】

[00236] ステビオールモノシドまたはルブソシドのいずれかのベータ－１，２連結における１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に糖を付加する能力をスクリーニングするために、ルブソシドのみへの高流量を有するベースの株を生成した。ルブソシドベースの株は、酵素ＵＧＴ９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３を含有しない点以外は、実施例２に記載されたＲｅｂＡベースの株と遺伝学的に同一である。表７で示されるように、ルブソシドベースの株は、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、およびＵＧＴ７６Ｇ１を有し、１９－配糖体、ステビオールモノシド、およびルブソシドを生成することのみ可能である。この株にＵＧＴ４００８７を付加することは、このプロファイルを全く変化させない。ＵＧＴ４００８７が、ステビオールモノシドまたはルブソシドのいずれかのベータ－１，２連結における１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に糖を付加することが可能であった場合、検出可能な量のステビオールビオシドもしくはステビオシドのいずれかまたはその両方が存在するはずである。この株が、ステビオールモノシドおよびルブソシドの両方のベータ－１，２連結における１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に糖を付加することが可能であるＵＧＴ９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３で形質転換される場合、ステビオールビオシド、ステビオシド、さらにはＲｅｂＡもみられる。

【0231】

[00237] ＥＵＧＴ１１（Os_UGT_91C1）はこれまでに、１９－Ｏ－ステビオール配糖体または１３－Ｏ－ステビオール配糖体のいずれかのＣ－２’位への第２の糖部分の付加を触媒することが他者によって特徴づけられている。ＷＯ２０１３／０２２９８９の図５を参照されたい。上述したように、ＵＧＴ４００８７は、ステビオールモノシドまたはルブソシドのいずれかのベータ－１，２連結における１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’位への糖の付加を検出可能なレベルで触媒しないようである。これらの結果から、ＵＧＴ４００８７は、機能的に区別可能であり、ＥＵＧＴ１１と比較して異なる結果をもたらすＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼであることが示される。

【0232】

【表7】

【0233】

実施例１１．Ｎ末端ドメインの交換によるＵＧＴキメラの操作
[00238] 植物性のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（UGT）は、それらのアミノ酸配列相同性が相対的に低いとしても、高度に保存されたタンパク質構造を共有する。これらのＵＧＴは、いわゆるＧＴ－Ｂ構造的フォールドを受け入れ、大まかにそれらの一次アミノ酸配列の中間地点で分割される２つのドメインからなる。Ｎ末端ドメインは、主として基質特異性を決定する糖アクセプタードメインである。このドメインは、予想通りにそのアミノ酸配列に関してより可変性のドメインであり、これはＵＧＴによってグリコシル化できる基質が多様であることを反映している。より高度に保存されたＣ末端ドメインは、糖ドナードメインであり、ここにＵＤＰ－グルコースが結合する。２つのドメインは通常、フレキシブルなリンカーによって連結されており、ドメイン交換設計のためにタンパク質を分割するのに理想的な領域を作り出している（図６）。ＵＧＴの高度に保存されたドメイン構造の性質を考慮して、いずれか２つのＵＧＴからのドメインを、基質特異性を変更するかまたは触媒活性などの望ましい機能を強化するかのいずれかのために組み換えることができる。この実施例において、本発明者らは、ドメイン交換を介していくつかのＵＧＴキメラを設計することによって、基質特異性、すなわちＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する活性を付与することにおけるＵＧＴ４００８７のＮ末端ドメインの役割を調査した。

【0234】

[00239] ドメイン交換実験を設計するのに採用されるであろう一般的なアプローチは、以下：１）交換候補の対を選択する工程、２）ＵＧＴ対の間でキメラを生成するための（任意選択で、Ｃ末端ドメインを突然変異させて、標的化された基質およびＮ末端ドメインとの相互作用を改善するための）ドメイン交換部位を選択する工程、ならびに３）望ましい活性のためにキメラタンパク質を作り出す、試験する、および開発する工程を含む。この実施例では、後述するようにドメイン交換を実行するためにこのアプローチを採用した。

【0235】

[00240] キメラを構築するための親として４つのＵＧＴ：ＵＧＴ４００８７（配列番号１１）、ＵＧＴＳｉ９１Ｄｌｉｋｅ（配列番号１２）、ＯＳ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１（配列番号８）、および９１Ｄｌｉｋｅ３（配列番号７）を選択した。ＵＧＴ４００８７のＮ末端ドメインを使用して、Ｓｉ９１Ｄｌｉｋｅ、ＯＳ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１および９１Ｄｌｉｋｅ３のＮ末端ドメインを置き換え、ＵＧＴ４００８７とそれぞれ９７％、７９％および７１％の全体的な配列同一性を有する３つのキメラを作り出した。

【0236】

[00241] スイスモデルを使用して、４つ全てのＵＧＴに関する構造モデルを生成した。構造アライメントおよび配列アライメントに基づき正確なアミノ酸位置（「交換部位」）を選択した。キメラタンパク質の３次元フォールディングのばらつきを最小化するために、酵素の２つの別個の半分を構成するＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間に配置されたフレキシブルな領域（図６）を、交換部位に使用した。この実施例において、この領域におけるＧｌｙ２１５およびＬｅｕ２１６（アミノ酸の数値は、ＵＧＴ４００８７に対するものである）は、４つのＵＧＴを包含する全てのＵＧＴにおいて高度に保存されている。それゆえに、ドメイン交換のために、これらの２つの残基の間で２つのドメインを分割した（図６）。

【0237】

[00242] ドメイン交換の作用を試験するために、異なるＵＧＴを包含することを除いて遺伝学的に同一な酵母株で実験を実行した。しかしながら、これらの酵母株は、実施例４に記載されるＵＧＴ多様性スクリーニングで使用されたものとは遺伝学的に異なる。実施例４～７に記載した株の形質転換、培養、および分析に関する一般的な方法を使用した。以下の表８に、様々なドメイン交換設計のＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換の比率を示す。

【0238】

【表8】

【0239】

[00243] ＵＧＴ４００８７は、Ｓｉ９１Ｄｌｉｋｅ、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１および９１Ｄｌｉｋｅ３とそれぞれ９０％、５４％および３６％の全体的な配列同一性を有する。ＮおよびＣ末端配列の両方においてＵＧＴ４００８７とおよそ４０％の配列同一性を有する９１Ｄｌｉｋｅ３を除いて、ＵＧＴ４００８７のＮ末端ドメインと、Ｓｉ９１ＤｌｉｋｅおよびＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１のＣ末端ドメインとのキメラは、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することにおいて活性である（表８）。Ｓｉ９１Ｄｌｉｋｅは検出可能な活性を有していないにもかかわらず、そのＮ末端ドメインのＵＧＴ４００８７のＮ末端ドメインによる置き換えは、ＵＧＴ４００８７活性の全てを付与したことから、ＵＧＴ４００８７のＮ末端ドメインは、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換にとって重要であることが示される。

【0240】

[00244] また４つの親のＵＧＴのアライメントは、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換に関する２つの活性な酵素（UGT40087およびOs_UGT_91C1）が共有するが、２つの不活性な酵素（Si91Dlikeおよび91Dlike3）においては異なっている６つのＮ末端アミノ酸残基（UGT40087における、V11、I12、P55、E90、S203、E223、およびV413；図８－配列アライメントの図）も明らかにした。

【0241】

実施例１２．Ｎ末端ループの交換によるＵＧＴバリアントの操作
[00245] ＵＧＴ４００８７およびＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１のモデル化構造の比較から、Ｎ末端の糖アクセプタードメインにおいて有意なコンフォメーションの差を有する４つのループが解明された。図６に、ループ箇所を示す。ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換に関するＵＧＴ４００８７の優れた活性に寄与し得るループを同定するために、２つのタンパク質でこれらループのそれぞれを交換して、合計１２種のＵＧＴバリアントを生成した。２つの可能性のあるループ長を構成するように、ループ＿３およびループ＿４の２つのバージョンを設計した。表９および１０に詳細な設計を列挙する。

【0242】

【表9】

【0243】

[00246] 表９において、下付き数字付きの２つのアミノ酸残基間の配列番号数を有するアミノ酸配列は、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１ＣからＵＧＴ４００８７塩基に交換されるループ領域である。Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃからの交換されたループ領域に隣接する下付き数字付きの２つのアミノ酸残基および下付き数字の数はそれぞれ、交換されたループ領域の取り込み前のＵＧＴ４００８７のアミノ酸残基およびアミノ酸位置に対応する。表９に列挙した新しいキメラＵＧＴにおいて、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃからの交換されたループ領域は、ＵＧＴ４００８７塩基の対応するループ領域を置き換えた。

【0244】

[00247] 配列番号２７のアミノ酸配列は、ＵＧＴ４００８７＿ループ１に組み込まれた、交換されたループ領域であり、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１の元のループ１の改変されたバージョンであることに留意する。より具体的には、配列番号２７の配列中の１２番目のアミノ酸残基は、プロリンである（配列番号８を有する元のループ１のOs_UGT_91Cにおける対応する位置に存在するアルギニンの代わりに）。したがって、ＵＧＴ４００８７＿ループ１において、配列番号１１を有するＵＧＴ４００８７の元の配列と比較して、単一のアミノ酸置換である５１位におけるプロリンが存在する。表９において、ＵＧＴ４００８７＿ループ１中の５１位における置換されたプロリンの位置は、太字で示される。

【0245】

【表10】

【0246】

[00248] 表１０において、下付き数字付きの２つのアミノ酸残基間の配列番号数を有するアミノ酸配列は、ＵＧＴ４００８７からＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１塩基に交換されるループ領域である。ＵＧＴ４００８７からの交換されたループ領域に隣接する下付き数字付きの２つのアミノ酸残基および下付き数字の数はそれぞれ、交換されたループ領域の取り込み前のＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１のアミノ酸残基およびアミノ酸位置に対応する。表１０に列挙した新しいキメラＵＧＴにおいて、ＵＧＴ４００８７からの交換されたループ領域は、ＯＳ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１塩基の対応するループ領域を置き換えた。

【0247】

[00249] 配列番号２８のアミノ酸配列は、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１＿ループ１に組み込まれた、交換されたループ領域であり、ＵＧＴ４００８７の元のループ１の改変されたバージョンであることに留意する。より具体的には、配列番号２８の配列中の１２番目のアミノ酸残基は、アルギニンである（配列番号１１を有するＵＧＴ４００８７の元のループ１における対応する位置に存在するプロリンの代わりに）。したがって、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１＿ループ１において、配列番号８を有するＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１の元の配列と比較して、単一のアミノ酸置換である５８位におけるアルギニンが存在する。表１０において、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１＿ループ１中の５８位における置換されたアルギニンの位置は、太字で示される。

【0248】

[00250] バリアントタンパク質を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって、実施例４に記載されるランディングパッド中のＦ－ＣｐｈＩ配列の端部にあるＧＡＬ１プロモーターおよび酵母ターミネーターに相同な６０ｂｐの配列を用いて合成した。ＵＧＴドメイン交換のキメラ実験に関する実施例１１と同じ株のバックグラウンドでＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することにおけるその活性に関して、各合成ＵＧＴバリアントを単一の染色体コピーとして個別に試験した。株を作り出すために、ＵＧＴキメラドナーＤＮＡおよびエンドヌクレアーゼＦ－ＣｐｈＩを含有するプラスミドを、酵母宿主に形質転換した。特異的なＵＧＴ遺伝子の内部のリバースプライマーおよび組込み遺伝子座の端部におけるユニバーサルフォワードプライマーを使用したコロニーＰＣＲによって、正しい組込みを検証した。確認された株を、上述したようにＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換に関して試験した。

【0249】

【表11】

【0250】

【表12】

【0251】

[00251] 親としてＵＧＴ４００８７を用いたところ、ループ交換バリアントは、ＵＧＴ４００８７＿ループ４＿２を除いて、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することにおいて全て活性であった（表１１）。ループ４＿２は、ＮおよびＣ末端ドメインの境界面の近くに配置する長い配列であり、その置き換えは、バリアントの全体構造に有意なばらつきを生じさせ得る。全ての活性なバリアントのなかでも、ＵＧＴ４００８７に対するＮ末端配列同一性は、８４％（ループ４＿１）から９９％（ループ１）までの範囲である。

【0252】

[00252] 親としてＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１を用いた場合でも、ループ交換バリアントのほとんどが、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することにおける活性を示した（表１２）。ここでもループ４＿２交換は活性がなくなったことから、その置き換えはバリアントの構造的な完全性に影響を与え得るという仮説が裏付けられる。特筆すべきことに、ループ４＿１の取り込みは、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換の増加（８８％から９７％）をもたらしたことから、ループ４＿１はＵＧＴ４００８７の優れた活性を付与することに関与することが示される。加えて、両方のタンパク質を親として用いたループ交換実験からの結果も、これらのループ領域は、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの活性を有するＵＧＴの活性および基質特異性において差を付与することにおいて重要であり、相同体ループバリアントの追加の交換またはこれらのループ領域の変異誘発は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することに関して改善されたＵＧＴバリアントを生成するために採用され得ることを示した。

【0253】

[00253] 本明細書で引用された全ての公報、特許および特許出願は、それぞれ個々の公報または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み入れられることが示されたかのように、参照により本明細書に組み入れられる。前述の発明を、明確な理解のために例証および例としていくらか詳細に記載したが、当業者には、添付の特許請求の範囲の本質または範囲から逸脱することなくそれらに特定の変更および改変をなし得ることが、本発明の教示の観点から容易に明らかになるであろう。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B-1】

【図2B-2】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5A-1】

【図5A-2】

【図5B】

【図5C】

【図5D-1】

【図5D-2】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【配列表】

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