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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-15
(45)【発行日】2023-12-25
(54)【発明の名称】改良された超粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 9/14 20060101AFI20231218BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20231218BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231218BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20231218BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20231218BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20231218BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231218BHJP
【ＦＩ】
A61K9/14
A61K47/04
A61K45/00
A61K38/18
A61K47/36
A61P27/16
A61P25/00
【請求項の数】
23
(21)【出願番号】P 2020516508
(86)(22)【出願日】2018-09-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-12-03
(86)【国際出願番号】 AU2018051029
(87)【国際公開番号】W WO2019056062
(87)【国際公開日】2019-03-28
【審査請求日】2021-09-21
(31)【優先権主張番号】2017903828
(32)【優先日】2017-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(31)【優先権主張番号】2017903829
(32)【優先日】2017-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(31)【優先権主張番号】2018902513
(32)【優先日】2018-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(73)【特許権者】
【識別番号】519044955
【氏名又は名称】ザ・バイオニクス・インスティテュート・オブ・オーストラリア
(73)【特許権者】
【識別番号】500074981
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティー オブ メルボルン
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】アンドリュー・ワイズ
(72)【発明者】
【氏名】フランク・カルソ
(72)【発明者】
【氏名】マティアス・ビョルンマルム
(72)【発明者】
【氏名】ユーティエン・マ
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】Biomacromolecules, (2014), 15, [11], p.4146-4151
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ９／００－９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
超粒子を含む組成物であって、前記超粒子がメソポーラスシリカナノ粒子及び少なくとも１つのペイロードを含み、前記ペイロードが少なくとも１．５μｇの神経栄養因子であり、前記超粒子がナノ粒子溶液のエレクトロスプレーによって製造される、前記組成物。
【請求項2】
前記超粒子が少なくとも５μｇのペイロードを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記超粒子が１．５μｇ～１０μｇのペイロードを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記超粒子が、径が少なくとも５０～１００ｎｍである細孔を備える、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記超粒子が不規則な細孔構造を有する、または、二峰性細孔構造を有するナノ粒子から構成される、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
前記神経栄養因子の等電点が８～１０である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記神経栄養因子がＢＤＮＦである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
前記神経栄養因子がニューロトロフィン－３である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記超粒子が、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種の異なるペイロードを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
異なるペイロードを含む少なくとも２種類の超粒子を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項11】
徐放性製剤として提供される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
グリコーゲンヒドロゲルを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記超粒子が、メソポーラスシリカナノ粒子を含む組成物をジカチオン水溶液中にエレクトロスプレーすることによって製造される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記超粒子が、ナノ粒子及びアルギン酸またはその多糖誘導体を含む組成物をジカチオン水溶液中にエレクトロスプレーすることによって製造される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
難聴を治療するための薬剤の製造における、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物の使用であって、前記神経栄養因子がニューロトロフィンである、使用。
【請求項16】
前記ニューロトロフィンがＢＤＮＦである、請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
前記ニューロトロフィンがニューロトロフィン－３である、請求項１５又は１６に記載の使用。
【請求項18】
前記薬剤が、対象の耳におけるらせん神経節ニューロンの生存を促進する、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項19】
対象における治療用ペイロードの持続的送達が望ましい疾病の治療のための薬剤の製造における、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項20】
メソポーラスシリカナノ粒子及びアルギン酸を含む組成物を、ジカチオン水溶液中にエレクトロスプレーすることを含み、製造された超粒子に少なくとも１．５μｇの神経栄養因子を担持することを更に含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の超粒子の製造方法。
【請求項21】
アルギン酸がアルギン酸ナトリウム塩［Ｎａ（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）ｎ］である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
超粒子を焼成に供してアルギン酸を除去することを更に含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
焼成が約６５０℃で、または、約６～約３０時間行われる、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、高レベルのペイロードが担持された、改良された超粒子（ｓｕｐｒａｐａｒｔｉｃｌｅｓ）及びその製造方法に関する。かかる超粒子は広範な治療用途に使用することができる。
【背景技術】
【0002】
メソポーラスシリカは、様々な化合物を封入するために及び多様なナノ構造材料のテンプレート合成に広く使用されている、極めて高表面積の多孔性材料である。この種の多孔性材料は、薬物送達などの多様な範囲の用途において関心の対象である一方で、効率的な担持及び持続的な薬物送達などの様々な問題が未解決のままである。
【0003】
この種の新規材料は多くの興味深い特性を有する可能性があることが予想されることから、これらの新規材料ならびにかかる材料の新規な製造方法を提供することが望ましい。
【0004】
したがって、改良された超粒子が求められている。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、高レベルのペイロードを担持することができる超粒子の予期せぬ生成に基づく。本発明者らはまた、本開示の超粒子が、高いレベルの担持量の要因である可能性のある特有の細孔径を有するように思われることも特定した。したがって、第１の例において、本開示は、超粒子を含む組成物であって、上記超粒子が少なくとも１．５μｇのペイロードを含む上記組成物に関する。別の例において、本開示は、超粒子を含む組成物であって、上記超粒子が少なくとも５μｇのペイロードを含む上記組成物に関する。別の例において、本開示は、超粒子を含む組成物であって、上記超粒子が少なくとも８μｇのペイロードを含む上記組成物に関する。別の例において、本開示は、超粒子を含む組成物であって、上記超粒子が少なくとも１０μｇのペイロードを含む上記組成物に関する。別の例において、本開示は、超粒子を含む組成物であって、上記超粒子が１．５μｇ～１０μｇのペイロードを含む上記組成物に関する。
【0006】
一例おいて、上記超粒子は、径が少なくとも６０ｎｍである細孔を備える別の例において、上記超粒子は、径が少なくとも１００ｎｍである細孔を備える。別の例において、上記超粒子は、径が少なくとも６０ｎｍ～２００ｎｍである細孔を備える。別の例において、上記超粒子は、径が少なくとも５０ｎｍ～１００ｎｍである細孔を備える。
【0007】
別の例において、上記超粒子は不規則な細孔構造を有する。
【0008】
一例において、上記超粒子は二峰性細孔構造を有するナノ粒子から構成される。一例において、上記ナノ粒子の二峰性細孔構造は３０ｎｍを超える大細孔径を有する。
【0009】
別の例において、上記ペイロードは、小分子、ペプチド、またはタンパク質である。例えば、上記ペイロードは抗体である。一例において、上記ペイロードは、幹細胞、ウイルス、核酸、神経栄養因子、抗がん剤、神経保護剤、またはそれらの組み合わせである。一例において、上記ペイロードは神経栄養因子である。別の例において、上記ペイロードはニューロトロフィンである。一例において、上記神経栄養因子の等電点は９～１０である。別の例において、上記ペイロードはニューロトロフィン－３である。別の例において、上記ペイロードはＢＤＮＦまたはニューロトロフィン－３である。
【0010】
別の例において、上記超粒子は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なるペイロードを含む。別の例において、上記超粒子は少なくとも２種のペイロードを含み、１種のペイロードが神経栄養因子である。別の例において、上記超粒子は少なくとも２種のペイロードを含み、１種のペイロードがニューロトロフィンである。
【0011】
他の例において、本明細書に開示の組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０の超粒子を含む。これらの例において、上記超粒子は異なるペイロードを含んでいてもよい。
【0012】
一例において、超粒子はナノ粒子を含む組成物をジカチオン水溶液中にエレクトロスプレーすることによって製造されてもよい。一例において、上記ナノ粒子を含む組成物はアルギン酸またはその多糖誘導体も含む。したがって、一例において、超粒子は、ナノ粒子及びアルギン酸またはその多糖誘導体を含む組成物をジカチオン水溶液中にエレクトロスプレーすることによって製造されてもよい。これらの例において製造された超粒子には、１．５μｇ～１５μｇのニューロトロフィンなどのペイロードが担持されていてもよい。これらの例において、ペイロードを担持する前に、超粒子を焼成に供して、アルギン酸を除去してもよい。一例において、上記焼成は約６５０℃で行われる。一例において、上記焼成は約６～約３０時間行われる。一例において、上記アルギン酸はアルギン酸ナトリウム塩である。したがって、一例において、本開示は、本明細書に開示の超粒子を含む組成物を包含し、上記超粒子は、ナノ粒子及びアルギン酸またはその多糖誘導体を含む組成物をジカチオン水溶液中にエレクトロスプレーすることによって製造される。この例において、上記超粒子を焼成に供してアルギン酸を除去してもよい。一例において、上記焼成は約６５０℃で行われる。一例において、上記焼成は約６～約３０時間行われる。
【0013】
本発明者らはまた、本明細書に開示の超粒子が、いくつかの態様において、ペイロードを比較的長期間にわたって放出することができることも特定した。更に、本明細書に開示の超粒子は、いくつかの態様において、ペイロードの放出を操作するための様々な製剤中で提供してもよい。例えば、本発明者らは、特定の例において、本開示に係る超粒子が、該超粒子のそれぞれのペイロードを長期間にわたって放出することができることを特定した。本発明者らはまた、本明細書に開示の超粒子は、いくつかの態様において、ペイロードの放出を加速または遅延させるための様々な製剤中で提供してもよいことを特定した。したがって、一例において、本明細書に開示の超粒子または組成物は、徐放性製剤として提供してもよい。一例において、上記徐放性製剤はフォーム剤またはゲル剤である。一例において、本明細書に開示の組成物はグリコーゲンヒドロゲルを含む。別の例において、本明細書に開示の組成物はアルギン酸［（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）ｎ］またはその多糖誘導体を含む。別の例において、本明細書に開示の組成物はアルギン酸ナトリウム塩［Ｎａ（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）ｎ］またはその多糖誘導体を含む。
【0014】
一例において、本明細書に開示の組成物は加速放出製剤として提供される。一例において、上記加速放出製剤はフォーム剤またはゲル剤である。一例において、上記ゲル剤またはフォーム剤は熱可逆性である。例えば、上記加速製剤は本明細書に開示の超粒子及びＰＦ１２７ベースのヒドロゲルを含んでいてもよい。
【0015】
別の例において、本開示は、疾患または障害を治療するための薬剤の製造における、本明細書において規定される組成物の使用を包含する。一例において、上記疾患または障害は難聴である。一例において、上記難聴は、感音性難聴（ＳＮＨＬ）、老人性難聴、または騒音性としてキャラクタライズされる。
【0016】
別の例において、本開示は、対象の耳におけるらせん神経節ニューロンの生存の促進方法であって、上記対象に本明細書において規定される組成物を投与することを含む上記方法を包含する。例えば、本組成物を上記対象の耳に投与してもよい。
【0017】
別の例において、本開示は、対象における治療用のペイロードの持続的送達が望ましい疾病の治療方法であって、上記対象に、本明細書において規定される組成物を投与することを含む上記方法を包含する。一例において、上記組成物は上記対象の耳に投与される。別の例において、上記組成物は腹腔内投与される。別の例において、上記組成物は中枢神経系に投与される。別の例において、上記組成物は心室投与により投与される。別の例において、上記組成物は上記超粒子を保持するスキャフォールド中で投与される。
【0018】
別の例において、本開示は、疾患または障害の治療に使用するための、本明細書において規定される組成物を備えるキットを包含する。一例において、上記障害は難聴である。別の例において、上記キットは人工内耳を更に備える。
【0019】
本発明者らはまた、ナノ粒子及びアルギン酸を含む組成物をエレクトロスプレーすることによって、高レベルのペイロードを担持することができる超粒子を製造することができることを特定した。したがって、一例において、本開示は、本明細書において規定される超粒子の製造に使用するための、ナノ粒子及びアルギン酸を含む組成物も包含する。一例において、上記アルギン酸はアルギン酸ナトリウム塩である。
【0020】
別の例において、本開示は、ナノ粒子及びアルギン酸またはその多糖誘導体を含む組成物をジカチオン水溶液中にエレクトロスプレーすることを含む超粒子の製造方法を包含する。一例において、上記方法は、上記超粒子を焼成に供してアルギン酸を除去することを更に含む。一例において、上記焼成は約６５０℃で行われる。一例において、上記焼成は約６～約３０時間行われる。
【0021】
本明細書のいずれの例も、別段の明記がない限り、他のいずれの例にも準用されるものとする。
【0022】
本開示は、例示のみを目的とする本明細書に記載の特定の例によって範囲が限定されるものではない。機能的に均等な製品、組成物、及び方法は、明確に本明細書に記載される開示の範囲内である。
【0023】
本明細書全体を通して、別段の明記がない限り、または文脈に別段の必要性がない限り、単一のステップ、組成物、ステップの群、または組成物の群への言及は、それらの単一及び複数の（すなわち１または複数の）ステップ、組成物、ステップの群、または組成物の群を包含するものと解釈される。
【0024】
本開示を、以下の非限定的な実施例により、及び添付の図面を参照することにより以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ＭＳ－ＳＰの製造手順の図である。
【図2】異なるｐＨ値の関数としてのＭＳ－ＳＰのゼータ電位の図である。ゼータ電位測定は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）、及び１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中で行った。
【図3】ＦＩＴＣリゾチーム（緑色）を担持したＭＳ－ＳＰの共焦点顕微鏡画像である。ａ）及びｂ）異なる倍率のＭＳ－ＳＰ。ｃ）ＦＩＴＣリゾチームを担持したＭＳ－ＳＰ断片の内部。
【図4】異なるＦＩＴＣリゾチーム担持時の濃度を用いた３日間（７２時間）のインキュベーション時間後の薬物担持量の図である。ａ）ＦＩＴＣリゾチーム担持時の濃度に対する、非多孔性ＭＳ－ＳＰａｌｇ（黒丸）、小孔ＭＳ－ＳＰａｌｇ（青四角）、及びＭＳ－ＳＰａｌｇ（赤三角）中へのＦＩＴＣリゾチームの吸着量。ｂ）ＦＩＴＣリゾチーム担持時の濃度に対する、非多孔性ＭＳ－ＳＰ（黒丸）、小孔ＭＳ－ＳＰ（青四角）、及びＭＳ－ＳＰ（赤三角）中へのＦＩＴＣリゾチームの吸着量。ｃ）ＭＳ－ＳＰａｌｇ及びｄ）ＭＳ－ＳＰにおけるＦＩＴＣリゾチーム担持効率。表示されるデータは、それぞれ５のＳＰを用いた３回の繰り返し実験の平均値であり、誤差棒は標準偏差を表す。
【図5】異なる径のＭＳ－ＳＰ中へのＦＩＴＣリゾチームの担持量及び該ＭＳ－ＳＰからの放出挙動の図である。ａ）ＦＩＴＣリゾチームの担持量、ｂ）ＦＩＴＣリゾチームのイン・ビトロ放出プロファイル、ｃ）各時点で放出されたＦＩＴＣリゾチームの値、ｄ）径が２００、５５０、６５０、１０００μｍのＭＳ－ＳＰからのＦＩＴＣリゾチームのイン・ビトロ放出量の検量線。
【図6】異なる数のＭＳ－ＳＰと共に４８時間インキュベートしたヒト脳膠芽腫細胞（Ｕ８７ＭＧ細胞株）の細胞生存率の図である。インサートを用いてエタノールを添加した細胞を陰性（細胞毒性）対照として調製し、未処理の細胞が１００％の生存率を示す。表示されるデータは４の試料の平均値であり、誤差棒は標準偏差を表す。
【図7】イン・ビトロでの累積薬物放出プロファイルの図である。ａ）ＭＳ－ＳＰ（赤丸）、及びＭＳ－ＳＰａｌｇ（黒三角）からのＦＩＴＣリゾチーム（０．２ｍｇ・ｍＬ－１、３日間薬物担持）のイン・ビトロ放出。表示されるデータは、それぞれ１０のＳＰを用いた３回の繰り返し実験の平均値であり、誤差棒は標準偏差を表す。ｂ）ＭＳ－ＳＰからのＦＩＴＣリゾチーム（１．０ｍｇ・ｍＬ－１、３日間薬物担持）のイン・ビトロ放出。ｂ）中の挿入図は、６日目から始まるＦＩＴＣリゾチームのイン・ビトロ放出プロファイルである。ｃ）ＭＳ－ＳＰ（１．０ｍｇ・ｍＬ－１、３日間薬物担持）からのＢＤＮＦのイン・ビトロ放出。ＢＤＮＦ濃度の測定にはＢＤＮＦ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）を用いた。
【図8】ＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＭＳ－ＳＰ（担持条件：１００μＬの０．２ｍｇ・ｍｌ－１のＦＩＴＣリゾチームを担持、３日間の担持時間）の、個々の時点で放出されたＦＩＴＣリゾチームの値の図である。表示されるデータは、それぞれ１０の超粒子を用いた３回の繰り返し実験の平均値であり、誤差棒は標準偏差を表す。
【図9】ＭＳ－ＳＰ（担持条件：１００μＬの１．０ｍｇ・ｍｌ－１のＦＩＴＣリゾチームを３日間にわたり担持）の、個々の時点で放出されたＦＩＴＣリゾチームの値の図である。薬物担持量は、超粒子当り６．４９±０．４８μｇであった。表示されるデータは、それぞれ１０のＭＳ－ＳＰを用いた３回の繰り返し実験の平均値であり、誤差棒は標準偏差を表す。
【図10】イン・ビトロＢＤＮＦ薬物試験（担持条件：１．０ｍｇ・ｍｌ－１のＢＤＮＦを３日間にわたり担持）の個々の時点における絶対値の図である。表示されるデータは、それぞれ１のＭＳ－ＳＰを用いた３回の繰り返し実験の平均値であり、誤差棒は標準偏差を表す。
【図11】ａ）ＭＳ－ＳＰから放出されたＢＤＮＦを測定するためのＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイ。ｂ）ＭＳ－ＳＰの使用の個々の時点で放出されたＢＤＮＦの値。薬物担持量は超粒子当り６．８２μｇである。表示されるデータは３回の繰り返し実験の平均値であり、誤差棒は標準偏差を表す。
【図12】ａ）ＰＦ１２７ヒドロゲル系中のＭＳ－ＳＰ（赤丸）、及びＭＳ－ＳＰａｌｇ（黒四角）のＦＩＴＣリゾチームのイン・ビトロ放出プロファイル。ｂ）図ａ）（１００μＬの０．２ｍｇ・ｍｌ－１のＦＩＴＣリゾチームを担持）の個々の時点で放出されたＦＩＴＣリゾチームの値。薬物担持量は、ＭＳ－ＳＰ及びＭＳ－ＳＰａｌｇにおいてそれぞれ超粒子当り１．８９±０．０８μｇ及び超粒子当り１．９３±０．０３μｇである。表示されるデータは、それぞれ１０の超粒子を用いた３回の繰り返し実験の平均値であり、誤差棒は標準偏差を表す。
【図13】５０％担持（３．６５μｇ／ＳＰ）の場合のイン・ビトロ放出プロファイルの図である。
【図14】１５０日のイン・ビトロ薬物放出試験後のＭＳ－ＳＰの分解の図である。ａ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃で１５０日のインキュベーション後のＭＳ－ＳＰのＳＥＭ画像。ｂ）及びｃ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃で１５０日のインキュベーション後のＭＳ－ＳＰの表面構造のＳＥＭ画像。
【図15】ニューロトロフィン－３の量（担持量に対する割合）及びμｇで表した全量を示す図である。１週間の移植の後に、各ＳＰには当初の担持量の約２ｕｇのニューロトロフィン－３（約４０％）が含まれていた。
【発明を実施するための形態】
【0026】
全般的な技法及び選択された用語の定義
特に別段の定義がなされない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、（例えば、生理学、臨床研究、分子生物学、高表面積分子、エレクトロスプレー、生化学）の分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つものと解釈される。
特に別段の定義がなされない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、（例えば、生理学、臨床研究、分子生物学、高表面積分子、エレクトロスプレー、生化学）の分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つものと解釈される。
【0027】
別段の指示がない限り、本開示において利用される技法は、当業者に周知の標準的な手順である。かかる技法は、Ｊ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９８４）， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）， Ｔ．Ａ． Ｂｒｏｗｎ （ｅｄｉｔｏｒ）， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）， Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ （ｅｄｉｔｏｒｓ）， ａｎｄ Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｉｔｏｒｓ）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｌ ｕｐｄａｔｅｓ ｕｎｔｉｌ ｐｒｅｓｅｎｔ）， Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｉｔｏｒｓ） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８８）， ａｎｄ Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｉｔｏｒｓ） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（今日に至るまでの全ての改訂版を含む）などの出所の文献の全体を通して記載及び説明される。
【0028】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形の用語及び単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、例えば、内容が明らかに別段を指示する場合を除いて、複数の指示対象を任意選択で包含する。したがって、例えば、「超粒子」への言及は任意選択で複数の超粒子を包含する。
【0029】
本明細書では、用語「約」とは、別段の明記がない限り、指定された値の±１０％、より好ましくは±５％、より好ましくは±１％をいう。
【0030】
用語「及び／または」、例えば「Ｘ及び／またはＹ」とは、「Ｘ及びＹ」または「ＸもしくはＹ」のいずれかを意味すると解されるべきものであり、両方の意味またはいずれかの意味に対して明示的にサポートするものと解釈されるべきものである。
【0031】
本明細書全体を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載された要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を包含することを意味するが、如何なる他の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群も排除することは意味しないと解釈されるべきものである。
【0032】
本明細書では、用語「治療」とは、臨床病理の過程の間に、治療を受ける個体または細胞の自然の経過を変化させるように設計された臨床的介入をいう。例示的な治療の所望の効果としては、治療を受ける障害に伴う症状の軽減が挙げられる。難聴の治療の文脈においては、治療の所望の効果としては、難聴の段階の低下及び難聴の改善または緩和が挙げられる。例えば、障害に伴う１または複数の症状が軽減または除去される場合、当該の個体は「治療が成功した」ということになる。
【0033】
「治療有効量」とは、特定の障害の測定可能な改善を実現するのに要する少なくとも最小量をいう。治療有効量としては、対象の障害の測定可能な改善を実現するのに要する少なくとも最小量も挙げることができる。治療有効量は１回または複数回の投与で与えることができる。上記治療有効量は、治療を受けている障害の重篤度に応じて、また治療を受けている対象の体重、年齢、人種的背景、性別、健康、及び／または身体の状態によっても変化し得る。一般的には、上記有効量は、医師による慣用的な試行及び実験を通じて決定することができる比較的広い範囲（例えば「投与量」範囲）内に収まることとなる。上記治療有効量は、単回投与で、または治療期間にわたって１回または数回繰り返される投薬で投与することができる。
【0034】
ペイロード
本開示によれば、超粒子は様々なペイロードを含むことができる。上記「ペイロード」は、障害の治療に有用な任意の薬剤であってよい。薬剤の例としては、ポリヌクレオチド、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、抗体薬物コンジュゲート、タンパク質、生物学的に活性なタンパク質、融合タンパク質、組換えタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、合成ポリペプチド、ワクチン、治療用血清、ウイルス、ポリヌクレオチド、幹細胞などの細胞、またはそれらの一部などの生物学的産物、ならびに小分子が挙げられる。
本開示によれば、超粒子は様々なペイロードを含むことができる。上記「ペイロード」は、障害の治療に有用な任意の薬剤であってよい。薬剤の例としては、ポリヌクレオチド、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、抗体薬物コンジュゲート、タンパク質、生物学的に活性なタンパク質、融合タンパク質、組換えタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、合成ポリペプチド、ワクチン、治療用血清、ウイルス、ポリヌクレオチド、幹細胞などの細胞、またはそれらの一部などの生物学的産物、ならびに小分子が挙げられる。
【0035】
例示的なウイルスペイロードとしては、適宜に改変されたレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）などの組換え形態、ならびに自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）及び非組み込み（ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）ＡＡＶなどのそれらの誘導体を挙げることができる。他の例示的なウイルス治療用ペイロードとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、ワクチン、及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を挙げることができる。例えば、上記ウイルス治療用ペイロードとしてはＡＡＶを挙げることができる。様々なＡＡＶ血清型が公知であり、好適なウイルスペイロードである可能性がある。一例において、上記ＡＡＶは血清型２である。別の例において、上記ＡＡＶは血清型１である。他の例において、上記ＡＡＶは血清型３、４、７、８、９、１０、１１、１２、または１３である。
【0036】
一例において、上記小分子は神経伝達物質である。本開示の文脈において、用語「神経伝達物質」は、１の細胞から別の細胞に化学シナプスを挟んで信号（複数可）を伝達する物質を指すために用いられる。一般に、神経伝達物質は、１のニューロンから別のニューロン、筋細胞、腺細胞などの標的細胞に化学シナプスを挟んで信号（複数可）を伝達する。別の例において、上記小分子は受容体アゴニストである。本開示の文脈において、用語「アゴニスト」は、受容体と結合したときに生理学的応答を開始する物質を指すために用いられる。別の例において、上記小分子は受容体アンタゴニストである。本開示の文脈において、用語「アンタゴニスト」は、受容体の生理学的作用を妨害または抑制する物質を指すために用いられる。
【0037】
例示的なポリヌクレオチドとしては、アンチセンスポリヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が挙げられる。一例において、上記ｄｓＤＮＡまたはｄｓＲＮＡはアプタマーである。別の例において、上記ｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである。
【0038】
例示的な抗体及びそれらのフラグメントとしては、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、または単一ドメイン抗体が挙げられる。一例において、上記抗体は、二重特異性であってもよく、抗体－薬物コンジュゲート、またはバイオ後続品抗体であってもよい。他の例示的なポリペプチドとしては、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、及び血液凝固因子が挙げられる。一例において、上記ポリペプチドは酵素である。例示的な酵素としては、プロテアーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、リポタマーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、コラゲナーゼ、グルタミナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ストレプトキナーゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、またはプログラマブル（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼが挙げられる。一例において、上記酵素はＤＮＡメチルトランスフェラーゼであってもよい。一例において、上記酵素は、遺伝子修飾を遺伝子またはその調節領域に導入することを目的とするプログラマブルヌクレアーゼであってもよい。例えば、上記プログラマブルヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型遺伝子操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）であってもよい。一例において、上記ＲＧＥＮは古細菌ゲノム由来であり、またはその組換えバージョンであってもよい。別の例において、上記ＲＧＥＮは細菌ゲノム由来であってもよく、またはその組換えバージョンである。別の例において、上記ＲＧＥＮはＴｙｐｅ Ｉ（ＣＲＩＳＰＲ）－ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）システム由来である。別の例において、上記ＲＧＥＮはＴｙｐｅ ＩＩ（ＣＲＩＳＰＲ）－ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）システム由来である。別の例において、上記ＲＧＥＮはＴｙｐｅ ＩＩＩ（ＣＲＩＳＰＲ）－ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）システム由来である。一例において、上記ヌクレアーゼはｃｌａｓｓ Ｉ ＲＧＥＮまたはｃｌａｓｓ ＩＩ ＲＧＥＮに由来する。
【0039】
別の例において、上記治療用ペイロードは、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。
【0040】
別の例において、上記治療用ペイロードは、対象において免疫応答を刺激する抗原であってもよい。例示的な抗原としては、タンパク質、ペプチド、多糖もしくはオリゴ糖（遊離またはタンパク質担体に結合）、またはそれらの混合物が挙げられる。他の例示的な抗原としては、細胞もしくはそれらの一部、またはウイルス粒子もしくはその一部が挙げられる。
【0041】
一例において、上記治療用ペイロードは抗腫瘍薬である。
【0042】
他の例示的な治療用ペイロードとしては、内耳における膜受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストが挙げられる。かかる治療用ペイロードは神経伝達を調節する可能性がある。別の例において、上記治療用ペイロードは、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、もしくは多発性硬化症などの１種または複数種の神経障害の治療に有用な神経学的薬剤である。
【0043】
一例において、上記ペイロードは「神経栄養因子」である。本開示の文脈において、用語「神経栄養因子」は、聴覚系由来の細胞を含む任意の細胞の増殖または生存能力を亢進する分子を指すために用いられる。例えば、本開示に含まれる神経栄養因子は、内耳、中耳、もしくは前庭系に位置する聴覚系由来の細胞または該細胞のシナプス結合の増殖または生存を亢進することができる。例示的な細胞としては、らせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）、内耳及び外耳有毛細胞を含む有毛細胞、蝸牛グリア細胞、及びシュワン細胞が挙げられる。例示的なシナプス結合としては、有毛細胞間、有毛細胞と上記で議論したＳＧＮまたは他のニューロンとの間の接続が挙げられる。他の例としては、ローゼンタール管中の神経細胞体もしくはそれらのシナプス結合、上中部蝸牛領域中のニューロンもしくはシナプス結合、及び／または骨らせん板中の神経線維が挙げられる。
【0044】
例示的な神経栄養因子としては、聴覚系由来の細胞及び／またはそれらのシナプス結合の生存を直接的または間接的に亢進するための公知の治療上の効能を有する上述の薬剤を挙げることができる。
【0045】
一例において、上記神経栄養因子は神経栄養ペプチドである。例示的な神経栄養ペプチドとしては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）などのＣＮＴＦファミリーのメンバー、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＴＬ－６）、グリア成熟因子（ＧＭＦ）、インスリン成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ニューレグリン１、ニューレグリン２、ニューレグリン３、及びニューレグリン４、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、及びペルセフィン（ＰＳＰＮ）などのＧＤＮＦファミリーのメンバー、Ａｌ、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３などのエフリン、インスリン成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ならびにＩＬ－１１などのインターロイキンが挙げられる。
【0046】
一例において、上記神経栄養因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、及びＩＬ－１１からなる群より選択される。
【0047】
らせん神経節ニューロンの変性の原因の１つは、ニューロトロフィンの内因性供給の減損である。したがって、一例において、上記神経栄養因子はニューロトロフィンである。本開示の文脈において、用語「ニューロトロフィン」とは、ニューロン及び／もしくはそれらのシナプス結合の生存、発生、ならびに／または機能を誘導するタンパク質を指すために用いられる。例示的なニューロトロフィンは上述しており、ＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、及びニューロトロフィン－４が挙げられる。したがって、一例において、上記超粒子はＢＤＮＦを含む。別の例において、上記超粒子は神経成長因子を含む。別の例において、上記超粒子はニューロトロフィン－３を含む。別の例において、上記超粒子はニューロトロフィン－４を含む。一例において、超粒子は、少なくとも２種の異なるニューロトロフィンを含んでいてもよい。他の例において、超粒子は少なくとも３種または４種の異なるニューロトロフィンを含んでいてもよい。
【0048】
複数の異なる治療用ペイロードを含む超粒子を投与することによって、治療上の効能が改善される場合がある。したがって、一例において、超粒子は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種の異なる治療用ペイロードを含んでいてもよい。
【0049】
例えば、超粒子は、少なくとも２種の異なる神経栄養因子を含んでいてもよい。他の例において、超粒子は、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なる神経栄養因子を含んでいてもよい。これらの例において、ニューロトロフィンなどの神経栄養因子の様々な組み合わせが企図される。神経栄養因子の例示的な組み合わせとしては、ＢＤＮＦ及び神経成長因子、ＢＤＮＦ及びニューロロフィン－３、ＢＤＮＦ及びニューロトロフィン－４、ＢＤＮＦ及びＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ及びＩＬ－１１、ニューロトロフィン－３及びニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－３及びＣＮＴＦ、ニューロトロフィン－３及びＣＮＴＦ、ニューロトロフィン－３及びＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－３及びＩＬ－１１、ニューロトロフィン－４及びＣＮＴＦ、ニューロトロフィン－４及びＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－４及びＩＬ－１１、ＣＮＴＦ及びＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ及びＩＬ－１１、ＧＤＮＦ及びＩＬ－１１、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、及びニューロトロフィン－４、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、及びＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、及びＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、及びＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、及びＩＬ－１１、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、及びＣＮＴＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、及びＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ＣＤＮＦ、及びＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、及びＩＬ－１１、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦ、及びＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦ、及びＩＬ－１１、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、及びＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、及びＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ＣＮＴＦ、及びＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦ、及びＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、及びＩＬ－１１、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦ、及びＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦ、及びＩＬ－１１が挙げられる。
【0050】
外科手術及び聴覚機器の移植などの様々な耳への介入は、中耳及び内耳における組織損傷、炎症、及び／または感染などの副作用を引き起こす可能性がある。かかる副作用に対して開始される生物学的反応（複数可）は、聴覚系由来の細胞及び／または該細胞のシナプス結合の増殖または生存能力に対して間接的に影響を与える可能性がある。したがって、一例において、神経栄養因子は組織の修復を支援し、炎症を軽減し、及び／または感染を軽減する。したがって、更なる例示的な神経栄養因子としては、ステロイドまたは抗酸化剤が挙げられる。他の例示的な神経栄養因子としては、抗体または抗トロポミオシン受容体キナーゼ（ＴｒＫ）Ｂ、抗ＴｒＫＣ、もしくはｐ７５ニューロトロフィン受容体と相互作用する結合タンパク質などの他の結合タンパク質が挙げられる。例えば、ｐ７５ニューロトロフィン受容体アンタゴニスト。別の例において、神経栄養因子としては核酸が挙げられる。例えば、上記神経栄養因子は、遺伝子治療薬、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのサイレンシングＲＮＡ、目的の核酸を含むＤＮＡプラスミドなどの発現構築物を挙げることができる。一例において、上記神経栄養因子は、オプシン（複数可）をコードする核酸を含む発現構築物である。
【0051】
更なる例示的な神経栄養因子の組み合わせとしては、ステロイド、抗酸化剤、抗体、または核酸と、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なる神経栄養因子とが挙げられる。例えば、超粒子は、デキサメタゾンまたはプレドニゾロンなどのステロイドと、ＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、及びＧＤＮＦのいずれか１種または複数種とを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は、オプシンと、ＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、及びＧＤＮＦのいずれか１種または複数種とを含む発現ベクターを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は、抗トロポミオシン受容体キナーゼ（ＴｒＫ）Ｂまたは抗ＴｒＫ Ｃなどの抗体と、ＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ＧＤＮＦ、及びＩＬ－１１のいずれか１種または複数種とを含んでいてもよい。
【0052】
一例において、超粒子は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なる治療用ペイロードであって、少なくとも１種が神経栄養因子である上記治療用ペイロードを含んでいてもよい。例えば、超粒子は、少なくとも３種の異なる治療用ペイロードであって、２種が神経栄養因子である上記治療用ペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は、少なくとも４種の異なる治療用ペイロードであって、３種が神経栄養因子である上記治療用ペイロードを含んでいてもよい。これらの例において、上記治療用ペイロードは聴覚系由来の細胞の増殖または生存能力を亢進する必要はなく、別の治療効果を与えるものであってもよい。例えば、上記治療用ペイロードは、超粒子の投与後に対象の免疫系を抑制してもよい。別の例において、超粒子は、聴覚系由来の細胞またはそれらのシナプス結合の生存を低下させるペイロードと、神経栄養因子（複数可）とを含んでいてもよい。この例において、上記神経栄養因子は、上記治療用ペイロードによって生じる聴覚系由来の細胞またはそれらのシナプス結合の生存の低下を緩和する可能性がある。一例において、超粒子は、シスプラチンまたは関連化合物を含む抗腫瘍薬、トブラマイシンまたは関連化合物などのアミノグリコシドを含む抗生物質、フロセミドなどのループ利尿薬、メトトレキサートなどの代謝拮抗薬、アスピリンなどのサリシラート、または放射性部分と、神経栄養因子（複数可）とを含む。超粒子は、抗生物質と、ＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ＧＤＮＦ、及びＩＬ－１１のいずれか１種または複数種とを含んでいてもよい。
【0053】
投与部位によっては、ペイロードを中耳から内耳または前庭系に拡散させる必要がある場合がある。この拡散は、正円窓または卵円窓を通るペイロードの拡散によって生じさせることができる。したがって、一例において、超粒子は、正円窓または卵円窓を通って内耳及び／または前庭系へのペイロードの拡散を助長する分子（複数可）を含んでいてもよい。
【0054】
一例において、上記ペイロードの等電点は７を超える。別の例において、上記ペイロードの等電点は８を超える。別の例において、上記ペイロードの等電点は９を超える。別の例において、上記ペイロードの等電点は１０を超える。別の例において、上記ペイロードの等電点は７～１０である。別の例において、上記ペイロードの等電点は７～９である。別の例において、上記ペイロードの等電点は８～１０である。別の例において、上記ペイロードの等電点は９～１０である。
【0055】
本開示の文脈において、ペイロードを含む超粒子を、担持超粒子と呼んでもよい。担持超粒子の製造方法は、得られる超粒子に少なくとも１．５μｇのペイロードが担持されていることが可能である限り特に限定されない。得られる超粒子が対象の耳に上記ペイロードを送達できることが好ましい。例示的な担持方法がＷａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ． １９， ６４５１に総説されており、該方法としてはペイロードの封入及び包括が挙げられる。非限定的な一例において、超粒子を当該ペイロードの水溶液と接触させ、その後一定期間インキュベートすることによって、超粒子に担持することができる。上記ペイロード溶液は、当該超粒子に担持すべき量よりも過剰な量のペイロードを含有していてもよく、インキュベーションは室温で行ってもよい。当該超粒子及びペイロードを含有する溶液を撹拌して、ペイロードの担持量を向上させてもよい。
【0056】
当業者であれば、ペイロードの必要なレベルは、当該ペイロード自体及び本開示に従って治療を受ける適応症によって影響を受ける可能性が高いことを理解しよう。
【0057】
超粒子
本開示の文脈において、用語「超粒子」（「ＳＰ」）は、細孔のネットワークを備える凝集粒子を指すために用いられる。上記細孔のネットワークにより、ペイロードを担持するための大きな細孔容積及び表面積を有する超粒子が提供される。大きな細孔容積及び表面積は、それらによって超粒子に担持することができるペイロードの量を高めることが可能になることから有利である。一例において、本開示に係る超粒子は凝集ナノ粒子である。
本開示の文脈において、用語「超粒子」（「ＳＰ」）は、細孔のネットワークを備える凝集粒子を指すために用いられる。上記細孔のネットワークにより、ペイロードを担持するための大きな細孔容積及び表面積を有する超粒子が提供される。大きな細孔容積及び表面積は、それらによって超粒子に担持することができるペイロードの量を高めることが可能になることから有利である。一例において、本開示に係る超粒子は凝集ナノ粒子である。
【0058】
一例において、本開示に係る超粒子は、少なくとも１．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２．０μｇのペイロードを含む。
【0059】
別の例において、本開示に係る超粒子は、少なくとも２．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２．６μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２．７μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２．７μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２．８μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２．９μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．０μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．１μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．２μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．３μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．４μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．６μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．７μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．８μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．９μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも４．０μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも４．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも５．０μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも５．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも６．０μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも６．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも７．０μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも７．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも８．０μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも８．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも９．０μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも９．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１０μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１０．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１１μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１１．５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１２μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１５μｇのペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２０μｇのペイロードを含む。
【0060】
例えば、超粒子は少なくとも６μｇのペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約２．５～１０μｇのペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約３～１０μｇのペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約４～１０μｇのペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～１０μｇのペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約６～１０μｇのペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～１５μｇのペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～２０μｇのペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約８～２０μｇのペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は、約８～１５μｇのペイロードを含んでいてもよい。
【0061】
例えば、超粒子は約６～８μｇのペイロードを含んでいてもよい。
【0062】
一例において、本開示に係る超粒子は、少なくとも１．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも２．０μｇの神経栄養因子を含む。
【0063】
別の例において、超粒子は少なくとも２．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも４．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも５．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも６．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも７．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも８．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも９．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも１０μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも１０．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも１１μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも１１．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも１２μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも１５μｇの神経栄養因子を含む。別の例において、超粒子は少なくとも２０μｇの神経栄養因子を含む。
【0064】
例えば、超粒子は少なくとも６μｇの神経栄養因子を含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約２．５～１０μｇの神経栄養因子を含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～１０μｇの神経栄養因子を含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約６～１０μｇの神経栄養因子を含んでいてもよい。例えば、超粒子は、約６～８μｇの神経栄養因子を含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～１５μｇの神経栄養因子を含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～２０μｇの神経栄養因子を含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約８～２０μｇの神経栄養因子を含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約８～１５μｇの神経栄養因子を含んでいてもよい。
【0065】
一例において、本開示に係る超粒子は、少なくとも１．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２．０μｇのニューロトロフィンを含む。
【0066】
別の例において、超粒子は少なくとも２．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも４．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも５．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも６．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも７．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも８．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも９．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１０．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１１μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１１．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１２μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２０μｇのニューロトロフィンを含む。
【0067】
例えば、超粒子は少なくとも６μｇのニューロトロフィンを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約２．５～１０μｇのニューロトロフィンを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～１０μｇのニューロトロフィンを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約６～１０μｇのニューロトロフィンを含んでいてもよい。例えば、超粒子は、約６～８μｇのニューロトロフィンを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～１５μｇのニューロトロフィンを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は、約５～２０μｇのニューロトロフィンを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約８～２０μｇのニューロトロフィンを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約８～１５μｇのニューロトロフィンを含んでいてもよい。
【0068】
一例において、本開示に係る超粒子は、少なくとも１．５μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２．０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。
【0069】
別の例において、超粒子は少なくとも２．５μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも３．５μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも４．０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも５．０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも６．０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも７．０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも８．０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも９．０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１０．５μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１１μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１１．５μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１２μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも１５μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。別の例において、超粒子は少なくとも２０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含む。
【0070】
例えば、超粒子は少なくとも６μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含んでいてもよい。
【0071】
別の例において、超粒子は約２．５～１０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～１０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約６～１０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含んでいてもよい。例えば、超粒子は約６～８μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～２０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約５～１５μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約８～２０μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含んでいてもよい。別の例において、超粒子は約８～１５μｇの、等電点が９～１０であるペイロードを含んでいてもよい。例えば、上記ペイロードは等電点が９～１０であるニューロトロフィンであってもよい。
【0072】
一例において、上述のペイロードを有する超粒子は、アルギン酸ヒドロゲル中で提供されてもよい。
【0073】
本開示の超粒子には上記に例示したペイロードが担持されていてもよく、該超粒子の細孔径は以下に記述する例から選択されてもよい。一例において、超粒子はミクロポーラスである。本開示の文脈において、用語「ミクロポーラス」は、細孔径が約２ｎｍ未満である粒子を指すために用いられる。例えば、ミクロポーラス超粒子の細孔径は約０．５ｎｍ～約２ｎｍであってよい。他の例において、ミクロポーラス超粒子の細孔径は、約１ｎｍ～約２ｎｍ、約１．５ｎｍ～約２ｎｍであってよい。別の例において、超粒子はメソポーラスである。本開示の文脈において、用語「メソポーラス」は、径が約２ｎｍ～約５０ｎｍである細孔を有する粒子を指すために用いられる。例えば、メソポーラス超粒子の細孔径は約２ｎｍ～約５０ｎｍであってよい。他の例において、メソポーラス超粒子の細孔径は、約２ｎｍ～約４０ｎｍ、約２ｎｍ～約３０ｎｍである。別の例において、超粒子はマクロポーラスである。本開示の文脈において、用語「マクロポーラス」は、細孔径が約５０ｎｍを超える粒子を指すために用いられる。例えば、マクロポーラス超粒子の細孔径は約５０ｎｍ～約５００ｎｍであってよい。他の例において、マクロポーラス超粒子の細孔径は、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍであってよい。
【0074】
一例において、超粒子はミクロポーラスナノ粒子から構成される。一例において、超粒子は細孔径が約０．５ｎｍ～約２ｎｍであるナノ粒子から構成される。他の例において、超粒子は、細孔径が約１ｎｍ～約２ｎｍ、約１．５ｎｍ～約２ｎｍであるナノ粒子から構成される。別の例において、超粒子はメソポーラスナノ粒子から構成される。一例において、超粒子は細孔径が約２ｎｍ～約５０ｎｍであるナノ粒子から構成される。他の例において、超粒子は、細孔径が約２ｎｍ～約４０ｎｍ、約２ｎｍ～約３０ｎｍであるナノ粒子から構成される。別の例において、超粒子はマクロポーラスナノ粒子から構成される。一例において、超粒子は細孔径が約５０ｎｍ～約９５ｎｍであるナノ粒子から構成される。他の例において、超粒子は、細孔径が約５０ｎｍ～約８５ｎｍ、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ、約５０ｎｍ～約６５ｎｍであるナノ粒子から構成される。
【0075】
別の例において、超粒子は二峰性細孔構造を有するナノ粒子から構成される。本開示の文脈において、用語「二峰性」は、複数の細孔径、一般により小さな細孔径とより大きな細孔径とを備える粒子を指すために用いられる。例えば、超粒子はメソ孔及びマクロ孔を有するナノ粒子を含んでいてもよい。一例において、かかる超粒子は、２ｎｍ～９５ｎｍの範囲の細孔を有するナノ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、１０ｎｍ～９５ｎｍの範囲の細孔を有する二峰性ナノ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、１５ｎｍ～９５ｎｍの範囲の細孔を有する二峰性ナノ粒子から構成される。
【0076】
他の例において、超粒子は１ｎｍ～２００ｎｍの範囲の細孔径を備えていてもよい。他の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約１ｎｍ～約５ｎｍであり、より大きな細孔径が約１０ｎｍ～約５０ｎｍである二峰性ナノ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約２ｎｍ～約４ｎｍであり、より大きな細孔径が約１５ｎｍ～約４０ｎｍである二峰性ナノ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約２ｎｍ～約３ｎｍであり、より大きな細孔径が約４ｎｍ～約４０ｎｍである二峰性ナノ粒子から構成される。他の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約１０ｎｍ～約５０ｎｍであり、より大きな細孔径が約７０ｎｍ～約９５ｎｍである二峰性ナノ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約１５ｎｍ～約４０ｎｍであり、より大きな細孔径が約８０ｎｍ～約９５ｎｍである二峰性ナノ粒子から構成される。
【0077】
一例において、超粒子はミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子はミクロポーラスミクロ粒子から構成される。一例において、超粒子は細孔径が約０．５ｎｍ～約２ｎｍであるミクロ粒子から構成される。他の例において、超粒子は、細孔径が約１ｎｍ～約２ｎｍ、約１．５ｎｍ～約２ｎｍであるミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子はメソポーラスミクロ粒子から構成される。一例において、超粒子は細孔径が約２ｎｍ～約５０ｎｍであるミクロ粒子から構成される。他の例において、超粒子は、細孔径が約２ｎｍ～約４０ｎｍ、約２ｎｍ～約３０ｎｍであるミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子はマクロポーラスミクロ粒子から構成される。一例において、超粒子は細孔径が約５０ｎｍ～約５００ｎｍであるミクロ粒子から構成される。他の例において、超粒子は、細孔径が約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍであるミクロ粒子から構成される。
【0078】
別の例において、超粒子は二峰性細孔構造を有するミクロ粒子から構成される。例えば、超粒子はメソ孔及びマクロ孔を有するミクロ粒子を含んでいてもよい。一例において、かかる超粒子は２ｎｍ～５００ｎｍの範囲の細孔を有するミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子は１０ｎｍ～２５０ｎｍの範囲の細孔を有する二峰性ミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子は１５ｎｍ～１５０ｎｍの範囲の細孔を有する二峰性ミクロ粒子から構成される。
【0079】
他の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約１ｎｍ～約５ｎｍであり、より大きな細孔径が約１０ｎｍ～約５０ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約２ｎｍ～約４ｎｍであり、より大きな細孔径が約１５ｎｍ～約７０ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約２ｎｍ～約３ｎｍであり、より大きな細孔径が約１５ｎｍ～約６５ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。他の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約１０ｎｍ～約３０ｎｍであり、より大きな細孔径が約１５ｎｍ～約２００ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約１５ｎｍ～約４０ｎｍであり、より大きな細孔径が約１５ｎｍ～約１５０ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、より小さな細孔径が約２０ｎｍ～約３０ｎｍであり、より大きな細孔径が約１００ｎｍ～約１２０ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。
【0080】
別の例において、超粒子には少なくとも３μｇの上述のペイロードが担持され、該超粒子は、より小さな細孔径が約２ｎｍ～約４ｎｍであり、より大きな細孔径が約１５ｎｍ～約４０ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子には少なくとも５μｇの上述のペイロードが担持され、該超粒子は、より小さな細孔径が約２ｎｍ～約４ｎｍであり、より大きな細孔径が約１５ｎｍ～約４０ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。
【0081】
別の例において、超粒子には少なくとも８μｇの上述のペイロードが担持され、該超粒子は、より小さな細孔径が約２ｎｍ～約４ｎｍであり、より大きな細孔径が約１５ｎｍ～約４０ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。
【0082】
別の例において、超粒子には少なくとも１０μｇの上述のペイロードが担持され、該超粒子は、より小さな細孔径が約２ｎｍ～約４ｎｍであり、より大きな細孔径が約１５ｎｍ～約４０ｎｍである二峰性ミクロ粒子から構成される。これらの例において、上記超粒子はアルギン酸ヒドロゲル中で提供されてもよい。
【0083】
別の例において、超粒子はミクロ粒子とナノ粒子とから構成される。この例において、ミクロ粒子及びナノ粒子の細孔径（複数可）は上述の通りであってよい。例えば、超粒子は、二峰性細孔構造を有するミクロ粒子とナノ粒子とから構成されていてもよい。
【0084】
一例において、超粒子の細孔径は実質的に均一であってもよい。別の例において、超粒子は一定ではない細孔径を備える。この例において、細孔径は一定ではなくてよいが、特定の径の範囲内に収まる。例えば、超粒子は主としてメソポーラスであってもよい。別の例において、超粒子は主としてマクロポーラスであってもよい。別の例において、超粒子は、細孔径が実質的に均一なナノ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、実質的に均一な小さな細孔径と大きな細孔径とを有する二峰性ナノ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、細孔径が実質的に均一なミクロ粒子から構成される。別の例において、超粒子は、実質的に均一な小さな細孔径と大きな細孔径とを有する二峰性ミクロ粒子から構成される。
【0085】
一例において、上述の超粒子は規則的な細孔構造を有していてもよい。これらの超粒子は規則的な３次元の間隔を伴う細孔を有する。別の例において、上述の超粒子は、不規則な細孔構造を有していてもよい。これらの超粒子は不規則な３次元の間隔を伴う細孔を有する。別の例において、超粒子は規則的な細孔構造と不規則な細孔構造の両方の組み合わせを有する。
【0086】
当業者であれば、超粒子の細孔径が、例えば、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、及びＸ線コンピュータ断層撮影法によって測定可能であることを理解しよう。当業者であれば、上記に例示した細孔径を有する超粒子を、それらの三次元構造の最も広い点における幅を測定することにより特定することができる。一例において、最も広い点または細孔は当該超粒子の表面上であってもよい。
【0087】
本開示の超粒子は、それらの粒子間の距離によってキャラクタライズすることができる。一例において、粒子間の平均距離は約８０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲であってもよい。別の例において、コロイド粒子間の平均距離は、約９０ｎｍ～約３００ｎｍ、約１００ｎｍ～ の範囲である。
【0088】
一例において、超粒子の細孔は連結している。例えば、超粒子は一連の相互連結した細孔を備えていてもよい。別の例において、超粒子の細孔は連結していない。別の例において、超粒子は、連結した細孔と連結していない細孔の両方の組み合わせを有する。
【0089】
本開示の超粒子は、それらの細孔の容積によってキャラクタライズすることができる。一例において、超粒子の細孔容積は、約０．５ｍＬ・ｇ－１～約１０ｍＬ・ｇ－１の範囲である。別の例において、超粒子の細孔容積は、約０．８ｍＬ・ｇ－１～約５ｍＬ・ｇ－１、約１ｍＬ・ｇ－１～約２．５ｍＬ・ｇ－１、約１．５ｍＬ・ｇ－１～約２ｍＬ・ｇ－１である。
【0090】
本開示の超粒子は、中空コアまたはドーナツ状のコアを有していてもよい。一例において、上記超粒子のコアの内容積は、当該超粒子の全容積の少なくとも約４５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％である。例示的な中空コアの超粒子の製造方法としては、ＵＳ４，４６８，４９８に記載のプロセスなどの酸性コアプロセス、及びＵＳ５，１５７，０８４及びＵＳ５，５２１，２５３に記載のプロセスのようなエステルコアプロセスが挙げられる。
【0091】
本開示の超粒子は、それらの構造の表面積によってキャラクタライズすることができる。一例において、超粒子の表面積は、約５００ｍ２・ｇ－１～約１５００ｍ２・ｇ－１の範囲である。別の例において、超粒子の表面積は、約５５００ｍ２・ｇ－１～約１２５０ｍ２・ｇ－１、約６００ｍ２・ｇ－１～１０００ｍ２・ｇ－１、約６００ｍ２・ｇ－１～７００ｍ２・ｇ－１である。一例において、超粒子の表面積は約６００ｍ２・ｇ－１である。一例において、超粒子の表面積は約６２０ｍ２・ｇ－１である。
【0092】
本開示に係る超粒子は特定のイン・ビトロ放出プロファイルによってキャラクタライズすることができる。一例において、超粒子は少なくとも５０日間ペイロードを放出する。一例において、超粒子は少なくとも１００日間ペイロードを放出する。一例において、超粒子は少なくとも１５０日間ペイロードを放出する。
【0093】
別の例において、超粒子はペイロードの初期バーストを放出し、それに続いてペイロードを持続的に放出する。例えば、超粒子は約３～１０日間高レベルのペイロードを放出し、その後３０日以上の間持続性放出プロファイルが続く。別の例において、超粒子は約８～１０日間高レベルのペイロードを放出し、その後５０日以上の間持続性放出プロファイルが続く。
【0094】
一例において、上記ペイロードの初期バーストは、少なくとも２日の間１．２μｇ／日である。別の例において、上記ペイロードの初期バーストは、少なくとも３日の間１．３μｇ／日である。別の例において、上記ペイロードの初期バーストは、２～４日の間１．４μｇ／日である。持続性放出プロファイルの例は少なくとも０．０４μｇ／日である。持続性放出プロファイルの別の例は少なくとも０．０６μｇ／日である。持続性放出プロファイルの他の例は少なくとも０．０７μｇ／日及び少なくとも０．１μｇ／日である。
【0095】
別の例において、超粒子は、少なくとも２０日間、少なくとも２μｇのペイロードを放出する。別の例において、超粒子は少なくとも３０日間、少なくとも２μｇのペイロードを放出する。別の例において、超粒子は少なくとも４０日間、少なくとも２μｇのペイロードを放出する。別の例において、超粒子は少なくとも２０日間、少なくとも４μｇのペイロードを放出する。別の例において、超粒子は、少なくとも３０日間、少なくとも４μｇのペイロードを放出する。別の例において、超粒子は、少なくとも４０日間、少なくとも４μｇのペイロードを放出する。
【0096】
別の例において、超粒子は、少なくとも２０日間、少なくとも２μｇの神経栄養因子を放出する。別の例において、超粒子は、少なくとも３０日間、少なくとも２μｇの神経栄養因子を放出する。別の例において、超粒子は、少なくとも４０日間、少なくとも２μｇの神経栄養因子を放出する。別の例において、超粒子は、少なくとも２０日間、少なくとも４μｇの神経栄養因子を放出する。別の例において、超粒子は、少なくとも３０日間、少なくとも４μｇの神経栄養因子を放出する。別の例において、超粒子は、少なくとも４０日間、少なくとも４μｇの神経栄養因子を放出する。例えば、超粒子は、少なくとも２０日間、少なくとも２μｇのＢＤＮＦを放出する。他の例において、超粒子は、少なくとも４０日間、少なくとも２μｇのＢＤＮＦを放出してもよい。別の例において、超粒子は、少なくとも２０日間、少なくとも４μｇのＢＤＮＦを放出してもよい。別の例において、超粒子は、少なくとも４０日間、少なくとも４μｇのＢＤＮＦを放出してもよい。
【0097】
当業者であれば、様々な方法を用いて、超粒子のイン・ビトロ放出プロファイルを測定することができる。かかる方法の例は実施例７に後述する。例えば、本明細書に開示の超粒子には、ＰＢＳなどの溶液中でインキュベートする前に、ＦＩＴＣリゾチームなどの標識ペイロードを担持してもよい。蛍光の間欠的な測定を用いて、経時的に放出されるペイロードのレベル（例えばμｇ）を測定してもよい。
【0098】
一例において、本開示の超粒子は、径が約１ｎｍ～１００ｎｍであるナノ粒子から製造される。別の例において、超粒子は、径が約０．１μｍ～１００μｍであるミクロ粒子から製造される。別の例において、超粒子はナノ粒子とミクロ粒子とから製造される。
【0099】
本開示の超粒子を形成する例示的な粒子としては、有機粒子、無機粒子、金属粒子、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例示的な有機粒子としては、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（エタクリル酸）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド）、ポリアミド、ポリ－２－ヒドロキシブチラート（ＰＨＢ）、ゼラチン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、及びポリ（乳酸－共－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの高分子粒子が挙げられる。例示的な無機粒子としては、重質充填剤すなわち高密度充填剤、顔料、クレー、及びその他の合成粒子などの無機充填剤が挙げられる。他の例示的な無機粒子としては、重晶石；赤鉄鉱；酸化マグネシウム；二酸化チタン、酸化カルシウム、酸化亜鉛、酸化マグネシウム、酸化セリウム、二酸化ジルコニウム、及び二酸化ケイ素を含む無機酸化物などの高密度鉱物が挙げられる。一例において、上記材料は二酸化ケイ素（すなわちシリカ）である。したがって、一例において、超粒子はシリカ超粒子と呼ばれる場合がある。例示的な金属粒子としては、金、銀、及び銅が挙げられる。一例において、超粒子は同一の粒子を含んでいてもよい。例えば、超粒子は実質的にシリカ粒子から構成されてもよい。別の例において、超粒子は異なる粒子、例えばシリカ粒子及びクレー粒子を含んでいてもよい。他の例において、超粒子は、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種の異なる粒子を含んでいてもよい。
【0100】
一例において、超粒子は高分子電解質または高分子電解質材料を含む。かかる超粒子の例はＷＯ２００６／０３７１６０に開示される。この例において、上記高分子電解質は、正に荷電した高分子電解質である（もしくは正に荷電する能力を有する）か、または負に荷電した高分子電解質である（もしくは負に荷電する能力を有する）か、または正味電荷がゼロである。
【0101】
本開示の超粒子の形状は様々であってもよい。例えば、超粒子は球形であってもよい。例示的な球形としては、球体及び卵形が挙げられる。別の例において、超粒子は非球形の形状である。例示的な非球形としては、ダンベル形、半球、円板、四面体、繊維、球端円柱、及び異形が挙げられる。一例において、超粒子は規則的な構造を有していてもよい。例えば、超粒子は規則的な配列を備えていてもよい。
【0102】
本開示の球形超粒子は、それらの径によってキャラクタライズすることができる。例えば、本開示の超粒子の径は１００μｍを超える。例えば、本開示の超粒子の径は、少なくとも約１５０μｍ、約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍ、約５００μｍ、約５５０μｍ、約６００μｍ、約６５０μｍ、約７００μｍ、約７５０μｍ、約８００μｍ、約８５０μｍ、約９００μｍ、約９５０μｍ、約１０００μｍであってもよい。例えば、超粒子の径は約５５０μｍであってもよい。超粒子のこの径は、それによりカニューレを介した内耳への送達が容易になる一方で、高い薬物担持量が可能になることから有利である。他の例において、超粒子の径は、約１５０μｍ～約１０００μｍ、約２００μｍ～約９００μｍ、約３００μｍ～約８００μｍであってもよい。別の例において、超粒子の径は約４００μｍ～約６００μｍであってもよい。別の例において、超粒子の径は約４５０μｍ～約５５０μｍであってもよい。別の例において、超粒子の径は約５２０μｍ～約５８０μｍであってもよい。別の例において、超粒子の径は約４６０μｍ～約５４０μｍであってもよい。別の例において、超粒子の径は約４７０μｍ～約５３０μｍであってもよい。別の例において、超粒子の径は約４８０μｍ～約５２０μｍであってもよい。別の例において、超粒子の径は約４９０μｍ～約５１０μｍであってもよい。他の例において、超粒子は、該粒子の三次元構造の最も広い点における幅によってキャラクタライズすることができる。例えば、超粒子の幅は上記に例示した径と一致するものであってよい。
【0103】
別の例において、超粒子表面を、ペイロードの担持量を高めるための官能性部分の付加によって修飾してもよい。任意の数の官能性部分を超粒子の表面に付加してもよく、上記官能性部分は担持されるペイロードを褒めるように選択される。一例において、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）などの部分がシリカ超粒子の表面上にグラフトされる。これにより、ペイロード上に存在するカルボキシル基と相互作用することができるアミン官能基が導入される。別の例において、上記超粒子は、ペイロードの担持量を高める、全体としての正味電荷をもつように修飾される（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ． Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ． （２０１２） ２４， ３３６２－３３６６）。例えば、全体としての正味の負電荷をもつペイロードの担持量が高められるように、超粒子の表面を、全体としての正味の正電荷をもつように修飾してもよい。別の例において、全体としての正味の正電荷をもつペイロードの担持量が高められるように、超粒子の表面が、全体としての正味の負電荷をもつように修飾される。
【0104】
本開示の超粒子は架橋された官能性部分を含んでいてもよい。例えば、機能的部分は化学反応によって架橋されていてもよい。一例において、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）分子は、ＰＧＡ分子のシスタミンとの化学反応によって架橋される（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ． Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ． （２０１２） ２４， ３３６２－３３６６）。
【0105】
製剤
超粒子は、対象への投与に適した医薬組成物として製剤化されてもよい。例示的な医薬組成物は超粒子を単独で、または薬学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤との組み合わせで提供してもよい。これらの組成物において、超粒子は、治療有効量のペイロードを対象に送達するのに十分な量で提供される。特定の投与経路に応じて、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｎ．Ｊ． ＵＳＡ， １９９１）に記載されるように、当技術分野で公知の様々な許容される担体を使用することができる。
超粒子は、対象への投与に適した医薬組成物として製剤化されてもよい。例示的な医薬組成物は超粒子を単独で、または薬学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤との組み合わせで提供してもよい。これらの組成物において、超粒子は、治療有効量のペイロードを対象に送達するのに十分な量で提供される。特定の投与経路に応じて、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｎ．Ｊ． ＵＳＡ， １９９１）に記載されるように、当技術分野で公知の様々な許容される担体を使用することができる。
【0106】
例示的な医薬組成物はまた、薬学的に許容される滅菌した水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液、または乳化液、ならびに使用直前に滅菌注射溶液または分散液に再構成するための滅菌粉末から構成されてもよい。好適な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適宜の混合物、植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用の有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散液の場合は必要な粒子径の維持、及び界面活性剤の使用により維持することができる。かかる組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤、または抗菌剤及び抗真菌剤などのアジュバントも含んでいてよい。
【0107】
別の例において、超粒子は徐放システムまたは標的化送達システム中に組み込まれていてもよい。例えば、本発明者らは、本明細書に開示の超粒子にアルギン酸塩ヒドロゲルを加えることにより、当該超粒子からのペイロードの放出が遅延することを確認している。かかる徐放システムとしては、局所投与用のフォーム剤、ゲル剤、滴剤、及び噴霧剤、または注射もしくは注入カニューレ用のデポ剤を挙げることができる。例示的な徐放システムとしては、ポリマーマトリクス、リポソーム、及びミクロスフェアが挙げられる。ポリマーマトリクスとしては、超粒子が多孔性ポリマーコーティングに囲まれているリザーバ型システム（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｔｏｒｆｆ （２０１２） ＪＡＬＡ． １７， ５０－５８）及び超粒子がポリマーマトリクス中に包埋されているモノリシックマトリクスシステム（Ｌａｎｇｅｒ Ｒ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２４９， １５２７－１５３３）が挙げられる。リポソームは生分解性であり、両親媒性の薬物送達システムであってもよく、リン脂質及びコレステロール用いて製剤化されたものであってよい。ミクロスフェアは、生分解性且つ生体適合性ポリマーを用いて製剤化されたものであってよい。別の例において、上記徐放システムは多糖ベースであってもよい。例えば、超粒子製剤はアニオン性多糖を含んでいてもよい。一例において、上記多糖はアルギン酸またはその誘導体であってもよい。例えば、上記超粒子はアルギン酸塩ヒドロゲルを含んでいてもよい。様々なアルギン酸誘導体が当技術分野において公知である。例としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、及びアルギン酸カルシウムが挙げられる。他の例としては、アルギン酸バリウム及びアルギン酸ストロンチウムが挙げられる。一例において、上記アルギン酸はアルギン酸ナトリウムである。したがって、一例において、本開示は、上述の超粒子とアルギン酸ナトリウムとを含む製剤を包含する。上記アルギン酸は様々な供給源から得ることができる（例えばＳｉｇｍａ， ＦＭＣ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）。別の例において、上記多糖はグリコサミノグリカンなどの非分岐多糖である。例えば、上記多糖はヒアルロン酸であってもよい。
【0108】
別の例において、超粒子はペイロードの放出を促進する製剤中で提供される。例えば、超粒子は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（ＰＦ１２７）ベースのヒドロゲルまたはその類似体と共に提供されてもよい。一例において、超粒子はＰＦ１２７ベースのヒドロゲルと共に提供されてもよい。
【0109】
別の例において、超粒子は、鼓膜、卵円窓または正円窓などの対象の耳内の膜を通る拡散を高める製剤中で提供される。例えば、超粒子製剤は人工外リンパを含んでいてもよい。
【0110】
別の例において、超粒子は、対象に対して適合性であり、対象に対して有害ではない生成物に分解するスキャフォールド内に組み込まれるかまたは包埋される。これらのスキャフォールドは対象に移植される超粒子を収納している。
【0111】
本開示の実施において、様々な異なるスキャフォールドを問題なく用いることができる。例示的なスキャフォールドとしては、生物学的な、分解性のスキャフォールドが挙げられるが、これらに限定はされない。天然の生分解スキャフォールドとしては、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンスキャフォールドが挙げられる。好適なスキャフォールドとしては、ポリグリコール酸スキャフォールド、またはポリ無水物、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの合成ポリマーが挙げられる。
【0112】
治療及び投与
本開示は、本明細書において規定される超粒子を投与することを含む、疾患または障害の治療方法を包含する。したがって、一例において、本開示に係る超粒子を含む組成物は、対象の疾患または障害を治療するのに有効な量で上記対象に投与される。一例において、上記疾患または障害は難聴である。本開示の文脈において、用語「難聴」は、音を検出または処理する対象の能力の低下を指すために用いられる。したがって、難聴への言及は、部分的な聴覚低下または完全な聴覚喪失を含む。
本開示は、本明細書において規定される超粒子を投与することを含む、疾患または障害の治療方法を包含する。したがって、一例において、本開示に係る超粒子を含む組成物は、対象の疾患または障害を治療するのに有効な量で上記対象に投与される。一例において、上記疾患または障害は難聴である。本開示の文脈において、用語「難聴」は、音を検出または処理する対象の能力の低下を指すために用いられる。したがって、難聴への言及は、部分的な聴覚低下または完全な聴覚喪失を含む。
【0113】
一例において、難聴は感音性難聴（ＳＮＨＬ）としてキャラクタライズされる。本開示の文脈において、ＳＮＨＬは、蝸牛内の繊細な感覚有毛細胞の損傷、または上記細胞のらせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）とのシナプス結合の喪失、または蝸牛のシュワン細胞の機能不全に起因する難聴を指すために用いられる。一例において、上記難聴は老人性難聴としてキャラクタライズされる。別の例において、上記難聴は騒音誘発性である。別の例において、上記難聴は疾患誘発性または遺伝性である。別の例において、上記難聴は、聴覚毒、例えばアミノグリコシドへの曝露により誘発される。
【0114】
一例において、上記対象は哺乳動物である。一例において、上記対象はヒトである。例えば、上記ヒトの対象は成人であってもよい。一例において、上記ヒトの対象は子供である。他の例示的な哺乳動物の対象としては、犬または猫などの愛玩動物、または馬または牛などの家畜動物が挙げられる。「対象」、「患者」、及び「個体」などの用語は、本開示において、文脈によって同義で用いてもよい用語である。
【0115】
一例において、本開示にかかる超粒子は腹腔内投与される。本開示はまた、耳を介した対象の細胞、組織、または器官へのペイロードの送達方法であって、本開示に係る超粒子を上記対象の耳に投与することを含む上記方法も包含する。この例において、上記方法は、対象の内耳、中耳、及び／または前庭系から細胞へとペイロードを送達してもよい。別の例において、上記方法は、治療用ペイロードを対象の神経細胞、神経組織、または脳に送達する。
【0116】
一例において、組成物は鼓膜上に投与される。この例において、組成物は局所投与用に製剤化されてもよい（例えば、滴剤、ゲル剤、フォーム剤、噴霧剤）。
【0117】
別の例において、組成物は「中耳」腔に投与される。本開示の文脈において、用語「中耳」は、鼓膜と内耳との間の空間を指すために用いられる。したがって、中耳は全ての内耳組織の外にある。例えば、組成物は、鼓膜を通した注射によって中耳に投与することができる。この例において、超粒子はデポ注射として投与されてもよい。別の例において、治療を行う臨床医が鼓膜に開口部を設け、中耳への組成物のアクセスを容易にしてもよい。組成物を中耳に投与する場合、組成物を正円窓及び／または卵円窓上に投与してもよい。
【0118】
別の例において、超粒子は内耳に投与される。例えば、超粒子を蝸牛に投与してもよい。一例において、超粒子を蝸牛の基底回転に投与してもよい。蝸牛または内耳の他の構造にアクセスするための外科的技法は当技術分野で公知である。ヒトの蝸牛に外科的にアクセスするための例示的な技法は、例えば、Ｃｌａｒｋ ＧＭ， ｅｔ ａｌ．， “Ｓｕｒｇｅｒｙ ｆｏｒ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｃｈａｎｎｅｌ ｃｏｃｈｌｅａｒ ｉｍｐｌａｎｔ、Ａｎｎ Ｏｔｏｌ Ｒｈｉｎｏｌ Ｌａｒｙｎｇｏｌ ９３：２０４－７， １９８４及びＣｌａｒｋ ＧＭ， ｅｔ ａｌ．， “Ｓｕｒｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ ｃｏｃｈｌｅａｒ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ”， Ｅａｒ ａｎｄ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｕｐｐｌ． １２：１５Ｓ－２４Ｓ， １９９１に記載される。
【0119】
超粒子と耳の介入の組み合わせは上記に議論されている。これらの例において、耳への介入は超粒子の投与と同時に行ってもよい。例えば、人工内耳を超粒子と同時に移植してもよい。ただし、らせん神経節ニューロンの生存率を高めることによって人工内耳の効用が向上する場合がある。したがって、超粒子が投与された後に人工内耳を移植することが望ましい場合がある。例えば、人工内耳は、超粒子が投与されてから約１ヶ月後、約２ヶ月後、約３ヶ月後、約６ヶ月後に移植してもよい。これらの例において、追加の超粒子を人工内耳と共に投与してもよい。
【0120】
一例において、１回目の超粒子が対象の蝸牛に投与され、少なくとも２回目の超粒子が対象の正円窓及び／または卵円窓に投与される。
【0121】
一例において、治療有効量が上記対象の耳に投与される。一例において、複数の超粒子が上記対象の耳に投与される。例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０の超粒子が上記対象の耳に投与されてもよい。別の例において、約１～１０の超粒子が投与される。他の例において、約２～９、約３～８、約４～７、約５～６の超粒子が上記対象の耳に投与される。これらの例において、超粒子は同一のペイロードを含んでいてもよい。あるいは、別の例において、超粒子に異なるペイロードが担持される。例えば、神経栄養因子が担持された超粒子とステロイドが担持された超粒子とが投与されてもよい。別の例において、神経栄養因子が担持された超粒子と抗生物質が担持された超粒子とが投与されてもよい。別の例において、神経栄養因子が担持された超粒子が抗生物質と共に投与されてもよい。
【0122】
組成物／キット
本開示に係る超粒子は、キットまたはパック中で提供されてもよい。例えば、本明細書に開示の組成物は、内耳障害を治療するための書面による指示と共に、適宜の容器中に包装されていてもよい。一例において、組成物は、点耳器または充填済み注射器などの単回投与容器中で提供されてもよい。
本開示に係る超粒子は、キットまたはパック中で提供されてもよい。例えば、本明細書に開示の組成物は、内耳障害を治療するための書面による指示と共に、適宜の容器中に包装されていてもよい。一例において、組成物は、点耳器または充填済み注射器などの単回投与容器中で提供されてもよい。
【0123】
一例において、上記キットは内耳障害の治療方法における使用のための、本開示に係る超粒子を備える。別の例において、上記キットは難聴の治療方法における使用のための、本開示に係る超粒子を備える。一例において、上記難聴はＳＮＨＬである。別の例において、上記難聴は騒音性難聴である。一例において、本開示に係るキットは補聴器またはインプラントを更に備える。したがって、一例において、上記キットは超粒子と蝸牛インプラントを備えていてもよい。
【0124】
製造
本開示は、高レベルのペイロードを担持可能な超粒子の製造方法を包含する。一例において、上記超粒子は、ナノ粒子とアルギン酸またはその多糖誘導体とを含む組成物から製造することができる。ナノ粒子の様々な例を上記に示している。一例において、上記ナノ粒子は二峰性細孔構造を有する。ナノ粒子は様々な方法を用いて製造することができる。かかる方法の１つがＣｕｉ ｅｔ ａｌ． ２０１５， ＡＣＳ Ｎａｎｏ， ９， １５７１－１５８０に記載される。
本開示は、高レベルのペイロードを担持可能な超粒子の製造方法を包含する。一例において、上記超粒子は、ナノ粒子とアルギン酸またはその多糖誘導体とを含む組成物から製造することができる。ナノ粒子の様々な例を上記に示している。一例において、上記ナノ粒子は二峰性細孔構造を有する。ナノ粒子は様々な方法を用いて製造することができる。かかる方法の１つがＣｕｉ ｅｔ ａｌ． ２０１５， ＡＣＳ Ｎａｎｏ， ９， １５７１－１５８０に記載される。
【0125】
別の例において、本開示にかかる超粒子は、エレクトロスプレーによって製造される。エレクトロスプレーの例は、Ｊａｗｏｒｅｋ Ａ．， ２００７ Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １， １８－３５に総説される。エレクトロスプレーの例も後述される。一例において、本開示は、ナノ粒子とアルギン酸またはその多糖誘導体とを含む組成物をジカチオン水溶液中にエレクトロスプレーすることを含む、超粒子の製造方法を包含する。
【0126】
当業者であれば、エレクトロスプレーに使用される溶液の種類に基づいて、エレクトロスプレーパラメータを最適化できることを理解しよう。例えば、電圧と流速とを最適化して、所望の径の超粒子を与えることができる。一例において、上記流速は約６～１０ｍＬ・ｈ－１である。別の例において、上記流速は約７～９ｍＬ・ｈ－１である。別の例において、上記流速は約８ｍＬ・ｈ－１である。一例において、上記電圧は約１０～２５ＫＶである。別の例において、上記電圧は約１１～２０ＫＶである。別の例において、上記電圧は約１２～１４ＫＶである。別の例において、上記電圧は約１３ＫＶである。
【0127】
一例において、超粒子は、ナノ粒子溶液をエレクトロスプレーすることによって製造される。一例において、溶液中のナノ粒子の濃度は約２０ｍｇ／ｍｌである。一例において、溶液中のナノ粒子の濃度は約３０ｍｇ／ｍｌである。一例において、溶液中のナノ粒子の濃度は約４０ｍｇ／ｍｌである。一例において、溶液中のナノ粒子の濃度は約５０ｍｇ／ｍｌである。一例において、溶液中のナノ粒子の濃度は約６０ｍｇ／ｍｌである。
【0128】
別の例において、超粒子は、アルギン酸またはその誘導体を含むナノ粒子溶液をエレクトロスプレーすることによって製造される。一例において、上記ナノ粒子溶液は５ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。一例において、上記ナノ粒子溶液は１０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。一例において、上記ナノ粒子溶液は２０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。一例において、上記ナノ粒子溶液は３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。別の例において、上記ナノ粒子溶液は５ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。別の例において、上記ナノ粒子溶液は１０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。別の例において、上記ナノ粒子溶液は２０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。
【0129】
一例において、上記ナノ粒子溶液は５ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。一例において、上記ナノ粒子溶液は１０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。一例において、上記ナノ粒子溶液は２０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。一例において、上記ナノ粒子溶液は３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。別の例において、上記ナノ粒子溶液は５ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。別の例において、上記ナノ粒子溶液は１０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。別の例において、上記ナノ粒子溶液は２０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。
【0130】
別の例において、アルギン酸を含むナノ粒子溶液をエレクトロスプレーすることによって超粒子が製造される。
【0131】
アルギン酸誘導体は、規定された温度でゲルを形成する限り特に限定されない。一例において、上記アルギン酸誘導体は多糖誘導体である。アルギン酸誘導体としては、様々なアルギン酸塩形態が挙げられる。例としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、及びアルギン酸カルシウムが挙げられる。他の例としては、アルギン酸バリウム及びアルギン酸ストロンチウムが挙げられる。一例において、上記アルギン酸はアルギン酸ナトリウムである。別の例において、アルギン酸を含むナノ粒子溶液をエレクトロスプレーすることによって超粒子が製造される。
【0132】
超粒子の所望の径及び形状に応じて様々な粘度のアルギン酸塩を用いて、本開示に係る超粒子を製造することができる。例えば、粘度が約２０～３００ｍＰａ・ｓであるアルギン酸塩を用いることができる。別の例において、アルギン酸塩の粘度は約２０～２００ｍＰａ・ｓである。一例において、アルギン酸塩の粘度は２０ｍＰａ・ｓである。別の例において、アルギン酸塩の粘度は１００ｍＰａ・ｓである。別の例において、アルギン酸塩の粘度は２００ｍＰａ・ｓである。
【0133】
一例において、ナノ粒子を含む組成物を水溶液中にエレクトロスプレーすることによって超粒子が製造される。一例において、これはジカチオン水溶液である。例示的なジカチオン成分としては、Ｃａ２＋及びＢａ２＋が挙げられる。例えば、上記水溶液は塩化カルシウムを含んでいてもよい。別の例において、上記水溶液は塩化バリウムを含む。
【0134】
一例において、超粒子は組成物をエレクトロスプレーすることによって製造され、該組成物中のアルギン酸塩の濃度は５ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該組成物中のナノ粒子の濃度は２０ｍｇ・ｍＬ－１～５０ｍｇ・ｍＬ－１であり、電圧は１０ｋＶ～２５ｋＶである。別の例において、超粒子は組成物をエレクトロスプレーすることによって製造され、該組成物中のアルギン酸塩の濃度は１０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該組成物中のナノ粒子の濃度は３０ｍｇ・ｍＬ－１～５０ｍｇ・ｍＬ－１であり、電圧は１１ｋＶ～２１ｋＶである。別の例において、超粒子は組成物をエレクトロスプレーすることによって製造され、該組成物中のアルギン酸塩の濃度は２０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該組成物中のナノ粒子の濃度は３５ｍｇ・ｍＬ－１～４５ｍｇ・ｍＬ－１であり、電圧は１２ｋＶ～１４ｋＶである。これらの例において、上記流速は８ｍＬ・ｈ－１である。
【0135】
別の例において、超粒子は組成物をエレクトロスプレーすることによって製造され、該組成物中のアルギン酸塩の濃度は３０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該組成物中のナノ粒子の濃度は４０ｍｇ・ｍＬ－１であり、電圧は１３ｋＶである。上記流速は８ｍＬ・ｈ－１である。
【0136】
一例において、本明細書において規定される方法を用いて製造された超粒子は焼成に供され、アルギン酸またはその誘導体が除去される。一例において、焼成は約５００℃で行われる。別の例において、焼成は約５５０℃で行われる。別の例において、焼成は約６００℃で行われる。別の例において、焼成は約６５０℃で行われる。別の例において、焼成は約７００℃で行われる。一例において、焼成は約６～約３０時間行われる。別の例において、焼成は約１０時間行われます。別の例において、焼成は約２０時間行われる。別の例において、焼成は約３０時間行われる。
【実施例】
【0137】
実施例１ － ナノ粒子の製造
メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳ－ＮＰ）を、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ． ２０１５， ＡＣＳ Ｎａｎｏ， ９， １５７１－１５８０に記載の方法に基づく方法を用いて製造した。ｌ．ｌｇの臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を撹拌しながら５０ｍｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に完全に溶解した。続いて４．３ｇのポリアクリル酸溶液（ＰＡＡ、Ｍｗ＝２５０ｋＤａ、３５ｗｔ％水溶液）を、２５℃で２０分間激しく撹拌しながら添加し、透明な溶液が得られるまで撹拌を続けた。次いでこの溶液に、激しく撹拌しながら３．５ｍｌの水酸化アンモニウム溶液（２８～３０％）を添加したところ、乳白色の懸濁液が得られた。２０分間撹拌した後、４．４６ｍｌのオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）を添加した。この溶液を更に１５分間撹拌した後、この混合物をテフロン(登録商標)で密封したオートクレーブに移し、９０℃で４８時間静置した。
メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳ－ＮＰ）を、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ． ２０１５， ＡＣＳ Ｎａｎｏ， ９， １５７１－１５８０に記載の方法に基づく方法を用いて製造した。ｌ．ｌｇの臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を撹拌しながら５０ｍｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に完全に溶解した。続いて４．３ｇのポリアクリル酸溶液（ＰＡＡ、Ｍｗ＝２５０ｋＤａ、３５ｗｔ％水溶液）を、２５℃で２０分間激しく撹拌しながら添加し、透明な溶液が得られるまで撹拌を続けた。次いでこの溶液に、激しく撹拌しながら３．５ｍｌの水酸化アンモニウム溶液（２８～３０％）を添加したところ、乳白色の懸濁液が得られた。２０分間撹拌した後、４．４６ｍｌのオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）を添加した。この溶液を更に１５分間撹拌した後、この混合物をテフロン(登録商標)で密封したオートクレーブに移し、９０℃で４８時間静置した。
【0138】
合成されたままのＭＳ－ＮＰをエタノールで１回、水で２回、エタノールで２回洗浄し、最後に９０℃で乾燥した。５５０℃で３０時間焼成することにより上記有機テンプレートを除去した。
【0139】
実施例２ － 出発材料である超粒子の製造プロセス － プロセスＡ
メソポーラスシリカ（ＭＳ）ナノ粒子をＷａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ． ２２， ３８２９－３８３１に従って調製した。ＭＳナノ粒子をＭｉｌｌｉ－Ｑ水中に粒子濃度５ｗｔ％で分散させ、短時間超音波処理して安定なコロイド懸濁液を形成した。次いで、上記ＭＳナノ粒子分散液の０．５～２．０μＬのアリコートを、パラフィンフィルムで事前に被覆した平坦な表面に塗布した。これらの液滴を空気流下で乾燥し、毛管力作用によってＭＳナノ粒子をメソポーラスシリカ超粒子（毛管力ＭＳ－ＳＰ）へと組織化することを推進した。上記毛管力ＭＳ－ＳＰの径は、液滴で塗布したナノ粒子分散液の容積によって制御した。
メソポーラスシリカ（ＭＳ）ナノ粒子をＷａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ． ２２， ３８２９－３８３１に従って調製した。ＭＳナノ粒子をＭｉｌｌｉ－Ｑ水中に粒子濃度５ｗｔ％で分散させ、短時間超音波処理して安定なコロイド懸濁液を形成した。次いで、上記ＭＳナノ粒子分散液の０．５～２．０μＬのアリコートを、パラフィンフィルムで事前に被覆した平坦な表面に塗布した。これらの液滴を空気流下で乾燥し、毛管力作用によってＭＳナノ粒子をメソポーラスシリカ超粒子（毛管力ＭＳ－ＳＰ）へと組織化することを推進した。上記毛管力ＭＳ－ＳＰの径は、液滴で塗布したナノ粒子分散液の容積によって制御した。
【0140】
毛管力の下で、上記ＭＳコロイドは密な構造へと自己組織化して、ＭＳ－ＳＰを形成した。次いで、この毛管力ＭＳ－ＳＰをパラフィンフィルムから取り出し、セラミック容器に移し、９２３Ｋでアニールして、上記毛管力ＭＳ－ＳＰの機械的安定性を高めた。次いで毛管力ＭＳ－ＳＰにペイロードを担持した。粒子当り約１．３３μｇのタンパク質が担持された。上記毛管力ＭＳ－ＳＰは二峰性細孔構造（２～３ｎｍ及び１５～３０ｎｍ）を有することが明らかになり、上記毛管力ＭＳ－ＳＰ内のマクロ孔、密に充填されたナノ粒子間の空間、は１００～２００ｎｍであった。
【0141】
実施例３ － 改変製造プロセス － プロセスＢ
８０ｍｇのＭＳ－ＮＰ粉末を２ｍｌのアルギン酸ナトリウム塩溶液（３０ｍｇ・ｍＬ－１の水溶液）に添加した。このＭＳ－ＮＰがアルギン酸ナトリウム塩溶液中に均一に分布するまで、得られた溶液を１時間超音波処理した。
８０ｍｇのＭＳ－ＮＰ粉末を２ｍｌのアルギン酸ナトリウム塩溶液（３０ｍｇ・ｍＬ－１の水溶液）に添加した。このＭＳ－ＮＰがアルギン酸ナトリウム塩溶液中に均一に分布するまで、得られた溶液を１時間超音波処理した。
【0142】
大きな細孔のＭＳ－ＳＰ（ＬＭＳ－ＳＰ）を形成するために、上記超音波処理した溶液を３ｍＬのプラスチックシリンジに入れ、シリンジポンプに載置し、液体を塩化カルシウム溶液（１ｗｔ％、水溶液として調製）浴中に、約８ｍＬ・ｈ－１の流速を用いてエレクトロスプレーした（エレクトロスプレー装置を図１に示す）。配管の端部と塩化カルシウム溶液の間に電界を印加することによって液滴径を制御した。アルギン酸ビーズＭＳ－ＳＰ（ＬＭＳ－ＳＰａｌｇ）を塩化カルシウム浴から収取し、ペイロードを担持した。これらの粒子（ＬＭＳ－ＳＰ）に関しては、プロセスＡによって製造した粒子と比較して、機械的安定性の向上と共に、薬物担持性能の顕著な向上、すなわち、粒子当り約７．８μｇのタンパク質、が観測された。
【0143】
実施例４ － 改変製造プロセス － プロセスＣ
ＭＳ－ＳＰ（ＬＭＳ－ＳＰａｌｇ）を実施例３に記載の方法を用いて製造した。６５０℃で３０時間焼成することによってアルギン酸ナトリウム塩を除去した。このステップにより、全ての有機成分が除去され、メソポーラスシリカ（ＭＳ－ＳＰ）ならびに微量の塩化カルシウム及び塩化ナトリウムのみが残留した。次いでＭＳ－ＳＰにペイロードを担持した。これらの粒子に関しては、プロセスＡによって製造した粒子と比較して、薬物担持性能の顕著な向上、すなわち、粒子当り約７．８μｇのタンパク質、が観測された。
ＭＳ－ＳＰ（ＬＭＳ－ＳＰａｌｇ）を実施例３に記載の方法を用いて製造した。６５０℃で３０時間焼成することによってアルギン酸ナトリウム塩を除去した。このステップにより、全ての有機成分が除去され、メソポーラスシリカ（ＭＳ－ＳＰ）ならびに微量の塩化カルシウム及び塩化ナトリウムのみが残留した。次いでＭＳ－ＳＰにペイロードを担持した。これらの粒子に関しては、プロセスＡによって製造した粒子と比較して、薬物担持性能の顕著な向上、すなわち、粒子当り約７．８μｇのタンパク質、が観測された。
【0144】
超粒子を、細孔をもたないナノ粒子から（非多孔性ＮＭＳ－ＳＰａｌｇ；ＮＭＳ－ＳＰａｌｇ）及び細孔径＜２ｎｍのナノ粒子から（小さな細孔のＭＳ－ｓＳＰａｌｇ；ｓＭＳ－ＳＰａｌｇ）も製造した。これらの超粒子からアルギン酸塩を除去すると、薬物担持性能が顕著に低下した（表１）。
【0145】
プロセスＢ及びプロセスＣによって製造したＭＳ－ＳＰの最大薬物担持量を表１にまとめる。
【表1】
【0146】
実施例５ － 超粒子の放出特性
リゾチーム
滅菌したＳＰを１００μＬのＦＩＴＣリゾチーム溶液（０．２ｍｇ・ｍＬ-１ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水溶液）と共にインキュベートすることにより、イン・ビトロ放出検討用にＦＩＴＣリゾチーム担持ＳＰを調製した。リゾチームはニューロトロフィンＢＤＮＦを模倣するのに適したモデルタンパク質であり、これは、リゾチームが類似の物理化学的特性を共有すること（リゾチーム：Ｍｗ＝１４．３±０．５ＫＤａ、ＲＨ＝１８．９±０．２５Å、及びｐＩ＝１１；ＢＤＮＦ：Ｍｗ＝１３ＫＤａ、ＲＨ＝２４．０±３．２Å、及びｐＩ＝１０）、ならびにＢＤＮＦは高価である一方でリゾチームは安価で容易に入手できることによる。
リゾチーム
滅菌したＳＰを１００μＬのＦＩＴＣリゾチーム溶液（０．２ｍｇ・ｍＬ-１ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水溶液）と共にインキュベートすることにより、イン・ビトロ放出検討用にＦＩＴＣリゾチーム担持ＳＰを調製した。リゾチームはニューロトロフィンＢＤＮＦを模倣するのに適したモデルタンパク質であり、これは、リゾチームが類似の物理化学的特性を共有すること（リゾチーム：Ｍｗ＝１４．３±０．５ＫＤａ、ＲＨ＝１８．９±０．２５Å、及びｐＩ＝１１；ＢＤＮＦ：Ｍｗ＝１３ＫＤａ、ＲＨ＝２４．０±３．２Å、及びｐＩ＝１０）、ならびにＢＤＮＦは高価である一方でリゾチームは安価で容易に入手できることによる。
【0147】
リゾチーム担持ＭＳ－ＳＰのイン・ビトロ放出プロファイルを図４の分図ａ）及びｂ）ならびに図７の分図ａ）に示す。プロセスＡ及びＣによって製造したＭＳ－ＳＰの放出プロファイルは類似する。但し、プロセスＣによって製造したＭＳ－ＳＰには、大幅により高いレベルの標識リゾチームが担持されている。プロセスＢによって製造したＭＳ－ＳＰでは、プロセスＡ及びＣによって製造したＭＳ－ＳＰと比較してペイロードの放出が大幅に低下している。
【0148】
ゼータ電位
次いで、ＭＳ－ＳＰにフルオレセイン標識リゾチーム（ＦＩＴＣリゾチーム）を担持した。図２に示すように、ｐＨ値が４から１０に上昇すると、ＭＳ－ＳＰは約－７．６ｍＶ～－３３．９ｍＶの範囲の負のゼータ電位を示した。したがって、正に荷電したリゾチーム及びＢＤＮＦは静電的な駆動力を利用してＭＳ－ＳＰに担持することができる。共焦点顕微鏡画像（図３のａ、ｂ）はＭＳ－ＳＰの表面上に担持されたＦＩＴＣリゾチームを示した。但し、ＭＳ－ＳＰの径は非常に大きい（数百マイクロメートルの径）ために、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡はＳＰの内部構造の撮像には適さない。しかし、手術用メスでこのＭＳ－ＳＰを破断したところ内部を撮像することができ、ＭＳ－ＳＰの多孔性内部構造中にもＦＩＴＣリゾチームが観察されることが判った（図３のｃ）。
次いで、ＭＳ－ＳＰにフルオレセイン標識リゾチーム（ＦＩＴＣリゾチーム）を担持した。図２に示すように、ｐＨ値が４から１０に上昇すると、ＭＳ－ＳＰは約－７．６ｍＶ～－３３．９ｍＶの範囲の負のゼータ電位を示した。したがって、正に荷電したリゾチーム及びＢＤＮＦは静電的な駆動力を利用してＭＳ－ＳＰに担持することができる。共焦点顕微鏡画像（図３のａ、ｂ）はＭＳ－ＳＰの表面上に担持されたＦＩＴＣリゾチームを示した。但し、ＭＳ－ＳＰの径は非常に大きい（数百マイクロメートルの径）ために、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡はＳＰの内部構造の撮像には適さない。しかし、手術用メスでこのＭＳ－ＳＰを破断したところ内部を撮像することができ、ＭＳ－ＳＰの多孔性内部構造中にもＦＩＴＣリゾチームが観察されることが判った（図３のｃ）。
【0149】
担持容量の更なる評価
次いで、ＦＩＴＣリゾチームを用い、３日間のインキュベーション時間で、異なる担持時の濃度における、種々の種類のＳＰの担持容量を検討した（図４）。概括的には、ＦＩＴＣリゾチームの濃度が増加すると、薬物担持量が増加した。結果は、アルギン酸塩を含有するＮＭＳ－ＳＰａｌｇ、ＳＭＳ－ＳＰａｌｇ、及びＬＭＳ－ＳＰａｌｇは、アルギン酸塩を除去したＮＭＳ－ＳＰ、ＳＭＳ－ＳＰ、及びＬＭＳ－ＳＰ（同等の担持時の濃度）よりも担持容量が高いことを示す。このことは、中性のｐＨ値付近における、正に荷電したＦＩＴＣリゾチームと負に荷電したアルギン酸塩との間の高い静電的相互作用に起因する可能性がある。更に、低いＦＩＴＣリゾチームの担持時の濃度（＜０．４ｍｇ・ｍＬ－１）においては、ＬＭＳ－ＳＰａｌｇの薬物担持容量は非多孔性ＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＳＭＳ－ＳＰａｌｇと同様であったが、担持時の濃度がより高かった場合（＞０．４ｍｇ・ｍＬ－１）には、ＮＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＳＭＳ－ＳＰａｌｇと比較して、より多くのＦＩＴＣリゾチームをＬＭＳ－ＳＰａｌｇに担持することができた。アルギン酸塩を除去したＭＳ－ＳＰに関しても同様の傾向が観測された。すなわち、ＬＭＳ－ＳＰには、ＮＭＳ－ＳＰ及びＳＭＳ－ＳＰよりも多くのＦＩＴＣリゾチームを担持することができた。これらの結果は、大きな多孔性構造（ＬＭＳ－ＳＰ及びＬＭＳ－ＳＰａｌｇにおける）が薬物担持量を向上させるための重要な因子であり、それはおそらく、更なる表面を与え、延いては、粒子の外表面と粒子内部の領域（ＳＰ構造内の）とが薬物によって完全に飽和された場合に、更なる担持容量を与えることによる可能性が高いことを示している。更に、上記担持容量はＭＳ－ＳＰの径にも依存し、より大きなＭＳ－ＳＰ（１０００μｍ）の担持容量はより小さなＭＳ－ＳＰ（２００μｍ）よりも大きかった（図５）。
次いで、ＦＩＴＣリゾチームを用い、３日間のインキュベーション時間で、異なる担持時の濃度における、種々の種類のＳＰの担持容量を検討した（図４）。概括的には、ＦＩＴＣリゾチームの濃度が増加すると、薬物担持量が増加した。結果は、アルギン酸塩を含有するＮＭＳ－ＳＰａｌｇ、ＳＭＳ－ＳＰａｌｇ、及びＬＭＳ－ＳＰａｌｇは、アルギン酸塩を除去したＮＭＳ－ＳＰ、ＳＭＳ－ＳＰ、及びＬＭＳ－ＳＰ（同等の担持時の濃度）よりも担持容量が高いことを示す。このことは、中性のｐＨ値付近における、正に荷電したＦＩＴＣリゾチームと負に荷電したアルギン酸塩との間の高い静電的相互作用に起因する可能性がある。更に、低いＦＩＴＣリゾチームの担持時の濃度（＜０．４ｍｇ・ｍＬ－１）においては、ＬＭＳ－ＳＰａｌｇの薬物担持容量は非多孔性ＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＳＭＳ－ＳＰａｌｇと同様であったが、担持時の濃度がより高かった場合（＞０．４ｍｇ・ｍＬ－１）には、ＮＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＳＭＳ－ＳＰａｌｇと比較して、より多くのＦＩＴＣリゾチームをＬＭＳ－ＳＰａｌｇに担持することができた。アルギン酸塩を除去したＭＳ－ＳＰに関しても同様の傾向が観測された。すなわち、ＬＭＳ－ＳＰには、ＮＭＳ－ＳＰ及びＳＭＳ－ＳＰよりも多くのＦＩＴＣリゾチームを担持することができた。これらの結果は、大きな多孔性構造（ＬＭＳ－ＳＰ及びＬＭＳ－ＳＰａｌｇにおける）が薬物担持量を向上させるための重要な因子であり、それはおそらく、更なる表面を与え、延いては、粒子の外表面と粒子内部の領域（ＳＰ構造内の）とが薬物によって完全に飽和された場合に、更なる担持容量を与えることによる可能性が高いことを示している。更に、上記担持容量はＭＳ－ＳＰの径にも依存し、より大きなＭＳ－ＳＰ（１０００μｍ）の担持容量はより小さなＭＳ－ＳＰ（２００μｍ）よりも大きかった（図５）。
【0150】
実験的に測定したＦＩＴＣリゾチームのＮＭＳ－ＳＰ及びｓＭＳ－ＳＰａｌｇへの最大担持量は、それぞれＳＰ当り約３μｇ及びＳＰ当り２μｇであり、これらはＳＰ当り約１５μｇのＬＭＳ－ＳＰよりも顕著に低い（ＦＩＴＣリゾチームの担持時の濃度は１．５ｍｇ・ｍＬ－１であり、担持時間は３日間であった）。更に、実験的に測定したＦＩＴＣリゾチームのＮＭＳ－ＳＰ及びｓＭＳ－ＳＰへの最大担持量は、それぞれＳＰ当り約２μｇ及びＳＰ当り１μｇであり、これらもＳＰ当り約１０μｇのＬＭＳ－ＳＰよりも大幅に少ない（ＦＩＴＣリゾチームの担持時の濃度は５．０ｍｇ・ｍＬ－１であり、担持時間は３日間であった）。
【0151】
【0152】
ＢＤＮＦ
ＭＳ－ＳＰを１００μｌのエタノール（８０ ｖｏｌ／ｖｏｌ％）４時間に浸漬して滅菌し、その後１００μｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水で６回すすいだ。次いで、ＭＳ－ＳＰを０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗浄した。ＭＳ－ＳＰを１５μｌのＢＤＮＦ（Ｇｅｎｅｗａｙ， ＢＤＮＦ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ，カタログ番号 １０－６６３－４５０７８）溶液（ＢＤＮＦの１ｍｇ／ｍｌ）が入ったエッペンドルフ・チューブに入れ、時々手で振とうしながら室温で３日間インキュベートすることによって、該ＭＳ－ＳＰに担持した。驚くべきことに、約１０μｇのＢＤＮＦの担持を達成した。
ＭＳ－ＳＰを１００μｌのエタノール（８０ ｖｏｌ／ｖｏｌ％）４時間に浸漬して滅菌し、その後１００μｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水で６回すすいだ。次いで、ＭＳ－ＳＰを０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗浄した。ＭＳ－ＳＰを１５μｌのＢＤＮＦ（Ｇｅｎｅｗａｙ， ＢＤＮＦ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ，カタログ番号 １０－６６３－４５０７８）溶液（ＢＤＮＦの１ｍｇ／ｍｌ）が入ったエッペンドルフ・チューブに入れ、時々手で振とうしながら室温で３日間インキュベートすることによって、該ＭＳ－ＳＰに担持した。驚くべきことに、約１０μｇのＢＤＮＦの担持を達成した。
【0153】
実施例６ － 超粒子の細胞毒性
ＭＳ－ＳＰを生体適合性の薬物担体として適用することができるかを検討するために、ＭＳ－ＳＰのイン・ビトロ細胞毒性の検討を実施した。ヒト脳神経膠芽腫細胞（Ｕ８７ＭＧ細胞株）をＭＳ－ＳＰと共にインキュベートし、細胞生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって評価した。図６に示すように、ＭＳ－ＳＰの数をウェル当り１０まで増加した場合においても（ウェル当り１×１０４細胞）、ＭＳ－ＳＰは非毒性であった。同様の粒子システムの典型的なイン・ビボ治療計画において、内耳当り１～８のＳＰの投与が提案されている。
ＭＳ－ＳＰを生体適合性の薬物担体として適用することができるかを検討するために、ＭＳ－ＳＰのイン・ビトロ細胞毒性の検討を実施した。ヒト脳神経膠芽腫細胞（Ｕ８７ＭＧ細胞株）をＭＳ－ＳＰと共にインキュベートし、細胞生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって評価した。図６に示すように、ＭＳ－ＳＰの数をウェル当り１０まで増加した場合においても（ウェル当り１×１０４細胞）、ＭＳ－ＳＰは非毒性であった。同様の粒子システムの典型的なイン・ビボ治療計画において、内耳当り１～８のＳＰの投与が提案されている。
【0154】
実施例７ － 薬物放出
担持容量の結果に基づいて、１０のＬＭＳ－ＳＰ及び１０のＭＳ－ＳＰａｌｇをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃でインキュベートすることにより、ＦＩＴＣリゾチームの放出の検討（担持時間３日間、担持時の濃度０．２ｍｇ・ｍＬ－１）を実施した。
担持容量の結果に基づいて、１０のＬＭＳ－ＳＰ及び１０のＭＳ－ＳＰａｌｇをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃でインキュベートすることにより、ＦＩＴＣリゾチームの放出の検討（担持時間３日間、担持時の濃度０．２ｍｇ・ｍＬ－１）を実施した。
【0155】
イン・ビトロ放出検討用のＦＩＴＣリゾチーム担持ＳＰの調製を、当該ＳＰを滅菌し、続いて１０のＭＳ－ＳＰまたは１０のＭＳ－ＳＰａｌｇのいずれかを１００μＬの「低濃度」ＦＩＴＣリゾチーム溶液（０．２ｍｇ・ｍＬ－１ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水溶液）と共にインキュベートすることによって行った。３日後に、上清を除去し、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を各チューブに添加し、３７℃でインキュベートした。規定した時間間隔で（１５０日間にわたって）、９０μＬの溶液を採取し、これを新たなＰＢＳで置換した。採取した試料の蛍光をＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダーで測定し、その結果、検量線を用いて上清中のＦＩＴＣリゾチームの濃度を測定することができた。
【0156】
上記低濃度溶液中での担持後のＦＩＴＣリゾチームの担持量は、ＬＭＳ－ＳＰ及びＬＭＳ－ＳＰａｌｇに関して、それぞれＳＰ当り１．８９±０．０２μｇ及び１．９３±０．０１μｇであった。図７のａに示すように、１５０日間以上にわたってＭＳ－ＳＰ当り＞１μｇのＦＩＴＣリゾチームが放出される一方、この期間にわたってＭＳ－ＳＰａｌｇから放出されるＦＩＴＣリゾチームの量はより少ない（ＳＰ当り約０．４μｇ）。後者から放出されるＦＩＴＣリゾチームの量がより少ないことの可能性のある理由はアルギン酸塩の存在であり、アルギン酸塩が、シリカ一次粒子の大きな孔を潜在的に塞ぐ、またはリゾチームと強く相互作用し、リゾチームの放出を妨げるもしく抑制する可能性がある。各時点における測定されたＦＩＴＣリゾチーム放出の個々の値（図７に示す累積の結果を用意するために用いた）を図８に示す。
【0157】
ＳＰに担持するのに用いられる、薬物の担持時の濃度が増加するにつれて、より多くの薬物をＬＭＳ－ＳＰに担持することができた。したがって、より高いインキュベーション濃度（１．０ｍｇ・ｍＬ－１）におけるＦＩＴＣリゾチーム及びＢＤＮＦの両方の薬物放出プロファイルを検討した。この濃度（１．０ｍｇ・ｍＬ－１）におけるＦＩＴＣリゾチーム担持量は、ＳＰ当り６．４９±０．４８μｇであった。ＦＩＴＣリゾチームの放出プロファイルは２段階の放出、すなわち、最初の３日間のバースト放出と１１０日間以上にわたる持続性放出で観測された（図７のｂ）。バースト段階ではＳＰ当り約４．２μｇのＦＩＴＣリゾチームが放出された。３日後に、約２．３μｇのＦＩＴＣリゾチーム（担持量－バースト放出の間に放出された量）がＳＰに担持された状態で残留し、その後、より持続性の放出挙動が観測された。各時点で放出されたＦＩＴＣリゾチームの個々の値は、ＳＰ当り数十～数百ナノグラムであった（図９）。図７のｃに示すように、イン・ビトロＢＤＮＦ放出プロファイルはＦＩＴＣリゾチームの放出プロファイルと類似し、最初の３日間でバースト放出が観測され、それに続いて４０日間にわたる持続性放出が観測された。このＳＰの４０日後の累積放出値は約４．６８μｇの薬物であり、各ＳＰの重量は約０．０５ｍｇであった。したがって、上記観測された累積放出量は約９３．６μｇ・ｍｇ－１であった。この値は、ナノポーラスシリカナノ粒子に関して最近観測された値と比較して、４０００倍の向上である。各時点で放出されたＢＤＮＦの個々の値は、ＳＰ当り数十～数百ナノグラムの範囲であった（図１０）。放出されたＢＤＮＦの量をＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイによっても測定し（図１１）、結果は同様であった。
【0158】
薬物放出挙動を更に調整し、内耳中へ外科的送達を助長する潜在的な方法を検討するために、ＰＦ１２７ヒドロゲル内に組み込んだＭＳ－ＳＰ及びＭＳ－ＳＰａｌｇのイン・ビトロ薬物放出の検討を試験した。ＰＦ１２７ヒドロゲルは、低温（例えば４℃）では粘性液体、体温（３７℃）ではゲルとしての形態をなす。これらの検討において、ＭＳ－ＳＰ及びＭＳ－ＳＰａｌｇ（両方共ＰＦ１２７ヒドロゲル中に存在）から、ほぼ１４日目までにほとんどのＦＩＴＣリゾチームが放出されたことが観測され（図１２）、このことは放出動態が加速されたことを示している。したがって、上記超粒子－ＰＦ１２７系は短期（約１週間）の薬物放出が所望の場合に適する一方、ＰＦ１２７ハイドロゲルを伴わないＳＰは長期（数ヶ月）の薬物放出により適する。
【0159】
上記ＳＰが約５０％担持された場合の経時的なＢＤＮＦ放出動態を確立するためのイン・ビトロ実験も実施した。リゾチームのデータと一致して、ＢＤＮＦ放出は最初の４週間にわたってより直線的であった（例えばバースト放出は見られなかった；図１３）。
【0160】
実施例８ － 超粒子の分解
生物学的環境において分解することが可能である多孔性シリカ粒子（例えばケイ酸へと分解され、ケイ酸は尿を介して排泄することができる）は、多様な生物医学的用途にとって関心の対象である。分解率を調べるために、ＭＳ－ＳＰを１５０日間インキュベートした（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３７℃）（図１４）。上記ＭＳ－ＳＰの径が約５５％減少することが観測され、上記ＭＳ－ＳＰの形状／モルホロジーも大幅に変化した。上記ＭＳ－ＳＰの表面上のシリカ一次粒子は、モルホロジー及び径の両方が変化した。
生物学的環境において分解することが可能である多孔性シリカ粒子（例えばケイ酸へと分解され、ケイ酸は尿を介して排泄することができる）は、多様な生物医学的用途にとって関心の対象である。分解率を調べるために、ＭＳ－ＳＰを１５０日間インキュベートした（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３７℃）（図１４）。上記ＭＳ－ＳＰの径が約５５％減少することが観測され、上記ＭＳ－ＳＰの形状／モルホロジーも大幅に変化した。上記ＭＳ－ＳＰの表面上のシリカ一次粒子は、モルホロジー及び径の両方が変化した。
【0161】
実施例９ － 薬物動態
イン・ビボ検討を実施して、耳に移植した超粒子中で送達したニューロトロフィンの薬物ペイロード及びクリアランスを、移植の４時間後、３日後、及び７日後に測定した。この目的は、経時的に蝸牛中に残存するニューロトロフィンの量を測定することであった。
イン・ビボ検討を実施して、耳に移植した超粒子中で送達したニューロトロフィンの薬物ペイロード及びクリアランスを、移植の４時間後、３日後、及び７日後に測定した。この目的は、経時的に蝸牛中に残存するニューロトロフィンの量を測定することであった。
【0162】
放射標識ニューロトロフィン－３を含有する１のＳＰを各蝸牛中に移植した。４時間後（ｎ＝５）、３日後（ｎ＝７）、または７日後（ｎ＝４）に蝸牛を採取した。全蝸牛のガンマ線カウントを測定して、ニューロトロフィン－３のクリアランスを経時的に測定した。ニューロトロフィン－３の残留量（担持量に対する％）及びμｇで表した合計を図１５に示す。移植の１週間後に、各ＳＰは初期担持量の約２ｕｇのニューロトロフィン－３（約４０％）を含有していた。
【0163】
正円窓への送達後のニューロトロフィン－３のクリアランスを調べるために、更なる実験（ｎ＝２）を実施した。移植の３日後 － ここでも全蝸牛の測定を用いて、正円窓膜からのニューロトロフィン－３のクリアランスを測定した。蝸牛内送達部位と比較して正円窓を使用すると、同様のレベルのクリアランスが観測された（蝸牛内送達の５６％と比較して、正円窓送達後には４７．４％のニューロトロフィン－３が残存）。
【0164】
これらのデータは、ニューロトロフィン－３の長期にわたる放出が、治療の１週間後においても依然利用可能な高レベルのニューロトロフィン－３により達成できることを示している。
【0165】
当業者であれば、概括的に記載された本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態において示された本開示に対して、多数の変更及び／または改変を行うことができることが理解されよう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり且つ限定的ではないと見なされるべきである。
【0166】
本出願は、２０１７年９月２０日出願のＡＵ２０１７９０３８２８、２０１７年９月２０日出願のＡＵ２０１７９０３８２９、及び２０１８年７月１１日出願のＡＵ２０１８９０２５１３の優先権を主張し、上記出願の開示は参照により本明細書に援用される。
【0167】
上述の全て刊行物は、その全体が本明細書に援用される。本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、物品などのいずれの記述も、単に本開示の文脈を示すことを目的とするものである。これらの事項のいずれかもしくは全てが、先行技術基準の一部を形成すること、または本出願の各請求項の優先日以前に存在した、本開示に関連する分野の共通の一般的知識であったことを認めると解釈されるべきものではない。
【0168】
引用文献
Ｃｌａｒｋ ＧＭ， ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ａｎｎ Ｏｔｏｌ Ｒｈｉｎｏｌ Ｌａｒｙｎｇｏｌ ９３：２０４－２０７
Ｃｌａｒｋ ＧＭ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｅａｒ ａｎｄ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｕｐｐｌ． １２：１５Ｓ－２４Ｓ
Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ． （２０１５） ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９：１５７１－１５８０
Ｊａｗｏｒｅｋ （２００７） Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７６（１）， １８－３５
Ｌａｎｇｅｒ Ｒ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２４９， １５２７－１５３３
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｎ．Ｊ． ＵＳＡ， １９９１）
Ｔａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ． ２４： ３３６２－３３６６
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ． １９： ６４５１－６４６４
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ． ２２： ３８２９－３８３１
Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｔｏｒｆｆ （２０１２） ＪＡＬＡ． １７， ５０－５８
Ｃｌａｒｋ ＧＭ， ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ａｎｎ Ｏｔｏｌ Ｒｈｉｎｏｌ Ｌａｒｙｎｇｏｌ ９３：２０４－２０７
Ｃｌａｒｋ ＧＭ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｅａｒ ａｎｄ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｕｐｐｌ． １２：１５Ｓ－２４Ｓ
Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ． （２０１５） ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９：１５７１－１５８０
Ｊａｗｏｒｅｋ （２００７） Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７６（１）， １８－３５
Ｌａｎｇｅｒ Ｒ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２４９， １５２７－１５３３
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｎ．Ｊ． ＵＳＡ， １９９１）
Ｔａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ． ２４： ３３６２－３３６６
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ． １９： ６４５１－６４６４
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ． ２２： ３８２９－３８３１
Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｔｏｒｆｆ （２０１２） ＪＡＬＡ． １７， ５０－５８
【図1】
【図2】
【図3a)】
【図3b)】
【図3c)】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14a)】
【図14b)】
【図14c)】
【図15】
