特許 7405086 ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-18

(45)【発行日】2023-12-26

(54)【発明の名称】ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20231219BHJP

   C07B 43/06 20060101ALI20231219BHJP

   C07H 21/02 20060101ALI20231219BHJP

   C07F 9/24 20060101ALI20231219BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/113 120Z

C07B43/06

C07H21/02

C07F9/24 F

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2020550483

(86)(22)【出願日】2019-10-02

(86)【国際出願番号】 JP2019038860

(87)【国際公開番号】W WO2020071407

(87)【国際公開日】2020-04-09

【審査請求日】2022-09-26

(31)【優先権主張番号】P 2018187767

(32)【優先日】2018-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003159

【氏名又は名称】東レ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】越本 恭平

(72)【発明者】

【氏名】伊関 克彦

(72)【発明者】

【氏名】稲田 英朗

(72)【発明者】

【氏名】藤田 達也

(72)【発明者】

【氏名】沖村 慶一

(72)【発明者】

【氏名】國嶋 崇隆

(72)【発明者】

【氏名】大木 忠明

(72)【発明者】

【氏名】青木 絵里子

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０７３７６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／１３３２２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】LIU, Y., et al.，Tetrahedron，2008年，Vol. 64, Issue 36，pp. 8417-8422

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、
脱水縮合剤の存在下、緩衝液と親水性有機溶媒とを含む混合溶媒中で、下記式（Ｉ）で表される第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と下記式（ＩＩ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とを反応させる工程を含み、
５’－Ｘｃ－Ｌｘ^１ ・・・（Ｉ）
Ｌｘ^２－Ｘ－Ｙ－Ｌｙ－Ｙｃ－３’ ・・・（ＩＩ）
［式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘ、Ｘｃ、Ｙ及びＹｃは、リボヌクレオチド残基からなり、Ｘｃは、Ｘと相補的であり、Ｙｃは、Ｙと相補的であり、Ｌｙは、非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｘ^１は、アミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｘ^２は、カルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｘ－Ｙは、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含み、
Ｌｘ ^１ は、下記式（ＶＩ）：

【化1】

で表され、
Ｌｘ ^２ は、下記式（ＶＩＩ）又は下記式（ＶＩＩ’）：

【化2】

【化3】

で表され、
Ｌｙは、下記式（Ｖ）又は下記式（ＸＸＩＩ）：

【化4】

【化5】

で表される］
前記脱水縮合剤は、トリアジン型脱水縮合剤、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、カルボジイミド型脱水縮合剤、２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤、及びホルムアミジニウム型脱水縮合剤からなる群から選択され、
前記脱水縮合剤がカルボジイミド型脱水縮合剤の場合は、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルと組み合わせて使用し、
前記脱水縮合剤が２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤の場合は、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物と組み合わせて使用し、
前記脱水縮合剤がホルムアミジニウム型脱水縮合剤の場合は、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体と組み合わせて使用する、
ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法。

【請求項2】

（ｉ）前記Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤が、ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤である、
（ｉｉ）前記Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物が、ヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体である、
（ｉｉｉ）前記シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルが、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アルキルエステルである、及び／又は
（ｉｖ）前記Ｎ－炭化水素置換イミダゾール誘導体が、Ｎ－アルキルイミダゾール誘導体である、
請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記親水性有機溶媒が、親水性の非プロトン性有機溶媒である、請求項１又は２に記載の製造方法。

【請求項4】

前記親水性の非プロトン性有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンウレア、又はアセトニトリルである、請求項３に記載の製造方法。

【請求項5】

前記脱水縮合剤が、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩、２－クロロ－１－メチルピリジニウムヨージド、又はクロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートであり、
前記Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物が、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールであり、
前記シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルが、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチルであり、
前記Ｎ－炭化水素置換イミダゾール誘導体が、Ｎ－メチルイミダゾールである、請求項１～４のいずれか一項記載の製造方法。

【請求項6】

前記脱水縮合剤と前記親水性の非プロトン性有機溶媒の組み合わせが、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートとジメチルスルホキシドとの組み合わせ、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートとＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドとの組み合わせ、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩と１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールとジメチルスルホキシドとの組み合わせ、又はクロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートと１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールとジメチルスルホキシドとの組み合わせである、請求項４又５のいずれか一項記載の製造方法。

【請求項7】

前記緩衝液のｐＨは、６．５～７．５である、請求項１～６のいずれか一項記載の製造方法。

【請求項8】

Ｌｙが、下記式（Ｖ）で表される、請求項１～７のいずれか一項記載の製造方法。

【化6】

【請求項9】

Ｌｘ^２が、下記式（ＶＩＩ）で表される、請求項１～８のいずれか一項記載の製造方法。

【化7】

【請求項10】

前記標的遺伝子は、ＴＧＦ－β１遺伝子である、請求項１～９のいずれか一項記載の製造方法。

【請求項11】

前記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号１で表される塩基配列からなる、請求項１～１０のいずれか一項記載の製造方法。

【請求項12】

以下の（ａ）又は（ｂ）である、一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
（ａ）１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｂ）１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
であって、
Ｌｘ ^２ は、下記式（ＶＩＩ）又は下記式（ＶＩＩ’）：

【化8】

【化9】

で表され、
Ｌｙは、下記式（Ｖ）又は下記式（ＸＸＩＩ）：

【化10】

【化11】

で表される、一本鎖オリゴＲＮＡ分子。

【請求項13】

以下の（１）又は（２）である、一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ：
（１）２４番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^１と連結されている配列番号２で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号３で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ、
（２）２２番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^１と連結されている配列番号５で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ、
を含む、標的遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットであって、
Ｌｘ ^１ は、下記式（ＶＩ）：

【化12】

で表され、
Ｌｘ ^２ は、下記式（ＶＩＩ）又は下記式（ＶＩＩ’）：

【化13】

【化14】

で表され、
Ｌｙは、下記式（Ｖ）又は下記式（ＸＸＩＩ）：

【化15】

【化16】

で表される、キット。

【請求項14】

下記のｉ）一般式（Ｘ）、又はｉｉ）一般式（Ｘ’）で示される、アミダイト。
ｉ）一般式（Ｘ）：

【化17】

［式中、ｐは、１であり、Ｒ^２は、置換されていない炭素数５のアルキレン鎖であり、Ｒ^３は、カルボン酸保護基であり、Ｒ^４は、電子吸引基で置換されたアルキル基であり、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、アルキル基であり、同一でも異なっていてもよい。］
ｉｉ）一般式（Ｘ’）：

【化18】

［式中、Ｒ^２は、置換されていない炭素数５のアルキレン鎖であり、Ｒ^３は、カルボン酸保護基であり、Ｒ^４は、電子吸引基で置換されたアルキル基であり、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、アルキル基であり、同一でも異なっていてもよい。］

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子発現抑制には、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と呼ばれる短い二本鎖のＲＮＡ分子を用いる方法が多く利用されている。また、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成した環状ＲＮＡ分子を用いた遺伝子発現を抑制する技術も報告されている（特許文献１）。

【0003】

しかし、ｓｉＲＮＡは生体内での安定性が低く、一本鎖ＲＮＡに解離しやすいため、遺伝子発現を安定的に抑制するのが困難である。特許文献２には、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を、アミノ酸誘導体を用いて形成される１つ又は２つのリンカーを用いて一本鎖に連結したヘアピン型一本鎖長鎖ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡを安定化できることが報告されている。この一本鎖長鎖ＲＮＡ分子の製造方法としては、ホスホロアミダイト法による固相合成法が特許文献２に記載されている。

【0004】

長鎖ＤＮＡ分子の製造方法としては、比較的短鎖の２つのオリゴＤＮＡ分子のペア、すなわち、末端にカルボキシル基を有する第１のオリゴＤＮＡ分子と、末端にアミノ基を有する第２のオリゴＤＮＡ分子との２つに分割して合成し、それらをトリアジン型脱水縮合剤を含む緩衝液中、アミド化により連結することで製造する技術が非特許文献２に報告されているが、ＲＮＡ分子に関する記載はない。

【0005】

一方、水系溶媒でのアミド化反応は、例えば非特許文献３に報告されているが、ＲＮＡ分子に関する記載はない。

【0006】

固相合成時に、５’末端にカルボン酸を含有するオリゴマーのカルボン酸とラベル体（例えば、シアニン、アミノ酸、ぺプチドといったアミノ基含有物質）とアミド結合を形成する際に用いるペプチドカップリング剤としてＨＡＴＵが例示されている（非特許文献４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】米国特許出願公開第２００４／０５８８８６号

【文献】国際公開ＷＯ２０１２／０１７９１９

【非特許文献】

【0008】

【文献】Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、第３９１巻、ｐ．８０６－８１１

【文献】Ｌｉｕら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２００８年、第６４巻、ｐ．８４１７－８４２２．

【文献】Ｂａｄｌａｎｄら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１７年、第５８巻、ｐ．４３９１－４３９４．

【文献】Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＯＦ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｇｕｉｄｅ ２０１５／１６、Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．、２０１７年、第５８巻、ｐ．４９－５１．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の効率的な製造方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の従来の製造方法は、ホスホロアミダイト法によりヌクレオシドを１ユニットずつ伸長するものであり、効率のよい方法とは言えない。

【0011】

そこで本発明者らは、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の効率的な製造方法の開発を目的に、非特許文献２の合成技術をヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の合成に適用したが、ＲＮＡ分子中には、アミド化反応において副反応の原因となる水酸基が多数存在するため、不純物が多く生成し、目的物を高い収率で得られないことが示された。

【0012】

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、緩衝液とジメチルスルホキシド等の親水性有機溶媒と含む混合溶媒中で、所定のタイプの脱水縮合剤を用いて２つの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の末端をアミド化反応させることによって、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を高い収率で効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0013】

ジメチルスルホキシド等の有機溶媒は、核酸の変性剤として使用されることが文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９０年、第３９１巻、ｐ．４９５３．、基礎分子生物学 第４版 田村ら著、２０１６年、東京化学同人等）に記載されており、そのような有機溶媒は核酸のアニーリングを不安定化することが知られている。このことを考えると、本発明者らが見出した上記知見は驚くべきものであった。

【0014】

すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、
脱水縮合剤の存在下、緩衝液と親水性有機溶媒とを含む混合溶媒中で、下記式（Ｉ）で表される第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と下記式（ＩＩ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とを反応させる工程を含み、
５’－Ｘｃ－Ｌｘ^１ ・・・（Ｉ）
Ｌｘ^２－Ｘ－Ｙ－Ｌｙ－Ｙｃ－３’ ・・・（ＩＩ）
［式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘ、Ｘｃ、Ｙ及びＹｃは、リボヌクレオチド残基からなり、Ｘｃは、Ｘと相補的であり、Ｙｃは、Ｙと相補的であり、Ｌｙは、非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｘ^１は、アミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｘ^２は、カルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｘ－Ｙは、上記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む］
上記脱水縮合剤は、トリアジン型脱水縮合剤、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、カルボジイミド型脱水縮合剤、２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤、及びホルムアミジニウム型脱水縮合剤からなる群から選択され、
上記脱水縮合剤がカルボジイミド型脱水縮合剤の場合は、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルと組み合わせて使用し、
上記脱水縮合剤が２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤の場合は、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物と組み合わせて使用し、
上記脱水縮合剤がホルムアミジニウム型脱水縮合剤の場合は、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体と組み合わせて使用する、
ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法。

【0015】

［２］上記リンカーＬｙが、アミノ酸骨格又はアミノアルコール骨格を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、上記リンカーＬｘ^２が、アミノ酸骨格を有する非ヌクレオチド性リンカーである［１］に記載の製造方法。

【0016】

［３］上記Ｌｙが、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は－ＮＨＣＨ_２ＣＯＯ－を含む非ヌクレオチド性リンカーであり、上記Ｌｘ^２が、カルボキシル基を有するピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は－ＮＨＣＨ_２ＣＯＯＨを含む非ヌクレオチド性リンカーである［１］又は［２］に記載の製造方法。

【0017】

［４］Ｌｘ^１が、下記式（ＩＩＩ）で表され、Ｌｘ^２が、下記式（ＩＶ）又は下記式（ＩＶ’）で表される、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。

【化1】

［式（ＩＩＩ）中、Ｒ^１は、置換されていてもよいアルキレン鎖であり、－ＯＲ^１は、Ｘｃの３’末端にホスホジエステル結合を介して結合している］

【化2】

［式（ＩＶ）中、Ｒ^２は、置換されていてもよいアルキレン鎖であり、ｐは、１又は２であり、－ＯＲ^２は、Ｘの５’末端にホスホジエステル結合を介して結合しており、式（ＩＶ’）中、Ｒ^２は、置換されていてもよいアルキレン鎖であり、－ＯＲ^２は、Ｘの５’末端にホスホジエステル結合を介して結合している］

【0018】

［５］（ｉ）上記Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤が、ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤である、
（ｉｉ）上記Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物が、ヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体である、
（ｉｉｉ）上記シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルが、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アルキルエステルである、及び／又は
（ｉｖ）上記Ｎ－炭化水素置換イミダゾール誘導体が、Ｎ－アルキルイミダゾール誘導体である、
［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。

【0019】

［６］上記親水性有機溶媒が、親水性の非プロトン性有機溶媒である、［１］～［５］に記載の製造方法。

【0020】

［７］上記親水性の非プロトン性有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンウレア、又はアセトニトリルである、［６］に記載の製造方法。

【0021】

［８］上記脱水縮合剤が、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩、２－クロロ－１－メチルピリジニウムヨージド、又はクロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートであり、
上記Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物が、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールであり、
上記シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルが、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチルであり、
上記Ｎ－炭化水素置換イミダゾール誘導体が、Ｎ－メチルイミダゾールである、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。

【0022】

［９］上記脱水縮合剤と上記親水性の非プロトン性有機溶媒の組み合わせが、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートとジメチルスルホキシドとの組み合わせ、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートとＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドとの組み合わせ、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩と１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールとジメチルスルホキシドとの組み合わせ、又はクロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートと１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールとジメチルスルホキシドとの組み合わせである、［７］又は［８］のいずれかに記載の製造方法。

【0023】

［１０］上記緩衝液のｐＨは、６．５～７．５である、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。

【0024】

［１１］Ｌｙが、ピロリジン骨格又はピぺリジン骨格を含む非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｘ^１が、アミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｘ^２が、カルボキシル基を有するピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカーである、［１］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。

【0025】

［１２］Ｌｙが、下記式（Ｖ）で表される、［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。

【化3】

【0026】

［１３］Ｌｘ^１が、下記式（ＶＩ）で表され、Ｌｘ^２が、下記式（ＶＩＩ）で表される、［１］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。

【化4】

【化5】

【0027】

［１４］上記標的遺伝子は、ＴＧＦ－β１遺伝子である、［１］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。

【0028】

［１５］上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号１で表される塩基配列からなる、［１］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。

【0029】

［１６］以下の（ａ）又は（ｂ）である、一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
（ａ）１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｂ）１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子

【0030】

［１７］以下の（１）又は（２）である、一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、標的遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキット。
（１）２４番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^１と連結されている配列番号２で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号３で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ
（２）２２番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^１と連結されている配列番号５で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ

【0031】

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８－１８７７６７号の開示内容を包含する。

【発明の効果】

【0032】

本発明によれば、標的遺伝子に対する発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、効率的に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１は、本発明の製造方法の概略図である。図中のＸ、Ｘｃ、Ｙ、Ｙｃ配列を表す線の上の垂直線（実線）は、配列が相補的であることを模式的に表しているが、個々のリボヌクレオチド残基やそれが対応する残基との相補性を限定的に表しているわけではない。図中の配列Ｘと配列Ｙの境界を、垂直線（点線）で模式的に表している。

【図2】図２は、ｓｓＴｂＲＮＡ分子（配列番号１）の模式図である。Ｌｘ^１はアミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーを表し、Ｌｙは非ヌクレオチド性リンカーを表し、Ｌｘ^２はカルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーを表す。配列番号１の２９位（Ｕ）～４７位（Ｃ）は活性配列（ＴＧＦ－β１遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列）に相当する。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0035】

本発明は、遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に関する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子発現抑制配列を含む二本鎖ＲＮＡのセンス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端が、非ヌクレオチド性リンカーを含む配列を介して連結され、そのアンチセンス鎖の３’末端にさらなる非ヌクレオチド性リンカーを含む配列を介してリボヌクレオチドがさらに連結された一本鎖構造を有する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の５’末端と３’末端は、結合されていない。本明細書において「ヘアピン型」とは、一本鎖ＲＮＡ分子が分子内アニーリング（自己アニーリング）により１つ以上の二重鎖構造を形成することを意味する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、その５’末端を含む５’側領域と３’末端を含む３’側領域がそれぞれ別個に分子内アニーリングすることにより、少なくとも２つの二重鎖構造を形成する。本明細書において「ＲＮＡ」、「ＲＮＡ分子」、「核酸分子」及び「核酸」は、ヌクレオチドのみから構成されていてもよいが、ヌクレオチドと非ヌクレオチド物質（例えば、プロリン誘導体、グリシン誘導体などのアミノ酸誘導体）から構成されていてもよい。

【0036】

本発明では、遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、（ｉ）アミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカー（Ｌｘ^１）を３’側に有する第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、（ｉｉ）カルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカー（Ｌｘ^２）を５’側に有し、非ヌクレオチド性リンカー（Ｌｙ）を３’側に含む第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との２つのフラグメントに分割して合成し、それらをアミド化反応で連結することにより、製造することができる。ここでカルボキシル基はカルボン酸基とも称される。本発明の方法の概略図を図１に示す。図１中、Ｌｘ^１はアミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｘ^２はカルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｙは、非ヌクレオチド性リンカーである。本発明の方法では、比較的長鎖のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、より短鎖の一本鎖ＲＮＡ分子のペアを連結することによって製造し、それにより高い生産効率を実現することができる。

【0037】

より具体的には、本発明に係る、遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法は、脱水縮合剤の存在下、下記式（Ｉ）で表される第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と下記式（ＩＩ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とを反応させる工程を含む。

【0038】

５’－Ｘｃ－Ｌｘ^１ ・・・（Ｉ）
Ｌｘ^２－Ｘ－Ｙ－Ｌｙ－Ｙｃ－３’ ・・・（ＩＩ）

【0039】

なお後述のとおり、上記方法で脱水縮合剤としてカルボジイミド型脱水縮合剤を使用する場合には、カルボジイミド型脱水縮合剤はＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルと組み合わせて使用される。脱水縮合剤として２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤を使用する場合には、２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤はＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物と組み合わせて使用される。脱水縮合剤としてホルムアミジニウム型脱水縮合剤を使用する場合には、ホルムアミジニウム型脱水縮合剤はＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体と組み合わせて使用される。

【0040】

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との反応は、アミド化反応である。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（具体的には、この分子の末端のＬｘ^１にあるアミノ基）と、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（具体的には、この分子の末端のＬｘ^２にあるカルボキシル基）のアミド化反応（脱水縮合反応）により、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の間にアミド結合を形成させることができる。本発明の製造方法におけるこのアミド化反応は、反応溶媒中、特に、緩衝液と親水性有機溶媒とを含む混合溶媒中で実施することができる。

【0041】

本発明において「オリゴＲＮＡ」及び「オリゴＲＮＡ分子」とは、４９塩基長以下（非ヌクレオチド性リンカーの残基数は不算入）の塩基配列を有するＲＮＡ分子を指す。本発明において用語「オリゴＲＮＡ」と「オリゴＲＮＡ分子」は通常、互換的に使用される。本発明に係る一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、一本鎖オリゴＲＮＡ、オリゴ核酸、一本鎖核酸分子、オリゴＲＮＡ、又はオリゴＲＮＡ分子と称されることもある。

【0042】

式（Ｉ）は、配列ＸｃとリンカーＬｘ^１が、５’末端側から、Ｘｃ－Ｌｘ^１の順番で連結された構造を表している。式（ＩＩ）は、配列Ｘ、Ｙ及びＹｃ並びにリンカーＬｘ^２及びＬｙが、５’末端側から、Ｌｘ^２－Ｘ－Ｙ－Ｌｙ－Ｙｃの順番で連結された構造を表している。

【0043】

式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘ、Ｘｃ、Ｙ及びＹｃは、リボヌクレオチド残基（１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基）からなる。リボヌクレオチド残基は、アデニン、ウラシル、グアニン又はシトシンから選択されるいずれかの核酸塩基を有するものであってよい。リボヌクレオチド残基はまた、修飾リボヌクレオチド残基であってもよく、例えば、修飾された核酸塩基（修飾塩基）を有していてもよい。修飾としては、蛍光色素標識、メチル化、ハロゲン化、シュードウリジン化、アミノ化、脱アミノ化、チオ化、ジヒドロ化などが挙げられるが、これらに限定されない。Ｘ、Ｘｃ、Ｙ及びＹｃは、それぞれ独立に、非修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよいし、非修飾リボヌクレオチド残基に加えて修飾リボヌクレオチド残基を含むものであってもよいし、修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよい。

【0044】

本発明において、Ｘｃは、Ｘと相補的である。Ｘｃは、好ましくは、Ｘの全領域又はその部分領域に対して完全に相補的な配列（相補配列）からなる。ＸｃがＸの全領域に対して完全に相補的である場合、Ｘｃは、Ｘの５’末端から３’末端の全領域の相補配列からなり、ＸｃとＸの塩基数は同一である。また、ＸｃがＸの部分領域に対して完全に相補的である場合、Ｘｃは、Ｘの部分領域の相補配列からなり、ＸｃはＸよりも１塩基以上、例えば１～４塩基又は１～２塩基少ない塩基数を有する。この部分領域は、Ｘ中のＬｘ²側の末端塩基から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。

【0045】

Ｘは、例えば、１９～３９塩基長であってよく、好ましくは１９～３０塩基長、より好ましくは１９～２５塩基長である。

【0046】

Ｘｃは、例えば、１９～３９塩基長であってよく、好ましくは１９～３０塩基長、より好ましくは１９～２５塩基長である。

【0047】

本発明において、ＹｃとＹは同一の塩基長を有する。本発明において、Ｙｃは、Ｙと相補的である。Ｙｃは、好ましくは、Ｙの全領域に対して完全に相補的な配列（相補配列）からなる。ＹｃがＹの全領域に対して完全に相補的である場合、Ｙｃは、Ｙの５’末端から３’末端の全領域の相補配列からなり、ＹｃとＹの塩基数は同一である。

【0048】

Ｙは、例えば、１～５塩基長であってよく、好ましくは１～３塩基長、より好ましくは１又は２塩基長である。

【0049】

Ｙｃは、例えば、１～５塩基長であってよく、好ましくは１～３塩基長、より好ましくは１又は２塩基長である。

【0050】

ＸとＹの塩基数（塩基長）の合計［（Ｘ＋Ｙ）］と、ＸｃとＹｃの塩基数（塩基長）の合計［（Ｘｃ＋Ｙｃ）］との差［（Ｘ＋Ｙ）－（Ｘｃ＋Ｙｃ）］は、特に限定されないが、例えば、０～４塩基（塩基長）であり、好ましくは０、１、又は２塩基（塩基長）である。

【0051】

式（ＩＩ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、Ｘ、Ｙ及びＹｃの合計塩基数は、例えば、２１～４９塩基であり、好ましくは２１～３０塩基、より好ましくは２５～３０塩基である。

【0052】

上記式（Ｉ）中のリンカーＬｘ^１は、アミノ基、好ましくは１級アミノ基又は２級アミノ基を有する、非ヌクレオチド性リンカーである。上記アミノ基はリンカーＬｘ^１の末端に存在してもよいし、内部に存在してもよいが、末端に存在することが好ましい。
リンカーＬｘ^１は、例えば、下記式（ＩＩＩ）で表される。

【0053】

【化6】

【0054】

式（ＩＩＩ）中、Ｒ^１は、炭素数ｍのアルキレン鎖である。ここで、アルキレン鎖Ｒ^１の炭素原子上の任意の水素原子は、任意の置換基で置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。ｍは、特に制限されず、リンカーＬｘ^１の所望の長さに応じて適宜設定できるが、例えば、製造コスト及び収率等の点からは、ｍは１～３０の整数が好ましく、より好ましくは１～２０の整数であり、さらに好ましくは１～１０の整数である。式（ＩＩＩ）中の－ＯＲ^１は、Ｘｃの３’末端にホスホジエステル結合を介して結合している。すなわち、リンカーＬｘ^１中の－ＯＲ^１は、Ｘｃの３’末端の糖（リボース）の３’位にホスホジエステル結合を介して結合している。

【0055】

リンカーＬｘ^１は直鎖構造を有することが好ましい。好ましい実施形態では、リンカーＬｘ^１は、下記式（ＶＩ）で表されるものであってよい。

【0056】

【化7】

【0057】

上記式（ＩＩ）中のリンカーＬｘ^２は、カルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーである。

【0058】

上記リンカーＬｘ^２は、カルボキシル基を有し、アミド化反応を阻害しない限り任意の構造であってよい。上記カルボキシル基はリンカーＬｘ^２の末端に存在してもよいし、内部に存在してもよいが、末端に存在することが好ましい。

【0059】

前記リンカーＬｘ^２としては、例えば、アミノ酸骨格を有する非ヌクレオチド性リンカーが挙げられる。そのようなリンカーＬｘ^２は、アミノ酸から誘導され、かつ末端にカルボキシル基を有する構造を含むリンカーであってよい。

【0060】

本明細書において「アミノ酸骨格」とは、分子中にアミノ基及びカルボキシル基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物又はその構造をいう。ここでアミノ基とは、アンモニア、一級アミン、又は二級アミンから１つ以上の水素原子を除去した官能基をいう。アミノ酸骨格を構成するアミノ基及び／又はカルボキシル基は、アミド結合、エステル結合等の任意の化学結合を形成していてもよい。アミノ酸骨格が由来するアミノ酸は、例えば、天然アミノ酸でもよいし、人工アミノ酸であってもよい。なお、天然アミノ酸は、天然に存在する構造のアミノ酸又はその光学異性体をいう。また、人工アミノ酸は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基及びカルボキシル基をそれぞれ1つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。人工アミノ酸は、例えば、ヘテロ環を含まないことが好ましい。アミノ酸は、例えば、グリシン、α－アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４－ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β－アラニン、１－アミノ－２－カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸、ニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペコリン酸、３－ピロリジンカルボン酸、γ－アミノ酪酸、若しくはサルコシンであってもよく、さらに置換基又は保護基を有していても有していなくてもよい。置換基としては、以下に限定されないが、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等が挙げられる。保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であってよく、公知の保護基等が挙げられる。保護基については、例えば、文献（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第４版、Ｇｒｅｅｎｅら著、２００７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の記載を援用できる。保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、ビス（２－アセトキシエチルオキシ）メチル基、トリイソプロピルシリルオキシメチル基、１－（２－シアノエトキシ）エチル基、２－シアノエトキシメチル基、２－シアノエチル基、トリルスルフォニルエトキシメチル基、トリチル基及びジメトキシトリチル基等が挙げられる。また、アミノ酸は、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でもよい。これらは単一の異性体であってもよく、混合物であってもよい。

【0061】

上記リンカーＬｘ^２の好ましい例としては、カルボキシル基を有するピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は－ＮＨＣＨ_２ＣＯＯＨを含む非ヌクレオチド性リンカーが挙げられる。一実施形態では、上記リンカーＬｘ^２は、例えば、下記式（ＩＶ）又は下記式（ＩＶ’）で表され、より好ましくは下記式（ＩＶ）で表される。

【0062】

【化8】

【0063】

式（ＩＶ）及び式（ＩＶ’）中、Ｒ^２は、炭素数ｎのアルキレン鎖である。ここで、アルキレン鎖Ｒ^２の炭素原子上の任意の水素原子は、任意の置換基で置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。ｎは、特に制限されず、リンカーＬｘ^２の所望の長さに応じて適宜設定できるが、例えば、製造コスト及び収率等の点からは、ｎは１～３０の整数が好ましく、より好ましくは１～２０の整数であり、さらに好ましくは１～１０の整数である。

【0064】

式（ＩＶ）中、ｐは、１又は２であり、好ましくは１である。

【0065】

式（ＩＶ）及び式（ＩＶ’）中の－ＯＲ^２は、Ｘの５’末端にホスホジエステル結合を介して結合している。すなわち、リンカーＬｘ^２中の－ＯＲ^２は、Ｘの５’末端の糖（リボース）の５’位にホスホジエステル結合を介して結合している。

【0066】

ここで、Ｒ^１のｍとＲ^２のｎの合計は、例えば、２～３１の整数であり、好ましくは２～２１の整数であり、より好ましくは２～１５の整数である。

【0067】

式（ＩＶ）では、リンカーＬｘ^２はピロリジン骨格又はピペリジン骨格のような環状構造を有している。

【0068】

好ましい実施形態では、リンカーＬｘ^２は、下記式（ＶＩＩ）で表されるものであってよい。

【0069】

【化9】

【0070】

式（ＶＩＩ）で表されるリンカーは、下記式（ＶＩＩ－１）又は下記式（ＶＩＩ－２）で表される光学活性体であってよい。

【0071】

【化10】

【0072】

【化11】

【0073】

別の実施形態では、リンカーＬｘ^２は、下記式（ＶＩＩ’）で表されるものであってよい。

【0074】

【化12】

【0075】

式（ＩＩ）中のリンカーＬｙは、非ヌクレオチド性リンカーである。上記リンカーＬｙは、アミド化反応を阻害しない限り任意の構造であってよい。リンカーＬｙとしては、アミノ酸骨格又はアミノアルコール骨格を有する非ヌクレオチド性リンカーが挙げられる。そのようなリンカーＬｙは、アミノ酸から誘導される構造を含むリンカーであってよい。この「アミノ酸骨格」は前述したとおりである。但しリンカーＬｙのアミノ酸骨格を構成するアミノ基及び／又はカルボキシル基は、アミド結合、エステル結合等の任意の化学結合を形成していてもよい。

【0076】

ここで「アミノアルコール骨格」は、分子中にアミノ基及びヒドロキシル基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物又はその構造をいう。「アミノ基」は前述したとおりである。リンカーＬｙのアミノアルコール骨格を構成するアミノ基及び／又はヒドロキシル基は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合等の任意の化学結合を形成していてもよい。アミノアルコールは、例えば、上記アミノ酸のカルボキシル基を変換して得られるアミノアルコールが挙げられる。アミノアルコールは、例えば、アミノエタノール、アミノプロパノール、バリノール、プロリノール、若しくはピペリジンメタノールであってもよく、さらに置換基又は保護基を有していても有していなくてもよい。置換基としては、以下に限定されないが、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等が挙げられる。保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であってよく、公知の保護基等が挙げられる。保護基については、例えば、文献（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第４版、Ｇｒｅｅｎｅら著、２００７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の記載を援用できる。保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、ビス（２－アセトキシエチルオキシ）メチル基、トリイソプロピルシリルオキシメチル基、１－（２－シアノエトキシ）エチル基、２－シアノエトキシメチル基、２－シアノエチル基、トリルスルフォニルエトキシメチル基、トリチル基及びジメトキシトリチル基等が挙げられる。また、アミノアルコールは、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でもよい。これらは単一の異性体であってもよく、混合物であってもよい。

【0077】

リンカーＬｙは、好ましくはピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は－ＮＨＣＨ_２ＣＯＯ－を含む非ヌクレオチド性リンカーである。リンカーＬｙは、２以上の位置で置換可能な環状構造を有することがより好ましい。リンカーＬｙは、ｎ員環（例えばｎ＝５又は６）を１つ又は２つ以上有していてもよく、２つ以上の環を有する場合、それらは縮合環、スピロ環又はビシクロ環等を形成していてもよい。リンカーＬｙは、１つ又は２つ以上の置換基を有していてもよい。リンカーＬｙは、そのいずれか２つの基（例えば、ｎ員環を構成する２つの原子上の置換基）を介して、上記のＹとＹｃを連結する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、このようなリンカーでセンス鎖とアンチセンス鎖が連結されていることにより、ヌクレアーゼ耐性に優れる。

【0078】

一実施形態では、リンカーＬｙは、ピロリジン骨格及びピぺリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカーであり、好ましくは、ピロリジン骨格又はピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド性リンカーである。上記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素原子が、１個以上置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、２位の炭素原子（Ｃ－２）以外の炭素原子が置換されていることが好ましい。上記炭素原子は、例えば、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよい。上記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。上記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素原子及び窒素原子には、例えば、水素原子が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。リンカーＬｙは、例えば、上記ピロリジン骨格のいずれかの基を介して、ＹとＹｃを連結してもよい。それらは、上記５員環を構成するいずれか１個の炭素原子と窒素原子、好ましくは、上記５員環の２位の炭素原子（Ｃ－２）と窒素原子を介して連結されうる。上記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等が挙げられる。

【0079】

一実施形態では、本発明において、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｌｙは、ピロリジン骨格又はピぺリジン骨格を含む非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｘ^１は、アミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Ｌｘ^２は、カルボキシル基を有するピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカーである。

【0080】

上記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素原子が、１個以上置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、２位の炭素原子（Ｃ－２）以外の炭素原子が置換されていることが好ましい。上記炭素原子は、例えば、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよい。上記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。上記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素原子及び窒素原子は、例えば、水素原子が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。リンカーＬｙは、例えば、上記ピペリジン骨格のいずれかの基を介して、ＹとＹｃを連結してもよい。それらは、上記６員環を構成するいずれか１個の炭素原子と窒素原子、好ましくは、上記６員環の２位の炭素原子（Ｃ－２）と窒素原子を介して連結されうる。
上記リンカーＬｙは、例えば、下記式（ＶＩＩＩ）で表される。

【0081】

【化13】

【0082】

式（ＶＩＩＩ）中、Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ独立して、Ｈ_２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ_２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり、
Ｚは、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５又はＣ－６に結合する水素原子又は置換基であり、
Ｌ^１は、炭素数ｒのアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ又はＳＲ^ａで置換されても、置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ^１は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ^１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、Ｏに結合するＬ^１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず、
Ｌ^２は、炭素数ｓのアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ又はＳＲ^ａで置換されても、置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ^２は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ^２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、Ｏに結合するＬ^２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず、
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
ｑは、１又は２であり、
ｒは、０～３０の範囲の整数であり、
ｓは、０～３０の範囲の整数であり、
環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子で置換されてもよく、環Ａ内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。

【0083】

ＹとＹｃは、式（ＶＩＩＩ）中の－ＯＬ^１又は－ＯＬ^２を介して、リンカーＬｙと連結する。一実施形態では、Ｙが－ＯＬ^１を介して、Ｙｃが－ＯＬ^２を介して、リンカーＬｙと連結してもよい。別の実施形態では、Ｙが－ＯＬ^２を介して、Ｙｃが－ＯＬ^１を介して、リンカーＬｙと連結してもよい。

【0084】

式（ＶＩＩＩ）中、Ｘ^１及びＸ^２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ_２、Ｏ、Ｓ又はＮＨである。式（ＶＩＩＩ）において、Ｘ^１がＨ_２であるとは、Ｘ^１が、Ｘ^１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ_２を形成することを意味する。Ｘ^２についても同様である。

【0085】

式（ＶＩＩＩ）中、Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ_２、ＮＨ、Ｏ又はＳである。

【0086】

式（ＶＩＩＩ）中、環Ａにおいて、ｑは、１又は２である。ｑが１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、上記ピロリジン骨格である。上記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｑが２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、上記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型及びＤ型のいずれでもよい。

【0087】

式（ＶＩＩＩ）中、Ｚは、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５又はＣ－６に結合する水素原子又は置換基である。Ｚが置換基の場合、置換基Ｚは、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。

【0088】

置換基Ｚは、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ、ＳＲ^ａ又はオキソ基（＝Ｏ）等である。

【0089】

Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり、同一でも異なってもよい。上記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。以下、同様である。置換基Ｚは、これらの列挙する置換基であってもよい。

【0090】

上記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等が挙げられる。上記保護基については、例えば、文献（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第４版、Ｇｒｅｅｎｅら著、２００７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の記載を援用できる。上記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（以下、ＴＢＤＭＳ基）、ビス（２－アセトキシエチルオキシ）メチル基（以下、ＡＣＥ基）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（以下、ＴＯＭ基）、１－（２－シアノエトキシ）エチル基（以下、ＣＥＥ基）、２－シアノエトキシメチル基（以下、ＣＥＭ基）、２－シアノエチル基（以下、ＣＥ基）、トリルスルフォニルエトキシメチル基（以下、ＴＥＭ基）、トリチル基（以下、Ｔｒ基）及びジメトキシトリチル基（以下、ＤＭＴｒ基）等が挙げられる。ＺがＯＲ^ａの場合、上記保護基は、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基及びＴＥＭ基等が挙げられる。この他にも、シリル含有基も挙げられる。以下、同様である。

【0091】

式（ＶＩＩＩ）中、Ｌ^１は、炭素数ｒのアルキレン鎖である。上記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ又はＳＲ^ａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ^１は、上記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。上記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ^１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、Ｏに結合するＬ^１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。

【0092】

式（ＶＩＩＩ）中、Ｌ^２は、炭素数ｓのアルキレン鎖である。上記アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ又はＳＲ^ａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ^２は、上記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ^２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、Ｏに結合するＬ^２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。

【0093】

Ｌ^１のｒ及びＬ^２のｓは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｒ及びｓは、例えば、リンカーＬｙの所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｒ及びｓは、例えば、製造コスト及び収率等の点から、それぞれ独立して、０～３０の整数が好ましく、より好ましくは０～２０の整数であり、さらに好ましくは０～１５の整数である。ｒ及びｓは、同じでもよいし、異なってもよい。

【0094】

Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、前述と同様である。

【0095】

式（ＶＩＩＩ）中、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ及びＩ等のハロゲンに置換されてもよい。

【0096】

好ましい実施形態では、上記リンカーＬｙは、下記式（ＶＩＩＩ－１）～（ＶＩＩＩ－９）のいずれかで表されるものであってよい。下記式（ＶＩＩＩ－１）～（ＶＩＩＩ－９）において、ｔは、０～１０の整数であり、ｒ及びｓは、上記式（ＶＩＩＩ）と同じである。具体例としては、式（ＶＩＩＩ－１）においてｒ＝８、式（ＶＩＩＩ－２）においてｒ＝３、式（ＶＩＩＩ－３）においてｒ＝４又は８、式（ＶＩＩＩ－４）においてｒ＝７又は８、式（ＶＩＩＩ－５）においてｒ＝３及びｓ＝４、式（ＶＩＩＩ－６）においてｒ＝８及びｓ＝４、式（ＶＩＩＩ－７）においてｒ＝８及びｓ＝４、式（ＶＩＩＩ－８）においてｒ＝５及びｓ＝４、式（ＶＩＩＩ－９）においてｔ＝１及びｓ＝４が挙げられる。

【0097】

【化14】

【0098】

一実施形態では、上記リンカーＬｙは、下記式（Ｖ）又は下記式（ＩＸ）で表されるものであってよい。

【0099】

【化15】

【0100】

【化16】

【0101】

式（Ｖ）で表されるリンカーは、下記式（Ｖ－１）又は下記式（Ｖ－２）で表される光学活性体であってよい。

【0102】

【化17】

【0103】

【化18】

【0104】

別の実施形態では、リンカーＬｙは、－ＮＨＣＨ_２ＣＯＯ－を含む非ヌクレオチド性リンカーであり、そのようなリンカーは、例えば、下記式（ＸＸＩ）で表される。このリンカーＬｙは、基本的に上記式（ＶＩＩＩ）で表されるリンカーＬｙと対応しており、上記式（ＶＩＩＩ）で表されるリンカーについての説明は下記式（ＸＸＩ）で表されるリンカーにも援用される。

【0105】

【化19】

【0106】

式（ＸＸＩ）中、Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ独立して、Ｈ_２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ_２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり、
Ｌ^１は、炭素数ｒのアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ又はＳＲ^ａで置換されても、置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ^１は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ^１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、Ｏに結合するＬ^１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず、
Ｌ^２は、炭素数ｓのアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ又はＳＲ^ａで置換されても、置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ^２は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ^２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、Ｏに結合するＬ^２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず、
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
ｒは、０～３０の範囲の整数であり、
ｓは、０～３０の範囲の整数である。

【0107】

ＹとＹｃは、式（ＸＸＩ）中の－ＯＬ^１又は－ＯＬ^２を介して、リンカーＬｙと連結する。一実施形態では、Ｙが－ＯＬ^１を介して、Ｙｃが－ＯＬ^２を介して、リンカーＬｙと連結してもよい。別の実施形態では、Ｙが－ＯＬ^２を介して、Ｙｃが－ＯＬ^１を介して、リンカーＬｙと連結してもよい。

【0108】

式（ＸＸＩ）中、Ｘ^１及びＸ^２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ_２、Ｏ、Ｓ又はＮＨである。式（ＸＸＩ）において、Ｘ^１がＨ_２であるとは、Ｘ^１が、Ｘ^１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ_２を形成することを意味する。Ｘ^２についても同様である。

【0109】

式（ＸＸＩ）中、Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ_２、ＮＨ、Ｏ又はＳである。

【0110】

Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり、同一でも異なってもよい。上記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。以下、同様である。

【0111】

上記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等が挙げられる。上記保護基については、例えば、文献（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第４版、Ｇｒｅｅｎｅら著、２００７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の記載を援用できる。上記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＣＥ基、ＴＥＭ基、Ｔｒ基及び、ＤＭＴｒ基等が挙げられる。以下、同様である。

【0112】

式（ＸＸＩ）中、Ｌ^１は、炭素数ｒのアルキレン鎖である。上記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ又はＳＲ^ａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ^１は、上記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。上記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ^１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、Ｏに結合するＬ^１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。

【0113】

式（ＸＸＩ）中、Ｌ^２は、炭素数ｓのアルキレン鎖である。上記アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ又はＳＲ^ａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ^２は、上記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ^２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、Ｏに結合するＬ^２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。

【0114】

Ｌ^１のｒ及びＬ^２のｓは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｒ及びｓは、例えば、リンカーＬｙの所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｒ及びｓは、例えば、製造コスト及び収率等の点から、それぞれ独立して、０～３０の整数が好ましく、より好ましくは０～２０の整数であり、さらに好ましくは０～１５の整数である。ｒ及びｓは、同じでもよいし、異なってもよい。

【0115】

Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、前述と同様である。

【0116】

式（ＸＸＩ）中、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ及びＩ等のハロゲンに置換されてもよい。

【0117】

好ましい実施形態では、上記リンカーＬｙは、下記式（ＸＸＩＩ）で表されるものであってよい。

【0118】

【化20】

【0119】

第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、当業者に公知のＲＮＡ合成法を用いて作製することができる。当業者に公知のＲＮＡ合成法としては、例えば、ホスホロアミダイト法やＨ－ホスホネート法等が挙げられる。ホスホロアミダイト法では、担体の疎水性基に結合したリボヌクレオシドをＲＮＡアミダイト（リボヌクレオシドホスホロアミダイト）との縮合反応により伸長し、酸化と脱保護を経て、ＲＮＡアミダイトとの縮合反応を繰り返し行うことにより、ＲＮＡ合成を行うことができる。

【0120】

式（Ｉ）で表される第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、一般的なＲＮＡ合成法、例えばホスホロアミダイト法により作製することができる。一実施形態では、予めリンカーＬｘ^１の構造に相当するアミノアルコールがアミノ基を介して結合された固相担体（例えば、後述する３’－ＰＴ Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ４ ＣＰＧ；Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、常法通り、３’末端側からＸｃを固相合成することにより、作製することができる。合成には、任意のＲＮＡアミダイトを使用することができ、例えば、２’位の水酸基にＴＢＤＭＳ基、ＴＯＭ基、ＡＣＥ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＴＥＭ基、ＤＭＴｒ基等の様々な保護基を有する汎用型ＲＮＡアミダイトも使用することができる。また固相担体としては、ポリスチレン系担体、アクリルアミド系担体、又はガラス担体などの任意の固相担体を使用することができる。担体は、ビーズ、プレート、チップ、チューブ等の任意の形態であってよい。アミノアルコールが結合された担体の例として、例えば、３’－ＰＴ Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ３ ＣＰＧ，又はＣ７ ＣＰＧ（Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0121】

式（ＩＩ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子も同様に、一般的なＲＮＡ合成法、例えばホスホロアミダイト法により作製することができる。一実施形態では、固相担体上に、常法通り、３’末端側からＹｃを固相合成した後、Ｙｃの５’末端にリンカーＬｙを連結する。次にその末端からさらに固相合成を行い、Ｘの５’末端にリンカーＬｘ^２を連結することにより、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を作製することができる。合成には、任意のＲＮＡアミダイトを使用することができ、例えば、２’位の水酸基にＴＢＤＭＳ基、ＴＯＭ基、ＡＣＥ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＴＥＭ基、ＤＭＴｒ基等の様々な保護基を有する汎用型ＲＮＡアミダイトも使用することができる。また固相担体としては、ポリスチレン系担体、アクリルアミド系担体、又はガラス担体などの任意の固相担体を使用することができる。担体は、ビーズ、プレート、チップ、チューブ等の任意の形態であってよい。担体の例として、例えばＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ^（Ｒ） ＨＬ ｒＧ（ｉｂｕ）、又はｒＵ（ＫＩＮＯＶＡＴＥ）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0122】

Ｘの５’末端へのリンカーＬｘ^２の連結には、それに適した任意のＲＮＡ合成用モノマーを用いることができ、例えば、下記式（Ｘ）で表されるＲＮＡ合成用のモノマーを用いることができる。このモノマーは、基本的に上記式（ＩＶ）で表されるリンカーと対応しており、上記式（ＩＶ）で表されるリンカーについての説明は下記式（Ｘ）で表されるモノマーにも援用される。下記式（Ｘ）で表されるモノマーは、例えば、自動核酸合成用のアミダイトとして使用でき、例えば、一般的な核酸自動合成装置に適用可能である。本発明は、下記式（Ｘ）で表されるＲＮＡ合成用のモノマー（アミダイト）も提供する。

【0123】

【化21】

【0124】

式（Ｘ）において、上記式（ＩＶ）と同一箇所については、式（ＩＶ）の説明を援用できる。具体的には、式（Ｘ）中、Ｒ^２は、炭素数ｎのアルキレン鎖である。ここで、アルキレン鎖Ｒ^２の炭素原子上の任意の水素原子は、任意の置換基で置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。ｎは、特に制限されず、リンカーＬｘ^２の所望の長さに応じて適宜設定できるが、例えば、製造コスト及び収率等の点からは、ｎは１～３０の整数が好ましく、より好ましくは１～２０の整数であり、さらに好ましくは１～１５の整数である。式（Ｘ）中、ｐは、１又は２であり、好ましくは１である。式（Ｘ）中、Ｒ^３は、カルボン酸保護基である。カルボン酸保護基については、例えば、文献（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第４版、Ｇｒｅｅｎｅら著、２００７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の記載を援用できる。カルボン酸保護基の具体例として、例えば、ＤＭＴｒ基、Ｔｒ基、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＣＥ基、ＴＥＭ基及び２，４－ジメトキシベンジル基が挙げられるが、ＣＥ基又は２，４－ジメトキシベンジル基が好ましい。

【0125】

Ｒ^４は、電子吸引基で置換されたアルキル基であり、具体的には、例えば、２－シアノエチル基（ＣＥ基）、ニトロフェニルエチル基等が挙げられるが、２－シアノエチル基（ＣＥ基）が好ましい。

【0126】

Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、アルキル基であり、同一でも異なっていてもよい。－ＮＲ^５Ｒ^６は、具体的には、例えば、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等が挙げられるが、ジイソプロピルアミノ基が好ましい。

【0127】

好ましい実施形態では、式（Ｘ）で表されるモノマーは、下記式（ＸＩ）又は下記式（ＸＶＩＩＩ）で表されるものであってよい。

【0128】

【化22】

【0129】

【化23】

【0130】

式（ＸＩ）で表されるモノマーは、下記式（ＸＩ－１）又は下記式（ＸＩ－２）で表される光学活性体であってよい。

【0131】

【化24】

【0132】

【化25】

【0133】

式（ＸＶＩＩＩ）で表されるモノマーは、下記式（ＸＶＩＩＩ－１）又は下記式
（ＸＶＩＩＩ－２）で表される光学活性体であってよい。

【0134】

【化26】

【0135】

【化27】

【0136】

以下に、式（Ｘ）で表されるモノマーの合成法の例を説明するが、合成に使用する出発物質と試薬は、市販品をそのまま利用してもよいし、公知の方法により合成してもよい。

【0137】

式（Ｘ）で表されるモノマーは、例えば、以下のスキーム１に示すように、式（ＸＩＩ）で表されるアルコール誘導体の、式（ＸＩＩＩ）で表されるリン酸化試薬によるリン酸化反応で合成することができる。

【0138】

【化28】

［式中、Ｘは、ハロゲン又はＮＲ⁵Ｒ⁶であり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、ｐは、前述の定義に同じ。］

【0139】

式（ＸＩＩＩ）で表されるリン酸化試薬の具体例としては、例えば、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト、ニトロフェニルエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト、メチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト又は２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ, Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト等が挙げられる。

【0140】

式（ＸＩＩＩ）で表されるリン酸化試薬の当量は、式（ＸＩＩ）で表されるアルコール誘導体に対して１～１０当量が好ましく、１．１～１．５当量がより好ましい。

【0141】

リン酸化反応に用いる活性化剤としては、テトラゾール又はジイソプロピルアミンテトラゾール塩等が挙げられるが、ジイソプロピルアミンテトラゾール塩が好ましい。

【0142】

上記活性化剤の当量は、式（ＸＩＩ）で表されるアルコール誘導体に対して１～１０当量が好ましく、１．１～１．５当量がより好ましい。

【0143】

リン酸化反応に用いる溶媒は、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル又はアセトニトリル等が挙げられるが、アセトニトリルが好ましい。

【0144】

リン酸化反応の反応温度は、２０～５０℃が好ましく、２０～３０℃がより好ましい。また、リン酸化反応の反応時間は、１～４８時間が好ましく、２～５時間がより好ましい。

【0145】

式（ＸＩＩ）で表されるアルコール誘導体は、例えば、以下のスキーム２に示すように、式（ＸＩＶ）で表されるアミン誘導体と式（ＸＶ）で表されるカルボン酸誘導体との縮合反応により合成することができる。

【0146】

【化29】

［式中、Ｒ^２、Ｒ^３、ｐは、前述の定義に同じ。］

【0147】

縮合反応に用いる、式（ＸＶ）で表されるカルボン酸誘導体の当量は、式（ＸＩＶ）で表されるアミン誘導体に対して１～３当量が好ましく、１．１～１．５当量がより好ましい。

【0148】

縮合反応に用いる縮合剤としては、例えば、シクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスジメチルアミノホスホニウム塩、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート又はＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート等が挙げられるが、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩が好ましい。

【0149】

上記縮合剤の当量は、式（ＸＶ）で表されるカルボン酸誘導体に対して１～１０当量が好ましく、１．１～１．５当量がより好ましい。

【0150】

縮合反応に用いる塩基としては、例えば、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン若しくはＮ－メチルモルホリン等の有機塩基又は炭酸カリウム、炭酸ナトリウム若しくは炭酸水素ナトリウム等の有機酸塩が挙げられるが、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンが好ましい。

【0151】

上記塩基の当量は、式（ＸＶ）で表されるカルボン酸誘導体に対して０～１０当量が好ましく、１～３当量がより好ましい。

【0152】

縮合反応に用いる溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム又はジエチルエーテル等が挙げられるが、ジクロロメタンが好ましい。

【0153】

縮合反応の反応温度は、０～５０℃が好ましく、０～３０℃がより好ましい。また、縮合反応の反応時間は、１～４８時間が好ましく、２～５時間がより好ましい。

【0154】

式（ＸＩＶ）で表されるアミン誘導体は、例えば、以下のスキーム３に示すように、式（ＸＶＩ）で表されるアミノ酸誘導体のカルボン酸への保護基導入反応と、得られた式（ＸＶＩＩ）で表されるアミノ酸誘導体の脱Ｂｏｃ化反応又はスキーム４に示すように、式（ＸIＸ）で表されるアミノ酸誘導体のカルボン酸への保護基導入反応と、得られた式（ＸＸ）で表されるアミノ酸誘導体の脱Ｆｍｏｃ化反応により合成することができる。

【0155】

【化30】

［式中、Ｒ^３、ｐは、前述の定義に同じ。］

【0156】

【化31】

［式中、Ｒ^３、ｐは、前述の定義に同じ。］

【0157】

上記カルボン酸への保護基導入反応は、例えば、文献（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第４版、Ｇｒｅｅｎｅら著、２００７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）等に記載の公知の方法で実施することができる。

【0158】

脱Ｂｏｃ化反応や脱Ｆｍｏｃ化反応は、例えば、文献（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第４版、Ｇｒｅｅｎｅら著、２００７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）等に記載の公知の方法により行うことができる。

【0159】

式（ＸＶＩ）や式（ＸＩＸ）で表されるアミノ酸誘導体は、購入することができるか又は公知の方法若しくはそれに準じた方法で製造できる。

【0160】

別の実施形態では、Ｘの５’末端へのリンカーＬｘ^２の連結に、下記式（Ｘ’）で表されるＲＮＡ合成用のモノマーも用いることができる。このモノマーは、基本的に上記式（ＩＶ’）で表されるリンカーと対応しており、上記式（ＩＶ’）で表されるリンカーについての説明は下記式（Ｘ’）で表されるモノマーにも援用される。本発明は、下記式（Ｘ’）で表されるＲＮＡ合成用のモノマー（アミダイト）も提供する。

【0161】

【化32】

【0162】

式（Ｘ’）において、上記式（ＩＶ’）と同一箇所については、式（ＩＶ’）の説明を援用できる。具体的には、式（Ｘ’）中、Ｒ^２は、炭素数ｎのアルキレン鎖である。ここで、アルキレン鎖Ｒ^２の炭素原子上の任意の水素原子は、任意の置換基で置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。ｎは、特に制限されず、リンカーＬｘ^２の所望の長さに応じて適宜設定できるが、例えば、製造コスト及び収率等の点からは、ｎは１～３０の整数が好ましく、より好ましくは１～２０の整数であり、さらに好ましくは１～１５の整数である。式（Ｘ’）中、Ｒ^３は、カルボン酸保護基である。カルボン酸保護基については、例えば、文献（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第４版、Ｇｒｅｅｎｅら著、２００７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の記載を援用できる。カルボン酸保護基の具体例として、例えば、ＤＭＴｒ基、Ｔｒ基、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＣＥ基、ＴＥＭ基及び２，４－ジメトキシベンジル基が挙げられるが、ＣＥ基が好ましい。

【0163】

Ｒ^４は、電子吸引基で置換されたアルキル基であり、具体的には、例えば、２－シアノエチル基（ＣＥ基）、ニトロフェニルエチル基等が挙げられるが、２－シアノエチル基（ＣＥ基）が好ましい。

【0164】

Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、アルキル基であり、同一でも異なっていてもよい。－ＮＲ^５Ｒ^６は、具体的には、例えば、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等が挙げられるが、ジイソプロピルアミノ基が好ましい。

【0165】

好ましい実施形態では、式（Ｘ’）で表されるモノマーは、下記式（ＸＸＩＩＩ）で表されるものであってよい。

【0166】

【化33】

【0167】

式（Ｘ’）で表されるモノマーは、例えば、式（ＸＶＩ）で表されるアミノ誘導体の代わりに、式（ＸＶＩ’）で表されるアミノ酸誘導体を用いて、上記スキーム１～３と同様の方法により製造することができる。

【0168】

【化34】

【0169】

式（ＸＶＩ’）で表されるアミノ酸誘導体は、購入することができるか又は公知の方法若しくはそれに準じた方法で製造できる。

【0170】

またＹｃの５’末端への上記リンカーＬｙの連結には、それに適した任意のＲＮＡ合成用モノマー、例えば、文献（日本国特許第５２６１６７７号明細書又は日本国特許第５８７６８９０号明細書）に記載されている公知のＲＮＡ合成用モノマーを用いることができる。

【0171】

本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｘ－Ｙは、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。遺伝子発現抑制配列は、Ｘのみ又はＹのみに含まれていてもよい。遺伝子発現抑制配列は、好ましくは、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの全体又は一部のセンス配列又はアンチセンス配列である。

【0172】

上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子発現抑制配列を１つ含んでもよいし、２つ以上含んでもよい。上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。異なる標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を２つ以上有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現抑制に有用である。本発明において「遺伝子」とは、ｍＲＮＡに転写されるゲノム領域を指し、タンパク質コード領域であってよいが、ＲＮＡコード領域であってもよい。

【0173】

本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子発現抑制配列を介して標的遺伝子の発現を抑制する能力を有する。本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子による標的遺伝子の発現抑制は、ＲＮＡ干渉によるものであることが好ましいが、それに限定されない。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９～２１塩基対程度の短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、標的ｍＲＮＡを分解することにより、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制し、それにより標的ｍＲＮＡが由来する標的遺伝子の発現を抑制する現象である。標的ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡに含まれる一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、ｓｉＲＮＡに含まれる一本鎖ＲＮＡの配列を、遺伝子発現抑制配列として使用できる。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで切断されてｓｉＲＮＡを生成することにより標的遺伝子の発現を抑制することができる。本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現又は発現増加と関連する疾患又は障害の治療又は予防のために用いることができる。

【0174】

遺伝子発現抑制配列は、好ましくは１９～３０塩基長であり、より好ましくは１９～２７塩基長であり、例えば、１９、２０、２１、２２、又は２３塩基長であってよい。遺伝子発現抑制配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部の配列と完全に同一又は完全に相補的なＲＮＡ配列からなることが好ましい。

【0175】

標的遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、ＴＧＦ－β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子が挙げられる。標的遺伝子がＴＧＦ－β１遺伝子である場合、本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制する。そのようなヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、ＴＧＦ－β１遺伝子の遺伝子発現抑制を通じて、ＴＧＦ－β１遺伝子の発現又は発現増加と関連する疾患又は障害、例えば肺線維症や急性肺疾患の治療又は予防のために用いることができる。

【0176】

本発明の方法により製造される、遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の１つの例は、配列番号１で表される塩基配列を有し、配列番号２で表される塩基配列を有する第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランドＡ）と配列番号３で表される塩基配列を有する第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランドＢ）の組み合わせにより得られる。配列番号１で表される塩基配列は、標的遺伝子であるＴＧＦ－β１遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。配列番号１で表される塩基配列の２９位～４７位の配列が遺伝子発現抑制配列（活性配列）に相当する（図２）。

【0177】

また、別の例としては、配列番号４で表される塩基配列を有し、配列番号５で表される塩基配列を有する第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランドＣ）と配列番号６で表される塩基配列を有する第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランドＤ）の組み合わせにより得られる。配列番号４で表される塩基配列は、標的遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。配列番号４で表される塩基配列の２７位～４５位の配列が遺伝子発現抑制配列（活性配列）に相当する。

【0178】

本発明では、上記式（Ｉ）で表される第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、上記式（ＩＩ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とを、反応溶媒中で、脱水縮合剤（縮合剤とも称される。）の存在下、反応させ、リンカーＬｘ^１とリンカーＬｘ^２の間にアミド結合を形成することにより、上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を製造することができる。反応溶媒は、緩衝液と親水性有機溶媒とを含む混合溶媒である。

【0179】

上記緩衝液としては、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（以下、ＭＥＳ緩衝液）、３－（Ｎ－モルホリノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液（以下、ＭＯＰＳＯ緩衝液）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）緩衝液（以下、ＰＩＰＥＳ緩衝液）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（以下、ＭＯＰＳ緩衝液）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸緩衝液（以下、ＢＥＳ緩衝液）、３－［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液（以下、ＤＩＰＳＯ緩衝液）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液（以下、ＨＥＰＥＳ緩衝液）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液（以下、ＰＯＰＳＯ緩衝液）、４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－（２－ヒドロキシプロパン－３－スルホン酸緩衝液（以下、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸緩衝液（以下、ＨＥＰＰＳ緩衝液）等が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＥＳ緩衝液又はＭＯＰＳ緩衝液等が好ましく用いられる。

【0180】

緩衝液のｐＨは適宜調整することができるが、６．５～７．５であることが好ましく、６．９～７．５であることがより好ましく、例えば６．５～７．０、６．９～７．１、又は７．０～７．５である。

【0181】

本発明では、上記反応溶媒の成分として、親水性有機溶媒を用いることができる。親水性有機溶媒は、例えば、親水性の非プロトン性有機溶媒であってもよい。

【0182】

親水性有機溶媒とは、水と自由な比率で混和できる有機溶媒を意味し、スルホラン等のスルホン系溶媒、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド系溶媒、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンウレア等のウレア系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、エタノール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール等のアルコール系溶媒が挙げられる。また、「非プロトン性」有機溶媒とは、プロトン供与性を持たない有機溶媒を意味し、親水性の非プロトン性有機溶媒としては、スルホラン等のスルホン系溶媒、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド系溶媒、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンウレア等のウレア系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒が挙げられるが、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ），Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド(以下、ＤＭＦ)，Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンウレア（以下，ＤＭＥＵ）、又はアセトニトリルが好ましく、ＤＭＳＯ又はＤＭＦがより好ましい。

【0183】

なお脱水縮合剤やＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステル、又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体を有機溶媒に溶解又は懸濁して添加する場合、その有機溶媒は、混合溶媒中の「有機溶媒」に含むものとする。有機溶媒は１種類を用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。

【0184】

一実施形態では、反応溶媒である混合溶媒中の有機溶媒の比率は、溶媒全体量（緩衝液と有機溶媒を含む混合溶媒の全量）の、１５～７０体積％（ｖ／ｖ％）であってよく、例えば、２０～７０体積％、２０～６５体積％、３５～６０体積％、３５～５５体積％、又は５０～５５体積％であってよい。本発明において、脱水縮合剤やＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）やシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルやＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体を、水、緩衝液又は有機溶媒等の溶液に溶解又は懸濁して添加する場合、溶媒全体量は、脱水縮合剤やＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）やシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルやＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体を含む溶液の量を含む。また混合溶媒中の有機溶媒の比率の算出において、脱水縮合剤やＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステル、又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体を有機溶媒に溶解又は懸濁して添加する場合、その有機溶媒の量は、混合溶媒中の有機溶媒の合計量に含めるものとする。

【0185】

親水性有機溶媒がＤＭＳＯである場合、混合溶媒中のＤＭＳＯの比率は溶媒全体量の２０～６５体積％であることが好ましく、３５～６０体積％であることが好ましく、５０～５５又は５０～６０体積％であることがより好ましい。親水性有機溶媒がＤＭＳＯであり、脱水縮合剤が、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、例えば、ＨＡＴＵなどのベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤である場合、混合溶媒中のＤＭＳＯの比率は溶媒全体量の３５～６５体積％であることが好ましく、５０～６５体積％であることがより好ましく、例えば５０～６０体積％であってよい。親水性有機溶媒がＤＭＳＯであり、脱水縮合剤が、トリアジン型脱水縮合剤、例えば、ＤＭＴ－ＭＭなどのトリアジン型４級モルホリニウム誘導体である場合、混合溶媒中のＤＭＳＯの比率は溶媒全体量の３５～６５体積％であることが好ましく、３５～６０体積％であることがより好ましく、例えば、５０～６０体積％、又は５０～５５体積％であってよい。これらの場合、反応溶媒（混合溶媒）のｐＨは、以下に限定するものではないが、６．５～７．５であることが好ましく、６．９～７．５であることがより好ましく、例えば６．５～７．０、６．９～７．１、又は７．０～７．５であってよい。

【0186】

親水性有機溶媒がＤＭＦである場合、混合溶媒中のＤＭＦの比率は溶媒全体量の２０～６５体積％であることが好ましく、３５～６５体積％であることが好ましく、５０～６５体積％であることがより好ましい。親水性有機溶媒がＤＭＦであり、脱水縮合剤が、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、例えば、ＨＡＴＵなどのベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤である場合、混合溶媒中のＤＭＦの比率は溶媒全体量の３５～６５体積％であることが好ましく、５０～６５体積％であることがより好ましく、例えば５０～６０体積％であってよい。これらの場合、反応溶媒（混合溶媒）のｐＨは、以下に限定するものではないが、６．５～７．５であることが好ましく、６．９～７．５であることがより好ましく、例えば６．５～７．０、６．９～７．１、又は７．０～７．５であってよい。

【0187】

親水性有機溶媒がＤＭＥＵである場合、混合溶媒中のＤＭＥＵの比率は溶媒全体量の２０～６５体積％であることが好ましく、３５～６５体積％であることが好ましく、５０～６０体積％であることがより好ましい。親水性有機溶媒がＤＭＥＵであり、脱水縮合剤が、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、例えば、ＨＡＴＵなどのベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤である場合、混合溶媒中のＤＭＥＵの比率は溶媒全体量の３５～６５体積％であることが好ましく、５０～６５体積％であることがより好ましく、例えば５０～６０体積％であってよい。これらの場合、反応溶媒（混合溶媒）のｐＨは、以下に限定するものではないが、６．５～７．５であることが好ましく、６．９～７．５であることがより好ましく、例えば６．５～７．０、６．９～７．１、又は７．０～７．５であってよい。

【0188】

親水性有機溶媒がアセトニトリルである場合、混合溶媒中のアセトニトリルの比率は溶媒全体量の２０～６５体積％であることが好ましく、３５～６５体積％であることが好ましく、５０～６５体積％であることがより好ましい。親水性有機溶媒がアセトニトリルであり、脱水縮合剤が、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、例えば、ＨＡＴＵなどのベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤である場合、混合溶媒中のアセトニトリルの比率は溶媒全体量の３５～６５体積％であることが好ましく、５０～６５体積％であることがより好ましく、例えば５０～６０体積％であってよい。これらの場合、反応溶媒（混合溶媒）のｐＨは、以下に限定するものではないが、６．５～７．５であることが好ましく、６．９～７．５であることがより好ましく、例えば６．５～７．０、６．９～７．１、又は７．０～７．５であってよい。

【0189】

緩衝液と親水性有機溶媒の添加順序に特に制限はなく、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を緩衝液に溶解した後に親水性有機溶媒を加えてもよいし、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に親水性有機溶媒を添加した後に緩衝液を加えてもよい。あるいは、緩衝液と親水性有機溶媒とを事前に混合した溶媒と、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、混合することもできる。通常、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を緩衝液に溶解した後に親水性有機溶媒を加えることが好ましい。

【0190】

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を緩衝液に溶解した後、一定時間（例えば、１～１５分間）にわたり静置してもよいし、静置することなく直ちに親水性有機溶媒を添加してもよい。また、緩衝液中で第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の熱変性（例えば、９０℃以上の温度での加熱した後、室温まで冷却）を行ってもよいし、行わなくてもよい。

【0191】

本発明の製造方法で用いる脱水縮合剤としては、（ｉ）トリアジン型脱水縮合剤、（ｉｉ）Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤（例えばベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤）、（ｉｉｉ）カルボジイミド型脱水縮合剤、（ｉｖ）２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤、又は（ｖ）ホルムアミジニウム型脱水縮合剤を用いることができる。脱水縮合剤として（ｉｉｉ）カルボジイミド型脱水縮合剤を用いる場合、カルボジイミド型脱水縮合剤をＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルと組み合わせて用いることができ、（ｉｖ）２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤を用いる場合、２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤をＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物と組み合わせて用いることができ、（ｖ）ホルムアミジニウム型脱水縮合剤を用いる場合、ホルムアミジニウム型脱水縮合剤をＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体と組み合わせて用いることができる。本発明の製造方法では、Ｎ－アシルオキシ含窒素芳香族化合物型活性中間体（例えばベンゾトリアゾリル型活性中間体）、シアノ（アシルオキシイミノ）酢酸エステル型活性中間体又はＮ’－アシル－Ｎ－炭化水素置換イミダゾール型活性中間体を経由してアミド化を引き起こす反応条件を好適に用いることができる。脱水縮合剤は、遊離体又は塩の形態であってよく、好ましくは塩の形態である。

【0192】

一実施形態では、本発明の製造方法は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）のうち少なくとも１つ又はそれらの任意の組み合わせ（例えば、全て）の条件を満たしてもよい：
（ｉ）Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤を使用し、それがベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤である、
（ｉｉ）Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物を使用し、それがヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体である、
（ｉｉｉ）シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルを使用し、それがシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アルキルエステルである、
（ｉｖ）Ｎ－炭化水素置換イミダゾール誘導体を使用し、それがＮ－アルキルイミダゾール誘導体である。

【0193】

トリアジン型脱水縮合剤は、トリアジンの、少なくとも１つの炭素原子が、４級アンモニウム又はハロゲン等の脱離可能な官能基で置換された構造を有する化合物（例えば、遊離体又は塩）を意味する。トリアジン型脱水縮合剤としては、例えば、文献（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２００１年，第５７巻、ｐ．１５５１－１５５８；Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１２年、第１８巻、ｐ．１５８５６－１５８６７；日本国特許第４３４９７４９号明細書、特開２００８－２１４４７３号公報、特開２０１６－１４１６１８号公報、特開２０１６－１４１６１９号公報、特開２０１７－１４９８７６号公報等）に記載された脱水縮合剤を用いることができる。より具体的には、トリアジン型脱水縮合剤は、トリアジン型４級モルホリニウム、例えば、４－［４，６－ビス（２，６－キシリル）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウム、４－［４－メトキシ－６－（２，６－キシリル）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウム、４－（４－ｔ－ブチル－６－メトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）４－メトキシモルホリニウム、４－（４，６－ジ－ｔ－ブチル－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム、Ｎ－［４－メトキシ－６－（Ｎ’－フェニルアセトアミド）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウム、Ｎ－［４－メトキシ－６－（Ｎ’－メチルアセトアミド）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウム、Ｎ－［４－メトキシ－６－（Ｎ’－フェニルベンズアミド）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウム、Ｎ－［４－メトキシ－６－（Ｎ’－メチルベンズアミド）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウム、Ｎ－［４－メトキシ－６－（２，５－ジオキソピロリジル）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウム、Ｎ－［４－メトキシ－６－（２－ピペリドン－１－イル）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウム、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム、及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム、並びにその誘導体が挙げられる。誘導体の例としては、ペルクロラート、トリフルオロメタンスルホナート、塩化物、ヘキサフルオロホスファート等の塩が挙げられる。トリアジン型脱水縮合剤は、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム塩であってよい。

【0194】

トリアジン型脱水縮合剤であるトリアジン型４級モルホリニウム誘導体としては、例えば、４－［４，６－ビス（２，６－キシリル）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウムペルクロラート、４－［４－メトキシ－６－（２，６－キシリル）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウムペルクロラート、４－（４－ｔ－ブチル－６－メトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）４－メトキシモルホリニウムトリフルオロメタンスルホナート、４－（４，６－ジ－ｔ－ブチル－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド、Ｎ－［４－メトキシ－６－（Ｎ’－フェニルアセトアミド）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウムペルクロラート、Ｎ－［４－メトキシ－６－（Ｎ’－メチルアセトアミド）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウムペルクロラート、Ｎ－［４－メトキシ－６－（Ｎ’－フェニルベンズアミド）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウムクロリド、Ｎ－［４－メトキシ－６－（Ｎ’－メチルベンズアミド）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウムクロリド、Ｎ－［４－メトキシ－６－（２，５－ジオキソピロリジル）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウムクロリド、Ｎ－［４－メトキシ－６－（２－ピペリドン－１－イル）－１，３，５－トリアジン－２－イル］－４－メチルモルホリニウムクロリド、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムトリフルオロメタンスルホナート等が好ましく、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（以下、ＤＭＴ－ＭＭ）がより好ましい。

【0195】

トリアジン型脱水縮合剤の当量としては、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に対して１０～１００当量が好ましく、２０～４０当量がより好ましい。

【0196】

Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤は、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造にテトラアルキルアミジニウム構造が付加した化合物を意味する。Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤としては、例えば、ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール構造を含むウロニウム型脱水縮合剤）、Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、Ｎ－ヒドロキシイミダゾール構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、又はＮ－ヒドロキシピリジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤等が好ましく、ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤、Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、又は３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤がより好ましく、ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤、又は３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤がより好ましい。

【0197】

ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤は、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール構造にテトラアルキルアミジニウム構造が付加した化合物を意味する。アミジニウム構造の二つの窒素原子上の４つの置換基はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、窒素原子とともに環を形成していてもよい。上記１－ヒドロキシベンゾトリアゾール構造はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限なく、ベンゼン環上に置換基を有していてもよいし、ベンゼン環中の一部の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい。

【0198】

ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤は、一般にＯ－アシル型（ウロニウム型）とＮ－アシル型（アミニウム型）の２つの形態をとることが文献（Ｃａｒｐｉｎｏら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００２年、第４１巻、ｐ．４４１－４４５．）で知られているが、本発明において「ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤」は、Ｏ－アシル型（ウロニウム型）とＮ－アシル型（アミニウム型）の両方の形態を包含する。

【0199】

【化35】

【0200】

ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤としては、例えば、文献（Ｋｎｏｒｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８９年、第３０巻、ｐ．１９２７－１９３０；Ｃａｒｐｉｎｏら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００１年、第３巻、ｐ．２７９３－２７９５；ＥＬ－Ｆａｈａｍら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、第７３巻、ｐ．２７３１－２７３７；国際公開第１９９４／００７９１０号、国際公開第２００２／０９４８２２号等）に記載された脱水縮合剤を用いることができる。より具体的には、ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤は、ベンゾトリアゾリルウロニウム、例えば、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム、［（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）ピペリジン－１－イルメチレン］ピペリジニウム等、並びにその誘導体、又は、アザベンゾトリアゾリルウロニウム、例えば、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラエチルウロニウム、［（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－４－モルホリノメチレン］ジメチルアンモニウム、［（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）ピペリジン－１－イルメチレン］ピペリジニウム、［（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）ピロリジン－１－イルメチレン］ピロリジニウム等、並びにその誘導体が挙げられる。誘導体の例としては、ペルクロラート、トリフルオロメタンスルホナート、塩化物、ヘキサフルオロホスファート等の塩が挙げられる。ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤は、例えば、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム塩やＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム塩であってもよい。

【0201】

ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤の好ましい例としては、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートやＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（以下、ＨＡＴＵ）が挙げられる。

【0202】

Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤は、Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン構造にテトラアルキルアミジニウム構造が付加した化合物を意味する。アミジニウム構造の二つの窒素原子上の４つの置換基はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、窒素原子とともに環を形成していてもよい。上記Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン構造はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限なく、ピリドン環上に置換基を有していてもよい。Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤としては、例えば、Ｏ－（１，２－ジヒドロ－２－オキソ－１－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム、Ｏ－（１，２－ジヒドロ－２－オキソ－１－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ビス（テトラメチレン）ウロニウム、及びＯ－（１，２－ジヒドロ－２－オキソ－１－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ビス（ペンタメチレン）ウロニウム等、並びにその誘導体が挙げられる。誘導体の例としては塩化物、臭化物、ヨウ化物、ペルクロラート、トリフルオロメタンスルホナート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスファート等の塩が挙げられる。Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤は、Ｏ－（１，２－ジヒドロ－２－オキソ－１－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム塩であってもよい。

【0203】

Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤の好ましい例としては、Ｏ－（１，２－ジヒドロ－２－オキソ－１－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（以下、ＴＰＴＵ）が挙げられる。

【0204】

３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤は、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン構造にテトラアルキルアミジニウム構造が付加した化合物を意味する。アミジニウム構造の二つの窒素原子上の４つの置換基はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、窒素原子とともに環を形成していてもよい。上記３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン構造はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限なく、４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン環上に置換基を有していてもよい。３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤としては、例えば、Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム、Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ ビス（テトラメチレン）ウロニウム、Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ ビス（ペンタメチレン）ウロニウム等、並びにその誘導体が挙げられる。誘導体の例としては塩化物、臭化物、ヨウ化物、ペルクロラート、トリフルオロメタンスルホナート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスファート等の塩が挙げられる。３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤は、Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム塩であってもよい。

【0205】

３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤の好ましい例としては、Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（以下、ＴＤＢＴＵ）が挙げられる。

【0206】

Ｎ－ヒドロキシイミダゾール構造を含むウロニウム型脱水縮合剤は、Ｎ－ヒドロキシイミダゾール構造にテトラアルキルアミジニウム構造が付加した化合物を意味する。アミジニウム構造の二つの窒素原子上の４つの置換基はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、窒素原子とともに環を形成していてもよい。上記Ｎ－ヒドロキシイミダゾール構造はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限なく、Ｎ－ヒドロキシイミダゾール環上に置換基を有していてもよい。Ｎ－ヒドロキシイミダゾール構造を含むウロニウム型脱水縮合剤としては、例えば、Ｏ－（イミダゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム、Ｏ－（イミダゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ ビス（テトラメチレン）ウロニウム、Ｏ－（イミダゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ ビス（ペンタメチレン）ウロニウム等、並びにその誘導体が挙げられる。誘導体の例としては塩化物、臭化物、ヨウ化物、ペルクロラート、トリフルオロメタンスルホナート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスファート等の塩が挙げられる。Ｎ－ヒドロキシイミダゾール構造を含むウロニウム型脱水縮合剤は、Ｏ－（イミダゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム塩であってもよい。

【0207】

Ｎ－ヒドロキシイミダゾール構造を含むウロニウム型脱水縮合剤の好ましい例としては、Ｏ－（イミダゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートが挙げられる。

【0208】

Ｎ－ヒドロキシピリジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤は、Ｎ－ヒドロキシピリジン構造にテトラアルキルアミジニウム構造が付加した化合物を意味する。アミジニウム構造の二つの窒素原子上の４つの置換基はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、窒素原子とともに環を形成していてもよい。上記Ｎ－ヒドロキシピリジン構造はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限なく、Ｎ－ヒドロキピリジン環上に置換基を有していてもよい。Ｎ－ヒドロキシピリジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤としては、例えば、Ｏ－ピリジル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム、Ｏ－ピリジル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ ビス（テトラメチレン）ウロニウム、Ｏ－ピリジル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ ビス（ペンタメチレン）ウロニウム、Ｏ－（４－ジメチルアミノ－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム、Ｏ－（４－ジメチルアミノ－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ ビス（テトラメチレン）ウロニウム、Ｏ－（４－ジメチルアミノ－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ ビス（ペンタメチレン）ウロニウム等、並びにその誘導体が挙げられる。誘導体の例としては塩化物、臭化物、ヨウ化物、ペルクロラート、トリフルオロメタンスルホナート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスファート等の塩が挙げられる。Ｎ－ヒドロキシピリジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤は、Ｏ－ピリジル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム塩やＯ－４－ジメチルアミノ－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム塩であってもよい。

【0209】

Ｎ－ヒドロキシピリジン構造を含むウロニウム型脱水縮合剤の好ましい例としては、Ｏ－（４－ジメチルアミノ－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートが挙げられる。

【0210】

Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤（例えば、ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤）の当量としては、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に対して１０～１００当量が好ましく、２０～４０当量がより好ましい。

【0211】

カルボジイミド型脱水縮合剤は、Ｎ＝Ｃ＝Ｎで表されるカルボジイミド構造を有する化合物を意味する。Ｎ上の置換基はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はない。カルボジイミド型脱水縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジメチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジエチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジプロピルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｎ’－メチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ－ベンジル－Ｎ’－メチルカルボジイミド、Ｎ－ベンジル－Ｎ’－エチルカルボジイミド、Ｎ－ベンジル－Ｎ’－プロピルカルボジイミド、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、３－（エチルイミノメチリデンアミノ）プロピルトリメチルアンモニウム、３－（イソプロピルイミノメチリデンアミノ）プロピルトリメチルアンモニウム等のカルボジイミド誘導体、並びにその塩（酸付加塩を含む）を用いることができる。塩の例としては、ペルクロラート、トリフルオロメタンスルホナート、塩化物、ヘキサフルオロホスファート、塩酸塩、臭素酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、過塩素酸塩等が挙げられる。３級アミン構造又は４級アンモニウム構造を含むカルボジイミド誘導体がより好ましく、例えば、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド及びその酸付加塩などの塩、Ｎ，Ｎ’－ビス（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びその酸付加塩などの塩、３－（エチルイミノメチリデンアミノ）プロピルトリメチルアンモニウム塩、３－（イソプロピルイミノメチリデンアミノ）プロピルトリメチルアンモニウム塩が挙げられる。特に好ましいカルボジイミド型脱水縮合剤の例は、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣＩ塩酸塩）である。

【0212】

Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物としては、例えば、ヒドロキシベンゾトリアゾール若しくはその誘導体、Ｎ－ヒドロキシトリアゾール若しくはその誘導体、Ｎ－ヒドロキシベンゾイミダゾール若しくはその誘導体、Ｎ－ヒドロキシイミダゾール若しくはその誘導体、Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン若しくはその誘導体、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン若しくはその誘導体、又はＮ－ヒドロキシピリジン若しくはその誘導体が好ましく、ヒドロキシベンゾトリアゾール若しくはその誘導体、Ｎ－ヒドロキシトリアゾール若しくはその誘導体、Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン若しくはその誘導体、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン若しくはその誘導体、又はＮ－ヒドロキシピリジン若しくはその誘導体がより好ましい。

【0213】

ヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体は、アミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、ベンゼン環上に置換基を有していてもよいし、ベンゼン環中の一部の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい。ヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体としては、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－６－クロロ－ベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－６－トリフルオロメチルベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－４－ニトロ－６―トリフルオロメチルベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－４－メチル－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－４－メトキシ－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－４－ｔｅｒｔ－ブチル－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－４，５，６－トリメチル－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－６－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－５－アザベンゾトリアゾール又は１－ヒドロキシ－４－アザベンゾトリアゾール等を用いることができ、好ましくは、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－４－メチル－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－４－メトキシ－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－４－ｔｅｒｔ－ブチル－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－４，５，６－トリメチル－７－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－６－アザベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－５－アザベンゾトリアゾール又は１－ヒドロキシ－４－アザベンゾトリアゾール等のヒドロキシアザベンゾトリアゾール又はその誘導体であり、より好ましくは、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（以下、ＨＯＡｔ）である。

【0214】

Ｎ－ヒドロキシトリアゾール又はその誘導体は、アミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、トリアゾール環上４又は５位に置換基を有していてもよい。Ｎ－ヒドロキシトリアゾール又はその誘導体は、例えば、１－ヒドロキシ－１，２，３－トリアゾール－４－カルボン酸エチルが挙げられる。

【0215】

Ｎ－ヒドロキシベンゾイミダゾール又はその誘導体は、アミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、ベンゼン環上に置換基を有していてもよいし、ベンゼン環中の一部の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい。Ｎ－ヒドロキシベンゾイミダゾール又はその誘導体は、例えば、Ｎ－ヒドロキシベンゾイミダゾール、Ｎ－ヒドロキシ－７－アザベンゾイミダゾールが挙げられる。

【0216】

Ｎ－ヒドロキシイミダゾール又はその誘導体は、アミド化反応に阻害しないものであれば、特に制限はなく、イミダゾール環上に置換基を有していてもよい。Ｎ－ヒドロキシイミダゾール又はその誘導体は、例えば、Ｎ－ヒドロキシイミダゾールが挙げられる。

【0217】

Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン又はその誘導体は、アミド化反応に阻害しないものであれば、特に制限はなく、ピリドン環上３～６位に置換基を有していてもよい。Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン又はその誘導体は、例えば、Ｎ－ヒドロキシ－２－ピリドン（以下、ＨＯＰＯ）が挙げられる。

【0218】

３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン又はその誘導体は、アミド化反応に阻害しないものであれば、特に制限はなく、ベンゼン環上に置換基を有していてもよい。３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン又はその誘導体は、例えば、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン、７－クロロ－３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－７－ニトロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－６，７－ジメトキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジンが挙げられる。

【0219】

Ｎ－ヒドロキシピリジン又はその誘導体は、アミド化反応に阻害しないものであれば、特に制限はなく、ピリジン環上に置換基を有していてもよい。Ｎ－ヒドロキシピリジン又はその誘導体は、例えば、Ｎ－ヒドロキシピリジン、４－（ジメチルアミノ）ピリジン－Ｎ－オキシドが挙げられる。

【0220】

シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルはエステル基として、アミド化反応を阻害しない置換基を有していてもよい。シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルとしては、例えば、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アルキルエステル、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アリールエステルが挙げられる。

【0221】

シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アルキルエステルにおいて、アルキルエステル基部分は、直鎖状、分岐状、環状のいずれであってもよく、炭素数１～１０のアルキル基であることが好ましい。シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アルキルエステルとしては、例えば、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸メチル、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸プロピル、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸ｔｅｒｔ－ブチル、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸ベンジル、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸シクロヘキシル、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メチルであり、より好ましくは、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチルである。

【0222】

シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アリールエステルにおいて、アリールエステル基部分は、ベンゼン環上に置換基を有していてもよいし、ベンゼン環中の一部の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい。シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アリールエステルとしては、例えば、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸フェニル、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸－１－ナフチルが挙げられる。

【0223】

カルボジイミド型脱水縮合剤の当量としては、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に対して１０～１００当量が好ましく、２０～４０当量がより好ましい。また、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルの当量としては、それぞれ第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に対して１０～１００当量が好ましく、２０～４０当量がより好ましい。

【0224】

２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤は、ピリジン環上の窒素原子上に炭化水素置換基を有するピリジニウム塩であって、ピリジン環の２位にハロゲンを有する化合物を意味する。上記ピリジン環はピリジン環上３～６位に置換基を有していてもよい。上記窒素原子上の炭化水素置換基、およびピリジン環上３～６位に置換基はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はない。２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤としては、例えば、２－クロロ－１－メチルピリジニウム、２－ブロモ－１－メチルピリジニウム、２－フルオロ－１－メチルピリジニウム、２－クロロ－１－エチルピリジニウム、２－ブロモ－１－エチルピリジニウム、２－フルオロ－１－エチルピリジニウム、２－フルオロ－１、３－ジメチルピリジニウム、２－クロロ－１－メチルキノリニウム、２－ヨード－１－メチルキノリニウム、２－クロロ－１－（２－オキソ－２－フェネチル）ピリジニウム、２－ブロモ－１－（２－オキソ－２－フェネチル）ピリジニウム、２－クロロ－１－［２－（３－ニトロフェニル）－２－オキソエチル］ピリジニウム、２－クロロ－１－［２－（４－フルオロフェニル）－２－オキソエチル］ピリジニウム、２－クロロ－１－［２－（４－クロロフェニル）－２－オキソエチル］ピリジニウム、２－ブロモ－１－［２－（４－ビフェニル）－２－オキソエチル］ピリジニウム、２－ブロモ－１－［２－（３－ニトロフェニル）－２－オキソエチル］ピリジニウム、２－ブロモ－１－［２－（４－メトキシフェニル）－２－オキソエチル］ピリジニウム、２－クロロ－１－ベンジルピリジニウム、２－ヨード－１－エチル－６－メトキシキノリニウム等、並びにその誘導体が挙げられる。誘導体の例としては塩化物、臭化物、ヨウ化物、ペルクロラート、トリフルオロメタンスルホナート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスファート等の塩が挙げられる。２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤は、２－クロロ－１－メチルピリジニウム塩であってもよい。

【0225】

２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤の好ましい例としては、２－クロロ－１－メチルピリジニウムヨージドが挙げられる。

【0226】

２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤の当量としては、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に対して１０～１００当量が好ましく、２０～４０当量がより好ましい。また、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）の当量としては、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に対して１０～１００当量が好ましく、２０～４０当量がより好ましい。

【0227】

ホルムアミジニウム型脱水縮合剤の二つの窒素原子上の４つの置換基はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、窒素原子とともに環を形成していてもよい。ホルムアミジニウム型脱水縮合剤としては、クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウム、２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウム、クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ビス（テトラメチレン）ホルムアミジニウム、クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ビス（ペンタメチレン）ホルムアミジニウム、２－クロロ－１，３－ジメチル－４，５－ジヒドロピリミジニウム、フルオロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウム、２－フルオロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウム、フルオロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ビス（テトラメチレン）ホルムアミジニウム等、並びにその誘導体が挙げられる。誘導体の例としては塩化物、臭化物、ヨウ化物、ペルクロラート、トリフルオロメタンスルホナート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスファート等の塩が挙げられる。ホルムアミジニウム型脱水縮合剤は、クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウム塩であってもよい。

【0228】

ホルムアミジニウム型脱水縮合剤の好ましい例としては、クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファート（以下、ＴＣＦＨ）が挙げられる。

【0229】

Ｎ－炭化水素置換イミダゾール誘導体は、イミダゾール構造の窒素原子上に炭化水素置換基を有する化合物を意味する。上記イミダゾール構造はイミダゾール環２位，４位又は５位上に置換基を有していてもよい。上記炭化水素置換基、およびイミダゾール環２位，４位又は５位上の置換基はアミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はない。Ｎ－炭化水素置換イミダゾール誘導体としては、例えば、Ｎ－アルキルイミダゾール誘導体、Ｎ－アリールイミダゾール誘導体が挙げられる。

【0230】

Ｎ－アルキルイミダゾール誘導体は、アミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、イミダゾール環上に置換基を有していてもよい。Ｎ－アルキルイミダゾール誘導体としては、例えば、Ｎ－メチルイミダゾール（以下、ＮＭＩ）、１，２－ジメチルイミダゾールが挙げられる。

【0231】

Ｎ－アリールイミダゾール誘導体は、アミド化反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、イミダゾール環上に置換基を有していてもよい。Ｎ－アリールイミダゾール誘導体としては、例えば、Ｎ－フェニルイミダゾール、１－フェニル－２－メチルイミダゾールが挙げられる。

【0232】

ホルムアミジニウム型脱水縮合剤の当量としては、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に対して１０～１００当量が好ましく、２０～４０当量がより好ましい。また、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体の当量としては、それぞれ第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に対して１０～１００当量が好ましく、２０～４０当量がより好ましい。

【0233】

前記脱水縮合剤並びに前記Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物、前記シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステル及び前記Ｎ－炭化水素置換イミダゾール誘導体は、市販品を用いてもよいし公知の方法若しくはそれに準じた方法で合成してもよい。

【0234】

一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に対して、脱水縮合剤、具体的には、トリアジン型脱水縮合剤、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤（例えばベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤）、カルボジイミド型脱水縮合剤、２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤又はホルムアミジニウム型脱水縮合剤を、固体として添加してもよいし、水、緩衝液、親水性有機溶媒又はそれらの混合溶媒等の溶液に溶解又は懸濁して添加してもよい。カルボジイミド型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルとを組み合わせて使用する場合、カルボジイミド型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルのいずれを先に添加してもよく、両者を同時に添加することもできる。２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物とを組み合わせて使用する場合、２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物のいずれを先に添加してもよく、両者を同時に添加することもできる。ホルムアミジニウム型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体とを組み合わせて使用する場合、ホルムアミジニウム型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体のいずれを先に添加してもよく、両者を同時に添加することもできる。

【0235】

また、脱水縮合剤、具体的には、トリアジン型脱水縮合剤、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤（例えばベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤）、カルボジイミド型脱水縮合剤、２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤又はホルムアミジニウム型脱水縮合剤に対して、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を添加することもできる。この際、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子はいずれを先に添加してもよく、両者を同時に添加することもできる。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、固体として添加してもよいし、水、緩衝液、親水性有機溶媒又はそれらの混合溶媒等に溶解又は懸濁して添加してもよいが、通常、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の溶液に脱水縮合剤を加えることが好ましい。カルボジイミド型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルとを組み合わせて使用する場合、カルボジイミド型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルに対して、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を添加することもできる。この際、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子はいずれを先に添加してもよく、両者を同時に添加することもできる。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、固体として添加してもよいし、水、緩衝液、親水性有機溶媒又はそれらの混合溶媒等に溶解又は懸濁して添加してもよいが、通常、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の溶液に脱水縮合剤を加えることが好ましい。２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物とを組み合わせて使用する場合、２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物に対して、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を添加することもできる。この際、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子はいずれを先に添加してもよく、両者を同時に添加することもできる。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、固体として添加してもよいし、水、緩衝液、親水性有機溶媒又はそれらの混合溶媒等に溶解又は懸濁して添加してもよいが、通常、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の溶液に脱水縮合剤を加えることが好ましい。ホルムアミジニウム型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体とを組み合わせて使用する場合、ホルムアミジニウム型脱水縮合剤とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体に対して、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を添加することもできる。この際、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子はいずれを先に添加してもよく、両者を同時に添加することもできる。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、固体として添加してもよいし、水、緩衝液、親水性有機溶媒又はそれらの混合溶媒等に溶解又は懸濁して添加してもよいが、通常、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の溶液に脱水縮合剤を加えることが好ましい。

【0236】

本発明において、脱水縮合剤としては、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム塩、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム塩、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド若しくはその塩、２－クロロ－１－メチルピリジニウム塩又はクロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウム塩が好ましく、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩、２－クロロ－１－メチルピリジニウムヨージド、又はクロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートがより好ましい。

【0237】

脱水縮合剤としてのカルボジイミド型脱水縮合剤や２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤やホルムアミジニウム型脱水縮合剤と共に用いるＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物としては、ヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体が好ましく、ヒドロキシアザベンゾトリアゾール又はその誘導体がより好ましく、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールがより好ましい。

【0238】

脱水縮合剤としてのカルボジイミド型脱水縮合剤と共に用いるシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルとしては、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸アルキルエステルが好ましく、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチルがより好ましい。

【0239】

脱水縮合剤としてのホルムアミジニウム型脱水縮合剤と共に用いるＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体としては、Ｎ－アルキルイミダゾール誘導体が好ましく、Ｎ－メチルイミダゾールがより好ましい。

【0240】

本発明において、脱水縮合剤は、少なくともトリアジン型脱水縮合剤、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤（例えばベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤）、カルボジイミド型脱水縮合剤、２－ハロピリジニウム型脱水縮合剤又はホルムアミジニウム型脱水縮合剤を含んでいればよく、２種類以上を混合してもよい。本発明において、脱水縮合剤やＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）やシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルやＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体を、水、緩衝液又は親水性有機溶媒等の溶液に溶解又は懸濁して添加する場合、脱水縮合剤やＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）やシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステルやＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体を含む溶液は、反応溶媒（混合溶媒）の一部を構成する。

【0241】

上記脱水縮合剤の好ましい態様、上記Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エステル又はＮ－炭化水素置換イミダゾール誘導体の好ましい態様、上記親水性有機溶媒の好ましい態様は、任意に組み合わせることができる。例えば、ＤＭＴ－ＭＭとＤＭＳＯとの組合せ、ＨＡＴＵとＤＭＳＯとの組合せ、ＨＡＴＵとＤＭＦとの組合せ、ＥＤＣＩ塩酸塩とＨＯＡｔとＤＭＳＯとの組み合わせ、ＥＤＣＩ塩酸塩とシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチルとＤＭＳＯとの組み合わせ、２－クロロ－１－メチルピリジニウムヨージドとＨＯＡｔとＤＭＳＯとの組み合わせ、クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートとＨＯＡｔとＤＭＳＯとの組み合わせ、クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートとＮ－メチルイミダゾールとＤＭＳＯとの組み合わせが挙げられ、特に好ましい組み合わせの態様は、ＨＡＴＵとＤＭＳＯとの組合せ、ＨＡＴＵとＤＭＦとの組合せ、ＥＤＣＩ塩酸塩とＨＯＡｔとＤＭＳＯとの組み合わせ、クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートとＨＯＡｔとＤＭＳＯとの組み合わせが挙げられる。

【0242】

反応溶媒（混合溶媒）のｐＨは適宜調整することができるが、６．５～７．５であることが好ましく、６．９～７．５であることがより好ましく、例えば６．５～７．０、６．９～７．１、又は７．０～７．５である。

【0243】

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の反応（アミド化反応）に用いる時間は、適宜設定することができるが、典型的には１時間以上、例えば、１～４８時間、又は１～２４時間であってよい。

【0244】

一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、等モル量で混合してもよい。本発明において「等モル量で混合する」とは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、１：１．１～１．１：１のモル比で混合することを意味する。アミド化反応液（反応溶媒）中で形成された本発明に係る遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、当業者に公知の方法により、精製することができる。精製技術としては、逆相クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、ゲル濾過、カラム精製、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）など、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0245】

特許文献２に記載の方法では、ごく短鎖のうちに伸長反応が停止したことによる短鎖核酸不純物や欠損体などの核酸不純物の生成により、反応液中の目的産物の純度の低下が起こる。一方、本発明の方法は、核酸不純物を低減できる点で有利である。好ましい実施形態では、本発明の方法は、核酸不純物の生成を低減しつつ、汎用型ＲＮＡアミダイトを使用して安定性の高い遺伝子発現抑制性一本鎖ＲＮＡ分子を製造することができる。

【0246】

本発明の方法により製造されたヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、常法により、生体内又は細胞内に投与することにより、標的遺伝子の発現を抑制するために用いることができる。

【0247】

なお、本発明における上記の好ましい態様、例えば、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子、緩衝液、有機溶媒、脱水縮合剤、ｐＨ、有機溶媒の比率、反応時間、使用量、その他の反応条件などは、任意に組み合わせることができる。

【0248】

本発明は、本発明の方法に従ってヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造のために第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子として用いることができる、一本鎖オリゴＲＮＡ分子を提供する。

【0249】

一実施形態では、標的遺伝子であるＴＧＦ－β１遺伝子又はＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造に用いる一本鎖オリゴＲＮＡ分子の例として、下記（ａ）又は（ｂ）が挙げられるが、これらに限定されない：
（ａ）１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｂ）１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子。

【0250】

さらに本発明は、本発明に係る一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ（ペア）を含む、標的遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットにも関する。そのようなキットは、本発明に係る標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法を実施するために、好適に用いることができる。

【0251】

一実施形態では、キットの例として、以下の（１）又は（２）に記載の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＴＧＦ－β１遺伝子又はＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットが挙げられるが、これらに限定されない：
（１）２４番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^１と連結されている配列番号２で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号３で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ、
（２）２２番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^１と連結されている配列番号５で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１番目のリボヌクレオチド残基がＬｘ^２と連結され、２６番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がＬｙを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ。

【実施例】

【0252】

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【0253】

（参考例１）
プロリンジアミド型アミダイトの合成
プロリンジアミド型アミダイトは、例えば、国際公開ＷＯ２０１２／０１７９１９の記載に従って合成することができる。具体的な合成例を以下に示すが、合成方法はそれにより限定されない。

【0254】

【化36】

【0255】

（１）Ｆｍｏｃ－ヒドロキシアミド－Ｌ－プロリン（化合物１）
Ｆｍｏｃ－Ｌ－プロリン（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４－アミノ－１－ブタノール（３．１８ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、その混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。得られた混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状物質としてＦｍｏｃ－ヒドロキシアミド－Ｌ－プロリンが得られた。Ｆｍｏｃは、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。

【0256】

（２）ＤＭＴｒ－アミド－Ｌ－プロリン（化合物２）
Ｆｍｏｃ－ヒドロキシアミド－Ｌ－プロリン（７．８０ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（８．２０ｇ、２４．２０ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（３９ｍＬ）を加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（７．８ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（１５０ｍＬ）で洗浄後、有機層を分離した。この有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３９ｍＬ）及びピペリジン（１８．７ｍＬ、１８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、その混合液から、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ－３００、展開溶媒 ジクロロメタン：メタノール＝９：１、０．０５％ピリジン含有）に供することにより、淡黄色油状物質としてＤＭＴｒ－アミド－Ｌ－プロリンが得られた。ＤＭＴｒは、４，４’－ジメトキシトリチル基である。

【0257】

（３）ＤＭＴｒ－ヒドロキシジアミド－Ｌ－プロリン（化合物３）
得られたＤＭＴｒ－アミド－Ｌ－プロリン（６．０１ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド（２．８３ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．４７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４．４７ｇ、４４．２１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６－ヒドロキシヘキサン酸（１．９５ｇ、１４．４７ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、１時間撹拌した。得られた混合液をジクロロメタン（６００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（８００ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状物質としてＤＭＴｒ－ヒドロキシジアミド－Ｌ－プロリンが得られた。

【0258】

（４）ＤＭＴｒ－ジアミド－Ｌ－プロリンアミダイト（化合物４）
得られたＤＭＴｒ－ヒドロキシジアミド－Ｌ－プロリン（８．５５ｇ、１４．１８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２．９１ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。その混合物に対し、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、さらに、２－シアノエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５.１３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。得られた混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水（２００ｍＬ）で３回洗浄した後、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝１：３、０．０５％ピリジン含有）に供することにより、無色シロップ状物質としてＤＭＴｒ－ジアミド－Ｌ－プロリンアミダイトが得られた。

【0259】

（実施例１）
１．プロリンエステル型アミダイトの合成（シアノエチル保護）

【0260】

【化37】

【0261】

（１）Ｂｏｃ－Ｌ－プロリン－シアノエチルエステル（化合物５）
Ｂｏｃ－Ｌ－プロリン（１０．００ｇ、４６．４６ｍｍｏｌ）、２－シアノエタノール（３．９６ｇ、５５.７５ｍｍｏｌ）を混合し、その混合物に対し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）を室温で加え、氷浴にて冷却した。Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（９．８０ｇ、５１．１０ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（１．１２ｇ、９．２９ｍｍｏｌ）を添加した後、氷浴を外し、アルゴン雰囲気下、室温で３時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝１９：１）に供することにより、油状物質としてＢｏｃ－Ｌ－プロリン－シアノエチルエステル（１２．４７ｇ、収率１００％）を得た。Ｂｏｃは、ブトキシカルボニル基である。

【0262】

（２）Ｎ－アミド－Ｌ－プロリン－シアノエチルエステル（化合物６）
Ｂｏｃ－Ｌ－プロリン－シアノエチルエステル（１２．４７ｇ、４６．４６ｍｍｏｌ）をジオキサン（２９ｍＬ）と混合した。得られた混合物に４Ｍ塩化水素ジオキサン溶液（４４ｍＬ）を加え、この混合物を室温で２時間撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、ジクロロメタン（９０ｍＬ）を加えた。この混合物に６－ヒドロキシヘキサン酸（８．０９ｇ、６１．２０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（９．４０ｇ、９２．９１ｍｍｏｌ）を加え、氷浴にて冷却した。ＥＤＣＩ塩酸塩（９．８０ｇ、５１．１０ｍｍｏｌ）を添加した後、氷浴を外し、室温で４時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝９：１）に供することにより、油状物質としてＮ－アミド－Ｌ－プロリン－シアノエチルエステル（１０．１６ｇ、収率７７％）を得た。

【0263】

（３）シアノエチル－Ｌ－プロリンアミダイト（化合物７）
得られたＮ－アミド－Ｌ－プロリン－シアノエチルエステル（５．００ｇ、１７．７１ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（４０ｍＬ）と混合し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。その混合物に対し、テトラゾール（１．４９ｇ、２１．２５ｍｍｏｌ）とジイソプロピルアミン（２．１５ｇ、２１．２５ｍｍｏｌ）を加え、さらに２－シアノエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（６．４１ｇ、２１．２５ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１０ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で３時間撹拌した。得られた混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝１：４）に供することにより、油状物質としてシアノエチル－Ｌ－プロリンアミダイト（７．０３ｇ、収率８２％）を得た。

【0264】

２．プロリンエステル型アミダイトの合成（２，４－ジメトキシベンジル保護）

【0265】

【化38】

【0266】

（１）Ｆｍｏｃ－Ｌ－プロリン－（２，４－ジメトキシ）ベンジルエステル（化合物８）
Ｆｍｏｃ－Ｌ－プロリン（１２．０４ｇ、３５．６７ｍｍｏｌ）、２，４－ジメトキシベンジルアルコール（５．００ｇ、２９.７３ｍｍｏｌ）を混合し、その混合物に対し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）を室温で加えた。ＥＤＣＩ塩酸塩（６．８４ｇ、３５．６７ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（０．３６ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で３時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）に供することにより、Ｆｍｏｃ－Ｌ－プロリン－（２，４－ジメトキシ）ベンジルエステル（１３．２４ｇ、収率９１％）を得た。Ｆｍｏｃは、フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。

【0267】

（２）Ｌ－プロリン－（２，４－ジメトキシ）ベンジルエステル（化合物９）
Ｆｍｏｃ－Ｌ－プロリン－（２，４－ジメトキシ）ベンジルエステル（１３．２４ｇ、２７．１６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１３０ｍＬ）と混合した。得られた混合物にジアザビシクロウンデセン（４．９６ｇ、３２．５９ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を室温で１時間撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝９：１）に供することにより、油状物質としてＬ－プロリン－（２，４－ジメトキシ）ベンジルエステル（６．３９ｇ、収率８９％）を得た。

【0268】

（３）Ｎ－アミド－Ｌ－プロリン－（２，４－ジメトキシ）ベンジルエステル（化合物１０）
Ｌ－プロリン－（２，４－ジメトキシ）ベンジルエステル（６．３９ｇ、２４．０９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１２０ｍＬ）と混合した。この混合物に６－ヒドロキシヘキサン酸（３．８２ｇ、２８．９０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４．８７ｇ、４８．１７ｍｍｏｌ）を加えた。ＥＤＣＩ塩酸塩（５．５４ｇ、２８．９０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で１６時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 酢酸エチル：メタノール＝９：１）に供することにより、油状物質としてＮ－アミド－Ｌ－プロリン－（２，４－ジメトキシ）ベンジルエステル（５．２２ｇ、収率５７％）を得た。

【0269】

（４）（２，４－ジメトキシ）ベンジル－Ｌ－プロリンアミダイト（化合物１１）
Ｎ－アミド－Ｌ－プロリン－（２，４－ジメトキシ）ベンジルエステル（２．００ｇ、５．２７ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（２７ｍＬ）と混合し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。その混合物に対し、テトラゾール（０．４４ｇ、６．３２ｍｍｏｌ）とジイソプロピルアミン（０．６４ｇ、６．３２ｍｍｏｌ）を加え、さらに２－シアノエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．９１ｇ、６．３２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２３時間撹拌した。得られた混合物をクロロホルム（６０ｍＬ）で希釈し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（６０ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝１：４）に供することにより、油状物質として（２，４－ジメトキシ）ベンジル－Ｌ－プロリンアミダイト（２．２７ｇ、収率７４％）を得た。

【0270】

（参考例２）
グリシンジアミド型アミダイトの合成
グリシンジアミド型アミダイトは、例えば、国際公開ＷＯ２０１３／１０３１４６の記載に従って合成することができる。具体的な合成例を以下に示すが、合成方法はそれにより限定されない。

【0271】

【化39】

【0272】

（１）Ｆｍｏｃ－ヒドロキシアミド－グリシン（化合物１２）
Ｆｍｏｃ－グリシン（４．００ｇ、１３．４５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（３．３３ｇ、１６．１５ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（４．９４ｇ、３２．２９ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１００ｍＬ）に４－アミノブタノール（１．４４ｇ、１６．１５ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９５：５）に付し、Ｆｍｏｃ－ヒドロキシアミド－グリシン（４．３０ｇ、８７％）を得た。

【0273】

（２）Ｆｍｏｃ－ＤＭＴｒ－アミド－グリシン（化合物１３）
化合物１２（４．２０ｇ、１１．４０ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（５．８０ｇ、１７．１０ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（８０ｍＬ）を加え、室温下で終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（２０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。未精製のＦｍｏｃ－ＤＭＴｒ－アミド－グリシン（１１．４０ｇ）を得た。

【0274】

（３）ＤＭＴｒ－アミド－グリシン（化合物１４）
未精製の化合物１３（１１．４０ｇ、１６．９９ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４５ｍＬ）及びピペリジン（１１．７ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、ＤＭＴｒ－アミド－グリシン（４．９０ｇ、９６％、 ２ｓｔｅｐｓ）を得た。

【0275】

（４）ＤＭＴｒ－ヒドロキシジアミド－グリシン（化合物１５）
化合物１４（４．８０ｇ、１０．７０ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下で６－ヒドロキシヘキサン酸（１．７０ｇ、１２．８４ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２．４６ｇ、１２．８４ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（３．９３ｇ、２５．６９ｍｍｏｌ）、及び無水ジクロロメタン（６０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（３．９０ｇ、３８．５３ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、ＤＭＴｒ－ヒドロキシジアミド－グリシン（４．８０ｇ、８０％）を得た。

【0276】

（５）ＤＭＴｒ－ジアミド－グリシンアミダイト（化合物１６）
化合物１５（４．７０ｇ、８．３５ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。次に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１．７２ｇ、１０．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（５ｍＬ）を加えた。さらに、２－シアノエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３．０２ｇ、１０．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリルジクロロメタン混合溶液（１：１）（４ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ－ヘキサン－アセトン（３：２）＋０．１％トリエチルアミン）に残渣を付し、ＤＭＴｒ－ジアミド－グリシンアミダイト（４．５０ｇ、７１％、ＨＰＬＣ９８．２％）を得た。

【0277】

（実施例２）
グリシンエステル型アミダイトの合成（シアノエチル保護）

【0278】

【化40】

【0279】

（１）Ｂｏｃ－グリシン－シアノエチルエステル（化合物１７）
Ｂｏｃ－グリシン（５．００ｇ、２８．５４ｍｍｏｌ）、２－シアノエタノール（２．４０ｇ、３３.７６ｍｍｏｌ）を混合し、その混合物に対し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）を室温で加え、氷浴にて冷却した。Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（６．００ｇ、３１．３０ｍｍｏｌ）と４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．７０ｇ、５．７３ｍｍｏｌ）を添加した後、氷浴を外し、アルゴン雰囲気下、室温で３時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）に供することにより、Ｂｏｃ－グリシン－シアノエチルエステル（５．７０ｇ、収率８８％）を得た。

【0280】

（２）グリシン－シアノエチルエステル（化合物１８）
Ｂｏｃ－グリシン－シアノエチルエステル（２．８０ｇ、１２．２７ｍｍｏｌ）をジオキサン（７．５ｍＬ）と混合した。得られた混合物に４Ｍ塩化水素ジオキサン溶液（２０ｍＬ）を加え、この混合物を室温で３時間撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた白色の固体を酢酸エチルで洗浄した。真空乾燥し、グリシン－シアノエチルエステル（１．９０g）を得た。

【0281】

（３）６－(４,４’－ジメトキシトリチル)ヘキサン酸（化合物２１）
共沸乾燥した６－ヒドロキシヘキサン酸（１．２ｇ、９．０８ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１１３ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（３０ｍＬ）に４，４－ジメトキシトリチルクロリド（３．１ｇ、９．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温にて５時間撹拌した後、メタノール（５ｍＬ）を加えて３０分撹拌した。混合液を減圧濃縮した後、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。減圧乾燥し、未精製の６－（４,４’－ジメトキシトリチル）ヘキサン酸（６．２ｇ）を得た。

【0282】

（４）Ｎ－アミド－グリシン－シアノエチルエステル（化合物１９）
グリシン－シアノエチルエステル（０．８５ｇ、６．７０ｍｍｏｌ）をＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）に溶かした。この混合物に６－(４,４’－ジメトキシトリチル)ヘキサン酸（６．２ｇ）とトリエチルアミン（１．３５ｇ、１３．３４ｍｍｏｌ）を加え氷冷下で撹拌した。ＥＤＣ（２．５５ｇ、１３．３０ｍｍｏｌ）を添加した後、氷浴を外し室温で１５時間撹拌した。得られた混合液を減圧濃縮し、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、そして飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、０．０５％ピリジン含有）に供することにより、白色固体を得た（２．５０ｇ、収率６９％）。得られた白色固体（２．５０ｇ、４．５９ｍｍｏｌ）を８０％酢酸水溶液（３０ｍＬ）に加え、室温で３時間撹拌した。反応溶液を分液ロートに入れ、水層から脱保護した４，４－ジメトキシトリチル基が除去できるまでヘキサンにより洗浄した。水層にトルエンを加え、共沸を３回行った。真空乾燥することにより、白色固体としてＮ－アミド－グリシン－シアノエチルエステル（０．８０ｇ、収率７２％）を得た。

【0283】

（５）シアノエチル－グリシンアミダイト（化合物２０）
Ｎ－アミド－グリシン－シアノエチルエステル（０．８０ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルで２回共沸した。ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．６８ｇ、３．９７ｍｍoｌ）を加え、真空乾燥した。この混合物に無水アセトニトリル（３ｍＬ）を加えた。２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．２０ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で３時間撹拌した。得られた混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。油状物質としてシアノエチル－グリシンアミダイト（１．４ｇ）を得た。

【0284】

（実施例３）
後述の実施例４では、ＴＧＦ－β１遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子（以下、ｓｓＴｂＲＮＡとも称する。）を、その２つの分割フラグメントである、末端にアミノ基を有する第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（以下、ストランドＡ）と、末端にカルボキシル基を有する第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランドＢ）をアミド化反応により連結することで作製する（図１参照）。

【0285】

そこで本実施例では、Ｌｙ、Ｌｘ^１及びＬｘ^２が以下に示す構造のストランドＡ及びストランドＢ－１の合成を行った。

【0286】

【化41】

【0287】

ストランドＡ及びストランドＢ－１は、ホスホロアミダイト法により、核酸自動合成装置（ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して合成した。この合成には、ＲＮＡアミダイトとしてＴＢＤＭＳアミダイトを用いた。ストランドＢ－１の３’末端には、保護グアノシンを結合した核酸合成用ポリマービーズＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標；日東電工株式会社） ＨＬ ｒＧ（ｉｂｕ）を用い、Ｌｙの連結のために、特殊アミダイトとしてＤＭＴｒ－ジアミド－Ｌ－プロリンアミダイト（化合物４）を、Ｌｘ^２の連結のために、シアノエチル－Ｌ－プロリンアミダイト（化合物７）又は（２，４－ジメトキシ）ベンジル－Ｌ－プロリンアミダイト（化合物１１）を用いた。また、ストランドＡの３’末端には、３’－ＰＴ Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ４ ＣＰＧ（化合物名：Ｎ－（４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）－ブチル）－（２－カルボキシアミド）－フタルイミジル－ｌｃａａ－ＣＰＧ；Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。核酸の固相合成及び合成後の脱保護反応は常法に従い行った。ここで、シアノエチル基の脱保護は固相担体からの切り出し時に行われる。（２，４－ジメトキシ）ベンジル基の脱保護は合成終了後の固相担体を３％トリクロロ酢酸／トルエン溶液中で１時間静置した後、溶液を除去することで行った。化合物７又は化合物１１のいずれを用いた場合でも同じストランドＢ－１が得られる。

【0288】

核酸合成後の反応溶液に塩化ナトリウム水溶液と２－プロパノールを加えて遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿物を注射用水に溶解させ、逆相クロマトグラフィー（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３，ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；移動相Ａ ：５０ｍＭ ＴＥＡＢ緩衝液，５％アセトニトリル；移動相Ｂ：５０ｍＭ ＴＥＡＢ緩衝液，５０％アセトニトリル）にて精製した。目的のフラクションに塩化ナトリウム水溶液とエタノールを加えて遠心分離し、沈殿物を回収した。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した。回収された目的物は、３’末端に、アミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^１を有するストランドＡと、５’末端に、カルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^２を有するストランドＢ－１である。ストランドＢ－１のＬｙ及びＬｘ^２はピロリジン骨格を有している。

【0289】

下記実施例において、ストランドＡの末端のアミノ基と、ストランドＢ－１の末端のカルボキシル基をアミド結合により連結し、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＴｂＲＮＡ）を作製する。

【0290】

（実施例４）
実施例３で合成したストランドＡ及びストランドＢ－１を用い、下記の操作Ａ～Ｃのいずれかの方法を用いて各種反応条件下でアミド化反応を行い、ストランドＡ及びストランドＢ－１を連結し、反応収率をＨＰＬＣ分析にて決定した。
・操作Ａ：ストランドＡの５．３ｍＭ水溶液３８０μＬとストランドＢ－１の５．６ｍＭ水溶液３６０μＬを混合し、水を加えて２ｍＬに定容した溶液から、３０μＬを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の０．４Ｍ水溶液を加え、室温で撹拌した。
・操作Ｂ：ストランドＡの５．３ｍＭ水溶液３８０μＬとストランドＢ－１の５．６ｍＭ水溶液３６０μＬを混合し、水を加えて２ｍＬに定容した溶液から、３０μＬを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の０．４Ｍ有機溶媒溶液を加え、室温で撹拌した。なおこの脱水縮合剤溶液は、それと混合した有機溶媒（下記表に記載）と同じ種類の有機溶媒を用いて調製した。
・操作Ｃ：ストランドＡの５．３ｍＭ水溶液３８０μＬとストランドＢ－１の５．６ｍＭ水溶液３６０μＬを混合し、水を加えて２ｍＬに定容した溶液から、３０μＬを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、脱水縮合剤を固体として加え、室温で撹拌した。
・操作Ｄ：ストランドＡの４．８ｍＭ水溶液１７０μＬとストランドＢ－１の４．８ｍＭ水溶液１７０μＬを混合し、水を加えて１ｍＬに定容した溶液から、３８μＬを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶液を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の０．４Ｍ有機溶媒溶液を加え、室温で撹拌した。なおこの脱水縮合剤溶液は、それと混合した有機溶媒（下記表に記載）と同じ種類の有機溶媒を用いて調製した。
・操作Ｅ：ストランドＡの４．８ｍＭ水溶液１７０μＬとストランドＢ－１の４．８ｍＭ水溶液１７０μＬを混合し、水を加えて１ｍＬに定容した溶液から、３８μＬを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶液を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、脱水縮合剤を固体として加え、室温で撹拌した。
・操作Ｆ：ストランドＡの４．８ｍＭ水溶液１７０μＬとストランドＢ－１の４．８ｍＭ水溶液１７０μＬを混合し、水を加えて１ｍＬに定容した溶液から、３８μＬを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶液を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の１．６Ｍ有機溶媒溶液を加え、室温で撹拌した。なおこの脱水縮合剤溶液は、それと混合した有機溶媒（下記表に記載）と同じ種類の有機溶媒を用いて調製した。
・操作Ｇ：ストランドＡの４．８ｍＭ水溶液１７０μＬとストランドＢ－１の４．８ｍＭ水溶液１７０μＬを混合し、水を加えて１ｍＬに定容した溶液から、３８μＬを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶液を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の０．２Ｍ溶液（注射用水とアセトニトリルの体積比にて１：１の混合溶液）を加え、室温で撹拌した。

【0291】

脱水縮合剤の添加から１、３、５、８、及び２３時間後にサンプリングを行い、反応液のＨＰＬＣ分析を行い、反応収率を決定した。ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
・カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）４．６×５０ｍｍ、２．５μｍ
・カラム温度：６０℃
・移動相Ａ：２００ｍＭ ＴＥＡＡ水溶液（ｐＨ７．０）／アセトニトリル＝９５／５
・移動相Ｂ：２００ｍＭ ＴＥＡＡ水溶液（ｐＨ７．０）／アセトニトリル＝５０／５０
・展開条件：Ａ／Ｂ＝１００／０（０－３ｍｉｎ）、１００／０→７０／３０（３－２３ｍｉｎ、リニアグラジエント）、７０／３０（２３－３３ｍｉｎ）、７０／３０→１００／０（３３－３３．１ｍｉｎ、リニアグラジエント）、１００／０（３３．１－４５ｍｉｎ）
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・検出：ＰＤＡ検出器（２５４ｎｍ）
・注入量：１０μＬ

【0292】

反応収率（％）は、ＨＰＬＣ解析結果に基づき、以下の式で算出した。
反応収率（％）＝（ｓｓＴｂＲＮＡのピーク面積）／（クロマトグラム中の総ピーク面積）×１００

【0293】

１）脱水縮合剤の検討
脱水縮合剤を検討するために、上記の方法により、試験例１～４、２１～３２及び比較例１～９、１２～２２についてアミド化反応を行った。試験例１～４、２１～３２及び比較例１～９、１２～２２における、操作、添加した緩衝液の種類及び添加量、添加した有機溶媒の種類及び添加量、並びに添加した脱水縮合剤の種類及び添加量を表１、表２、及び表３に示す。

【0294】

【表1】

【0295】

ＭＯＰＳ、ＤＭＴ－ＭＭ、ＨＡＴＵ、ＥＤＣＩ、ＨＯＡｔの意味については上述している。

【0296】

ＨＢＴＵは、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートである。ＴＳＴＵは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレートである。ＴＦＦＨは、フルオロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートである。ＣＯＭＵ（登録商標；Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）は、１－［（１－（シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノ）］ウロニウムヘキサフルオロホスファートである。ＰｙＢＯＰは、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファートである。ＤＰＰＡは、ジフェニルホスホリルアジドである。ＣＤＩはカルボニルジイミダゾールである。

【0297】

【表2】

【0298】

ＨＣＴＵは、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートである。ＴＰＴＵは、Ｏ－（１，２－ジヒドロ－２－オキソ－１－ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートである。ＴＤＢＴＵは、Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートである。ＨＯＢｔは、１－ヒドロキシベンゾトリアゾールである。ＨＯＰＯは、２－ヒドロキシピリジン－Ｎ－オキシドである。ＴＣＦＨは、クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートである。ＮＭＩは、Ｎ－メチルイミダゾールである。化合物２２は、１－ヒドロキシ－１，２，３－トリアゾール－４－カルボン酸エチルである。化合物２３は、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチルである。化合物２４は、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジンである。化合物２５は、４－（ジメチルアミノ）ピリジン－Ｎ－オキシドである。化合物２６は、２－クロロ－１－メチルピリジニウムヨージドである。

【0299】

【表3】

【0300】

ＨＯＴＴは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｓ－（１－オキシド－２－ピリジル）チオウロニウムヘキサフルオロホスファートである。ＤＥＰＢＴはリン酸ジエチル３，４－ジヒドロ―４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン－３－イルである。ＤＭＡＰは４－ジメチルアミノピリジンである。ＤＩＣはジイソプロピルカルボジイミドである。化合物２７は３－ニトロ－１－トシル－１，２，４－トリアゾールである。化合物２８はＮ－ｔｅｒｔ－ブチル－５－メチルイソオキサゾリウムパークロレートである。化合物２９は２，４，６－トリプロピル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリホスホリナンである。

【0301】

表４、表５、及び表６に脱水縮合剤による反応性の違いを示す。

【0302】

【表4】

【0303】

表４に示されるように、脱水縮合剤としてＤＭＴ－ＭＭ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、又はＥＤＣＩ塩酸塩とＨＯＡｔとを組み合わせて使用した場合に高い収率が得られた（試験例１～４）一方、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵと同じベンゾトリアゾリル構造を含む脱水縮合剤であっても、ＰｙＢＯＰ等のホスホニウム型脱水縮合剤では高い収率は得られなかった（比較例５）。また、ウロニウム型脱水縮合剤においても、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含まないＴＳＴＵ、ＴＦＦＨ、ＣＯＭＵ（登録商標；Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）では高い収率は得られなかった（比較例２～４）。

【0304】

【表5】

【0305】

また表５に示されるように、脱水縮合剤としてＨＣＴＵ、ＴＰＴＵ又はＴＤＢＴＵ単独の場合、ＥＤＣＩ塩酸塩と、ＨＯＢｔ、化合物２２、ＨＯＰＯ、化合物２３、化合物２４若しくは化合物２５とを組み合わせた場合、ＴＣＦＨと、ＨＯＡｔ若しくはＮＭＩとを組み合わせた場合、又は、化合物２６とＨＯＡｔとを組み合わせた場合に高い収率が得られた（試験例２１～３２）。

【0306】

【表6】

【0307】

表６に示されるように緩衝液の代わりに注射用水を使ったところ、収率が低くなる結果が得られた（比較例２１、２２）。

【0308】

以上の結果から、Ｎ－ヒドロキシ含窒素芳香環構造（例えば１－ヒドロキシベンゾトリアゾール構造）を含むウロニウム型脱水縮合剤（例えばベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤）又はＥＤＣＩ塩酸塩とＮ－ヒドロキシ含窒素芳香族化合物とを組み合わせた場合において高い収率が得られることが示された。一方、脱水縮合剤としてＤＰＰＡやＣＤＩを用いた場合では、それぞれ単独又はＨＯＡｔと組み合わせても高い収率は得られなかった（比較例６～９）。

【0309】

２）トリアジン型脱水縮合剤を用いたアミド化反応
トリアジン型脱水縮合剤を用いたアミド化反応の反応条件を検討するために、ＤＭＴ－ＭＭを脱水縮合剤に用いて上記の方法により、試験例１、５～１４及び比較例１０のアミド化反応を行った。試験例１、５～１４及び比較例１０における、操作、添加した緩衝液の種類及び添加量、添加した有機溶媒の種類及び添加量並びに脱水縮合剤の種類及び添加量を表７に示す。

【0310】

【表7】

【0311】

表８～１０に有機溶媒の添加効果、有機溶媒比率の影響、緩衝液ｐＨの影響について示す。表中の有機溶媒比率は、アミド化に使用した脱水縮合剤溶液に含まれる有機溶媒の量も、有機溶媒の合計量に含めて算出した。

【0312】

【表8】

【0313】

表８に示されるように、有機溶媒を添加しない場合（比較例１０）と比べて、有機溶媒の添加により目的物の収率が向上する結果が得られた。特にＤＭＳＯを添加した場合に高い効果が得られた（試験例１）。

【0314】

【表9】

【0315】

表９に示されるように、ＤＭＳＯの比率を溶媒全体の３５～６０体積％としたとき、目的物が高い収率で得られた（試験例１、９～１１）。

【0316】

【表10】

【0317】

表１０に示されるように、ｐＨ６．５～７．５の範囲で特に高い収率が得られた。ｐＨが６．０まで低下すると、反応速度の低下により収率が低くなる傾向が見られた。

【0318】

３）ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤を用いたアミド化反応
ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤を用いたアミド化反応の反応条件を検討するために、ＨＡＴＵを脱水縮合剤に用いて、上記の方法により、試験例２、１５～２０、３３～３８及び比較例１１についてアミド化反応を行った。試験例２、１５～２０、３３～３８及び比較例１１における、操作、添加した緩衝液の種類及び添加量、添加した有機溶媒の種類及び添加量並びに添加した脱水縮合剤の種類及び添加量を表１１に示す。

【0319】

【表11】

【0320】

表１２、１３に有機溶媒の添加効果、有機溶媒比率の影響について示す。

【0321】

【表12】

【0322】

表１２に示されるように、有機溶媒を添加しない場合（比較例１１）と比べて、有機溶媒の添加により目的物の収率が向上する結果が得られた（試験例２、１６～２０、３８）。特に非プロトン性の親水性有機溶媒を添加した場合に高い効果が得られた。

【0323】

【表13】

【0324】

表１３に示されるように、ＤＭＳＯの比率を溶媒全体の２０～６５体積％としたとき、目的物が高い収率で得られた（試験例２、１５、３３、３４）。また、ＤＭＦ、ＤＭＥＵ、アセトニトリルの比率を溶媒全体の５０～６５体積％としたときも、目的物が高い収率で得られた（試験例１６，１７，１９、３５～３７）。

【0325】

（実施例５）
ｓｓＴｂＲＮＡの単離精製
１）ＤＭＴ－ＭＭを用いたアミド化反応
ストランドＡ水溶液及びストランドＢ－１水溶液より各１μｍｏｌを測り取って混合し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液を８０μＬ添加して溶解させ、溶液を９５℃まで加熱後、室温まで放冷した。１Ｍ ＤＭＴ－ＭＭ水溶液を８０μＬ、ＤＭＳＯを１００μＬ添加し撹拌後、室温にて６時間静置した。上記反応溶液に２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を２０μＬと、エタノール８００μＬを加えて撹拌し、－３０℃にて静置後遠心分離し、上清を除去し、取得した沈殿物を乾燥させた。沈殿物を注射用水に溶解させ、強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＮＡＰａｃ ＰＡ１００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；移動相Ａ：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、１０％アセトニトリル；移動相Ｂ：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、１０％アセトニトリル, ７００ｍＭ ＮａＣｌＯ_４）にて精製し、目的物を分取した。目的のフラクションをエタノール沈殿にて回収し、白色固体１１．７ｍｇ（ＲＰ－ＨＰＬＣ純度：９０％、収率：６９％）を得た。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した。

【0326】

２）ＨＡＴＵを用いたアミド化反応
ストランドＡ水溶液及びストランドＢ－１水溶液より各１μｍｏｌを測り取って混合し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液を１００μＬ添加して溶解させ、溶液を９５℃まで加熱後、室温まで放冷した。ＨＡＴＵの０．２Ｍ ＤＭＳＯ溶液を１００μＬ添加し撹拌後、室温にて４時間静置した。上記反応溶液に２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を２０μＬと、エタノール８００μＬを加えて撹拌し、－３０℃にて静置後遠心分離し、上清を除去し、取得した沈殿物を乾燥させた。沈殿物を注射用水に溶解させ、強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＮＡＰａｃ ＰＡ１００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；移動相Ａ：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、１０％アセトニトリル；移動相Ｂ：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、１０％アセトニトリル，７００ｍＭ ＮａＣｌＯ_４）にて精製し、目的物を分取した。目的のフラクションをエタノール沈殿にて回収し、白色固体１４．１ｍｇ（ＡＥＸ－ＨＰＬＣ純度：９６％，収率８３％）を得た。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した。

【0327】

上記の方法で得られたｓｓＴｂＲＮＡの純度をＲＰ－ＵＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｕｌｔｒａ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；逆相超高速液体クロマトグラフィー）により分析し、特許文献２に記載のホスホロアミダイト法を用いた固相合成により合成したｓｓＴｂＲＮＡと比較した結果を表１４に示す。分析条件及び解析条件は下記の通りである。
分析条件：
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ １３０Å（Ｗａｔｅｒｓ）、２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ
・カラム温度：８０℃
・移動相Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡＡ・１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ７．３）
・移動相Ｂ：５０ｍＭ ＴＥＡＡ・１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液／メタノール＝２０／８０
・展開条件：Ａ／Ｂ＝１００／０→７５／２５（０－１０ｍｉｎ、リニアグラジエント）、７５／２５→０／１００（１０－１０．５ｍｉｎ、リニアグラジエント）、０／１００（１０．５－１５ｍｉｎ）、０／１００→１００／０（１５－１５．５ｍｉｎ、リニアグラジエント）
・流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
・検出：ＰＤＡ検出器（２６０ｎｍ）
・注入量：１０μＬ
解析条件：
・Ｗｉｄｔｈ：２ｓｅｃ
・Ｓｌｏｐｅ：４０００μＶ／ｍｉｎ
・Ｄｒｉｆｔ：０μＶ／ｍｉｎ
・Ｔ．ＤＢＬ：１０００ｍｉｎ
・最小面積：５００カウント

【0328】

【表14】

【0329】

表１４中、ストランドＡ、ストランドＢ－１及びｓｓＴｂＲＮＡ分子の値は、クロマトグラムに基づくそれぞれのピーク面積比率を表し、上記の解析条件を用いて算出した。また、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピーク付近の核酸（主としてｓｓＴｂＲＮＡ分子とその欠損体を含む）の相対量として、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピークを含む、ＲＲＴ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ；ここではｓｓＴｂＲＮＡ分子のピークの保持時間を１とした場合の相対保持時間）＝０．９８～１．０７の範囲についてピーク面積％の合計値を算出した。なおストランドＡとストランドＢ－１のピーク保持時間はｓｓＴｂＲＮＡ分子のピークとは十分に離れており、ＲＲＴ＝０．９８～１．０７の範囲には含まれない。

【0330】

表１４に示すように本発明の方法で合成したｓｓＴｂＲＮＡ分子に含まれる核酸不純物の量はわずかであり、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピーク付近に現れる欠損体（ｓｓＴｂＲＮＡ分子の配列の一部が欠けたもの）の量も少なかった。一方、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成により合成した場合（特許文献２）、ｓｓＴｂＲＮＡ分子以外の短鎖核酸不純物（合成が短鎖のうちに停止したＲＮＡ分子など）が比較的多く含まれており、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピーク付近に現れる欠損体も多かった。本発明の方法では、目的のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を高純度で製造できることが示された。

【0331】

（実施例６）
ＴＧＦ－β１遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の２つの分割フラグメントとして、Ｌｙ、Ｌｘ^１及びＬｘ^２が以下に示す構造のストランドＡ及びストランドＢ－２の合成を行った。

【0332】

【化42】

【0333】

ストランドＡ及びストランドＢ－２は、ホスホロアミダイト法により、核酸自動合成装置（ＡＢＩ３９００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して合成した。この合成には、ＲＮＡアミダイトとしてＴＢＤＭＳアミダイトを用いた。ストランドＢ－２の３’末端には、２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳ－グアノシン（Ｎ－ｉＢｕ）－３’－ｌｃａａ－ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、Ｌｙの連結のために、特殊アミダイトとしてＤＭＴｒ－ジアミド－Ｌ－プロリンアミダイト（化合物４）を、Ｌｘ^２の連結のために、シアノエチル－グリシンアミダイト（化合物２０）を用いた。また、ストランドＡの３’末端には、３’－ＰＴ Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ４ ＣＰＧ（化合物名：Ｎ－（４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）－ブチル）－（２－カルボキシアミド）－フタルイミジル－ｌｃａａ－ＣＰＧ；ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用いた。核酸の固相合成及び合成後の脱保護反応は常法に従い行った。

【0334】

各ストランドの脱保護反応終了後の反応溶液に塩化ナトリウム水溶液と２－プロパノールを加えて遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿物を注射用水に溶解させた。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した。回収された目的物は、３’末端にアミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^１を有するストランドＡ（質量分析測定値：７８１７．３、理論値：７８１６．８）と、５’末端にカルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^２を有するストランドＢ－２（質量分析測定値：９１９５．０、理論値：９１９４．６）である。

【0335】

ストランドＡ水溶液及びストランドＢ－２水溶液より各１００ｎｍｏｌを測り取って混合し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液を１０μＬ添加して溶解させ、溶液を９５℃まで加熱後、室温まで放冷した。ＨＡＴＵの０．２Ｍ ＤＭＳＯ溶液を１０μＬ添加し撹拌後、室温にて４時間静置した。上記反応溶液に２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を２μＬと、エタノール５０μＬを加えて撹拌し、－３０℃にて静置後遠心分離し、上清を除去し、取得した沈殿物を乾燥させた。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した（測定値：１６９９３．９、理論値１６９９３．３）。

【0336】

（実施例７）
ＴＧＦ－β１遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の２つの分割フラグメントとして、Ｌｙ、Ｌｘ^１及びＬｘ^２が以下に示す構造のストランドＡ及びストランドＢ－３の合成を行った。

【0337】

【化43】

【0338】

ストランドＡ及びストランドＢ－３は、ホスホロアミダイト法により、核酸自動合成装置（ＡＢＩ３９００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して合成した。この合成には、ＲＮＡアミダイトとしてＴＢＤＭＳアミダイトを用いた。ストランドＢ－３の３’末端には、２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳ－グアノシン（Ｎ－ｉＢｕ）－３’－ｌｃａａ－ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、Ｌｙの連結のために、特殊アミダイトとしてＤＭＴｒ－ジアミド－グリシンアミダイト（化合物１６）を、Ｌｘ^２の連結のために、シアノエチル－グリシンアミダイト（化合物２０）を用いた。また、ストランドＡの３’末端には、３’－ＰＴ Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ４ ＣＰＧ（化合物名：Ｎ－（４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）－ブチル）－（２－カルボキシアミド）－フタルイミジル－ｌｃａａ－ＣＰＧ；ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用いた。核酸の固相合成及び合成後の脱保護反応は常法に従い行った。

【0339】

各ストランドの脱保護反応終了後の反応溶液に塩化ナトリウム水溶液と２－プロパノールを加えて遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿物を注射用水に溶解させた。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した。回収された目的物は、３’末端にアミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^１を有するストランドＡ（質量分析測定値：７８１７．３、理論値：７８１６．８）と、５’末端にカルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^２を有するストランドＢ－３（質量分析測定値：９１５５．０、理論値：９１５４．５）である。

【0340】

ストランドＡ水溶液及びストランドＢ－３水溶液より各１００ｎｍｏｌを測り取って混合し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液を１０μＬ添加して溶解させ、溶液を９５℃まで加熱後、室温まで放冷した。ＨＡＴＵの０．２Ｍ ＤＭＳＯ溶液を１０μＬ添加し撹拌後、室温にて４時間静置した。上記反応溶液に２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を２μＬと、エタノール５０μＬを加えて撹拌し、－３０℃にて静置後遠心分離し、上清を除去し、取得した沈殿物を乾燥させた。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した（測定値：１６９５４．１、理論値：１６９５３．３）。

【0341】

（実施例８）
本実施例では、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、その２つの分割フラグメントである、末端にアミノ基を有する第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（以下、ストランドＣ）と、末端にカルボキシル基を有する第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランドＤ）をアミド化反応により連結することで作製した。

【0342】

まず、Ｌｙ、Ｌｘ^１及びＬｘ^２が以下に示す構造のストランドＣ及びストランドＤ－１の合成を行った。

【0343】

【化44】

【0344】

ストランドＣ及びストランドＤ－１は、ホスホロアミダイト法により、核酸自動合成装置（ＡＢＩ３９００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して合成した。この合成には、ＲＮＡアミダイトとしてＴＢＤＭＳアミダイトを用いた。ストランドＤ－１の３’末端には、２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳ－アデノシン（Ｎ－Ｂｚ）－３’－ｌｃａａ－ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、Ｌｙの連結のために、特殊アミダイトとしてＤＭＴｒ－ジアミド－Ｌ－プロリンアミダイト（化合物４）を、Ｌｘ^２の連結のために、シアノエチル－Ｌ－プロリンアミダイト（化合物７）を用いた。また、ストランドＣの３’末端には、３’－ＰＴ Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ４ ＣＰＧ（化合物名：Ｎ－（４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）－ブチル）－（２－カルボキシアミド）－フタルイミジル－ｌｃａａ－ＣＰＧ；ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用いた。核酸の固相合成及び合成後の脱保護反応は常法に従い行った。

【0345】

各ストランドの脱保護反応終了後の反応溶液に塩化ナトリウム水溶液と２－プロパノールを加えて遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿物を注射用水に溶解させた。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した。回収された目的物は、３’末端にアミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^１を有するストランドＣ（質量分析測定値：７２２２．９、理論値：７２２２．４）と、５’末端にカルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^２を有するストランドＤ－１（質量分析測定値：９８５３．５、理論値：９８５３．０）である。

【0346】

ストランドＣ水溶液及びストランドＤ－１水溶液より各１００ｎｍｏｌを測り取って混合し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液を１０μＬ添加して溶解させ、溶液を９５℃まで加熱後、室温まで放冷した。ＨＡＴＵの０．２Ｍ ＤＭＳＯ溶液を１０μＬ添加し撹拌後、室温にて４時間静置した。上記反応溶液に２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を２μＬと、エタノール５０μＬを加えて撹拌し、－３０℃にて静置後遠心分離し、上清を除去し、取得した沈殿物を乾燥させた。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した（測定値１７０５７．９、理論値：１７０５７．４）。

【0347】

（実施例９）
ＧＡＰＤＨ遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の２つの分割フラグメントとして、Ｌｙ、Ｌｘ^１及びＬｘ^２が以下に示す構造のストランドＣ及びストランドＤ－２の合成を行った。

【0348】

【化45】

【0349】

ストランドＣ及びストランドＤ－２は、ホスホロアミダイト法により、核酸自動合成装置（ＡＢＩ３９００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して合成した。この合成には、ＲＮＡアミダイトとしてＴＢＤＭＳアミダイトを用いた。ストランドＤ－２の３’末端には、２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳ－アデノシン（Ｎ－Ｂｚ）－３’－ｌｃａａ－ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、Ｌｙの連結のために、特殊アミダイトとしてＤＭＴｒ－ジアミド－グリシンアミダイト（化合物１６）を、Ｌｘ^２の連結のために、シアノエチルグリシンアミダイト（化合物２０）を用いた。また、ストランドＣの３’末端には、３’－ＰＴ Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ４ ＣＰＧ（化合物名：Ｎ－（４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）－ブチル）－（２－カルボキシアミド）－フタルイミジル－ｌｃａａ－ＣＰＧ；ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用いた。核酸の固相合成及び合成後の脱保護反応は常法に従い行った。

【0350】

各ストランドの脱保護反応終了後の反応溶液に塩化ナトリウム水溶液と２－プロパノールを加えて遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿物を注射用水に溶解させた。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した。回収された目的物は、３’末端にアミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^１を有するストランドＣ（質量分析測定値：７２２２．９、理論値：７２２２．４）と、５’末端にカルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーＬｘ^２を有するストランドＤ－２（質量分析測定値：９７７３．３、理論値：９７７２．９）である。

【0351】

ストランドＣ水溶液及びストランドＤ－２水溶液より各１００ｎｍｏｌを測り取って混合し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液を１０μＬ添加して溶解させ、溶液を９５℃まで加熱後、室温まで放冷した。ＨＡＴＵの０．２Ｍ ＤＭＳＯ溶液を１０μＬ添加し撹拌後、室温にて４時間静置した。上記反応溶液に２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を２μＬと、エタノール５０μＬを加えて撹拌し、－３０℃にて静置後遠心分離し、上清を除去し、取得した沈殿物を乾燥させた。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した（測定値：１６９７７．６、理論値１６９７７．３）。

【産業上の利用可能性】

【0352】

本発明は、標的遺伝子に対する発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の効率的な製造を可能にすることができる。

【配列表フリーテキスト】

【0353】

配列番号１～６：合成ＲＮＡ
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

【図1】

【図2】

【配列表】

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