特許 7406199 サルコペニア抑制食品の製造方法、サルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-19

(45)【発行日】2023-12-27

(54)【発明の名称】サルコペニア抑制食品の製造方法、サルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品

(51)【国際特許分類】

   A23B 7/155 20060101AFI20231220BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20231220BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20231220BHJP

   A23L 5/00 20160101ALI20231220BHJP

   A23L 19/00 20160101ALI20231220BHJP

【ＦＩ】

A23B7/155

A23L33/105

A23L33/135

A23L5/00 J

A23L19/00 A

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2023520364

(86)(22)【出願日】2022-06-30

(86)【国際出願番号】 JP2022026232

(87)【国際公開番号】W WO2023084839

(87)【国際公開日】2023-05-19

【審査請求日】2023-04-03

(31)【優先権主張番号】P 2021184844

(32)【優先日】2021-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】399015207

【氏名又は名称】株式会社 皇漢薬品研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】304020292

【氏名又は名称】国立大学法人徳島大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001807

【氏名又は名称】弁理士法人磯野国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】呉 明輝

(72)【発明者】

【氏名】宇都 義浩

【審査官】中島 芳人

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１９－１７０２５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０－１３２６２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４－０４９１５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－１８９５７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０２０－０２６４３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０３－２７７２４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００８－１７９６２０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｌ １９／

Ａ２３Ｌ ３３／

Ａ２３Ｌ ５／

Ａ２３Ｂ ７／

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｏｏｇｌｅ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

乳酸菌又はビフィズス菌の少なくとも一方を含む微生物群を用いたアメリカ人参の発酵により製造し、
前記微生物群は、
ビフィドバクテリウム ロンガム、
ビフィドバクテリウム ビフィダム、
ビフィドバクテリウム アドレッセンス、
ラクトバシラス アシドフィルス、
ラクトバシラス パラカゼイ、
ラクトバシラス ガツセリー、
ラクトバシラス デルブリッキ(ブルガリクス)、
ラクトバシラス ヘルベティカス、
ラクトバシラス カゼイ、
ラクトバシラス ラムノーシ、
ラクトバシラス デルブリッキ、
ストレプトコッカス サーモフィルス、
ラクトバシラス ブレビス、
ラクトバシラス ジェンセニー、
ラクトバシラス ラクティス、及び
エンテロコッカス フェシーム
を含み、
前記発酵は、複数種の微生物を含む前記微生物群による共生発酵である
ことを特徴とするサルコペニア抑制食品の製造方法。

【請求項2】

前記微生物群は、人の腸内で生育可能な乳酸菌又はビフィズス菌の少なくとも一方を含む
ことを特徴とする請求項１に記載のサルコペニア抑制食品の製造方法。

【請求項3】

前記発酵は３６時間以上１２０時間以下行われる
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のサルコペニア抑制食品の製造方法。

【請求項4】

乳酸菌又はビフィズス菌の少なくとも一方を含む微生物群を用いた発酵により得られたアメリカ人参の発酵物を含み、
前記微生物群は、
ビフィドバクテリウム ロンガム、
ビフィドバクテリウム ビフィダム、
ビフィドバクテリウム アドレッセンス、
ラクトバシラス アシドフィルス、
ラクトバシラス パラカゼイ、
ラクトバシラス ガツセリー、
ラクトバシラス デルブリッキ(ブルガリクス)、
ラクトバシラス ヘルベティカス、
ラクトバシラス カゼイ、
ラクトバシラス ラムノーシ、
ラクトバシラス デルブリッキ、
ストレプトコッカス サーモフィルス、
ラクトバシラス ブレビス、
ラクトバシラス ジェンセニー、
ラクトバシラス ラクティス、及び
エンテロコッカス フェシーム
を含み、
前記発酵は、複数種の微生物を含む前記微生物群による共生発酵である
ことを特徴とするサルコペニア抑制食品。

【請求項5】

乳酸菌又はビフィズス菌の少なくとも一方を含む微生物群を用いた発酵により得られたアメリカ人参の発酵物を含み、
前記微生物群は、
ビフィドバクテリウム ロンガム、
ビフィドバクテリウム ビフィダム、
ビフィドバクテリウム アドレッセンス、
ラクトバシラス アシドフィルス、
ラクトバシラス パラカゼイ、
ラクトバシラス ガツセリー、
ラクトバシラス デルブリッキ(ブルガリクス)、
ラクトバシラス ヘルベティカス、
ラクトバシラス カゼイ、
ラクトバシラス ラムノーシ、
ラクトバシラス デルブリッキ、
ストレプトコッカス サーモフィルス、
ラクトバシラス ブレビス、
ラクトバシラス ジェンセニー、
ラクトバシラス ラクティス、及び
エンテロコッカス フェシーム
を含み、
前記発酵は、複数種の微生物を含む前記微生物群による共生発酵である
ことを特徴とする筋肉増強食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、サルコペニア抑制食品の製造方法、サルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品に関する。

【背景技術】

【0002】

健康志向の高まりを受け、サルコペニアに対する関心が集まっている。サルコペニアは加齢等により筋肉量が減少する現象であり、サルコペニアにより、例えば高齢者の身体機能障害が発生する。サルコペニアに関する文献として、非特許文献１が知られている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【文献】井上愛子ら、老年医学の展望 サルコペニアの分子メカニズム、日本老年医学会雑誌２０１８年５５巻１号１３～２４頁、２０１８年１月２５日発行

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

非特許文献１に記載のように、サルコペニアは加齢等により進行し、骨格筋質量の顕著な減少を生じさせる。一方で、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）の低下が筋肉量減少を招くため、ＩＧＦ－１はサルコペニア抑制に使用できる可能性がある。しかし、ＩＧＦ－１は一般消費者が容易に入手できるものではない。このため、一般消費者が容易に入手可能な全く新しい技術が望まれている。
本開示が解決しようとする課題は、一般消費者が容易に入手可能なサルコペニア抑制食品の製造方法、サルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品の提供である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示のサルコペニア抑制食品の製造方法は、乳酸菌又はビフィズス菌の少なくとも一方を含む微生物群を用いたアメリカ人参の発酵により製造し、前記微生物群は、ビフィドバクテリウム ロンガム、ビフィドバクテリウム ビフィダム、ビフィドバクテリウム アドレッセンス、ラクトバシラス アシドフィルス、ラクトバシラス パラカゼイ、ラクトバシラス ガツセリー、ラクトバシラス デルブリッキ(ブルガリクス)、ラクトバシラス ヘルベティカス、ラクトバシラス カゼイ、ラクトバシラス ラムノーシ、ラクトバシラス デルブリッキ、ストレプトコッカス サーモフィルス、ラクトバシラス ブレビス、ラクトバシラス ジェンセニー、ラクトバシラス ラクティス、及びエンテロコッカス フェシームを含み、前記発酵は、複数種の微生物を含む前記微生物群による共生発酵であることを特徴とする。その他の解決手段は発明を実施するための形態において後記する。

【発明の効果】

【0006】

本開示によれば、一般消費者が容易に入手可能なサルコペニア抑制食品の製造方法、サルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】本開示のサルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品の製造方法を示すフローチャートである。

【図2】筋萎縮を説明するギムザ染色画像である。

【図3】筋萎縮抑制評価により得られた細胞横径を示すグラフである。

【図4】筋萎縮を説明するギムザ染色画像であり、発酵時間を変えた場合の結果である。

【図5】筋萎縮抑制効果を評価して得られた細胞横径を示すグラフであり、発酵時間を変えた場合の結果である。

【図6】Ｍｕｒｆ－１の発現量を示すグラフである。

【図7】Ａｔｒｏｇｉｎの発現量を示すグラフである。

【図8】マウスの体重変化を示すグラフである。

【図9】坐骨神経切除後の筋肉量変化を示すグラフである。

【図10】筋肉増強の評価結果を示す蛍光画像である。

【図11】筋肉増強の評価結果を示す筋肉量を示すグラフである。

【図12】筋肉分化マーカの発現量を示すグラフである。

【図13】試験１日目のマウスの体重を示すグラフである。

【図14】試験５８日目のマウスの体重を示すグラフである。

【図15】試験期間中のマウスの体重変化を示すグラフである。

【図16】握力の平均値についての経時変化を示すグラフである。

【図17】握力の平均値について、５８日目の結果を示すグラフである。

【図18】握力の最大値についての経時変化を示すグラフである。

【図19】握力の最大値について、５８日目の結果を示すグラフである。

【図20】前脛骨筋、長趾伸筋及び長腓骨筋の合計質量を示すグラフである。

【図21】腓腹筋及びヒラメ筋の合計質量を示すグラフである。

【図22】脂肪質量を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0008】

以下、図面を参照しながら本開示を実施するための形態（実施形態と称する）を説明する。以下の一の実施形態の説明の中で、適宜、一の実施形態に適用可能な別の実施形態の説明も行う。本開示は以下の一の実施形態に限られず、異なる実施形態同士を組み合わせたり、本開示の効果を著しく損なわない範囲で任意に変形したりできる。また、同じ部材については同じ符号を付すものとし、重複する説明は省略する。更に、同じ機能を有するものは同じ名称を付すものとする。図示の内容は、あくまで模式的なものであり、図示の都合上、本開示の効果を著しく損なわない範囲で実際の構成から変更したり、図面間で一部の部材の図示を省略したり変形したりすることがある。

【0009】

以下、本開示のサルコペニア抑制食品の製造方法及びサルコペニア抑制食品を説明する。なお、本開示の筋肉増強食品は、本開示のサルコペニア抑制食品と同様であり、本開示のサルコペニア抑制食品の製造方法と同様にして製造できる。従って、本開示の筋肉増強食品及びその製造方法については、本開示のサルコペニア抑制食品及びその製造方法に関する説明を適用でき、それらの詳細な説明は適宜省略する。

【0010】

図１は、本開示のサルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品の製造方法（以下、本開示の製造方法という）を示すフローチャートである。本開示の製造方法は、乳酸菌を用いたアメリカ人参の発酵によりサルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品を製造する方法であり、原料準備工程Ｓ１と、発酵工程Ｓ２と、性状調整工程Ｓ３とを含む。

【0011】

原料準備工程Ｓ１は、本開示の製造方法に使用される原料を準備する工程である。原料としては、アメリカ人参（ウィスコンシンジンセン。西洋人参。学名；Panax quinquefolius）が使用される。アメリカ人参を使用することで、筋萎縮を抑制できるとともに、筋肉量を増加できる。そして、これらの効果を奏することでサルコペニアを抑制できる。例えば、筋委縮が生じても筋肉量を増加させることで、筋肉量の減少を抑制して、サルコペニアを抑制できる。以下、サルコペニアの抑制は、筋肉増強の意味を含む。

【0012】

発酵工程Ｓ２は、乳酸菌又はビフィズス菌の少なくとも一方を含む微生物群を用いて、アメリカ人参を含む原料を発酵させる工程である。以下、単に「微生物群」というときは、特に断らない限り、ここでいう「微生物群」をいうものとする。発酵工程Ｓ２では、例えば、洗浄及び乾燥を経て粉末状に加工したアメリカ人参が使用される。粉末のアメリカ人参を使用することで、発酵効率を向上できる。ただし、粉末に限定されず、刻み、チップ、アメリカ人参そのままの乾燥物（乾燥原体）を発酵させてもよい。切断の程度としては、例えば、アメリカ人参を０．５ｃｍ～１ｃｍ×０．５ｃｍ～１ｃｍ程度の大きさに加工できる。また、発酵促進の観点から、例えば摩り下ろすことでペースト状に加工してもよい。

【0013】

アメリカ人参は、切断後そのままの状態で使用されてもよく、切断後乾燥してから使用してもよい。乾燥物の場合、発酵促進の観点から、粉末状であることが好ましい。

【0014】

アメリカ人参に加え、他の原料を併用してもよい。

【0015】

発酵工程Ｓ２は、微生物群を用いて、原料準備工程Ｓ１で準備したアメリカ人参を発酵させる工程である。微生物群は、発酵物にサルコペニア抑制効果を発揮できるものであれば任意であるが、人の腸内で生育可能な乳酸菌又はビフィズス菌の少なくとも一方を含むことが好ましい。このような細菌を使用することで、実際に食べたときの状況を再現させて、人の体外で発酵できる。

【0016】

また、微生物群は、
ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂロンガム）、
ビフィドバクテリウム ビフィダム（Ｂビフイダム）、
ビフィドバクテリウム アドレッセンス（Ｂアドレッセンス）、
ラクトバシラス アシドフィルス（Ｌアシドフィルス）、
ラクトバシラス パラカゼイ（Ｌパラカゼイ）、
ラクトバシラス ガツセリー（Ｌガツセリー）、
ラクトバシラス デルブリッキ(ブルガリクス)（Ｌデルブリッキ（ブルガリクス））、
ラクトバシラス ヘルベティカス（Ｌヘルベティカス）、
ラクトバシラス カゼイ（Ｌカゼイ）、
ラクトバシラス ラムノーシ（Ｌラムノーシ）、
ラクトバシラス デルブリッキ（Ｌデルブリッキ）、
ストレプトコッカス サーモフィルス（Ｓサーモフィルス）、
ラクトバシラス ブレビス（Ｌブレビス）、
ラクトバシラス ジェンセニー（Ｌジェンセニー）、
ラクトバシラス ラクティス（Ｌラクティス）、又は
エンテロコッカス フェシーム（Ｅフェシーム）
の少なくとも１種を含むことが好ましい。これらの微生物は、人の腸内で生育可能な乳酸菌（乳酸桿菌、乳酸構褻、乳酸球菌）及びビフィズス菌である。これらの微生物の少なくとも１種を含むことで、実際に食べたときの状況を再現させて、人の体外で発酵できる。ただし、微生物群は、これら少なくとも１種を含むことが好ましいが、必ずしもこれらに限定されない。

【0017】

好ましい微生物及びその学名を下記表１に示す。

【0018】

【表1】

【0019】

中でも、表１に示す微生物を全て含む微生物群を使用することが好ましい。即ち、微生物群は、
ビフィドバクテリウム ロンガム、
ビフィドバクテリウム ビフィダム、
ビフィドバクテリウム アドレッセンス、
ラクトバシラス アシドフィルス、
ラクトバシラス パラカゼイ、
ラクトバシラス ガツセリー、
ラクトバシラス デルブリッキ(ブルガリクス)、
ラクトバシラス ヘルベティカス、
ラクトバシラス カゼイ、
ラクトバシラス ラムノーシ、
ラクトバシラス デルブリッキ、
ストレプトコッカス サーモフィルス、
ラクトバシラス ブレビス、
ラクトバシラス ジェンセニー、
ラクトバシラス ラクティス、及び
エンテロコッカス フェシーム
を含み、微生物群による発酵は、複数種の微生物を含む微生物群による共生発酵であることが好ましい。表１に示した微生物は、人の腸内細菌叢を疑似的に再現した組合せであり、腸内での発酵のように予め疑似発酵させることにより、発酵生成物をより効率よく体内利用できる。ただし、発酵は、表１に示す微生物の組み合わせを使用することが好ましいが、必ずしもこの組み合わせに限定されない。

【0020】

発酵条件は、発酵物にサルコペニア抑制効果を持たせられれば特に制限はないが、発酵時間として、人が摂取した食品が通常体内（腸内）に留まり、腸内細菌により代謝される時間程度にすることが好ましい。具体的には例えば発酵は通常２４時間以上、好ましくは３６時間以上、より好ましくは４８時間以上、特に好ましくは６０時間以上、上限としては例えば１２０時間以下、好ましくは９６時間以下、より好ましくは８４時間以下、特に好ましくは７２時間以下で行われることが好ましい。発酵時間をこの範囲にすることで、腸内での発酵のように予め疑似発酵させることができ、発酵生成物をより効率よく体内利用できる。

【0021】

発酵温度は、微生物群の種類によって適宜変更すればよいが、人の腸内温度と同程度の温度程度にすることが好ましい。具体的には例えば、発酵温度は通常３５℃以上、好ましくは３６℃以上、より好ましくは３６．５℃以上、その上限として、通常は４２℃以下、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３８℃以下である。この温度にすることで、腸内での発酵のように予め疑似発酵させることができ、発酵生成物をより効率よく体内利用できる。

【0022】

発酵の雰囲気は、微生物群の種類によって適宜変更すればよいが、例えば嫌気性雰囲気にできる。

【0023】

発酵は、原料と微生物群との混合スラリーを用いて行うことができる。混合スラリーは、原料及び微生物群に加えて、更に、例えばブドウ糖、乳糖、オリゴ糖等の糖類を含有できる。

【0024】

性状調整工程Ｓ３は、発酵工程Ｓ２で得られた発酵物を、適宜所望の性状に調整する工程である。所望の性状とは、例えば性状が乾燥物であれば、例えばスラリーである発酵物を乾燥させればよい。乾燥は、例えば発酵物をそのまま乾燥させてもよいし、発酵物から例えばろ過により固定分を除去して得られた溶液を乾燥させてもよい。乾燥後、適宜所望の大きさに粉砕できる。

【0025】

本開示のサルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品は、微生物群を用いたアメリカ人参の発酵物を含む。サルコペア抑制効果は、本発明者の検討によれば、発酵物中の特定の成分のみによって奏されるものではなく、発酵物中の各成分が相互に作用しあう結果、奏されると考えられる。そこで、「発酵物」という表現が使用される。ただし、サルコペニア抑制効果を奏する発酵物は、上記発酵工程Ｓ２で得られたスラリーにおいて液相に含まれると考えられる。

【0026】

本開示のサルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品は、例えば高齢者を対象に使用できる。また、本開示のサルコペニア抑制食品は、筋委縮効果に加えて、筋肉量増強効果も奏する。このため、例えば健常人、アスリート、スポーツ関係者への使用も好適である。筋肉量増強効果に着目して、筋肉増強食品として手軽に経口摂取することもできる。さらには、本開示のサルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品は、筋肉から分泌されるマイオカイン等のホルモン物質への寄与も期待される。

【実施例】

【0027】

本開示の製造方法に沿って本開示のサルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品を製造し、筋萎縮抑制効果及び筋肉量増加効果を評価した。なお、図２０、図２１、及び図２２は、測定値をマウスの体重で割ることで、マウスの単位質量当たりの測定値として図示した。

【0028】

・サルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品の製造
＜実施例１＞
アメリカ人参を乾燥させて粉末状（粒径１０μｍ～１００μｍの混合物）に処理して、微生物発酵のための原料を調整した（原料準備工程Ｓ１）。次いで、ビフィドバクテリウム ロンガム、ビフィドバクテリウム ビフィダム、ビフィドバクテリウム アドレッセンス、ラクトバシラス アシドフィルス、ラクトバシラス パラカゼイ、ラクトバシラス ガツセリー、ラクトバシラス デルブリッキ(ブルガリクス)、ラクトバシラス ヘルベティカス、ラクトバシラス カゼイ、ラクトバシラス ラムノーシ、ラクトバシラス デルブリッキ、ストレプトコッカス サーモフィルス、ラクトバシラス ブレビス、ラクトバシラス ジェンセニー、ラクトバシラス ラクティス、及びエンテロコッカス フェシームを含む微生物群（上記表１に示す全ての微生物を含む微生物群）を使用し、原料を共生発酵させた（発酵工程Ｓ２）。共生発酵は、原料と乳酸菌との混合物を水中に懸濁し、スラリー状にしたものについて行った。発酵時間は２４時間、発酵温度は３７℃、発酵雰囲気は嫌気性とした。共生発酵によりスラリー状の発酵物を得た。得た発酵物について、ろ過を行って固形分を除去することで、本開示のサルコペニア抑制食品及び筋肉増強食品の液体（発酵液）を得た（性状調整工程Ｓ３）。

【0029】

＜実施例２＞
発酵工程Ｓ２で得た発酵物について、凍結乾燥及び粉砕を行って、本開示のサルコペニア抑制食品の粉末（粒径１０μｍ～１００μｍの混合物）を得た（性状調整工程Ｓ３）。

【0030】

＜比較例１＞
発酵工程Ｓ２を行わないこと以外は実施例２と同様にして、粉末を得た。

【0031】

＜比較例２＞
アメリカ人参に代えて高麗ニンジンを使用したこと以外が実施例１と同様にして液体（発酵液）を得た。

【0032】

・評価（筋萎縮抑制、細胞横径測定）
以下のようにして筋芽細胞を筋管細胞に分化させた後、デキサメタゾンで筋萎縮を誘導させた。デキサメタゾン添加時に、本開示のサルコペニア抑制食品を同時添加し、本開示のサルコペニア抑制食品による筋萎縮抑制を評価した。

【0033】

まず、細胞播種として、培養培地で２４穴プレートにＣ２Ｃ１２細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種した。次いで分化誘導として、２４時間後、分化培地に交換した。更に、２４時間後培地交換行い、その後更に４８時間後、培地交換を行った。分化を確認後、デキサメタゾン（１０μＭ）と、本開示のサルコペニア抑制食品又はＩＧＦ－１とを培地に添加した。本開示のサルコペニア抑制食品の添加量は、１μｇ又は１０μｇとした。

【0034】

添加して２４時間後、ギムザ染色を行った。ギムザ染色後、顕微鏡で細胞を撮影し、ＩｍａｇｅＪ（画像処理ソフトウェア）を用い画像中の筋管細胞の横径を測定した。筋芽細胞は細胞融合し筋管細胞へ分化をする。筋管細胞は、後記する画像（図２）中で核（濃い有色の球状の部分）を複数個含む有色の線状に伸びている部分である。そして、横径として、筋管細胞の最も太い箇所の横径を測定した。例えば後記の図２のブランク（Ｂ）の図でいえば、図示の３つの横径Ｌのうち、最も長い横径Ｌを測定した。

【0035】

図２は、筋萎縮を説明するギムザ染色画像である。上から、ブランク（Ｂ）、コントロール（Ｃ）、ＩＧＦ－１（１００μｇ）＋デキサメタゾン（Ｉ）を示す。Ｂは筋委縮させない筋管細胞、Ｃはデキサメタゾンの添加により筋委縮させた筋管細胞、Ｉは、デキサメタゾンによって筋委縮したものの、ＩＧＦ－１により筋萎縮が抑制された筋管細胞である。Ｃでは白部分が減少し、筋委縮していることがわかる。一方で、Ｂ及びＩでは、白い部分の面積が大きく、筋委縮が抑制されたことがわかる。横径の測定結果を表２に示す。

【0036】

【表2】

【0037】

図３は、筋萎縮抑制評価により得られた細胞横径を示すグラフである。ＢとＣとを比較すると、デキサメタゾンの添加による筋萎縮により、細胞横径が短くなった。しかし、Ｉに示すように、ＩＧＦ－１の添加により筋萎縮が抑制され、細胞横径がＣよりも長くなった。

【0038】

実施例１及び２に示すように、発酵液（実施例１）及び粉末（実施例２）のいずれを添加しても、Ｃよりも細胞横径が長くなった。これにより、本開示のサルコペニア抑制食品は筋萎縮を抑制（緩和）することが確認できた。特に、それぞれ１０μｇを添加した場合、ＩＧＦ－１を使用したＩの細胞横径に迫る長さとなり、抑制効果が大きいことが確認できた。

【0039】

一方で、比較例１及び２では、いずれもＣと同程度であった。なお、比較例１において１０μｇ添加した場合、１μｇ添加よりも細胞横径が長くなったが、１μｇと１０μｇとの項目間での測定誤差を考えると、ほとんど変化しなかったといえる。従って、発酵させたアメリカ人参によりはじめて筋委縮を抑制でき、発酵させない場合、及び、高麗ニンジンを使用した場合には、そのような効果が発揮されないことが確認できた。

【0040】

図４は、筋萎縮を説明するギムザ染色画像であり、添加量を１０μｇに固定して発酵時間を変えた場合の結果である。上から順に、実施例１において発酵時間を２４時間、７２時間、１２０時間に変えた場合の画像である。いずれの場合も、デキサメタゾンを含む。発酵時間が長いほど細胞横径が長くなるが、７２時間と１２０時間とでは同程度のように見える。横径の測定結果を表３に示す。

【0041】

【表3】

【0042】

図５は、筋萎縮抑制効果を評価して得られた細胞横径を示すグラフであり、発酵時間を変えた場合の結果である。上記の図４を参照して説明したように、発酵時間が長いほど細胞横径が長くなるが、ある程度長いと頭打ちになる傾向がある。例えば２４時間と７２時間とを比較すると、７２時間の方が細胞横径が長い。しかし、７２時間と１２０時間とを比較すると、Ｃよりは長いものの、１２０時間の細胞横径は、７２時間よりも短くなった。この結果は、発酵時間の長時間化により、意図しない反応が生じ、筋萎縮抑制効果が小さくなったためと考えられる。このため、発酵は３６時間以上１２０時間時間以下で行うことが好ましく、中でも、３６時間以上９６時間時間以下で行うことがより好ましいことがわかった。

【0043】

・評価（筋萎縮抑制、筋萎縮マーカの確認）
筋萎縮マーカの発現量を調べた。上記の「評価（筋萎縮抑制、細胞横径測定）」において、デキサメタゾン（１０μＭ）と本開示のサルコペニア抑制食品又はＩＧＦ－１とを添加して２４時間経過した後、細胞を回収した。添加量は１０μｇにした。回収した細胞について、筋萎縮マーカ（Ｍｕｒｆ－１、Ａｔｒｏｇｉｎ）の発現量を測定した。発現量を表４に示す。

【0044】

【表4】

【0045】

図６は、Ｍｕｒｆ－１の発現量を示すグラフである。また、図７は、Ａｔｒｏｇｉｎの発現量を示すグラフである。数値が大きいほど、筋萎縮関連遺伝子の発現が増加したことを示す。従って、数値が小さいことが好ましい。実施例１の発現量は、上記実施例１のサルコペニア抑制食品を培地に添加、比較例１の発現量は、上記比較例１のアメリカ人参（発酵せず）を培地に添加した結果である。

【0046】

図６及び図７の結果から、筋萎縮マーカの発現抑制により、本開示のサルコペニア抑制食品により筋萎縮を抑制できたことがわかった。

【0047】

・評価（筋萎縮抑制、萎縮量の測定）
以下の方法に沿ってモデルマウスの筋委縮を評価した。実験動物は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８周齢、雄）である。実験方法は、マウス片足の坐骨神経を切除し、筋委縮モデルを作成し、Ｓｈａｍとの筋肉湿質量を比較した。なお、Ｓｈａｍは偽手術を表し、坐骨神経を切除しない方の足に施される。坐骨神経切除の際にはマウスの下肢の筋肉を切り開いて神経の切除が行われる。もう一方の下肢でも筋肉を切り開き（神経は切らない）、切除群と同様のストレスを与えることで条件を揃えることを目的にＳｈａｍが行われる。

【0048】

投与群として、コントロール（Ｃ）は粉末試料のみ、実施例２は、粉末試料と実施例２のサルコペニア抑制食品（含有量３質量％）との混合粉末、比較例３は、粉末試料とアメリカ人参の乾燥粉末（含有量３質量％）との混合粉末である。マウスに対し、これらの粉末を経口摂取させた。試験スケジュールは、１週間の順化後、試料投与開始を１日目とし、１５日目坐骨神経切除、２５日目に筋肉採取を行った。筋肉採取は、前脛骨金、長趾伸筋、長腓骨筋を採取し、質量を測定した。

【0049】

図８は、マウスの体重変化を示すグラフである。白丸はコントロール（Ｃ）、白三角は比較例１、白四角は実施例２である。坐骨神経切除の前後において、どのマウスにおいて日数ととともに体重増加が認められた。

【0050】

図９は、坐骨神経切除後の筋肉量変化（即ち筋肉の萎縮）を示すグラフである。本試験では、マウスの右下肢をＳｈａｍ、左下肢に坐骨神経切除を行った。解剖時の左右の筋肉質量で比較して筋肉量変化は、筋肉質量をＳｈａｍ群で除算することで評価した。グラフは、Ｓｈａｍを１とする相対的な値で示した。グラフの算出に使用した測定結果を表５に示す。

【0051】

【表5】

【0052】

コントロールでは２９．９％萎縮（＝｛（０．０７７－０．０５４）／０．０７７｝×１００）、比較例１では２３．４％萎縮したのに対し、実施例２では２０．０％萎縮にとどまった。従って、本開示のサルコペニア抑制食品を摂取することで、手軽に筋萎縮を抑制できることが確認できた。

【0053】

・評価（蛍光画像に基づく筋肉増強評価）
筋肉の分化過程では、未分化な筋芽細胞が融合して、多核細胞である筋管細胞に分化し、さらに成熟した筋管細胞から収縮能を持つ筋繊維が形成され、筋肉が形成される。本試験では、本開示のサルコペニア抑制食品の添加による筋芽細胞から筋管細胞への分化能を評価した。分化能が大きいほど、筋肉が増強され易いといえる。

【0054】

まず、細胞播種として、培養培地で２４穴プレートにＣ２Ｃ１２細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種した。次いで分化誘導として、２４時間後、分化培地に交換し、ＩＧＦ－１、実施例１の発酵液、又は比較例４の抽出液（以下、これらを纏めて検体という）を添加した。ＩＧＦ－１の添加量は１００ｎｇ、実施例１の発酵液は、４８時間発酵させたもの（本開示のサルコペニア抑制食品）、比較例４の抽出液は、アメリカ人参の乾燥粉末の熱水抽出液である。更に、２４時間後、培地交換し、検体を１度目と同様に培地に添加した。更に、４８時間後、培地交換し、検体を１度目と同様に添加した。２４時間経過した後、免疫染色（ＭＨＣ，ＤＡＰＩ）を行い、蛍光顕微鏡で観察した。

【0055】

図１０は、筋肉増強の評価結果を示す蛍光画像である。図１０において、「コントロール」（Ｃ）は、本開示のサルコペニア抑制食品及びＩＧＦ－１の何れも添加しないもの、「ＩＧＦ－１」（Ｉ）は、ＩＧＦ－１を１００ｎｇ添加したものである。「未処理液（１０μｇ）」（比較例４）は、比較例４の抽出液を１０μｇ添加したもの、「発酵液（１０μｇ）」（実施例１）は、実施例１の発酵液を１０μｇ添加したものである。

【0056】

各図において、白色又は薄いグレーの部分（以下、白色等の部分という。蛍光画像における蛍光色の部分）の面積が大きいほど筋管が多く、筋肉が増強されたと判断できる。Ｃと比較例４とを比べると、白色等の部分は同じように分散している。一方で、Ｉに示すように、ＩＧＦ－１の添加により白色等の部分が増え、筋肉が増強されたことがわかる。実施例１に示すように、本開示のサルコペニア抑制食品を添加した場合、ＩほどではないがＣ及び比較例４よりも、白色等の部分が増えたことがわかる。

【0057】

図１１は、筋肉増強の評価結果を示す筋肉量を示すグラフである。下記表６に、測定された面積を示し、図１１は、表６をグラフ化したものである。

【0058】

【表6】

【0059】

実施例１及び比較例４は、それぞれ、１０μｇを添加した。比較例４は、測定誤差を考慮するとＣとほぼ同じであり、比較例４に筋肉増強効果は存在しないと判断できる。一方で、実施例１では、Ｉほどではないが、比較例４及びＩよりも有意に筋肉量に増加が認められた。従って、本開示のサルコペニア抑制食品及び本開示の筋肉増強食品には、筋肉増強効果が存在することが確認できた。

【0060】

・評価（筋肉増強効果、筋肉分化マーカの確認）
筋肉分化マーカ（ＭｙｏＤ）の発現量を測定した。培養培地で直径６０ｍｍシャーレに２．５×１０^５ｃｅｌｌｓずつ接種したこと以外は「・評価（蛍光画像に基づく筋肉増強評価）」と同様にして細胞播種及び分化誘導を行った。筋肉分化マーカの発現量測定は、ＲＴ－ＰＣＲを用いて行った。

【0061】

図１２は、筋肉分化マーカの発現量を示すグラフである。下記表７に、測定された発現量を示し、図１２は、表７をグラフ化したものである。数値が大きいほど、筋肉分化が進行したと判断できる。

【0062】

【表7】

【0063】

測定誤差を考慮すると、比較例４とＣとはほぼ同じであり、添加による分化マーカの増加は無かったと考えられる。しかし、実施例１の発酵液１０μｇの添加の場合、分化マーカの有意な増加が認められた。このため、上記の図１１の結果とともに、本開示のサルコペニア抑制食品及び本開示の筋肉増強食品には、筋肉増強効果が存在することが確認できた。

【0064】

・評価（別の筋肉増強の効果確認試験）
本開示の筋肉増強食品として、上記実施例２の粉末を準備した。実験動物としてＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２４匹用意し、８匹ずつにグループ分けした。それぞれのグループに対して、同じ粉末飼料を用いて、３質量％の割合で実施例２の粉末を混ぜた飼料、３質量％の割合で比較例１の粉末（発酵させていないアメリカ人参の粉末）を混ぜた飼料、及び、粉末飼料のみを、試験期間中に与えた。

【0065】

試験期間は、１週間の順化後、５８日間とし、５８日間では、試料はそれぞれマウスが自由に経口摂取できるようにした。５８日の間、毎日体重及び握力を測定した。握力の測定は、マウスの刺激を与えることでマウスの前脚が引っ張った紐の引っ張り力を測定することで行い、各マウスについて３回ずつ行い、それらの平均値及び最大値を測定した。

【0066】

５８日目に解剖し、筋肉質量及び脂肪質量を測定した。筋肉質量は、後肢の筋肉を前側及び後側に分けて採取し、それぞれの合計質量を測定した。前側の筋肉は、前脛骨筋、長趾伸筋及び長腓骨筋であり、後側の筋肉は腓腹筋及びヒラメ筋である。

【0067】

図１３は、試験１日目のマウスの体重を示すグラフである。実施例２は、実施例２の粉末を混ぜた飼料を与えたマウス、比較例１は、比較例１の粉末を混ぜた飼料を与えたマウス、コントロールは、実施例２及び比較例１の何れの粉末も混ぜていない粉末飼料を与えたマウスである。以下、同様である。１日目において、実施例２のマウスは２１．０８ｇ、比較例１のマウスは２１．７１ｇ、コントロールのマウスは２１．５９ｇであった。

【0068】

図１４は、試験５８日目のマウスの体重を示すグラフである。５８日目において、実施例２のマウスは２６．７２ｇ、比較例１のマウスは２７．３０ｇ、コントロールのマウスは２７．８２ｇであった。

【0069】

図１５は、試験期間中のマウスの体重変化を示すグラフである。四角のプロットは実施例２のマウスを表し、三角のプロットは比較例１のマウスを表し、丸のプロットはコントロールのマウスを表す。各プロットの意味は、以降のグラフにおいても同様である。いずれのマウスにも、試験期間中に体重増加が認められた。従って、実施例２の粉末又は比較例１の粉末を含む飼料は、何も混ぜていない通常のコントロールの飼料と同様に、日常的に摂取可能で、安全性にも優れることが確認できた。

【0070】

図１６は、握力の平均値についての経時変化を示すグラフである。各グループには上記のように８匹ずつのマウスが含まれるため、図１６に示すグラフは、各グループにおいて８匹のマウスの平均値をグラフ化した。後記する図１８に示すグラフについても同様である。

【0071】

試験期間中、各マウスにおいて同様の傾向がみられた。具体的には、１日目から５日目迄に急激に握力が上昇した後、６日目以降は、ほぼ同程度の握力であった。各マウスの握力についての大小関係としては、１５日目迄は概ね各マウスの握力は同程度であったが、１６日目以降は、常に実施例２のマウスの握力が最も大きかった。比較例１のマウスの握力、及び、コントロールのマウスの握力については、概ね比較例１のマウスの握力が大きかった。しかし、４９日目で、コントロールのマウスの握力の方が大きくなることがあった。このため、比較例１のマウスの握力とコントロールのマウスの握力との関係は安定せず、どちらが大きいとは一概にはいえないことが示唆された。

【0072】

図１７は、握力の平均値について、５８日目の結果を示すグラフである。実施例２のマウスの握力の平均値は０．１３５ｋｇ、比較例１のマウスの握力の平均値は０．１２７ｋｇ、コントロールのマウスの握力の平均値は０．１１７ｋｇであった。この結果から、実施例２の飼料を５８日間摂取したマウスの握力の平均値は、比較例１のマウス及びコントロールのマウスよりも大きくなることがわかる。特に、上記の図１６に示すグラフとともに検討すると、本開示の筋肉増強食品を経口摂取したマウスでは、握力の平均値は、安定的に大きくなることがわかる。

【0073】

図１８は、握力の最大値についての経時変化を示すグラフである。各グループには上記のように８匹ずつのマウスが含まれるため、図１８に示すグラフは、各グループにおいて８匹のマウスの最大値をグラフ化した。

【0074】

図１８に示すグラフにおいても、握力の最大値は、概ね、上記図１６に示した握力の平均値と同様の傾向を示した。３４日目では、実施例２のマウスの握力は、比較例１のマウスの握力よりも低下した。しかし、３５日目を含む３５日目以降では、常に、実施例２のマウスの握力は、比較例１及びコントロールのマウスの握力よりも高くなった。一方で、比較例１及びコントロールのマウスの握力については、概ね比較例１のマウスの握力の方が大きかったが、概ね同程度であった。試験期間終盤の４９日目では、コントロールのマウスの握力の方が大きくなったが、５８日目には、再び比較例１のマウスの握力の方が大きくなった。

【0075】

図１９は、握力の最大値について、５８日目の結果を示すグラフである。実施例２のマウスの握力の平均値は０．１４８ｋｇ、比較例１のマウスの握力の平均値は０．１４２ｋｇ、コントロールのマウスの握力の平均値は０．１３３ｋｇであった。この結果から、実施例２の飼料を５８日間摂取したマウスの握力の最大値は、比較例１のマウス及びコントロールのマウスよりも大きくなることがわかる。特に、上記の図１８に示すグラフとともに検討すると、本開示の筋肉増強食品を経口摂取したマウスでは、握力の最大値は、安定的に大きくなることがわかる。

【0076】

握力は、瞬間的に、又は、たまたま、何らかの理由で大きくなることがあり得る。しかし、そのような現象が継続して生じることはない。図１６～図１９に示すように、本開示の筋肉増強食品を経口摂取することで、安定して継続的に筋肉を増強でき、この結果、握力が常に比較例１及びコントロールのマウスよりも高い状態を維持したと考えられる。

【0077】

図２０は、前脛骨筋、長趾伸筋及び長腓骨筋の合計質量を示すグラフである。上記のように、これらの筋肉は、前側の筋肉である。各グループには上記のように８匹ずつのマウスが含まれるため、図２０に示すグラフは、各グループにおいて８匹のマウスの平均値をグラフ化した。図２０に示すグラフは、コントロールを１とした場合の相対的な値で示した。これらの点は、後記の図２１に及び図２２示すグラフについても同様である。実施例２のマウスの筋肉は１．０６９、比較例１のマウスの筋肉は０．９８８であった。

【0078】

図２１は、腓腹筋及びヒラメ筋の合計質量を示すグラフである。上記のように、これらの筋肉は、後側の筋肉である。実施例２のマウスの筋肉質量は１．０２９、比較例１のマウスの筋肉質量は１．０１２であった。従って、実施例２のマウスの脂肪質量は、比較例１及びコントロールのマウスよりも大きかった。

【0079】

図２０及び図２１に示すように、実施例２のマウスの筋肉は、前側及び後ろ側のそれぞれにおいて、比較例１及びコントロールのマウスよりも大きかった。この結果は、上記の図１６～図１９に示すように、実施例２のマウスの握力の平均値及び最大値が、比較例１及びコントロールのマウスよりも大きくなったことを裏付ける結果である。

【0080】

図２２は、脂肪質量を示すグラフである。実施例２のマウスの脂肪質量は０．９５３であった。従って、実施例２のマウスの脂肪質量は、コントロールのマウスよりも減少した。筋肉が増えれば代謝が上がるため、脂肪量は増加する。このため、この結果は、上記の図２０及び図２１に示すように、実施例２のマウスの筋肉が、コントロールのマウスよりも増えたことを裏付ける結果である。

【0081】

以上のように、本開示の筋肉増強食品を経口摂取することで、筋肉量の増加も認められた。従って、本開示の筋肉増強食品によれば、サルコペニア抑制効果に加えて、筋肉増強効果を奏することもできる。

【符号の説明】

【0082】

Ｓ１ 原料準備工程
Ｓ２ 発酵工程
Ｓ３ 性状調整工程

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】