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特許7406228変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ及び該ＲＮＡホモログの利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-19
(45)【発行日】2023-12-27
(54)【発明の名称】変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ及び該ＲＮＡホモログの利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20231220BHJP
A01N 57/16 20060101ALI20231220BHJP
A01N 63/12 20200101ALI20231220BHJP
A01P 5/00 20060101ALI20231220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
A01N57/16 104C
A01N63/12
A01P5/00
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019188562
(22)【出願日】2019-10-15
(65)【公開番号】P2021061785
(43)【公開日】2021-04-22
【審査請求日】2022-07-20
(73)【特許権者】
【識別番号】504229284
【氏名又は名称】国立大学法人弘前大学
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(72)【発明者】
【氏名】牛田 千里
(72)【発明者】
【氏名】増井 達信
(72)【発明者】
【氏名】小山 昂志
【審査官】井関 めぐみ
(56)【参考文献】
【文献】Y． HOKII et al.，“A small nucleolar RNA functions in rRNA processing in Caenorhabditis elegans”，Nucleic Acids Research，2010年05月11日，Vol. 38, No. 17，p.5909-5918，DOI: 10.1093/nar/gkq335
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１１
Ａ０１Ｎ ５７／１６
Ａ０１Ｎ ６３／１２
Ａ０１Ｐ ５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列表の配列番号３、配列番号７又は配列番号２３に記載の塩基配列から本質的になる、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
【請求項2】
請求項１に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫の成長抑制用組成物又は線虫の産卵抑制用組成物。
【請求項3】
請求項１に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫のｒＲＮＡ前駆体蓄積促進用組成物又は線虫のリボソーム合成抑制用組成物。
【請求項4】
請求項１に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫用農薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、変異型核小体低分子ＲＮＡである変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する組成物及び農薬、並びに変異型核小体低分子ＲＮＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来の殺生物性の農薬として、化学農薬、抗生物質、生物農薬などが挙げられる。このうち、化学農薬及び抗生物質としては、低分子化合物が用いられている。人体に適用する医薬品については、オリゴＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの核酸を用いる核酸医薬が開発されているが、核酸を利用した農薬についてはこれまでにほとんど知られていない。
【0003】
植物に感染し、大きな農業被害をもたらす害虫の一種として、線虫がある。線虫のうち、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓの細胞性ＣｅＲ－２ ＲＮＡの量を減少させた変異体は、野生型Ｎ２株と比較して、ｒＲＮＡ前駆体のプロセシング・パターンに変化をもたらすことが報告されている（非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Yusuke Hokii et al., Nucleic Acids Research, Volume 38, Issue 17, 1 September 2010, Pages 5909-5918
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかし、非特許文献１には、ＣｅＲ－２ ＲＮＡを発現する野生型の線虫に対して、なんらかの生理作用を及ぼし得る核酸分子などの物質について記載が無い。
【0006】
そこで、本発明は、植物に有害事象をもたらす線虫などの生物体に対して有益な生理作用を及ぼし得る核酸分子及びその製造方法並びに該核酸分子を有効成分として含有する組成物及び農薬を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を積み重ねたところ、Ｐｅｃｕｌｉｓの文献（BRENDA A. PECULIS, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, July 1997, p. 3702-3713）から、アフリカツメガエルにおいてＵ８ ｓｎｏＲＮＡの５’末端の配列に改変を加えた場合にｒＲＮＡのプロセシングにパターン変化が生じること、Ｕ８ ｓｎｏＲＮＡの５’末端の配列が２８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端と不完全な塩基対（ミスマッチ及びギャップを含む塩基対）を形成する可能性があることを見出した。そこで、この不完全な塩基対形成は線虫でも起こり得るのではないかと考えた。
【0008】
そして、これとは逆に、脊椎動物のＵ８ ｓｎｏＲＮＡに相当するＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの５’末端を改変して、２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端とより高度に相補的塩基対を形成するようにすれば、２６Ｓ ｒＲＮＡのプロセシングを阻害できると考えた。また、標的となるｒＲＮＡ前駆体は核小体に局在することから、核小体に局在が可能な構造を保持するようにすれば、より効果的に２６Ｓ ｒＲＮＡのプロセシングを抑制し得ると考えた。
【0009】
上記考えに基づいて、本発明者らは、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡに比べて、５’末端部分が２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端と相補性の高い塩基からなる塩基配列になるように改変した変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを作製した。そして、驚くべきことに、この変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるリボソームの合成を減少し、Ｃ，ｅｌｅｇａｎｓの個体成長の抑制及び産卵開始の遅延をもたらし得るものであった。特に、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの有無ではＣ．ｅｌｅｇａｎｓの表現型に影響をほとんど及ぼさないのに対して、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡがＣ．ｅｌｅｇａｎｓに対して上記のような表現型を導くことは、本発明者らによって初めて見出された驚くべき知見である。
【0010】
このような知見を基にして、本発明者らは、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡにおける５’末端側の塩基配列が、２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の塩基配列と相補性が高くなるように改変された変異がある、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡ並びに該変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを有効成分として含有する組成物及び農薬を創作することに成功した。本発明は、かかる知見や成功例に基づいて完成された発明である。
【0011】
したがって、本発明の一態様によれば、以下［１］～［１１］のＲＮＡホモログ、組成物、農薬及び方法が提供される。
［１］線虫が有する野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログにおいて、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の５’末端側の塩基配列と高度に相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［２］前記線虫は、カエノラブディティス属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）線虫、ヘモンカス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）線虫又はシファシア属（Ｓｙｐｈａｃｉａ）線虫である、［１］に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［３］野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列において、５’末端側の１位～８位の塩基からなる塩基配列が、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の２１位～２８位の塩基からなる塩基配列と、６個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する、［１］～［２］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［４］更に野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列において、５’末端側の９位～１８位の塩基からなる塩基配列が、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の４位～１３位の塩基からなる塩基配列と、９個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する、［３］に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［５］更に野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列において、５’末端側の８位の塩基と９位の塩基との間に、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の１４位～２０位の塩基からなる塩基配列の一部又は全部と相補的である塩基配列を挿入するように改変された変異を有する、［３］～［４］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［６］配列表の配列番号３、配列番号７又は配列番号２３に記載の塩基配列から本質的になる、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［７］［１］～［６］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫の成長抑制用組成物又は線虫の産卵抑制用組成物。
［８］［１］～［６］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫のｒＲＮＡ前駆体蓄積促進用組成物又は線虫のリボソーム合成抑制用組成物。
［９］［１］～［６］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫用農薬。
［１０］生物体のｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成して結合する核小体低分子ＲＮＡを取得する工程と、
前記核小体低分子ＲＮＡの５’末端側の塩基配列を、前記ｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補性が高くなるように改変することにより、変異型核小体低分子ＲＮＡを得る工程と
を含む、変異型核小体低分子ＲＮＡの製造方法。
［１１］前記生物体は、線虫である、［１０］に記載の製造方法。
［１］線虫が有する野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログにおいて、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の５’末端側の塩基配列と高度に相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［２］前記線虫は、カエノラブディティス属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）線虫、ヘモンカス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）線虫又はシファシア属（Ｓｙｐｈａｃｉａ）線虫である、［１］に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［３］野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列において、５’末端側の１位～８位の塩基からなる塩基配列が、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の２１位～２８位の塩基からなる塩基配列と、６個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する、［１］～［２］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［４］更に野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列において、５’末端側の９位～１８位の塩基からなる塩基配列が、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の４位～１３位の塩基からなる塩基配列と、９個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する、［３］に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［５］更に野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列において、５’末端側の８位の塩基と９位の塩基との間に、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の１４位～２０位の塩基からなる塩基配列の一部又は全部と相補的である塩基配列を挿入するように改変された変異を有する、［３］～［４］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［６］配列表の配列番号３、配列番号７又は配列番号２３に記載の塩基配列から本質的になる、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ。
［７］［１］～［６］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫の成長抑制用組成物又は線虫の産卵抑制用組成物。
［８］［１］～［６］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫のｒＲＮＡ前駆体蓄積促進用組成物又は線虫のリボソーム合成抑制用組成物。
［９］［１］～［６］のいずれか１項に記載の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫用農薬。
［１０］生物体のｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成して結合する核小体低分子ＲＮＡを取得する工程と、
前記核小体低分子ＲＮＡの５’末端側の塩基配列を、前記ｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補性が高くなるように改変することにより、変異型核小体低分子ＲＮＡを得る工程と
を含む、変異型核小体低分子ＲＮＡの製造方法。
［１１］前記生物体は、線虫である、［１０］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ、組成物及び農薬によれば、成長抑制作用、産卵抑制作用、ｒＲＮＡ前駆体蓄積促進作用及び／又はリボソーム合成抑制作用といった有益な生理作用を通じて、線虫によって有害事象がもたらされる動植物を保護することが期待される。また、本発明の一態様の方法によれば、線虫を含む生物体に有益な変異型核小体低分子ＲＮＡを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の詳細について説明するが、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
【0015】
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている推測及び理論は、本発明者らのこれまでの知見及び経験によってなされたものであることから、本発明はこのような推測及び理論のみによって拘泥されるものではない。
【0016】
「ＲＮＡ」は、核酸分子の一種であり、モノマーであるヌクレオチドが多数結合してなるポリマーである。ＲＮＡは、ヌクレオチドを構成する成分の一つである塩基（プリン塩基又はピリミジン塩基）の並びを表した「塩基配列」によって構造が特定される。すなわち、ＲＮＡは、ヌクレオチドが塩基配列によって示される塩基の順番で結合してなるポリマーである。
「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形担体又は溶媒の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。
「及び／又は」は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「含有量」は、濃度と同義であり、組成物の全体量に対する成分の量の割合を意味する。ただし、成分の含有量の総量は、１００％を超えることはない。
数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
「塩基配列から本質的になる」は、該塩基配列からなるか、又は該塩基配列を有し、さらに該塩基配列によって表される核酸分子が有する構造及び／又は機能を損なわない範囲内で該塩基配列の５’末端側又は３’末端側に塩基が付加された塩基配列からなることを意味する。
「ＲＮＡホモログ」とは、同一又は近似する構造及び／又は機能を有し、かつ同一又は近似する塩基配列を有するＲＮＡの群を意味する。ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡ及び各生物におけるＣｅＲ－２ａ ＲＮＡに相当するＲＮＡを意味する。ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の５’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成し、かつＣｅＲ－２ａ ＲＮＡと同一又は近似する塩基配列を有する。
「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形担体又は溶媒の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。
「及び／又は」は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「含有量」は、濃度と同義であり、組成物の全体量に対する成分の量の割合を意味する。ただし、成分の含有量の総量は、１００％を超えることはない。
数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
「塩基配列から本質的になる」は、該塩基配列からなるか、又は該塩基配列を有し、さらに該塩基配列によって表される核酸分子が有する構造及び／又は機能を損なわない範囲内で該塩基配列の５’末端側又は３’末端側に塩基が付加された塩基配列からなることを意味する。
「ＲＮＡホモログ」とは、同一又は近似する構造及び／又は機能を有し、かつ同一又は近似する塩基配列を有するＲＮＡの群を意味する。ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡ及び各生物におけるＣｅＲ－２ａ ＲＮＡに相当するＲＮＡを意味する。ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の５’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成し、かつＣｅＲ－２ａ ＲＮＡと同一又は近似する塩基配列を有する。
【0017】
［変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ］
変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ（以下、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログともよぶ。）の塩基配列において、塩基の置換を有する塩基配列、又は塩基の置換と付加及び／若しくは欠失とを有する塩基配列を有するＲＮＡ分子である。ここで、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味し、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味する。本明細書では、塩基を置換、付加及び／又は欠失することにより、塩基配列に変更を加えることを「変異」とよぶ。
変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ（以下、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログともよぶ。）の塩基配列において、塩基の置換を有する塩基配列、又は塩基の置換と付加及び／若しくは欠失とを有する塩基配列を有するＲＮＡ分子である。ここで、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味し、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味する。本明細書では、塩基を置換、付加及び／又は欠失することにより、塩基配列に変更を加えることを「変異」とよぶ。
【0018】
本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、線虫が有する野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログにおいて、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の５’末端側の塩基配列と高度に相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する塩基配列から本質的になる。このような塩基配列により、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログよりも、より強度に２６Ｓ ｒＲＮＡと結合する。
【0019】
本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、線虫におけるリボソームの合成を低減し、線虫の個体成長の抑制及び産卵開始の遅延をもたらし得る。このようなリボソームの合成低減が成長抑制及び産卵抑制をもたらす理由について、以下のような可能性が推測される。すなわち、２６Ｓ ｒＲＮＡとより強度に結合することにより、リボソームの合成低下によりタンパク質合成が低下し、生殖細胞の形成（成虫において最も盛んに細胞分裂が行われ、したがって、盛んにタンパク質合成が行われると考えられる）が低下するために、幼虫期の成長遅延及び産卵開始の遅延が観察される可能性がある。また、ＬＳＵ ｒＲＮＡ前駆体のプロセシングが正常に行われないために、６０Ｓサブユニットの合成が低下し、結果としてリボソームを構成するタンパク質及び／又は４０Ｓリボソームサブユニットが細胞内に余るような状況ができ、これらが何らかのメカニズムにより、成長遅延及び産卵開始遅延のシグナルとなる可能性がある。
【0020】
線虫が有する野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、相互に近似した構造及び塩基配列を有する。代表的な野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列をアライメントしたものを下記塩基配列アライメント（１）に示す。塩基配列アライメント（１）における下線部で示した塩基のうちの幾つかは、各生物の２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成する。
【0021】
【化1】
【0022】
野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログと同様に、線虫が有する２６Ｓ ｒＲＮＡは、相互に近似した構造及び塩基配列を有する。特に、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログと相補的塩基対を形成する５’末端の塩基配列はよく保存されている。例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃ．ｉｎｏｐｉｎａｔａ、Ｃ．ｂｒｉｇｇｓａｅ、Ｃ．ｒｅｍａｎｅｉ、Ｃ．ｂｒｅｎｎｅｒといったカエノラブディティス属線虫の２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端の塩基配列は共通する。さらに、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓといったヘモンカス属線虫及びＳｙｐｈａｃｉａ ｍｕｒｉｓといったシファシア属線虫の２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端の塩基配列は、カエノラブディティス属線虫のものと数塩基が相違するのみである。これらの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端の塩基配列をアライメントしたものを下記塩基配列アライメント（２）に示す。塩基配列アライメント（２）における下線部で示した塩基のうちの幾つかは、各生物の野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの５’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成する。
【0023】
【化2】
【0024】
塩基配列アライメント（１）及び（２）の下線部の塩基についてアライメントしたものを下記塩基配列アライメント（３）に示す（なお、ＴはＵに置換されている）。塩基配列アライメント（３）における網掛け部分の塩基間において相補的塩基対が形成される。
【0025】
【化3】
【0026】
塩基配列アライメント（３）が示すとおり、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列における５’末端側の１位～８位の塩基からなる塩基配列中の数塩基は、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の２１位～２８位の塩基からなる塩基配列と相補的塩基対を形成する。また、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列における５’末端側の９位～１８位の塩基からなる塩基配列中の数塩基は、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の４位～１３位の塩基からなる塩基配列と相補的塩基対を形成する。
【0027】
上記のとおり、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ及び２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端の塩基配列は、線虫間でよく保存されている。これにより、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対する変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、Ｃ．ｉｎｏｐｉｎａｔａ、Ｃ．ｂｒｉｇｇｓａｅ、Ｃ．ｒｅｍａｎｅｉ、Ｃ．ｂｒｅｎｎｅｒといったカエノラブディティス属線虫のみならず、Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓといったヘモンカス属線虫及びＳ．ｍｕｒｉｓといったシファシア属線虫などの他の線虫に対しても、同様の効果を有する可能性が高い。したがって、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログが対象とする線虫は特に限定されないが、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを発現する線虫であることが好ましく、カエノラブディティス属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）線虫、ヘモンカス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）線虫及びシファシア属（Ｓｙｐｈａｃｉａ）線虫からなる群から選ばれる少なくとも１種の線虫であることがより好ましく、カエノラブディティス属線虫であることがさらに好ましい。
【0028】
本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の５’末端側の塩基配列と高度に相補的塩基対を形成するために、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列において、５’末端側の１位～８位の塩基からなる塩基配列が、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の２１位～２８位の塩基からなる塩基配列と、６個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有することが好ましい。
【0029】
Ｃ．ｉｎｏｐｉｎａｔａは、最近同定された新種の線虫（Kanzaki, N. et al. Nat. Commun. 9: 3216. Doi: 10.1038/s41467-018-05712-5, 2018.）であり、イチジクの実を宿主とする。また、Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓは、ヒツジ、ヤギ、ウシなどの第四胃に寄生する吸血性の線虫で、畜産業者に大きな経済的損失を与える。Ｓ．ｍｕｒｉｓは、ネズミ蟯虫である。
【0030】
また、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列において、５’末端側の９位～１８位の塩基からなる塩基配列が、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の４位～１３位の塩基からなる塩基配列と、９個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有することが好ましい。
【0031】
さらに、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの塩基配列において、５’末端側の８位の塩基と９位の塩基との間に、２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における５’末端側の１４位～２０位の塩基からなる塩基配列の一部又は全部と相補的である塩基配列を挿入するように改変された変異を有することが好ましい。
【0032】
以下では、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログについて、具体的態様である変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを例にとり説明するが、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡに限定されるものではない。
【0033】
野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡ（配列番号１）は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（以下、Ｃｅともよぶ。）における核小体低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ；ｓｎｏＲＮＡ）の１種であり、ｒＲＮＡ前駆体のプロセシングに関与している。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＵ８ ｓｎｏＲＮＡ（配列番号４）は、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡに相当する。
【0034】
野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの５’末端側の塩基配列は、Ｃｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の塩基配列（配列番号２）と部分的に相補的塩基対を形成する。同様に、Ｕ８ ｓｎｏＲＮＡの５’末端側の塩基配列は、２８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の塩基配列（配列番号５）と部分的に相補的である。ここで、ＲＮＡにおける相補的塩基対を形成する塩基の組合せとしては、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）との組合せ、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との組合せ、及びグアニン（Ｇ）とウラシル（Ｕ）との組合せがある。
【0035】
図１は、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの構造及び野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡとＣｅの２６Ｓ ｒＲＮＡとの相補的塩基対の形成態様を示す。なお、図１には、ヒトのＵ８ ｓｎｏＲＮＡの構造及びヒトＵ８ ｓｎｏＲＮＡとヒトの２８Ｓ ｒＲＮＡとの相補的塩基対の形成態様を合わせて示す。他の線虫（Ｎｅｍａｔｏｄａ）でも、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡに相当するｓｎｏＲＮＡは見られる。そして、各線虫が有するｓｎｏＲＮＡは、共通してＤ ｂｏｘ、ＬＳｍ結合モチーフ様配列及びＣ ｂｏｘを有しており、構造的によく保存されている。
【0036】
図１に示すとおり、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの５’末端側の１位から１８位までの塩基からなる塩基配列（５’－ＣＡＧＵＣＵＵＣＡＧＵＡＵＧＧＧＵＣ－３’）（配列番号１の１位～１８位の塩基）は、Ｃｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の４位から２８位までの塩基からなる塩基配列（３’－ＣＣＣＡＵＵＡＧＵＧＣＵＧＡＣＵＣＡＡＣＵＣＣＡＡ－５’）（配列番号２の４位～２８位の塩基）と部分的に相補的塩基対を形成する。
【0037】
例えば、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの５’末端側の１位から８位までの塩基からなる塩基配列（５’－ＣＡＧＵＣＵＵＣ－３’）（配列番号１の１位～８位の塩基）とＣｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の２１位から２８位までの塩基からなる塩基配列（３’－ＣＣＣＡＵＵＡＧ－５’）（配列番号２の２１位～２８位の塩基）との間で形成される相補的塩基対の数は４個である。
【0038】
本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、５’末端側の１位から８位までの塩基からなる塩基配列が、Ｃｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の２１位から２８位までの塩基からなる塩基配列と、６個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する。
【0039】
具体的には、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、５’末端側の１位の塩基（Ｃ）のＧへの置換、２位の塩基（Ａ）のＧへの置換、５位の塩基（Ｃ）のＡへの置換及び６位の塩基（Ｕ）のＡへの置換からなる群から選ばれる少なくとも２個以上の置換がなされているように改変された変異を有することが好ましい。変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの５’末端側の塩基配列とＣｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の塩基配列との相補性が大きい（形成される相補的塩基対の数が多い）ほど、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡが有する線虫の成長抑制作用及び／又は線虫の産卵抑制作用は大きくなることから、該置換の数は、３個以上が好ましく、４個全てであることがより好ましい。
【0040】
野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの５’末端側の９位から１８位までの塩基からなる塩基配列（５’－ＡＧＵＡＵＧＧＧＵＣ－３’）（配列番号１の９位～１８位の塩基配列）とＣｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の４位から１３位までの塩基からなる塩基配列（３’－ＵＣＡＡＣＵＣＣＡＡ－５’）（配列番号２の４位～１３位の塩基配列）との間で形成される相補的塩基対の数は８個である。
【0041】
そこで、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、５’末端側の９位から１８位までの塩基からなる塩基配列が、Ｃｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の４位から１３位までの塩基からなる塩基配列と、９個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有することが好ましい。
【0042】
具体的には、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、５’末端側の１２位の塩基（Ａ）のＵへの置換及び１８位の塩基（Ｃ）のＵへの置換からなる群から選ばれる少なくとも１個以上の置換がなされているように改変された変異を有することが好ましい。変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡが有する線虫の成長抑制作用及び／又は線虫の産卵抑制作用の観点から、該置換は５’末端側の１２位の塩基（Ａ）のＵへの置換であることが好ましく、該置換の数が２個全てであることがより好ましい。
【0043】
野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの５’末端側には、Ｃｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の１４位から２０位までの塩基からなる塩基配列（３’－ＵＧＣＵＧＡＣ－５’）（配列番号２の１４位～２０位の塩基配列）と相補的塩基対を形成する塩基からなる塩基配列はない。
【0044】
そこで、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、５’末端側の８位の塩基（Ｃ）と９位の塩基（Ａ）との間に、Ｃｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の１４位から２０位までの塩基からなる塩基配列の一部又は全部と相補的である塩基配列、例えば、５’－ＡＣＧＡＣＵＧ－３’（配列番号６）で表される塩基配列などを挿入するように改変された変異を有することが好ましい。
【0045】
変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、上記した変異を有するものであれば特に限定されない。変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの具体例としては、配列番号３に記載の塩基配列から本質的になる変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡ、配列番号７に記載の塩基配列から本質的になる変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡ及び配列番号２３に記載の塩基配列から本質的になる変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡなどが挙げられる。図２に、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡ又は配列番号３に記載の塩基配列からなる変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡと２６Ｓ ｒＲＮＡとの相補的塩基対を形成する態様を模式的に示す。
【0046】
本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、線虫の細胞の核小体における２６Ｓ ｒＲＮＡと結合することにより、線虫の成長抑制作用及び／又は線虫の産卵抑制作用を発揮する。そこで、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、線虫の核小体に到達及び入り込み易いように設計されていてもよい。
【0047】
変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、これまでに知られている核酸合成技術を適用して製造することができ、例えば、手動又は自動の反応により、酵素的又は化学合成的に製造することができる。例えば、ＣｅのゲノムＤＮＡのうち、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡをコードする領域（ＣｅのＩＶ番染色体の８，４２８，４７８－８，４２９，１５７）を含む部分を鋳型として、５’末端側に上記した変異を有するような塩基からなる塩基配列を付加したプライマー（例えば、配列番号２５～２７の塩基配列を有するプライマー）を用いて核酸合成反応を実施する。次いで得られた反応産物を回収し、該反応産物を鋳型としてＰＣＲを実施することにより変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を得る。該ＤＮＡ断片をＲＮＡ合成に適したプラスミドに挿入し、該プラスミドを直線化した上でＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡ合成反応に供する。次いで反応産物として、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを得る。この際、溶媒又は樹脂を用いる抽出、沈降、電気泳動、クロマトグラフィーなどによって、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを精製してもよい。変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの取得に際しては、ジーンデザイン、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＱＩＡＧＥＮ、シグマアルドリッチなどの受託製造会社を利用した受託製造サービスを利用してもよい。
【0048】
変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、線虫の細胞若しくは組織に導入し、又は線虫に導入し、標的である核小体における２６Ｓ ｒＲＮＡと結合するように使用することができる変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログが２６Ｓ ｒＲＮＡと結合することにより、線虫の成長抑制及び／又は線虫の産卵抑制を誘導することができる。変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの導入は、当技術分野で公知の方法により、当業者であれば適切に行なうことができる。例えば、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを線虫に適用するためには、土壌及び／又は植物体に変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを散布又は注入すること、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログが発現するように遺伝子組換えしたウイルスを線虫に適用すること、ＢｉｏＣｌａｙ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ａ．Ｗｏｒｒａｌｌらの文献（Elizabeth A. Worrall et al., Frontiers Plant Science, March 2019, Volume 10, Article 265, [https://www.nature.com/articles/nplants2016207]）を参照）を利用することなどが挙げられる。
【0049】
変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、線虫内で生成し得るようにデザインされたものであってもよい。例えば、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログをコードするＤＮＡ断片を線虫細胞用の発現ベクターに挿入したものであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡのプロモータをクローニングサイトの上流に持つプラスミドベクターなどが挙げられる。
【0050】
［変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する組成物及び農薬］
本発明の別の一態様は、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫の成長抑制用組成物である。本発明の別の一態様は、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫の産卵抑制用組成物である。
本発明の別の一態様は、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫の成長抑制用組成物である。本発明の別の一態様は、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫の産卵抑制用組成物である。
【0051】
線虫の成長抑制用組成物は、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログが有する線虫の成長抑制作用を利用してなるものである。「線虫の成長抑制作用」は、線虫の体長が大きくなる速度を抑制する作用及び線虫の最大体長を抑制する作用からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用を意味する。
【0052】
Ｃｅは、２０℃において、孵化後９時間のＬ１期において最大３７０μｍ、Ｌ１期後１２時間（孵化後２１時間）のＬ２期において最大４８０μｍ、Ｌ２期後８時間（孵化後２９時間）のＬ３期において最大６４０μｍ、Ｌ３期後８時間（孵化後３７時間）のＬ４期において最大８５０μｍ、Ｌ４期後１８時間（孵化後５５時間）の成虫期において１，０６０μｍ程度になるといわれている。
【0053】
以下では、Ｃｅである線虫について、後述する実施例に記載の液体培養条件にて、２０℃でインキュベートする場合の各作用について言及する。
【0054】
線虫の成長抑制用組成物は、線虫の体長が大きくなる速度を抑制する作用が発揮する場合、Ｌ２期～成虫期の線虫、好ましくはＬ２期～Ｌ４期の線虫の体長を、線虫の成長抑制用組成物を使わない場合と比べて、小さくすることができる。例えば、線虫の成長抑制用組成物を使用することにより、Ｌ４期の線虫の体長を８５０μｍ未満にすることが期待される。
【0055】
線虫の成長抑制用組成物が線虫の体長が大きくなる速度を抑制する作用を発揮する場合であっても、線虫の体長は孵化後５５時間以降に１，０６０μｍに達し得る。したがって、線虫の成長抑制用組成物は、線虫の体長が大きくなる速度を抑制する作用を発揮するからといって、線虫の最大体長を抑制するとは限らない。
【0056】
それに対して、線虫の成長抑制用組成物は、線虫の最大体長を抑制する作用が発揮する場合、線虫の最大体長を、線虫の成長抑制用組成物を使わない場合と比べて、小さくすることができる。例えば、線虫の成長抑制用組成物を使わない場合に線虫の体長は最大１，４００μｍ以上に達するところ、線虫の成長抑制用組成物を使用する場合は１，４００μｍ未満に抑えることが期待される。
【0057】
線虫の産卵抑制用組成物は、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログが有する線虫の産卵抑制作用を利用してなるものである。「線虫の産卵抑制作用」は、線虫の産卵開始時期を遅らせる作用を意味する。
【0058】
線虫の産卵抑制用組成物を用いることにより、線虫の産卵抑制用組成物を用いない場合と比べて、線虫の平均産卵開始時間は大きくなり、好ましくは５時間以上又は１．１０倍以上の時間になり、より好ましくは７時間以上又は１．１５倍以上の時間になる。
【0059】
線虫の産卵抑制用組成物を用いない場合は、線虫の多くは孵化後５０時間までに産卵を開始する。それに対して、線虫の産卵抑制用組成物を用いる場合は、線虫の多くは孵化後５０時間までに産卵を開始せず、孵化後５０時間、好ましくは孵化後５５時間を過ぎて産卵を開始する。
【0060】
線虫の産卵抑制用組成物は、線虫の産卵開始時期を遅らせ得るものではあるが、線虫の産卵個数を必ずしも抑制するものではない。ただし、線虫の産卵抑制用組成物は、線虫の産卵個数を抑制するものであってもよい。
【0061】
線虫の成長抑制作用及び線虫の産卵抑制作用は、後述する実施例に記載の方法によって、確認及び評価することができる。具体的には、線虫の成長抑制作用は、線虫の体長を経時的に測定し、体長成長プロファイル及び／又は体長１ｍｍ到達時の平均時間を確認することにより、評価することができる。線虫の産卵抑制作用は、線虫の受精卵個数及び／又は産卵開始個体数を経時的に測定し、時間当たりの受精卵個数、時間当たりの産卵開始個体数及び／又は平均産卵開始時間を確認することにより、評価することができる。
【0062】
変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログが有する線虫の成長抑制作用及び線虫の産卵抑制作用は、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログが野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡと比べてＣｅのリボソーム構成因子である２６Ｓ ｒＲＮＡの前駆体と強く結合し、それにより２６Ｓ ｒＲＮＡがプロセシングを受けることが阻害されることを作用機序とすると推測される。この結果として、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡが核小体にある場合、ｒＲＮＡ前駆体がプロセシングを受けずに蓄積し、リボソームの合成が抑制される。
【0063】
これにより、本発明の別の一態様は、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫のｒＲＮＡ前駆体蓄積促進用組成物である。本発明の別の一態様は、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫のリボソーム合成抑制用組成物である。
【0064】
線虫のｒＲＮＡ前駆体蓄積促進用組成物又は線虫のリボソーム合成抑制用組成物を用いることにより、このような組成物を用いない場合と比べて、リボソームの小ユニットである４０Ｓと大ユニットである６０Ｓの比率（４０Ｓ／６０Ｓ）が大きくなり、好ましくは５０％以上又は該組成物を用いない場合と比べて１．５倍以上、より好ましくは７０％以上又は該組成物を用いない場合と比べて２．０倍以上になる。これは２６Ｓ ｒＲＮＡ前駆体がプロセシングを受けて６０Ｓの構成成分の一つとなるところ、２６Ｓ ｒＲＮＡがプロセシングを受けない場合は６０Ｓの量が少なくなり、４０Ｓ／６０Ｓの比率が大きくなることに依拠する。線虫のリボソーム及びリボソームの各ユニットの定量は、後述する実施例に記載の方法によって測定することができる。
【0065】
変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログは、線虫に対する、成長抑制作用、産卵抑制作用、ｒＲＮＡ前駆体蓄積促進作用及びリボソーム合成抑制作用からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用を有することにより、線虫に対する農薬の有効成分として使用することができる。そこで、本発明の別の一態様は、本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを有効成分として含有する、線虫用農薬である。
【0066】
本発明の一態様の農薬を用いれば、土壌及び／又は植物体に付着した線虫に対して作用することにより、例えば、線虫の成長を抑制することにより、線虫が成虫になる前に、線虫の成虫に被害を受け易い植物の若芽を十分に生育させること；線虫の産卵を抑制することにより、線虫が産卵を開始する前に他の殺線虫剤により線虫を殺滅すること；ｒＲＮＡ前駆体の蓄積を促進し、リボソームの合成を抑制することにより、線虫の薬剤耐性を導くタンパク質の合成を抑制し、線虫が薬剤に対する感受性を高めることなどが期待される。
【0067】
本発明の一態様の組成物及び農薬における変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログの含有量は、それぞれ求められる作用及び効果が発揮する程度の量であれば特に限定されないが、例えば、組成物又は農薬の総量に対して、０．０００１質量％～９９質量％であり、好ましくは０．００１質量％～１０質量％である。本発明の一態様の組成物及び農薬の１回の使用量及び使用回数は、適用する線虫の種類及び数、適用対象、適用形態、温度、湿度、室内外などの適用環境に応じて適宜設定することができ、特に限定されないが、例えば、１回の使用量は有効成分である変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログあたり０．００１μｇ～１，０００ｍｇであり；使用回数は１日に１回～複数回又は数日～数週間ごとに１回～複数回である。本発明の一態様の組成物及び農薬は、一定期間、例えば、数週間～数ヶ月間に渡って適用することが好ましい。
【0068】
変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡが有するＣｅの成長抑制作用及びＣｅの産卵抑制作用は、２０℃及び１５℃に比べて、２５℃の場合に、強く発揮する傾向にある。そこで、本発明の一態様の組成物及び農薬を室外で使用する場合の時期は、好ましくは気温が２０℃以上である、より好ましくは２５℃以上である春、夏及び秋である。本発明の一態様の組成物及び農薬を室内で使用する場合は、温度を２０℃以上に設定することが好ましく、２５℃以上に設定することがより好ましい。
【0069】
本発明の一態様の組成物及び農薬は、有効成分として変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログを単独で使用してもよいが、１種又は２種以上の殺線虫剤と併用してもよい。
【0070】
本発明の一態様の組成物及び農薬の剤形は、含有する変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログが有効成分として作用及び効果を発揮する剤形であれば、特に限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤などの固形剤；液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤などが挙げられる。
【0071】
本発明の一態様の組成物及び農薬は、その剤形に応じて、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログと、薬学的に許容される担体、添加剤などとを用いて製剤化される。例えば、固形剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、ｐＨ調整剤などを用いて製剤化することができる。また、液剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液、界面活性剤、ｐＨ調整剤などを用いて製剤化することができる。
【0072】
本発明の一態様の組成物及び農薬は、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログが線虫の細胞内に移行され易いように、核酸導入補助剤とともに製剤化されることが好ましい。核酸導入補助剤としては、例えば、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、リポソーム、ポリアミン、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
本発明の一態様の組成物及び農薬は容器詰めされたものであることが好ましい。容器は特に限定されず、剤形などに応じて適宜選択できるが、例えば、コーティング紙、ＰＥＴやＰＴＰなどのプラスチック、アルミなどの金属、ガラスなどを素材とするパック、瓶、缶、パウチ、１層又は積層（ラミネート）のフィルム袋などが挙げられる。
【0074】
本発明の一態様の組成物及び農薬の使用方法は特に限定されないが、例えば、本発明の一態様の組成物及び農薬をそのまま、若しくは水などとともに、又は水などで希釈するなどして、使用することができる。
【0075】
本発明の別の一態様は、本発明の一態様の組成物又は農薬を利用する方法である。本発明の一態様の方法は、本発明の一態様の組成物又は農薬を、線虫に適用することにより、線虫の成長を抑制し、産卵を抑制し、ｒＲＮＡ前駆体の蓄積を促進し、及び／又はリボソームの合成を抑制する工程を含む、線虫を減弱化する方法又は線虫から植物を保護する方法である。投与方法、線虫の減弱化の確認方法などは、上記項目を適宜参照できる。
【0076】
［変異型核小体低分子ＲＮＡの製造方法］
本発明の別の一態様は、変異型核小体低分子ＲＮＡの製造方法である。本発明の一態様の製造方法は、生物体の２６Ｓ ｒＲＮＡ、２８Ｓ ｒＲＮＡなどのｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列の情報を基に、該塩基配列と比較的高度に相補的塩基対を形成するような核小体低分子ＲＮＡをデザインすることを基本構成とする。
本発明の別の一態様は、変異型核小体低分子ＲＮＡの製造方法である。本発明の一態様の製造方法は、生物体の２６Ｓ ｒＲＮＡ、２８Ｓ ｒＲＮＡなどのｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列の情報を基に、該塩基配列と比較的高度に相補的塩基対を形成するような核小体低分子ＲＮＡをデザインすることを基本構成とする。
【0077】
本発明の一態様の製造方法は、生物体のｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成して結合する核小体低分子ＲＮＡを取得する工程と、核小体低分子ＲＮＡの５’末端側の塩基配列を、ｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補性が高くなるように改変することにより、変異型核小体低分子ＲＮＡを得る工程とを少なくとも含む。
【0078】
「ｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補性が高くなるように改変すること」とは、変異前の野生型核小体低分子ＲＮＡよりも、５’末端側の塩基配列がｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成する数が多くなるように改変することを意味する。
【0079】
本発明の一態様の製造方法における各工程は、従来公知の方法を採用して実施することが可能である。例えば、生物体の２６Ｓ ｒＲＮＡ、２８Ｓ ｒＲＮＡなどのｒＲＮＡ前駆体の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）などの公共のデータベースを利用して検索可能である。
【0080】
生物体のｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成して結合する核小体低分子ＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードする遺伝子は、公知の方法により生物体から取得したゲノムＤＮＡ又はＲＮＡに対して、ｒＲＮＡ前駆体の塩基配列、野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの塩基配列（配列番号１）及びヒトＵ８ ｓｎｏＲＮＡの塩基配列（配列番号４）などの情報を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ伸長反応）、ハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡ作製技術などの公知の生物工学的手法を採用して取得することができる。
【0081】
取得した核小体低分子ＲＮＡは、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを取得したのと同様の方法を採用することにより、ｒＲＮＡ前駆体の５’末端側の塩基配列と相補性が高くなるように改変することができる。
【0082】
本発明の一態様の方法は、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【0083】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【0084】
［１．実施例の概要］
線虫としては、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓを用いた。
線虫としては、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓを用いた。
【0085】
線虫を、標準プロトコールであるＢｒｅｎｎｅｒの文献（Brenner, S., The genetics of Caehorhabditis elegans. Genetics 77: 71-94., 1974）によって培養した。線虫は、図３に示す株を使用した。
【0086】
ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡはＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＲＮｏｍｉｃｓにより発見されたｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡであり、ＩＶ番染色体上にコードされている。ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは核小体に局在し、その遺伝子欠損株（ＭＴ１６９３９）ではリボソーム大サブユニットｒＲＮＡ（ＬＳＵ ｒＲＮＡ）前駆体の蓄積が確認されている（非特許文献１を参照）。
【0087】
後述する結果が示すとおり、ＭＴ１６９３９に遺伝子ｃｅｒ－２ａをレスキューした株（ＭＴｃｅｒ）ではＬＳＵ ｒＲＮＡ前駆体の蓄積が解消された。したがって、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡはＬＳＵｒＲＮＡプロセシングにおける５．８Ｓ及び２６Ｓの切断に関与すると考えられる。これらのことから、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは脊椎動物ではＵ８ ｓｎｏＲＮＡの線虫ホモログであることが示唆される。
【0088】
ここでは、ＭＴ１６９３９、ＭＴｃｅｒ及び変異遺伝子ｃｅｒ－２ａ（ｃｅｒＸ）の導入株（ＭＴｃｅｒＸ）を用いて、継時的な体長測定及び産卵数計測を行った。また、線虫から株ごとに細胞抽出液を調製して、ショ糖密度勾配遠心法によってリボソームを分離し、４０Ｓ、６０Ｓ及び８０Ｓリボソームの割合を解析した。
【0089】
ＩＩ番染色体上にＭｏｓ１ トランスポゾンを有する株（ＭＴ４３２２）に、選択マーカー遺伝子（ｕｎｃ－１１９）及び遺伝子ｃｅｒ－２ａ（配列番号１）又は変異遺伝子ｃｅｒＸ（配列番号３）がコードされたプラスミドを注入し、相同組み換えを誘導することで遺伝子の導入を行った（ＭｏｓＳＣＩ法）。ＩＶ番染色体の欠損は全て、ＭＴ１６９３９の雄との交配に由来する。
【0090】
上記の各株の遺伝子型をまとめたものを図３に示す。
【0091】
［２．線虫の液体培養］
食料源として濃縮されたＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を用意するために、ＬＢ培地によりＷ３１１０を一晩前培養したもの（５０ｍｌ）を、ＬＢ培地（３Ｌ）に添加し、３７℃で１２５ｒｐｍ／ｍｉｎで振とうしながら８時間培養した。Ｗ３１１０は４，５００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離によって回収した。回収したＷ３１１０ペレットを５０ｍｌの蒸留水中に再懸濁して、Ｗ３１１０の再懸濁液を得た。
食料源として濃縮されたＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を用意するために、ＬＢ培地によりＷ３１１０を一晩前培養したもの（５０ｍｌ）を、ＬＢ培地（３Ｌ）に添加し、３７℃で１２５ｒｐｍ／ｍｉｎで振とうしながら８時間培養した。Ｗ３１１０は４，５００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離によって回収した。回収したＷ３１１０ペレットを５０ｍｌの蒸留水中に再懸濁して、Ｗ３１１０の再懸濁液を得た。
【0092】
様々な発生段階が混在している状態の線虫を、直径１５ｃｍのＮＧＭプレート上で、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＯＰ５０（ＣＧＣより入手）を一晩培養したもの２００μｌとともに播種して前培養した。線虫の前培養液（充填容積） 約４０μｌと、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０の再懸濁液 ２ｍｌとを含むＳ培地１００ｍｌを、２０℃で１２５ｒｐｍ／ｍｉｎで振とうしながら１６４時間培養し、次いで１ｍｌのＷ３１１０の再懸濁液を培養液に添加した。線虫をさらに２１時間培養し、６，０００ｒｐｍで３分間、４℃で遠心分離して回収した。線虫を、２Ｍ スクロースを用いたショ糖浮遊法によってＥ．ｃｏｌｉと分離し、１００ｍｇ／ｍｌ シクロへキシミドを含む０．１Ｍ ＮａＣｌを用いて洗浄した。１００ｍｌ Ｓ培地からの線虫の収量は、充填容積 ３００μｌ～４００μｌであった。
【0093】
［３．Ｍｏｓ１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｐｙ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ（ＭｏｓＳＣＩ）］
線虫株ＨＵＪ０００３及びＨＵＪ０００４は、Ｆｒｏｋｊａｒ－Ｊｅｎｓｅｎらの文献（Frokjar-Jensen et al., Single-copy insertion of transgene in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 40:1375-1383, 2008；Improved Mos1-mediated transgenesis in C. elegans. Nat Methods, 9:117-118, 2012）に記載のＭｏｓＳＣＩ法によって作製した。
線虫株ＨＵＪ０００３及びＨＵＪ０００４は、Ｆｒｏｋｊａｒ－Ｊｅｎｓｅｎらの文献（Frokjar-Jensen et al., Single-copy insertion of transgene in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 40:1375-1383, 2008；Improved Mos1-mediated transgenesis in C. elegans. Nat Methods, 9:117-118, 2012）に記載のＭｏｓＳＣＩ法によって作製した。
【0094】
ｃｅｒ－２ａ（８，４２８，４７８－８，４２９，１５７）及びｃｅｒ－２ｂ（４，８８０，３９１－４，８８１，４１２）を含むＩＶ番染色体のゲノムＤＮＡ領域を、それぞれプライマーＣＰ１及びＣＰ２並びにプライマーＣＰ３及びＣＰ４によりＰＣＲによって増幅した。
【0095】
得られた増幅産物を制限酵素ＳｂｆＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＣＦＪ１５１のマルチクローニングサイトに挿入した。得られたプラスミドを、それぞれｃｅｒ－２ａを有するｐＴＫＤ８４３及びｃｅｒ－２ｂを有するｐＴＫＤ８４４と名付けた。
【0096】
ｐＴＫＤ８４３及びｐＴＫＤ８４４を、共導入マーカーとしてｐＲＦ４（ｒｏｌ－６ （ｓｕ１００６）） ５０ｎｇ／μｌ及びｐＣＦＪ６０１（Ｐｅｆｔ－３：：Ｍｏｓ１ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ：：ｔｂｂ－２ ３’ＵＴＲ） ５０ｎｇ／μｌとともに線虫株ＥＧ４３２２に５０ｎｇ／μｌでマイクロインジェクション法により注入した。
【0097】
導入遺伝子が正しい遺伝子座中に挿入されたことを確認するために、シングルワームＰＣＲをプライマーＣＦ４２０及びＣＦ４２１を用いて実行した。Ｍｏｓ１エレメントの不在は、上記のＦｒｏｋｊａｒ－Ｊｅｎｓｅｎらの文献に従って、プライマーｏＪＬ１０２及びｏＪＬ１０３を用いたシングルワームＰＣＲによって検証した。得られたＩＩ番染色体にｃｅｒ－２ａ及びｃｅｒ－２ｂを導入した株は、それぞれＨＵＪ０００３及びＨＵＪ０００４と名付けた。
【0098】
ＨＵＪ０００３及びＨＵＪ０００４の雌雄同体をＭＴ１６９３９の雄と交配して得た株を、それぞれＨＵＪ０００５及びＨＵＪ０００６と名付けた。ＥＧ４３２２の雌雄同体をＭＴ１６９３９の雄と交配して得た株を、ＨＵＪ０００７（ＭＴ４３２２）と名付けた。
【0099】
変異株ＥＧ４３２２のＩＩ番染色体に、プラスミドｐＣＦＪ１５１（Ａｄｄｇｅｎｅより入手）を用いたＭｏｓＳＣＩ法により、Ｃｂ－ｕｎｃ－１１９をシングルコピーで挿入した。共導入マーカーとして５０ｎｇ／μｌ ｐＲＦ４（ｒｏｌ－６（ｓｕ１００６））と５０ｎｇ／μｌ ｐＣＦＪ６０１（Ｐｅｆｔ－３：：Ｍｏｓ１ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ：：ｔｂｂ－２ ３’ＵＴＲ）とを用いた。線虫へのＤＮＡの導入はマイクロインジェクション法により行った。得られた株をＨＵＪ００１１（ＥＧ１１９）と名付けた。
【0100】
ＭＴ１６９３９の雌雄同体をＨＵＪ００１１の雄と交配して得た株を、ＨＵＪ０００８（ＭＴ１１９）と名付けた。
【0101】
ＥＧ４３２２のＩＩ番染色体に、プラスミドｐＴＫＤ８４５を用いたＭｏｓＳＣＩ法により、ｃｅｒＸを含むＤＮＡ断片をシングルコピーで挿入した。共導入マーカーとして５０ｎｇ／μｌ ｐＲＦ４（ｒｏｌ－６（ｓｕ１００６））と５０ｎｇ／μｌ ｐＣＦＪ６０１（Ｐｅｆｔ－３：：Ｍｏｓ１ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ：：ｔｂｂ－２ ３’ＵＴＲ）を用いた。線虫へのＤＮＡの導入はマイクロインジェクション法により行った。得られた株をＨＵＪ００１２（Ｎ２ｃｅｒＸ）と名付けた。なお、ＨＵＪ００１２はＥＧ４３２２バックグラウンドでｃｅｒ－２ａをＩＩ番染色体に挿入してある。また、ＥＧ４３２２はＭｏｓＳＣＩ用の線虫株で、今回ＭｏｓＳＣＩ法により作製した変異株やそれらの変異株と交配することにより作製した株はＥＧ４３２２バックグラウンドとなっており、改変を加えているｃｅｒ－２ａ関連以外の遺伝子に関してはＮ２とほぼ同じである。
【0102】
ｐＴＫＤ８４５はｐＣＦＪ１５１のマルチクローニングサイトに、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ；ＯＥ－ＰＣＲ）により得たＤＮＡ断片を挿入して作製した。ｐＴＫＤ８４５はｃｅｒＸ及びその周辺の配列を有する。ＯＥ－ＰＣＲは２回のＰＣＲ反応から成る。１回目のＰＣＲは２種類の反応液から成る。１回目のＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡをそれぞれｐＴＫＤ８４３とし、プライマーｃｅｒ－２ａ－ＢＰｓｔｒ＿Ｆ及びプライマーｃｅｒ－２ａ＋１０５＋ｘｈｏを用いた反応、並びにプライマーｃｅｒ－２ａ－３９８＋ｓｂｆＩ及びプライマーｃｅｒ－２ａ－ＢＰｓｔｒ＿Ｒを用いた反応を実施した。２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲ反応液を混合して、制限酵素ＤｐｎＩで処理したものを鋳型に用いた。プライマーはｃｅｒ－２ａ＋１０５＋ｘｈｏ及びｃｅｒ－２ａ－３９８＋ｓｂｆＩを用いた。
【0103】
ＭＴ１６９３９の雌雄同体をＨＵＪ００１２の雄と交配して得た株を、ＨＵＪ０００９（ＭＴｃｅｒＸ）と名付けた。
【0104】
使用したプライマーの配列を表１に示す。
【0105】
【表1】
【0106】
［４．リアルタイムＰＣＲを使用した変異体中のＣｅＲ－２ａ及びＣｅＲ－２ｂ ＲＮＡの絶対的定量］
線虫から、トータルＲＮＡ １μｇ中におけるＣｅＲ－２ａ及びＣｅＲ－２ｂ ＲＮＡの絶対コピー数を、下記手順に従って検量線法を使用して計測した。
線虫から、トータルＲＮＡ １μｇ中におけるＣｅＲ－２ａ及びＣｅＲ－２ｂ ＲＮＡの絶対コピー数を、下記手順に従って検量線法を使用して計測した。
【0107】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用のテンプレートＤＮＡを、非特許文献１の記載に準じて、ネスティッドＰＣＲによって生成した。第１のＰＣＲは、テンプレートとしてｃｅｒ－２ａを含むｐＣＦＪ１５１を使用し、プライマーはＲＴＰ１及びＣｅＲ２ａＴ７Ｆ１を用いて実施した。第１のＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、プライマーＲＴＰ１及びＥｃｏＲＩＴ７を用いて第２のＰＣＲを実施した。なお、プライマーＣｅＲ２ａＴ７Ｆ１及びＥｃｏＲＩＴ７は、Ｔ７プロモータ配列領域を含む。
【0108】
第２のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用のテンプレートとして使用し、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）を用いてＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを生成した。転写物を定量し、ｑＲＴ－ＰＣＲのスタンダードサンプルとして使用した。ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの４．４×１０９～４．４×１０２コピーの１０倍連続希釈を使用した。
【0109】
トータルＲＮＡを、液体培地中で培養した線虫からＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて抽出し、次いでＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した。ｃＤＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）及びプライマーＲＴＰ１を用いて１μｇのトータルＲＮＡから合成した。得られたｃＤＮＡは、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）並びにｃｅｒ－２特異的プライマーＲＴＦ１及びＲＴＲ１を用いたリアルタイムＰＣＲに供した。リアルタイムＰＣＲは、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ ＯＰＴＩＣＯＮ ２ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して行った。閾線は、ＭＪ Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）用のデフォルト設定にしたがって設定した。ＣＴ値を、同じ条件下で計算した。絶対的定量によって、検量線に対するＣＴ値にしたがって各線虫株のＣｅＲ－２ ＲＮＡのコピー数を決定した。最終データは、トータルＲＮＡ １μｇごとのコピー数として表した。
【0110】
使用したプライマーの配列を表２に示す。
【0111】
【表2】
【0112】
［５．ノーザンハイブリダイゼーション］
線虫のトータルＲＮＡ（１μｇ）を、ホルムアルデヒドを含む１．０％変性アガロースゲル上で分離し、キャピラリーブロッティングによってＢｉｏｄｙｎｅ Ｐｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上にブロットした。オリゴヌクレオチドＮＢ１及びＮＢ２を、ＤＩＧ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ ２ｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＤＩＧ－ｄｄＵＴＰを用いてラベルして、ハイブリダイゼーション用のプローブとして使用した。
線虫のトータルＲＮＡ（１μｇ）を、ホルムアルデヒドを含む１．０％変性アガロースゲル上で分離し、キャピラリーブロッティングによってＢｉｏｄｙｎｅ Ｐｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上にブロットした。オリゴヌクレオチドＮＢ１及びＮＢ２を、ＤＩＧ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ ２ｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＤＩＧ－ｄｄＵＴＰを用いてラベルして、ハイブリダイゼーション用のプローブとして使用した。
【0113】
使用したオリゴヌクレオチドの配列を表３に示す。
【0114】
【表3】
【0115】
［６．リボソーム沈降プロファイルの測定］
リボソーム沈降プロファイルは、下記手順に従い、Ｋｉｒｓｔｅｉｎ－Ｍｉｌｅｓらの文献（Kirstein-Miles,J.,et al., The nascent polypeptide-associated complex is a key regulator of proteostasis. EMBO J. 32: 1451-1468, 2013）及びＳａｉｊｏｕらの文献（Saijou,E.,et al., RBD-1, a nucleolar RNA-binding protein, is essential for Caenorhabditis elegans early development through 18S ribosomal RNA processing. Nucleic Acids Res. 32: 1028-1036., 2004）に記載のショ糖密度勾配遠心法に軽微な修正を加えた方法によって分析した。
リボソーム沈降プロファイルは、下記手順に従い、Ｋｉｒｓｔｅｉｎ－Ｍｉｌｅｓらの文献（Kirstein-Miles,J.,et al., The nascent polypeptide-associated complex is a key regulator of proteostasis. EMBO J. 32: 1451-1468, 2013）及びＳａｉｊｏｕらの文献（Saijou,E.,et al., RBD-1, a nucleolar RNA-binding protein, is essential for Caenorhabditis elegans early development through 18S ribosomal RNA processing. Nucleic Acids Res. 32: 1028-1036., 2004）に記載のショ糖密度勾配遠心法に軽微な修正を加えた方法によって分析した。
【0116】
充填容積 約４００μｌの線虫を、溶解バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ ７．５］，２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２５０ｍＭ ｓｕｃｒｏｓｅ）に添加して混合した。得られた混合物を、Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ ＭＳ－１００（Ｔｏｍｙ Ｓｅｉｋｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して、３，５００ｒｐｍで２分間、４℃にてホモジナイズした。
【0117】
ホモジナイズ後の細胞デブリを、１４，０００ｇで１０分間、４℃にて遠心分離によって除去した。回収した上清を、１０～３０％（ｗ／ｖ）ショ糖密度勾配溶液上に重層し、３６，０００ｒｐｍで２００分、スイングアウトロータ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｐ４０ＳＴ－１７１４）内で４℃にて遠心分離した。各勾配を分画し、ＭＯＤＥＬ １５２ Ｐｉｓｔｏｎ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ ｉｐＴＭ（ＢｉｏＣｏｍｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）及びＥＣＯＮＯ ＵＶ ＭＯＮＩＴＯＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して２５４ｎｍの吸光度（Ａ２５４）を測定した。
【0118】
［７．線虫の体長の測定］
２０体のＬ１期線虫を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＰ５０を播種したＮＧＭプレート上に配置した。配置直後を時間０（ｔ＝０）として設定した。Ｌ１期線虫を播種したＮＧＭプレートを２０℃、２５℃又は１５℃でインキュベートした。
２０体のＬ１期線虫を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＰ５０を播種したＮＧＭプレート上に配置した。配置直後を時間０（ｔ＝０）として設定した。Ｌ１期線虫を播種したＮＧＭプレートを２０℃、２５℃又は１５℃でインキュベートした。
【0119】
線虫の画像を、デジタルカメラを用いて実体顕微鏡下（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＺ６０）で１２時間毎に撮影した。線虫を、４８時間毎にＥ．ｃｏｌｉ ＯＰ５０を播種したＮＧＭプレートに移し、Ｌ１期線虫がＬ２期に移ることを防いだ。
【0120】
体長は、線虫の鼻から肛門までをＩｍａｇｅＪ（Ｍｏｒｃｋ，Ｃ．，ａｎｄＰｉｌｏｎ，Ｍ．，２００６）を用いて計測した。データを、ｓｔａｇｅ ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ ＭＲ－４（ＮＡＤＥＣ ＣＯ．，ＬＴＤ．）を使用して、ピクセルからマイクロメータに変換した。Ｌ１期幼虫の鼻及び肛門は画像上で検出可能ではないので、１２時間後のデータを示す。
【0121】
［８．線虫の産卵アッセイ］
５０体のＬ１期線虫を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＰ５０を播種したＮＧＭプレート上に配置した。Ｌ１期線虫を播種したＮＧＭプレートを２０℃、２５℃又は１５℃でインキュベートした。
５０体のＬ１期線虫を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＰ５０を播種したＮＧＭプレート上に配置した。Ｌ１期線虫を播種したＮＧＭプレートを２０℃、２５℃又は１５℃でインキュベートした。
【0122】
線虫を、ヤングアダルト期後、プレート上に産卵するまで実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＺ６０）を用いて３時間毎に観察した。３時間ごとに、プレート上の線虫が産み出した卵の数を計測した。
【0123】
［９．結果］
２０℃及び２５℃でインキュベートした線虫の体長測定の結果を、それぞれ図４及び図５に示す。それぞれの図が示すとおり、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを発現するＮ２ｃｅｒＸ及びＭＴｃｅｒＸは、それぞれ対応するＮ２及びＭＴｃｅｒに対して、体長の伸長速度が遅かった。また、線虫を１５℃でインキュベートした場合においても、図４及び図５と同様の傾向を示すことがわかった。
２０℃及び２５℃でインキュベートした線虫の体長測定の結果を、それぞれ図４及び図５に示す。それぞれの図が示すとおり、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを発現するＮ２ｃｅｒＸ及びＭＴｃｅｒＸは、それぞれ対応するＮ２及びＭＴｃｅｒに対して、体長の伸長速度が遅かった。また、線虫を１５℃でインキュベートした場合においても、図４及び図５と同様の傾向を示すことがわかった。
【0124】
２０℃及び２５℃でインキュベートした線虫の産卵個数を測定した結果を、それぞれ図６及び図７に示す。また、２０℃及び２５℃でインキュベートした線虫の体長１ｍｍ到達時間及び産卵開始時間を測定した結果を、図８に示す。それぞれの図が示すとおり、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを発現するＮ２ｃｅｒＸ及びＭＴｃｅｒＸは、それぞれ対応するＮ２及びＭＴｃｅｒに対して、体長１ｍｍ到達時の時間及び産卵開始の時間が遅かった。また、線虫を１５℃でインキュベートした場合においても、図６～８と同様の傾向を示すことがわかった。
【0125】
以上の結果より、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、線虫に対して、成長抑制作用及び産卵抑制作用を示すことがわかった。特に、図８に示すように、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの有無を比較したＭＴｃｅｒ及びＭＴ４３２２（ＩＩＩ番染色体に遺伝子ｕｎｃ－１１９が存在すると想定される）との比較では、２０℃及び２５℃の体長１ｍｍ到達時間及び２５℃における産卵開始時間においてほとんど差がなく、ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの有無が線虫の表現型に影響をほとんど及ぼさないことがわかった。それにもかかわらず、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡが線虫の成長抑制作用及び線虫の産卵抑制作用を示すということは、本発明者らによって初めて見出された驚くべき知見である。
【0126】
リボソーム沈降プロファイルの測定結果を図９に示す。図９（Ａ）は、それぞれの線虫株から調製した細胞抽出液に対するショ糖密度遠心によって、リボソームを４０Ｓ、６０Ｓ及び８０Ｓに分離したことを示す模式図である。図９（Ｂ）は、得られた画分の２５４ｎｍにおける吸光度を測定し、画分ごとの吸光度をグラフ化した図である。図９（Ｃ）は、線虫株ごとにそれぞれのピークの面積を求めて、４０Ｓ、６０Ｓ及び８０Ｓの比率を算出した結果を示す図である。
【0127】
図９が示すとおり、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡを発現するＮ２ｃｅｒＸ及びＭＴｃｅｒＸは、それぞれ対応するＮ２及びＭＴｃｅｒに対して、２６Ｓ ｒＲＮＡがプロセシングを受けずに６０Ｓの量が少なくなり、４０Ｓ／６０Ｓの比率が大きくなった。これにより、変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡは、線虫に対して、ｒＲＮＡ前駆体蓄積促進作用及びリボソーム合成抑制作用を示すことがわかった。
【0128】
本明細書に記載のある塩基配列について、以下に示す。
［配列番号１］野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの塩基配列
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号２］２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列（５’末端側の１位～１００位の塩基配列を抜粋）
CUCAACCUGAACUCAGUCGUGAUUACCCGCUGAACUUAAGCAUAUCAUUUAGCGGAGGAAAAGAAACUAAAAAGGAUUCCCUUAGUAACGGCGAGUGAAA
［配列番号３］変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの塩基配列
GGGUAAUCAGUUUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号４］ヒトＵ８ ｓｎｏＲＮＡの塩基配列
AUCGUCAGGUGGGAUAAUCCUUACCUGUUCCUCCUCCGGAGGGCAGAUUAGAACAUGAUGAUUGGAGAUGCAUGAAACGUGAUUAACGUCUCUGCGUAAUCAGGACUUGCAACACCCUGAUUGCUCCUGUCUGAUU
［配列番号５］２８Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列（５’末端側の１位～１００位の塩基配列を抜粋）
CGCGACCUCAGAUCAGACGUGGCGACCCGCUGAAUUUAAGCAUAUUAGUCAGCGGAGGAGAAGAAACUAACCAGGAUUCCCUCAGUAACGGCGAGUGAAC
［配列番号６］Ｃｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の１４位～２０位の塩基からなる塩基配列と相補的である塩基配列
CAGUCGU
［配列番号７］変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの塩基配列において、８位と９位の間にＡＣＧＡＣＵＧが挿入されている配列
GGGUAAUCACGACUGAGUUUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号８］プライマーＣＰ１
AAACCTGCAGGTACTGGTACGATCCCTGTTC
［配列番号９］プライマーＣＰ２
AAACTCGAGATCGTGTATTTTATGTCAACG
［配列番号１０］プライマーＣＰ３
AAACCTGCAGGGGGAAAAATGAGTTGTAGGC
［配列番号１１］プライマーＣＰ４
AAACTCGAGCGAAAATCTACCAAATCCTG
［配列番号１２］プライマーＣＦ４２０
TTTCTCACATGTTTTGCTGC
［配列番号１３］プライマーＣＦ４２１
ACATTGTCGAAATGTCCTCC
［配列番号１４］プライマーｏＪＬ１０２
CAACCTTGACTGTCGAACCACCATAG
［配列番号１５］プライマーｏＪＬ１０３
TCTGCGAGTTGTTTTTGCGTTTGAG
［配列番号１６］プライマーＲＴＰ１
GTTCAGAATCGGGCTG
［配列番号１７］プライマーＣｅＲ２ａＴ７Ｆ１
CGACTCACTATAGTCTTCAGTATGGGTCA
［配列番号１８］プライマーＥｃｏＲＩＴ７
AAAGAATTCTAATACGACTCACTATA
［配列番号１９］プライマーＲＴＦ１
GTCAATCTCTGATCTGCAAC
［配列番号２０］プライマーＲＴＲ１
CGGGTATTGCGTTCCCA
［配列番号２１］プローブＮＢ１
TGGAACGTTGACATTTCGACACTCAACTGA
［配列番号２２］プローブＮＢ２
AAGAAGAAGCCTAGACGCATATAGCCACCA
［配列番号２３］変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの塩基配列において、１３位及び１４位の塩基がそれぞれ「Ｃ」と「Ａ」に置き換えられた配列
GGGUAAUCAGUUCAGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号２４］プローブｃｅｒ－２ａ－ＢＲｓｔｒ＿Ｆ
GGGTAATCAGTTTGGGTCAATCTCTGATCTG
［配列番号２５］プローブｃｅｒ－２ａ－１０５＋ｘｈｏ
AAACTCGAGATCGTGTATTTTATGTCAACG
［配列番号２６］プローブｃｅｒ－２ａ－ＢＲｓｔｒ＿Ｒ
ACCCAAACTGATTACCCGAGAAAGGGTGAAAGTGTGC
［配列番号２７］プローブｃｅｒ＋３９８＋ｓｂｆ
AAACCTGCAGGTACTGGTACGATCCCTGTTC
［配列番号２８］Ｃｅｌｅ（２ｂ）
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAAAUGAAGAGAUCGGGCGAUGAAAUUUUGUGAUUAAAUCGCACGGCGAGAUGGGAACGCAAUACCCGUCUGGCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号２９］Ｃｉｎｏ
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAAAUGAUGAGCUCGGGCGAUGAUCUUUUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号３０］Ｃｂｒｉ１
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUUUGUGAUUAAAUCGCACGGCGAGAUGGGAACGCAAUACCCGUCUGGCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号３１］Ｃｂｒｉ２
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAAAUGAAGAGAUCGGGCGAUGAAAUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGGGGUGGGAAACGCAAUACCUGACCGUCAGCCUCGAUUCUGACA
［配列番号３２］Ｃｒｅｍ１
UAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAAAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUAUAUCGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCAGCCCGAUUCUGAA
［配列番号３３］Ｃｒｅｍ２
UAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCCUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGUUGGGAACGCAAUACCUGACUGCCAGCCCGGUUCUGA
［配列番号３４］Ｃｂｒｅ１
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGACUCUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号３５］Ｃｂｒｅ３
UUGUCAUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAACAUGAUGAAAACGGGCGAUGAUCCAUCGGUGAUUAUAACGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCUGCCCGAAUCUGA
［配列番号３６］Ｃｂｒｅ４
UUGUCAUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAACAUGAUGAUAACGGGCGAUGAUCCAUCGGUGAUUAUAACGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCUGCCCGAAUCUGA
［配列番号３７］Ｃｂｒｅ５
UUGUCAUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAACAUGAUGAAAACGGGCGAUGAUCCUUUGGUGAUUAUAACGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCUGCCCGAAUCUGA
［配列番号３８］Ｈｃｏｎ
UUGUCUUCAGUAAGGGUCAAUUCAGACCUGAAUCUGAAUAUGAUGAGAUCGGGCGAUGAGUCAAAGUGAGUUACGACGCACGGAUCGUCGGGACCGCAACUCCCGUACGAGGCCCGAAUCUGAA
［配列番号３９］Ｓｍｕｒ
UCGGUCUCAGUAAGGGUCAAUUCAGACCUGAAUCUGAAACGUGAUGAGAUCGGGCGAUGAGUUCCAGAUGAGUUAAAGCGCACGGCGGCGCGAGUGUCGCAACUUGCGUUUGAUGCCUGAGUCUGAGUC
［配列番号４０］Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ ２６Ｓ ｒＲＮＡ
UGCAACCUGAGCUCAGGCGUGAUUACCCGCUGAACUUAAGCAUAUCACUUAGCGGAGA
［配列番号４１］Ｓｙｐｈａｃｉａ ｍｕｒｉｓ ２６Ｓ ｒＲＮＡ
UAGUACCUCAACUCAGUCGUGAUUACCCGCUGAAUUUAAGCAUAUACUAAGCGCGGAA
［配列番号４２］プライマーｃｅｒ－２ａ－ＢＰｓｔｒ＿Ｆ
GGGTAATCAGTTTGGGTCAATCTCTGATCTG
［配列番号４３］プライマーｃｅｒ－２ａ＋１０５＋ｘｈｏ
AAACTCGAGATCGTGTATTTTATGTCAACG
［配列番号４４］プライマーｃｅｒ－２ａ－３９８＋ｓｂｆＩ
AAACCTGCAGGTACTGGTACGATCCCTGTTC
［配列番号４５］プライマーｃｅｒ－２ａ－ＢＰｓｔｒ＿Ｒ
ACCCAAACTGATTACCCGAGAAAGGGTGAAAGTGTGC
［配列番号１］野生型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの塩基配列
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号２］２６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列（５’末端側の１位～１００位の塩基配列を抜粋）
CUCAACCUGAACUCAGUCGUGAUUACCCGCUGAACUUAAGCAUAUCAUUUAGCGGAGGAAAAGAAACUAAAAAGGAUUCCCUUAGUAACGGCGAGUGAAA
［配列番号３］変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの塩基配列
GGGUAAUCAGUUUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号４］ヒトＵ８ ｓｎｏＲＮＡの塩基配列
AUCGUCAGGUGGGAUAAUCCUUACCUGUUCCUCCUCCGGAGGGCAGAUUAGAACAUGAUGAUUGGAGAUGCAUGAAACGUGAUUAACGUCUCUGCGUAAUCAGGACUUGCAACACCCUGAUUGCUCCUGUCUGAUU
［配列番号５］２８Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列（５’末端側の１位～１００位の塩基配列を抜粋）
CGCGACCUCAGAUCAGACGUGGCGACCCGCUGAAUUUAAGCAUAUUAGUCAGCGGAGGAGAAGAAACUAACCAGGAUUCCCUCAGUAACGGCGAGUGAAC
［配列番号６］Ｃｅの２６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端側の１４位～２０位の塩基からなる塩基配列と相補的である塩基配列
CAGUCGU
［配列番号７］変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの塩基配列において、８位と９位の間にＡＣＧＡＣＵＧが挿入されている配列
GGGUAAUCACGACUGAGUUUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号８］プライマーＣＰ１
AAACCTGCAGGTACTGGTACGATCCCTGTTC
［配列番号９］プライマーＣＰ２
AAACTCGAGATCGTGTATTTTATGTCAACG
［配列番号１０］プライマーＣＰ３
AAACCTGCAGGGGGAAAAATGAGTTGTAGGC
［配列番号１１］プライマーＣＰ４
AAACTCGAGCGAAAATCTACCAAATCCTG
［配列番号１２］プライマーＣＦ４２０
TTTCTCACATGTTTTGCTGC
［配列番号１３］プライマーＣＦ４２１
ACATTGTCGAAATGTCCTCC
［配列番号１４］プライマーｏＪＬ１０２
CAACCTTGACTGTCGAACCACCATAG
［配列番号１５］プライマーｏＪＬ１０３
TCTGCGAGTTGTTTTTGCGTTTGAG
［配列番号１６］プライマーＲＴＰ１
GTTCAGAATCGGGCTG
［配列番号１７］プライマーＣｅＲ２ａＴ７Ｆ１
CGACTCACTATAGTCTTCAGTATGGGTCA
［配列番号１８］プライマーＥｃｏＲＩＴ７
AAAGAATTCTAATACGACTCACTATA
［配列番号１９］プライマーＲＴＦ１
GTCAATCTCTGATCTGCAAC
［配列番号２０］プライマーＲＴＲ１
CGGGTATTGCGTTCCCA
［配列番号２１］プローブＮＢ１
TGGAACGTTGACATTTCGACACTCAACTGA
［配列番号２２］プローブＮＢ２
AAGAAGAAGCCTAGACGCATATAGCCACCA
［配列番号２３］変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡの塩基配列において、１３位及び１４位の塩基がそれぞれ「Ｃ」と「Ａ」に置き換えられた配列
GGGUAAUCAGUUCAGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号２４］プローブｃｅｒ－２ａ－ＢＲｓｔｒ＿Ｆ
GGGTAATCAGTTTGGGTCAATCTCTGATCTG
［配列番号２５］プローブｃｅｒ－２ａ－１０５＋ｘｈｏ
AAACTCGAGATCGTGTATTTTATGTCAACG
［配列番号２６］プローブｃｅｒ－２ａ－ＢＲｓｔｒ＿Ｒ
ACCCAAACTGATTACCCGAGAAAGGGTGAAAGTGTGC
［配列番号２７］プローブｃｅｒ＋３９８＋ｓｂｆ
AAACCTGCAGGTACTGGTACGATCCCTGTTC
［配列番号２８］Ｃｅｌｅ（２ｂ）
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAAAUGAAGAGAUCGGGCGAUGAAAUUUUGUGAUUAAAUCGCACGGCGAGAUGGGAACGCAAUACCCGUCUGGCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号２９］Ｃｉｎｏ
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAAAUGAUGAGCUCGGGCGAUGAUCUUUUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号３０］Ｃｂｒｉ１
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUUUGUGAUUAAAUCGCACGGCGAGAUGGGAACGCAAUACCCGUCUGGCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号３１］Ｃｂｒｉ２
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAAAUGAAGAGAUCGGGCGAUGAAAUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGGGGUGGGAAACGCAAUACCUGACCGUCAGCCUCGAUUCUGACA
［配列番号３２］Ｃｒｅｍ１
UAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAAAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUAUAUCGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCAGCCCGAUUCUGAA
［配列番号３３］Ｃｒｅｍ２
UAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCCUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGUUGGGAACGCAAUACCUGACUGCCAGCCCGGUUCUGA
［配列番号３４］Ｃｂｒｅ１
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGACUCUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
［配列番号３５］Ｃｂｒｅ３
UUGUCAUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAACAUGAUGAAAACGGGCGAUGAUCCAUCGGUGAUUAUAACGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCUGCCCGAAUCUGA
［配列番号３６］Ｃｂｒｅ４
UUGUCAUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAACAUGAUGAUAACGGGCGAUGAUCCAUCGGUGAUUAUAACGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCUGCCCGAAUCUGA
［配列番号３７］Ｃｂｒｅ５
UUGUCAUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAACAUGAUGAAAACGGGCGAUGAUCCUUUGGUGAUUAUAACGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCUGCCCGAAUCUGA
［配列番号３８］Ｈｃｏｎ
UUGUCUUCAGUAAGGGUCAAUUCAGACCUGAAUCUGAAUAUGAUGAGAUCGGGCGAUGAGUCAAAGUGAGUUACGACGCACGGAUCGUCGGGACCGCAACUCCCGUACGAGGCCCGAAUCUGAA
［配列番号３９］Ｓｍｕｒ
UCGGUCUCAGUAAGGGUCAAUUCAGACCUGAAUCUGAAACGUGAUGAGAUCGGGCGAUGAGUUCCAGAUGAGUUAAAGCGCACGGCGGCGCGAGUGUCGCAACUUGCGUUUGAUGCCUGAGUCUGAGUC
［配列番号４０］Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ ２６Ｓ ｒＲＮＡ
UGCAACCUGAGCUCAGGCGUGAUUACCCGCUGAACUUAAGCAUAUCACUUAGCGGAGA
［配列番号４１］Ｓｙｐｈａｃｉａ ｍｕｒｉｓ ２６Ｓ ｒＲＮＡ
UAGUACCUCAACUCAGUCGUGAUUACCCGCUGAAUUUAAGCAUAUACUAAGCGCGGAA
［配列番号４２］プライマーｃｅｒ－２ａ－ＢＰｓｔｒ＿Ｆ
GGGTAATCAGTTTGGGTCAATCTCTGATCTG
［配列番号４３］プライマーｃｅｒ－２ａ＋１０５＋ｘｈｏ
AAACTCGAGATCGTGTATTTTATGTCAACG
［配列番号４４］プライマーｃｅｒ－２ａ－３９８＋ｓｂｆＩ
AAACCTGCAGGTACTGGTACGATCCCTGTTC
［配列番号４５］プライマーｃｅｒ－２ａ－ＢＰｓｔｒ＿Ｒ
ACCCAAACTGATTACCCGAGAAAGGGTGAAAGTGTGC
【産業上の利用可能性】
【0129】
本発明の一態様の変異型ＣｅＲ－２ａ ＲＮＡホモログ、組成物及び農薬は、線虫の体長伸長速度の抑制及び産卵開始の遅延などを誘導することにより、線虫による有害事象が生じる植物を保護及び成長促進するために利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】