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特許7406831スピラマイシン産生菌、カリマイシン産生菌、作製方法、応用、及び生成物の産生量を増加させる方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-20
(45)【発行日】2023-12-28
(54)【発明の名称】スピラマイシン産生菌、カリマイシン産生菌、作製方法、応用、及び生成物の産生量を増加させる方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20231221BHJP
C12P 19/62 20060101ALI20231221BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231221BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20231221BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P19/62
C12N15/31
C12N15/63 Z
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021535984
(86)(22)【出願日】2019-12-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-10
(86)【国際出願番号】 CN2019124724
(87)【国際公開番号】W WO2020125531
(87)【国際公開日】2020-06-25
【審査請求日】2021-12-06
(31)【優先権主張番号】201811577592.8
(32)【優先日】2018-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【微生物の受託番号】CGMCC CGMCC 16056
【微生物の受託番号】CGMCC CGMCC 16055
(73)【特許権者】
【識別番号】518232320
【氏名又は名称】沈陽福洋医薬科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＹＡＮＧ ＦＵＹＡＮＧ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】姜恩鴻
(72)【発明者】
【氏名】赫衛清
(72)【発明者】
【氏名】趙小峰
(72)【発明者】
【氏名】姜勲雷
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００６－５０１８６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３２９８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】LIU, Jing, et al.，Metabolic Engineering，2017年，Vol. 39，pp. 29-37
【文献】LIU, Jing, et al.，Applied Microbiology and Biotechnology，2017年，Vol. 101，pp. 5773-5783
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
菌株内のＬｒｐ遺伝子が不活化しており、前記菌株の保管番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１６０５６であることを特徴とするスピラマイシン産生菌。
【請求項2】
菌株内のＬｒｐ遺伝子が不活化しており、前記菌株の保管番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１６０５５であることを特徴とするカリマイシン産生菌。
【請求項3】
前記Ｌｒｐタンパク質のアミノ酸配列はＳｅｑ．２で示されることを特徴とする、請求項１に記載のスピラマイシン産生菌、又は請求項２に記載のカリマイシン産生菌。
【請求項4】
前記Ｌｒｐ遺伝子のヌクレオチド配列はＳｅｑ．１で示されることを特徴とする、請求項３に記載のスピラマイシン産生菌、又は請求項３に記載のカリマイシン産生菌。
【請求項5】
前記Ｌｒｐ遺伝子の不活性化が全部のノックアウトにより行われることを特徴とする、請求項１に記載のスピラマイシン産生菌、又は請求項２に記載のカリマイシン産生菌。【請求項6】
スピラマイシン産生菌及び／又はカリマイシン産生菌の作製方法であって、（１）Ｌｒｐ遺伝子を不活化するための組換えベクターを作製して、スピラマイシン産生菌及び／又はカリマイシン産生菌に導入し、
（２）Ｌｒｐ遺伝子が不活化した組換え菌をスクリーニングにより取得すること
を含み、
スピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌のゲノムを鋳型とし、全部又は部分的にＬｒｐ遺伝子をノックアウトすることを原則に、適切な部位にプライマーを設計して、左右のアームにおける遺伝子断片をＰＣＲ増幅し、ノックアウトベクターにクローニングすることで組換えベクターを作製し、これをスピラマイシン産生菌及び／又はカリマイシン産生菌に導入して、Ｌｒｐ遺伝子が不活化した組換え菌を耐性及び継代スクリーニングにより取得することを特徴とする、作製方法。
【請求項7】
スピラマイシン及び／又はカリマイシンの成分IIIの産生量を増加させる方法であって、（１）スピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌の染色体上のＬｒｐ遺伝子を改変してＬｒｐ遺伝子を不活化させ、
（２）ステップ（１）で改変したスピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌を用いて発酵生産を行うこと
を含む、方法。
【請求項8】
スピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌におけるＬｒｐ遺伝子を不活化したあと、スピラマイシン生合成経路関連遺伝子、アラニン生合成経路関連遺伝子、及びアシルＣｏＡ代謝経路関連遺伝子の発現を向上させることで、スピラマイシン及び／又はカリマイシンの成分IIIの産生量を増加させることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項9】
改変したスピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌を種培養、発酵培養したあとに発酵液を抽出し、取得した発酵生成物をＨＰＬＣで測定分析することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項10】
Ｌｒｐ遺伝子の不活化は、部分的なノックアウト又は全部のノックアウトにより行われることを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物遺伝子工学の分野に属し、スピラマイシン産生菌、カリマイシン産生菌、作製方法、応用、及び生成物の産生量を増加させる方法に関し、具体的には、調節遺伝子の作用と、抗生物質の産生量及び有効成分を増加させる方法、並びにその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
カリマイシンは、かつて、シェンジマイシン（Ｓｈｅｎｇｊｉｍｙｃｉｎ）、ビテスピラマイシン（Ｂｉｔｅｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）とも称され、合成生物学技術によって、カルボマイシン産生菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）の４”－イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子（ｉｓｔ）をスピラマイシン産生菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ Ｆ２１）にクローニングし、発現させることで得られる遺伝子操作菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＷＳＪ－１）の発酵生成物である（特許文献１、特許文献２）。カリマイシンは多成分抗生物質であり、４”－イソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Iを主成分としている。これらの成分ＩＩＩ、ＩＩ、Iは、３位のＯＲ基（順に、プロピオニル基、アセチル基、ヒドロキシ基）により命名されている。カリマイシンの構造式は次の通りである。
【0003】
【化1】
【0004】
カリマイシンの構造式
イソバレリルスピラマイシンIII：Ｒ＝ＣＯＣＨ２ＣＨ３
Ｒ′＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２
イソバレリルスピラマイシンII ：Ｒ＝ＣＯＣＨ３
Ｒ′＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２
イソバレリルスピラマイシンI ：Ｒ＝Ｈ
Ｒ′＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２
イソバレリルスピラマイシンIII：Ｒ＝ＣＯＣＨ２ＣＨ３
Ｒ′＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２
イソバレリルスピラマイシンII ：Ｒ＝ＣＯＣＨ３
Ｒ′＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２
イソバレリルスピラマイシンI ：Ｒ＝Ｈ
Ｒ′＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２
【0005】
カリマイシンは、新薬の１つとしてすでに新薬審査段階に入っており、品質基準において、成分IIIを３０％以上とすべき旨を規定している。
【0006】
ストレプトマイセス属には一連の調節遺伝子が存在しており、その転写を活性化又は抑制することで、二次代謝産物の生合成が向上する結果、産生量を増加させられる（非特許文献１）。ロイシン応答調節タンパク質（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｒｐ）は転写調節因子であり、調節遺伝子のプロモーター配列に結合することで、調節遺伝子の転写活性を活性化又は抑制して、多くの微生物の生理的代謝を制御する（非特許文献２、非特許文献３）。例えば、分枝鎖アミノ酸の代謝、鞭毛の合成、病原性因子の抑制、ポリアミンの恒常性及びメタノールの同化等の過程を制御する（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。しかし、これまで、抗生物質の生合成におけるＬｒｐ遺伝子の機能や働きについては研究報告が少なく、Ｌｉｕ他（非特許文献９）のみが、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）において、Ｌｒｐタンパク質ファミリーＬｒｐ／ＡｓｎＣ調節因子ＳＣＯ３３６１のコード遺伝子が不足した場合に、アクチノロージンの産生量が明らかに減少するほか、固形培地における気中菌糸及び胞子の形成が抑制されることを発見している。このことから、当該調節因子は多能性の調節因子であり、二次代謝及び形態の発育を調節すると考えられる（非特許文献１０）。且つ、Ｌｉｕらは、エリスロマイシン産生菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）において、ＳＡＣＥ＿Ｌｒｐ遺伝子の欠損によりエリスロマイシンの発酵産生量を増加させられることも発見している（非特許文献１１）。しかし、ｌｒｐ遺伝子の改変によって抗生物質成分の産生量及び比率を増加させたとの研究は、今のところ報告がない。
【0007】
上記に鑑みて、本発明を提案する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】中国特許第ＺＬ９７１０４４４０６号明細書
【文献】中国特許第ＺＬ０２１４８７７１５号明細書
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｂｅｋｋｅｒ Ｖ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ．２０１４，５（５）：２９３－２９９
【文献】Ｐｅｅｔｅｒｓ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈａｅａ．２０１０，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ７５０４５７
【文献】Ｕｎｏａｒｕｍｈｉ Ｙ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｅｖｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１６ １６（１）：１１１
【文献】Ｈａｎｅｙ ＳＡ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２，１７４（１）：１０８－１１５
【文献】Ｂｒａａｔｅｎ ＢＡ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２，８９（１０）：４２５０－４
【文献】Ｂａｅｋ ＣＨ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００９， １９１（４）：１２７８－９２
【文献】Ｉｓｈｉｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１８，１２５（１）：６７－７５
【文献】Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＪＥ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１８ ４５：６７－７４
【文献】Ｌｉｕ Ｊ．ａｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７，１０１（１４）：５７７３－５７８３
【文献】Ｌｉｕ Ｊ ａｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１７，３９：２９－３７
【文献】Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１７，３９：２９－３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明が解決しようとする技術的課題は、従来技術の瑕疵を解消するために、スピラマイシン産生菌、カリマイシン産生菌、作製方法、応用、及び生成物の産生量を増加させる方法を提供することである。本発明では、Ｌｒｐ遺伝子を不活化することで、スピラマイシンの産生量を増加させるとともに、その誘導体であるカリマイシンの主成分４’’－イソバレリルスピラマイシンIIIの産生量と比率も大幅に増加させた。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上記の技術的課題を解決するために、本発明が採用する技術方案の基本思想は以下の通りである。
【0012】
本実験室では、スピラマイシン産生菌Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１において、バイオインフォマティクス解析により、ｏｒｆ＿５５９１－ｌｒｐ遺伝子を発見した。当該遺伝子とＳ．ｆｌａｖｉｄｏｖｉｒｅｎｓのＬｒｐ／ＡｓｎＣファミリー転写調節因子との相同性はそれぞれ９３％／３４％であった。また、Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓにおける正の調節遺伝子ｏｒｆ４２（ｓｒｍ４０の相同遺伝子）及びｏｒｆ２３（ｓｒｍ２２の相同遺伝子）のプロモーター領域と、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓにおける正の調節遺伝子ａｃｙＢ２及びｉｓｔの遺伝子間配列を解析したところ、いずれにもＬｒｐの特徴的結合配列ＹＡＧＨＡＷＡＴＴＷＴＤＣＴＲが含まれていることを発見した（Ｈ＝Ｇではなく、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｄ＝Ｃではない）。本発明の目的は、Ｌｒｐ遺伝子の改変によって、スピラマイシンと、その誘導体であるカリマイシンの主成分４’’－イソバレリルスピラマイシンIIIの産生量及び比率を増加させることである。
【0013】
本発明の第１の目的は、菌株内のＬｒｐ遺伝子が不活化しており、前記菌株の保管番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１６０５６であるスピラマイシン産生菌を提供することである。
【0014】
本発明の第２の目的は、菌株内のＬｒｐ遺伝子が不活化しており、前記菌株の保管番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１６０５５であるカリマイシン産生菌を提供することである。
【0015】
更なる方案において、上記のスピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌のうち、上記のＬｒｐ遺伝子のヌクレオチド配列はＳｅｑ．１で示され、好ましくは、Ｌｒｐタンパク質のアミノ酸配列はＳｅｑ．２で示される。
【0016】
本発明の第３の目的は、スピラマイシン産生菌及び／又はカリマイシン産生菌の作製方法を提供することである。当該作製方法は、以下を含む。
【0017】
（１）Ｌｒｐ遺伝子を不活化するための組換えベクターを作製して、スピラマイシン産生菌及び／又はカリマイシン産生菌に導入する。
【0018】
（２）Ｌｒｐ遺伝子が不活化した組換え菌をスクリーニングにより取得する。
【0019】
更なる方案において、スピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌のゲノムを鋳型とし、全部又は部分的にＬｒｐ遺伝子をノックアウトすることを原則に、適切な部位にプライマーを設計して、左右のアームにおける遺伝子断片をＰＣＲ増幅し、ノックアウトベクターにクローニングすることで組換えベクターを作製し、これをスピラマイシン産生菌及び／又はカリマイシン産生菌に導入して、Ｌｒｐ遺伝子が不活化した組換え菌を耐性及び継代スクリーニングにより取得する。
【0020】
本発明の第４の目的は、スピラマイシンの産生量の増加におけるスピラマイシン産生菌の応用を提供することであり、スピラマイシン産生菌におけるＬｒｐ遺伝子が不活化している。
【0021】
本発明の第５の目的は、カリマイシンの成分IIIの産生量増加におけるカリマイシン産生菌の応用を提供することであり、カリマイシン産生菌におけるＬｒｐ遺伝子が不活化している。
【0022】
本発明の第６の目的は、スピラマイシン及び／又はカリマイシンの成分IIIの産生量を増加させる方法を提供することである。当該方法は、以下を含む。
【0023】
（１）スピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌の染色体上のＬｒｐ遺伝子を改変してＬｒｐ遺伝子を不活化させる。
【0024】
（２）ステップ（１）で改変したスピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌を用いて発酵生産を行う。
【0025】
好ましい方案において、スピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌におけるＬｒｐ遺伝子を不活化したあと、スピラマイシン生合成経路関連遺伝子、アラニン生合成経路関連遺伝子、及びアシルＣｏＡ代謝経路関連遺伝子の発現を向上させることで、スピラマイシン及び／又はカリマイシンの成分IIIの産生量を増加させる。
【0026】
更なる方案において、改変したスピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌を種培養、発酵培養したあとに発酵液を抽出し、取得した発酵生成物をＨＰＬＣで測定分析する。
【0027】
更なる方案において、上記のＬｒｐ遺伝子の不活化には、挿入、突然変異、部分的なノックアウト又は全部のノックアウトが含まれる。
【発明の効果】
【0028】
上記の技術方案を用いることで、本発明は従来技術と比較して以下の有益な効果を有する。
【0029】
本発明では、スピラマイシン産生菌又はカリマイシン産生菌の染色体上のＬｒｐ遺伝子を改変してＬｒｐ遺伝子を不活化させることで、スピラマイシン生合成経路関連遺伝子の発現が促進され、アラニン生合成経路関連遺伝子が高発現してスピラマイシンの成分IIIの前駆体－プロピオニル基の供給が増加し、アシルＣｏＡ代謝経路関連遺伝子の発現が向上してスピラマイシンの巨大ラクトン環の形成における脂肪酸鎖の合成が促進される。これにより、スピラマイシンの産生量が増加するとともに、その誘導体であるカリマイシンの主成分４’’－イソバレリルスピラマイシンIIIの産生量と比率も大幅に増加する。
【0030】
以下に、図面を組み合わせて、本発明の具体的実施形態につき更に詳細に述べる。
【0031】
図面は、本発明の一部として本発明の更なる理解のために用いられる。また、本発明の概略的実施例及びその説明は本発明の解釈のために用いられるが、本発明を不当に限定するものではない。なお、言うまでもなく、以下で記載する図面は実施例の一部にすぎず、当業者であれば、創造的労働を要することなくこれらの図面から更にその他の図面を得ることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図2】図２は、精製したＬｒｐタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、図中の１は誘導前菌体、２は誘導後菌体、３は誘導後沈殿、４は誘導後上清、５は精製後タンパク質、ＭはＰｒｏｔｅｉｎ Ｍａｋｅｒである。
【図3】図３は、Ｌｒｐタンパク質と、プロモーター領域Ｐｏｒｆ４２、Ｐｏｒｆ２３及びＰｉｓｔ－ａｃｙＢ２との結合のＥＭＳＡ解析であり、図中のＣ１はＰｏｒｆ４２－Ｌｒｐ複合体、Ｃ２はＰｏｒｆ２３－Ｌｒｐ複合体、Ｃ３はＰｉｓｔ－ａｃｙＢ２－Ｌｒｐ複合体、Ｎは非特異性対照ＤＮＡ（ｐＱＥ９ベクター上の配列）である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
説明すべき点として、これらの図面及び文字記載は何らかの方式で本発明の構想の範囲を制限するとの意図ではなく、特定の実施例を参照して当業者に本発明の概念を説明するためのものである。
【0034】
本発明における実施例の目的、技術方案及び利点をより明確とすべく、以下では、本発明の実施例にかかる図面を組み合わせて、実施例の技術方案につき明瞭簡潔に述べる。なお、以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例1】
【0035】
大腸菌におけるＬｒｐタンパク質の発現及び精製
【0036】
プライマーｌｒｐ－Ｆ及びｌｒｐ－Ｒ（表１参照）を用い、Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１原株（唐莉他、生物工程学報１９９１、１２４－１３１）の総ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＬｒｐ遺伝子断片を取得し、これをｐＱＥ９ベクター（上海君瑞生物技術有限公司から購入）にクローニングした。そして、そのＮ末端にＨｉｓ６タグを結合し、ｐＱＥ９－ｌｒｐ組換えプラスミドを作製した。続いて、これをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（北京全式金生物技術有限公司）に形質転換した。形質転換体はＬＢ培地で培養し、０．５ｍＭのＩＰＴＧ、１６℃で８～１０ｈ発現誘導した。そして、Ｈｉｓ６タグを結合したＬｒｐタンパク質をＮｉ２＋－ＮＴＡカラム（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社）を用いて精製した。Ｌｒｐタンパク質が有すると考えられる３次元構造を図１に示す。また、精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定したところ、結果は図２に示す通りとなった。
【0037】
【表1】
【実施例2】
【0038】
ゲルシフト又は電気泳動移動度シフトアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ，ＥＭＳＡ）によって、Ｌｒｐタンパク質と、調節遺伝子ｉｓｔ－ａｃｙＢ２、ｏｒｆ４２（ｓｒｍ４０の相同遺伝子）及びｏｒｆ２３（ｓｒｍ２２の相同遺伝子）のプロモーター領域との結合を測定した。
【0039】
対応するプライマーを用いてＰＣＲを行い（表１参照）、ｉｓｔ－ａｃｙＢ２遺伝子間、ｏｒｆ４２及びｏｒｆ２３のプロモーター領域における配列断片をそれぞれ取得した。そして、０．４ｎｇのＤＮＡを採取し、異なる濃度（０．４ｎｇ、１．０ｎｇ、２．０ｎｇ）のＬｒｐタンパク質と反応させた。反応は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＤＴＴを含む２０μＬの５％（ｖ／ｖ）グリセリン溶液内で行った。また、０．１ｎｇ／μＬのｐＱＥ９ベクターにおける一部の配列を対照ＤＮＡとし、３００μｇ／ｍＬのアセチル化ウシ血清アルブミンを対照として、室温で２０ｍｉｎ反応させた。そして、１０μＬを採取し、５％ポリアクリルアミドゲル、Ｔｒｉｓ－ホウ酸－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．７）中で電気泳動させた。続いて、ＧｅｌＲｅｄ溶液（ＢｉｏＴｉｕｍ社）で２０ｍｉｎ染色してから水で２度洗浄し、ゲルイメージングシステム（Ｔａｎｏｎ社）を用いて走査した。
【0040】
その結果、Ｌｒｐタンパク質は、ｉｓｔ－ａｃｙＢ２、ｏｒｆ４２及びｏｒｆ２３のプロモーター領域とそれぞれ結合可能であり（図３）、Ｌｒｐタンパク質が転写調節因子であることが示された。これより、Ｌｒｐタンパク質は、スピラマイシン（ＳＰ）又はカリマイシン（ＢＴ）の生合成における正の調節遺伝子ａｃｙＢ２、ｏｒｆ４２及びｏｒｆ２３を調節可能であり、ＢＴ又はＳＰの生合成経路に影響を及ぼすと推測された。
【実施例3】
【0041】
ｌｒｐ遺伝子欠損スピラマイシン産生菌△ｌｒｐ－ＳＰ変異株の作製
【0042】
スピラマイシンの調節遺伝子に対するＬｒｐの作用と、スピラマイシンの生合成に対するＬｒｐの影響を研究するために、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９ストレプトマイセス属遺伝子編集システム（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ），２０１５，４７（４）：２３１－２４３）及びオーバーラップＰＣＲ手法を用いて、Ｌｒｐ遺伝子を３２７ｂｐ削除した。次に、設計したプライマーｌｒｐ－ＡＦ、ｌｒｐ－１０９ＬｙｓＲ、プライマーｌｒｐ－１０９ＬｙｓＦ、ｌｒｐ－ＡＲを用い、Ｌｒｐ遺伝子の左右のアームにおける１．３ｋｂ及び１．０ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ増幅した。そして、これら２つの断片をオーバーラップＰＣＲで連結し、酵素切断部位ＸｂａＩ及びＨｉｎｄIIIでｐＫＣｃａｓ９ｄＯベクターにクローニングすることで（Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ），２０１５，４７（４）：２３１－２４３）、組換えベクターｐＫＣ－ｌｒｐＬＲを取得した。
【0043】
続いて、作製した組換えベクターをＳ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１に形質転換し、継代及び耐性スクリーニングによって突然変異株を選別したあと、ＰＣＲ及びシーケンシングにより検証を行った。その結果、図４に示すように、Ｌｒｐ遺伝子が確かに切断されたことで、△ｌｒｐ－ＳＰ変異株の作製に成功したことが証明された。
【0044】
本出願で作製した△ｌｒｐ－ＳＰ変異株は、Ｌｒｐ遺伝子を欠損したスピラマイシン産生菌であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓと分類及び命名するとともに、２０１８年７月１６日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心に提出し、保管した。なお、住所は北京市朝陽区北辰西路１号院３号、保管番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１６０５６である。
【0045】
本実施例で使用した方法は本発明の内容を説明するためのものに過ぎず、本発明はこれに限らない。本発明を実施するために、当業者は、分子生物学における汎用技術を応用して、スピラマイシン及びカリマイシン産生菌のゲノムを鋳型とし、Ｌｒｐの遺伝子構造を破壊することを原則に、適切な部位に２対のプライマーを設計して、左右のアームにおける遺伝子断片をＰＣＲ増幅し、ベクターにクローニングすることで、組換えベクターを作製することが可能である。そして、この組換えベクターを遺伝子相同組換えによって産生菌に導入することで、Ｌｒｐ遺伝子破壊変異株が得られる。
【実施例4】
【0046】
Ｌｒｐ遺伝子欠損カリマイシン産生菌△ｌｒｐ－ＢＴ株の作製
【0047】
△ｌｒｐ－ＳＰ変異株によりカリマイシンを合成可能とするために、ｐＳＥＴ－ｅｒｍＥ＊ｐ－ｉｓｔプラスミド（張家瑚他、生物工程学報、２０１４、３０（９）：１３９０－１４００）を△ｌｒｐ－ＳＰ変異株に形質転換するとともに、Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１原株に形質転換して、Ｌｒｐ遺伝子を欠損したカリマイシン産生菌△ｌｒｐ－ＢＴと、その対照株Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１－ＢＴを取得した。
【0048】
本出願で作製した△ｌｒｐ－ＢＴ変異株は、Ｌｒｐ遺伝子を欠損したカリマイシン産生菌であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓと分類及び命名するとともに、２０１８年７月４日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心に提出し、保管した。なお、住所は北京市朝陽区北辰西路１号院３号、保管番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１６０５５である。
【0049】
本発明は、カリマイシン産生菌（中国特許第ＺＬ９７１０４４４０．６号、第ＺＬ０２１４８７７１１．５号）において、実施例３で記載した汎用の方法をそのまま用い、Ｌｒｐ遺伝子を破壊することで、△ｌｒｐ－ＢＴ株を取得してもよい。
【実施例5】
【0050】
△ｌｒｐ－ＳＰ及び△ｌｒｐ－ＢＴ変異株の発酵生成物の産生量及び成分測定
【0051】
変異株と、対照株である原株の胞子を３０ｍｌ／２５０ｍｌのフラスコに移植し、ＴＳＢ（Ｋｉｅｓｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｐ４１２）培地を用いて、２８℃で４８ｈ種培養したあと、３０℃で６ｄ発酵培養した。次に、適量の発酵培地を採取し、１００００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を定量採取して酢酸エチルで抽出した。抽出後の沈殿は等量のアセトニトリルで溶解し、０．２２μｍの有機相フィルタで濾過したあと、ＨＰＬＣ測定を行った。測定条件としては、アジレント社製高速液体クロマトグラフ（１２００Ｓｅｒｉｅｓ）を用い、クロマトグラフィーカラムをＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、流動相を１００％アセトニトリル：１０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０）＝１：１、流速を１ｍＬ／ｍｉｎ、測定波長を２３２ｎｍとした。そして、ピーク面積でＳＰ及びＢＴの成分含有量を定量分析した。
【0052】
変異株△ｌｒｐ－ＳＰ及び△ｌｒｐ－ＢＴと、原株Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１及び１９４１－ＢＴを発酵させて抽出したあと、ＨＰＬＣ測定を行ったところ、結果は図５に示す通りとなった。なお、液相のピーク面積分析データについては表２を参照する。
【0053】
【表2】
【0054】
結果から明らかなように、△ｌｒｐ－ＳＰ変異株のＳＰ産生量は原株の７６．３％から８１．５％まで上昇した。また、ＳＰIIIが占める割合は、Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１よりも大幅に増加し、原株の２４．４％から３３．０％まで上昇した。つまり、１．３７倍上昇した。一方、△ｌｒｐ－ＢＴ変異株のＩＳＰ総産生量はＳ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１－ＢＴ変異株よりも高く、原株の１７．７％から１８．９％まで上昇した。また、ＩＳＰIIIが占める割合は著しく増加し、原株の４．２％から８．４％まで上昇した。つまり、成分ＩＳＰIIIの産生量は２倍上昇した。２種類の変異株の結果が一致していたことから、Ｌｒｐタンパク質のドメインの破壊により成分IIIの産生量を増加させられることが確かに実証された。
【実施例6】
【0055】
△ｌｒｐ－ＳＰ変異株におけるアミノ酸含有量の測定
【0056】
ｌｒｐ遺伝子の破壊がアミノ酸代謝に及ぼす影響を測定するために、本実施例では、△ｌｒｐ－ＳＰ変異株とＳ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１対照株についてアミノ酸測定を行った。測定方法は、次の通りであった。（１）標準曲線の作製：アミノ酸混合標準液を外部標準として用いた。（２）１００ｍｇの微生物を５ｍＬチューブに採取し、５個のスチールボールを投入して、液体窒素により５ｍｉｎ凍結保存した。これをハイスループット組織破砕装置に投入し、７０Ｈｚで１ｍｉｎ動作させた。次に、１６００μＬ（１：５０）の希塩酸を投入したあと、３０ｓ渦動及び振蕩してから、４００μＬの５０ｐｐｍノルバリン（５０μｇ／ｍＬ）を内部標準として加え、３０ｓ渦動及び振蕩した。これを超音波装置に投入して室温で３０ｍｉｎ処理し、７５０μＬのクロロホルムを加えて１ｍｉｎ渦動及び振蕩した。続いて、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を５００μＬ採取して、新しい１．５ｍＬ遠沈管に移した。そして、サンプルを真空遠心濃縮機で濃縮した。これに９０μＬのメトキシ溶液（１５ｍｇ／ｍＬ、ピリジンに溶解）を加え、３０ｓ渦動及び振蕩して、３７℃の条件で２ｈ反応させた。最後に、６０μＬのＢＳＴＦＡ試薬（１％のクロロトリメチルシランを含有）を加え、３７℃の条件で９０ｍｉｎ反応させたあと、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を採取してテストボトルに投入した。測定機器はアジレント社製７８９０Ａ／５９７５Ｃガスクロマトグラフ質量分析計とした。（３）クロマトグラフィーによるアミノ酸測定条件：クロマトグラフィーカラムとして、ＨＰ－５ＭＳ毛細管カラム（５％ ｐｈｅｎｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｓｉｌｏｘ：３０ｍｘ２５０μｍ ｉ．ｄ．、０．２５－μｍ、アジレント Ｊ＆Ｗ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フォルサム、カルフォルニア）を用い、スプリット注入を行った。注入量は１μＬ、スプリット比は２０：１であった。また、注入口の温度は２５０℃、イオン源の温度は２３０℃、インターフェースの温度は２５０℃、四重極の温度は１５０℃であった。手順の昇温開始温度は７０℃とし、２ｍｉｎ維持したあと、１０℃／ｍｉｎで３００℃まで昇温してから５ｍｉｎ維持した。総動作時間は３０ｍｉｎであった。また、キャリアガスはヘリウムガスとした。キャリアガスの流速は１ｍＬ／ｍｉｎとし、溶媒は４ｍｉｎ遅延させた。また、ＭＳ条件を、電子衝撃イオン（ＥＩ）源、フルスキャン及びＳＩＭスキャン方式、電子エネルギー７０ｅＶとした。
【0057】
スピラマイシンの生合成に関連する主要なアミノ酸含有量データの結果を表３に示す。表３より、△ｌｒｐ－ＳＰ変異株の細胞内における分枝鎖アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ）の含有量は、Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ １９４１原株よりも明らかに低下していた。
【0058】
【表3】
【実施例7】
【0059】
△ｌｒｐ－ＳＰ変異株におけるスピラマイシン生合成関連遺伝子の発現についてのｑＰＣＲ測定
【0060】
ｑＰＣＲによって、スピラマイシンの生合成経路に関連するｃｏｍｐ４５５３＿ｃ０＿ｓｅｑ２遺伝子、アラニンの生合成経路に関連するｃｏｍｐ９１１２＿ｃ０＿ｓｅｑ１遺伝子、及び、アシルＣｏＡの代謝経路に関連するｃｏｍｐ８７７１＿ｃ０＿ｓｅｑ１遺伝子の発現状況を検証した。リアルタイム定量ＰＣＲには、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ９６（ロシュ社）を用いて測定を行った。対応する菌株はＴＳＢ液体培地で６０ｈ成長させたあと、菌体を遠心分離にかけて菌糸体を収集し、Ｐ－Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。次に、細菌総ＲＮＡ抽出試薬キット（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（天根生化科技有限公司）を用いて抽出し、ＤＮＡａｓｅＩ（北京全式金生物技術有限公司）を用いて総ＲＮＡ内の残留ＤＮＡを除去した。続いて、Ｓｔａｒ Ｓｃｒｉｐｔ II Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＧｅｎＳｔａｒ，康潤生物社）試薬キットで総ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。そして、ｑＰＣＲ検査試薬キット（Ｆａｓｔｓｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ，ロシュ社）を用い、遺伝子発現の定量測定を行った。反応条件は下記の通りとした。
【0061】
１）９６℃で初期改変３００ｓ
【0062】
アニーリング温度は、プライマーのＴｍ値の違いによって適切に調整した。
【0063】
融解条件：
９５℃ １０ｓ
６５℃ ６０ｓ
９７℃ １ｓ
９５℃ １０ｓ
６５℃ ６０ｓ
９７℃ １ｓ
【0064】
結果は、図６に示したように、対照株と比較して、△ｌｒｐ－ＳＰ変異株におけるｃｏｍｐ８７７１＿ｃ０＿ｓｅｑ１遺伝子の発現量は５．７２倍上昇し、ｃｏｍｐ９１１２＿ｃ０＿ｓｅｑ１遺伝子の発現量は１１．４７倍上昇し、ｃｏｍｐ４５５３＿ｃ０＿ｓｅｑ２遺伝子の発現量は６．３４倍上昇した。
【0065】
Ｌｒｐ遺伝子の欠損により、スピラマイシン生合成経路関連遺伝子の発現が促進されること、アラニン生合成経路関連遺伝子が高発現してスピラマイシンの成分IIIの前駆体－プロピオニル基の供給が増加すること、アシルＣｏＡ代謝経路関連遺伝子の発現が向上してスピラマイシンの巨大ラクトン環の形成における脂肪酸鎖の合成が促進されること、がｑＰＣＲによって実証された。上記より、Ｌｒｐ遺伝子がスピラマイシンの生合成、特に、成分IIIの合成に関連することを理論的に証明することができた。
【0066】
以上は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を何らかの形式に制限するものではない。本発明については好ましい実施例によって上記のように開示したが、本発明を限定するものではない。本発明の技術方案を逸脱しない範囲において、当業者が上記で提示した技術内容を用いて実施可能なわずかな変形或いは補足は、同等に変形された等価の実施例とみなされ、いずれも本発明の技術方案の内容を逸脱するものではない。また、本発明の技術的本質に基づいて上記の実施例に加えられる任意の簡単な修正、同等の変形及び補足は、いずれも本発明の方案の範囲内とされる。
【受託番号】
【0067】
ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１６０５５及びＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１６０５６
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】