特許 7407309 ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤としての置換｛５－メトキシ－６－［（５－メトキシピリジン－２－イル）メトキシ］ピリジン－３－イル｝メチル化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-20

(45)【発行日】2023-12-28

(54)【発明の名称】ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤としての置換｛５－メトキシ－６－［（５－メトキシピリジン－２－イル）メトキシ］ピリジン－３－イル｝メチル化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 401/14 20060101AFI20231221BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20231221BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20231221BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20231221BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20231221BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20231221BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231221BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231221BHJP

【ＦＩ】

C07D401/14 CSP

A61K31/506

A61P25/28

A61P21/00

A61P25/16

A61P25/04

A61P29/00

A61P25/00

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2022567251

(86)(22)【出願日】2021-04-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-13

(86)【国際出願番号】 US2021028773

(87)【国際公開番号】W WO2021225798

(87)【国際公開日】2021-11-11

【審査請求日】2022-11-15

(31)【優先権主張番号】63/020,093

(32)【優先日】2020-05-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100126778

【弁理士】

【氏名又は名称】品川 永敏

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(72)【発明者】

【氏名】リチャーズ，サイモン ジェイムズ

【審査官】吉森 晃

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５２１６５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１１／１５０１９８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式の化合物、

【化1】

又はその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

以下である、請求項１に記載の化合物。

【化2】

【請求項3】

請求項１若しくは２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、アルツハイマー病の治療剤。

【請求項4】

請求項１若しくは２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を予防するための剤。

【請求項5】

請求項１若しくは２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、進行性核上麻痺の治療剤。

【請求項6】

請求項１若しくは２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、タウ媒介性神経変性障害の治療剤。

【請求項7】

請求項１若しくは２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、ミクログリア媒介性炎症を伴う疾患又は障害の治療剤。

【請求項8】

請求項１若しくは２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、末梢神経因性疼痛、中枢神経因性疼痛、及び加齢性サルコペニアから選択される疾患又は障害の治療剤。

【請求項9】

アルツハイマー病の治療剤の製造における、請求項１若しくは２に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項10】

軽度認知障害からアルツハイマー病への進行の予防剤の製造における、請求項１若しくは２に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項11】

進行性核上麻痺の治療剤の製造における、請求項１若しくは２に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項12】

タウ媒介性神経変性障害の治療剤の製造における、請求項１若しくは２に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項13】

ミクログリア媒介性炎症を伴う疾患又は障害の治療剤の製造における、請求項１若しくは２に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項14】

パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、末梢神経因性疼痛、中枢神経因性疼痛、及び加齢性サルコペニアから選択される疾患又は障害の治療剤の製造における、請求項１若しくは２に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項15】

請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とともに含む、医薬組成物。

【請求項16】

医薬組成物を調製するためのプロセスであって、請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と混合することを含む、プロセス。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、新規の置換｛５－メトキシ－６－［（５－メトキシピリジン－２－イル）メトキシ］ピリジン－３－イル｝メチル化合物、当該化合物を含む医薬組成物、及び当該化合物を使用して生理学的障害を治療する方法に関する。

【0002】

本発明は、アルツハイマー病並びにミクログリア媒介性炎症を伴う他の疾患及び障害の治療の分野におけるものである。

【0003】

アルツハイマー病は、世界中で何百万人もの患者が罹患している壊滅的な神経変性障害である。現在認可されている市販の薬剤が患者に一時的な対症効果しかもたらしていないことを考慮すると、アルツハイマー病の治療において著しい未だ満たされていない必要性が存在する。

【0004】

ミクログリア発現の上昇及び関連する神経炎症は、アルツハイマー病の発症及び進行の両方で重要な役割を果たしていると考えられている（Ｈｅｍｏｎｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１１，２３３，１－１９（２０１９））。コロニー刺激因子－１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ）は、２つのホモ二量体糖タンパク質リガンドであるＣＳＦ－１及びＩＬ－３４によって活性化されるクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼである。それは全てのミクログリアに発現し、それらの発生及び維持を直接制御する（Ｃｈｉｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３９（６），３７８－３９３（２０１７））。最近の研究（Ｏｌｍｏｓ－Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１３９，８９１－９０７（２０１６））では、ＣＳＦ－１Ｒの阻害によるミクログリア増殖の阻害がアルツハイマー病のＡＰＰ／ＰＳ１モデルにおける疾患進行を改善することが示されている。アルツハイマー病の５ｘＦＡＤモデルでは、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤ＰＬＸ３３９７の投与により、神経内アミロイド、神経突起斑形成、並びに前原線維オリゴマー及び原線維オリゴマーの減少と、それに伴う認知機能の改善が観察された（Ｓｏｓｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎ．，１３，１１，１－１１（２０１８））。加えて、Ｐ３０１Ｓマウスタウオパチーモデルでは、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤ＪＮＪ－４０３４６５２７がタウのリン酸化及び凝集を阻害することが示されている（Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１４２，３２４３－３２６４（２０１９））。したがって、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤は、動物モデルにおける斑形成の予防及びタウの病理学的過リン酸化形態の蓄積の減少のための認められているアプローチである。

【0005】

更に、ミクログリア媒介性炎症は、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｂｏｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ Ｒｅｌａｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．，１７，９，６８３－６８８（２０１１））、パーキンソン病（ＰＤ）（Ｔａｎｓｅｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，３７，３，５１０－５１８（２０１０））、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８，１００５，１－１２（２０１７））、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）（Ｐａｇａｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ，１７，３４７－３５３（２０１８））、多発性硬化症（ＭＳ）（Ｂｅｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏｍｍｕｎ．，６：９，１－１７（２０１８））、末梢神経因性疼痛（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９，１３８－１５２（２０１８））、中枢神経因性疼痛（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐａｉｎ，１４，１－１２（２０１８）、並びに高齢者における加齢性サルコペニア及び運動障害（Ｇｉｏｒｇｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２９，１５３９－１５５４（２０１９））などの障害に関連している。歴史的に、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤は、様々なタイプのがん及び自己免疫疾患の治療における使用について研究されている（Ｋｕｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，１０３，６６２－６７９（２０１８））。

【0006】

Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２０，１５４３－１５４７（２０１０）は、ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ阻害剤として３－アミノ－６－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピラジン－２－オール誘導体を開示している。

【0007】

したがって、ヒトにおけるアルツハイマー病又はミクログリア媒介性炎症を伴う疾患及び障害の治療のための、強力な、選択的な、かつ／又は脳浸透性のＣＳＦ－１Ｒ阻害剤が必要とされている。

【0008】

本発明は、ＣＳＦ－１Ｒの阻害剤である、ある特定の新規の化合物を提供する。

【0009】

したがって、本発明は、式Ｉの化合物、

【化1】

又はその薬学的に許容される塩を提供する。

【0010】

一実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物を更に提供する。

【化2】

【0011】

本発明は、アルツハイマー病の治療を必要とする患者におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、患者に、有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法も提供する。

【0012】

本発明は、軽度認知障害からアルツハイマー病への進行の治療を必要とする患者における軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を予防する方法であって、患者に、有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を更に提供する。

【0013】

本発明は、患者における進行性核上麻痺を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法も提供する。

【0014】

本発明は、患者におけるタウ媒介性神経変性障害を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法も提供する。

【0015】

本発明は、ミクログリア媒介性炎症を伴う疾患又は障害を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を更に提供する。

【0016】

本発明は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、末梢神経因性疼痛、中枢神経因性疼痛、及び加齢性サルコペニアから選択される疾患又は障害を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法も提供する。

【0017】

更に、本発明は、療法に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を提供する。

【0018】

本発明は、アルツハイマー病の治療に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩も提供する。

【0019】

本発明は、軽度認知障害からアルツハイマー病への進行の予防に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を更に提供する。

【0020】

本発明は、進行性核上麻痺の治療に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩も提供する。

【0021】

本発明は、タウ媒介性神経変性障害の治療に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩も提供する。

【0022】

本発明は、ミクログリア媒介性炎症を伴う疾患又は障害の治療に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を更に提供する。

【0023】

本発明は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、末梢神経因性疼痛、中枢神経因性疼痛、及び加齢性サルコペニアから選択される疾患又は障害の治療に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩も提供する。

【0024】

なお更に、本発明は、アルツハイマー病の治療用の薬剤又は軽度認知障害からアルツハイマー病への進行の予防用の薬剤の製造のための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。加えて、本発明は、進行性核上麻痺の治療に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩の使用も提供する。更に、本発明は、タウ媒介性神経変性障害の治療用の薬剤の製造のための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。加えて、本発明は、ミクログリア媒介性炎症を伴う疾患又は障害の治療に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩の使用も提供する。更に、本発明は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、末梢神経因性疼痛、中枢神経因性疼痛、及び加齢性サルコペニアから選択される疾患又は障害の治療に使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩の使用も提供する。

【0025】

本発明は、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とともに含む、医薬組成物を更に提供する。本発明は、医薬組成物を調製するためのプロセスであって、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と混合することを含む、プロセスを更に提供する。

【0026】

一実施形態では、本発明は、患者におけるがんを治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、がんは、神経膠腫、膵臓がん、乳がん、又は急性骨髄性白血病から選択される。一実施形態では、神経膠腫は、多形神経膠芽腫である。更なる一実施形態では、本発明は、患者における自己免疫疾患を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、自己免疫疾患は、リウマチ性関節炎である。

【0027】

軽度認知障害は、経時的に軽度認知障害からアルツハイマー認知症への進行を呈する患者の臨床所見及び進行に基づいてアルツハイマー病に関連する認知症の潜在的な前駆期として定義されている。「軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を予防すること」又は「軽度認知障害からアルツハイマー病への進行の予防」という用語は、患者における軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を抑制すること、遅延させること、止めること、又は逆転させることを含む。

【0028】

本明細書で使用される場合、「治療する」又は「治療すること」という用語は、既存の症状又は障害の進行又は重症度を抑制すること、遅延させること、止めること、又は逆転させることを含む。

【0029】

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、ヒトを指す。

【0030】

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者に単回又は複数回投与すると、診断中又は治療中の患者に所望の効果をもたらす、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩の量又は用量を指す。

【0031】

有効量は、既知の技法を使用して当業者によって容易に決定され得る。患者の有効量を決定する際に、患者の人種、患者のサイズ、年齢、及び全般的な健康状態、関与する特定の疾患又は障害、疾患又は障害の関与度又は重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与様式、投与される調製物のバイオアベイラビリティ特性、選択される投薬レジメン、併用薬の使用、並びに他の関連状況を含むが、これらに限定されない、いくつかの要因が考慮される。

【0032】

本発明の化合物は、概して、幅広い投薬量範囲にわたって有効である。例えば、１日当たりの投薬量は、通常、約０．１～約１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。いくつかの事例では、前述の範囲の下限よりも低い投薬量レベルが十分以上であり得る一方で、他の事例では、許容される副作用を伴って、更に多い用量が用いられてもよく、したがって、上記の投薬量範囲は決して本発明の範囲を限定するようには意図されていない。

【0033】

本発明の化合物は、好ましくは、経口経路及び経皮経路を含む、化合物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される医薬組成物として製剤化される。より好ましくは、かかる組成物は、経口投与用である。かかる医薬組成物及びそれを調製するためのプロセスは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい）。

【0034】

本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩は、当該技術分野で周知であり、かつ理解されている方法による以下の調製物及び実施例に従って調製され得る。これらの調製物及び実施例のステップに好適な反応条件は、当該技術分野で周知であり、溶媒及び共試薬の適切な置き換えは、当該技術分野の技術の範囲内である。同様に、合成中間体が必要に応じて又は所望どおりに様々な周知の技法によって単離及び／又は精製され得、かつ多くの場合、様々な中間体をほとんど又は全く精製することなくその後の合成ステップで直接使用することが可能であることが当業者に理解されるであろう。一例として、調製物及び実施例の化合物は、例えば、シリカゲル精製によって単離され得る、濾過によって直接単離され得る、又は結晶化によって単離され得る。更に、当業者であれば、いくつかの状況下で、部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）が導入される順序が重要ではないことを認識するであろう。本発明の化合物を製造するのに必要なステップの特定の順序は、合成される特定の化合物、出発化合物、及び置換部分の相対的な不利益に依存し、熟練の化学者に十分に理解されている。全ての置換基は、別途指示されない限り、既定のとおりであり、全ての試薬は、当該技術分野で周知であり、理解されている。

【0035】

ある特定の略語は以下のように定義される：「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ＣＳＦ－１Ｒ」はコロニー刺激因子－１受容体を指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタン又は塩化メチレンを指し、「ＤＭＥＭ」はダルベッコ改変イーグル培地を指し、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＥＧＴＡ」はエチレングリコール四酢酸を指し、「ＥＳ／ＭＳ」は、エレクトロスプレーイオン化質量分析を指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「ＥｔＯＨ」はエチルアルコール又はエタノールを指し、「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を指し、「ＨＥＰＥＳ」は４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸を指し、「ｈＣＳＦ－１Ｒ」はヒトコロニー刺激因子１受容体を指し、「ＩＣ_５０」は、薬剤の濃度であって、その薬剤に可能な最大阻害応答の５０％をもたらす濃度（相対ＩＣ_５０）、又はプラセボ対照と比較して標的活性の５０％阻害をもたらす薬剤の濃度（絶対ＩＣ_５０）を指し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドを指し、「ＬＣ／ＭＳ」は液体クロマトグラフィー質量分析を指し、「Ｍ－ＣＳＦ」はマクロファージコロニー刺激因子を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノール又はメチルアルコールを指し、「ＭＰ－ＴＭＴ」は２，４，６－トリメルカプトトリアジンの樹脂結合等価物であるマクロポーラスポリスチレン結合トリメルカプトトリアジンを指し、「ｍ／ｚ」は質量対電荷比を指し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を指し、「ｐＣＳＦ－１Ｒ」はリン酸化コロニー刺激因子１受容体を指し、「ＰＤＧＦＲβ」は血小板由来増殖因子受容体ベータを指し、「ＰＤＧＦ－ＢＢ」は血小板由来増殖因子－２Ｂサブユニットを指し、「ＲＴ」は室温を指し、「ＳＣＸ」は強陽イオン交換クロマトグラフィーを指し、「ＳＦＣ」は超臨界流体クロマトグラフィーを指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指す。

【0036】

任意選択的なステップでは、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩は、標準条件下で、式Ｉの適切な遊離塩基と好適な溶媒中の適切な薬学的に許容される酸との反応によって形成され得る。加えて、かかる塩の形成は、窒素保護基の脱保護と同時に起こり得る。かかる塩の形成は、当技術分野で周知であり、理解されている。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１－２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓａｌｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７－４３５（２０００）、及びＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９，（１９７７）、“Ｓａｌｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１－２１７（１９８６）を参照されたい。当業者であれば、式Ｉの化合物が薬学的に許容される塩に容易に変換され、かつ薬学的に許容される塩として分離され得ることを理解するであろう。

【0037】

調製物及び実施例
以下の調製物及び実施例は、本発明を更に例証する。

【0038】

調製物１

【化3】

【0039】

塩化オキサリル（３０９ｍＬ、３５５７ｍｍｏｌ）を２－クロロピリミジン－４－カルボン酸（４７０．０ｇ、２９６４．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５Ｌ）及びＤＭＦ（１０ｍＬ）混合物懸濁液に１時間かけて緩徐に添加する。懸濁液を周囲温度で１時間撹拌し、その後、０℃に冷却する。ＥｔＯＨ（１．０５Ｌ）のＤＣＭ（１．４Ｌ）溶液を緩徐に添加し、混合物を１０℃で３０分間撹拌する。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２．５Ｌ）を緩徐に添加し、層を分離する。水溶液をＤＣＭ（５Ｌ）で抽出し、有機抽出物を合わせ、ブライン（２×４Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、固体残渣を得る。残渣をｎ－ヘプタン（２．５Ｌ）中でスラリー化し、濾過し、真空下で乾燥させて、黄色の固体として表題化合物を得る（４９３．５ｇ、８９％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（^３５Ｃｌ／^３７Ｃｌ）１８７．０／１８９．０［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0040】

調製物２

【化4】

【0041】

２－クロロ－４－メチル－ピリミジン（２０ｇ、１５５．５７ｍｍｏｌ）、１－メチル－４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール（４０ｇ、１８２．６３３ｍｍｏｌ）、ビス（トリフェニルホスフィン）二塩化パラジウム（ＩＩ）（２．７ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（８７ｇ、６１６．８９ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（２５０ｍＬ）、及び水（８０ｍＬ）を窒素雰囲気下で一緒に添加する。溶液を窒素／真空パージし（３回）、２０時間撹拌しながら１００℃に加熱する。反応物を飽和塩化アンモニウム（約５００ｍＬ）に注ぎ、生成物をＥｔＯＡｃ（約３×２００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮して黒色の油を得て、その後、これを１００％ヘキサン－１００％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、オレンジ色の固体として表題化合物を得る（２６．３７９ｇ、収率９７％、１５１．４３ｍｍｏｌ）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ １７５（Ｍ＋Ｈ）。

【0042】

調製物３

【化5】

【0043】

２－クロロピリミジン－４－カルボン酸エチル（４９３．０ｇ、２６４２．０ｍｍｏｌ）、１－メチル－４－（４，４，５，５テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピラゾール（７７０．０ｇ、３７００ｍｍｏｌ）、ビス（トリフェニルホスフィン）二塩化パラジウム（ＩＩ）（５５．６３ｇ、７９．２６ｍｍｏｌ）、及びフッ化カリウム（４６５．０ｇ、７９２４．０ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（５Ｌ）及び水（１．２３Ｌ）中で合わせ、窒素で２０分間パージする。混合物を１９時間かけて８２℃（内部温度）に加熱する。混合物を周囲温度に冷却し、ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）で希釈する。層を分離し、有機層を水（５Ｌ）で洗浄する。水層をＥｔＯＡｃ（５Ｌ）で抽出し、有機抽出物を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させて、淡黄色の固体を得る。残渣をヘプタン（２．５Ｌ）中でスラリー化し、濾過し、ヘプタン（２．５Ｌ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、淡黄色の固体として表題化合物を得る（４５５．０ｇ、７３％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２３３．０（Ｍ＋Ｈ）。

【0044】

調製物４

【化6】

水素化ホウ素ナトリウム（１０９．０ｇ、２８８１．１ｍｍｏｌ）を、内部温度を２５℃未満に維持しながら、２－（１－メチルピラゾール－４－イル）ピリミジン－４－カルボン酸エチル（４５２．０ｇ、１９２６．８ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（６．３Ｌ）及びＴＦＡ（１．３５Ｌ）溶液に少量ずつに分けて添加し、ＬＣ／ＭＳが完全な反応を示すまで混合物を撹拌する。１５％硫酸水素カリウム水溶液（６Ｌ）を添加し、その後、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（５Ｌ）を添加し、あらゆる沈殿した固体を濾過により除去する。層を分離し、水溶液をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（５Ｌ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、約２Ｌ体積になるまで濃縮する。生成物が有機相から完全に抽出されるまでこの混合物を１５％硫酸水素カリウム水溶液で抽出する。固体炭酸カリウムを少量ずつに分けて添加してｐＨをｐＨ１２に調整する。含水物質を２－メチルテトラヒドロフラン（４×７．５Ｌ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させて、淡黄色の固体として表題化合物を得る（２５１．０ｇ、６７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ １９１．０（Ｍ＋Ｈ）．表題化合物の２つの他のバッチを同様の様式で調製して、淡黄色の固体として表題化合物を得る（１８．０ｇ及び１１４．３ｇ）。合わせた物質をヘプタン（２．５Ｌ）で粉砕し、濾過し、ハウス真空下で乾燥させて、淡黄色の固体として表題生成物を得る（３７１ｇ、１９１１．６ｍｍｏｌ）。ＭＳ（ｍ／ｚ）１９１（Ｍ＋Ｈ）。

【0045】

調製物５

【化7】

【0046】

［２－（１－メチルピラゾール－４－イル）ピリミジン－４－イル］メタノール（１００ｇ、５２５．７６ｍｍｏｌ）を窒素下でＤＣＭ（１Ｌ）に添加して、白色のスラリーを得る。スラリーを０℃に冷却し、ＴＥＡ（１４４ｍＬ、１０３０ｍｍｏｌ）を３分間かけて滴加する。塩化メタンスルホニル（６０ｍＬ、７７３ｍｍｏｌ）を５０分間かけて滴加し、発熱を観察する。内部温度を８℃未満で維持する。添加中、反応混合物が徐々に赤色になり、添加の最後には黄色になった。添加が完了した後、反応混合物をＮ_２下で５時間かけて３８℃に加熱する。反応混合物を窒素下で８℃に冷却し、ＴＥＡ（２５ｍＬ、１７９ｍｍｏｌ）を添加し、その後、塩化メタンスルホニル（１０ｍＬ、１２９ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴加する（穏やかな発熱が観察される）。その後、反応混合物を一晩還流させる。混合物を冷却し、水（１Ｌ）で処理する。相を分離し、水相をＤＣＭ（０．５Ｌ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させて、茶色の油を得る。粗油をＤＣＭ（２５０ｍｌ）中に溶解させ、シリカパッドに通して濾過し、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）で洗浄する。濾液を蒸発させて、茶色の固体を得る（９２．６ｇ、４４４ｍｍｏｌ、８４．４％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）２０９（Ｍ＋Ｈ）。

【0047】

調製物６

【化8】

【0048】

４－メチル－２－（１－メチルピラゾール－４－イル）ピリミジン（１０．００ｇ、５７．４１ｍｍｏｌ）、二酸化セレン（７．６ｇ、６６ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（１１０ｍＬ）、及び水（５．７ｍＬ）を一緒に添加する。混合物を２０時間撹拌しながら１００℃に加熱して、黒色の溶液を得る。反応物を冷却し、珪藻土に通して濾過し、ＴＨＦ（約１００ｍＬ）で洗浄する。濾液と洗浄物を合わせ、真空内で濃縮する。クロロホルム（約１５０ｍＬ）を添加し、結果として得られた固体を濾過し、収集する。固体をクロロホルム（約５０ｍＬ）で更に洗浄し、濾過する。合わせた濾液を約３０ｍＬ体積になるまで濃縮し、１００％ヘキサン－１００％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物として薄黄色の固体を得る（４．５５０ｇ、収率４２％、２４．１８ｍｍｏｌ）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ １８９／２０７（Ｍ＋Ｈ／Ｍ＋１８）。

【0049】

調製物７

【化9】

【0050】

２－（１－メチルピラゾール－４－イル）ピリミジン－４－カルバルデヒド（４．５５０ｇ、２４．１８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（６０ｍＬ）、続いて、４－メチルベンゼンスルホンヒドラジド（５．０５ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を２時間撹拌する。混合物を０℃に冷却し、濾過し、結果として得られた固体をＭｅＯＨ（約２０ｍＬ）で洗浄する。固体を真空内で乾燥させて、白色の固体として表題化合物を得る（７．２２９ｇ、収率８４％、２０．２８ｍｍｏｌ）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３５７（Ｍ＋Ｈ）。

【0051】

調製物８

【化10】

【0052】

５－ブロモ－２－クロロ－３－メトキシ－ピリジン（１４．５ｇ、６５．２ｍｍｏｌ）、フェニルメタノール（７．４ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）、及びカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（９．５ｇ、８５ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（２００ｍＬ）と一緒に窒素下で添加し、２時間かけて５０℃に加熱する。反応混合物を室温に冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液（３５０ｍＬ）に注ぐ。生成物をＥｔＯＡｃ（２×３００ｍＬ）で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮する。粗残渣を１００％ヘキサン－５０％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーＣｏｍｂｉｆｌａｓｈ（登録商標）により精製して、白色の固体として表題化合物を得る（１６．５３ｇ、５６．１９ｍｍｏｌ、８６％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ ２９４／２９６（Ｍ＋Ｈ）^＋。

【0053】

調製物９

【化11】

【0054】

以下の手順は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００８，７３，６４２５－６４２８に記載の手順に基づく。カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（２１２ｇ、１８５１．５０ｍｍｏｌ）を少量ずつに分けて５－ブロモ－２－クロロ－３－メトキシ－ピリジン（３２３ｇ、１４２２．８ｍｍｏｌ）及び（５－メトキシ－２－ピリジル）メタノール（２００ｇ、１４２２．９ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（４Ｌ）溶液に窒素雰囲気下で、２０℃で添加する。混合物を１時間かけて５０℃に加熱し、その後、周囲温度に冷却した後、飽和塩化アンモニウム水溶液（５００ｍＬ）を添加する。結果として得られた沈殿物を濾過により除去し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、濾液を蒸発させて、眉毛（ｂｒｏｗ）残渣を得る。残渣をＤＣＭ中に溶解させ、シリカゲルプラグ（１ｋｇ）に通し、ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘプタン（１：１）で溶出する。所望の画分を単離し、蒸発乾固させ、ｎ－ヘプタン（５Ｌ）中でスラリー化する。スラリーを８０℃に加熱し、その後、周囲温度に冷却する。結果として得られた固体を濾過により収集し、ｎ－ヘプタンで洗浄し、４５℃の真空オーブン内で乾燥させて、オフホワイトの固体として表題化合物を得る（４１３．５ｇ、８８％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３２５．０／３２７．０［Ｍ＋Ｈ］。

【0055】

調製物１０

【化12】

【0056】

トルエン（３００ｍＬ）を窒素下で－７８℃に冷却し、温度を－６５℃未満に維持しながらＮ－ブチルリチウム（２．５ｍｏｌ／Ｌ）のヘキサン（４０ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）溶液を滴加する。温度を確実に－６０℃未満に維持しながら２－ベンジルオキシ－５－ブロモ－３－メトキシ－ピリジン（２５．７ｇ、８７ｍｍｏｌ）のトルエン（１５０ｍＬ）溶液を滴加し、溶液を４０分間撹拌する。温度を－６０℃未満に維持しながらＴＨＦ（１５０ｍＬ）を反応物に滴加し、混合物を１０分間撹拌する。ホウ酸トリイソプロピル（２５ｍＬ、１０８ｍｍｏｌ）を２分間かけて滴加し、反応物を撹拌しながら１０℃に加温させる。反応物を飽和塩化アンモニウム溶液（５００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ）で抽出する。抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮する。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を残渣に添加し、混合物を５分間超音波処理し、その後、濾過する。固体を更にジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄し、真空内で乾燥させて、白色の固体として表題化合物を得る（８．９９ｇ、３４．７１ｍｍｏｌ、４０％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２６０［Ｍ＋Ｈ］。

【0057】

調製物１１

【化13】

【0058】

１，４－ジオキサン（６．１５Ｌ）、５－ブロモ－３－メトキシ－２－［（５－メトキシ－２－ピリジル）メトキシ］ピリジン（４１３．５ｇ、１２５９ｍｍｏｌ）、４，４，５，５－テトラメチル－２－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－１，３，２－ジオキサボロラン（３６０．２ｇ、１３９０ｍｍｏｌ）、ビス（トリフェニルホスフィン）二塩化パラジウム（ＩＩ）（８．９ｇ、１３ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（３７６ｇ、３７９２．８８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で一緒に添加し、溶液に窒素を１５分間スパージする。ＬＣＭＳが出発材料の完全な変換を示すまで反応混合物を１００℃に加熱する。溶液を２５℃に冷却し、反応混合物を珪藻土プラグに通して濾過し、ＥｔＯＡｃ（２．５Ｌ）で溶出し、溶媒を蒸発させて、黒色の固体を得る。残渣を１：１ ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘプタン（１０Ｌ）、続いて、ＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）で溶出するシリカプラグ（１ｋｇ）に通して精製し、精製した物質を蒸発乾固させる。精製した物質をシクロペンチルメチルエーテル／ｎ－ヘプタン（１：１、５Ｌ）中で３０℃でスラリー化し、結果として得られた沈殿物を濾過により収集して、灰色の固体として表題化合物を得る（３９３．９ｇ、８３％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３７３．２［Ｍ＋Ｈ］。

【0059】

調製物１２

【化14】

【0060】

（６－ベンジルオキシ－５－メトキシ－３－ピリジル）ボロン酸（４．００ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）、４－メチル－Ｎ－［（Ｅ）－［２－（１－メチルピラゾール－４－イル）ピリミジン－４－イル］メチレンアミノ］ベンゼンスルホンアミド（５．５ｇ、１５ｍｍｏｌ）、リン酸カリウム（８．３ｇ、３９ｍｍｏｌ）、及び１，２－ジクロロベンゼン（１２０ｍＬ）を一緒に添加する。混合物に窒素を流し、１０時間撹拌しながら１５０℃に加熱し、その後、一晩かけて室温に冷却する。その後、反応物を５時間かけて１７０℃に加熱し、飽和塩化アンモニウム溶液（約２５０ｍＬ）に注ぐ。混合物をＥｔＯＡｃ（２×２００ｃｍ３）で抽出し、有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮する。残渣を１００％ＤＣＭ－５０％ＤＣＭ／ＴＨＦで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーＣｏｍｂｉｆｌａｓｈ（登録商標）により精製して、黄色の固体として表題化合物を得る（３．１５ｇ、８．１２ｍｍｏｌ、５３％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３８８［Ｍ＋Ｈ］。

【0061】

調製物１３

【化15】

【0062】

４－［（６－ベンジルオキシ－５－メトキシ－３－ピリジル）メチル］－２－（１－メチルピラゾール－４－イル）ピリミジン（３．１４７ｇ、８．１２３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５ｍＬ）に添加し、その後、ＴＦＡ（１５ｍＬ）を添加する。反応物を１５０分間撹拌し、その後、真空内で濃縮する。反応物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（約８０ｍＬ）に慎重に注ぎ、２：１ ＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＨ（約６×３０ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮する。残渣を１００％ＤＣＭ－８５％ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーＣｏｍｂｉｆｌａｓｈ（登録商標）により精製して、薄黄色の固体として表題化合物を得る（２．５２３ｇ、８．４８６ｍｍｏｌ、１００％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２９８［Ｍ＋Ｈ］。

【0063】

実施例１

【化16】

【0064】

３－メトキシ－５－［［２－（１－メチルピラゾール－４－イル）ピリミジン－４－イル］メチル］ピリジン－２－オール（０．１ｇ、０．３３６ｍｍｏｌ）、（５－メトキシ－２－ピリジル）メタノール（０．１ｇ、０．７１９ｍｍｏｌ）、及びＴＨＦ（３．５ｍＬ）を一緒に添加する。トリフェニルホスフィン（０．１８ｇ、０．１６０ｍＬ、０．６８６ｍｍｏｌ）及びアゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．１３ｍＬ、０．６５６ｍｍｏｌ）を反応物に添加する。容器を密封し、窒素を流し、１時間撹拌する。反応物をＭｅＯＨで希釈し、ＳＣＸ２カラムに注ぐ。カラムに１カラム体積のＭｅＯＨを流し、１カラム体積の２Ｍメタノールアンモニアを流して溶出し、その後、真空内で濃縮する。残渣を、５５℃でカラムＰＰＵ内径３ｃｍ×１５ｃｍ（５μ）を使用し、かつ１００ｍＬ／分で４分間（６分間方法）かけて１５－２５％ＭｅＯＨ（４０ｍＭアンモニア）の勾配で溶出するＳＦＣにより精製して、黄色の油として表題化合物を得る（０．００９７ｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１９［Ｍ＋Ｈ］。

【0065】

代替調製物実施例１

【化17】

【0066】

３－メトキシ－２－［（５－メトキシ－２－ピリジル）メトキシ］－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン（１５０ｇ、３９９．０ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（３７５ｍＬ、４３９２ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（１．０７５Ｌ）溶液に窒素をスパージし、窒素雰囲気下で４－（クロロメチル）－２－（１－メチルピラゾール－４－イル）ピリミジン（８３．４ｇ、３９６ｍｍｏｌ）、ジクロロ［１，１’－ビス（ジ－ｔｅｒｔ－ブチルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）（５．２５ｇ、８．０６ｍｍｏｌ）、リン酸カリウム一水和物（３８６．４ｇ、１５９４ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（１．２Ｌ）及び水（３００ｍＬ）溶液に添加し、８０℃に加熱する（合計添付時間８０分間）。更に１５分経った後、反応物を周囲温度に冷却し、水（２．５Ｌ）及び２－メチルテトラヒドロフラン（２．５Ｌ）で希釈する。有機層を分離し、水（２×２．５Ｌ）で洗浄する。水層を２－メチルテトラヒドロフラン（２．５Ｌ）で抽出し、有機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、ゴム状の残渣を得る。残渣を、ＥｔＯＡｃ、続いて、５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲル（１ｋｇ）に通して濾過する。所望の画分を収集し、蒸発乾固させ、ＤＣＭ中に溶解させ、窒素雰囲気下でＭＰ－ＴＭＴ（２５ｇ）と２５℃で撹拌する。樹脂を濾過により除去し、０－５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製する。精製した生成物を含む画分を蒸発させ、ＴＨＦ（１．１５Ｌ）中に溶解させる。溶液を５０℃に加温し、溶液が濁るまでｎ－ヘプタン（１．５Ｌ）を緩徐に添加する。溶液を６５℃に加熱し、ＴＨＦ（５００ｍＬ）を緩徐に添加してスラリーを溶解させて、透明な溶液を得る。混合物を０℃に冷却し、結果として得られた固体を真空濾過により収集し、乾燥させて、白色の固体として表題化合物を得る（１０１．７ｇ、６０％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１９．０［Ｍ＋Ｈ］。

【0067】

実施例２

【化18】

【0068】

４－（｛５－メトキシ－６－［（５－メトキシピリジン－２－イル）メトキシ］ピリジン－３－イル｝メチル）－２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリミジン（２５７ｍｇ）をアセトン（５ｍＬ）中に溶解させて、透明な淡黄色の溶液を得る。混合物に塩酸（１．４ｍＬ、１Ｍ ＥｔＯＡｃ溶液）を導入して白色の固体を沈殿させる。懸濁液を１５分間撹拌し、アセトン（１０ｍＬ）で希釈する。反応混合物を濾過し、固体を窒素気流下で、周囲温度で乾燥させて、結晶性固体として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１９［Ｍ＋Ｈ］。

【0069】

実施例３

【化19】

【0070】

ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）及び４－（｛５－メトキシ－６－［（５－メトキシピリジン－２－イル）メトキシ］ピリジン－３－イル｝メチル）－２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリミジン（１０ｇ）をフラスコに装填する。反応物を４０～５０℃に加熱し、４～６時間撹拌する。反応混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃで希釈する。混合物を１０℃に冷却し、１２時間撹拌し、濾過し、固体をＥｔＯＡｃですすぐ。固体を５０℃以下の温度で乾燥させて、結晶性固体として表題化合物を得る（収率９０％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１９．０［Ｍ＋Ｈ］。

【0071】

実施例４

【化20】

【0072】

４－（｛５－メトキシ－６－［（５－メトキシピリジン－２－イル）メトキシ］ピリジン－３－イル｝メチル）－２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリミジン（８３．５ｍｇ）を周囲温度で２５％（ｖ／ｖ）アセトン（３．５ｍＬ）水溶液中に２週間懸濁させる。結果として得られた懸濁液を濾過し、単離した固体を空気乾燥させて、結晶性固体として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１９［Ｍ＋Ｈ］。

【0073】

実施例５

【化21】

【0074】

４－（｛５－メトキシ－６－［（５－メトキシピリジン－２－イル）メトキシ］ピリジン－３－イル｝メチル）－２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリミジン（８２．３ｍｇ）を周囲温度で５０％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ（２．７ｍＬ）水溶液中に２週間懸濁させる。結果として得られた懸濁液を濾過し、単離した固体を空気乾燥させて、結晶性固体として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１９［Ｍ＋Ｈ］。

【0075】

実施例６

【化22】

【0076】

４－（｛５－メトキシ－６－［（５－メトキシピリジン－２－イル）メトキシ］ピリジン－３－イル｝メチル）－２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリミジン（５９．９ｍｇ）を６５℃で４４％（ｖ／ｖ）ＴＨＦ（３．６ｍＬ）ヘプタン溶液中に溶解させる。この溶液を氷水浴中で冷却した過剰量のヘプタンに添加する。結果として得られたＴＨＦのヘプタンに対するｖ／ｖ比を、それぞれ、１７：８３と推定する。固体を沈殿させて懸濁液を得て、これを濾過する。単離した固体を空気乾燥させて、結晶性固体として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１９［Ｍ＋Ｈ］。

【0077】

実施例７

【化23】

【0078】

４－（｛５－メトキシ－６－［（５－メトキシピリジン－２－イル）メトキシ］ピリジン－３－イル｝メチル）－２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリミジン（５２．３ｍｇ）を６５℃でシクロペンチルメチルエーテル（４ｍＬ）中に溶解させて、溶液を得る。その後、熱溶液を氷水浴中で冷やしたガラス容器に通して濾過し、固体を沈殿させる。その後、結果として得られた懸濁液を０℃未満の温度で一晩撹拌した後、固体を濾過により単離し、空気乾燥させて、結晶性固体として遊離塩基形態Ｅの表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１９［Ｍ＋Ｈ］。

【0079】

結晶性形態のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）
結晶性固体のＸＲＰＤパターンを、４０ｋＶ及び４０ｍＡで動作する、ＣｕＫα（１．５４１８Å）線源及びＬｉｎｘｅｙｅ検出器又はＯｐｔｉｘ長距離高精度焦点線源のいずれかを装備した、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ Ｅｎｄｅａｖｏｒ Ｘ線粉末回折計、ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ ＭＰＤ、又はＥｍｐｙｒｅａｎ回折計で得る。試料を、４～４２ ２θ°で、０．００９ ２θ°のステップサイズ及び０．５秒／ステップの走査速度で、０．３°の一次スリット開口及び３．９°のＰＳＤ開口を使用して走査する。乾燥粉末を石英試料ホルダーに充填し、ガラススライドを使用して滑らかな表面を得る。結晶形態回折パターンを周囲温度及び相対湿度で収集する。結晶ピーク位置を、８．８５３及び２６．７７４ ２θ°でピークを有する内部ＮＩＳＴ６７５標準に基づいて全パターンをシフトした後にＭＤＩ－Ｊａｄｅで決定する。任意の所与の結晶形態に関して、結晶形態及び晶癖などの要因から生じる優先配向に起因して、回折ピークの相対強度が変動し得ることが結晶学分野で周知である。優先配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は不変である。例えば、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ＃２３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ＃１８，ｐａｇｅｓ１８４３－１８４４，１９９５を参照されたい。更に、任意の所与の結晶形態に関して、角度ピーク位置がわずかに変動し得ることも結晶学分野で周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度の変動、試料変位、又は内部標準の存在若しくは不在に起因してシフトすることができる。この場合、±０．２ ２θ°のピーク位置変動性は、示される結晶形態の明確な特定を妨げることなく、これらの潜在的な変動を考慮に入れると推定される。結晶形態の確認を特徴的なピークの任意の固有の組み合わせに基づいて行うことができる。

【0080】

したがって、実施例２の試料は、以下の表１に記載の回析ピーク（２θ値）を有するものとしてＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。具体的には、このパターンは、０．２度の回折角を許容する、１２．８°、２６．６°、２２．１°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて、４．２°のピークを有する。

【0081】

実施例３（結晶性形態Ａ）の試料は、以下の表２に記載の回析ピーク（２θ値）を有するものとしてＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。具体的には、このパターンは、０．２度の回折角を許容する、２０．４°、１７．２°、５．７°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて、１２．５°のピークを有する。

【0082】

実施例４（結晶性形態Ｂ）の試料は、以下の表３に記載の回析ピーク（２シータ値）を有するものとしてＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。具体的には、このパターンは、０．２度の回折角を許容する、１１．４°、２１．１°、２４．４°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて、２７．２°のピークを有する。

【0083】

実施例５（結晶性形態Ｃ）の試料は、以下の表４に記載の回析ピーク（２シータ値）を有するものとしてＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。具体的には、このパターンは、０．２度の回折角を許容する、１９．５°、２０．３°、２３．３°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて、１２．４°のピークを有する。

【0084】

実施例６（結晶性形態Ｄ）の試料は、以下の表５に記載の回析ピーク（２シータ値）を有するものとしてＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。具体的には、このパターンは、０．２度の回折角を許容する、１４．２°、２４．４°、２４．７°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて、１２．８°のピークを有する。

【0085】

実施例７（結晶性形態Ｅ）の試料は、以下の表６に記載の回析ピーク（２シータ値）を有するものとしてＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。具体的には、このパターンは、０．２度の回折角を許容する、１４．２°、２４．２°、２６．０°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて、２３．９°のピークを有する。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【0086】

生物学的アッセイ
ｈＣＳＦ－１Ｒ結合アッセイ
試験化合物の段階希釈物をＤＭＳＯで調製して３倍希釈して、１０点応答曲線を得る。１０点化合物滴定液（１５ｎＬ）を、音響分注を使用して対応するアッセイプレート（ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ（商標）－３８４ Ｐｌｕｓ Ｆ、ブラック）の行Ａ～Ｐ、列３～１２及び１３～２２の各ウェルに添加する。その後、アッセイ対照としてＤＭＳＯ（１５ｎＬ）を行Ａ～Ｐ、列１～２及び２３～２４に添加する。アッセイ緩衝液（ＨＥＰＥＳ ６２．５ｍＭ、ｐＨ７．５、０．０１％Ｂｒｉｊ（商標）３５、１２．５ ＭｇＣｌ_２、及び１．２５ｍＭ ＥＧＴＡ）を使用して、全てのアッセイ試薬を調製する。ＣＳＦ－１Ｒ ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｅｕ Ｋｉｎａｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙを、本質的に供給業者（ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｅｕ Ｋｉｎａｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｐａｃｋｅｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に推奨されるとおりに実行する。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｅｕ－ａｎｔｉ－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＰＶ５５９６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びＫｉｎａｓｅ Ｔｒａｃｅｒ２３６（ＰＶ５５９２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む溶液（７．５μＬ）をプレート全体に添加し、それぞれ、最終濃度を２ｎＭ及び２００ｎＭにする。その後、組換えヒトＣＳＦ－１Ｒ（７．５μＬ、ａａ ５３８－９１９、バキュロウイルス発現系で発現させたもの）を行Ａ～Ｐ、列１～２２に添加し、５ｎＭの最終酵素濃度を得る。アッセイ緩衝液（７．５μＬ）を列２３及び２４に添加する。アッセイプレートを短時間振盪し、室温で１時間インキュベートし、ユーロピウムベースのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイ（励起３４０ｎｍ、発光６６５ｎｍ、発光６１５ｎｍ、遅延時間１００μｓ）に適切なフィルター及び機器設定を使用してプレートリーダーで読み取る。各ウェルの発光比（６６５／６１５）を計算し、相対活性を列１及び２（１００％活性）並びに列２３及び２４（０％活性）に基づいて決定する。１０点応答曲線をプロットし、４パラメータロジスティック方程式に当てはめて、ＩＣ_５０値を得る。実施例１は、８０．４７ｎＭ＋１５．５３（ｎ＝６）のＩＣ_５０を示す。このデータは、実施例１がキナーゼ結合アッセイにおいて組換え切断型ＣＳＦ－１Ｒに対して活性であることを示す。

【0087】

ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（登録商標）ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＲＴＫ）細胞ベースの機能アッセイ
インビトロＰＤＧＦＲβ（受入ＮＭ＿００２６０９、品番９３－０４９３Ｃ３）及びｃ－Ｋｉｔ（受入ＮＭ＿０００２２２、品番９３－０８５３Ｃ３）細胞アッセイの場合、試験化合物をＤＭＳＯで調製して、１０ｍＭストック溶液を作製する。ストック溶液をＤＭＳＯで２倍に段階希釈して、最終化合物濃度が２０．０μＭ～０．０１９ｎＭの範囲である２０点曲線を得る。

【0088】

ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（登録商標）ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＲＴＫ）細胞ベースの機能アッセイを、ヒトＰＤＧＦＲβ Ｕ２ＯＳ細胞及びヒトｃ－Ｋｉｔ Ｕ２ＯＳ細胞を用いたＥｎｚｙｍｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ技術を使用して化合物のプロファイリングするために利用する。細胞を、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８及び２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｉｔ－１０３（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（登録商標）、９２－３１０３Ｇ）培地で、細胞継代５から細胞継代３０まで連続して培養する。培地（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（登録商標）、９３－０５６３Ｒ１６Ｂ）中のＰＤＧＦＲβ又はｃ－Ｋｉｔ細胞（２７μＬ）を、１．５×１０^４細胞／ウェルで、Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ポリ－ｄ－リジンコーティング白色プレートの全てのウェルに播種する。その後、細胞プレートを３７℃、５．０％ＣＯ_２で一晩インキュベートする。その後、化合物段階希釈物を行Ａ～Ｐ、列３～２２に添加する。ＤＭＳＯ及び阻害剤対照を、それぞれ、行Ａ～Ｐ、列１～２及び２３～２４に添加する。化合物又は対照を含む細胞プレートを３７℃、５．０％ＣＯ_２で１時間インキュベートする。インキュベートした後、ＥＣ_８０用量の３ｎＭ組換えヒトＰＤＧＦ－ＢＢ（カタログ番号１００－１４Ｂ）又は１０ｎＭ組換えヒト幹細胞因子（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（登録商標）、番号３００－０７）アゴニストを対応するＰＤＧＦＲβ又はｃ－Ｋｉｔ細胞プレートにスタンプし、２３℃、５．０％ＣＯ_２で３時間インキュベートする。その後、化学発光試薬（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（登録商標）、番号９３－０００１ＸＬ）を各細胞プレートに添加し、室温で１時間インキュベートする。１時間後、細胞プレートを化学発光可能なプレートリーダーで読み取る。２０点曲線をプロットし、４パラメータロジスティック方程式に当てはめて、阻害剤（０％活性）及びＤＭＳＯ（１００％活性）対照ウェルに対する各ウェルの活性に基づくＩＣ_５０値を得る。実施例１は、それぞれ、ＰＤＧＦＲβ及びｃ－Ｋｉｔに対して、２０，０００ｎＭ（ｎ＝４）及び５，６１５ｎＭ＋８８１（ｎ＝４）のＩＣ_５０を示す。このデータは、実施例１がｈＣＳＦ－１Ｒと比較してＰＤＧＦＲβ又はｃ－Ｋｉｔに関して薬理学的に関連する活性を有しないことを示す。

【0089】

ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（登録商標）ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）インビボキナーゼ競合結合アッセイ
ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）スクリーニングプラットフォームは、新規かつ専売の活性部位特異的競合結合アッセイを、試験化合物と４５０を超えるヒトキナーゼ及び疾患関連変異体バリアントとの間の相互作用を定量的に測定するために用いる。ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）アッセイはＡＴＰを必要とせず、それ故に、真の熱力学的相互作用親和性を報告する。キナーゼ活性部位に結合して固定化リガンドへのキナーゼの結合を直接（立体的に）又は間接的に（アロステリックに）阻害する化合物は、固体支持体に捕捉されるキナーゼの量を減らすであろう。しかしながら、キナーゼに結合しない化合物は、固体支持体に捕捉されるキナーゼの量に影響を及ぼさない。化合物活性（結合％）を、会合したＤＮＡ標識を検出するｑＰＣＲ法を使用して対照試料と比較して試験試料に捕捉されたキナーゼの量を測定することによって監視する。結合活性を阻害％に変換し、ＩＣ_５０値をＣＳＦ－１Ｒ倍率選択性評価のために決定する。

【0090】

４６８キナーゼパネルへの結合を監視するためのアッセイをＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で行う。試験化合物を１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭストックとして提供し、２０ｎＭ、２ｎＭ、及び０．２ｎＭの最終濃度で評価する。キナーゼをｑＰＣＲ検出のためにＤＮＡでタグ付けする。ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズをビオチン化低分子リガンドで室温で３０分間処理して、キナーゼアッセイ用のアフィニティー樹脂を得る。リガンドビーズを過剰量のビオチンでブロックし、ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ ＳｅａＢｌｏｃｋ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄して結合していないリガンドを除去し、非特異的結合を減少させる。結合反応物を、１×結合緩衝液（２０％Ｐｉｅｒｃｅ ＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び６ｍＭ ＤＴＴ）中で、キナーゼ、リガンド結合アフィニティービーズ、及び試験化合物を組み合わせることによって構築する。試験化合物を１００％ＤＭＳＯ中４０倍ストックとして調製し、アッセイに直接希釈する。全ての反応を、０．０２ｍＬの最終体積でポリプロピレン３８４ウェルプレートで行う。アッセイプレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートし、アフィニティービーズを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄する。その後、ビーズを溶出緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．５μＭ非ビオチン化親和性リガンド）中に再懸濁し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。溶出液中のキナーゼ濃度をｑＰＣＲによって測定する。一次スクリーニング結合相互作用の結果を「対照に対する％」として報告し、ここで、数値が小さいほど、マトリックス内のヒットが強いことを示す。

【0091】

対照に対するパーセント（対照に対する％）の計算：

【数1】

試験化合物＝Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙが提出した化合物
陰性対照＝ＤＭＳＯ（１００％対照）
陽性対照＝対照化合物（０％対照）

【0092】

続いて、阻害パーセント値及び３点濃度応答データを決定し、ＮＧＲソフトウェアで分析し、非標準ＩＣ_５０値を結果として得られた曲線当てはめから計算する。最大外挿範囲の３ ｌｏｇ単位を使用して、ＮＳＩＣ５０が選択した範囲でマスクされないようにする。また、有効ポイントの最小数は３である。

【0093】

フィットモデル：ヒルフィット
４パラメータロジスティックモデル又はシグモイド用量反応モデル。

【0094】

ｆｉｔ＝（Ａ＋（（Ｂ－Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ））））
ｉｎｖ＝（Ｃ／（（（（Ｂ－Ａ）／（ｙ－Ａ））－１）＾（１／Ｄ）））
ｒｅｓ＝（ｙ－ｆｉｔ）
式中、Ａがゼロに固定した下限値であり、
Ｂが１００に固定した上限値であり、
Ｃが効力であり、
Ｄが１に固定したヒル値である。

【0095】

ＩＣ_５０値から、他のキナーゼとの関係でＣＳＦ－１Ｒに対する化合物倍率選択性を決定する。このデータは、実施例１が２μＭの化合物濃度でパネル中の４６８個のタンパク質キナーゼに対して優れた選択性を有し、３個のキナーゼのみが３５％未満の制御活性（又は６５％超の阻害）を示したことを示す（ＣＳＦ１Ｒ ９９％、ＣＳＦ１Ｒ自己阻害９８．９％、ＫＩＴ ９９．４％、ＫＩＴ Ｖ５５９Ｄ ９９．５％、ＫＩＴ Ｌ５７６Ｐ ９６．４％、ＫＩＴ Ｖ５５９Ｄ Ｖ６５４Ａ ８４％、及びＰＤＧＦＲＢ ９０．８％阻害）。このデータは、実施例１が、ｈＫＩＴ（６２倍の選択性）、ｈＰＤＧＦＲβ（２５８倍の選択性）、及びｈＴＲＫＢ（７００倍の選択性）を除いて、パネル中の全てのキナーゼとの関係でＣＳＦ－１Ｒに対して１０００倍超の選択性を有することも示す。加えて、ｈＫＩＴ変異体Ｖ５５９Ｄ、Ｖ５５９Ｄ、Ｖ６５４Ａ、及びＬ５７６Ｐは、ＣＳＦ－１Ｒに対して５９～５００倍の選択性を示した。

【0096】

ｐＣＳＦ－１Ｒ細胞イメージングアッセイ
ヒトＣＳＦ－１Ｒ過剰発現ＮＩＨ－３Ｔ３細胞（内部で生成された細胞株、クローンＨ２Ｓ－２５－２０）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地（５０ｍＬ）を含むＴ２２５組織培養フラスコで増殖させる。無血清ＤＭＥＭ培地を使用して、細胞を３８４ウェルのポリ－ｄ－リジンコーティング黒色プレートに５，０００細胞／ウェルでプレーティングする。細胞ストック溶液は１．６７ｘ１０^５細胞／ｍＬであり、３０μｌのプレーティング体積を使用する。プレートを室温で０．５時間、その後、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートする。細胞を、０．１％ＤＭＳＯを含む無血清ＤＭＥＭ中に溶解させた化合物（６μｌの６×段階希釈ストック溶液）で処理し、３７℃で２時間インキュベートする。組換えヒトＭ－ＣＳＦ（４μｌの２００ｎｇ／ｍＬストック溶液、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ－ＩＰＴＧ誘導系を使用してＥ．ｃｏｌｉで発現させたもの）を無血清ＤＭＥＭ培地に添加する。Ｍ－ＣＳＦ刺激剤を添加した直後に、プレートを１，０００×ｇで１分間遠心分離する。プレートを３７℃で２０分間インキュベートする。細胞を新鮮な１６％パラホルムアルデヒド（１２μｌ）で固定し、プレートを室温で３０分間インキュベートする。パラホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳ（３０μｌ）を添加する。ＰＢＳを除去し、０．１％トリトン－１００を補充したＰＢＳ（３０μｌ）を添加する。プレートを室温で２０分間インキュベートする。プレートをＰＢＳ（２×５０μｌ／ウェル）で洗浄する。１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ（３０μｌ／ウェル）で１：９，０００に希釈した一次抗体ウサギ抗ｐＣＳＦ－１Ｒ（６．４ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＭＡ５－１５１５１、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＣＳＦ１Ｒ（Ｔｙｒ７２３）モノクローナル抗体（Ｆ．５４０．２））を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ（２×５０μｌ／ウェル）で洗浄する。ＰＢＳ（３０μｌ／ウェル）で１：１，０００に希釈した二次抗体抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号Ａ１１０３４）を添加する。プレートをＰＢＳ（２×５０μｌ／ウェル）で洗浄する。ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液と混合した核染色剤ヨウ化プロピジウム（２μｇ／ｍｌ）を添加し（３０μｌ／ウェル）、プレートを黒色のテープで密封して、Ａｃｕｍｅｎ機器でｐＣＳＦ－１Ｒをイメージングする。１０点化合物曲線をプロットし、４パラメータロジスティック方程式に当てはめて、参照ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤（ＰＬＸ３３９７、Ｐｌｅｘｉｃｏｎ、０％活性）及びＤＭＳＯ（１００％活性）対照ウェルに対する各ウェルの活性に基づくＩＣ_５０値を得る。実施例１は、５２．３１ｎＭ＋１８．１４（ｎ＝４）のＩＣ_５０を示す。このデータは、実施例１が細胞ベースのＣＳＦ－１Ｒリン酸化イメージングアッセイにおいて内因性全長ＣＳＦ－１Ｒに対して活性であることを示す。