(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-21
(45)【発行日】2024-01-04
(54)【発明の名称】細胞誘導の方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20231222BHJP
C07D 471/14 20060101ALI20231222BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C07D471/14 101
【請求項の数】
4
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022117552
(22)【出願日】2022-07-22
(62)【分割の表示】P 2020562821の分割
【原出願日】2019-01-29
(65)【公開番号】P2022166007
(43)【公開日】2022-11-01
【審査請求日】2022-08-19
(31)【優先権主張番号】201810083174.7
(32)【優先日】2018-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201810083591.1
(32)【優先日】2018-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201810083568.2
(32)【優先日】2018-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520176566
【氏名又は名称】中国科学院動物研究所
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＺＯＯＬＯＧＹ，ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， １ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】周 ▲き▼
(72)【発明者】
【氏名】李 偉
(72)【発明者】
【氏名】何 正泉
(72)【発明者】
【氏名】王 柳
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０４８１９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／２００３４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】British Journal of Pharmacology，2010年，Vol.159，pp.304-315
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インビトロでの肝細胞増殖の誘導における（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅの使用。
【請求項2】
（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅによって増殖を誘導された肝細胞のバイオ人工肝臓の構築における使用。
【請求項3】
（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅによって増殖を誘導された肝細胞の、該肝細胞により得られる肝臓疾患モデルの構築における使用。
【請求項4】
肝細胞を培地で培養し、（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅを培地に加え、インビトロでの肝細胞増殖を誘導するように培養を続けるステップを含む、インビトロでの肝細胞増殖を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ技術分野に関し、具体的には細胞誘導技術分野に関し、より具体的には、線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を誘導する方法およびその使用、線維芽細胞の不死化細胞への分化転換を誘導する方法およびその使用、並びにインビトロでの肝細胞の増殖を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
分化転換（Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、分化転移とも呼ばれる）とは、あるタイプの分化細胞が別のタイプの分化細胞に転換する現象をいう。現在、複数のタイプの細胞の分化転換が実現でき、例えば、胚性線維芽細胞、軟骨芽細胞、網膜上皮細胞の筋細胞への分化転換、Ｂリンパ球のマクロファージへの分化転換、マウス線維芽細胞の機能的神経細胞への分化転換などが実現できている。
【0003】
脂肪細胞（ａｄｉｐоｃｙｔｅ）は成人体内に大量に存在し、その組織は脂肪組織とも呼ばれ、多くの場合は白色を呈し、幼年期に大量に増殖し、思春期にその数がピークに達した後、一般に増加しなくなる。正常な動物やヒトの体内では、脂肪組織は主に腹腔内と腹部の皮下に存在するが、肥満患者の体のさまざまな部位、例えば、腎臓、腸間膜、皮下、腹腔などの周囲に脂肪組織が現れる。これは、脂肪細胞に分化する可能性のある細胞が脂肪前駆細胞であるだけではなく、特定の条件下では、一部の非脂肪前駆細胞も脂肪細胞に分化できることを示している。これは、脂肪細胞が脂肪前駆細胞から分化されたものであるという従来の考え方を覆した。非脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化転換することにより、脂肪細胞の転換メカニズムもより明確に理解でき、さらに抗肥満薬の開発を導くことができる。
【0004】
線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）は、疎性結合組織の主要な細胞成分であり、胚期の間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）が分化してなる。線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換は、多くの分野で重要な適用がある。例えば、瘢痕創傷に見られる最も一般的なタイプの筋線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換は、将来傷に瘢痕を残らず、しわのある皮膚に脂肪細胞を再生する可能性があり、新しいアンチエイジング治療戦略を導き出す可能性がある。これから見ると、非脂肪前駆細胞、特に線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を実現することは重要な意義を有する。
【0005】
今までの既存技術には、線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を誘導する方法はいくつか開示されている。ＣＮ１０４３４２４０１Ｂには、サイトカインの特定の組み合わせを使用して、線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を促進する方法が開示され、組成物の開始因子は、上皮成長因子、肝細胞成長因子、デキサメタゾン、インスリン、およびＰＰＡＲγアゴニストである。ＣＮ１０４３７２０２４Ａには、ウシ線維芽細胞／筋芽細胞の脂肪細胞への分化転換を誘導する方法が開示され、この方法は、ウシ転写因子ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子をクローニングし、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子過剰発現ベクターを構築してパッケージングして組換えアデノウイルスを取得し、アデノウイルスをウシ線維芽細胞や筋芽細胞に感染させて上記細胞から脂肪細胞への急速な分化転換を実現することを含む。上記の方法は、大量の高分子物質またはリプログラミングプロセスを使用し、効率が低く、安全性にも一定の影響を受ける。
【0006】
小分子化合物も、線維芽細胞から脂肪細胞への分化転換を誘導することができ、分化転換の速度、生存率および能力を改善できることは確認されている。例えば、ＣＮ１０５７５４９３５Ａには、線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を誘導する誘導培地が開示され、
この培地は、基礎培地と、誘導小分子の組み合わせとを含み、前記誘導小分子の組み合わせはＳＧまたは６ＴＦであり、ＳはＳＢ４３１５４２、ＧはＧＳＫ１２６、６はＥ６１５４１、Ｔはトラニルシプロミン、Ｆはフォルスコリンである。しかしながら、線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を誘導して疾患の研究、治療、およびより広範な適用に使用するために、より多くの小分子化合物を探索する必要がある。
この培地は、基礎培地と、誘導小分子の組み合わせとを含み、前記誘導小分子の組み合わせはＳＧまたは６ＴＦであり、ＳはＳＢ４３１５４２、ＧはＧＳＫ１２６、６はＥ６１５４１、Ｔはトラニルシプロミン、Ｆはフォルスコリンである。しかしながら、線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を誘導して疾患の研究、治療、およびより広範な適用に使用するために、より多くの小分子化合物を探索する必要がある。
【0007】
正常組織に由来する体細胞は、通常のインビトロ培養条件下で成長および分裂することができるが、有限回数の細胞継代後、増殖が停止し、老化と死亡するため、細胞培養技術の適用が制限される。細胞不死化（ｃｅｌｌ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）とは、インビトロで培養するプロセス中に、細胞が自身の遺伝的変化または様々な外部刺激により、増殖と老化の危機から脱出し、正常細胞の老化と死亡のプロセスを回避し、長期間継代培養し、無限に分裂増殖できることを指す。
【0008】
細胞不死化のメカニズムと方法について大量の研究が行われてきた。放射性因子、テロメラーゼの活性化、ウイルス遺伝子のトランスフェクション、癌原遺伝子、腫瘍抑制遺伝子などはいずれも無制限の細胞増殖分裂を引き起こせることが確認されている。しかし、長年の研究の結果、不死化のメカニズムが似ているところがあるが、同じ不死化方法がすべての細胞に適用できるわけではないことは分かった。例えば、肝細胞不死化の方法には、腫瘍抑制遺伝子ノックアウト、プラスミドの形質導入およびウイルスのトランスフェクション、回復可能な不死化などが含まれ、上皮細胞不死化の方法には、ＤＮＡ腫瘍形成性ウイルストランスフェクションなどが含まれ、心筋細胞不死化の方法には、Ｐ１６レンチウイルスベクターと可逆的なＳＶ４０ウイルス形質導入経路の成功例がある。
【0009】
現在、既存技術には、線維芽細胞の不死化細胞への転換を誘導する方法はいくつか開示されている。王 新文ら（『皮膚線維芽細胞の不死化についての研究の進展』、中国生物工程雑誌、第２２巻第４期、２００２年８月）は、皮膚線維芽細胞の不死化の方法を開示し、上記の一般的に使用される方法の他に、まとめると、ＨＰＶ、テトラニトロキノリン一酸化物、アフラトキシンなどの方法がさらにある。
【0010】
特定の細胞のための不死化技術をターゲットした開発は、継代回数の少ない、増殖分裂の遅い正常な体細胞の長期継代、無制限の分裂増殖を実現でき、細胞周期寿命を延ばすことができる。これは、細胞成長の法則を理解し、細胞の老化の原因を探るのに役立つだけではなく、臓器移植の問題を解決するのに重要な臨床的意義も持っている。
【0011】
また、資料によると、細胞の不死化は腫瘍細胞への転換の前提であり、正常細胞から腫瘍細胞への転換に必要な段階である。細胞不死化の研究は、腫瘍の治療と腫瘍細胞増殖の制御のための確固たる基盤を築くことができる。
【0012】
したがって、線維芽細胞の不死化細胞への転換についての研究は、幅広い応用の見込みがある。
【0013】
肝臓は人体で最大の内臓であり、代謝の主要な場所である。肝細胞は肝臓の８５％を占める。肝細胞は、体内で強力な再生能力を持っており、正常な肝臓の３分の２を取り除いた後、１週間以内に細胞が増殖して元の体積に回復できる。残念ながら、ヒトの肝臓は体内で急速に再生できるが、初代肝細胞はインビトロ培養条件下では短時間しか増殖できず、長期間増殖することができない。これまでのところ、実験室でのヒト肝細胞の増幅努力は、代謝機能の低い不死化癌細胞を引き起こすことになる。ヒトの肝細胞の不足と肝細胞の増幅時の機能喪失は、科学、医学、および薬学の発展における主要な障害であり、この問題を解決することで、肝細胞のインビトロでの薬物代謝、薬物毒性、末期肝疾患の細胞治療を促進し、バイオ人工肝臓を構築して、移植を待つ患者、疾患モデルの構築などの研
究とアプリケーションをサポートすることに寄与する。
究とアプリケーションをサポートすることに寄与する。
【0014】
現在、この分野で最も一般的に使用されている方法は転写因子リプログラミング技術であるが、このような技術は、外因性遺伝子フラグメントの挿入により、臨床アプリケーションに入るリスクが高くなる。この前の研究では、小分子リプログラミング技術を使用して、中国と日本の２つの研究チームがそれぞれ初代肝細胞のインビトロでの肝前駆細胞への変換と急速な増殖に成功し、定方向分化誘導を行った後、増殖した前駆体様肝細胞は成熟肝細胞の機能を取り戻すことができ、マウスに移植して７０％以上の統合を達成できることは明らかになった。小分子化合物リプログラミング技術を使用する場合、得られた肝細胞は遺伝子改変されていないため、体内の細胞の初期状態により近く、将来の臨床アプリケーションにより安全で効果的である。この分野では、インビトロでの肝細胞の増殖を誘導するために小分子化合物を使用するという強い要求がまだある。
【発明の概要】
【0015】
本発明者らは継続的な探索した結果、上記の目的が、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅによって実現できることを意外に発見した。
【0016】
したがって、本発明は、細胞の分化転換の誘導におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【0017】
好ましくは、前記分化転換は、線維芽細胞の分化転換を誘導することである。好ましくは、前記分化転換は、線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を誘導することである。
【0018】
一実施形態では、前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎであり、ＢｌｅまたはＢｌｅｂもしくはＢｌｅｂｂと略す。
【0019】
一実施形態では、前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅであり、Ｓ－Ｂｌｅｂ－ＯＢと略す。
【0020】
本発明で使用される（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（（Ｓ）－（－）－ＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたはＳ－Ｂｌｅｂとも表される）は、非ミオシンＩＩＡＴＰａｓｅに作用する細胞透過性阻害剤であり、ミオシン軽鎖キナーゼを阻害せず、分裂溝の収縮を阻害し、有糸分裂または収縮ループの組立を妨害しない。その構造式は式（Ｉ）で表され、分子量は２９２．３３である。
【0021】
本発明で使用される（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅ（（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－ＢｅｎｚｏａｔｅまたはＳ－Ｂｌｅｂ－ＯＢとも表される）は（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎの誘導体であり、その構造式は式（ＩＩ）で表される。
【0022】
【化1】
【0023】
【化2】
【0024】
また、本発明は、線維芽細胞を培地で培養し、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤とＢＭＰ４を培地に加え、脂肪細胞を得るまで培養を続けるステップを含む、線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を誘導する方法に係る。
【0025】
好ましくは、前記培地は、基礎培養液、ウシ胎児血清、および脂肪誘導培養液からなる群より選ばれるいずれか一つまたは複数を含む。
【0026】
好ましくは、前記基礎培養液は、高グルコースＤＭＥＭ、ウシ胎児血清、および二重抗生（ペニシリン-ストレプトマイシン溶液）を含む。
【0027】
好ましくは、前記脂肪誘導培養液は、Ｎ２Ｂ２７培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌの１：１混合物）、Ｎ２添加剤、Ｂ２７添加剤、２％ウシ血清アルブミン、β－メルカプトエタノール、ＧｌｕｔａＭＡＸ、インスリンと二重抗生、および血清代替物を含む。
【0028】
本発明はさらに、前記方法により得られる脂肪細胞、または前記脂肪細胞を含む試薬または研究用具若しくは診断用具に係る。
【0029】
本発明の上記方法は、単一の小分子または単一因子のみにより処理すればよく、操作が単純であり、再現性が良く、インビボおよびインビトロでいずれも効率的に実行でき、トランスジェニック操作に係わらず、得られた脂肪細胞は安全であり、組織再生や修復などの分野と業界でのアプリケーションに適している。
【0030】
本発明はまた、細胞不死化の誘導におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【0031】
好ましくは、前記不死化は、線維芽細胞の不死化細胞への分化転換を誘導することである。
【0032】
好ましくは、前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅである。
【0033】
また、本発明は、線維芽細胞を培地で培養し、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を培地に加え、不死化細胞を得るまで培養を続けるステップを含むことを特徴とする、線維芽細胞の不死化細胞への分化転換を誘導する方法に係る。
【0034】
好ましくは、前記培地は、基礎培養液、ウシ胎児血清、および不死化誘導培養液からなる群より選ばれるいずれか一つまたは複数を含む。
【0035】
本発明はさらに、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤、基礎培養液、ウシ胎児血清、および不死化誘導培養液を含むことを特徴とする、線維芽細胞の不死化細胞への分化転換を誘導する培地に係る。
【0036】
好ましくは、前記基礎培養液は、高グルコースＤＭＥＭと二重抗生を含み、および／または、前記不死化誘導培養液は、Ｎ２Ｂ２７培養液：（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌの１：１混合物）、Ｎ２添加剤、Ｂ２７添加剤、２％ウシ血清アルブミン、β－メルカプトエタノール、ＧｌｕｔａＭＡＸ、インスリン、および二重抗生を含む。
【0037】
好ましくは、前記不死化誘導培養液はさらに、ＫＯＳＲ、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＡ８３－０１からなる群より選ばれるいずれか一つまたは複数を含む。
【0038】
本発明はさらに、前記方法により得られる不死化細胞、または前記不死化細胞を含む試薬または研究用具若しくは診断用具に係る。
【0039】
本発明はさらに、増殖または老化を誘導するための製剤の調製における遺伝子の使用に係り、前記遺伝子は、Ｓｏｘ２、Ｓｒｒｔ、Ｙａｐ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｍｋｉ６７、Ｐｃｎａ、Ｐ１９、Ｐ１６ｉｎｋ４ａ、Ｐ１５ｉｎｋ４ｂ、Ｍｏｒｆ４１１、Ｅｌｆ５からなる群より選ばれる一つ以上を含む。
【0040】
好ましくは、増殖関連遺伝子は、Ｓｏｘ２、Ｓｒｒｔ、Ｙａｐ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｍｋｉ６７、Ｐｃｎａからなる群より選ばれる一つ以上を含む。好ましくは、老化関連遺伝子は、Ｐ１９、Ｐ１６ｉｎｋ４ａ、Ｐ１５ｉｎｋ４ｂ、Ｍｏｒｆ４１１、Ｅｌｆ５からなる群より選ばれる一つ以上を含む。
【0041】
本発明の上記方法は、単一の小分子または単一因子のみにより処理すればよく、操作が単純であり、再現性が良く、インビボおよびインビトロでいずれも効率的に実行でき、トランスジェニック操作に係わらず、得られた脂肪細胞は安全であり、細胞成長の法則を理解し、細胞の老化の原因を探り、臓器移植問題を解決するのに適するだけではなく、腫瘍の治療と腫瘍細胞増殖の制御のための確固たる基盤を築くことができ、重要な意義を持っている。また、本発明は増殖関連遺伝子と老化関連遺伝子を発見したため、誘導細胞の増殖と老化に対し斬新な選択肢を提供している。
【0042】
また、本発明者らは継続的な探索した結果、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が肝細胞の長期増殖を有意に促進でき、さらに上記の目的を実現できることを意外に発見した。
【0043】
したがって、本発明は、概して、インビトロでの肝細胞増殖の誘導におけるＭｙｏｓｉ
ｎ阻害剤の使用に係る。
ｎ阻害剤の使用に係る。
【0044】
本発明はさらに、バイオ人工肝臓の構築におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【0045】
本発明はさらに、肝臓疾患モデルの構築におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【0046】
好ましくは、前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅである。
【0047】
また、本発明は、肝細胞を培地で培養し、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を培地に加え、インビトロでの肝細胞増殖を誘導するように培養を続けるステップを含むことを特徴とする、インビトロでの肝細胞増殖を誘導する方法に係る。好ましくは、前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅである。
【0048】
本発明はさらに、前記方法により得られる肝細胞に係る。
【0049】
本発明はさらに、前記肝細胞を含む、試薬、バイオ人工肝臓、研究用具または診断用具に係る。
【0050】
本発明はさらに、前記インビトロでの肝細胞増殖を誘導する方法により得られる、または前記方法によって得られた肝細胞により得られる、肝臓疾患モデルに係る。
【0051】
本発明はさらに、バイオ人工肝臓の構築における、前記方法により得られる肝細胞の使用に係る。
【0052】
本発明はさらに、肝臓疾患モデルの構築における、前記方法により得られる肝細胞の使用に係る。
【0053】
上記使用は、治療的使用であってもよく、非治療的使用であってもよい。
【0054】
本発明の上記方法は、単一の小分子または単一因子のみにより処理すればよく、操作が単純であり、再現性が良く、インビトロで効率的に実行でき、転写因子リプログラミング技術および複雑なトランスジェニック操作に係わらず、長期的に増幅でき、しかも小分子で増幅した肝細胞は依然として機能を持っている。
【図面の簡単な説明】
【0055】
【図1】図１Ａは実施例１の実験フローを示す図である。図１Ｂは、ヒト包皮線維芽細胞から誘導された脂肪細胞のオイルレッドＯ染色を示す図である。図１Ｃと図１Ｄはそれぞれマウス胚線維芽細胞から得られた脂肪細胞の形態、オイルレッドＯ染色、および脂肪滴面積比を示す図である。図１Ｅと図１Ｆはそれぞれ、元の脂肪誘導培養液に異なる物質を添加した後のオイルレッドＯ染色と脂肪滴面積の統計を示す図である。
【図4A】図４Ａは、細胞をマウス肝細胞培養液（ＭｙｏｓｉｎＩＩ阻害剤（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ５μｍоｌを添加）に再懸濁し、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎを塗布したペトリ皿に播種し、１週間後にＡｌｂを発現した緑色の肝細胞クラスターを観察することを示す図である。
【図5】図５Ａと図５Ｂは、１２日継代（合計３世代）培養した後の増幅結果を示す図である。図５Ｃは、１２日継代（合計３世代）培養した後のアルブミンおよびアルファフェトプロテイン遺伝子発現の結果を示す図である。
【図6-1】図６Ａは、２日間培養を継続した後、小分子群の細胞クローニングがさらに増幅したが、対照群では有意な変化がなかったことを示す図である。図６Ｂは、６日培養した後の小分子群と対照群の細胞数を示す図である。図６Ｃは、小分子群と対照群における増殖細胞核抗原遺伝子（ＰＣＮＡ）の発現結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0056】
以下、図面を参照して本発明の具体的な実施例をより詳細に説明する。本発明の具体的な実施例は図面に示されているが、ここで説明する実施例に制限せずに、本発明は様々な形で実施できることを理解されたい。逆に、これらの実施例は、本発明をよりよく理解し、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるために提供されたものである。
【0057】
なお、明細書および特許請求の範囲では、特定の構成要素を指すために特定の用語が使われている。技術者が同じ構成要素を指すために異なる用語を使用する場合があることを、当業者は理解するのであろう。本明細書および特許請求の範囲は、構成要素を区別する方法として用語の違いを使用せず、構成要素の機能の違いをその区別の基準として使用する。例えば、明細書および特許請求の範囲全文で言及されている「含む」または「備える」はオープンな用語であるため、「含むがそれらに限定されない」と解釈すべきである。以下の明細書の説明は、本発明を実施するための好ましい実施形態であるが、その説明は、明細書の一般的な原則を説明することを目的としており、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されるものに従うものとする。
【0058】
本文で使用されているように、特定の成分について、「実質的に含まない」とは、特定の成分が意図的に組成物に配合されておらず、および／または汚染物としてまたは痕跡量でのみ存在することをいう。よって、組成物の偶発的な汚染によって引き起こされる特定の成分の総量は、０．０５％未満、好ましくは０．０１％未満である。もっとも好ましいのは、特定の成分の量が標準的な分析方法では検出できない組成物である。
【0059】
本明細書で使用されているように、「一」または「一つ」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲で使用されているように、「含む」という単語とともに使用される場合、「一」または「一つ」は、１つまたは複数を意味することができる。
【0060】
代替案のみを指すこと、または代替案が相互に排他的であると明確に述べられている場
合以外に、特許請求の範囲では「または」という用語を使用して「および／または」を表すが、本開示内容は代替案のみを指すこと及び「および／または」の定義をサポートしている。本文で使用されているように、「もう一つの／別の」は、少なくとも２つめの、またはそれ以上を意味することができる。
合以外に、特許請求の範囲では「または」という用語を使用して「および／または」を表すが、本開示内容は代替案のみを指すこと及び「および／または」の定義をサポートしている。本文で使用されているように、「もう一つの／別の」は、少なくとも２つめの、またはそれ以上を意味することができる。
【0061】
本願全体を通して、「約／くらい」という用語は、その値がデバイスのエラーの固有の変動を含むことを示すために使用され、その方法は、その値または研究対象間に存在する変動を測定するために使用される。
【0062】
本文では、「分化」とは、あまり特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスをいう。「脱分化」とは、一部または最終的に分化した細胞が、多能性または多潜在性などのより初期の発生段階に戻る細胞プロセスをいう。「分化転換」とは、あるタイプの分化細胞が別のタイプの分化細胞に転換するプロセスをいう。典型的には、細胞は中間多能性段階を通過せずに、プログラミングすることによって分化転換が発生し、すなわち、細胞は、あるタイプの分化細胞から別のタイプの分化細胞に直接にプログラミングされる。
【0063】
本文で使用されているように、「被験者」または「必要とする被験者」という用語は、細胞または組織の移植を必要とする任意の年齢のオスまたはメスの哺乳動物を指し、好ましくはヒトを指す。通常、被験者は細胞または組織の移植を必要とし（本文ではレシピエントとも呼ばれる）、これは、細胞または組織移植を介した治療に適した病症または病状または望ましくない状況、状態または症候群、若しくは物理的、形態学的、または生理学的異常によるものである。
【0064】
本文に係るいくつかの用語の定義は次の通りである。
ＢＭＰ４：骨形成タンパク質４（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｂｍｐ４）。
高グルコースＤＭＥＭ：高グルコースＤＭＥＭ培地（ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）、すなわち、ＭＥＭ培地をベースにして開発された、様々なグルコースとアミノ酸を含む市販の培地。
Ｎ２Ｂ２７：ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地とｎｅｕｒｏｂａｓａｌ基礎培地を１：１で混合した、Ｎ２添加剤とＢ２７添加剤を含む成分がはっきりしている細胞培養液である。マウス胚性幹細胞の神経系への分化に寄与すると報告されている。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２：クローン密度の培養に適した、ＤＭＥＭ培地とＦ１２培地を１：１で混合した市販の基礎培養液。
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ：神経細胞培養に寄与する市販の基礎培地。
ＧｌｕｔａＭＡＸ：細胞培地中のＬ－グルタミンを直接に置き換えることができる細胞培養添加剤。
二重抗生：ペニシリンとストレプトマイシンは、細胞培養中に細菌の混入を防ぐために細胞培養で一般的に使用される２つの抗生物質である。
Ｎ２添加剤：市販の無血清細胞培養添加剤。
Ｂ２７添加剤：市販の無血清細胞培養添加剤。
ＫＯＳＲ：市販の血清の代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ＫＯＳＲ）。
ＣＨＩＲ９９０２１：Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤としてよく使用されるＧＳＫ－３α／β阻害剤。
Ａ８３－０１：ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及びＡＬＫ７の活性を顕著に阻害できる選択的ＴＧＦ－β阻害剤。
ＢＭＰ４：骨形成タンパク質４（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｂｍｐ４）。
高グルコースＤＭＥＭ：高グルコースＤＭＥＭ培地（ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）、すなわち、ＭＥＭ培地をベースにして開発された、様々なグルコースとアミノ酸を含む市販の培地。
Ｎ２Ｂ２７：ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地とｎｅｕｒｏｂａｓａｌ基礎培地を１：１で混合した、Ｎ２添加剤とＢ２７添加剤を含む成分がはっきりしている細胞培養液である。マウス胚性幹細胞の神経系への分化に寄与すると報告されている。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２：クローン密度の培養に適した、ＤＭＥＭ培地とＦ１２培地を１：１で混合した市販の基礎培養液。
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ：神経細胞培養に寄与する市販の基礎培地。
ＧｌｕｔａＭＡＸ：細胞培地中のＬ－グルタミンを直接に置き換えることができる細胞培養添加剤。
二重抗生：ペニシリンとストレプトマイシンは、細胞培養中に細菌の混入を防ぐために細胞培養で一般的に使用される２つの抗生物質である。
Ｎ２添加剤：市販の無血清細胞培養添加剤。
Ｂ２７添加剤：市販の無血清細胞培養添加剤。
ＫＯＳＲ：市販の血清の代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ＫＯＳＲ）。
ＣＨＩＲ９９０２１：Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤としてよく使用されるＧＳＫ－３α／β阻害剤。
Ａ８３－０１：ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及びＡＬＫ７の活性を顕著に阻害できる選択的ＴＧＦ－β阻害剤。
【実施例】
【0065】
次は具体的な実施例を用いて本発明の実施形態を詳しく説明する。ただし、以下の内容は、本発明に対するいかなる制限として解釈されるべきではない。特に明記しない限り、実施例で使用される材料は市販の製品である。
【0066】
（実施例１）
線維芽細胞の脂肪細胞への転換
１２ウェルプレートを例にして（ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３５）、各ウェルに１×ＤＭＥＭで調製した２０μｇ／ｍｌマトリゲル溶液（ＢＤ，３５４２７７）を、１２時間コーティングした後、コーティング溶液を除去して１×ＰＢＳフラッシング溶液で一回洗浄した。
線維芽細胞の脂肪細胞への転換
１２ウェルプレートを例にして（ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３５）、各ウェルに１×ＤＭＥＭで調製した２０μｇ／ｍｌマトリゲル溶液（ＢＤ，３５４２７７）を、１２時間コーティングした後、コーティング溶液を除去して１×ＰＢＳフラッシング溶液で一回洗浄した。
【0067】
マウス胚性線維芽細胞（Ｃ５７、Ｅ１３．５で調製）または成人包皮線維芽細胞（ＨＦＦ２０ｙ、北京幹細胞ライブラリー）を、１ウェル当たり１×１０４の細胞で各ウェルに均一に播種し、基礎培養液（高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃ１２４３０５００ＢＴ），二重抗生）＋１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，１６０００－０４４）で２４時間培養した。培養液を除去してＰＢＳで一回洗浄した。
【0068】
上記のように処理された線維芽細胞を脂肪誘導培養液：（Ｎ２Ｂ２７培養液：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，１０５６５０１８）とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ，２１１０３－０４９）を１：１で混合し、Ｎ２添加剤（１００×、Ｇｉｂｃｏ，１７５０２０４８）、Ｂ２７添加剤（５０×、Ｇｉｂｃｏ，１７５０４０４４）、２％ウシ血清アルブミン（１０００×、ｓｉｇｍａ、Ａ８０２２）、β－メルカプトエタノール（１０００×、Ｇｉｂｃｏ，２１９８５０２３）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（２００×、Ｇｉｂｃｏ，３５０５０－０６１）、１μｇ／ｍｌインスリン（Ｒｏｃｈｅ，１１３７６４９７００１）、二重抗生を添加）に加え、１０％血清代替物（Ｇｉｂｃｏ，１０８２８－０２８）にＭｙｏｓｉｎ阻害剤（ジメチルスルホキシドで溶解（ｓｉｇｍａ、Ｄ２６５０）した１００ｍＭ濃縮ストック、－２０℃で遮光して１か月間保管した）および１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，１０８２８－０２８）を加え、２１日間培養した後に同定した。実験のフローは図１Ａに示す。
【0069】
脂肪細胞の同定は、オイルレッドＯ染色液（細胞専用、Ｓｏｌａｒｂｉｏ，Ｇ１２６２）を使用した細胞オイルレッド染色により行われ、具体的には、培養液を除去し、ＯＲＯ
Ｆｉｘａｔｉｖｅを加えて１０～１５分間固定した後、固定液を除去して、流動する空気中に１０～１５分間放置した。この時、ＯＲＯ Ｓｔａｉｎ Ａ：ＯＲＯ Ｓｔａｉｎ
Ｂ＝３：２の比率でＯＲＯ Ｓｔａｉｎを配置し、混合した後１０分間静置してからウェルに加え、１５分間染色した後、染色液を除去し、６０％イソプロパノールを加えて２０～３０秒間すすぎ、蒸留水で３回洗浄して光学顕微鏡下で写真を撮った。中性脂肪は橙赤色または赤橙色を呈し、リン脂質はピンク色を呈した。ヒト包皮線維芽細胞を誘導して得られた脂肪細胞のオイルレッドＯ染色は図１Ｂに示す。
Ｆｉｘａｔｉｖｅを加えて１０～１５分間固定した後、固定液を除去して、流動する空気中に１０～１５分間放置した。この時、ＯＲＯ Ｓｔａｉｎ Ａ：ＯＲＯ Ｓｔａｉｎ
Ｂ＝３：２の比率でＯＲＯ Ｓｔａｉｎを配置し、混合した後１０分間静置してからウェルに加え、１５分間染色した後、染色液を除去し、６０％イソプロパノールを加えて２０～３０秒間すすぎ、蒸留水で３回洗浄して光学顕微鏡下で写真を撮った。中性脂肪は橙赤色または赤橙色を呈し、リン脂質はピンク色を呈した。ヒト包皮線維芽細胞を誘導して得られた脂肪細胞のオイルレッドＯ染色は図１Ｂに示す。
【0070】
マウス胚性線維芽細胞から得られた脂肪細胞の形態とオイルレッドＯ染色は図１Ｃに示すように、橙赤色の脂肪滴の形成が見られ、これは、中性脂肪の現れを示している。脂肪滴の面積の割合はほぼ１３％であり、対照群よリ有意に高い（Ｐ＜０．０１）。統計結果は図１Ｄに示される。
【0071】
元の脂肪誘導培養液に１０μＭ Ａ８３－０１（ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０４－００１４）を添加することで、脂肪誘導効率が有意に向上し、２０％と高い（Ｐ＜０．００１）；または、１０μＭ ＳＢ４３１５４２（ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０４－００１０－１０）を添加すると、脂肪誘導効率を有意に向上させることもでき、１８％にも達した（Ｐ＜０．００１）。ＢＭＰの阻害剤を添加すると、脂肪誘導効率は対照レベルに戻った。オイルレッド
Ｏ染色を図１Ｅに示し、脂肪滴面積の統計を図１Ｆに示す。
インビボ実験：同じバッチの６～８週間のＩＣＲメスマウスを選択し、ランダムに二つの群に分け、各群で５匹ずつとした。一つの群に対して、小分子（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅ（０．５ｍｇ／ｋｇ、１０％ＤＭＳＯ＋２％Ｔｗｅｅｎ８０＋生理食塩水に溶解）をマウスの腹側に注入し、もう一つの群に対し、小分子群と同じ量のＤＭＳＯを、実験群と同じ注射方法で注射した。１日１回注射し、１９日間注射した後、薬剤を３２日間停止し、マウスを頸椎脱臼により殺処分して腹側脂肪の含有量を観察した。その結果は図２に示す。小分子処理群は腹側脂肪の含有量を有意に増加することができる。詳細は図２Ａ、図２Ｂに示す。また、（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎの代わりに（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅで処理すると、腹側脂肪の含有量を増加することができる。実験の結果では、最適化していない場合には、腹側脂肪の含有量が約５０％増加したことは示されている。
Ｏ染色を図１Ｅに示し、脂肪滴面積の統計を図１Ｆに示す。
インビボ実験：同じバッチの６～８週間のＩＣＲメスマウスを選択し、ランダムに二つの群に分け、各群で５匹ずつとした。一つの群に対して、小分子（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅ（０．５ｍｇ／ｋｇ、１０％ＤＭＳＯ＋２％Ｔｗｅｅｎ８０＋生理食塩水に溶解）をマウスの腹側に注入し、もう一つの群に対し、小分子群と同じ量のＤＭＳＯを、実験群と同じ注射方法で注射した。１日１回注射し、１９日間注射した後、薬剤を３２日間停止し、マウスを頸椎脱臼により殺処分して腹側脂肪の含有量を観察した。その結果は図２に示す。小分子処理群は腹側脂肪の含有量を有意に増加することができる。詳細は図２Ａ、図２Ｂに示す。また、（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎの代わりに（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅで処理すると、腹側脂肪の含有量を増加することができる。実験の結果では、最適化していない場合には、腹側脂肪の含有量が約５０％増加したことは示されている。
【0072】
（実施例２）
線維芽細胞の不死化細胞への転換
１２ウェルプレートを例にして（ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３５）、各ウェルに１×ＤＭＥＭで調製した２０μｇ／ｍｌマトリゲル溶液（ＢＤ，３５４２７７）を、１２時間コーティングした後、コーティング溶液を除去して１×ＰＢＳフラッシング溶液で一回洗浄した。
線維芽細胞の不死化細胞への転換
１２ウェルプレートを例にして（ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３５）、各ウェルに１×ＤＭＥＭで調製した２０μｇ／ｍｌマトリゲル溶液（ＢＤ，３５４２７７）を、１２時間コーティングした後、コーティング溶液を除去して１×ＰＢＳフラッシング溶液で一回洗浄した。
【0073】
マウス胚性線維芽細胞（Ｃ５７、Ｅ１３．５で調製）または尾先端線維芽細胞（出生後１週間または成体マウスから調製）を、１ウェル当たり２×１０４の細胞で各ウェルに均一に播種し、基礎培養液（高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃ１２４３０５００ＢＴ），二重抗生）＋１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，１６０００－０４４）で２４時間培養した。培養液を除去してＰＢＳで一回洗浄した。
【0074】
上記のように処理された線維芽細胞を不死化誘導培養液：（Ｎ２Ｂ２７培養液：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，１０５６５０１８）とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ，２１１０３－０４９）を１：１で混合し、Ｎ２添加剤（１００×、Ｇｉｂｃｏ，１７５０２０４８）、Ｂ２７添加剤（５０×、Ｇｉｂｃｏ，１７５０４０４４）、２％ウシ血清アルブミン（１０００×、ｓｉｇｍａ、Ａ８０２２）、β－メルカプトエタノール（１０００×、Ｇｉｂｃｏ，２１９８５０２３）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００×、Ｇｉｂｃｏ，３５０５０－０６１）、１μｇ／ｍｌインスリン（Ｒｏｃｈｅ，１１３７６４９７００１）、二重抗生を添加）に加えた。１０％ＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ，１２６１８０１３）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０４－０００４－１０）、１０μＭのＡ８３－０１（ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０４－００１４）、および２５μＭのＭｙｏｓｉｎ阻害剤（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（ＭＣＥ、ＨＹ－１３４４１）または２５μＭの（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅ（ＴＲＣ、Ｂ２０８０７０）を加えた。２１～２８日間培養した後同定した。実験のフローは図３Ａに示す。（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（ＭＣＥ、ＨＹ－１３４４１）または（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅ（ＴＲＣ、Ｂ２０８０７０）を含む不死化誘導培養液を利用して得られた細胞について、下記の実験を通して不死化細胞ＳＭＰＣであるか否かという同定をした。
【0075】
不死化細胞ＳＭＰＣの同定は主に下記のことを含む。
【0076】
幹細胞マーカーの染色。実験方法は次の通りである。まず、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＣＤｙｌＤｙｅをＰＢＳで１：４０に希釈してＣＤｙｌ希釈緩衝液を調製し、次にＣＤｙｌ希釈緩衝液を培養液で１：１００に希釈してＣＤｙｌ染色液を調製した。培養液を除去した
後、ＣＤｙｌ染色液を加え、３７℃ ＣＯ２インキュベーターで１時間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、培養液を加えて３７℃ ＣＯ２インキュベーターで３時間退色した。蛍光顕微鏡下で観察し、その結果を図３Ｂに示す。その中で、Ｍｅｒｇｅは重ねた図を表す。未処理のマウス繊維芽細胞はＣＤｙｌで着色できなかった。ＳＭＰＣと呼ばれる、不死化誘導培養液で処理された細胞は、ＣＤｙｌで着色でき、「幹細胞性」を得たことは示される。
後、ＣＤｙｌ染色液を加え、３７℃ ＣＯ２インキュベーターで１時間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、培養液を加えて３７℃ ＣＯ２インキュベーターで３時間退色した。蛍光顕微鏡下で観察し、その結果を図３Ｂに示す。その中で、Ｍｅｒｇｅは重ねた図を表す。未処理のマウス繊維芽細胞はＣＤｙｌで着色できなかった。ＳＭＰＣと呼ばれる、不死化誘導培養液で処理された細胞は、ＣＤｙｌで着色でき、「幹細胞性」を得たことは示される。
【0077】
細胞成長曲線の作成。実験方法は次の通りである。不死化細胞ＳＭＰＣ（第２世代および第４世代のマウス胚性線維芽細胞を対照として使用）を、ウェル当たり２×１０４細胞で１２ウェルプレートに均一に播種した。２４時間ごとに血球計算盤でカウントし、細胞成長曲線を描き、細胞周期を計算した。結果を図３Ｃと図３Ｄに示す。ＳＭＰＣは、初期の細胞量が同じである場合に、急速に増殖することができ、２４、４８、７２、９６時間で、細胞量は対照よりも有意に増加した（Ｐ＜０．００１）。計算された細胞周期から分かるように、ＳＭＰＣの細胞周期の長さは１６時間であり、第２世代および第４世代のマウス胚性線維芽細胞の細胞周期の長さである３６時間および４５時間と比べて、有意に短縮された（Ｐ＜０．００１）。
【0078】
細胞周期の構成解析。実験方法は次の通りである。不死化細胞（マウス胚性線維芽細胞とマウス胚性幹細胞を対照として使用）を０．２５％トリプシンで消化した後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで終止させて遠心分離し、上澄を捨て、培養液で再懸濁してから４００メッシュのセルストレーナーを通し、ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ高速マルチカラーフローサイトメーターで細胞周期を解析した。結果を図３Ｅと図３Ｆに示す。不死化細胞ＳＭＰＣの均一性は、マウス胚性幹細胞と同様に強化された。また、マウス胚性線維芽細胞より、不死化細胞ＳＭＰＣのＧ０／Ｇ１期が短縮され、Ｓ期がマウス胚性幹細胞と同様に長くなった。
【0079】
（実施例３）
増殖および老化遺伝子の検出
実験方法は次の通りである。不死化細胞ＳＭＰＣ（マウス胚性線維芽細胞を対照として使用）を収集した。（ａ）キット法を用いてＲＮＡを抽出した。細胞ペレットに適量のＴＲＩｚоｌを加えて細胞を溶解し、１／５容量のクロロホルムを加え、ボルテックスして均一に混合した後、氷上に３分間静置し、１００００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上層の水相を新しい遠心チューブに移し、等容量の７５％エタノールを加えて一緒に吸着カラムに移し、１００００ｇで１５秒間遠心分離し、コレクションチューブ内の液体を捨てた。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉで１回洗浄した、１０μＬ ＤＮａｓｅ Ｉ＋７０μＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＲＤＤを吸着膜に添加し、室温で１５分間インキュベーションしてＤＮＡを消化してから、３５０μＬ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉで１回洗浄し、５００μＬ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩで１回洗浄し、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＷａｔｅｒでＲＮＡを溶出した。紫外／可視光分光光度計で濃度を測定した。（ｂ）ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。２μｇのＲＮＡサンプルにランダムプライマー、ｄＮＴＰを加えた後、６５℃で５分間加熱してＲＮＡの高次構造を除去し、そして氷上で３分間クエンチしてＲＮＡテンプレートとランダムプライマーを結合させた。逆転写酵素とＲＮＡ酵素阻害剤を加え、４２℃で１時間逆転写してｃＤＮＡを取得した。（ｃ）増殖および老化関連遺伝子をリアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより検出した。
増殖および老化遺伝子の検出
実験方法は次の通りである。不死化細胞ＳＭＰＣ（マウス胚性線維芽細胞を対照として使用）を収集した。（ａ）キット法を用いてＲＮＡを抽出した。細胞ペレットに適量のＴＲＩｚоｌを加えて細胞を溶解し、１／５容量のクロロホルムを加え、ボルテックスして均一に混合した後、氷上に３分間静置し、１００００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上層の水相を新しい遠心チューブに移し、等容量の７５％エタノールを加えて一緒に吸着カラムに移し、１００００ｇで１５秒間遠心分離し、コレクションチューブ内の液体を捨てた。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉで１回洗浄した、１０μＬ ＤＮａｓｅ Ｉ＋７０μＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＲＤＤを吸着膜に添加し、室温で１５分間インキュベーションしてＤＮＡを消化してから、３５０μＬ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉで１回洗浄し、５００μＬ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩで１回洗浄し、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＷａｔｅｒでＲＮＡを溶出した。紫外／可視光分光光度計で濃度を測定した。（ｂ）ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。２μｇのＲＮＡサンプルにランダムプライマー、ｄＮＴＰを加えた後、６５℃で５分間加熱してＲＮＡの高次構造を除去し、そして氷上で３分間クエンチしてＲＮＡテンプレートとランダムプライマーを結合させた。逆転写酵素とＲＮＡ酵素阻害剤を加え、４２℃で１時間逆転写してｃＤＮＡを取得した。（ｃ）増殖および老化関連遺伝子をリアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより検出した。
【0080】
ＰＣＲ反応システムは次の通りである：７．５μＬ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、２μＬ Ｐｌｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．５μＬプライマー（上流および下流プライマーを混合）、０．５μＬ ｃＤＮＡ、４．５μＬ再蒸留水。ＰＣＲ反応プロセスは次の通りである。増幅曲線：９５℃、２分間、９５℃で１５秒間変性し、６２℃で１５秒間アニーリングし、７２℃で４５秒間延伸し、延伸が完了した後に蛍光シグナルを検出した。融解曲線：９５℃で１分間変性し、５７℃で
３０秒間アニーリングし、９５℃にゆっくりとアニーリングさせて３０秒間維持した。この実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ社ＭＸ３００５Ｐ蛍光リアルタイム定量ＰＣＲ装置上で行われ、Ａｃｔｂを内部参照遺伝子とし、結果はΔΔＣｔ法で処理された。結果を図１Ｇと図１Ｈに示す。不死化細胞ＳＭＰＣ増殖の関連遺伝子：Ｓｏｘ２、Ｓｒｒｔ、Ｙａｐ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｍｋｉ６７、Ｐｃｎａの発現量は、マウス胚性線維芽細胞の発現量より高かったが、老化関連遺伝子：Ｐ１９、Ｐ１６ｉｎｋ４ａ、Ｐ１５ｉｎｋ４ｂ、Ｍｏｒｆ４ｌ１、Ｅｌｆ５は、マウス胚性線維芽細胞の発現量より低かった。
Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、２μＬ Ｐｌｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．５μＬプライマー（上流および下流プライマーを混合）、０．５μＬ ｃＤＮＡ、４．５μＬ再蒸留水。ＰＣＲ反応プロセスは次の通りである。増幅曲線：９５℃、２分間、９５℃で１５秒間変性し、６２℃で１５秒間アニーリングし、７２℃で４５秒間延伸し、延伸が完了した後に蛍光シグナルを検出した。融解曲線：９５℃で１分間変性し、５７℃で
３０秒間アニーリングし、９５℃にゆっくりとアニーリングさせて３０秒間維持した。この実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ社ＭＸ３００５Ｐ蛍光リアルタイム定量ＰＣＲ装置上で行われ、Ａｃｔｂを内部参照遺伝子とし、結果はΔΔＣｔ法で処理された。結果を図１Ｇと図１Ｈに示す。不死化細胞ＳＭＰＣ増殖の関連遺伝子：Ｓｏｘ２、Ｓｒｒｔ、Ｙａｐ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｍｋｉ６７、Ｐｃｎａの発現量は、マウス胚性線維芽細胞の発現量より高かったが、老化関連遺伝子：Ｐ１９、Ｐ１６ｉｎｋ４ａ、Ｐ１５ｉｎｋ４ｂ、Ｍｏｒｆ４ｌ１、Ｅｌｆ５は、マウス胚性線維芽細胞の発現量より低かった。
【0081】
（実施例４）
成体マウス初代肝細胞の分離とインビトロでの増殖
Ａｌｂ－ＣｒｅマウスはＢＲＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥから導入され、Ｃｒｅリコンビナーゼは、アルブミンを発現する成熟肝細胞でのみ発現された。Ｒｏｓａ２６／ｍＴｍＧマウスはＣｈａｒｌｅｓ ｒｉｖｅｒから導入され、Ｒｏｓａ２６部位で赤緑蛍光レポーターシステムが組み込まれたマウスであり、通常の状況下では、細胞はＴｏｍａｔｏ赤色蛍光タンパク質を発現し、ｃｒｅ組換えのある場合には、緑色ＧＰＦ蛍光を発現する。Ａｌｂ－Ｃｒｅ成体マウスとＲｏｓａ２６／ｍＴｍＧマウスを交配して生まれたＡｌｂ－Ｃｒｅ×Ｒｏｓａ２６／ｍＴｍＧマウスの成熟肝細胞を緑色にマークし、他の組織細胞は赤色を発現した。
成体マウス初代肝細胞の分離とインビトロでの増殖
Ａｌｂ－ＣｒｅマウスはＢＲＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥから導入され、Ｃｒｅリコンビナーゼは、アルブミンを発現する成熟肝細胞でのみ発現された。Ｒｏｓａ２６／ｍＴｍＧマウスはＣｈａｒｌｅｓ ｒｉｖｅｒから導入され、Ｒｏｓａ２６部位で赤緑蛍光レポーターシステムが組み込まれたマウスであり、通常の状況下では、細胞はＴｏｍａｔｏ赤色蛍光タンパク質を発現し、ｃｒｅ組換えのある場合には、緑色ＧＰＦ蛍光を発現する。Ａｌｂ－Ｃｒｅ成体マウスとＲｏｓａ２６／ｍＴｍＧマウスを交配して生まれたＡｌｂ－Ｃｒｅ×Ｒｏｓａ２６／ｍＴｍＧマウスの成熟肝細胞を緑色にマークし、他の組織細胞は赤色を発現した。
【0082】
Ａｌｂ－Ｃｒｅ×Ｒｏｓａ２６／ｍＴｍＧ成体マウスを頸椎脱臼で殺処分し、肝小葉を取り出して小さい塊に切り、１００倍容量の予冷ＰＢＳで繰り返しピペッティングして洗浄し、洗浄液が赤くならないように血球を除去し、３～５倍容量のコラゲナーゼＩＶ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１７１０４０１９，３７℃に予熱）を加えて３７℃のインキュベーターで３０～４０分間消化し、その間に２～３回ピペッティングし、遠心分離して上澄を除去した。３～５倍容量のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ，２５３０００６２）を加えて３７℃のインキュベーターで２０分間消化し、停止するために２倍容量の１０％血清を加え、遠心分離して上澄を取った。細胞をマウス肝細胞培養液（５μｍоｌのＭｙｏｓｉｎＩＩ阻害剤（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを添加）で再懸濁し、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎを塗布したペトリ皿に播種し、１週間後にＡｌｂを発現した緑色の肝細胞クラスターを観察した。結果を図４Ａに示す。マウス肝細胞培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，１０５６５０１８）、Ｎ２添加剤（１００×、Ｇｉｂｃｏ，１７５０２０４８）、Ｂ２７添加剤（５０×、Ｇｉｂｃｏ，１７５０４０４４）、５％ウシ血清アルブミン（１０００×、ｓｉｇｍａ、Ａ８０２２）、β－メルカプトエタノール（１０００×、Ｇｉｂｃｏ，２１９８５０２３）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（２００×、Ｇｉｂｃｏ，３５０５０－０６１）、非必須アミノ酸（１００×、Ｇｉｂｃｏ，１１１４０－０５０）、１μｇ／ｍＬインスリン（Ｒｏｃｈｅ，１１３７６４９７００１）、肝細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ、２９４－ＨＧ－０２５）、形質転換成長因子ｂｅｔａ阻害剤Ａ８３－０１（５μＭ、ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００１４）、グリコーゲン合成キナーゼ３ｂｅｔａ阻害剤Ｃｈｉｒ９９０２１（６μＭ、ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００４－１０）、マクロファージ刺激タンパク質１および２阻害剤ＸＭＵ－ＭＰ－１（２～５μＭ、ＭＣＥ、ＨＹ－１００５２６）肝細胞成長因子４（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ、５８４６－ｆ４－０２５）二重抗生）を含む。
【0083】
ＭｙｏｓｉｎＩＩ阻害剤（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅを添加せずに、対照として等容量のＤＭＳＯを添加し、それぞれ３回（Ｐ３）、５回（Ｐ５）、７回（Ｐ７）継代培養した。その結果、図４Ｂに示すように、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを加えると、ＡｌＢ－ＧＦＰ陽性肝細胞の長期的増殖を有意に促進できる（インビトロで少なくとも２０世代継代）ことが示された。また、（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ誘導体（Ｓ）－（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ Ｏ－Ｂｅｎｚｏａｔｅも、肝細胞の継代増
殖に対して類似した効果を持っており、処理された肝細胞がインビトロで２０世代以上継代できることは示された。
殖に対して類似した効果を持っており、処理された肝細胞がインビトロで２０世代以上継代できることは示された。
【0084】
（実施例５）
インビトロでのヒト胚性肝細胞の増殖
１、実験手順
（１）プレートのコーティング マウス尾コラーゲン（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１０４８３０１、３ｍｇ／ｍＬ）でコーティングされた培養プレートの濃度は５μｇ／ｃｍ２であり、２４ウェルプレートを例にすると、各ウェルの底面積は１．９ｃｍ２であるので、各ウェルに９．５μｇ（約３．２μｌ）が必要である。３．２μｌのマウス尾コラーゲンを取り、５００μｌの２０ｍＭ氷酢酸に溶解し、ウェルに加え、３７℃の細胞インキュベーターで１時間インキュベーションし、吸い取って廃棄した後、ＰＢＳで３回洗浄した。
インビトロでのヒト胚性肝細胞の増殖
１、実験手順
（１）プレートのコーティング マウス尾コラーゲン（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１０４８３０１、３ｍｇ／ｍＬ）でコーティングされた培養プレートの濃度は５μｇ／ｃｍ２であり、２４ウェルプレートを例にすると、各ウェルの底面積は１．９ｃｍ２であるので、各ウェルに９．５μｇ（約３．２μｌ）が必要である。３．２μｌのマウス尾コラーゲンを取り、５００μｌの２０ｍＭ氷酢酸に溶解し、ウェルに加え、３７℃の細胞インキュベーターで１時間インキュベーションし、吸い取って廃棄した後、ＰＢＳで３回洗浄した。
【0085】
（２）ヒト胚性肝細胞の回復 液体窒素タンクからヒト胚性肝細胞（凍結保存の日付けは２０１４年１月１５日、凍結保存溶液はｃｅｌｌ ｂａｎｋｅｒ２、凍結保存細胞数は２×１０７／チューブ）を取り出してすぐに３７℃の水浴ナベに入れ、溶解した後すぐに５ｍＬ肝細胞培地（対照群）が入った１５ｍＬの遠心チューブに吸い取り、５０ｇ、４℃、５分間遠心分離した。上澄を捨て、５００μｌ肝細胞培地で再懸濁してカウントすると１．１６×１０６となり、細胞回復率は５．８％であった。
【0086】
（３）ヒト胚性肝細胞の播種 播種密度は、１×１０５／２４ウェルプレートのウェルに、それぞれ５００μｌ肝細胞培地（対照群）を加えた。肝細胞培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，１０５６５０１８）、Ｎ２添加剤（１００×、Ｇｉｂｃｏ，１７５０２０４８）、Ｂ２７添加剤（５０×、Ｇｉｂｃｏ，１７５０４０４４）、５％ウシ血清アルブミン（１０００×、ｓｉｇｍａ、Ａ８０２２）、β－メルカプトエタノール（１０００×、Ｇｉｂｃｏ，２１９８５０２３）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（２００×、Ｇｉｂｃｏ，３５０５０－０６１）、非必須アミノ酸（１００×、Ｇｉｂｃｏ，１１１４０－０５０）、１μｇ／ｍＬインスリン（Ｒｏｃｈｅ，１１３７６４９７００１）、肝細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ、２９４－ＨＧ－０２５）、形質転換成長因子ｂｅｔａ阻害剤Ａ８３－０１（５μＭ、ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００１４）、グリコーゲン合成キナーゼ３ｂｅｔａ阻害剤Ｃｈｉｒ９９０２１（６μＭ、ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００４－１０）、マクロファージ刺激タンパク質１および２阻害剤ＸＭＵ－ＭＰ－１（２～５μＭ、ＭＣＥ、ＨＹ－１００５２６）肝細胞成長因子４（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ、５８４６－ｆ４－０２５）二重抗生）を含む。１０μＭ小分子（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを含む肝細胞培地および２０μＭ小分子（－）－Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを含む肝細胞培地で播種してから２４時間後、各群から３つのウェルで消化した細胞を取りカウントし、壁への付着率を計算した。播種から７２時間後、各群で３つのウェルの細胞を消化してカウントした。７２時間の細胞数を２４時間の細胞数で割ると、細胞数の変化倍数を得ることができる。各ウェルから一部の細胞（細胞数の２／５）を取って、ＲＮＡの抽出とヒト肝細胞関連遺伝子の発現の検出に使用した。
【0087】
（４）ヒト胚性肝細胞の初代継代 ７２時間初代培養中の細胞数の３／５の播種密度で、細胞をそれぞれマウス尾コラーゲンでコーティングした２４ウェルプレートに播種した（上述のように）。各群で３つのウェルであった。細胞培養の７２時間後に消化してカウントした。この細胞数と播種時の細胞数との比は、初代継代の増殖倍数となる。各ウェルから一部の細胞（細胞数の２／５）をＲＮＡの抽出及びヒト肝細胞関連遺伝子の発現の検出に使用した。
【0088】
（５）ヒト胚性肝細胞の二世代の継代 ７２時間初代継代培養中の細胞数の３／５の
播種密度で、細胞をそれぞれマウス尾コラーゲンでコーティングした２４ウェルプレートに播種した（上述のように）。対照群の初代継代培養の７２時間後にほとんどの細胞が死亡し、少数の細胞しか残っていなかったため、これらの細胞はすべて播種された。２日ごとに培養液を交換し、１４４時間（６日）培養を続けた後、細胞を消化してカウントし、この時の細胞数と播種時の細胞数との比は、二世代の継代の増殖倍数となる。各ウェルの細胞培養上澄を取ってヒトアルブミンの濃度を検出し、一部の細胞（細胞数の２／５）をＲＮＡの抽出及びヒト肝細胞関連遺伝子の発現の検出に使用した。
播種密度で、細胞をそれぞれマウス尾コラーゲンでコーティングした２４ウェルプレートに播種した（上述のように）。対照群の初代継代培養の７２時間後にほとんどの細胞が死亡し、少数の細胞しか残っていなかったため、これらの細胞はすべて播種された。２日ごとに培養液を交換し、１４４時間（６日）培養を続けた後、細胞を消化してカウントし、この時の細胞数と播種時の細胞数との比は、二世代の継代の増殖倍数となる。各ウェルの細胞培養上澄を取ってヒトアルブミンの濃度を検出し、一部の細胞（細胞数の２／５）をＲＮＡの抽出及びヒト肝細胞関連遺伝子の発現の検出に使用した。
【0089】
２、結果
ヒト胚性肝細胞を液体窒素で３年半凍結保存した後の回復率は約５．８％であった。図５Ａと図５Ｂに示すように、小分子培地で１２日間継代（合計３世代）培養した後、１０μＭの小分子培地は約２２．１倍（ＳＤ＝４．２）で増幅させることができ、２０μＭの小分子培地は約１３．０倍（ＳＤ＝３．３９）で増幅させることができた。この時、細胞形態は依然として典型的な肝細胞形態であり、不規則な多角形を呈した。しかし、対照群の培地で継代培養した後、初代継代培養後にほとんどの細胞が死亡したため、残った小部分の細胞は培養されて１２日に増幅倍数が５８．３倍になった（ＳＤ＝１３．９）が、この時の細胞は、細長い扁平な典型的な肝細胞形態を呈した。図５Ｃに示すようにヒト肝細胞特異的遺伝子であるアルブミン（ＡＬＢＵＭＩＮ）とアルファフェトプロテイン（Ａｌｐｈａ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）をリアルタイムＰＣＲで検出した。その結果、ヒト肝細胞は１０μＭと２０μＭ小分子培地で１２日間継代培養した後、依然としてヒト肝細胞特異的遺伝子を発現し、これに対して、対照群の培地で１２日間継代して得られた細胞から、非常に低いアルブミン発現が検出され、アルファフェトプロテイン遺伝子の発現が検出できず、この時の細胞がもはや肝細胞ではないことは示されている。これは、図５Ａと図５Ｃの結果と一致している。
ヒト胚性肝細胞を液体窒素で３年半凍結保存した後の回復率は約５．８％であった。図５Ａと図５Ｂに示すように、小分子培地で１２日間継代（合計３世代）培養した後、１０μＭの小分子培地は約２２．１倍（ＳＤ＝４．２）で増幅させることができ、２０μＭの小分子培地は約１３．０倍（ＳＤ＝３．３９）で増幅させることができた。この時、細胞形態は依然として典型的な肝細胞形態であり、不規則な多角形を呈した。しかし、対照群の培地で継代培養した後、初代継代培養後にほとんどの細胞が死亡したため、残った小部分の細胞は培養されて１２日に増幅倍数が５８．３倍になった（ＳＤ＝１３．９）が、この時の細胞は、細長い扁平な典型的な肝細胞形態を呈した。図５Ｃに示すようにヒト肝細胞特異的遺伝子であるアルブミン（ＡＬＢＵＭＩＮ）とアルファフェトプロテイン（Ａｌｐｈａ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）をリアルタイムＰＣＲで検出した。その結果、ヒト肝細胞は１０μＭと２０μＭ小分子培地で１２日間継代培養した後、依然としてヒト肝細胞特異的遺伝子を発現し、これに対して、対照群の培地で１２日間継代して得られた細胞から、非常に低いアルブミン発現が検出され、アルファフェトプロテイン遺伝子の発現が検出できず、この時の細胞がもはや肝細胞ではないことは示されている。これは、図５Ａと図５Ｃの結果と一致している。
【0090】
（実施例６）
ヒト成体肝細胞の小分子増幅
１、実験手順
（１）プレートのコーティング方法は上記の通りである。
ヒト成体肝細胞の小分子増幅
１、実験手順
（１）プレートのコーティング方法は上記の通りである。
【0091】
（２）成人肝細胞の回復と培養 液体窒素タンクから成人肝細胞（Ｍ００９９５－Ｐ
Ｍａｌｅ ｈｕｍａｎ、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）を取り出してすぐに３７℃の水浴ナベに入れ、溶解した後すぐに３７℃に予熱した５ｍＬ肝細胞播種培地（ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ Ｍｅｄｉｕｍ）に加え、カウントした後、９×１０４／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、肝細胞が壁に２～４時間付着した後、肝細胞播種培地を吸引して捨て、それぞれ肝臓細胞培養対照培地、１０μｍ小分子培地、および２０μｍ小分子培地を加えた。２日ごとに培養液を交換した。２日目に写真から細胞数を推算した。４日後に２０μｍ小分子培地群を１０μｍ小分子培地に変更して培養した。共培養の６日目に細胞をカウントした。一部の細胞を取り、ＲＮＡの抽出及びヒト肝細胞特異的遺伝子の発現の検出に使用した。
Ｍａｌｅ ｈｕｍａｎ、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）を取り出してすぐに３７℃の水浴ナベに入れ、溶解した後すぐに３７℃に予熱した５ｍＬ肝細胞播種培地（ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ Ｍｅｄｉｕｍ）に加え、カウントした後、９×１０４／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、肝細胞が壁に２～４時間付着した後、肝細胞播種培地を吸引して捨て、それぞれ肝臓細胞培養対照培地、１０μｍ小分子培地、および２０μｍ小分子培地を加えた。２日ごとに培養液を交換した。２日目に写真から細胞数を推算した。４日後に２０μｍ小分子培地群を１０μｍ小分子培地に変更して培養した。共培養の６日目に細胞をカウントした。一部の細胞を取り、ＲＮＡの抽出及びヒト肝細胞特異的遺伝子の発現の検出に使用した。
【0092】
（３）成人肝細胞の継代 上記対照群で培養した肝細胞４．７×１０４および１０μｍ小分子培地で培養した肝細胞８×１０４をそれぞれマウス尾コラーゲンでコーティングした２４ウェルプレートに再播種し、２日ごとに培養液を交換して６日間培養し、写真を撮って細胞成長状況を記録した。
【0093】
（４）１０μｍ小分子培地で増幅された成人肝細胞のＣＹＰ１Ａ２誘導 ３×１０５肝細胞をマウス尾コラーゲンでコーティングした２４ウェルプレートに播種し、１０μｍ小分子培地で２４時間培養した後、５０μｍオメプラゾール（Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）を含む１０μｍ小分子培地に置き換え、対照群はＤＭＳＯを含む１０μｍ小分子培地であり
、４８時間後に細胞を収集してＣＹＰ１Ａ２遺伝子の発現を検出した。
、４８時間後に細胞を収集してＣＹＰ１Ａ２遺伝子の発現を検出した。
【0094】
２、結果
成人肝細胞の播種後５時間の壁への付着率はほぼ同じであり、２日後には、対照群、１０μｍ小分子群、および２０μｍ小分子群の細胞はいずれも大量に死亡した。写真を撮って細胞の壁への付着率を推算した（２．５３×１０４、ＳＤ＝０．０９）。４日目に、小分子群の細胞には増幅クローンが現れたが、対照群には有意な増幅はなかった。この時、２０μｍ培地群は１０μｍ小分子培地に変更された（ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃と命名され、すなわち、２０μｍで４日間培養し、１０μｍで２日間培養した）。引き続き２日間培養した後、小分子群の細胞クローンはさらに増幅したが、対照群には明らかな変化はなかった（図６Ａ）。６日間培養した後、細胞数はそれぞれ、対照群では１．５９×１０４（ＳＤ＝０．２８）、１０μｍ群では６．４７×１０４（ＳＤ＝１．２４）、＃群では９．４７×１０４（ＳＤ＝０．９８）であった（図６Ｂ）。６日目の細胞数と２日目の細胞数との比は、細胞増幅倍数となる。その結果、小分子が成人肝細胞に対して有意な増幅効果を有することは示された（図６Ａと図６Ｂ）。小分子群の増殖細胞核抗原遺伝子（ＰＣＮＡ）の発現は、対照群より有意に高く、小分子が細胞増殖に影響を与えることはさらに証明された（図６Ｃ）。小分子によって増幅された成人肝細胞は、依然としてヒト肝細胞特異的遺伝子であるアルブミン（ＡＬＢＵＭＩＮ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４を発現した（図６Ｄ）。１０μｍ小分子培地はヒト肝細胞を継代培養できたが、対照群培地は成人肝細胞を継代培養できなかった（図６Ｅ）。継代培養された成人肝細胞をオメプラゾールによって誘導した後、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の発現を増加させることができる。これは、小分子によって増幅された肝細胞が依然として機能を有することを示唆している（図６Ｆ）。
成人肝細胞の播種後５時間の壁への付着率はほぼ同じであり、２日後には、対照群、１０μｍ小分子群、および２０μｍ小分子群の細胞はいずれも大量に死亡した。写真を撮って細胞の壁への付着率を推算した（２．５３×１０４、ＳＤ＝０．０９）。４日目に、小分子群の細胞には増幅クローンが現れたが、対照群には有意な増幅はなかった。この時、２０μｍ培地群は１０μｍ小分子培地に変更された（ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃と命名され、すなわち、２０μｍで４日間培養し、１０μｍで２日間培養した）。引き続き２日間培養した後、小分子群の細胞クローンはさらに増幅したが、対照群には明らかな変化はなかった（図６Ａ）。６日間培養した後、細胞数はそれぞれ、対照群では１．５９×１０４（ＳＤ＝０．２８）、１０μｍ群では６．４７×１０４（ＳＤ＝１．２４）、＃群では９．４７×１０４（ＳＤ＝０．９８）であった（図６Ｂ）。６日目の細胞数と２日目の細胞数との比は、細胞増幅倍数となる。その結果、小分子が成人肝細胞に対して有意な増幅効果を有することは示された（図６Ａと図６Ｂ）。小分子群の増殖細胞核抗原遺伝子（ＰＣＮＡ）の発現は、対照群より有意に高く、小分子が細胞増殖に影響を与えることはさらに証明された（図６Ｃ）。小分子によって増幅された成人肝細胞は、依然としてヒト肝細胞特異的遺伝子であるアルブミン（ＡＬＢＵＭＩＮ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４を発現した（図６Ｄ）。１０μｍ小分子培地はヒト肝細胞を継代培養できたが、対照群培地は成人肝細胞を継代培養できなかった（図６Ｅ）。継代培養された成人肝細胞をオメプラゾールによって誘導した後、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の発現を増加させることができる。これは、小分子によって増幅された肝細胞が依然として機能を有することを示唆している（図６Ｆ）。
【0095】
以上は本発明の原理のみを示したにすぎず、本発明の範囲は本明細書に記載の例示的な態様に限定されるものではなく、現在知られているおよび将来開発される同等物をすべて含むべきである。なお、本発明の技術的原理から逸脱することなく、いくつかの改善および変更を行うことができ、これらの改善および変更も本発明の範囲と見なされるべきである。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4A】
【図4B-1】
【図4B-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】