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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-21
(45)【発行日】2024-01-04
(54)【発明の名称】クローディン１８Ａ２に対する抗体及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231222BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20231222BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20231222BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231222BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231222BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231222BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231222BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231222BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231222BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231222BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231222BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20231222BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20231222BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231222BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231222BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231222BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231222BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20231222BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20231222BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20231222BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231222BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231222BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231222BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20231222BHJP
A61K 31/282 20060101ALI20231222BHJP
A61K 31/513 20060101ALI20231222BHJP
A61K 31/69 20060101ALI20231222BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20231222BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/18 ZNA
C12P21/08
C07K16/46
C12N15/62 Z
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12N15/12
C07K19/00
C07K14/725
C12N5/09
A61P43/00 121
A61P35/00
A61P35/02
A61K45/00
A61K38/19
A61K38/22
A61K38/20
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K47/68
A61K48/00
A61K31/704
A61K31/282
A61K31/513
A61K31/69
G01N33/574 A
【請求項の数】
30
(21)【出願番号】P 2021568260
(86)(22)【出願日】2020-05-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-25
(86)【国際出願番号】 CN2020090427
(87)【国際公開番号】W WO2020228806
(87)【国際公開日】2020-11-19
【審査請求日】2022-01-14
(31)【優先権主張番号】201910406762.4
(32)【優先日】2019-05-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】519385168
【氏名又は名称】斉魯制薬有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲楊▼ ▲瑩▼▲瑩▼
(72)【発明者】
【氏名】李 高
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲亞▼▲寧▼
(72)【発明者】
【氏名】安 振明
(72)【発明者】
【氏名】▲趙▼ ▲樹▼雍
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 玉雪
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 世▲聰▼
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 美娟
(72)【発明者】
【氏名】姜 ▲錦▼▲錦▼
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１６６１２２（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ０７Ｋ １６／１８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号１１１、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号１１２、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号１１３、配列番号９３及び配列番号１０７から選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
（１）配列番号２７及び２８、（２）配列番号２７及び１１４、
（３）配列番号２７及び１１５、
（４）配列番号２７及び１１６、
（５）配列番号１２０及び１２１、
（６）配列番号１２０及び１２３、
（７）配列番号１２０及び１２４、
（８）配列番号１２２及び１２１のいずれか１群の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、又はモノクローナル抗体である、又は
重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに含む、又は
全長抗体である、又は
前記抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の形態である、又は
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、線形抗体、単一ドメイン抗体である
請求項１又は２に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記重鎖固定領域は、Ｆｃ又はＦｃ変異体を含み、前記Ｆｃは、マウス又はヒト由来である、請求項３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を捕捉マーカー又は検出マーカーとカップリングして形成され、前記検出マーカーは、放射性核種、発光物質、有色物質又は酵素を含む、コンジュゲート。
【請求項6】
１つの抗原結合ドメインが、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性抗体。
【請求項7】
１つの抗原結合ドメインが、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を含む、多重特異性抗体。
【請求項8】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を含み、抗体－リンカー－毒素により互いに連結して形成される、抗体薬物複合体。
【請求項9】
細胞外認識ユニットが請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項10】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片をコードする、核酸。
【請求項11】
請求項１０に記載の核酸を含む、組換えベクター。
【請求項12】
請求項１１に記載の組換えベクターを含むか、又は、ゲノムに請求項１０に記載の核酸が組み込まれた、宿主細胞。
【請求項13】
原核細胞又は真核細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項14】
前記原核細胞は、大腸菌であり、前記真核細胞は、酵母若しくは哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項15】
適切な条件下で請求項１２～１４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、前記細胞から発現産物を精製することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を調製する方法。
【請求項16】
ＣＬＤＮ１８．２を発現させる腫瘍細胞を特異的に標的とする治療において使用される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項17】
ＣＬＤＮ１８．２を発現させる腫瘍の診断において使用される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＣＬＤＮ１８．２を発現させる腫瘍は、胃癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌及び胆嚢癌及びそれらの転移を含み、前記胃癌の移転は、クルーケンベルグ腫瘍である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項18】
試料中のＣＬＤＮ１８．２の発現を検出する方法であって、（１）試料を請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（２）抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片とＣＬＤＮ１８．２との複合体の形成を検出することとを含む、方法。
【請求項19】
前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片は、検出可能に標識される、請求項１８に記載の試料中のＣＬＤＮ１８．２の発現を検出する方法。
【請求項20】
有効量の請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片、又は有効量の請求項６に記載の二重特異性抗体、又は有効量の請求項７に記載の多重特異性抗体、又は有効量の請求項８に記載の抗体薬物複合体、又は有効量の請求項９に記載のキメラ抗原受容体、又は有効量の請求項１０に記載の核酸、又は有効量の請求項１１に記載の組換えベクター、又は有効量の請求項１２～１４のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、医薬組成物。
【請求項21】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項22】
１種以上の他の追加の治療薬をさらに含む、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。
【請求項23】
前記１種以上の他の追加の治療薬は、化学治療薬、細胞毒性剤、放射性治療薬、癌ワクチン、腫瘍減量剤、標的抗癌剤、抗血管新生剤、生物学的応答修飾剤、サイトカイン、ホルモン、抗転移剤、免疫治療薬、腫瘍溶解性ウイルス及びプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項24】
ＣＬＤＮ１８．２を発現させる細胞の死を誘導する方法に使用される、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記細胞を前記医薬組成物と接触させることを含み、前記ＣＬＤＮ１８．２を発現させる細胞が癌細胞である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項25】
前記細胞は、固形腫瘍細胞であり、胃癌細胞、食道癌細胞、膵臓癌細胞、ウィルムス腫瘍細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肝癌細胞、頭頸部癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞及び胆嚢癌細胞から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項26】
被験体においてＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患を治療する方法に使用される、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物であって、その必要のある被験体に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。
【請求項27】
前記疾患は、腫瘍である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項28】
前記腫瘍は、胃癌、食道癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍、肺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、頭頸部癌、慢性骨髄性白血病又は胆嚢癌である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項29】
前記被験体に追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項30】
前記追加の治療薬は、化学治療薬、細胞毒性剤、放射性治療薬、癌ワクチン、腫瘍減量剤、標的抗癌剤、抗血管新生剤、生物学的応答修飾剤、サイトカイン、ホルモン、抗転移剤、免疫治療薬、腫瘍溶解性ウイルス及びプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫学の分野に属し、より具体的には、クローディン１８．２（Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ＣＬＤＮ１８Ａ２、ＣＬＤＮ１８．２）に対する抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む誘導体、医薬組成物及びその癌治療における関連応用に関する。
【背景技術】
【0002】
クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）は、密着結合の主要な構造タンパク質を含む内在性膜タンパク質であり、密着結合は例えば上皮細胞又は内皮細胞層において見出されるような、分極細胞タイプにおける最も頂端の細胞－細胞接着結合である。密着結合は、細胞周辺に連続的なシールを形成する網状タンパク質の鎖からなり、傍細胞空間における溶質及び水の輸送に対して物理的障壁となるが、この物理的障壁は調節可能である。ヒトにおけるクローディンファミリーは、２２～３４ｋＤａの範囲にわたるサイズの、少なくとも２３メンバーからなる。クローディンは正常組織の機能及び安定にとって重要であるが、腫瘍細胞は密着結合機能の異常を示すことが多い。このことは、腫瘍細胞の脱分化によるクローディンの発現の調節異常及び／又は局在化、又は迅速に成長する癌性組織が、異常な血管形成が見られる腫瘍塊内において栄養を効率的に吸収する必要性と関連する可能性がある（Ｍｏｒｉｎ、２００５年、ＰＭＩＤ：１６２６６９７５）。個々のクローディンファミリーメンバーは、ある特定のタイプの癌では上方制御され得るが、別のタイプの癌では下方制御され得る。
【0003】
クローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ １８、ＣＬＤＮ１８）は、上皮と内皮の密着結合内に位置する内在性膜タンパク質であり、分子量が約２７．９ＫＤであり、他のクローディンとともに細胞間の密着結合を形成し、組織分子とイオンを調節して細胞間隙を透過し、組織ホメオスタシスを維持する。クローディン１８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ０１６３６９のスプライス変異体１（ＣＬＤＮ１８Ａ１、ＣＬＤＮ１８．１）、及びＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６のスプライス変異体２（ＣＬＤＮ１８Ａ２、ＣＬＤＮ１８．２）の２つのサブタイプがあることが知られている。正常細胞において、ＣＬＤＮ１８Ａ１は、肺の上皮で選択的に発現し、ＣＬＤＮ１８Ａ２は、正常な胃上皮の分化細胞で特異的に発現し、細胞分裂活性を有する胃上皮幹細胞で発現しない。しかし、腫瘍細胞においては、ＣＬＤＮ１８Ａ２は様々なタイプの癌でいずれも過剰発現し、例えば胃癌患者の７５％、膵臓癌患者の５０％、食道癌患者の３０％で高度に発現し、肺癌などの癌でも高度に発現する。したがって、ＣＬＤＮ１８Ａ２に特異的に結合するがＣＬＤＮ１８Ａ１に結合しない抗体を見つけることは、癌の治療及び検出に対して重要な意味を有する。
【0004】
従来のＣＬＤＮ１８Ａ２抗体であるＩＭＡＢ３６２は、既に臨床研究段階に入っている。臨床結果によれば、ＣＬＤＮ１８．２が高度に発現した胃癌患者（７０％以上の腫瘍細胞内のＣＬＤＮ１８．２の発現≧２＋）について、化学療法＋ＩＭＡＢ３６２は、単純な化学療法に比べて、無増悪生存期間を６．１ヶ月から９．１ヶ月まで延長し、ＨＲ＝０．４６であり、全生存期間を９．３ヶ月から１６．６ヶ月まで延長し、ＨＲ＝０．４４であった。抗体ＩＭＡＢ３６２のほか、ＣＬＤＮ１８．２を標的部位として調製されたＣＡＲ－Ｔも臨床研究に入っている。しかしながら、これらの臨床段階に入った抗体（又はＣＡＲ－Ｔにおける抗原結合断片）は、クローディン１８．２との親和性が弱い。したがって、同じ投与量でより高い薬効作用を得るために、親和性の高いＣＬＤＮ１８．２抗体をスクリーニングして調製する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を提供する。前記抗体又はその抗原結合断片は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１に顕著に結合しない。
【課題を解決するための手段】
【0006】
いくつかの実施形態において、前記ＣＬＤＮ１８．２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１００２０２６のペプチド（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００１００２０２６）である。前記ＣＬＤＮ１８．１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５７４５３のペプチド（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿０１６３６９）である。
【0007】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＣＬＤＮ１８．１との顕著な結合を示さない。いくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＣＬＤＮ１８．１との結合レベルが、ＣＬＤＮ１８．２との結合レベルの２０％以下である。例えば、結合レベルは、前記抗体又は抗原結合断片とＣＬＤＮ１８．２との結合レベルの２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は１％未満であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＣＬＤＮ１８．２との結合レベルが、ＣＬＤＮ１８．１との結合レベルの１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍又は１０倍より高い。
【0008】
本発明は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合できる抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５から選択される配列で示される３つのＨＣＤＲを含む重鎖可変領域、及び／又は、配列番号８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３から選択される配列で示される３つのＬＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0009】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３７、４０、４３、４５、４９、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３で示されるＨＣＤＲ１と、配列番号３８、４１、４６、４８、５０、５２、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４で示されるＨＣＤＲ２と、配列番号３９、４２、４４、４７、５１、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５で示されるＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、及び／又は、配列番号８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１１１、１１２、１１３で示されるＬＣＤＲ１と、配列番号９３、９４、９５、９６で示されるＬＣＤＲ２と、配列番号９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０で示されるＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0010】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、
配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９、又は、
配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２、又は、
配列番号４３、配列番号４１及び配列番号４４、又は、
配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７、又は、
配列番号３７、配列番号４８及び配列番号３９、又は、
配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１、又は、
配列番号４９、配列番号５２及び配列番号５１、又は、
配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５、又は、
配列番号５６、配列番号５７及び配列番号５８、又は、
配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１、又は、
配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６４、又は、
配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７、又は、
配列番号６８、配列番号６９及び配列番号７０、又は、
配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３、又は、
配列番号７４、配列番号７５及び配列番号７６、又は、
配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９、又は、
配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８２、又は、
配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は
配列番号８６、配列番号９３及び配列番号９７、又は、
配列番号８７、配列番号９４及び配列番号９８、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号９９、又は、
配列番号８７、配列番号９５及び配列番号１００、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号９７、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１０１、又は、
配列番号８９、配列番号９３及び配列番号１０２、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１００、又は、
配列番号９０、配列番号９３及び配列番号１０３、又は、
配列番号９１、配列番号９６及び配列番号１０４、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号９８、又は、
配列番号９２、配列番号９３及び配列番号１０５、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１０６、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号８７、配列番号９３及び配列番号１０８、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１０９、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１１０、又は、
配列番号１１１、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号１１２、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号１１３、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号１１１、配列番号９３及び配列番号１１０、又は、
配列番号１１２、配列番号９３及び配列番号１１０、又は、
配列番号１１３、配列番号９３及び配列番号１１０から選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９、又は、
配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２、又は、
配列番号４３、配列番号４１及び配列番号４４、又は、
配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７、又は、
配列番号３７、配列番号４８及び配列番号３９、又は、
配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１、又は、
配列番号４９、配列番号５２及び配列番号５１、又は、
配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５、又は、
配列番号５６、配列番号５７及び配列番号５８、又は、
配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１、又は、
配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６４、又は、
配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７、又は、
配列番号６８、配列番号６９及び配列番号７０、又は、
配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３、又は、
配列番号７４、配列番号７５及び配列番号７６、又は、
配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９、又は、
配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８２、又は、
配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は
配列番号８６、配列番号９３及び配列番号９７、又は、
配列番号８７、配列番号９４及び配列番号９８、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号９９、又は、
配列番号８７、配列番号９５及び配列番号１００、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号９７、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１０１、又は、
配列番号８９、配列番号９３及び配列番号１０２、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１００、又は、
配列番号９０、配列番号９３及び配列番号１０３、又は、
配列番号９１、配列番号９６及び配列番号１０４、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号９８、又は、
配列番号９２、配列番号９３及び配列番号１０５、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１０６、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号８７、配列番号９３及び配列番号１０８、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１０９、又は、
配列番号８８、配列番号９３及び配列番号１１０、又は、
配列番号１１１、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号１１２、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号１１３、配列番号９３及び配列番号１０７、又は、
配列番号１１１、配列番号９３及び配列番号１１０、又は、
配列番号１１２、配列番号９３及び配列番号１１０、又は、
配列番号１１３、配列番号９３及び配列番号１１０から選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0011】
本発明の一態様に係る抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記可変領域は、
（１）配列番号３７、３８、３９、８６、９３、９７、
（２）配列番号４０、４１、４２、８７、９４、９８、
（３）配列番号４３、４１、４４、８８、９３、９９、
（４）配列番号４５、４６、４７、８７、９５、１００、
（５）配列番号３７、４８、３９、８８、９３、９７、
（６）配列番号４９、５０、５１、８８、９３、１０１、
（７）配列番号４９、５２、５１、８９、９３、１０２、
（８）配列番号５３、５４、５５、８８、９３、１００、
（９）配列番号５６、５７、５８、９０、９３、１０３、
（１０）配列番号５９、６０、６１、９１、９６、１０４、
（１１）配列番号６２、６３、６４、８８、９３、９８、
（１２）配列番号６５、６６、６７、９２、９３、１０５、
（１３）配列番号６８、６９、７０、８８、９３、１０６、
（１４）配列番号７１、７２、７３、８８、９３、１０７、
（１５）配列番号７４、７５、７６、８８、９３、１０６、
（１６）配列番号７７、７８、７９、８７、９３、１０８、
（１７）配列番号８０、８１、８２、８８、９３、１０９、
（１８）配列番号８３、８４、８５、８８、９３、１１０、
（１９）配列番号７１、７２、７３、１１１、９３、１０７、
（２０）配列番号７１、７２、７３、１１２、９３、１０７、
（２１）配列番号７１、７２、７３、１１３、９３、１０７、
（２２）配列番号８３、８４、８５、１１１、９３、１１０、
（２３）配列番号８３、８４、８５、１１２、９３、１１０、
（２４）配列番号８３、８４、８５、１１３、９３、１１０のいずれか１群の６つのＣＤＲを含み、各群の６つのＣＤＲは、ＨＣＤ１、ＨＣＤ２、ＨＣＤ３、ＬＣＤ１、ＬＣＤ２、ＬＣＤ３の順に配列されている。
（１）配列番号３７、３８、３９、８６、９３、９７、
（２）配列番号４０、４１、４２、８７、９４、９８、
（３）配列番号４３、４１、４４、８８、９３、９９、
（４）配列番号４５、４６、４７、８７、９５、１００、
（５）配列番号３７、４８、３９、８８、９３、９７、
（６）配列番号４９、５０、５１、８８、９３、１０１、
（７）配列番号４９、５２、５１、８９、９３、１０２、
（８）配列番号５３、５４、５５、８８、９３、１００、
（９）配列番号５６、５７、５８、９０、９３、１０３、
（１０）配列番号５９、６０、６１、９１、９６、１０４、
（１１）配列番号６２、６３、６４、８８、９３、９８、
（１２）配列番号６５、６６、６７、９２、９３、１０５、
（１３）配列番号６８、６９、７０、８８、９３、１０６、
（１４）配列番号７１、７２、７３、８８、９３、１０７、
（１５）配列番号７４、７５、７６、８８、９３、１０６、
（１６）配列番号７７、７８、７９、８７、９３、１０８、
（１７）配列番号８０、８１、８２、８８、９３、１０９、
（１８）配列番号８３、８４、８５、８８、９３、１１０、
（１９）配列番号７１、７２、７３、１１１、９３、１０７、
（２０）配列番号７１、７２、７３、１１２、９３、１０７、
（２１）配列番号７１、７２、７３、１１３、９３、１０７、
（２２）配列番号８３、８４、８５、１１１、９３、１１０、
（２３）配列番号８３、８４、８５、１１２、９３、１１０、
（２４）配列番号８３、８４、８５、１１３、９３、１１０のいずれか１群の６つのＣＤＲを含み、各群の６つのＣＤＲは、ＨＣＤ１、ＨＣＤ２、ＨＣＤ３、ＬＣＤ１、ＬＣＤ２、ＬＣＤ３の順に配列されている。
【0012】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0013】
本発明の一態様に係る抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片は、
（１）配列番号１及び２、
（２）配列番号３及び４、
（３）配列番号５及び６、
（４）配列番号７及び８、
（５）配列番号９及び１０、
（６）配列番号１１及び１２、
（７）配列番号１３及び１４、
（８）配列番号１５及び１６、
（９）配列番号１７及び１８、
（１０）配列番号１９及び２０、
（１１）配列番号２１及び２２、
（１２）配列番号２３及び２４、
（１３）配列番号２５及び２６、
（１４）配列番号２７及び２８、
（１５）配列番号２９及び３０、
（１６）配列番号３１及び３２、
（１７）配列番号３３及び３４、
（１８）配列番号３５及び３６、
（１９）配列番号２７及び１１４、
（２０）配列番号２７及び１１５、
（２１）配列番号２７及び１１６、
（２２）配列番号３５及び１１７、
（２３）配列番号３５及び１１８、
（２４）配列番号３５及び１１９のいずれか１群の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と少なくとも８０％～１００％の配列同一性を有するものを含む。
（１）配列番号１及び２、
（２）配列番号３及び４、
（３）配列番号５及び６、
（４）配列番号７及び８、
（５）配列番号９及び１０、
（６）配列番号１１及び１２、
（７）配列番号１３及び１４、
（８）配列番号１５及び１６、
（９）配列番号１７及び１８、
（１０）配列番号１９及び２０、
（１１）配列番号２１及び２２、
（１２）配列番号２３及び２４、
（１３）配列番号２５及び２６、
（１４）配列番号２７及び２８、
（１５）配列番号２９及び３０、
（１６）配列番号３１及び３２、
（１７）配列番号３３及び３４、
（１８）配列番号３５及び３６、
（１９）配列番号２７及び１１４、
（２０）配列番号２７及び１１５、
（２１）配列番号２７及び１１６、
（２２）配列番号３５及び１１７、
（２３）配列番号３５及び１１８、
（２４）配列番号３５及び１１９のいずれか１群の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と少なくとも８０％～１００％の配列同一性を有するものを含む。
【0014】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係る抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。
【0015】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１２０、１２２、１２５、１２８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は、配列番号１２１、１２３、１２４、１２６、１２７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0016】
本発明の一態様に係る抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片は、
（１）配列番号１２０及び１２１、
（２）配列番号１２０及び１２３、
（３）配列番号１２０及び１２４、
（４）配列番号１２２及び１２１、
（５）配列番号１２５及び１２６、
（６）配列番号１２５及び１２７、
（７）配列番号１２８及び１２６のいずれか１群の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するものを含む。
（１）配列番号１２０及び１２１、
（２）配列番号１２０及び１２３、
（３）配列番号１２０及び１２４、
（４）配列番号１２２及び１２１、
（５）配列番号１２５及び１２６、
（６）配列番号１２５及び１２７、
（７）配列番号１２８及び１２６のいずれか１群の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するものを含む。
【0017】
いくつかの好ましい実施形態において、前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、モノクローナル抗体である。
【0018】
いくつかの好ましい実施形態において、前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、前記重鎖固定領域は、Ｆｃ又はＦｃ変異体を含み、Ｆｃは、マウス又はヒト由来である。
【0019】
いくつかの好ましい実施形態において、前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、全長抗体である。
【0020】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の形態である。
【0021】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係る抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、線形抗体、単一ドメイン抗体である。
【0022】
いくつかの実施形態において、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を捕捉マーカー又は検出マーカーとカップリングして形成され、前記検出マーカーが、放射性核種、発光物質（例えばルシフェラーゼ）、有色物質又は酵素を含む、コンジュゲートを提供する。
【0023】
いくつかの実施形態において、本発明は、そのうちの１つの抗原結合ドメインが本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性抗体又は多重特異性抗体を提供する。
【0024】
いくつかの実施形態において、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体を提供する。前記抗体薬物複合体の構造は、本分野で周知であり、抗体－リンカー－薬物（毒素）により互いに連結して形成される。
【0025】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞外認識ユニットが前記抗体又はその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体を提供する。
【0026】
いくつかの実施形態において、本発明は、前記いずれか１つの抗体又はその抗原結合断片をコードする、核酸を提供する。本発明の別の態様において、本発明は、前記核酸を含む、組換えベクターを提供する。
【0027】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明に係る発現ベクターを含むか又はゲノムに前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸が組み込まれた、宿主細胞を提供する。いくつかの好ましい解決手段において、宿主細胞は、大腸菌のような原核細胞、又は酵母若しくは哺乳動物細胞のような真核細胞であり、哺乳動物細胞は、例えばＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞である。
【0028】
いくつかの実施形態において、本発明は、適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養し、前記細胞から発現産物を精製することを含む、前記抗体又はその抗原結合断片を調製する方法を提供する。
【0029】
いくつかの実施形態において、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片の、ＣＬＤＮ１８．２を発現させる腫瘍細胞を特異的に標的とする薬物、例えばモノクローナル抗体薬物、抗体薬物複合体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体の調製、又はキメラ抗原受容体修飾免疫細胞の調製、又はＣＬＤＮ１８．２を発現させる腫瘍を診断するための試薬の調製における用途を提供し、いくつかの実施形態において、前記ＣＬＤＮ１８．２を発現させる腫瘍は、胃癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌、胆嚢癌及びそれらの転移を含み、前記胃癌の移転は、例えばクルーケンベルグ腫瘍である。
【0030】
いくつかの実施形態において、本発明は、試料中のＣＬＤＮ１８．２の発現を検出する方法であって、試料を前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片とＣＬＤＮ１８．２との複合体の形成を検出することとを含み、任意選択的に、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片が検出可能に標識される、方法を提供する。
【0031】
いくつかの実施形態において、本発明は、有効量の本発明の抗体又はその抗原結合断片、又は前記抗体又はその抗原結合断片をコードする有効量の核酸、又はコード核酸を含む有効量の組換えベクター、又はコード核酸を含む有効量の宿主細胞、又は有効量の本発明の抗体薬物複合体、又は有効量の本発明のキメラ抗原受容体、又は有効量の本発明の二重特異性抗体又は多重特異性抗体を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0032】
いくつかの好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、１種以上の他の追加の治療薬をさらに含む。前記追加の治療薬は、細胞毒性剤、細胞増殖阻害剤、抗血管新生剤、腫瘍減量剤、化学治療薬、放射性治療薬、標的抗癌剤、生物学的応答修飾剤、癌ワクチン、サイトカイン、ホルモン、抗転移剤及び免疫治療薬を含む。
【0033】
いくつかの実施形態において、本発明は、容器と、容器内に含まれる本発明の医薬組成物とを含む、ドラックボックス又はキットを提供する。
【0034】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２を発現させる細胞の死を誘導する方法であって、前記細胞を本発明の医薬組成物と接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態においては、前記細胞を体外で医薬組成物と接触させる。いくつかの実施形態においては、前記細胞を体内で医薬組成物と接触させる。いくつかの実施形態において、前記細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、胃癌細胞、食道癌細胞、腸癌細胞、膵臓癌細胞、ウィルムス腫瘍細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肝癌細胞、頭頸部癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞及び胆嚢癌細胞から選択される。
【0035】
いくつかの実施形態において、本発明は、必要のある被験体においてＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患を治療する方法であって、前記被験体に本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記疾患は、腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、好ましくは、胃癌、食道癌、腸癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍、肺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、頭頸部癌、慢性骨髄性白血病又は胆嚢癌である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記被験体に追加の治療薬を投与することをさらに含む。
【0036】
本発明の抗体は、他の追加の治療薬と併用投与することができ、化学治療薬、細胞毒性剤、放射性治療薬、癌ワクチン、腫瘍減量剤、標的抗癌剤、抗血管新生剤、生物学的応答修飾剤、サイトカイン、ホルモン、抗転移剤及び免疫治療薬を含むが、これらに限定されない。
【0037】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片と併用することができる化学治療薬は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）を含む有糸分裂阻害剤；イリノテカン、トポテカン、及びカンプトテシン及びその類似体に由来する他の化合物を含むカンプトテシン化合物のようなトポイソメラーゼＩ阻害剤；エトポシド、テニポシド、ミドキシゾズ（ｍｉｄｏｘｉｚｏｚ）のようなポドフィロトキシン誘導体；シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、トリメチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ブリキノリジン（ｂｒｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎｅ）、ウラシルマスタード、クロプロフェン、ダカルバジンのようなアルキル化剤；シタラビン、５－フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、プロカルバジンを含む代謝拮抗剤；ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、サルコマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ロキシスロマイシン、アドリアマイシン、ラパマイシン及びその誘導体、及びダウノマイシンを含むがこれらに限定されない抗生物質；及びパクリタキセル、ドセタキセル、ダカルバジン、アザシチジン、アムサコン（ａｍｓａｃｏｎ）、メルファラン、イホスファミド及びミトキサントロンを含むがこれらに限定されない他の化学療法剤を含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、前記追加の治療薬は、エピルビシン、オキサリプラチン及び５－フルオロウラシルから選択される１種以上である。
【0038】
いくつかの実施形態において、前記標的抗癌剤は、高分子標的薬及び低分子標的薬などを含むが、これらに限定されない。
【0039】
いくつかの好ましい実施形態において、高分子標的薬は、セツキシマブ、パニツムマブ及びニモツズマブなどを含む上皮成長因子標的薬、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びＴ－ＤＭ１などを含むＨＥＲ－２又はＨＥＲ－３シグナル伝達経路阻害剤、ＶＥＧＦ－ＴＲＡＰ、ベバシズマブ及びラムシルマブなどを含む抗血管内皮成長因子薬物、及び、ＰＩ３Ｋ、ＰＡＲＰ、ＰＩ３Ｋα、ＰＫＢ／ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３などの標的部位を含むがこれらに限定されない他の標的部位を標的とする薬物を含むが、これらに限定されない。
【0040】
いくつかの実施形態において、低分子標的薬は、エルロチニブ又はゲフィチニブなどを含む上皮成長因子標的薬；ラパチニブ又はアファチニブなどを含むＨＥＲ－２又はＨＥＲ－３シグナル伝達経路阻害剤；イマチニブ又はスニチニブなどを含むチロシンキナーゼ阻害剤；ソラフェニブ、レゴラフェニブ、パゾチニブ、組換えヒトエンドスタチン及びアパチニブなどを含む抗血管内皮成長因子薬物；クリゾチニブなどを含むｃ－Ｍｅｔ／ＲＯＳ１標的薬；ボリノスタット及びマリマスタットなどを含むがこれらに限定されない他の標的薬；エベロリムスなどを含むｍＴＯＲ標的薬；及び、ＰＩ３Ｋα、ＰＫＢ／ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３などの標的部位を含むがこれらに限定されない他の標的部位を標的とする薬物を含むが、これらに限定されない。
【0041】
いくつかの実施形態において、前記免疫治療薬物は、免疫阻害剤及びアゴニスト、及び、免疫治療に関連する細胞療法を含むが、これらに限定されず、標的部位は、Ｄ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＩＤＯ、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４７、ＳＩＲＰα、４－１ＢＢ、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ１Ｒ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ３、ＴＧＦβ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ａ２ＡＲ、ＫＩＲ及びＮＫＧ２Ａなどを含む。
【0042】
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とする免疫チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、シンチリマブ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂなどの高分子薬物、及び、低分子薬物を含むが、これらに限定されない。
【0043】
いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ－４を標的とする免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブなどを含むが、これらに限定されず、サイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ４及びＩＬ１３などを含むが、これらに限定されず、ＢＲＡＦを標的とする阻害剤は、Ｂｉｎａｒｙｍｅｔｉｎｉｂなどを含むが、これらに限定されない。
【0044】
いくつかの実施形態において、他の治療薬は、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、アルファウイルス、マラバウイルス、レトロウイルス及びコクサッキーウイルスのような腫瘍溶解性ウイルスから選択され、或いは、他の治療薬は、癌ワクチン又はプロテアーゼ阻害剤、例えばボルテゾミブなどから選択される。
【図面の簡単な説明】
【0045】
図面は、本明細書の開示内容の新規性をさらに説明する。これらの図面を参照して、本明細書に開示された特性及び利点をよりよく理解することができるが、これらの図面は、本明細書に開示された原理の具体的な実施形態のみを説明するために用いられ、添付の特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【0046】
【図1-5】フローサイトメトリーを用いて、本発明の１８個のハイブリドーマ細胞株の上清と、ｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換するＨＥＫ２９３細胞との結合状況を検出することを示す。
【図6-11】本発明の１８個のキメラ抗体と、ｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞との結合状況を示す。
【図12-17】本発明の１８個のキメラ抗体と、ｈＣＬＤＮ１８．２を天然に発現させる胃癌腫瘍組織由来細胞との結合状況を示す。
【図18-23】本発明の１８個のキメラ抗体によるｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞のＡＤＣＣ結果を示す。
【図24-29】本発明の１８個のキメラ抗体によるｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞のＣＤＣ結果を示す。
【図30】本発明のヒト化抗体ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａと、ｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞との結合状況を示す。
【図31】本発明のヒト化抗体ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑと、ｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞との結合状況を示す。
【図32】本発明のヒト化抗体ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａと、ｈＣＬＤＮ１８．２を天然に発現させる胃癌腫瘍組織由来細胞との結合状況を示す。
【図33】本発明のヒト化抗体ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑと、ｈＣＬＤＮ１８．２を天然に発現させる胃癌腫瘍組織由来細胞との結合状況を示す。
【図34】本発明のヒト化抗体ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２ＡによるｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞のＡＤＣＣ結果を示す。
【図35】本発明のヒト化抗体ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１ＱによるｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞のＡＤＣＣ結果を示す。
【図36】本発明のヒト化抗体ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２ＡによるｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞のＣＤＣ結果を示す。
【図37】本発明のヒト化抗体ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１ＱによるｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞のＣＤＣ結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0047】
＜用語＞
本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々の刊行物、特許又は特許出願が特定にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々の刊行物、特許又は特許出願が特定にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
【0048】
以下に本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、解決手段及び試薬に限定されるものではなく、これらが変化することができることを理解すべきである。また、本明細書において使用される用語は、発明を実施するための実施形態を説明するためだけであり、本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解すべきである。別途定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、いずれも当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。
【0049】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、数値範囲を含み、かつ本発明のいくつかの態様は、範囲形式で記載することができる。他の説明がない限り、数値範囲又は範囲で記載される形式は、単に便宜性及び簡潔性のためであることを理解すべきであり、本発明の範囲を厳密に限定するものと見なすべきではない。したがって、範囲形式の記載は、本明細書にすでに明示されているとおり、取りうる全ての部分範囲と該範囲内で取りうる全ての特定の数値が具体的に開示するものと考えるべきである。例えば、１～６の範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲とこれらの範囲内の特定の数値、例えば１、２、３、４、５、６を具体的に開示するものと考えるべきである。前記数値の幅に関係なく、上記原則はいずれも同様に適用される。範囲を用いて記載する場合、該範囲は、範囲の端点を含む。
【0050】
量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、用語「約」は、特定の値の±２０％、場合によっては±１０％、場合によっては±５％、場合によっては±１％、場合によっては±０．１％の変動を含むことを意味する。
【0051】
本明細書において使用されるアミノ酸の１文字記号及び３文字記号は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）で記述されている通りである。
【0052】
本明細書において使用される用語「抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２の抗体」、「抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体」、「抗ＣＬＤＮ１８．２の抗体」、「抗ＣＬＤＮ１８．２抗体」、「ＣＬＤＮ１８．２に対する抗体」とは、十分な親和性でＣＬＤＮ１８．２タンパク質又はその断片に結合して、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする診断剤及び／又は治療薬として使用することができる抗体を指す。ヒト由来のＣＬＤＮ１８．２タンパク質は、ｈＣＬＤＮ１８．２であるため、「抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２の抗体」、「抗ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２抗体」、「抗ｈＣＬＤＮ１８．２の抗体」、「抗ｈＣＬＤＮ１８．２抗体」、「ｈＣＬＤＮ１８．２に対する抗体」とは、特に、十分な親和性でヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質又はその断片に結合して、ヒトＣＬＤＮ１８．２を標的とする診断剤及び／又は治療薬として使用することができる抗体を指す。
【0053】
本明細書において使用される用語「抗体」とは、典型的に、ジスルフィド共有結合及び非共有結合性相互作用により一緒に保持された２つの重鎖（Ｈ）ポリペプチド鎖と２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖とを含むＹ字型４量体タンパク質である。天然ＩｇＧ抗体は、このような構造を有する。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と定常領域を含む。
【0054】
本分野においてＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主な種類の抗体が知られており、対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれ、ＩｇＧとＩｇＡは、さらに異なるサブクラスに分類することができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分類することができ、ＩｇＡは、ＩｇＡ１とＩｇＡ２に分類することができる。任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２つの明らかに異なるタイプの１つに分類することができる。
【0055】
ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の場合、該定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と呼ばれる３つのドメインを含む（ＩｇＭ及びＩｇＥが第４のドメインＣＨ４を有する）。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤの分類において、ＣＨ１とＣＨ２のドメインは、可変長のプロリン及びシステイン豊富なセグメントである柔軟なヒンジ領域によって離されている。抗体の各クラスは、対をなすシステイン残基によって形成される鎖間及び鎖内のジスルフィド結合をさらに含む。
【0056】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体毎にアミノ酸組成に顕著な変化を示し、主に抗原認識及び結合の役割を担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成しており、したがって完全なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する（すなわち、これは２価である）。重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）ドメインは、それぞれ超可変領域（ＨＶＲ）又はより一般的に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる極度の可変性を有する３つの領域を含み、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ４つのフレームワーク領域ＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で表される）を有する。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般的に、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ））におけるＦＲ１－ＨＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）－ＦＲ４の配列に現れる。
【0057】
用語「Ｆｃ」は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【0058】
本明細書において使用されるとき、広義の「抗体」のタイプは、ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び霊長類化抗体、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト抗体（組換えにより産生したヒト抗体を含む）、組換えにより産生した抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、単価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体（突然変異タンパク質及びその変異体を含む）などを含む。
【0059】
用語「全長抗体」、「完全な抗体」及び「完全抗体」は、本明細書において交換可能に使用することができ、構造が天然抗体の構造と基本的に類似する抗体又はＦｃ領域を含む抗体を指す。
【0060】
用語「モノクローナル抗体」（又は「マブ」と呼ばれる）とは、単一細胞のクローンにより産生した、実質的に均質で、ある特定の抗原エピトープのみに対する抗体を指す。モノクローナル抗体は、本分野で知られている様々な技術を用いて調製することができ、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージ表示技術、遺伝子組換え動物、合成技術又は上記技術の組み合わせなどを含む。
【0061】
用語「キメラ抗体」は、構築物であり、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同性であり、これ又はこれらの鎖の残部は、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスの抗体及びこのような抗体の断片に属する抗体の対応する配列と同一又は相同性である。狭義には、キメラ抗体は、ヒト軽鎖及び重鎖定常領域に操作可能に連結されている選択されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域の全て又は大部分を含む。定常領域配列又はその変異体若しくは誘導体は、開示された重鎖及び軽鎖可変領域と、標準的な分子生物学技術を使用して操作可能に会合されて、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２でそのまま使用され得るか又はそれに組み込まれ得る全長抗体を提供することができる。
【0062】
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片である。多くの場合には、ヒト化抗体は、受容体由来のＣＤＲの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は霊長類動物のような非ヒト種（ドナー抗体）に由来するＣＤＲの残基で置換されるヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基は、対応する非ヒト残基で置換される。いくつかの場合には、「復帰突然変異」をヒト化抗体に導入することができ、受容体ヒト抗体の可変領域の１つ又は複数のＦＲの残基を非ヒト種ドナー抗体に由来する対応する残基で置換する。このような復帰突然変異は、１種以上のグラフトＣＤＲの適切な三次元構造を維持し、これにより、親和性及び抗体の安定性を改善する一助とすることができる。様々なドナー種に由来する抗体を使用することができ、これらのドナー種は、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類動物を含むが、これらに限定されない。また、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさら改善するために、受容体抗体にもドナー抗体にも見出されない新たな残基を含んでもよい。
【0063】
なお、本発明のモノクローナル抗体可変領域のＣＤＲ及びＦＲの分割は、Ｋａｂａｔに基づいて定義される。他の命名及び番号付けシステム、例えばＣｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＡＨｏなども当業者に知られている。したがって、本発明のマブ配列を基礎とし、任意の命名システムから誘導された１種以上のＣＤＲを含むヒト化抗体は、いずれも本発明の範囲内に明確に保持される。
【0064】
用語「配列同一性」又は「配列類似性」又は「配列相同性」とは、前記配列をアラインメントする（必要な場合にギャップを導入する）ことにより最大のパーセント配列同一性を取得し、かつ任意の保存的置換を配列同一性の一部と見なさない場合の、候補配列中のアミノ酸残基と参照ポリペプチド配列中の同じアミノ酸残基のパーセントを指す。本分野の様々な方法を用いて配列をアラインメントすることにより、アミノ酸配列同一性パーセントを測定することができ、例えば、公衆が入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用する。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【0065】
用語「抗体断片」は、完全抗体の少なくとも一部を含む。本明細書において使用されるとき、抗体分子の「断片」は、抗体の「抗原結合断片」を含み、かつ用語「抗原結合断片」とは、免疫グロブリン又は抗体における、選択された抗原又はその抗原エピトープに特異的に結合又は反応するポリペプチド断片、又はこの断片からさらに誘導された融合タンパク質産物、例えば一本鎖抗体、キメラ抗原受容体中の細胞外結合領域などを指す。例示的な抗体断片又はその抗原結合断片は、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体、線形抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）及び抗体断片により形成された二重特異性抗体又は多重特異性抗体などを含むが、これらに限定されない。
【0066】
用語「Ｆａｂ断片」は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、かつ軽鎖の定常領域及び重鎖の第一定常領域ＣＨ１を含み、一価の抗体断片である。用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのＦａｂ断片及びヒンジ領域を含み、二価の抗体断片である。
【0067】
用語「Ｆｄ断片」は、一般的に重鎖可変領域及び定常領域ＣＨ１を含み、用語「Ｆｖ断片」は、抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むが、定常領域がなく、かつ全ての抗原結合部位の最小抗体断片を有する。
【0068】
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖を含む少なくとも１つの可変領域抗体断片と、重鎖を含む少なくとも１つの可変領域抗体断片とを含む融合タンパク質であり、前記軽鎖及び重鎖可変領域は、（例えば、短い柔軟性のあるポリペプチドリンカーのような合成リンカーを介して）隣接し、かつ一本鎖ポリペプチドの形式で発現することができ、前記ｓｃＦｖは、それが由来する完全抗体の特異性を保留する。指定されない限り、ｓｃＦｖは、任意の順序で（例えば、ポリペプチドのＮ－末端及びＣ末端に対して）前記ＶＬ及びＶＨ可変領域を有することができ、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含むか又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含むことができる。
【0069】
用語「多重特異性抗体」とは、抗体を１つ又は複数の他の結合分子に（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他の方法により）機能的に連結することにより形成された、２つ以上の異なる部位及び／又は標的部位に結合する新たな抗体構築物を指す。より多く使用されるのは「二重特異性抗体」であり、それは、特に、２種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体構築物を指す。一般的に、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む。
【0070】
用語「抗原」は、抗体又は抗体結合断片が認識し、特異的に結合する物質を指し、広義には、抗原は、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一のドメイン、複数のドメイン、又は完全な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）若しくはタンパク質を含む、選択された標的の任意の免疫原性断片又は決定基を含むことができる。ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖及び脂質は、それらの一部及び組み合わせがいずれも抗原を構成することができる。非限定的な例示的抗原は、腫瘍抗原又は病原体抗原などを含む。「抗原」とは、免疫応答を引き起こす分子であってもよい。任意の形式の抗原又は該抗原を含む細胞若しくは製剤は、いずれも抗原決定基に対して特異性を有する抗体を生成するために用いることができる。抗原は、単離された全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、その表面に少なくとも一部の抗原を発現させる細胞で免疫化される）、可溶性タンパク質（例えば、該タンパク質のＥＣＤ部分のみで免疫化される）又はタンパク質構築物（例えば、Ｆｃ抗原）であってもよい。該抗原は、遺伝子修飾された細胞において産生することができる。前記任意の抗原は、単独で使用することができるか、又は本分野で周知の１種以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用することができる。該抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムであっても非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を引き起こすのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードすることができる。任意のベクターを使用してその中に抗原を発現させる細胞を形質転換することができ、前記ベクターは、アデノウイルススベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド、及びカチオン性脂質のような非ウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【0071】
用語「エピトープ」とは、抗原上に免疫グロブリン又は抗体に特異的に結合する部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸、又はタンパク質の三次折り畳みにより並列するが隣接しないアミノ酸で形成することができる。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは、一般に、変性溶媒への暴露の際に保持される一方で、三次折り畳みにより形成されるエピトープは、一般に、変性溶媒での処理によって失われる。エピトープは、一般に、独特の空間的コンフォメーションで少なくとも３～１５個のアミノ酸を含む。所定の抗体によりそれが結合するエピトープを決定する方法は、本分野で周知であり、免疫ブロット及び免疫沈殿検出分析などを含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法は、例えば、Ｘ線結晶分析法、二次元核磁気共鳴などの本分野における技術と本明細書に記載の技術を含む。
【0072】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖、環状又は分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸、特に保存的に修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつ非アミノ酸によって中断されてもよい。該用語は、変性されたアミノ酸ポリマー、例えば硫酸化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ化、メチル化、酸化、タンパク質加水分解加工、プレニル化、ラセミ化、セレネニル化、転移－ＲＮＡ媒介のアミノ付加、例えばアルギニン化、遍在化、又は任意の他の操作、例えば標識成分との複合などにより変性されたアミノ酸ポリマーをさらに含む。本明細書において使用されるとき、用語「アミノ酸」とは、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸を指し、グリシン、Ｄ又はＬ光学異性体、及び、アミノ酸類似体及びペプチド模倣物を含む。指定されたタンパク質「に由来する」ポリペプチド又はアミノ酸配列とは、ポリペプチドの供給源を指す。該用語は、指定された核酸配列が発現するポリペプチドをさらに含む。
【0073】
用語「アミノ酸修飾」（又は「修飾されたアミノ酸」）は、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含む。本明細書における「アミノ酸置換」又は「置換」は、別のアミノ酸で親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸を置換することを意味する。例えば、置換Ｓ３２Ａとは、第３２位のセリンがアラニンで置換されることを指す。
【0074】
ヒト化抗体可変領域とヒト受容体可変領域の配列同一性又は相同性は、本明細書において述べたように測定することができ、このように測定した場合、好ましくは少なくとも６０％又は６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、異なる残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的置換」は、１つのアミノ酸残基が類似する化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）の他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸置換を指す。一般的に、保存的アミノ酸置換は、実質的にタンパク質の機能特性を変更しない。本分野では、類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を含むアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を含むアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖を含むアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を含むアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を含むアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を含むアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、他の類似の側鎖を含むアミノ酸残基で本発明の抗体のＣＤＲ領域又はフレームワーク領域内の１つ以上のアミノ酸残基を置換することができる。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合には、配列同一性パーセント又は類似度は、該置換の保存的な性質を補正するように上方に調整することができる。
【0075】
モノクローナル抗体生産過程において、異なる物理化学的要因により、例えばグリコシル化、酸化、糖化、脱アミド化、異性化及び末端基環化などの様々な翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＰＴＭ）変異体が産生しやすく、これらのＰＴＭは、抗体の物理化学的性質の変化を引き起こし、抗体Ｆｃ受容体との相互反応を変更し、標的抗原との結合活性に影響を与える可能性があり、いくつかのＰＴＭの産生は、さらに抗体の安定性を低下させ、免疫原性などを引き起こす可能性がある（ＪＡＲＡＳＣＨら、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、２０１５）。ＰＴＭ部位に対するアミノ酸修飾により、例えば保存的置換により、それがもたらす悪影響を排除することができる。ＰＴＭを操作する目的に基づく抗体ＣＤＲのアミノ酸置換は、いずれも本発明の範囲内に明確に保持される。
【0076】
用語「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」（ＡＤＣＣ）とは、抗体がウイルスに感染した細胞又は腫瘍細胞の抗原エピトープに結合し、そのＦｃ断片が殺傷細胞（ＮＫ細胞、マクロファージなど）表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合し、殺傷細胞を媒介して標的細胞を直接殺傷することを意味する。
【0077】
用語「補体依存性細胞毒性」（ＣＤＣ）とは、補体が関与する細胞毒性作用を指し、すなわち、特異性抗体により細胞膜表面の対応する抗原に結合し、複合体を形成して補体の古典的経路を活性化し、形成された膜攻撃複合体が標的細胞に対して溶解効果を発揮することを意味する。
【0078】
本発明の抗体は、アミノ酸残基置換、突然変異及び／又は修飾を含むがこれらに限定されない、定常領域（例えばＦｃ）の置換又は修飾をさらに含むことができ、それらは、以下の好ましい特性を有する化合物を産生することができ、これらの好ましい特性は、変更された薬物動態学、増加した血清半減期、増加した結合親和性、低減された免疫原性、増加した収量、Ｆｃ受容体（Ｒ）の変更されたＦｃリガンドとの結合、増強又は低減されたＡＤＣＣ又はＣＤＣ、変更されたグリコシル化及び／又はジスルフィド結合及び修飾の結合特異性を含むが、これらに限定されない。
【0079】
用語「親和性」又は「結合親和性」とは、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。用語「ＫＤ」とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指す。結合親和性は、本分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法及びフローサイトメトリーなどを使用して決定することができる。
【0080】
用語「競合結合」又は「競合的抗体」とは、一般的に、本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体を指し、その結合により、本発明の抗体と抗原エピトープとの結合が阻害されるか又は遮断され、競合測定において競合的阻害が得られる。
【0081】
用語「医薬組成物」とは、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被験体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない製剤を指す。
【0082】
用語「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容可能な担体」とは、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤又は媒体を指す。
【0083】
用語「有効量」とは、それは単回又は複数回で患者に投与した後、治療される患者において予期された効果を達成する、本発明の抗体又は断片の薬物製剤の用量を指す。有効量は、当業者としての主治医によって、人種差、体重、年齢及び健康状況、関連する具体的な疾患、疾患の重症度、個体患者の応答、投与される具体的な抗体、投与モード、投与製剤の生物学的利用能特性、選択された用量レジメン、及び任意の併用治療の使用などの様々な要因を考慮することにより容易に決定することができる。
【0084】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及び「宿主細胞培養物」は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、一次形質転換された細胞及びそれに由来する子孫を含み、継代の数を考慮しない。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。本明細書において、最初に形質転換された細胞からスクリーニングされるか又は選択されるものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体の子孫が含まれる。
【0085】
本明細書において使用される用語「トランスフェクション」とは、外因性核酸を真核細胞に導入することを指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、脂質トランスフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及び微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む、本分野で公知の様々な手段により実現することができる。
【0086】
用語「安定なトランスフェクション」又は「安定的トランスフェクション」とは、外因性核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡをトランスフェクション細胞のゲノムに導入して組み込むことを指す。用語「安定なトランスフェクタント」（ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）とは、外因性ＤＮＡをゲノムＤＮＡ中の細胞に安定して組み込むことを指す。
【0087】
用語「をコードする核酸分子」、「をコードするＤＮＡ配列」及び「をコードするＤＮＡ」とは、デオキシリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順を決める。したがって、核酸配列は、アミノ酸配列をコードする。
【0088】
抗体及び抗原結合断片を生産及び精製する方法は、コールド・スプリング・ハーバー研究所の抗体実験技術ガイドにおける第５～８章及び第１５章のような従来技術でよく知られている。本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、遺伝子操作方法で非ヒト由来ＣＤＲ領域に１つ又は複数のヒトＦＲ領域を加えたものである。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから取得されるか、又は免疫グロブリン雑誌、（２００１）ＩＳＢＮ：０１２４４１３５１から取得される。
【0089】
本発明の操作された抗体又はその抗原結合断片は、従来の方法を用いて調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列を、発現ベクターにクローニングして組み換えることができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定的にトランスフェクションすることができる。より推奨される従来技術としては、哺乳類発現系は、特にＦｃ領域中の高度に保存されたＮ末端でグリコシル化された抗体を作ることができる。安定クローンは、ヒト由来抗原に特異的に結合する抗体の発現を介して得ることができる。陽性クローンは、抗体を産生するためにバイオリアクターの血清不含培地で拡大培養される。抗体が分泌される培養液は、従来技術により精製され、採取される。抗体は、従来の方法により濾過され、濃縮される。可溶性混合物と多量体も、分子篩、イオン交換のような従来の方法により除去されてもよい。
【0090】
本明細書において使用される用語「個体」又は「被験体」とは、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本発明の個体は、ヒト、非ヒト霊長類動物（例えば、カニクイザル、アカゲザル又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
【0091】
用語「抗体薬物複合体」（ＡＤＣ）とは、治療的活性物質又は活性薬物成分（ＡＰＩ）が抗体の結合標的を標的としてその薬理学的機能を示すように、治療的活性物質又は活性薬物成分（ＡＰＩ）に共有結合してカップリングした抗体を指す。治療的活性物質又は活性薬物成分は、ＡＤＣ標的細胞、好ましくは悪性細胞又は癌細胞を死滅させることができる細胞毒素であってもよい。治療的活性物質、活性薬物成分又は細胞毒素の共有結合は、非部位特異的方式でペイロードをリジン又はシステイン残基にカップリングする標準化学リンカーを利用して行うことができ、又は好ましくは、部位特異的方式で複合を行い、これは、複合部位及び産生されたＡＤＣの薬物対抗体比を完全に制御することを可能にする。
【0092】
用語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、任意の特異性を免疫エフェクター細胞に移植する、操作された受容体である。一般的に、これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植し、レトロウイルス、レンチウイルスベクター又はトランスポゾンによりそれらのコード配列の移転を促進することに用いられる。ＣＡＲで操作されたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞と略称する）は、キメラ受容体が取り付けられた、遺伝学的に操作されたＴ細胞であり、その細胞外認識ユニットは、抗体から誘導された認識ドメインを含み、かつその細胞内領域は、リンパ球刺激部分に由来する。原型的なＣＡＲの構造は、モジュール化され、様々な機能ドメインを収容するように設計されることにより、特異性を選択し、Ｔ細胞の活性化を制御することができる。好ましい抗体から誘導された認識ユニットは、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖可変領域の特異性を組み合わせ残基に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。最も一般的なリンパ球活性化部分は、Ｔ－細胞が誘発する（例えばＣＤ３ζ）部分に直列連結されたＴ－細胞共刺激（例えばＣＤ２８）ドメインを含む。このようなキメラ受容体をエフェクターリンパ球（例えば、Ｔ細胞及び自然殺傷細胞）に装備させることにより、操作された細胞は、非ＨＬＡ拘束方式で、予め定義された任意の所望の標的抗原に対する特異性を有するように再指向される。レトロウイルス、レンチウイルスベクター又はトランスポゾンを利用してＣＡＲ構築物を所定の患者の外周リンパ球からのＴ細胞に体外導入する。得られたＣＡＲで操作されたＴ細胞は、患者に注入して戻された後、輸送され、それらの標的部位に到達し、かつ標的細胞又は組織と相互作用するときに活性化され、それらの予め定義されたエフェクター機能を発揮する。ＣＡＲ方法の治療標的は、癌及びＨＩＶ感染細胞、又は自己免疫エフェクター細胞を含む。
【0093】
本明細書において使用される用語「腫瘍」とは、細胞又は組織の病理学的な増殖を特徴とする疾患、及び、他の組織又は器官へのその後の遊走又は浸潤を指す。腫瘍増殖は、一般的に、制御されず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発又は阻害しない。腫瘍は、膀胱、骨、脳、乳腺、軟骨、神経膠細胞、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿道、尿管、尿道、子宮、膣器官、又は組織又は対応する細胞から選択されるものを含むがこれらに限定されない、様々な細胞、組織又は器官に影響を与えることができる。腫瘍は、例えば、肉腫、癌、又は細胞腫瘍（形質細胞の悪性腫瘍）のような癌を含む。本発明に係る腫瘍は、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、急性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、慢性白血病、慢性顆粒球性白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症）、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、原発性マクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、例えば、肉腫及び癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、血管肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、気管支癌、髄様癌、腎臓細胞癌、肝癌、ナイル管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴覚神経腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫）、食道癌、胆嚢癌、腎臓癌、多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記「腫瘍」は、膵臓癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、リンパ腫、胆嚢癌、腎臓癌、白血病、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮頸癌及び神経膠腫を含むが、これらに限定されない。
【0094】
本明細書において使用される用語「疾患」又は「病症」又は「障害」などとは、細胞、組織又は器官の正常な機能を損傷又は妨害する任意の変化又は失調を指す。例えば、前記「疾患」は、腫瘍、病原体感染、自己免疫疾患、Ｔ細胞機能障害性疾患、又は免疫寛容の欠陥（例えば移植拒絶）を含むが、これらに限定されない。
【0095】
本明細書において使用される用語「治療」とは、個人又は処理細胞に起因する疾患を変化させようとする過程での臨床的介入を指し、予防してもよいし、臨床病理上で介在してもよい。治療効果は、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、何らかの疾患による直接的又は間接的な病理結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は緩和、予後の緩和又は改善などを含むが、これらに限定されない。
【0096】
用語「薬学的キット」又は「キット」は、有効量の１種以上の単位投与形態の本発明の医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、薬学的キットは、滅菌容器を含むことができ、このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ブリスターパック又は本分野の既知の他の適切な容器の形態であってもよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は薬物を保持するのに適切な他の材料から作ることができる。また、薬学的キットは、本発明の医薬組成物を個体に投与する説明書をさらに含む。説明書には、一般的に、本発明の医薬組成物を用いて疾患を治療する方法が含まれる。
【実施例】
【0097】
以下に具体的な実施例を参照しながら、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。以下の実施例において具体的な条件を明記していない実験方法は、一般的に、従来の条件、例えばＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、分子クローニング実験マニュアル、第三版、科学出版社、２００２に記載される条件、或いはメーカーが推奨する条件で行った。
【実施例1】
【0098】
＜動物免疫＞
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を産生するために、標準的な生物学プロトコルを用いて試験操作を行う。ｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２）とｈＣＬＤＮ１８．２をコードするＤＮＡベクターとを免疫原として使用し、合計１５匹の異なる系統のマウスを免疫化した。
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を産生するために、標準的な生物学プロトコルを用いて試験操作を行う。ｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２）とｈＣＬＤＮ１８．２をコードするＤＮＡベクターとを免疫原として使用し、合計１５匹の異なる系統のマウスを免疫化した。
【0099】
免疫化の後期に目頭から静脈採血により血漿試料を得、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにより免疫血清に対して力価検出を行い、動物の免疫応答状況を決定し、４回免疫化した後、６匹のマウスを選択して安楽死させ、ハイブリドーマ細胞を調製した。
【実施例2】
【0100】
＜抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞の産生＞
抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞を産生するために、二酸化炭素を用いて６匹のマウスを安楽死させた後、注射器を用いてそれぞれフィーダー細胞を収集し、フィーダー細胞懸濁液を準備された９６ウェルプレートに播種した。一定量の骨髄腫細胞と脾臓細胞を比率に応じて混合し、細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（１ｍＬの１００×ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ＋１ｍＬのアミノプテリン＋１０ｍＬのＦＢＳ＋８８ｍＬのＤＭＥＭ）を融合後の細胞に加え、均一に混合して細胞懸濁液を調製した。次に、細胞懸濁液を培養皿に注ぎ、十分かつ均一に混合し、多導管ピペットを用いて細胞懸濁液を９６ウェルのフィーダー細胞プレートに播種した。融合後のフィーダー細胞プレートをインキュベーターに入れ、５．５％ＣＯ２で、３７℃で７～１０日間恒温培養した。そして、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにより抗ＣＬＤＮ１８．２の陽性クローンをスクリーニングした。スクリーニングされた陽性クローンに対して有限希釈法を採用し、細胞をサブクローニングして、安定した単一のハイブリドーマ細胞を得た。ｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）を使用し、ＦＡＣＳによりサブクローニング後の細胞上清をスクリーニングした。明細書の図１～５に示すように、ｈＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を最終的に１８個得た。
抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞を産生するために、二酸化炭素を用いて６匹のマウスを安楽死させた後、注射器を用いてそれぞれフィーダー細胞を収集し、フィーダー細胞懸濁液を準備された９６ウェルプレートに播種した。一定量の骨髄腫細胞と脾臓細胞を比率に応じて混合し、細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（１ｍＬの１００×ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ＋１ｍＬのアミノプテリン＋１０ｍＬのＦＢＳ＋８８ｍＬのＤＭＥＭ）を融合後の細胞に加え、均一に混合して細胞懸濁液を調製した。次に、細胞懸濁液を培養皿に注ぎ、十分かつ均一に混合し、多導管ピペットを用いて細胞懸濁液を９６ウェルのフィーダー細胞プレートに播種した。融合後のフィーダー細胞プレートをインキュベーターに入れ、５．５％ＣＯ２で、３７℃で７～１０日間恒温培養した。そして、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにより抗ＣＬＤＮ１８．２の陽性クローンをスクリーニングした。スクリーニングされた陽性クローンに対して有限希釈法を採用し、細胞をサブクローニングして、安定した単一のハイブリドーマ細胞を得た。ｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）を使用し、ＦＡＣＳによりサブクローニング後の細胞上清をスクリーニングした。明細書の図１～５に示すように、ｈＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を最終的に１８個得た。
【0101】
上記スクリーニングされた、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を培養し、従来の生物学的方法を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡをテンプレートとし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、逆転写によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをテンプレートとし、抗体の定常領域プライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離した後、精製してＤＮＡ断片を回収し、配列決定により本発明の１８個のモノクローナル抗体可変領域のアミノ酸配列を得、結果を表１に示す。
【0102】
【表1】
【0103】
上記アミノ酸配列を基に、Ｋａｂａｔ番号付け規則を利用して抗体可変領域のＣＤＲ及びＦＲを分割した。各抗体の６個のＣＤＲ配列は以下の表２に示すとおりであり、表２の括弧内の数字は配列番号を表し、例えば、（３７）は、配列番号３７を表す。
【0104】
【表2】
【実施例3】
【0105】
＜抗ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体の構築と真核細胞の一過性トランスフェクションによるその発現＞
配列決定が完了した本発明のモノクローナル抗体可変領域とヒトＩｇＧ１定常領域とを接合して生成された目的遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターにクローニングし、トランスフェクションレベルの発現プラスミドを調製した。血清不含培地でＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養し、細胞を振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に接種し、かつ３７℃、８％ＣＯ２の環境下でシェーカー上に置いて培養した。細胞密度を調整し、目的遺伝子断片を含む組換え発現ベクターとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３試薬とを適切な比率で混合し、かつ細胞培養振盪フラスコに加え、１６～１８時間トランスフェクションした後に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２を加え、細胞を６日間培養した後に上清を収集して精製し、最終精製キメラ抗体にＳＤＳ－ＰＡＧＥ純度分析及びＡ２８０濃度測定を行った。キメラ抗体は、元のハイブリドーマクローンに接頭辞ｃｈ－を追加することによって命名される。
配列決定が完了した本発明のモノクローナル抗体可変領域とヒトＩｇＧ１定常領域とを接合して生成された目的遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターにクローニングし、トランスフェクションレベルの発現プラスミドを調製した。血清不含培地でＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養し、細胞を振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に接種し、かつ３７℃、８％ＣＯ２の環境下でシェーカー上に置いて培養した。細胞密度を調整し、目的遺伝子断片を含む組換え発現ベクターとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３試薬とを適切な比率で混合し、かつ細胞培養振盪フラスコに加え、１６～１８時間トランスフェクションした後に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２を加え、細胞を６日間培養した後に上清を収集して精製し、最終精製キメラ抗体にＳＤＳ－ＰＡＧＥ純度分析及びＡ２８０濃度測定を行った。キメラ抗体は、元のハイブリドーマクローンに接頭辞ｃｈ－を追加することによって命名される。
【実施例4】
【0106】
＜抗ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体の結合試験＞
Ａ．抗ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体とｈＣＬＤＮ１８．２を発現させる細胞との結合
ＦＡＣＳを用いて、抗ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体とｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）及びｈＣＬＤＮ１８．２を天然に発現させる胃癌腫瘍組織由来細胞（ＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２）のそれぞれとの結合状況を検出した。
Ａ．抗ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体とｈＣＬＤＮ１８．２を発現させる細胞との結合
ＦＡＣＳを用いて、抗ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体とｈＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）及びｈＣＬＤＮ１８．２を天然に発現させる胃癌腫瘍組織由来細胞（ＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２）のそれぞれとの結合状況を検出した。
【0107】
ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２又はＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を収集し、ＰＢＳで再懸濁し、細胞濃度を調整し、勾配希釈された抗体を加え、関連しないヒトＩｇＧを陰性対照とし、特許ＣＮ１０３５０９１１０Ｂに開示されたキメラ抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０を陽性対照（参照抗体）とした。シェーカーを用いて４℃で５０ｍｉｎ～１ｈインキュベートした後、リン酸塩緩衝液で２回遠心洗浄し、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ二次抗体を加え、ウェルあたり１００μＬとし、シェーカーを用いて４℃で４０ｍｉｎ～１ｈインキュベートした後、リン酸塩緩衝液で２回遠心洗浄し、次に調製された試料をフローサイトメーターで検出し、ソフトウェアにより各濃度の平均蛍光強度（以下、ＭＦＩと略称する）を算出し、その後にＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアにより半量結合濃度（以下、ＥＣ５０と略称する）及び最大平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を算出し、結果を表３に示す。
【0108】
【表3】
【0109】
表３及び図６～１７は、本発明のキメラ抗体及び参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０と、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞のそれぞれとの親和性結果を示している。実験結果によれば、本発明のキメラ抗体とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合の最大平均蛍光強度は５５８６～１２２０３であるが、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は５４５１しかなく、キメラ抗体とＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は７６１６～１９８７６、半量結合濃度（ＥＣ５０）は４．５５４～９６．２３ｎＭであるが、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０とＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は７１６０、半量結合濃度（ＥＣ５０）は６３．８５ｎＭしかない。以上より、本発明のキメラ抗体の大部分は、いずれもｈＣＬＤＮ１８．２抗原との結合能力がｃｈ－１７５Ｄ１０よりも高いことがわかった。
【0110】
Ｂ．抗ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体の結合選択性
ＦＡＣＳを用いて、本発明のキメラ抗体と、ラットＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２）及びヒトＣＬＤＮ１８．１を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１）のそれぞれとの結合状況を検出した。
ＦＡＣＳを用いて、本発明のキメラ抗体と、ラットＣＬＤＮ１８．２を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２）及びヒトＣＬＤＮ１８．１を安定形質転換し発現させるＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１）のそれぞれとの結合状況を検出した。
【0111】
ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２及びＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞をそれぞれ収集し、ＰＢＳで再懸濁し、細胞濃度を調整し、勾配希釈されたキメラ抗体を加え、関連しないヒトＩｇＧを陰性対照とし、ｃｈ－１７５Ｄ１０を陽性対照（参照抗体）とした。シェーカーを用いて４℃で５０分間インキュベートした後、リン酸塩緩衝液で２回遠心洗浄し、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ二次抗体を加え、ウェルあたり１００μＬであり、シェーカーを用いて４℃で４０分間インキュベートした後、リン酸塩緩衝液で２回遠心洗浄し、調製された試料をフローサイトメーターで検出し、その後にＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアにより半量結合濃度（ＥＣ５０）及び最大平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を算出し、結果を表４に示す。
【0112】
【表4】
【0113】
表４は、本発明のキメラ抗体及び参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０と、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞のそれぞれとの親和性結果を示している。実験結果によれば、本発明のキメラ抗体は、参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０と同様に、いずれもｍＣＬＤＮ１８．２抗原に結合し、キメラ抗体とＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は６０９３～１４７６８、半量結合濃度（ＥＣ５０）は０．５７３～１．７６３ｎＭであり、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０とＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は４１８７、半量結合濃度（ＥＣ５０）は１．０１４ｎＭであり、キメラ抗体は結合ＥＣ５０が参照抗体に相当し、最大結合が参照抗体より高い。また、キメラ抗体は、参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０と同様に、いずれもｈＣＬＤＮ１８．１抗原に結合しない。
【実施例5】
【0114】
＜抗ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体の体外機能試験＞
Ａ．抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）
ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２を標的細胞とし、１５８Ｖ／Ｖ型ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子をトランスフェクションするＮＫ細胞（ＮＫ９２／ＦｃＲγ３ａ．１５８Ｖ／Ｖ）をエフェクター細胞とし、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出量を検出し、かつこれを細胞殺傷作用の指標とした。
Ａ．抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）
ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２を標的細胞とし、１５８Ｖ／Ｖ型ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子をトランスフェクションするＮＫ細胞（ＮＫ９２／ＦｃＲγ３ａ．１５８Ｖ／Ｖ）をエフェクター細胞とし、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出量を検出し、かつこれを細胞殺傷作用の指標とした。
【0115】
ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を遠心分離して収集し、上清を捨てた後にＡＤＣＣ緩衝液で再懸濁し、細胞密度を調整し、９６ウェルアッセイプレートに移した。異なる濃度勾配のキメラ抗体、対照試料標準液又はＡＤＣＣ緩衝液を９６ウェルプレートに移し、細胞インキュベーター内（３７℃／５％ＣＯ２）で約３０分間インキュベートし、エフェクター細胞、ＡＤＣＣ緩衝液又は細胞溶解液を９６ウェルアッセイプレートに移し、細胞インキュベーター内（３７℃／５％ＣＯ２）で約６時間インキュベートを続けた。インキュベートが完了した後、９６ウェルアッセイプレートを取り出し、低速で遠心分離した後、上清を注意深く吸い取り、新たな９６ウェルアッセイプレートに移し、ＬＤＨ標準液を加えた後、室温で約１０～３０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＯＤ値を検出した。検出波長は４９２ｎｍ、参照波長は６５０ｎｍである。
【0116】
ＡＤＣＣ効果による細胞溶解パーセントは、％細胞溶解＝１００％×（試料放出量－標的細胞及びエフェクター細胞の混合放出量）／（最大放出量－標的細胞放出量）という式により算出され、式中、最大放出量は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理された標的細胞のウェルに生じた吸光度値であり、標的細胞及びエフェクター細胞の混合放出量は、標的細胞及びエフェクター細胞の混合ウェルに生じた吸光度値であり、標的細胞放出量は、標的細胞のみを含むウェルに生じた吸光度値であり、試料放出量は、キメラ抗体、標的細胞及びエフェクター細胞の混合ウェルに生じた吸光度値であり、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアは、ＥＣ５０と最大分解を算出し、結果を表５に示す。
【0117】
【表5】
【0118】
表５及び図１８～２３は、本発明のキメラ抗体及び参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０によるＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞のＡＤＣＣ結果を示している。実験結果によれば、本発明のキメラ抗体によるＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の最大ＡＤＣＣ効果は２９．０６％～４８．４６％、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０によるＡＤＣＣ効果は３１．８１％であり、本発明のキメラ抗体の、５０％のＡＤＣＣ効果を達成する濃度（ＥＣ５０）は０．０１０～０．０６４μｇ／ｍＬ、同様の反応条件下でｃｈ－１７５Ｄ１０の、５０％のＡＤＣＣ効果を達成する濃度（ＥＣ５０）は０．０２１μｇ／ｍＬである。上記結果は、本発明のキメラ抗体がＡＤＣＣ活性の面で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０に相当することを証明している。
【0119】
Ｂ．補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）
ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２を標的細胞とし、混合正常ヒト血清（ＰＮＨＳ）を補体供給源とし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）化学発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞生存率を検出した。
ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２を標的細胞とし、混合正常ヒト血清（ＰＮＨＳ）を補体供給源とし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）化学発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞生存率を検出した。
【0120】
ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を収集し、ＣＤＣ緩衝液で再懸濁し、細胞密度を調整し、細胞を３８４ウェル細胞プレートに接種し、ウェルあたり２０μＬであり、４倍濃度の試料溶液を調製し、溶液（対照群はＣＤＣ緩衝液である）を３８４ウェル細胞プレートの対応するウェルに移し、ウェルあたり１０μＬであり、室温で約３０分間インキュベートし、ＣＤＣ緩衝液を用いて混合正常ヒト血清（Ｐｏｏｌｅｄ Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ、ＰＮＨＳ）を４倍の作動濃度に希釈した。希釈後のＰＮＨＳを、インキュベートが完了した３８４ウェルプレートの対応するウェルに移し、ウェルあたり１０μＬであり、細胞インキュベーター内（３７℃／５％ＣＯ２）に入れて約４時間インキュベートを続けた後、３８４ウェルプレートを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）細胞生存率分析キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により検出し、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ Ｐｌｕｓソフトウェアを用いて結果を読み取った。
【0121】
ＣＤＣ試験におけるキメラ抗体による細胞溶解率は、％細胞溶解＝１００％×（１－（試験ウェル－血清対照ウェル）／（細胞及び血清のウェル－血清対照ウェル））という式により算出する。
【0122】
実験対照：血清対照ウェル：血清のみ（すなわち３０μＬ緩衝液＋１０μＬの希釈後の血清）である。細胞及び血清のウェル：ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞懸濁液のウェルに血清（すなわち２０μＬの細胞懸濁液＋１０μＬの緩衝液＋１０μＬの希釈後の血清）を加える。試験ウェル：ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞懸濁液のウェルに血清及びキメラ抗体（すなわち２０μＬの細胞懸濁液＋１０μＬの抗体＋１０μＬの希釈後の血清）を加える。
【0123】
ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いてＥＣ５０及び最大溶解を算出し、結果を表６に示す。
【0124】
【表6】
【0125】
表６及び図２４～２９は、本発明のキメラ抗体及び参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０によるＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞のＣＤＣ結果を示している。実験結果によれば、本発明のキメラ抗体によるＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２の最大ＣＤＣ効果は８９．０８％～９７．１１％、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０による最大ＣＤＣ効果は８７．４１％であり、本発明のキメラ抗体の、５０％のＣＤＣ効果を達成する濃度（ＥＣ５０）は０．０３８～０．３８０μｇ／ｍＬ、同様の反応条件下でｃｈ－１７５Ｄ１０の、５０％のＣＤＣ効果を達成する濃度（ＥＣ５０）は１μｇ／ｍＬより高い。以上より、抗体の大部分はＣＤＣ活性が参照抗体より高いことがわかる。
【実施例6】
【0126】
＜抗ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体の変異体の調製＞
本発明のモノクローナル抗体の翻訳後修飾（ＰＴＭ）分析により、２９９Ｂ２及び２５３Ｃ４の可変領域にいずれも１つの脱アミド部位が存在することが発見され、２９９Ｂ２軽鎖可変領域上の第３１、第３２又は第３３位のアミノ酸に対して単一部位の部位特異的変異を行い、それぞれ２９９Ｂ２－Ｎ３１Ｑ、２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ及び２９９Ｂ２－Ｇ３３Ａである３つの２９９Ｂ２の突然変異体を調製した。
本発明のモノクローナル抗体の翻訳後修飾（ＰＴＭ）分析により、２９９Ｂ２及び２５３Ｃ４の可変領域にいずれも１つの脱アミド部位が存在することが発見され、２９９Ｂ２軽鎖可変領域上の第３１、第３２又は第３３位のアミノ酸に対して単一部位の部位特異的変異を行い、それぞれ２９９Ｂ２－Ｎ３１Ｑ、２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ及び２９９Ｂ２－Ｇ３３Ａである３つの２９９Ｂ２の突然変異体を調製した。
【0127】
また、２５３Ｃ４軽鎖可変領域上の第３１、第３２又は第３３位のアミノ酸に対して単一部位の部位特異的変異を行い、それぞれ２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ、２５３Ｃ４－Ｓ３２Ａ及び２５３Ｃ４－Ｇ３３Ａである３つの２５３Ｃ４の突然変異体を調製した。
【0128】
２９９Ｂ２－Ｎ３１Ｑ、２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ及び２９９Ｂ２－Ｇ３３Ａの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、２９９Ｂ２と同様であり、２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ、２５３Ｃ４－Ｓ３２Ａ及び２５３Ｃ４－Ｇ３３Ａの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、２５３Ｃ４と同様である。上記６つの変異体の可変領域ＣＤＲ配列と重鎖及び軽鎖可変領域配列をそれぞれ表７及び表８に示す。
【0129】
【表7】
【0130】
【表8】
【0131】
実施例３を参照して、上記６つの変異体可変領域とヒトＩｇＧ１定常領域を接合して生成された目的遺伝子断片を発現ベクターにクローニングして、上記変異体のキメラ抗体を構築し、変異体のキメラ抗体は、「ハイブリドーマクローン－突然変異部位」に接頭辞ｃｈ－を追加することによって命名され、例えば２９９Ｂ２－Ｎ３１Ｑのキメラ抗体は、ｃｈ－２９９Ｂ２－Ｎ３１Ｑと命名される。哺乳動物細胞系の一過性トランスフェクション及び発現を経た後、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を用いて親和性検出を行い、ＦＡＣＳによりモノクローナルの細胞上清をスクリーニングし、抗体ｃｈ－２９９Ｂ２及びｃｈ－２５３Ｃ４の変異体の親和性結果を表９に示す。
【0132】
【表9】
【実施例7】
【0133】
＜ヒト化抗体の調製＞
Ａ．抗体２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａのヒト化設計及び発現
配列類似性の比較により、２９９Ｂ２との類似度が最も高い抗体生殖細胞系列を選択して抗体テンプレートとし、本実施例において、ＩＭＧＴデータベースであるＩＧＨＶ１－４６＊０１を選択して２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ重鎖の抗体テンプレートとし、ＩＧＫＶ４－１＊０１を選択して２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ軽鎖の抗体テンプレートとし、抗体テンプレートのＣＤＲ領域を２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａの軽鎖及び重鎖ＣＤＲ領域で置き換えた。
Ａ．抗体２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａのヒト化設計及び発現
配列類似性の比較により、２９９Ｂ２との類似度が最も高い抗体生殖細胞系列を選択して抗体テンプレートとし、本実施例において、ＩＭＧＴデータベースであるＩＧＨＶ１－４６＊０１を選択して２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ重鎖の抗体テンプレートとし、ＩＧＫＶ４－１＊０１を選択して２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ軽鎖の抗体テンプレートとし、抗体テンプレートのＣＤＲ領域を２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａの軽鎖及び重鎖ＣＤＲ領域で置き換えた。
【0134】
マウス抗可変領域配列に対して相同性モデリングを行った。マウス抗可変領域の配列に基づいて、ＰＤＢ抗体データベースにおいて最適なモデリングテンプレートを検索し、相同性が７４％の２ＧＫＩをテンプレートとして選択した。２ＧＫＩの空間構造に基づいて、１．フレームワーク領域の古典的残基が選択的に復帰突然変異し、２．フレームワーク領域における疎水性コア領域の残基が選択的に復帰突然変異し、３．重鎖／軽鎖相互作用界面残基が選択的に復帰突然変異し、４．類似の残基が低い優先度で復帰突然変異することもできるという標準に従って、ＣＤＲグラフト化の配列のフレームワーク領域のアミノ酸残基を復帰突然変異した。
【0135】
２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａがヒト化操作を経て、４個のヒト化抗体ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ－１、ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ－２、ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ－３、ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ－４を得、上記全ての２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａのヒト化抗体配列を表１０に示す。
【0136】
当業者に知られている標準方法により、ヒト化された抗体ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ可変領域とヒトＩｇＧ１の定常領域を接合して生成された目的遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターにサブクローニングし、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３トランスフェクション試薬を採用して対数増殖期のＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞を一過性トランスフェクションし、培養上清を収集し、親和性精製を行い、最終精製抗体にＳＤＳ－ＰＡＧＥ純度分析及びＡ２８０濃度測定を行った。
【0137】
Ｂ．抗体２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑのヒト化設計及び発現
配列類似性の比較により、２５３Ｃ４との類似度が最も高い抗体生殖細胞系列を選択して抗体テンプレートとし、本実施例において、ＩＭＧＴデータベースであるＩＧＫＶ４－１＊０１を選択して２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ重鎖の抗体テンプレートとし、ＩＧＨＶ１－２＊０６を選択して２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ軽鎖の抗体テンプレートとし、抗体テンプレートのＣＤＲ領域を２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑの軽鎖及び重鎖ＣＤＲ領域で置き換えた。
配列類似性の比較により、２５３Ｃ４との類似度が最も高い抗体生殖細胞系列を選択して抗体テンプレートとし、本実施例において、ＩＭＧＴデータベースであるＩＧＫＶ４－１＊０１を選択して２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ重鎖の抗体テンプレートとし、ＩＧＨＶ１－２＊０６を選択して２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ軽鎖の抗体テンプレートとし、抗体テンプレートのＣＤＲ領域を２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑの軽鎖及び重鎖ＣＤＲ領域で置き換えた。
【0138】
マウス抗可変領域配列に対して相同性モデリングを行った。マウス抗可変領域の配列に基づいて、ＰＤＢ抗体データベースにおいて最適なモデリングテンプレートを検索し、相同性が７４％の２ＧＫＩをテンプレートとして選択した。２ＧＫＩの空間構造に基づいて、１．フレームワーク領域の古典的残基が選択的に復帰突然変異し、２．フレームワーク領域における疎水性コア領域の残基が選択的に復帰突然変異し、３．重鎖／軽鎖相互作用界面残基が選択的に復帰突然変異し、４．類似の残基が低い優先度で復帰突然変異することもできるという標準に従って、ＣＤＲグラフト化の配列のフレームワーク領域のアミノ酸残基を復帰突然変異した。
【0139】
２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑのヒト化操作を経て、３個のヒト化抗体ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ－１、ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ－２、ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ－３を得、上記全ての２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑのヒト化抗体配列を表１０に示す。
【0140】
当業者に知られている標準的な方法により、ヒト化された抗体ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１Ｑ可変領域とヒトＩｇＧ１の定常領域を接合して生成された目的遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターにサブクローニングし、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３トランスフェクション試薬を採用して対数増殖期のＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞を一過性トランスフェクションし、培養上清を収集し、親和性精製を行い、最終精製抗体にＳＤＳ－ＰＡＧＥ純度分析及びＡ２８０濃度測定を行った。
【0141】
【表10】
【実施例8】
【0142】
＜ヒト化抗体ｈｕ２９９Ｂ２とｈｕ２５３Ｃ４の結合活性＞
Ａ．ヒト化抗体とｈＣＬＤＮ１８．２を発現させる細胞との結合
実施例４Ａを参照して結合活性の測定を行い、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２及びＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を使用し、関連しないヒトＩｇＧを陰性対照とし、特許ＣＮ１０３５０９１１０Ｂに開示されたキメラ抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０を陽性対照（参照抗体）とした。フローサイトメトリーで検出し、ソフトウェアにより各濃度の平均蛍光強度（以下、ＭＦＩと略称する）を算出し、その後にＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアにより半量結合濃度（ＥＣ５０）及び最大平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を算出し、結果を表１１に示す。
Ａ．ヒト化抗体とｈＣＬＤＮ１８．２を発現させる細胞との結合
実施例４Ａを参照して結合活性の測定を行い、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２及びＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を使用し、関連しないヒトＩｇＧを陰性対照とし、特許ＣＮ１０３５０９１１０Ｂに開示されたキメラ抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０を陽性対照（参照抗体）とした。フローサイトメトリーで検出し、ソフトウェアにより各濃度の平均蛍光強度（以下、ＭＦＩと略称する）を算出し、その後にＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアにより半量結合濃度（ＥＣ５０）及び最大平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を算出し、結果を表１１に示す。
【0143】
【表11】
【0144】
表１１及び図３０～３３は、本発明のヒト化抗体及び参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０と、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞のそれぞれとの親和性結果を示している。実験結果によれば、本発明のｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａヒト化抗体とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合の最大平均蛍光強度は２９５２９～３９９８６であるが、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は２６９２１しかない。ヒト化抗体ｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２ＡとＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２との親和性は参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０より優れており、ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１ＱとＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は、参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０とほぼ同じであり、ＥＣ５０は、参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０より優れている。
【0145】
本発明のｈｕ２９９Ｂ２－Ｓ３２Ａ、ｈｕ２５３Ｃ４－Ｎ３１ＱのそれぞれとＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は１５５８５～２５１８９、半量結合濃度（ＥＣ５０）は１１．４２～２９．６８ｎＭであり、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０とＰＤＸ－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度はわずか５７０３、半量結合濃度（ＥＣ５０）は２４．８９ｎＭしかない。以上より、本発明のヒト化抗体と天然ｈＣＬＤＮ１８．２抗原の最大結合は、ｃｈ－１７５Ｄ１０より高く、ＥＣ５０は、ｃｈ－１７５Ｄ１０とほぼ同じであることがわかる。
【0146】
Ｂ．ヒト化抗体の結合選択性
実施例４Ｂに記載の方法を参照して、ＦＡＣＳを使用して、本発明のヒト化抗体とＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞のそれぞれとの結合状況を検出した。
実施例４Ｂに記載の方法を参照して、ＦＡＣＳを使用して、本発明のヒト化抗体とＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞のそれぞれとの結合状況を検出した。
【0147】
ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２及びＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞をそれぞれ収集し、ＰＢＳで再懸濁し、細胞濃度を調整し、勾配希釈されたヒト化抗体を加え、関連しないヒトＩｇＧを陰性対照とし、ｃｈ－１７５Ｄ１０を陽性対照（参照抗体）とした。シェーカーを用いて４℃で５０分間インキュベートした後、リン酸塩緩衝液で２回遠心洗浄し、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ二次抗体を加え、ウェルあたり１００μＬであり、シェーカーを用いて４℃で４０分間インキュベートした後、リン酸塩緩衝液で２回遠心洗浄し、調製された試料をフローサイトメーターで検出し、その後にＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアにより半量結合濃度（ＥＣ５０）及び最大平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を算出し、結果を表１２に示す。
【0148】
【表12】
【0149】
表１２は、本発明のヒト化抗体及び参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０と、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞のそれぞれとの親和性結果を示している。実験結果によれば、本発明のヒト化抗体は参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０と同様に、いずれもｍＣＬＤＮ１８．２抗原に結合し、ヒト化抗体とＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は３６８４１～１０２７８５、半量結合濃度（ＥＣ５０）は０．０２６～０．３４２μｇ／ｍＬであり、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０とＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２との結合の最大平均蛍光強度は８６４０７、半量結合濃度（ＥＣ５０）は、０．１３６μｇ／ｍＬであり、ヒト化抗体とｍＣＬＤＮ１８．２の結合は、参照抗体とほぼ同じである。また、ヒト化抗体は参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０と同様に、いずれもｈＣＬＤＮ１８．１抗原に結合しない。
【実施例9】
【0150】
＜ヒト化抗体の体外機能試験＞
Ａ．抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）
実施例５Ａに記載の方法を参照して、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２を標的細胞とし、１５８Ｖ／Ｖ型ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子をトランスフェクションするＮＫ細胞（ＮＫ９２／ＦｃＲγ３ａ．１５８Ｖ／Ｖ）をエフェクター細胞とし、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出量を検出し、かつこれを細胞殺傷作用の指標とした。
Ａ．抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）
実施例５Ａに記載の方法を参照して、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２を標的細胞とし、１５８Ｖ／Ｖ型ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子をトランスフェクションするＮＫ細胞（ＮＫ９２／ＦｃＲγ３ａ．１５８Ｖ／Ｖ）をエフェクター細胞とし、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出量を検出し、かつこれを細胞殺傷作用の指標とした。
【0151】
ＡＤＣＣ効果による細胞溶解パーセントは、％細胞溶解＝１００％×（試料放出量－標的細胞及びエフェクター細胞の混合放出量）／（最大放出量－標的細胞放出量）という式により算出し、式中、最大放出量は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理された標的細胞のウェルに生じた吸光度値であり、標的細胞及びエフェクター細胞の混合放出量は、標的細胞及びエフェクター細胞の混合ウェルに生じた吸光度値であり、標的細胞放出量は、標的細胞のみを含むウェルに生じた吸光度値であり、試料放出量は、ヒト化抗体、標的細胞及びエフェクター細胞の混合ウェルに生じた吸光度値である。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによりＥＣ５０と最大分解を算出し、結果を表１３に示す。
【0152】
【表13】
【0153】
表１３及び図３４～３５は、本発明のヒト化抗体及び参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０によるＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞のＡＤＣＣ結果を示している。実験結果によれば、本発明のヒト化抗体によるＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の最大ＡＤＣＣ効果は５４．８５％～７０．２６％、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０によるＡＤＣＣ効果は５０％程度であり、本発明のヒト化抗体の、５０％のＡＤＣＣ効果を達成する濃度（ＥＣ５０）は０．０２２～０．０３８μｇ／ｍＬであり、同様の反応条件下でｃｈ－１７５Ｄ１０の、５０％のＡＤＣＣ効果を達成する濃度（ＥＣ５０）は約０．０４０μｇ／ｍＬである。上記結果は、本発明のヒト化抗体がＡＤＣＣ活性の面で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０に相当することを証明している。
【0154】
Ｂ．補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）
実施例５Ｂに記載の方法を参照して、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２を標的細胞とし、混合正常ヒト血清（ＰＮＨＳ）を補体供給源とし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）化学発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞生存率を検出し、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して結果を読み取った。
実施例５Ｂに記載の方法を参照して、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２を標的細胞とし、混合正常ヒト血清（ＰＮＨＳ）を補体供給源とし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）化学発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞生存率を検出し、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して結果を読み取った。
【0155】
ＣＤＣ試験におけるヒト化抗体による細胞溶解率は、％細胞溶解＝１００％×（１－（試験ウェル－血清対照ウェル）／（細胞及び血清のウェル－血清対照ウェル））という式により算出する。
【0156】
実験対照：血清対照ウェル：血清のみ（すなわち３０μＬ緩衝液＋１０μＬの希釈後の血清）である。細胞及び血清のウェル：ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞懸濁液のウェルに血清（すなわち２０μＬの細胞懸濁液＋１０μＬの緩衝液＋１０μＬの希釈後の血清）を加える。試験ウェル：ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞懸濁液のウェルに血清及びキメラ抗体（すなわち２０μＬの細胞懸濁液＋１０μＬの抗体＋１０μＬの希釈後の血清）を加える。
【0157】
ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いてＥＣ５０及び最大溶解を算出し、結果を表１４に示す。
【0158】
【表14】
【0159】
表１４及び図３６～３７は、本発明のヒト化抗体及び参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０によるＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞のＣＤＣ結果を示している。実験結果によれば、本発明のヒト化抗体によるＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＬＤＮ１８．２の最大ＣＤＣ効果は９６．１１％～９９．８７％、同様の反応条件下で参照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０による最大ＣＤＣ効果は８７．７６％であり、本発明のキメラ抗体の、５０％のＣＤＣ効果を達成する濃度（ＥＣ５０）は、０．０９２～０．１７５μｇ／ｍＬであり、同様の反応条件下でｃｈ－１７５Ｄ１０の、５０％のＣＤＣ効果を達成する濃度（ＥＣ５０）は、１μｇ／ｍＬより高い。以上よりわかるとおり、全てのヒト化抗体のＣＤＣ活性は参照抗体より高い。
【0160】
上記のような本発明の実施形態は、例示的なものに過ぎず、当業者であれば、従来とは異なる実験を行う必要なしに、無数の特定の化合物、材料、及び操作の等価物を認識又は決定することができる。
【0161】
全てのこれらの等価物は、いずれも本発明の範囲内にあり、かつ請求項に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【配列表】