特許 7408008 抗アルファ－４－ベータ－７抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-21

(45)【発行日】2024-01-04

(54)【発明の名称】抗アルファ－４－ベータ－７抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20231222BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231222BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2023502654

(86)(22)【出願日】2021-07-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-18

(86)【国際出願番号】 US2021070898

(87)【国際公開番号】W WO2022016198

(87)【国際公開日】2022-01-20

【審査請求日】2023-10-31

(31)【優先権主張番号】63/052,933

(32)【優先日】2020-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】512212195

【氏名又は名称】アッヴィ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ミン，ジン

(72)【発明者】

【氏名】ン，イォク－チャン

(72)【発明者】

【氏名】ベナトゥイル，ロレンゾ

(72)【発明者】

【氏名】ビクスビー，ジャクリーヌ

(72)【発明者】

【氏名】デフチャー，タチャーナ

(72)【発明者】

【氏名】ドン，フェン

(72)【発明者】

【氏名】エルナンデス・ジュニア，アクセル

(72)【発明者】

【氏名】クリシュナン，プリーシ

(72)【発明者】

【氏名】ルゥ，リヤンジュイン

(72)【発明者】

【氏名】メンサ，フェデリコ

(72)【発明者】

【氏名】ミラー，レニー

(72)【発明者】

【氏名】サフ，ガウタム

【審査官】山▲崎▼ 真奈

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１０４８９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Chang Li et al.，VIROLOGICA SINICA，2014年，Vol. 29, Issue 6，pp. 381-392

【文献】Mathieu Uzzan et al.，Sci. Transl. Med.，2018年，Vol. 10, article eaau4711，pp. 1-15

【文献】Michael C. Sneller et al.，Sci. Transl. Med.，2019年，Vol. 11, article eaax3447，pp. 1-8

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖領域；及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖領域を含む抗ヒトα４β７モノクローナル抗体であって、
ＶＨ ＣＤＲ＃１がＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨ（配列番号７２）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃２がＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧ（配列番号７３）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃３がＶＤＶ（配列番号７４）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃１がＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧ（配列番号７５）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃２がＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号７６）であり；及び
ＶＬ ＣＤＲ＃３がＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号７７）である、
抗ヒトα４β７抗体。

【請求項2】

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７０）
のＶＨ鎖領域；及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＳＦＫＬＬＩＹＨＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＹＡＱＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７１）
のＶＬ鎖領域
を含む、請求項１に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。

【請求項3】

ＩｇＧである、請求項２に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。

【請求項4】

カッパ軽定常領域を含む、請求項３に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。

【請求項5】

ＩｇＧ１である、請求項４に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。

【請求項6】

アミノ酸置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを有するバリアントＣＨ３ドメインを含む、請求項５に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。

【請求項7】

配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。

【請求項8】

配列番号９２のアミノ酸配列から、それぞれなる重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列から、それぞれなる軽鎖を含む抗体である、請求項１に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。

【請求項9】

配列番号９３のアミノ酸配列から、それぞれなる重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列から、それぞれなる軽鎖を含む抗体である、請求項１に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、これにより参照によってその全体を組み込む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年７月１４日に作成され、４８３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１０６，７９７バイトである。

【0002】

本出願は、とりわけ、新規の抗α４β７抗体、この抗体をコードするポリヌクレオチド、この抗体を産生する方法及びこれらの抗体の使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

今日、世界的に見ると３７００万人以上がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しており、流行している人口は増え続けている。抗レトロウイルス併用療法（ｃＡＲＴ）の出現によりＨＩＶの管理は著しく進歩してきた。ｃＡＲＴは、ＨＩＶを抱えている人の生涯を通じて終始一貫して受ける必要がある。ｃＡＲＴはリスクベネフィット限界を有し、さらに、ＨＩＶ潜伏ウイルス保有宿主を減らさない。生涯処置を必要としなくてもウイルス負荷を検出レベルより低く保つことができる改良処置の重大な必要性が存在する。

【0004】

急性ヒトＨＩＶ感染では、高レベルのウイルス複製と感染したＣＤ４＋Ｔ細胞の甚大な枯渇の両方が、ＨＩＶ感染に関連する免疫不全の発生に中心的な役割を果たすと考えられている。α４β７は、Ｔ細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋）、Ｂ細胞及び他の免疫細胞上で発現される腸管ホーミングインテグリンであり、ＨＩＶ感染の病態形成に重要な役割を果たす。α４β７は、ビリオンが感染宿主細胞から出芽するとＨＩＶのエンベロープに組み込まれることも報告されている（Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１７年）。

【0005】

α４β７インテグリンは、Ｔ細胞サブセット、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び他の免疫細胞上で発現されるヘテロ二量体受容体である。このインテグリンは、腸管粘膜の内皮性小静脈上で発現されるそのリガンド粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭＡｄＣＡＭ－１）に結合することにより、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）中へのリンパ球輸送を媒介する。高α４β７発現ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＨＩＶ感染の標的であり（Ｃｉｃａｌａら、ＰＮＡＳ ２００９年）、この細胞は感染し、したがって、急性ＨＩＶ感染の間枯渇する（Ｓｉｖｒｏら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１８年）。ＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞に並びにＨＩＶビリオンに存在するα４β７は、ＧＡＬＴへのその輸送を媒介することができると考えられる（Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７年）。ＧＡＬＴに向かうＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗レトロウイルス療法の間でも身体において最大のＨＩＶ保有宿主を構成する（Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ ａｎｄ Ｄｏｕｅｋ、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１７年

【文献】Ｃｉｃａｌａら、ＰＮＡＳ ２００９年

【文献】Ｓｉｖｒｏら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１８年

【文献】Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ ａｎｄ Ｄｏｕｅｋ、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

（発明の要旨）
本開示は、ヒトα４β７に特異的に結合する抗α４β７抗体及びその結合断片を提供する。例示的な抗α４β７抗体の重及び軽鎖の例示的なＣＤＲのアミノ酸配列、並びにＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、下の、発明を実施するための形態で提供される。

【0008】

本開示の抗α４β７抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書で提供され、ポリヌクレオチドを含むベクターも同様である。さらに、開示された抗α４β７抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核細胞及びこのベクターをトランスフェクトされた真核細胞並びにヌクレオチド配列を発現するように操作された真核（哺乳動物などの）宿主細胞が本明細書で提供される。宿主細胞を培養し抗体を回収することにより、抗体を産生する方法も提供される。

【0009】

本開示は、ＨＩＶ感染と診断された、ヒト対象などの対象を抗α４β７抗体を用いて処置する方法を提供する。方法は、一般に、対象に、治療効果を与えるのに有効な本明細書に記載される抗α４β７抗体の量を投与するステップを含む。対象は、ＨＩＶ感染のいかなる臨床カテゴリーで診断してもよい。

【0010】

本明細書に記載される抗α４β７抗体は、ウイルスタンパク質の代わりにヒトα４β７を標的にするので、ＨＩＶ突然変異ベースの耐性機構を誘導しない有利な治療アプローチを提供するが、この耐性機構は、ＨＩＶの高突然変異頻度のせいでウイルスタンパク質を標的にする処置により発生することが多い。

【0011】

本明細書に提示されるデータに基づいて、本明細書に記載される抗α４β７抗体は、ＨＩＶ感染と診断された対象に治療効果をもたらすと予想される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】マウス抗体Ａｂ－ｍｌによるＭＡｄＣＡＭ－１へのＨｕＴ７８細胞の接着の遮断を示す。

【図2】ＭＡｄＣＡＭ－１へのＣＨＯＫ１－ｃα４β７（ｃｙｎｏ α４β７）細胞接着アッセイを使用してＡｂ－ｍｌの機能的カニクイザル交差反応性を示す。

【図3】一次ヒトＣＤ４＋メモリーＴ細胞へのヒトＭＡｄＣＡＭ－１結合のＡｂ－ｍｌブロッキングを示す。

【図4】ヒト一次ＣＤ４＋メモリーＴ細胞へのマウス－ヒトキメラＡｂ－ｃ１の結合（ｈα４β７＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋）を示す。

【図5】フローサイトメトリーによる酵母上で示されるヒトα４β７抗原に対するライアビリティー操作ヒト化抗α４β７ Ａｂ－ｈ１．９ ｓｃＦｖクローンの結合を示す。クローンＡｂ－ｈ１．９（ａ－ｅ）は、親Ａｂ－ｈ１．９と類似する結合を有していた。

【図6A】４５人のＨＩＶ＋個人及び１０人の健康な（ＨＩＶ－）ドナー由来の試料でのα４β７発現分析を示す。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７の発現（％として又はＭＥＳＦにより測定されるレベルとして）はＨＩＶ＋とＨＩＶ－の個人間で比較された。マン・ホイットニーの両側検定により有意に異なる比較だけが図に示されている。Ｔ細胞集団は、Ｎ＋＝ナイーブ（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ－）、ＣＭ＝セントラルメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、ＴＭ＝トランジエントメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、ＥＭ＝エフェクターメモリー（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ＋）、ＴＥ＝ターミナルエフェクター（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ－）；ＭＥＳＦ＝等可溶性蛍光色素の分子として略記される。

【図6B】４５人のＨＩＶ＋個人及び１０人の健康な（ＨＩＶ－）ドナー由来の試料でのα４β７発現分析を示す。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７の発現（％として又はＭＥＳＦにより測定されるレベルとして）はＨＩＶ＋とＨＩＶ－の個人間で比較された。マン・ホイットニーの両側検定により有意に異なる比較だけが図に示されている。Ｔ細胞集団は、Ｎ＋＝ナイーブ（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ－）、ＣＭ＝セントラルメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、ＴＭ＝トランジエントメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、ＥＭ＝エフェクターメモリー（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ＋）、ＴＥ＝ターミナルエフェクター（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ－）；ＭＥＳＦ＝等可溶性蛍光色素の分子として略記される。

【図6C】４５人のＨＩＶ＋個人及び１０人の健康な（ＨＩＶ－）ドナー由来の試料でのα４β７発現分析を示す。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７の発現（％として又はＭＥＳＦにより測定されるレベルとして）はＨＩＶ＋とＨＩＶ－の個人間で比較された。マン・ホイットニーの両側検定により有意に異なる比較だけが図に示されている。Ｔ細胞集団は、Ｎ＋＝ナイーブ（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ－）、ＣＭ＝セントラルメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、ＴＭ＝トランジエントメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、ＥＭ＝エフェクターメモリー（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ＋）、ＴＥ＝ターミナルエフェクター（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ－）；ＭＥＳＦ＝等可溶性蛍光色素の分子として略記される。

【図6D】４５人のＨＩＶ＋個人及び１０人の健康な（ＨＩＶ－）ドナー由来の試料でのα４β７発現分析を示す。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７の発現（％として又はＭＥＳＦにより測定されるレベルとして）はＨＩＶ＋とＨＩＶ－の個人間で比較された。マン・ホイットニーの両側検定により有意に異なる比較だけが図に示されている。Ｔ細胞集団は、Ｎ＋＝ナイーブ（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ－）、ＣＭ＝セントラルメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、ＴＭ＝トランジエントメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、ＥＭ＝エフェクターメモリー（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ＋）、ＴＥ＝ターミナルエフェクター（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ－）；ＭＥＳＦ＝等可溶性蛍光色素の分子として略記される。

【図6E】４５人のＨＩＶ＋個人及び１０人の健康な（ＨＩＶ－）ドナー由来の試料でのα４β７発現分析を示す。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７の発現（％として又はＭＥＳＦにより測定されるレベルとして）はＨＩＶ＋とＨＩＶ－の個人間で比較された。マン・ホイットニーの両側検定により有意に異なる比較だけが図に示されている。Ｔ細胞集団は、Ｎ＋＝ナイーブ（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ－）、ＣＭ＝セントラルメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、ＴＭ＝トランジエントメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、ＥＭ＝エフェクターメモリー（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ＋）、ＴＥ＝ターミナルエフェクター（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ－）；ＭＥＳＦ＝等可溶性蛍光色素の分子として略記される。

【図6F】４５人のＨＩＶ＋個人及び１０人の健康な（ＨＩＶ－）ドナー由来の試料でのα４β７発現分析を示す。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７の発現（％として又はＭＥＳＦにより測定されるレベルとして）はＨＩＶ＋とＨＩＶ－の個人間で比較された。マン・ホイットニーの両側検定により有意に異なる比較だけが図に示されている。Ｔ細胞集団は、Ｎ＋＝ナイーブ（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ－）、ＣＭ＝セントラルメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、ＴＭ＝トランジエントメモリー（ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、ＥＭ＝エフェクターメモリー（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ＋）、ＴＥ＝ターミナルエフェクター（ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ－）；ＭＥＳＦ＝等可溶性蛍光色素の分子として略記される。

【図7A】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを用いたＨＩＶビリオン補足を示す。すべての試験は、ビーズフォーマットでビリオン補足アッセイを用いて行った。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、６種の実験室増殖ＨＩＶ株（図７Ａ～７Ｆ）を５ｎＭ及び１５ｎＭで用いて試験し、陰性対照抗体は１５ｎＭでのみ試験した。補足された試料中のＨＩＶ ｐ２４ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、１０μｇの抗体で被覆したビーズを用いて２人のＨＩＶ感染個人由来の試料でも試験した（図７Ｇ－１及び７Ｇ－２）。デジタルドロプレットＰＣＲにより検出される入力試料（図７Ｇ－１）中の及び補足試料（図７Ｇ－２）中のＨＩＶ ｇａｇＲＮＡの量はコピー／ｍＬで示される。

【図7B】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを用いたＨＩＶビリオン補足を示す。すべての試験は、ビーズフォーマットでビリオン補足アッセイを用いて行った。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、６種の実験室増殖ＨＩＶ株（図７Ａ～７Ｆ）を５ｎＭ及び１５ｎＭで用いて試験し、陰性対照抗体は１５ｎＭでのみ試験した。補足された試料中のＨＩＶ ｐ２４ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、１０μｇの抗体で被覆したビーズを用いて２人のＨＩＶ感染個人由来の試料でも試験した（図７Ｇ－１及び７Ｇ－２）。デジタルドロプレットＰＣＲにより検出される入力試料（図７Ｇ－１）中の及び補足試料（図７Ｇ－２）中のＨＩＶ ｇａｇＲＮＡの量はコピー／ｍＬで示される。

【図7C】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを用いたＨＩＶビリオン補足を示す。すべての試験は、ビーズフォーマットでビリオン補足アッセイを用いて行った。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、６種の実験室増殖ＨＩＶ株（図７Ａ～７Ｆ）を５ｎＭ及び１５ｎＭで用いて試験し、陰性対照抗体は１５ｎＭでのみ試験した。補足された試料中のＨＩＶ ｐ２４ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、１０μｇの抗体で被覆したビーズを用いて２人のＨＩＶ感染個人由来の試料でも試験した（図７Ｇ－１及び７Ｇ－２）。デジタルドロプレットＰＣＲにより検出される入力試料（図７Ｇ－１）中の及び補足試料（図７Ｇ－２）中のＨＩＶ ｇａｇＲＮＡの量はコピー／ｍＬで示される。

【図7D】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを用いたＨＩＶビリオン補足を示す。すべての試験は、ビーズフォーマットでビリオン補足アッセイを用いて行った。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、６種の実験室増殖ＨＩＶ株（図７Ａ～７Ｆ）を５ｎＭ及び１５ｎＭで用いて試験し、陰性対照抗体は１５ｎＭでのみ試験した。補足された試料中のＨＩＶ ｐ２４ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、１０μｇの抗体で被覆したビーズを用いて２人のＨＩＶ感染個人由来の試料でも試験した（図７Ｇ－１及び７Ｇ－２）。デジタルドロプレットＰＣＲにより検出される入力試料（図７Ｇ－１）中の及び補足試料（図７Ｇ－２）中のＨＩＶ ｇａｇＲＮＡの量はコピー／ｍＬで示される。

【図7E】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを用いたＨＩＶビリオン補足を示す。すべての試験は、ビーズフォーマットでビリオン補足アッセイを用いて行った。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、６種の実験室増殖ＨＩＶ株（図７Ａ～７Ｆ）を５ｎＭ及び１５ｎＭで用いて試験し、陰性対照抗体は１５ｎＭでのみ試験した。補足された試料中のＨＩＶ ｐ２４ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、１０μｇの抗体で被覆したビーズを用いて２人のＨＩＶ感染個人由来の試料でも試験した（図７Ｇ－１及び７Ｇ－２）。デジタルドロプレットＰＣＲにより検出される入力試料（図７Ｇ－１）中の及び補足試料（図７Ｇ－２）中のＨＩＶ ｇａｇＲＮＡの量はコピー／ｍＬで示される。

【図7F】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを用いたＨＩＶビリオン補足を示す。すべての試験は、ビーズフォーマットでビリオン補足アッセイを用いて行った。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、６種の実験室増殖ＨＩＶ株（図７Ａ～７Ｆ）を５ｎＭ及び１５ｎＭで用いて試験し、陰性対照抗体は１５ｎＭでのみ試験した。補足された試料中のＨＩＶ ｐ２４ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、１０μｇの抗体で被覆したビーズを用いて２人のＨＩＶ感染個人由来の試料でも試験した（図７Ｇ－１及び７Ｇ－２）。デジタルドロプレットＰＣＲにより検出される入力試料（図７Ｇ－１）中の及び補足試料（図７Ｇ－２）中のＨＩＶ ｇａｇＲＮＡの量はコピー／ｍＬで示される。

【図7G-1】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを用いたＨＩＶビリオン補足を示す。すべての試験は、ビーズフォーマットでビリオン補足アッセイを用いて行った。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、６種の実験室増殖ＨＩＶ株（図７Ａ～７Ｆ）を５ｎＭ及び１５ｎＭで用いて試験し、陰性対照抗体は１５ｎＭでのみ試験した。補足された試料中のＨＩＶ ｐ２４ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、１０μｇの抗体で被覆したビーズを用いて２人のＨＩＶ感染個人由来の試料でも試験した（図７Ｇ－１及び７Ｇ－２）。デジタルドロプレットＰＣＲにより検出される入力試料（図７Ｇ－１）中の及び補足試料（図７Ｇ－２）中のＨＩＶ ｇａｇＲＮＡの量はコピー／ｍＬで示される。

【図7G-2】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを用いたＨＩＶビリオン補足を示す。すべての試験は、ビーズフォーマットでビリオン補足アッセイを用いて行った。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、６種の実験室増殖ＨＩＶ株（図７Ａ～７Ｆ）を５ｎＭ及び１５ｎＭで用いて試験し、陰性対照抗体は１５ｎＭでのみ試験した。補足された試料中のＨＩＶ ｐ２４ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、１０μｇの抗体で被覆したビーズを用いて２人のＨＩＶ感染個人由来の試料でも試験した（図７Ｇ－１及び７Ｇ－２）。デジタルドロプレットＰＣＲにより検出される入力試料（図７Ｇ－１）中の及び補足試料（図７Ｇ－２）中のＨＩＶ ｇａｇＲＮＡの量はコピー／ｍＬで示される。

【図8A】ＦｃγＲに結合する免疫複合体（異なる抗体を有するＨＩＶビリオン）を示す。免疫複合体は、抗体（Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、ＦｃγＲ結合を著しく減少させるＬＡＬＡ突然変異を有するＡｂ－ｈ１．９ｄ、Ａｂ－Ｖｅｄｏ及びアイソタイプネガティブコントロール）をＨＩＶ ＮＬ４－３と一緒にインキュベートすることにより先ず形成され、その後プレート上に固定化されたＦｃγＲ上で補足された。ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）はニッケルプレート上で補足され、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）は、検出感度を高めるためのニュートラアビジンプレート上で補足された。検出されるＨＩＶ ｐ２４ ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。代表的な実験の結果が示されている。

【図8B】ＦｃγＲに結合する免疫複合体（異なる抗体を有するＨＩＶビリオン）を示す。免疫複合体は、抗体（Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、ＦｃγＲ結合を著しく減少させるＬＡＬＡ突然変異を有するＡｂ－ｈ１．９ｄ、Ａｂ－Ｖｅｄｏ及びアイソタイプネガティブコントロール）をＨＩＶ ＮＬ４－３と一緒にインキュベートすることにより先ず形成され、その後プレート上に固定化されたＦｃγＲ上で補足された。ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）はニッケルプレート上で補足され、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）は、検出感度を高めるためのニュートラアビジンプレート上で補足された。検出されるＨＩＶ ｐ２４ ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。代表的な実験の結果が示されている。

【図8C】ＦｃγＲに結合する免疫複合体（異なる抗体を有するＨＩＶビリオン）を示す。免疫複合体は、抗体（Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、ＦｃγＲ結合を著しく減少させるＬＡＬＡ突然変異を有するＡｂ－ｈ１．９ｄ、Ａｂ－Ｖｅｄｏ及びアイソタイプネガティブコントロール）をＨＩＶ ＮＬ４－３と一緒にインキュベートすることにより先ず形成され、その後プレート上に固定化されたＦｃγＲ上で補足された。ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）はニッケルプレート上で補足され、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）は、検出感度を高めるためのニュートラアビジンプレート上で補足された。検出されるＨＩＶ ｐ２４ ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。代表的な実験の結果が示されている。

【図8D】ＦｃγＲに結合する免疫複合体（異なる抗体を有するＨＩＶビリオン）を示す。免疫複合体は、抗体（Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、ＦｃγＲ結合を著しく減少させるＬＡＬＡ突然変異を有するＡｂ－ｈ１．９ｄ、Ａｂ－Ｖｅｄｏ及びアイソタイプネガティブコントロール）をＨＩＶ ＮＬ４－３と一緒にインキュベートすることにより先ず形成され、その後プレート上に固定化されたＦｃγＲ上で補足された。ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）はニッケルプレート上で補足され、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）は、検出感度を高めるためのニュートラアビジンプレート上で補足された。検出されるＨＩＶ ｐ２４ ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。代表的な実験の結果が示されている。

【図8E】ＦｃγＲに結合する免疫複合体（異なる抗体を有するＨＩＶビリオン）を示す。免疫複合体は、抗体（Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、ＦｃγＲ結合を著しく減少させるＬＡＬＡ突然変異を有するＡｂ－ｈ１．９ｄ、Ａｂ－Ｖｅｄｏ及びアイソタイプネガティブコントロール）をＨＩＶ ＮＬ４－３と一緒にインキュベートすることにより先ず形成され、その後プレート上に固定化されたＦｃγＲ上で補足された。ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）はニッケルプレート上で補足され、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）は、検出感度を高めるためのニュートラアビジンプレート上で補足された。検出されるＨＩＶ ｐ２４ ｇａｇの量は、アッセイされる１０μＬ中ｐｇ／ｍＬで示される。代表的な実験の結果が示されている。

【図9A】ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７被覆ビーズのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ媒介取込みのα４β７－及びＦｃ依存性を示す。複合体で３時間処置されたＴＨＰ－１細胞における免疫複合体（α４β７被覆ビーズ及び示された抗α４β７又は対照抗体を含有する）の食作用スコアーがプロットされている。図９Ａは、１つの代表的な実験のデータを示す。

【図9B】ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７被覆ビーズのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ媒介取込みのα４β７－及びＦｃ依存性を示す。複合体で３時間処置されたＴＨＰ－１細胞における免疫複合体（α４β７被覆ビーズ及び示された抗α４β７又は対照抗体）の食作用スコアーがプロットされている。図９Ｂは、３つの独立した実験の正規化されたデータを示す。有意性は、テューキー多重比較検定と連結させた一元配置分散分析を使用して決定された。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、^＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、^＊ｐ＝０．０１～０．０５、ｎｓ≧０．０５。

【図9C】ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７被覆ビーズのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ媒介取込みのα４β７－及びＦｃ依存性を示す。複合体で３時間処置されたＴＨＰ－１細胞における免疫複合体（α４β７被覆ビーズ及び示された抗α４β７又は対照抗体）の食作用スコアーがプロットされている。図９Ｃは、イメージサイトメトリーにより得られた、３種の内部移行されたα４β７被覆ビーズとのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ免疫複合体処置細胞の代表的な画像を示す。

【図10】α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ（ウイルス様粒子）への抗α４β７抗体の結合を示す。ＶＬＰへのＡｂの結合はＥＬＩＳＡを使用して判定された。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ及びＡｂ－Ｖｅｄｏは、類似するＥＣ_５０値でα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ被覆プレートに結合した。２つの独立した実験の代表的データが示されている。

【図11A】ＴＨＰ－１細胞によるＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ媒介α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ（ウイルス様粒子）取込みのα４β７－及びＦｃ依存性を示す。図１１Ａは、フローサイトメトリーにより測定されるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとしてのＴＨＰ－１細胞によるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ取込みを示す。図１０Ａ～１０Ｂで提示される平均±ｓ．ｄ．はそれぞれ４つ及び３つの独立した実験から収集された。有意性（^＊＊＊＊ｐ＝５．４×１０^－５）は両側スチューデントｔ検定により計算され、ｐ＜０．０５は有意であるとみなされる。

【図11B】ＴＨＰ－１細胞によるＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ媒介α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ（ウイルス様粒子）取込みのα４β７－及びＦｃ依存性を示す。図１１Ｂは、ラトランクリンＡ（ＬａｔＡ）によるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ取込みの阻害を示す。図１１Ｂでは、ＴＨＰ－１細胞はＬａｔＡで２時間前処置され、次に図１１Ａと同じくＶＬＰ及び抗体と一緒にインキュベートされた。

【図12A】異なる抗体によるα４β７とのＨＩＶ ｇｐ１２０の相互作用の阻害を示す。図１２Ａは、ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドへのＲＰＭＩ ８８６６細胞の結合を示すが、対照ペプチドには結合しない。ＲＰＭＩ ８８６６細胞は、細胞表面でα４β７を構成的に発現する。ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドとＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２対照ペプチドは、α４β７とｇｐ１２０の間の結合を媒介すると報告されている４個のアミノ酸が対照ペプチドの中では突然変異していることを除いて配列が同一であった。

【図12B】異なる抗体によるα４β７とのＨＩＶ ｇｐ１２０の相互作用の阻害を示す。図１２Ｂは、異なる抗体によるα４β７を発現するＲＰＭＩ ８８６６細胞へのＨＩＶ ｇｐ１２０ペプチドの結合の阻害を示す。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７を発現するＲＰＭＩ ８８６６細胞へのＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドの結合を阻害するのはＡｂ－Ｖｅｄｏよりも強力であった。

【図13】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが結合するヒト及びカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのパーセンテージを示す。ヒト及びカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、フローサイトメトリー分析により評価された。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが結合するα４β７＋Ｔ細胞サブセットのパーセンテージが決定された。データは、３人のヒト及び５頭のカニクイザルドナーから得られた。

【図14A】種々のインテグリンへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性を示す。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性は、ヒト（１４Ａ、１４Ｃ及び１４Ｅ）又はカニクイザルインテグリン（１４Ｂ、１４Ｄ及び１４Ｆ）を発現する組換え細胞上で評価された。α４β１（図１４Ｃ／１４Ｄ）及びαＥβ７（図１４Ｅ／１４Ｆ）インテグリンと比べた標的インテグリンα４β７（図１４Ａ／１４Ｂ）への結合。Ａｂ－Ｎａｔａ及びエトロリズマブ（ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）由来Ａｂ－Ｅｔｒｏをそれぞれα４及びβ７インテグリン特異的陽性対照として、並びにＡｂ－Ｃｔｅｔをアイソタイプコントロールとして使用した。ＦＡＣＳ結合結果は、滴定されたｍＡｂについてのＭＦＩとして表される。Ｎ＝１。

【図14B】種々のインテグリンへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性を示す。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性は、ヒト（１４Ａ、１４Ｃ及び１４Ｅ）又はカニクイザルインテグリン（１４Ｂ、１４Ｄ及び１４Ｆ）を発現する組換え細胞上で評価された。α４β１（図１４Ｃ／１４Ｄ）及びαＥβ７（図１４Ｅ／１４Ｆ）インテグリンと比べた標的インテグリンα４β７（図１４Ａ／１４Ｂ）への結合。Ａｂ－Ｎａｔａ及びエトロリズマブ（ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）由来Ａｂ－Ｅｔｒｏをそれぞれα４及びβ７インテグリン特異的陽性対照として、並びにＡｂ－Ｃｔｅｔをアイソタイプコントロールとして使用した。ＦＡＣＳ結合結果は、滴定されたｍＡｂについてのＭＦＩとして表される。Ｎ＝１。

【図14C】種々のインテグリンへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性を示す。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性は、ヒト（１４Ａ、１４Ｃ及び１４Ｅ）又はカニクイザルインテグリン（１４Ｂ、１４Ｄ及び１４Ｆ）を発現する組換え細胞上で評価された。α４β１（図１４Ｃ／１４Ｄ）及びαＥβ７（図１４Ｅ／１４Ｆ）インテグリンと比べた標的インテグリンα４β７（図１４Ａ／１４Ｂ）への結合。Ａｂ－Ｎａｔａ及びエトロリズマブ（ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）由来Ａｂ－Ｅｔｒｏをそれぞれα４及びβ７インテグリン特異的陽性対照として、並びにＡｂ－Ｃｔｅｔをアイソタイプコントロールとして使用した。ＦＡＣＳ結合結果は、滴定されたｍＡｂについてのＭＦＩとして表される。Ｎ＝１。

【図14D】種々のインテグリンへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性を示す。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性は、ヒト（１４Ａ、１４Ｃ及び１４Ｅ）又はカニクイザルインテグリン（１４Ｂ、１４Ｄ及び１４Ｆ）を発現する組換え細胞上で評価された。α４β１（図１４Ｃ／１４Ｄ）及びαＥβ７（図１４Ｅ／１４Ｆ）インテグリンと比べた標的インテグリンα４β７（図１４Ａ／１４Ｂ）への結合。Ａｂ－Ｎａｔａ及びエトロリズマブ（ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）由来Ａｂ－Ｅｔｒｏをそれぞれα４及びβ７インテグリン特異的陽性対照として、並びにＡｂ－Ｃｔｅｔをアイソタイプコントロールとして使用した。ＦＡＣＳ結合結果は、滴定されたｍＡｂについてのＭＦＩとして表される。Ｎ＝１。

【図14E】種々のインテグリンへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性を示す。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性は、ヒト（１４Ａ、１４Ｃ及び１４Ｅ）又はカニクイザルインテグリン（１４Ｂ、１４Ｄ及び１４Ｆ）を発現する組換え細胞上で評価された。α４β１（図１４Ｃ／１４Ｄ）及びαＥβ７（図１４Ｅ／１４Ｆ）インテグリンと比べた標的インテグリンα４β７（図１４Ａ／１４Ｂ）への結合。Ａｂ－Ｎａｔａ及びエトロリズマブ（ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）由来Ａｂ－Ｅｔｒｏをそれぞれα４及びβ７インテグリン特異的陽性対照として、並びにＡｂ－Ｃｔｅｔをアイソタイプコントロールとして使用した。ＦＡＣＳ結合結果は、滴定されたｍＡｂについてのＭＦＩとして表される。Ｎ＝１。

【図14F】種々のインテグリンへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性を示す。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性は、ヒト（１４Ａ、１４Ｃ及び１４Ｅ）又はカニクイザルインテグリン（１４Ｂ、１４Ｄ及び１４Ｆ）を発現する組換え細胞上で評価された。α４β１（図１４Ｃ／１４Ｄ）及びαＥβ７（図１４Ｅ／１４Ｆ）インテグリンと比べた標的インテグリンα４β７（図１４Ａ／１４Ｂ）への結合。Ａｂ－Ｎａｔａ及びエトロリズマブ（ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）由来Ａｂ－Ｅｔｒｏをそれぞれα４及びβ７インテグリン特異的陽性対照として、並びにＡｂ－Ｃｔｅｔをアイソタイプコントロールとして使用した。ＦＡＣＳ結合結果は、滴定されたｍＡｂについてのＭＦＩとして表される。Ｎ＝１。

【図15】ＨＥＫ２９３細胞におけるＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの非特異的結合評価を示す。ＨＥＫ２９３細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの非特異的結合はフローサイトメトリー分析により評価された。１００μｇ／ｍＬ試験濃度では、陽性対照は高い結合を示し、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとアイソタイプコントロールＡｂ－ｃＴｅｔの両方では観察された結合はごくわずかであった。試験ｍＡｂ（Ａ）に結合するパーセンテージＨＥＫ２９３細胞及び試験ｍＡｂ（Ｂ）による結合強度のＭＦＩが提示される。Ｎ＝２。

【図16A】ヒト一次細胞上でのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はＡｂ－Ｖｅｄｏとのα４β７複合体の内部移行を示す。図１６Ａは、末梢血ヒトドナー由来のＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔナイーブ細胞上でのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの内部移行を示す。２人のドナー由来のドットプロットは、処置後１８時間で４又は３７℃でのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを用いた処置によるα４β７細胞のパーセンテージを示す。細胞表面に残るα４β７は、Ａｌｅｘａ－６４７標識抗β７ Ａｂ－Ｅｔｒｏを用いて検出された。

【図16B】ヒト一次細胞上でのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はＡｂ－Ｖｅｄｏとのα４β７複合体の内部移行を示す。図１６Ｂは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴで処置されたＴ細胞サブセットにおけるα４β７内部移行（４℃での処置後に観察される発現に関係する減少した表面α４β７発現）の定量化を示す。（Ｎ＝２人のドナー）。ナイーブ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋と定義された。

【図17A】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でＭＡｄＣＡＭ－１共刺激シグナルを遮断することを示す。図１７Ａでは、アイソタイプコントロールＡｂ及びＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの存在下での抗ＣＤ３及びＭＡｄＣＡＭ－１によるヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、フローサイトメトリー分析によりＫｉ６７＋ＣＤ２５＋細胞（Ｘ軸はＫｉ６７＋、Ｙ軸はＣＤ２５＋）のパーセンテージとして測定された。このデータは代表的なドナーのものである。

【図17B】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でＭＡｄＣＡＭ－１共刺激シグナルを遮断することを示す。図１７Ｂでは、アイソタイプコントロールＡｂ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びＡｂ－Ｖｅｄｏの存在下での抗ＣＤ３及びＭＡｄＣＡＭ－１によるヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、Ｋｉ６７＋ＣＤ２５＋細胞（Ｙ軸上）のパーセンテージとして測定された。データは６人の個々の健康なドナーのものである。統計分析は、両側パラメトリック対応ありｔ検定を使用して実施された：^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。

【図18】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがＶＣＡＭ－１媒介細胞接着を遮断しないことを示す。ＶＣＡＭ－１へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴによる細胞接着遮断は、ＨｕＴ７８細胞接着アッセイを使用して判定された。Ａｂ－Ｎａｔａ、抗α４ｍＡｂは陽性対照としての役目を果たし、Ａｂ－ｃＴｅｔは陰性対照として使用された。発光の減少（ＲＬＵ）がリガンド遮断のせいで細胞結合の減少を示す代表的なデータが示される。Ｎ＝３。

【図19A】フローサイトメトリーにより、Ａｂ－Ｖｅｄｏと比べたヒトＦｃγＲ発現細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合を示す。ヒトＦｃγＲへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ（図１９Ａ）及びＡｂ－Ｖｅｄｏ（図１９Ｂ）の結合は、種々の細胞表面ヒトＦｃγＲを発現する操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を使用することにより分析され、蛍光の幾何平均により表される。Ｎ＝１。

【図19B】フローサイトメトリーにより、Ａｂ－Ｖｅｄｏと比べたヒトＦｃγＲ発現細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合を示す。ヒトＦｃγＲへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ（図１９Ａ）及びＡｂ－Ｖｅｄｏ（図１９Ｂ）の結合は、種々の細胞表面ヒトＦｃγＲを発現する操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を使用することにより分析され、蛍光の幾何平均により表される。Ｎ＝１。

【図20A】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのレポーターベースのＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を示す。Ｆｃ媒介ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を誘導するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの能力は、レポーターアッセイにより評価された。（図２０Ａ）操作されたジャーカットヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８＋エフェクターレポーター細胞及びＲＰＭＩ８８６６標的細胞を使用した場合のＡＤＣＣ活性；Ｎ＝２。

【図20B】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのレポーターベースのＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を示す。Ｆｃ媒介ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を誘導するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの能力は、レポーターアッセイにより評価された。（図２０Ｂ）操作されたジャーカットヒトＦｃγＲＩＩａ Ｈ１３１＋エフェクターレポーター細胞及びＲＰＭＩ８８６６標的細胞を使用した場合のＡＤＣＰ活性；Ｎ＝２。Ａｂ－Ｒｉｔｕは、アッセイでの陽性対照として使用された。結果は発光（ＲＬＵ）により表され；高シグナルはＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を示す。

【図21】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＣＤＣ活性を示す。Ｆｃ媒介ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＤＣ活性を誘導するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの能力は、ＲＰＭＩ８８６６標的細胞及びヒト血清を補体因子の供給源として使用して評価された；Ｎ＝試験された２ドナー血清。Ａｂ－Ｒｉｔｕは陽性対照として使用された。結果はパーセンテージ細胞殺傷として表される；高い細胞殺傷ほどＣＤＣ活性を示す。

【図22】Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの細胞傷害性ベースのＡＤＣＣ活性を示す。Ｆｃ媒介ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣを誘導するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの能力は、ＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイにおいて、標的細胞としてＨｕＴ７８を及びエフェクター細胞として２人のドナー由来のヒト一次ＮＫ細胞を使用して評価された。標的細胞殺傷（細胞傷害性）は両ドナーについてパーセンテージＡＤＣＣにより表される。

【発明を実施するための形態】

【0013】

理論に拘束されるものではないが、本発明の実施形態は、以下の２つの主要な作用機構を介してＨＩＶ感染に対するウイルス制御を発揮すると仮定される：１）Ｆａｂ依存性機構：α４β７と、ＭＡｄＣＡＭ－１及びＨＩＶ ｇｐ１２０などのそのリガンドとの相互作用を遮断し、それにより、これらのリガンドのシグナル伝達によって媒介されるＣＤ４＋ Ｔ細胞の共刺激を阻害し、これらの刺激された細胞におけるＨＩＶ複製（Ｎａｗａｚら、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８、Ｌｉｖｉａら、ＰＮＡＳ．２０２０）、消化器組織のＨＩＶ感染（Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７）及び細胞間ウイルス伝播（Ａｒｔｈｏｓら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８）をそれぞれ抑制すること、並びに２）Ｆｃ依存性機構：抗α４β７ ｍＡｂはα４β７＋ ＨＩＶビリオンに結合し、免疫複合体を形成し、この免疫複合体は、ｍＡｂ Ｆｃドメインと、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＦｃγＲとの相互作用を通じて内部移行し、プロセシングされ、結果として得られたウイルスペプチドが続いてＡＰＣの表面上に提示されて、新しく耐久性のあるＨＩＶ特異的免疫反応を誘発して、ウイルス複製を抑制する、「ワクチン接種効果」を誘導すること（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１８；Ｎａｒａｎｊｏ－Ｇｏｍｅｚら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ＨＩＶ ＡＩＤＳ ２０１９）。

【0014】

α４β７インテグリンは、通常、そのリガンドに対して低い親和性で休止（不活性）状態にある。活性化されると、これは、高い親和性でそのリガンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１及びｇｐ１２０）に結合することができる（Ｙｅら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２；Ｌｅｒｔｊｕｔｈａｐｏｒｎら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、２０１８）。ＨＩＶ感染中、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ２領域におけるモチーフは、ＭＡｄＣＡＭ－１を模倣し、α４β７に結合することができる（Ｐｅａｃｈｍａｎら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、２０１５）。α４β７とｇｐ１２０との相互作用は、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）の活性化を誘導し、ウイルス学的シナプスの形成を潜在的に誘導し、それによって、ＨＩＶの細胞間伝播を増強する（Ａｒｔｈｏｓら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８）。細胞間伝播は、組織内でのウイルスの拡散を促進するために不可欠であり、ウイルスの伝播には無細胞ウイルスよりも重要である。α４β７に結合すると、本発明の実施形態は、α４β７とｇｐ１２０との相互作用を破壊することにより、ＨＩＶのα４β７媒介性細胞間伝播を低減させ、細胞へのα４β７抗体結合複合体の内部移行を誘導することができる又はα４β７を不活性化することができる。したがって、本発明の実施形態は、組織内のＨＩＶ複製及びウイルスの拡散を阻害する能力を示す。

【0015】

ウイルスタンパク質の代わりにα４β７のヒトタンパク質を標的とすることにより、本発明の実施形態は、ＨＩＶの高い突然変異頻度のためにウイルスタンパク質を標的とする処置に通常関連するウイルス耐性突然変異の出現を誘導しない。

【0016】

６．１．略語
本明細書に記載されている抗体は、多くの実施形態では、それらのそれぞれのポリペプチド配列によって記載されている。別段の指示がない限り、ポリペプチド配列は、Ｎ→Ｃ方向において提供されている。

【0017】

本明細書に記載されているポリヌクレオチドは、多くの実施形態では、それらのそれぞれのポリヌクレオチド配列によって記載されている。別段の指示がない限り、５’→３’方向のポリヌクレオチド配列。

【0018】

ポリペプチド配列に関して、以下の表１に示されているように、遺伝的にコードされたアミノ酸についての従来の３文字又は１文字の略語が使用され得る。

【0019】

【表1】

【0020】

ある特定の配列は、ある特定のクラス（例えば、脂肪族、疎水性など）に属するアミノ酸残基を特定する構造式によって定義される。本明細書で使用される場合、遺伝的にコードされたアミノ酸が属する様々なクラスは、以下の表２に示されている。一部のアミノ酸は、１つより多いクラスに属する場合がある。スルフヒドリル基を含有するシステイン、及び立体構造的に制限されているプロリンには、クラスが割り当てられていない。

【0021】

【表2】

【0022】

様々な例示的な実施形態を通して使用されている略語は、以下の表３に提供されているものを含む：

【0023】

【表3】

【0024】

６．２．定義
本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して使用されている科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。

【0025】

本明細書で使用される場合、抗体アミノ酸残基の番号付けは、別段の指示がない限り、ＥＵ番号付けスキームに従って行われる。

【0026】

６．３．抗α４β７抗体
一態様では、本開示は、α４β７ヘテロ二量体インテグリン受容体（ａ４ｂ７、ＬＰＡＭ－１、リンパ球パイエル板接着分子１、並びにインテグリンアルファ－４及びインテグリンベータ－７の二量体としても知られている）に特異的に結合する抗体に関する。

【0027】

本明細書で使用される場合、「抗体」（Ａｂ）という用語は、特定の抗原、例えば、α４β７に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。一部の実施形態では、本開示の抗α４β７抗体は、ヒトα４β７に結合し、それによって免疫系をモジュレートする。本開示の抗α４β７抗体は、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域としても知られている、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。当該技術分野で知られているように、抗体の超可変領域を示すアミノ酸位置／境界は、文脈及び当該技術分野で知られている様々な定義に応じて変化し得る。可変ドメイン内のいくつかの位置は、それらの位置が、ある一連の基準の下では超可変領域内にあると判断され得るのに対して、異なる一連の基準の下では超可変領域外にあると判断され得るという点で、ハイブリッド超可変位置とみなされ得る。また、これらの位置の１つ以上は、拡張された超可変領域にも見出され得る。本開示は、これらのハイブリッド超可変位置における修飾を含む抗体を提供する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの各々は、主にβシート構造をとることによって３つのＣＤＲによって接続される４つのＦＲ領域を含み、この３つのＣＤＲは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域に近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の標的結合部位の形成に寄与する。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ． １９８７）を参照のこと。

【0028】

本開示の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体などを含むが、これらに限定されない、ポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作された、及び／又は別様で性質が修飾されたものであってもよい。様々な実施形態では、抗体は、抗体の定常領域の全て又は一部を含む。一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ_１又はＩｇＡ_２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４）及びＩｇＭから選択されるアイソタイプである。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗α４β７抗体はＩｇＧ_１を含む。他の実施形態では、抗α４β７抗体はＩｇＧ_２を含む。さらに他の実施形態では、抗α４β７抗体はＩｇＧ_４を含む。本明細書で使用される場合、抗体の「定常領域」には、ヒトＩｇＧ_１におけるＴ２５０Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｍ４２８Ｌ及び／又はＡ４３１Ｇのいずれかなどの、天然の定常領域、アロタイプ又はバリアントが含まれる。

【0029】

抗α４β７抗体の軽定常領域は、カッパ（κ）軽鎖領域又はラムダ（λ）領域であり得る。λ軽鎖領域は、既知のサブタイプ、例えば、λ_１、λ_２、λ_３又はλ_４のうちのいずれか１つであり得る。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、カッパ（κ）軽鎖領域を含む。

【0030】

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で利用可能又は公知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物又はファージのクローンを含む、単一クローンから誘導される。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術又はそれらの組合せの使用を含む、当該技術分野で公知の多種多様な技術を使用して調製され得る。

【0031】

本明細書で使用される場合、「キメラ」抗体という用語は、ラット又はマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列、及び典型的にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。

【0032】

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものも含むことができる。

【0033】

「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてのトランスジェニック動物から単離され、内因性の機能的免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む、当該技術分野で公知の様々な方法によって作製され得る。

【0034】

本開示の抗α４β７抗体は、全長（インタクトな）抗体分子を含む。

【0035】

抗α４β７抗体は、少なくとも１つの定常領域により媒介される生物学的エフェクター機能を変化させるために、その配列が修飾された抗体であり得る。例えば、一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、未修飾抗体と比較して少なくとも１つの定常領域により媒介される生物学的エフェクター機能を低減させるために修飾され得、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／又はＦｃγＲＩＩＩｂなどのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）の１つ以上への結合が低減され得る。ＦｃγＲ結合は、ＦｃγＲ相互作用に必要な特定の領域における抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることによって低減され得る（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１４８３～１４９１；並びにＬｕｎｄら、１９９１、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：２６５７～２６６２を参照のこと）。抗体のＦｃγＲ結合能力の低減は、オプソニン作用、食作用及び抗原依存性細胞傷害性（「ＡＤＣＣ」）などのＦｃγＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能も低減させることができる。

【0036】

本明細書に記載されている抗α４β７抗体は、例えば、ＦｃγＲ相互作用を増強するために、未修飾抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域により媒介される生物学的エフェクター機能を獲得又は改善するように修飾された抗体を含む（例えば、米国特許出願第２００６／０１３４７０９号を参照のこと）。例えば、本開示の抗α４β７抗体は、対応する未修飾定常領域よりも高い親和性で、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／又はＦｃγＲＩＩＩｂに結合する定常領域を有することができる。

【0037】

抗α４β７抗体のＦｃγＲ結合及び／又はＡＤＣＣエフェクター機能を修飾することができるさらなる置換は、Ｆｃ領域におけるＫ３２２Ａ置換又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ二重置換を含む。例えば、Ｈｅｚａｒｅｈら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７５（２４）：１２１６１～１２１６８（２００１）を参照のこと。

【0038】

本開示の抗α４β７抗体は、対応する野生型ＣＨ２又はＦｃ領域の結合と比較して、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を増加させる及び／又はＦｃγＲＩＩＩａへの結合を低減させるアミノ酸置換を含む修飾（又はバリアント）ＣＨ２ドメイン又はＦｃドメイン全体を含むことができる。バリアントＣＨ２又はバリアントＦｃドメインは、２６３位、２６６位、２７３位及び３０５位に１つ以上の置換を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、野生型ＣＨ２ドメインに対して、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５Ｋ及びＶ３０５Ｗから選択される１つ以上の置換を含む。

【0039】

対応する野生型ＣＨ２又はＦｃ領域の結合と比較して、ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増加及び／又はＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低減をもたらすことができるバリアントＣＨ２又はバリアントＦｃドメインの他の例には、ヒトＩｇＧ_１におけるＳ２６７Ｅ又はＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆなどの、Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９（５）、１０３５～１０４３（２０１３）に見出されるものが含まれる。

【0040】

ヒトＩｇＧ_４定常領域を含む抗α４β７抗体は、Ｆａｂアーム交換を阻止することが報告されている、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むことができる。例えば、Ｓｉｌｖａ，ＪＰら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９０（９）、５４６２～５４６９（２０１５）を参照のこと。

【0041】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、例えば、ＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域における免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることによって、胎児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎに対するそれらの結合親和性を増加又は減少させる修飾を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧクラスの抗α４β７抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４及び４２８のうちの少なくとも１つが単独で又はそれらの任意の組合せで置換されるように突然変異される。２５０位については、置換アミノ酸残基は、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含む、スレオニン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。３１４位については、置換アミノ酸残基は、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含む、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。４２８位については、置換アミノ酸残基は、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含む、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。Ｆｃエフェクター機能を修飾することが知られている例示的な置換は、Ｆｃ置換Ｔ２５０Ｑと組み合わせて生じ得る、Ｆｃ置換Ｍ４２８Ｌである。適切なアミノ酸置換の追加の具体的な組合せは、米国特許第７，２１７，７９７号の表１に特定されている。このような突然変異は、ＦｃＲｎへの結合を増加させ、抗体を分解から保護し、その半減期を延長させる。

【0042】

ヒトα４β７に対して高い親和性を有する抗α４β７抗体は、治療及び診断用途に望ましい場合がある。したがって、本開示は、ヒトα４β７に対して高い結合親和性を有する抗体を企図する。具体的な実施形態では、抗α４β７抗体は、少なくとも約１００ｎＭの親和性でヒトα４β７に結合するが、より高い親和性、例えば、少なくとも約９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ又はさらにそれ以上を示し得る。一部の実施形態では、抗体は、約１ｐＭ～約１０ｎＭ、約１００ｐＭ～約１０ｎＭ、約１００ｐＭ～約１ｎＭの範囲の親和性又は前述の値のいずれかの間の範囲の親和性でヒトα４β７に結合する。

【0043】

ヒトα４β７に対する抗α４β７抗体の親和性は、例えば、限定の目的ではないが、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴又は蛍光偏光アッセイなどの、当該技術分野で周知である又は本明細書に記載されている技術を使用して決定され得る。

【0044】

抗α４β７抗体は、一般に、本明細書において（Ｎ→Ｃの順で）、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ＃１、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ＃２及びＶ_Ｈ ＣＤＲ＃３と称される３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有する可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む重鎖、並びに本明細書において（Ｎ→Ｃの順で）、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ＃１、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ＃２及びＶ_Ｌ ＣＤＲ＃３と称される３つの相補性決定領域を有する可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む軽鎖を含む。例示的なＣＤＲのアミノ酸配列並びに例示的な抗α４β７の重鎖及び軽鎖のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列が本明細書に提供されている。抗α４β７抗体の具体的な実施形態には、これらの例示的なＣＤＲ並びに／又はＶ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ配列、並びにこのような抗体とヒトα４β７の結合について競合する抗体が含まれる。

【0045】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、ヒトへの投与に適している。具体的な実施形態では、抗α４β７抗体は、ヒト化されている。

【0046】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、表４の配列から選択される。

【0047】

【表4】

【0048】

上記のＣＤＲを有する抗α４β７抗体の具体的な例示的な実施形態は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６及び３７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号４２、４３、４４、４５、４６及び４７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号５２、５３、５４、５５、５６及び５７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号６２、６３、６４、６５、６６及び６７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号７２、７３、７４、７５、７６及び７７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号８２、８３、８４、８５、８６及び８７のＣＤＲを有する。

【0049】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５の配列から選択されるＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖を含む：

【0050】

【表5】

【0051】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号１０に対応するＶ_Ｈ鎖、及び配列が配列番号１１に対応するＶ_Ｌ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号２０又は２２～２３のいずれか１つに対応するＶ_Ｈ鎖、及び配列が配列番号２５又は２７～２８のいずれか１つに対応するＶ_Ｌ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号２１のバリアントに対応するＶ_Ｈ鎖、及び配列が配列番号２６のバリアントに対応するＶ_Ｌ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号４０に対応するＶ_Ｈ鎖、及び配列が配列番号４１に対応するＶ_Ｌ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号５０に対応するＶ_Ｈ鎖、及び配列が配列番号５１に対応するＶ_Ｌ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号６０に対応するＶ_Ｈ鎖、及び配列が配列番号６１に対応するＶ_Ｌ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号７０に対応するＶ_Ｈ鎖、及び配列が配列番号７１に対応するＶ_Ｌ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号８０に対応するＶ_Ｈ鎖、及び配列が配列番号８１に対応するＶ_Ｌ鎖を含む。

【0052】

当業者であれば、本明細書に記載されている抗α４β７抗体におけるＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ配列のある特定の突然変異は、本開示の範囲内の抗α４β７抗体をもたらすことを理解する。突然変異は、有意な抗α４β７活性を保持しながら、本明細書に開示されているＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ配列からのアミノ酸置換、付加又は欠失を含むことができる。したがって、一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶ_Ｈ配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶ_Ｈ配列を含む。抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶ_Ｈ配列と比較して、最大で８個まで、最大で７個まで、最大で６個まで、最大で５個まで、最大で４個まで、最大で３個まで又は最大で２個までの突然変異を有するＶ_Ｈ配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶ_Ｈ配列と比較して、５個以下、４個以下、３個以下又は２個以下の突然変異を有するＶ_Ｈ配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、単一のアミノ酸置換を有するＶ_Ｈ配列を含む。一部の実施形態では、Ｖ_Ｈ配列における突然変異は、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ＃１、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ＃２又はＶ_Ｈ ＣＤＲ＃３に位置する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶ_Ｌ配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶ_Ｌ配列を含む。抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶ_Ｌ配列と比較して、最大で８個まで、最大で７個まで、最大で６個まで、最大で５個まで、最大で４個まで、最大で３個まで又は最大で２個までの突然変異を有するＶ_Ｌ配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶ_Ｌ配列と比較して、５個以下、４個以下、３個以下又は２個以下の突然変異を有するＶ_Ｌ配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、単一のアミノ酸置換を有するＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ配列における突然変異は、ＶＬ ＣＤＲ＃１、ＶＬ ＣＤＲ＃２又はＶＬ ＣＤＲ＃３に位置する。

【0053】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表６の配列から選択される重鎖アミノ酸配列及び／又は軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0054】

【表6】

【0055】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９０に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９２に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９４に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９６に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９８に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。

【0056】

抗体重鎖のＣ末端上の１つ以上（例えば、１、２、３又はそれ以上）のアミノ酸残基の切断などの、抗α４β７抗体の配列に対する翻訳後修飾を行って、切断型を生成することができる。

【0057】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９１に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９３に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９５に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９７に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９９に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。

【0058】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、インビトロアッセイにおいて、ヒトα４β７への結合について参照抗体と競合する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７への結合について競合する。参照抗体は、本明細書に記載されている抗α４β７抗体のいずれかであり得る。一部の実施形態では、参照抗体は、表４～６に提供されている抗体である。一部の実施形態では、参照抗体は、表８に提供されている抗体である。具体的な実施形態では、参照抗体は、抗ヒトα４β７抗体由来のアミノ酸配列を使用して生成された研究グレードの抗体、又はそれと等価のアミノ酸配列を有する抗体、例えば、ベドリズマブから選択される。

【0059】

一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、１つのα４（配列番号１～２）及び１つのβ７（配列番号３～４）のヒトα４β７ヘテロ二量体に拮抗する、例えば、それを阻害する。α４β７受容体拮抗作用は、多くの機構によって、例えば、ヒトＭＡｄＣＡＭ－１（配列番号５）又はヒトＶＣＡＭ－１（配列番号６）などの、そのリガンドの少なくとも１つによるα４β７の結合を阻害することによって発生し得る。

【0060】

本明細書に記載されている抗α４β７抗体は、ヒトα４β７に結合する。他の種、例えば、サル、例えば、カニクイザル由来のα４β７への結合に対する抗体の交差反応は、生物活性についてサル動物モデルにおいて試験を行うことができるなどの利点を提供することができる。このような動物モデル試験は、抗α４β７抗体をスクリーニングして、有効性に関連する特性、例えば、好ましい薬物動態又は安全性に関連する特性、例えば、肝毒性の減少を選択するために使用され得る。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、カニクイザルα４β７及びヒトα４β７に結合する。

【0061】

競合のためのアッセイには、限定されないが、放射性物質標識イムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイ及び表面プラズモン共鳴アッセイが含まれる。

【0062】

参照抗体と試験抗体との間の抗体競合アッセイを実施する際に（種又はアイソタイプに関係なく）、最初に、フルオロフォア、ビオチン又は酵素（又はさらに放射性）標識などの検出可能な標識により参照を標識して、その後の同定を可能にすることができる。この場合、ヒトα４β７を発現する細胞は、非標識試験抗体とインキュベートされ、標識された参照抗体が加えられ、結合した標識の強度が測定される。試験抗体が、重複するエピトープに結合することによって標識された参照抗体と競合する場合、強度は、試験抗体を用いずに行われた対照反応と比較して減少する。

【0063】

このアッセイの具体的な実施形態では、アッセイ条件（例えば、特定の細胞密度）下で最大結合の８０％（「ｃｏｎｃ_８０％」）をもたらす標識された参照抗体の濃度が最初に決定され、競合アッセイが、１０×ｃｏｎｃ_８０％の標識されていない試験抗体及びｃｏｎｃ_８０％の標識された参照抗体を用いて行われる。

【0064】

阻害は、以下の式に従って計算される阻害定数又はＫ_ｉとして表すことができる：
Ｋ_ｉ＝ＩＣ_５０／（１＋［参照Ａｂ濃度］／Ｋ_ｄ）、
式中、ＩＣ_５０は、参照抗体の結合が５０％減少する試験抗体の濃度であり、Ｋ_ｄは、参照抗体の解離定数であり、ヒトα４β７に対するその親和性の尺度である。本明細書に開示されている抗α４β７抗体と競合する抗体は、本明細書に記載されているアッセイ条件下で１０ｐＭ～１０ｎＭのＫ_ｉを有することができる。

【0065】

様々な実施形態では、試験抗体は、使用される特定のアッセイ条件下で最大結合の８０％である参照抗体濃度において、及び参照抗体濃度よりも１０倍高い試験抗体濃度において、参照抗体の結合を、少なくとも約２０％以上、例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくはさらにそれ以上、又は前述の値のいずれかの間の範囲のパーセンテージ減少させる場合、参照抗体と競合するとみなされる。

【0066】

本開示の別の態様は、ヒトα４β７に特異的に結合することができる抗α４β７抗体結合断片を含む。一部の実施形態では、これらの抗α４β７結合断片は、本明細書に開示されている抗α４β７抗体の少なくとも１つ及び最大で全てのＣＤＲを含む。抗体結合断片の例には、限定ではなく例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片及び単一ドメイン断片が含まれる。

【0067】

抗α４β７抗体又はその結合断片は、例えば、Ｊｕｎｇ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：９、９５９～９６６；Ｙａｚａｋｉら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ Ｓｅｌ． １７（５）：４８１～９． Ｅｐｕｂ ２００４年８月１７日；並びに米国特許出願公開第２００７／０２８０９３１号に記載されているように、そのＣＤＲの１つ以上に挿入された１つ以上のアミノ酸を有することができる。

【0068】

６．４．抗α４β７抗体をコードするポリヌクレオチド、発現系及び抗体を作製する方法
本開示は、抗α４β７抗体についての免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター並びに本開示の抗α４β７抗体を産生することができる宿主細胞を包含する。

【0069】

本開示の抗α４β７抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現によって調製され得る。抗体を組換え的に発現させるために、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片を担持する１つ以上の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、それにより、軽鎖及び重鎖が宿主細胞内で発現され、任意選択的に、宿主細胞が培養される培地内に分泌され、その培地から抗体が回収され得る。

【0070】

そのような抗α４β７抗体をコードするポリヌクレオチドを生成するために、軽鎖及び重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片が最初に得られる。これらのＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、生殖細胞系列ＤＮＡ又は軽鎖及び重鎖可変配列をコードするｃＤＮＡの増幅及び修飾によって得ることができる。

【0071】

抗α４β７抗体に関連するＶ_Ｈ及びＶ_ＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。これらの操作において、Ｖ_Ｌ又はＶ_ＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味することを意図する。

【0072】

Ｖ_Ｈ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、ある特定の実施形態では、ＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。

【0073】

Ｖ_Ｌ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得るが、ある特定の実施形態では、カッパ定常領域である。

【0074】

本開示の抗α４β７抗体を発現させるために、上記のように得られた部分的又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。この文脈において、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するという意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することを意図する。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入され得る又はより典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。

【0075】

抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。抗α４β７抗体に関連する軽鎖又は重鎖配列の挿入前に、発現ベクターは既に抗体定常領域配列を担持することができる。例えば、抗α４β７モノクローナル抗体に関連するＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列を全長抗体遺伝子に変換する１つのアプローチは、それらを、既に重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をそれぞれコードしている発現ベクターに挿入することであり、それによって、Ｖ_Ｈセグメントは、ベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、Ｖ_Ｌセグメントは、ベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結される。加えて又は代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子はベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。

【0076】

抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。

【0077】

抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子などの追加の配列を担持することができる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする。軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために一般的に使用されている多種多様な技術、例えば、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。

【0078】

原核又は真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現させることが可能である。ある特定の実施形態では、抗体の発現は、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体を最適に分泌する、真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞において実施される。本開示の組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１～６２１に記載されているＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されている、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６～４２２０に記載されているＤＨＦＲ^－ ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収され得る。宿主細胞はまた、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子などの、インタクトな抗体の部分を産生するために使用され得る。上記の手順に対する変更は、本開示の範囲内であることが理解される。例えば、本開示の抗α４β７抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（しかし両方ではない）をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい可能性がある。

【0079】

組換えＤＮＡ技術はまた、ヒトα４β７への結合に必要ではない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全てを除去するために使用され得る。このような切断されたＤＮＡ分子から発現される分子も、本開示の抗体に包含される。

【0080】

本開示の抗α４β７抗体の組換え発現のために、本開示の２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターを宿主細胞に同時トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、同一の選択可能マーカーを含有することができる又はそれらは、別個の選択可能マーカーを各々含有することができる。代替として、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターが使用され得る。

【0081】

抗α４β７抗体の１つ以上の部分をコードするポリヌクレオチドが得られると、さらなる改変又は突然変異が、例えば、異なるＣＤＲ配列を有する抗体、Ｆｃ受容体に対する親和性が低下した抗体、又は異なるサブクラスの抗体をコードするポリヌクレオチドを生成するために、コード配列に導入され得る。

【0082】

本開示の抗α４β７抗体はまた、化学合成によって、又は無細胞プラットフォームを使用することによって産生され得る。

【0083】

６．５．抗α４β７抗体の精製
本開示のポリペプチドが、組換え発現によって産生されると、これは、タンパク質の精製のための当該技術分野で公知の任意の方法によって精製され得る。

【0084】

ポリペプチドは、単量体又は二量体として、例えば、２つのポリペプチドを含む抗α４β７抗体として精製され得る。

【0085】

単離されると、抗α４β７抗体はさらに精製され得る。

【0086】

６．６．使用方法
６．６．１．治療利益
本明細書に提供されているデータは、開示されている抗ヒトα４β７抗体が、α４β７に対する好ましい結合親和性、特異性及び効力、並びに初代免疫細胞に対する好ましい結合プロファイル、ＦｃγＲ結合、並びにヒトα４β７＋細胞に対するＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性の欠如を示すことを実証している。これらの抗ヒトα４β７抗体は、実験室で成長させた異なるＨＩＶ株のビリオンにおけるα４β７及び患者のＨＩＶ試料からのα４β７に結合し、続いて免疫複合体を形成することが示された。これらの免疫複合体は、異なるＦｃγＲに結合することができ、食作用によってヒト単球細胞系ＴＨＰ－１に取り込まれる。これらの抗体はまた、α４β７と、ＭａｄＣＡＭ－１及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質などのそのリガンドとの相互作用を遮断する。したがって、抗α４β７抗体、結合断片及び／又はそれらを含む医薬組成物は、ＨＩＶ感染のウイルス抑制を誘導するため、又はＦｃ依存性機構及びＦａｂ依存性機構によってＨＩＶ感染対象におけるウイルス量を減少させるために治療的に使用され得る。一部の実施形態では、ＨＩＶ感染のウイルス抑制は、ＨＩＶウイルスの機能を低下させること、及び／又はＨＩＶウイルスの複製を低下させることを含む。

【0087】

開示された抗ヒトα４β７抗体は、それを必要とする対象においてＨＩＶ感染を治療する方法に使用され得る。一部の実施形態では、この方法は、対象におけるウイルス量を減少させることを含む。一部の実施形態では、対象におけるウイルス量は、検出不可能なレベルまで減少する。一部の実施形態では、対象は、ＨＩＶに感染したヒト対象である。

【0088】

一部の実施形態では、この方法は、治療利益をもたらすために、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、α４β７に拮抗する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＨＩＶビリオンに結合する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、免疫複合体を形成するために、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＨＩＶビリオンにおけるα４β７に結合する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＨＩＶビリオンと免疫複合体を形成する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、これらの免疫複合体は、食作用によってＡＰＣによって取り込まれる。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、α４β７と、ＭａｄＣＡＭ－１などのそのリガンド及びＨＩＶ ｇｐ１２０との相互作用を遮断する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、α４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０との相互作用を遮断し、細胞間ＨＩＶ伝播を阻害する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＭａｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０によって媒介されるＣＤ４ Ｔ細胞刺激を遮断する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＭａｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０によって共刺激されたＣＤ４ Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製を抑制する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＨＩＶ複製のウイルス抑制を誘導する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、免疫媒介性のＨＩＶ抑制を誘導する抗α４β７抗体を投与することを含む。

【0089】

６．７．配列表の説明
組み込まれた配列表に開示された配列及びそれらの簡単な説明の相関関係を表７に示す。

【0090】

【表7】

【実施例】

【0091】

以下の実施例は、本明細書に記載される抗体及び結合断片の例示的実施形態のある特定の特色及び特性を強調しているが、限定ではなく説明目的で提供される。

【0092】

抗体
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、陽性対照及びアイソタイプコントロールを含む実施例を通して使用される抗体は表８に収載されている。

【0093】

【表8】

【0094】

統計
半数阻害濃度（ＩＣ_５０）及び半数効果濃度（ＥＣ_５０）値は、グラフパッドプリズムを使用して濃度応答曲線の非線形回帰解析により決定した。比較の有意性は、マン・ホイットニー両側検定により決定した。注記されたものを除いて、すべての値は、少なくとも３つの独立した実験結果の平均又は標準偏差であった。

【0095】

［実施例１］
７．１．抗ヒトα４β７抗体の産生
７．１．１．ハイブリドーマスクリーニング
ハイブリドーマベースの技法を利用して、マウス抗ヒトα４β７抗体の最初のパネルを産生した。マウスは、アジュバンドに加えてヒトα４β７を発現するＨＥＫ２９３、ＣＨＯ－Ｋ１又はＢａＦ３組換え細胞を用いて免疫した。候補ハイブリドーマ由来抗体の選択は、表９の基準に基づいた。

【0096】

【表9】

【0097】

機能的ハイブリドーマｍＡｂのパネルはこの選別から同定され、すべての候補が好ましいプロファイルを示した。しかし、齧歯動物交差反応性を有するものはなく、これは、１）ヒトα４／β７がカニクイザルα４／β７に対し９６％／９７％アミノ酸配列相同性を有するが、ラット及びマウスα４／β７に対しては８４％／８５％配列相同性しかないこと；及び２）すべての選択された機能的ハイブリドーマｍＡｂはα４β７に対し高度に選択的であり、α４β７ヘテロ二量体上の立体構造的エピトープに結合しうることにより説明しうる。

【0098】

７．１．２．抗体特性評価
２００～３００ｍｌローラーボトル培養及びプロテインＡ親和性精製による小規模の抗体産生は、サブクローニングされた安定なハイブリドーマ細胞系で実施した。ｍＡｂの純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び質量分析により確かめられた。精製された抗体は、アイソフォーム及び種交差反応性を決定するため、結合及び機能アッセイを通じて特性評価した。

【0099】

結合スクリーニング
精製された抗体は、ＢａＦ３－ｈα４β７、ＢａＦ３－ｈαＥβ７、ＢａＦ３－ｃαＥβ７、ＢａＦ３、ＣＨＯＫ１－ｃα４β７、ＣＨＯＫ１－ｍα４β７及びＣＨＯＫ１－ｈα４β１細胞系を１μｇ／ｍｌの濃度で用いてＦＡＣＳによりアイソフォーム及び種交差反応性について特性評価した。例示的ｍＡｂ Ａｂ－ｍ１のＦＡＣＳプロファイルを含む、ＦＡＣＳプロファイルは表１０にまとめられている。

【0100】

【表10】

【0101】

機能的検証
精製された抗体は、ＨｕＴ７８細胞におけるＭａｄＣＡＭ－１への接着アッセイにより特性評価した。Ａｂ－ｍ１は、ＭａｄＣＡＭ－１アッセイにおいて潜在的な遮断効力を示し、したがって、機能的に検証した。Ａｂ－ｍ１についての３つの独立した実験のデータは表１１にまとめられている。代表的なデータは図１に示されている。

【0102】

【表11】

【0103】

機能的特性評価
Ａｂ－ｍ１のさらなる機能的特性評価は、カニクイザル交差反応性について調べるため、ＣＨＯＫ１－ｃα４β７においてＭａｄＣＡＭ－１への接着アッセイを使用して実施した。ＣＨＯＫ１－ｃα４β７での接着アッセイデータは上の表１１にまとめられている。代表的なデータは図２に示されている。

【0104】

ヒトα４β７へのＡｂ－ｍ１結合の親和性を決定するため、ＢａＦ３－ｈα４β７においてＦＡＣＳベースの滴定を実施した。ＥＣ_５０が決定され、表１２にまとめられている。

【0105】

【表12】

【0106】

エピトープビニングは、表１３に示される５０×過剰な非標識Ａｂの存在下でＡｌｅｘａ４８８フルオロフォアにコンジュゲートされたコンパレータ抗体を使用して競合的ＦＡＣＳにより実施した。Ａｂ－ｍ１は、非標識ＡｂによるＡｌｅｘａ４８８標識Ａｂの結合阻害のパーセンテージに基づいてベドリズマブ（Ａｂ－Ｖｅｄｏ）様グループに属すると特性評価した（表１３）。

【0107】

【表13】

【0108】

候補プロファイリング
ヒトα４β７へのｍＡｂ結合の親和性は、一次ヒトＣＤ４＋メモリーＴ細胞において確かめた。Ａｂ－ｍｌは、一次ヒトＣＤ４＋メモリーＴ細胞へのヒトＭａｄＣＡＭ－１結合を高効力（ＩＣ_５０＝６３．７ｐＭ、最大阻害１００％、図３）で遮断することもできた。

【0109】

７．１．３．ＶＨ／ＶＬシーケンシング、キメラ抗体産生及び特性評価
ハイブリドーマクローンは回収され、完全ハイブリドーマ培養培地（１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ）において増大した。細胞は、室温で５分間、１０００ｒｐｍでの遠心分離により収集し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて２回洗浄した。ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌを用いて細胞ペレット（おおよそ１×１０^７細胞）から抽出した。

【0110】

抗体ＶＨ及びＶＬ断片は、マウスＩｇプライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ、６９８３１－３）を使用してＲＴ－ＰＣＲにより、そのハイブリドーマ全ＲＮＡから別々に増幅した。適切なサイズの陽性ＰＣＲ産物は、ＶＨ及びＶＬ領域のシーケンシング及び同定のためにＴベクターに挿入した（表１４）。完全長抗体配列は、ＶＨ／ＶＬ配列と理論的定常領域配列との組合せを使用して構築した。

【0111】

プライマー設計後、ＶＨ／ＶＬは個々に増幅させ、発現ベクター中にクローニングして、相同組換えを経てキメラ抗体構築物を作製した。ＶＨ及びＶＬにおけるＣＤＲのアミノ酸配列は表１４に示されている。

【0112】

【表14】

【0113】

キメラ抗体は、ＨＥＫ２９３細胞において一過性トランスフェクションにより産生した。発現後、タンパク質は精製された。キメラ抗体についての高パーセンテージ単量体はＳＥＣ－ＨＰＬＣにより確かめた。

【0114】

Ａｂ－ｃ１は、Ａｂ－ｍ１の可変領域及びヒトＩｇＧ１／κ定常領域を有するキメラ抗体である。ヒト一次ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞へのＡｂ－ｃ１結合の親和性はＦＡＣＳにより決定され、１つの代表的なヒト全血から、３．９ｐＭの結合ＥＣ_５０値であった（図４及び表１５に示される）。ＭａｄＣＡＭ－１へのα４β７インテグリン結合を遮断するＡｂ－ｃ１の能力は、ＨｕＴ７８細胞及びＣＨＯＫ１－ｃα４β７細胞でも評価した（表１５）。

【0115】

【表15】

【0116】

精製されたキメラ抗体Ａｂ－ｃ１は、その結合特異性及びカニクイザル交差反応性を確かめるため、ＢａＦ３－ｈα４β７、ＢａＦ３－ｈαＥβ７、ＢａＦ３－ｃαＥβ７、ＢａＦ３、ＣＨＯＫ１－ｃα４β７及びＣＨＯＫ１－ｈα４β１細胞系を１つの濃度（１μｇ／ｍｌ）で用いてＦＡＣＳによりさらに特性評価した。試験したキメラのＦＡＣＳプロファイルは図１６にまとめられている。

【0117】

【表16】

【0118】

ＨｕＴ７８を使用して、キメラＡｂ－ｃ１が、ｈα４β７インテグリンへのＭａｄＣＡＭ－１媒介接着を遮断することができるかどうかを調べた。表１７に示されるように、Ａｂ－ｃ１は、ＭａｄＣＡＭ－１へのＨｕＴ７８細胞接着を阻害する能力を示している。

【0119】

ＣＨＯＫ１－ｃα４β７を使用して、キメラ抗体が、ｃα４β７へのＭａｄＣＡＭ－１媒介接着を阻害できるかどうかを調べた。表１７に示されるように、Ａｂ－ｃ１は、ＭａｄＣＡＭ－１へのＣＨＯＫ１－ｃα４β７細胞接着を阻害する能力を示している。

【0120】

【表17】

【0121】

７．１．４．ヒト化
抗体Ａｂ－ｍ１は、ＨｕＴ７８細胞とヒト一次ＣＤ４＋Ｔメモリー細胞の両方での結合及び効力、カニクイザル交差反応性、ＣＤＲ配列多様性、結合選択性、配列ライアビリティー（すなわち、グリコシル化）及びエピトープ群に基づいて選択された。指定の特徴については表１８を参照のこと。

【0122】

【表18】

【0123】

ヒト化抗体は、表１９に従ってＶＨ及びＶＬ断片を組み立て、ヒトＩｇＧ１及びカッパ定常領域を組み込むことから設計された。

【0124】

【表19】

【0125】

これらのヒト化抗α４β７ｍＡｂは産生され、十分な発現を有し、ＳＥＣにより＞９５％単量体を示した。同一性はＭＳにより確かめられ、ヒト化抗α４β７の安定性はＤＳＣにより測定された。ヒト化Ａｂ－ｈ１の４種は、ＭａｄＣＡＭ－１媒介ＨｕＴ７８細胞接着を遮断するその能力について評価され、そのすべてが、１桁の数字又は低い２桁のｐＭ範囲のＩＣ_５０値を有する強い効力を示した（表２０）。

【0126】

【表20】

【0127】

７．１．５．Ａｂ－ｈ１．９のライアビリティー操作
抗体Ａｂ－ｈ１．９は、脱アミド化、異性化、酸化、グリコシル化、加水分解及び切断に関して減少した化学的ライアビリティーを有するバリアントＶＨ及びＶＬ鎖を産生するために選択された。

【0128】

Ａｂ－ｈ１．９ＶＨの配列は：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＨＴＥＹＡＰＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＶＤＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２３）であり、
Ａｂ－ｈ１．９ＶＬの配列は：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＧＩＳＤＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＳＦＫＬＬＩＹＨＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＹＡＱＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２８）であり、
選択されたライアビリティー突然変異部位は下線が引かれ、ＣＤＲは太字である。ライアビリティーはＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ１に存在している。

【0129】

ビオチン化ヒトα４β７細胞外ドメインタンパク質を使用する２ラウンドのライアビリティーフリー抗α４β７クローン選択が実施された。それぞれのライブラリーからのコロニーは配列決定され、いずれかのＣＤＲに追加のライアビリティーを有するコロニーは取り除かれた。それぞれのライブラリーからのクローンは、親Ａｂ－ｈ１．９と比べて、酵母上の表面α４β７抗原への結合についてＦＡＣＳによりスクリーニングした。

【0130】

親と類似した形で結合すると同定されたライアビリティー操作クローン（図５）は表２１に提示されている。これらのライアビリティー操作クローンはその可変領域と一緒にＩｇＧフォーマットに変換された。

【0131】

【表21】

【0132】

Ａｂ－ｈ１．９ｅを通したライアビリティー操作ｍＡｂ Ａｂ－ｈ１．９ａは、ＦＡＣＳによりα４β７発現ＨｕＴ７８細胞への結合について試験した。これらの抗体は結合活性を保持しており、２５３ｐＭ～７０２ｐＭに及ぶＥＣ_５０値を有していた。ＶＨ－ＣＤＲ３の大部分（例えば、ＣＤＲ中のアミノ酸残基の３分の１）がライアビリティー操作ｍＡｂでは突然変異していたことを考慮すると、α４β７結合のこの保持は驚きであった。Ａｂ－ｈ１．９ｄは、最も強力な結合親和性（２５３ｐＭ）を示し、良好な薬物様特性を見せた。

【0133】

ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＬＡＬＡフォーマットにおける抗体Ａｂ－ｈ１．９（ａ）～（ｅ）のタンパク質産生特性も試験し、Ａｂ－ｈ１．９ｄが優れた特性を示した。

【0134】

７．１．６．抗体
例示的Ａｂ－ｈ１．９ｄ由来ＩｇＧ１抗体変換は表２２に示されている。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＨｕＩｇＧ１は、カノニカルヒト重鎖定常領域を特徴とする配列番号９０のＨＣ、及びカノニカルヒトカッパ軽鎖定常領域を特徴とする配列番号１００のＬＣを有するヒトＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＨｕＩｇＧ１は、配列番号９１のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、バリアントＣＨ３置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを特徴とする配列番号９２のＨＣ、及び配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、配列番号９３のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡは、バリアントＣＨ２置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ及びバリアントＣＨ３置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを特徴とする配列番号９４のＨＣ、並びに配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡは、配列番号９５のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＱＬは、バリアントＣＨ２置換Ｔ２５０Ｑ、及びバリアントＣＨ３置換Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ及びＭ４２８Ｌを特徴とする配列番号９６のＨＣ、並びに配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＱＬは、配列番号９７のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ／ＱＬは、バリアントＣＨ２置換Ｔ２５０Ｑ、及びバリアントＣＨ３置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ及びＭ４２８Ｌを特徴とする配列番号９８のＨＣ、並びに配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ／ＱＬは、配列番号９９のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。

【0135】

【表22】

【0136】

産生後、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗ヒトα４β７抗体では優れた特性を示し、高特異性（α４β７への低結合）及び望ましいＰＫ／ＰＤ（低ＡＤＡ）力価及び高プラズマ曝露）を実証した。

【0137】

［実施例２］
７．２．健康なドナー又はＨＩＶ＋個人由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上でのα４β７発現
７．２．１．材料及び方法
急性ＨＩＶ感染の間、α４β７発現ＣＤ４＋Ｔ細胞は優先的に感染し、したがって、枯渇する（Ｓｉｖｒｏら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１８年）。末梢α４β７発現がｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人において時間とともに回復するかどうかを調べるため、１０人の健康な（ＨＩＶ－）ドナー及び４５人のｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人（年齢：２６～６６歳、中央値４２歳；ＨＩＶ感染期間：１～３６歳、中央値１２歳）のＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上でのα４β７のパーセンテージ及び発現レベルを、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７及びα４β７についての抗体のカクテルを使用してフローサイトメトリー分析により比較した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるα４β７のパーセンテージ（％）と発現レベル（ＭＥＳＦ）の両方を分析した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ－ナイーブ細胞、ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ－ターミナルエフェクター細胞、ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ＋エフェクターメモリー細胞、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋セントラルメモリー細胞及びＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－トランジエントメモリー細胞と定義された。

【0138】

７．２．２．結果
ＨＩＶ－及びｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人の両方で、α４β７を発現している細胞のパーセンテージはメモリーＴ細胞サブセットと比べるとナイーブＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞ではより高く、α４β７発現レベル（ＭＥＳＦにより測定した場合）は、ナイーブ細胞よりもセントラルメモリー、トランジエントメモリー及びエフェクターメモリー細胞上のほうが高かった（図６Ａ～６Ｆ）。末梢ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、ＨＩＶ－及びＨＩＶ＋個人において類似するレベルのα４β７を発現した（ＭＥＳＦ測定）。この分析は、ｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人間の末梢ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７発現は、高度に変わりやすいが、非感染個人の末梢ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７発現と違ってはいないことを示した。これらの結果は、ＨＩＶ＋個人間の末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞でのα４β７発現が、出芽ＨＩＶビリオン中へのα４β７の組込みを支援できることを示唆していた。

【0139】

［実施例３］
７．３．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴでのＨＩＶビリオン補足
７．３．１．材料及び方法
α４β７がＨＩＶビリオンのエンベロープに存在することを確かめるため、及びＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがＨＩＶビリオンのエンベロープ中に組み込まれたα４β７に結合して免疫複合体を形成することができるかどうかを試験するため、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを、実験室生育ＨＩＶ－１株又は公表された方法（Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７年）に従ってウイルス血症ＨＩＶ＋個人由来の試料を使用してビリオン補足アッセイ（ビーズフォーマット）において先ず試験した。実験室生育ＨＩＶ－１株では、異なる群、遺伝子サブタイプ、及び共受容体使用を表す６種の株（ＢＣＦ０６、ＣＭＵ０８、ＮＬ４－３、ＲＵ５０７、ＹＢＦ３０及びＩＩＩＢ）（表２３）は、細胞においてα４βの発現を誘導するレチノイン酸（ＲＡ）の存在下、活性化された一次ヒトＰＢＭＣ［例えば、ＯＫＴ３抗体又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により活性化される］で作製した。プロテインＧコンジュゲート免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）は、適切な抗体を装備され、次にそれぞれのＨＩＶ株のウイルスストック（約２ｎｇ ｐ２４ｇａｇ／反応）と一緒にインキュベートした。インキュベーション後、装備されたビーズは洗浄されて未結合ウイルス粒子を取り除き、それに続いてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処置して、ｐ２４ｇａｇ定量化のため補足されたビリオンを溶解した。ＨＩＶ患者の試料では、試料のウイルス力価（コピー／ｍＬ）は、ＣＯＢＡＳ Ｔａｑｍａｎ ２．０アッセイにより決定した。１０μｇの適切な抗体を装備されたプロテインＧコンジュゲート免疫磁気ビーズを、４００μＬの患者血清と一緒に２時間インキュベートした。次に、ビーズを洗浄して未結合ウイルス粒子を取り除き、結合したビリオンのＲＮＡは引き続いてＱｉａｇｅｎのウイルスＲＮＡ抽出キットを製造業者の説明書によって使用して抽出した。患者の試料から補足されたビリオンのコピー数は、引き続いて、ＨＩＶサブタイプＢではＬＴＲ－ｇａｇにおける保存された領域を標的にするプライマー及びプローブを使用してデジタルドロプレットＰＣＲにより定量化した。

【0140】

ＨＩＶビリオンを補足するための抗体のＥＣ_５０値を決定するため、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを、９６ウェルプレーフォーマットに改造されたビリオン補足アッセイにおいて試験した。段階希釈された抗体を予洗されたＰｉｅｒｃｅＴＭタンパク質Ｇ被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に添加した。インキュベーション後、プレートを洗浄して未結合抗体を取り除いた。それぞれのＨＩＶ株のウイルスストック（おおよそ２ｎｇ ｐ２４ ｇａｇ）をそれぞれのウェルに添加してインキュベートした。プレートを洗浄して未結合ウイルス粒子を取り除き、次に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処置して、ｐ２４ ｇａｇ定量化のために補足されたビリオンを溶解した。ＨＩＶ ｐ２４ ｇａｇは、高感度ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ｐ２４ ｇａｇ検出キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により検出した。

【0141】

７．３．２．結果
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、臨床株であれ実験室適応株であれ、補足されたビリオン中のウイルスｐ２４ ｇａｇタンパク質により示されるように、試験された６種の実験室生育ＨＩＶ株すべてからビリオンを補足することができた（図７Ａ～７Ｆ）。補足されたビリオン由来のｐ２４ ｇａｇタンパク質の量は、アッセイにおいて使用された抗体濃度（５及び１５ｎＭ）への用量応答を実証した。陰性対照抗体と反応した試料と比べてＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと反応した試料中のＨＩＶ ＲＮＡコピー数の数が多いことにより示されるように（図７Ｇ－２）、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ－１患者の試料からもビリオンを補足することができた（図７Ｇ－１に示されるウイルス入力）。

【0142】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶビリオンを補足するためのそのＥＣ_５０値を決定するため、次に９６ウェルプレーフォーマットに適合されたビリオン補足アッセイにおいて試験した。ＥＣ_５０値は試験されたすべてのウイルスについて類似しており、０．１２ｎＭ（０．０１９μｇ／ｍＬ）～０．２５ｎＭ（０．０３８μｇ／ｍＬ）に及んだ（表２３）。同じパネルのウイルスに対して試験された場合、Ａｂ－ＶｅｄｏはＨＩＶビリオンを補足するのにＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴほど強力ではなく、ＥＣ_５０値はそれぞれ個々のウイルスについてＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＥＣ_５０値の約２～３倍であった（表２３）。ＨＩＶ ＩＩＩＢ株は、ビーズフォーマットアッセイを使用してＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ（図７Ｆ）及びＡｂ－Ｖｅｄｏ（データは示さず）により補足することができたが、そのＥＣ_５０値はウイルスストックの低力価のせいでプレートフォーマットアッセイにより決めることはできなかった。

【0143】

【表23】

【0144】

まとめると、これらのデータにより、試験されたすべての実験室生育ＨＩＶ株及びＨＩＶ－１患者の試料のビリオンにはα４β７が存在することが確かめられ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが、耐久性のあるＨＩＶウイルス制御のための提唱された「予防接種効果」の誘導に必要な一連のステップの第一歩である、免疫複合体を形成するＨＩＶビリオン上のα４β７への結合ではＡｂ－Ｖｅｄｏよりも強力であることが実証された。

【0145】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、試験されたすべてのＨＩＶ株及びＨＩＶ－１患者の試料のビリオンのエンベロープ上のα４β７に結合できる強力な抗α４β７抗体である。

【0146】

［実施例４］
７．４．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンの免疫複合体のＦｃγＲへの結合
７．４．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンにより形成される免疫複合体がｉｎ ｖｉｔｒｏでＦｃγＲに結合できるかどうかを試験するため、適切な抗体を先ずＨＩＶ ＮＬ４－３ウイルス（α４β７の発現を誘導するようにＲＡの存在下で活性化されたヒトＰＢＭＣにおいて調製された）と混合して免疫複合体を形成させ、この複合体を、引き続いて、ニッケル被覆プレート上に固定化されたＨｉｓタグ付きＦｃγＲ［ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）では、表３２に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴに対して比較的高い親和性を有する］又は検出感度を高めるためニュートラアビジン被覆プレート上に固定化されたビオチン化ＦｃγＲ［ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１又はＲ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）では、表３２に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴに対して比較的低い親和性を有する］と一緒にインキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄してＦｃγＲに結合しなかった免疫複合体を取り除き、次に、溶解バッファーで処置して、補足された免疫複合体を溶解して、ｐ２４ ｇａｇ定量化のためウイルスタンパク質を放出した。

【0147】

７．４．２．結果
ＨＩＶビリオンとＷＴ Ｆｃドメインを有するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴにより形成される免疫複合体は、ＦｃγＲに結合しているタンパク質複合体中のＨＩＶ ｐ２４カプシドタンパク質の存在により示される異なるＦｃγＲに結合することができた（図８Ａ～８Ｅ）。ＨＩＶビリオン単独ではＦｃγＲにも（データは示さず）、ＨＩＶビリオンとＦｃγＲへのその結合を有意に減少させるそのＦｃドメイン中に操作されたＬＡＬＡ突然変異を有すること以外Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと同一の抗体であるＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡにより形成される免疫複合体にも結合しなかった（図８Ａ～８Ｅ）。さらに、ＨＩＶビリオンとＡｂ－Ｖｅｄｏにより形成される免疫複合体は、ＦｃγＲへの最小結合を示した（図８Ａ～８Ｅ）。これは、Ａｂ－ＶｅｄｏのＦｃドメイン中の操作された突然変異のせいで、異なるＦｃγＲに対するＡｂ－Ｖｅｄｏの結合親和性がＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴよりも有意に低いことと一致している。ヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１又はＲ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８、Ｆ１７６としても知られる）に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合親和性がＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８、Ｖ１７６としても知られる）よりも低いせいで（図１９Ａ）、ニッケルプレート上に固定化された対応するＨｉｓタグ付きＦｃγＲを使用する代わりに、これらのＦｃγＲによるＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの免疫複合体の補足を増強するため、ビオチン化ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１又はＲ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）は、ニュートラアビジン被覆プレート上に固定化された。

【0148】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンにより形成される免疫複合体は、ＦｃγＲＩＩａ（ＡＤＣＰを担当している）を含む異なるＦｃγＲに結合できた。これは、複合体がＡＰＣにより取り込まれてＨＩＶ制御のための提唱された「予防接種効果」を誘導することを可能にすると考えられるステップである。

【0149】

［実施例５］
７．５．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＴＨＰ－１細胞におけるα４β７被覆ビーズのＦｃ依存性取込みを媒介する
７．５．１．材料及び方法
細胞培養
ＴＨＰ－１細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を補充されたＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）において３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。細胞は２日又は３日ごとに継代され、５００，０００～１，０００，０００細胞／ｍｌの密度で維持した。

【0150】

ビーズ調製
組換えヒトα４β７タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）は、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ透析装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して１×ＰＢＳ中４℃で一晩透析した。こうして得られたα４β７は、次に、４℃で２時間、１００×モル過剰ＮＨＳ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）でビオチン化した。過剰なビオチンは、４℃で一晩透析により取り除いた。α４β７被覆ビーズでは、ニュートラアビジン標識蛍光ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）は、４℃で１～２４時間、ビオチン化α４β７と一緒にインキュベートした。ビーズ－タンパク質コンジュゲーション反応は、別段述べられなければ、１ｍｌのストックビーズ当たり２ｍｇのα４β７タンパク質の比で起きた。タンパク質コンジュゲートビーズは、１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄し、次に、使用に先立って１００×希釈した。ビーズへのタンパク質のコンジュゲーションの成功は、抗α４β７をアイソタイプコントロール条件と比較する食作用アッセイにおいて確かめた。

【0151】

食作用アッセイ
タンパク質被覆ビーズ及びＴＨＰ－１細胞を使用する食作用アッセイは、以前記載された研究（Ａｃｋｅｒｍａｎら、２０１１年）から改作した。アッセイは９６ウェルプレートで実施した。免疫複合体は、１０μｌの調製したα４β７被覆ビーズを１０μｌの示された抗体（１０μｇ／ｍｌ）と組み合わせることにより形成した。これらは３７℃、５％ＣＯ_２で１～２時間インキュベートした。ＴＨＰ－１細胞（１００，０００／ウェル）は、次に、最終体積２００μｌで、示された時間免疫複合体と一緒にインキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞は、固定化可能なｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色し、続いてＦＡＣＳバッファーで洗浄し、固定化した。得られた細胞に関するデータは、ＢＤ製のＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０を使用して収集した。蛍光ビーズ及びｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色蛍光は、それぞれＰＥ－ＣＦ５９４及びＢＶ５１０設定を用いて検出した。次に、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。食作用スコアーは以下の通りに計算した：食作用スコアー＝（ＭＦＩ×パーセントビーズ陽性細胞）／１０００。正規化：３つの独立した実験のデータを正規化し、１つのグラフ上にプロットした。正規化するため、「ビーズのみ」条件での１つの複写物は、この値を同じ値で割ることにより１に設定した（それぞれの実験について行った）。他の値はすべてこの正規化値で割って正規化された食作用スコアーを表示し、このスコアーは「ビーズのみ」条件からの倍率変化を表す。

【0152】

イメージングフローサイトメトリー
ビーズの内部移行はイメージングフローサイトメトリーを使用して確かめた。固定化された細胞は、ＩｍａｇｅｓｔｒｅａｍＸ Ｍａｒｋ ＩＩイメージングフローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）上で４０×の拡大率及び中度の感度及び中度の速度設定で分析した。蛍光ビーズは、４８８ｎｍ（５ｍＷ）／５６０～５９５ｎｍ（励起／放射）を使用して画像化した。ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色は、４０５ｎｍ（５ｍＷ）／４３０～４８０ｎｍ（励起／放射）を使用して画像化された。明視野像はチャネル２に収集された（カメラ１）。データは、ＩＤＥＡＳ解析ソフトウェアｖ６．１（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）を使用して解析した。標準ゲート開閉戦略を使用して適切な細胞集団を見つけた。簡単に言えば、フォーカス細胞は、明視野画像鮮明度のため高（＞４０）勾配ＲＭＳ（二乗平均平方根）を使用して同定した。単細胞は、明視野像の高アスペクト比及び低オブジェクトエリアにより同定された。細胞オブジェクトエリアは明視野像において同定され、「細胞内マスク」を限定するため細胞境界から４画素が損なわれた。細胞内マスクにおいて陽性蛍光シグナルを有する細胞は、真の内部移行イベントとして同定された。斑点数フィーチャーを使用して、真の内部移行イベントを有する細胞中の内部移行したビーズの数を数えた。真の内部移行イベントを有する少なくとも２０００細胞は試料ごとに分析した。

【0153】

統計分析
データはグラフパッドプリズムを使用してプロットした。有意性は、テューキー多重比較検定と連結させた一元配置分散分析を使用して決定した。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、^＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、^＊ｐ＝０．０１～０．０５。

【0154】

７．５．２．結果
抗原提示細胞による免疫複合体の取込みは、下流細胞性及び液性免疫を開始するのに重大な意味を持つ。ＴＨＰ－１細胞は、抗体－蛍光ビーズ免疫複合体をＦｃ／ＦｃγＲ依存的に貪食することが報告されている（Ａｃｋｅｒｍａｎら、２０１１年）。したがって、ＴＨＰ－１細胞を使用して、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがα４β７被覆蛍光ビーズの食作用を媒介するかどうかを調べた。α４β７－ビーズ／Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ抗体免疫複合体で３時間処置した細胞は、フローサイトメトリーにより、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ及びＡｂ－Ｖｅｄｏ（フィーチャリングＬＡＬＡ）と比べて蛍光ビーズの有意な取込みを示した（図９Ａ～９Ｂ）。ＬＡＬＡ突然変異は、ＦｃγＲへのＩｇＧ Ｆｃの結合を大幅に低減することが分かっている。これらのデータから、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが、α４β７被覆蛍光ビーズを含有する免疫複合体の頑強なＦｃ／ＦｃγＲ依存性食作用を媒介することが示唆される。

【0155】

Ａｍｎｉｓ Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍを用いたイメージングフローサイトメトリーを実施して、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ／α４β７ビーズ免疫複合体がＴＨＰ－１細胞に内部移行したことを確かめた。予測通り、蛍光ビーズは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ免疫複合体処置後にＴＨＰ－１細胞内に局在した（図９Ｃ）。

【0156】

［実施例６］
７．６．ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ／Ａｂ免疫複合体のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ誘導取込みはα４β７－及びＦｃ依存性である
７．６．１．材料および方法
ＥＬＩＳＡによるα４β７発現ＧＦＰ＋ウイルス様粒子（ＶＬＰ）への抗体結合
α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰは、α４β７ ｃＤＮＡ構築物及びＨＩＶｇａｇ－ＧＦＰ ＤＮＡ構築物を順次トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から生成され、続いて細胞培養上澄みからＶＬＰを精製した。ＥＬＩＳＡを実施して、ＧＦＰ＋ＶＬＰ表面上でのα４β７の発現及び種々の試験Ａｂによる結合特異性を確かめた。簡単に言えば、高結合平底９６ウェルプレートのそれぞれのウェルを、ＰＢＳ中７．５×１０^７粒子／ｍＬの濃度で５０μＬのα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰを用いて被覆し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルはＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄し、室温（ＲＴ）で３０分間１００μＬのスーパーブロック液で遮断した。３回洗浄後、それぞれのウェルは、ＲＴで１時間、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中５０μＬの４倍段階希釈一次抗体と一緒にインキュベートし、続いて洗浄し、ＲＴで１時間、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中５０μｌのＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃγ特異的二次抗体と一緒にインキュベートした。最終洗浄後、ＴＭＢ基質を発色現像のためにそれぞれのウェルに添加し、反応は２ＮのＨ_２ＳＯ_４を添加することにより停止させた。それぞれのウェルについての光学密度（ＯＤ）はプレートリーダーにより４５０ｎｍで測定した。

【0157】

ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ／抗α４β７免疫複合体の内部移行
α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ取込み実験では、５×１０^４ＴＨＰ－１細胞を平底９６ウェルプレートにおいて、最終濃度１μｇ／ｍｌの抗体及び１００μＬ体積のＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中１対１００の細胞対粒子比のα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰなしで又はこれと混合した。プレートは、ＣＯ_２インキュベータにおいて３７℃で１６時間インキュベートした。次に、細胞を再懸濁して、Ｖ字型底９６ウェルプレートに移し、遠心分離を通して２００μＬのＰＢＳ、２％ＦＢＳで１回洗浄した。細胞ペレットは２００μＬのＰＢＳ、０．５％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、フローサイトメトリーによるパーセントＧＦＰ＋細胞の決定に供した。

【0158】

ＶＬＰ取込みの阻害では、ＴＨＰ－１細胞（５×１０^６／ｍＬ）を、ＣＯ_２インキュベータにおいて３７℃で２時間、最終濃度２４０ｎＭのラトランクリンＡ（ＬａｔＡ）を用いて若しくはこれなしで又は０．１％ＤＭＳＯ（対照）を用いて前処置し、続いて上に示された通りに抗体及びα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰと一緒に若しくはこれなしでインキュベートした。

【0159】

７．６．２．結果
ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ／Ａｂ免疫複合体のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ誘導取込みはα４β７－及びＦｃ依存性である
哺乳動物細胞から生成される組換えウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、０．１～０．２ミクロンに及ぶ動的サイズを有する。したがって、ＶＬＰは以前に実験で使用された蛍光標識ビーズよりもサイズがビリオンに類似しており、ＴＨＰ－１細胞によるα４β７＋ビリオン／Ａｂ免疫複合体の内部移行／取込みをモデル化するためのツールとして利用された。精製されたα４β７発現ＧＦＰ＋ＶＬＰは、ＥＬＩＳＡによって、抗α４β７ Ａｂに結合するその能力について評価した。図１０に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ及びＡｂ－Ｖｅｄｏはα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰに比較できるほどに類似する結合ＥＣ_５０値（それぞれ、０．０５０ｎＭ、０．０４８ｎＭ及び０．０５８ｎＭ）で結合し、アイソタイプコントロールＡｂ（抗ＣＭＶ ＩｇＧ）はα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰに全く結合しなかった。このデータにより、種々の抗α４β７ Ａｂが、良好な結合親和性及び特異性でα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰに結合できることが示唆される。

【0160】

次に、ＴＨＰ－１細胞によるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰの取込みは、機能的Ｆｃを用いて又はなしで種々の抗α４β７ Ａｂの存在下で評価した。図１１Ａに示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ処置は、ＧＦＰ＋細胞の５０倍誘導を表すアイソタイプＡｂ対照処置による１．２％ＧＦＰ＋細胞と比べて６０％を超えるＧＦＰ＋ＴＨＰ－１細胞の検出を誘導した。これにより、ＴＨＰ－１細胞によるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ取込みがＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ特異的であり、α４β７発現に依存していることが示唆される。しかし、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ又はＡｂ－Ｖｅｄｏ（ＬＡＬＡ）はＴＨＰ－１細胞において最小レベルのＶＬＰ取込みしか示さず、これらの細胞による抗α４β７ Ａｂ誘導α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ取込みが、そのα４β７結合Ｆａｂドメインに加えて、免疫複合体のＦｃ／ＦｃγＲ媒介内部移行を可能にする抗体の機能的Ｆｃドメインを必要とすることが示唆される。

【0161】

α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ媒介取込みが、細胞表面ＦｃγＲに結合しているだけではなく、本当に内部移行のせいであることを確かめるため、Ａｂ／ＶＬＰ免疫複合体と一緒のそのインキュベーションに先立って、既知の内部移行阻害剤であるラトランクリンＡ（ＬａｔＡ）を使用してＴＨＰ－１細胞を前処置した。図１１Ｂに示されるが、非処置の細胞と比べて、ＬａｔＡ処置細胞ではＧＦＰ＋細胞が４０％減少した。これにより、非処置（モック）又はＤＭＳＯ処置対照において観察される全ＧＦＰシグナルの少なくとも４０％がＴＨＰ－１細胞でのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ依存性ＶＬＰ内部移行から生じたことが示唆される。

【0162】

［実施例７］
７．７．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＨＩＶに対する中和活性を示さなかった
７．７．１．材料及び方法
ＨＩＶビリオンに結合できる一部のＡｂ、例えば、ＨＩＶ広域中和抗体は、ウイルス感染を遮断することができる。ＨＩＶビリオン上のα４β７へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合が宿主細胞のＨＩＶ感染を遮断することができるかどうかを試験するため、ＴＺＭ－ｂｌインジケータ細胞系を使用してウイルス中和アッセイにおいてそのことを評価した（Ａｒｒｉｌｄｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１５年）。

【0163】

ＨＩＶ中和アッセイ
おおよそ１５０，０００ＲＬＵ（ＴＺＭ－ｂｌ細胞上でのウイルス滴定により以前決定された）に対応するＨＩＶウイルス（ＰＨＡ及びＲＡで調製された）は、段階希釈抗体と一緒にプレインキュベートした。ＤＥＡＥ－デキストランを含有するＴＺＭ－ｂｌ細胞は、プレインキュベートされたＨＩＶと抗体を含有する混合物に添加され、次に、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞はＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処置され、ルシフェラーゼシグナルを測定した。

【0164】

７．７．２．結果
表２３に示されるＨＩＶ株のパネルに対して試験された場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは５０μｇ／ｍＬまでの濃度でいかなる中和活性も示さず、ＣＤ４＋結合部位を標的にするＨＩＶ広域中和抗体は、試験された群Ｍ ＨＩＶ株のすべて（すなわち、ＣＭＵ０８、ＮＬ４－３及びＲＵ５７０）に対しておおよそ０．１μｇ／ｍＬの中和ＩＣ_５０値を有していた（データは示されず）。

【0165】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＨＩＶビリオンに結合するが、ＨＩＶ感染を中和せず、このことは、α４β７は宿主細胞上ではウイルス受容体ではないという見解と一致している。この知見は、ウイルスにコードされた糖タンパク質ではなくα４β７を標的にするとウイルス耐性機構を回避しうるという仮説を支持する。

【0166】

［実施例８］
７．８．異なる抗体によるα４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の相互作用の阻害
７．８．１．材料及び方法
α４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の間の相互作用は、ＬＦＡ－１を活性化し、ＨＩＶの細胞間伝播を潜在的に促進することが報告されている（Ａｒｔｈｏｓら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年）。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがこの相互作用を破壊することができるかどうかを試験するため、公表された方法（Ｐｅａｃｈｍａｎら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ）に従ってプレート上に固定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ペプチドに結合するα４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を使用して、α４β７／ｇｐ１２０結合アッセイを設定した。ニュートラアビジン被覆高容量９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、ビオチン化ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴ又はｇｐ１２０－Ｖ２対照ペプチドで被覆した（表２４）。２つのビオチン化ペプチドの配列は、α４β７とｇｐ１２０の間の結合を媒介することが報告されている４つのアミノ酸が対照ペプチドでは突然変異していることを除いて同一であった。

【0167】

【表24】

【0168】

抗体－細胞混合物を添加する前に、ペプチド被覆プレートを洗浄して未結合ペプチドを取り除いた。抗体－細胞混合物ストックを作製するため、ＲＰＭＩ８８６６細胞（８×１０^６細胞／ｍＬ）を、最終濃度２ｍＭでＭｎＣｌ_２を補充した冷ブロッキングバッファーに再懸濁して、α４β７の立体構造を活性化した。段階希釈Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、Ａｂ－Ｖｅｄｏ又はアイソタイプネガティブコントロール抗体をＭｎＣｌ_２処置細胞と混合し、混合物をインキュベートした。抗体－細胞混合物（ウェル当たり５０μＬ中２×１０^５細胞）を、ｇｐ１２０ペプチドで被覆されたプレートのそれぞれのウェルに添加し、インキュベートした。プレートを洗浄し、ペプチド被覆プレートに付着した生細胞はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）により決定した。

【0169】

７．８．２．結果
このアッセイの特異性は、α４β７へのｇｐ１２０の結合を媒介することが報告されている４アミノ酸に突然変異を宿す固定化されたｇｐ１２０－Ｖ２対照ペプチド（図１２Ａ）への結合ではなく、プレート上に固定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドへのα４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞の結合により示される（表２４）。このアッセイフォーマットにおいて試験された場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドへのＲＰＭＩ８８６６細胞の結合を０．０２２±０．０１６μｇ／ｍＬのＩＣ_５０値で遮断した（図１２Ｂ）。Ａｂ－Ｖｅｄｏは、同じアッセイで試験した場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＩＣ_５０値よりも高いＩＣ_５０値（０．０４２±０．０２３μｇ／ｍＬ）を有しており、この相互作用を遮断するのにＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴほど強力ではないことを示した（図１２Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがα４β７とｇｐ１２０の相互作用を効果的に破壊し、細胞間ウイルス伝播を潜在的に阻害できることを示している。

【0170】

このアッセイフォーマットにおいて試験された場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドへのＲＰＭＩ８８６６細胞の結合を０．０２２±０．０１６μｇ／ｍＬのＩＣ_５０値で遮断した（図１２Ｂ）。これらの結果は、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがα４β７とｇｐ１２０の相互作用を効果的に破壊し、細胞間ウイルス伝播を潜在的に阻害できることを示している。

【0171】

［実施例９］
７．９．α４β７インテグリンを発現するヒト及びカニクイザル細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合
７．９．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、ＥＣＬ結合アッセイを使用してＨｕＴ７８細胞（内在性α４β７を発現するヒトＴリンパ腫細胞）上で並びにフローサイトメトリーを使用してヒト及びカニクイザル末梢リンパ球上で評価した。

【0172】

さらに、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合ＥＣ_５０値が決定され、ヒトとカニクイザル血液由来全、ナイーブ並びにメモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方について比較した。

【0173】

ＥＣＬ細胞結合アッセイ
内在性α４β７を発現するＨｕＴ７８細胞は、２０％のＦＢＳ、ペニシリン（５０ユニット／ｍＬ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＩＭＤＭ培地で培養した。ＨｕＴ７８細胞は収集され、１回洗浄し、１．５×１０^６細胞／ｍＬでＤＰＢＳに再懸濁した。細胞（５０μＬ中７．５×１０^４）は、ＭＳＤ高結合プレートのそれぞれのウェルに添加した。６．７％のウシ胎仔血清（ＤＰＢＳに希釈された）を添加し、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。上澄みは取り除き、１．５μｇ／ｍＬ～０．００００９１μｇ／ｍＬ（５％ＦＢＳ及び１ｍＭのＭｎＣｌ_２を含有するＤＰＢＳバッファー中）に及ぶ１対４倍８ポイント希釈を通じて調製された滴定Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ抗体又はアイソタイプコントロールの２５μＬをそれぞれのウェルに添加し、次に、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。プレートはＤＰＢＳで２回洗浄し、５％のＦＢＳ／ＤＰＢＳ／１ｍＭ ＭｎＣｌ_２中１対５００希釈でのヤギ抗ヒトＡｂ ｓｕｌｆｏタグの２５μＬをそれぞれのウェルに添加し、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。細胞はＤＰＢＳで２回洗浄し、次に２×ＭＳＤリードバッファーＴを１５０μＬそれぞれのウェルに添加した。プレートはＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００リーダー上で読み取り、結合曲線及び結合ＥＣ_５０値は、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。

【0174】

ヒト及びカニクイザル末梢Ｔ細胞結合アッセイ
凍結したヒト又はカニクイザルＰＢＭＣ（標準Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ分離法を使用して血液ドナーから単離される）はＲＰＭＩ１６４０／１０％ ＦＢＳ培地に解凍し、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。約１～２×１０^５（１００μＬ中）を９６ウェルＵ字型底プレートに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。プレートは遠心分離し、上澄みは取り除いた。５％ヤギ血清及び蛍光色素標識抗体カクテルを含有するＦＡＣＳバッファーに希釈した５～０．００００１６μｇ／ｍＬに及ぶ最終濃度で１対５倍希釈を通じて調製された滴定されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロール（２５μＬ）をそれぞれのウェルに添加し、次に、プレートを氷上で１時間インキュベートした。同時に、補償及びＦＭＯ対照も調製した。インキュベーションに続いて、細胞は遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。二次抗体（ＰＥコンジュゲート）は、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに１対２，０００希釈し、５０μＬをそれぞれのウェルに添加した。プレートは氷上で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。フローデータ（ＦＣＳ ３．０ファイル）はＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０ソフトウェアを使用して解析し、結合曲線及び結合ＥＣ_５０値は、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。

【0175】

７．９．２．結果
ＥＣＬ細胞結合
表２５にまとめられているように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨｕＴ７８細胞、ヒト及びカニクイザル血液由来リンパ球についてそれぞれ２６ｐＭ、１３０ｐＭ、６２ｐＭの結合ＥＣ_５０値を示した。

【0176】

【表25】

【0177】

ヒト及びカニクイザル末梢Ｔ細胞結合アッセイ
ヒトとカニクイザル血液由来全、ナイーブ並びにメモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞両方に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合ＥＣ_５０値は表２６に示されている。

【0178】

【表26】

【0179】

平均結合ＥＣ_５０値は、評価されたすべてのＴ細胞サブセット上で１０～１６５ｐＭに及ぶ。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト及びカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞又はそのサブセットに非常に類似した形で結合する。なぜならば、それぞれの対応する細胞型についての平均ＥＣ_５０値は、これらの２つの種間で２～３倍しか変動しないからである。

【0180】

ヒト及びカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴサブセットへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合Ｔ細胞サブセットのパーセンテージを比較するためにも分析し、図１３に示されている。全体では、それぞれのＴ細胞サブセット中のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合細胞のパーセンテージは、ヒトとカニクイザルの間で匹敵する。これらの発見は、ヒト及びカニクイザル由来のα４とβ７の両方は高度に相同的である（９７％アミノ酸同一性、表２７参照）という事実があるので驚くことではなかった。

【0181】

【表27】

【0182】

さらに、カニクイザルに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの機能的交差反応性は、ｉｎ ｖｉｖｏ研究で確かめた。カニクイザルでＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを繰り返し投与すると、α４β７受容体が完全に占められた時には、末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞数は増加した。これらのデータは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのオンターゲット機能的薬力学的効果を示しており、カニクイザルをＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの毒性学的評価のための薬理学的に妥当な種として支持した。

【0183】

要約すれば、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトとカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔサブセットの両方に強く結合し、優れたカニクイザル結合交差反応性を実証している。

【0184】

［実施例１０］
７．１０．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのインテグリン結合特異性
７．１０．１．材料及び方法
個別のヒト及びカニクイザルヘテロ二量体インテグリンα４β７、α４β１及びαＥβ７を発現する組換え細胞により、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性の評価が可能になった。

【0185】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト上皮ＨＥＫ２９３細胞への非特異的結合についても評価した。

【0186】

インテグリン結合特異性アッセイ
種々のヒト及びカニクイザルインテグリン（α４β７、α４β１又はαＥβ７）発現ＣＨＯ－Ｋ１又はＢＡＦ３細胞は、カニクイザルα４β１を除いて、収集し、数を数え、ミリリットル当たり１．５×１０^６細胞の密度でＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、１％ＢＳＡ）中で調製した。１．５×１０^５細胞を含有する１００μＬを、９６ウェルＵ字型底プレートのそれぞれのウェルに添加し、遠心分離して上澄みを取り除いた。ＦＡＣＳバッファー中の滴定されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、アッセイ対照又はアイソタイプコントロール（それぞれ１００μＬ）を添加して、細胞ペレットを元に戻した。ウェル内容物は混合し、続いて氷上で１時間インキュベートした。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、次に、ＦＡＣＳバッファー中１対６００希釈二次抗体（ヤギ抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃγ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）の１００μＬをそれぞれのウェルに添加して混合させた。プレートは氷上で４５分間インキュベートした。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいて測定した。細胞結合抗体についての蛍光強度中央値は、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。

【0187】

カニクイザルα４β１を発現するＣＨＯ－Ｋ１では、それぞれ１対２５希釈でのＣＤ２９－ＡＰＣ及びＣＤ４９ｄ－ＢＶ４２１混合物の２５μＬ並びにＦＡＣＳバッファー中１対５倍段階希釈により調製されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、アッセイ対照又はアイソタイプコントロールの２５μＬを含有する抗体染色カクテルを、９６ウェルＵ字型底のそれぞれのウェルに添加し、カニクイザルα４β１細胞ペレットを元に戻した。ウェル内容物は混合し、続いて氷上で４５分間インキュベートした。併せて、染色対照も調製した。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、次に、ＦＡＣＳバッファー中１対６００希釈二次抗体（ヤギ抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃγ特異的ＰＥ）５０μＬをそれぞれのウェルに添加して、混合した。プレートは氷上でさらに４５分間インキュベートした。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。次に、ＣＤ２９＋ＣＤ４９ｄ＋細胞をゲート開閉して、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して細胞結合試験抗体について蛍光強度中央値を決定した。データはグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してプロットした。

【0188】

非特異的ＨＥＫ２９３細胞結合アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞は完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ピルビン酸Ｎａ）で培養した。細胞は、非酵素的解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ１３１５１－０１４）を使用して収集し、数を数えて、ＦＡＣＳバッファー（２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）に１．５×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。９６ウェルＵ字型底プレートのそれぞれのウェルに、７．５×１０^４細胞を分散させた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、陽性対照抗体又はアイソタイプコントロール抗体をそれぞれのウェルに１００μｇ／ｍＬで添加し、氷上で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中１対１００希釈ヤギ抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ１０９－１１６－０９８）の１００μＬと一緒に氷上で３０分間さらにインキュベートした。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）により読み取った。結合データはグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して解析した。

【0189】

７．１０．２．結果
インテグリン結合特異性
図１４Ａ～１４Ｃに示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒトα４β７発現細胞に特異的に結合し、ヒトα４β１発現細胞には結合せず、抗α４ｍＡｂ、Ａｂ－ｎａｔａは両インテグリンに確かに結合した。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗β７ｍＡｂ、研究グレードのエトロリズマブについて観察されたはるかに強力な結合と比べてヒトαＥβ７発現細胞には最小限に結合した。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、カニクイザルインテグリンには類似する結合特異性プロファイルを示した。これらのデータにより、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトとカニクイザルα４β７の両方に対し結合特異性を有することが示された。

【0190】

非特異的ＨＥＫ２９３細胞結合
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト上皮ＨＥＫ２９３細胞への非特異的結合についても評価した。図１５に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、対照抗体に匹敵して、高濃度（１００μｇ／ｍＬ）ではＨＥＫ２９３細胞への非特異的結合は全く見せず、陽性対照ｍＡｂはこれらの細胞に強い非特異的結合を示した。

【0191】

［実施例１１］
７．１１．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのウサギ及び齧歯動物結合交差反応性
７．１１．１．材料及び方法
ウサギ、ラット及びマウスから単離されたＰＢＭＣへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、フローサイトメトリーによって評価した。

【0192】

ウサギ及び齧歯動物交差反応性結合アッセイ
ウサギＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ ＦＢＳ培地に置き、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。細胞（１００μＬ中１×１０^５）を９６ウェルＵ字型底プレート中に分散させ、氷上で３０分間インキュベートした。プレートは遠心分離して上澄みを取り除き、滴定されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロールの２５μＬプラス１対１０希釈ＣＤ４－ＦＩＴＣ抗体の２５μＬ（ＡｂはすべてＦＡＣＳバッファーに希釈される）をそれぞれのウェルに添加し、細胞ペレットを元に戻した。ウェル内容物は混合し、続いて氷上で４５分間インキュベートした。併せて、適切な染色対照も調製した。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、二次抗体－ＰＥの５０μＬを、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに１対２０００希釈で細胞ペレットに添加した。プレートは氷上４５分間さらにインキュベートした。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。パーセンテージ抗体結合細胞は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して決定し、結合曲線及び結合ＥＣ_５０値はグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。

【0193】

メスＣ５７Ｂ／６Ｎマウス及びメスルイスラットは、それぞれＴａｃｏｎｉｃ研究所及びＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ研究所から受け取った。ＰＢＭＣはプールされたマウスから単離され、ラット血液はラット動物から単離された。赤血球はＲＢＣ溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して溶解した。細胞はＰＢＳで１回洗浄し、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、１％ＢＳＡ）に再懸濁した。おおよそ２．５×１０^５細胞（１００μＬ）は、９６ウェルＵ字型底プレートに添加し、次に氷上で３０分間インキュベートした。適切な蛍光色素コンジュゲート抗体は、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロールに加えて、１対５０希釈でマウス細胞（ＣＤ３－ＡＰＣ、α４β７－ＰＥ又はＩｇＧ２ａ－ＦＩＴＣ対照）又はラット細胞（ＣＤ３－ＡＰＣ、α４－ＦＩＴＣ又はＩｇＧ２ａ－ＰＥ対照）に添加した。ウェル内容物は徹底的に混合し、プレートは氷上で１時間インキュベートした。最終濃度は、アイソタイプコントロール及びＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴでは１０及び１μｇ／ｍＬであった。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、二次抗体－ＰＥ又は二次抗体－ＡＦ４８８の１００μＬは１対８００希釈でウェルに添加し、ウェルは氷上で４５分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。試験抗体又はアイソタイプコントロールに結合したパーセンテージＣＤ３＋細胞は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して決定し、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してグラフで表した。

【0194】

７．１１．２．結果
表２８にまとめたように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト及びカニクイザル対応物と比べて、ウサギリンパ球及びＣＤ４＋Ｔ細胞について類似する結合ＥＣ_５０値を示し、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ラット又はマウスＰＢＭＣ（リンパ球及びＣＤ４＋Ｔ細胞）への測定できるほどの結合は全く示さなかった。

【0195】

【表28】

【0196】

［実施例１２］
７．１２．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ誘導α４β７内部移行
７．１２．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、２人のＰＢＭＣドナー由来のヒト一次ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞上で細胞表面α４β７の内部移行を誘導するその能力について調べた。

【0197】

内部移行アッセイ
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ内部移行は、エトロリズマブの細胞機構を決定するのに使用されたのと類似のＦＡＣＳプロトコルを使用して調べ定量化した（Ｌｉｃｈｎｏｇら、Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（ＧＥ １７－１４４０－０３）及びＳｅｐＭａｔｅチューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ８５４５０）を使用して２人の健康な血液ドナー（ＲＢＣ、Ｄｏｎｏｒ ＫＰ５８２１９及びＫＰ５８２３９）から単離し、５％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １０４３８－０２６）に再懸濁し、液体窒素に凍結保存した。凍結ＰＢＭＣを解凍し、数を数え、ＲＰＭＩ培地＋１０％ ＦＢＳ中１×１０^６細胞／ｍＬで元に戻し、１００μＬの細胞をウェル当たり１×１０^５細胞で蒔いた。次に、蒔いた細胞を４℃でインキュベートする又は３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータに３０分間置いてプレート温度を順応させた。ヒトＰＢＭＣは、１．２５μｇ／ｍＬ（最終０．６２５μｇ／ｍＬ）での２×濃縮、非標識Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ抗体の１００μＬと一緒に４℃で１時間、前インキュベートさせた。細胞は遠心分離し、洗浄して、２００μＬのＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳに再懸濁し、４℃又は３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）で２回洗浄し、次に、ＡＦ６４７標識非競合抗β７抗体と一緒に又はこれなしで、ＣＤ４＋（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１７４１０）、ＣＤ８＋（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４４７１０）及びＣＤ４５ＲＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０４１３０）を用いて３０分間染色した。細胞蛍光はフローサイトメトリー（ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ）により獲得した。データは、ＦｌｏｗＪｏ １０ソフトウェアを使用して解析し、パーセンテージ内部移行は、１００×［内部移行前の全細胞表面α４β７発現（４℃でＭＦＩ）－内部移行後の残りの細胞表面α４β７発現（３７℃でＭＦＩ）／内部移行前の全細胞表面α４β７発現（４℃でＭＦＩ）］により計算した。

【0198】

７．１２．２．結果
図１６Ａに示されるように、内部移行を最小にするために、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが４℃でヒトＰＢＭＣに結合した１８時間後に評価した場合、ドナー１由来のＣＤ４＋ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ^＋）の７３％及びＣＤ８＋のナイーブＴ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ^＋）の４９％がβ７陽性のままであった。しかし、内部移行を促進するために同じプロトコル下でしかし３７℃でのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴインキュベーション後では、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の１７％及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の７％だけがβ７陽性であることが見出された。これらのデータは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴに結合した表面α４β７の有意な内部移行は３７℃で起こったことを示している。類似する結果がドナー２由来のＰＢＭＣを用いて観察された。図１６Ｂで３７℃でのα４β７内部移行の定量化に基づけば（４℃での処置後に観察された発現と比べて減少した表面α４β７発現）、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７^＋ナイーブＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方でα４β７内部移行を約８０％誘導することができた。

【0199】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、Ａｂ－Ｖｅｄｏと比べてα４β７内部移行を誘導するのがより強力である。

【0200】

［実施例１３］
７．１３．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴによるＭＡｄＣＡＭ－１リガンド遮断
７．１３．１．材料及び方法
ＭＡｄＣＡＭ－１リガンド遮断アッセイ
ＦＡＣＳベースのアッセイでは、ＨｕＴ７８細胞又はヒトＰＢＭＣを収集し、ＤＰＢＳで１回洗浄し、１．５×１０^６細胞／ｍＬの密度に調整して、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、１％ＢＳＡ／１ｍＭ ＭｎＣｌ_２）に再懸濁した。１×１０^５（１００μＬ）／ウェルで細胞を９６ウェルＵ字型底プレート中に分散させ、遠心分離して上澄みを取り除いた。滴定したＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロール（５０μＬ）プラスＦＡＣＳバッファー中に０．３μｇ／ｍＬのＭＡｄＣＡＭ－１－ｍＦｃ、２ｍＭのＭｎＣｌ_２及び１対５０希釈（３０μｇ／ｍＬ）Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート検出Ａｂを含有する５０μＬの混合物をそれぞれのウェルに添加した。プレートは氷上で１時間インキュベートし、次に遠心分離した。プレートは２００μＬのＦＡＣＳバッファーで１回穏やかに洗浄し、細胞は同じバッファーで元に戻した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ）により読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱ゲート開閉により決定した。フローデータ（ＦＣＳ ３．０ファイル）は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して解析し、結合曲線及び阻害ＩＣ_５０値はグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。

【0201】

プレートベースのアッセイでは、９６ウェル平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ ６５５０７７）を、コーティングバッファー（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、０．１％ＢＳＡ）を使用して４℃で一晩、１００μＬの２０μｇ／ｍＬ ＭＡｄＣＡＭ－１ ｈＦｃ又はアイソタイプコントロール（最終濃度２μｇ／ウェル）で被覆した。次の日、プレートを２００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、０．１％ＢＳＡ）で２回洗浄し、次に、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、１％ＢＳＡ）を使用して３７℃で１時間遮断した。ブロッキングインキュベーション中、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びアイソタイプコントロールの希釈液を調製し、ＨｕＴ７８細胞を収集した。２×開始濃度は５μｇ／ｍＬで調製し、次に段階１対４．５ ７ポイント希釈（最終濃度は２．５～０．０００３μｇ／ｍＬに及ぶ）は２通り又は３通り実施した。細胞は数え、洗浄し、アッセイ培地（ＩＭＤＭ、１％ ＢＳＡ）に２×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁し、これに最終濃度２ｍＭのＭｎＣｌ_２を添加し、１００，０００細胞を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに分散させた。次に、希釈した抗体を細胞に添加し、混合物は３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした。ＭＡｄＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートからのブロッキング液はデカントし、１００μＬ／ウェルの前インキュベートしたＨｕＴ７８細胞及びｍＡｂ混合物はＭＡｄＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートのそれぞれのウェル中に分配した。プレートは１，０００ｒｐｍで１分間回転させ、３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした。接着プレートはデカントし、１５０μＬの洗浄バッファーで４回穏やかに洗浄した。洗浄後、１００μＬ／ウェルの混合物（５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬及び５０μＬのアッセイ培地を含有する）をそれぞれのウェルに添加した。プレートはオービタルシェーカー上に２分間置き、次にＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルをプロットし、ＩＣ_５０値はグラフパッドプリズム７．０において４パラメータカーブフィット解析を使用して決定した。

【0202】

７．１３．２．結果
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、プレートベースとＦＡＣＳベースのアッセイの両方を使用して、α４β７発現ＨｕＴ７８細胞及びヒトリンパ球（ＰＢＭＣ）へのＭＡｄＣＡＭ－１タンパク質の組換え細胞外ドメインの結合を遮断するその能力について試験した。

【0203】

ＦＡＣＳ－及びプレートベースのアッセイを使用することにより、それぞれ５０ｐＭ及び２５ｐＭのＩＣ_５０値が得られた。

【0204】

さらに、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴによるヒト血液由来リンパ球へのＭＡｄＣＡＭ－１結合の遮断が２２３ｐＭのＩＣ_５０値で観察された（表２９）。

【0205】

【表29】

【0206】

これらのデータにより、ＭＡｄＣＡＭ－１／α４β７相互作用に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの強い阻害効果が実証された。

【0207】

［実施例１４］
７．１４．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＭＡｄＣＡＭ－１同時刺激を遮断する
７．１４．１．材料及び方法
ヒトＰＢＭＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞単離
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は健康なドナーから収集した新鮮な血液から単離された。次に、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４ネガティブセレクションキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＢＭＣから単離した。

【0208】

ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化及び増殖アッセイ
９６ウェル平底組織培養プレートを、ＨＢＳＳ中２００ｎｇ／ウェル抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて４℃で一晩被覆した。翌日、抗ＣＤ３被覆プレートをＨＢＳＳで１回洗浄し、２００ｎｇ／ウェルのＭＡｄＣＡＭ－１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、プレートは２００μｌのＨＢＳＳで１回洗浄し、５０，０００ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌ試験抗体の存在下又は非存在下でそれぞれのウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で９６時間培養後、細胞は洗浄し、Ｌｉｖｅ－Ｄｅａｄ Ａｑｕａバイアビリティー色素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色し、続いて細胞活性化マーカー抗ＣＤ２５ ＦＩＴＣ（クローンＭＡ０２５１ ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗Ｋｉ６７ ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。細胞はフローサイトメーター上で分析し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。複数のドナー由来のデータをプロットし、統計解析はグラフパッドプリズムを使用して実施した。有意性は、テューキー多重比較検定と連結させた一元配置分散分析を使用して決定された。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊ｐ＝０．００１～０．０１。

【0209】

７．１４．２．結果
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＭＡｄＣＡＭ－１同時刺激を遮断する
α４β７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＭＡｄＣＡＭ－１媒介腸管ホーミングは、ＧＡＬＴ（腸管関連リンパ組織）のＨＩＶ感染で中心的な役割を果たす。この役割に加えて、ＭＡｄＣＡＭ－１は同時刺激シグナルをヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達し、ＨＩＶ複製を促進するとも報告されている（Ｎａｗａｚら、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８年）。ＨＩＶ感染及び複製はこれらの細胞の代謝的活性化を必要とし、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒトリンパ球へのＭＡｄＣＡＭ－１結合を２２３ｐＭのＩＣ_５０値で遮断できる（表３５）ので、本発明者らはＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でＭＡｄＣＡＭ－１同時刺激シグナルを遮断でき、それにより今度はこれらの細胞においてＭＡｄＣＡＭ－１媒介ウイルス複製が阻害されるかどうかを評価した。

【0210】

１人の代表的な健康なドナー由来のヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３単独と一緒に９６時間インキュベートすると、細胞の２２．６％が活性化されＫｉ６７＋ＣＤ２５＋表現型を示した（図１７Ａ）。細胞がプレート結合抗ＣＤ３及びＭＡｄＣＡＭ－１と併せて一緒にインキュベートされると、５６．６％のＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化された。これは、ＭＡｄＣＡＭ－１が同時刺激シグナルを細胞表面α４β７と相互作用することにより媒介されるＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達したことを示している。９６時間のインキュベーション中に細胞にＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを添加すると、細胞活性化は２０．８％まで減少し、これは抗ＣＤ３単独に匹敵するレベルであり、アイソタイプコントロールＡｂは細胞活性化に対しては全く阻害効果がなかった。データによれば、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが、ＭＡｄＣＡＭ－１が発揮する同時刺激シグナルを効果的に完全に遮断したことが示唆される。アッセイは、５人の追加の個々のドナー由来の一次ＣＤ４ Ｔ細胞を用いて繰り返し、データは図１７Ｂにまとめられている。図１７Ａにおいて１人の代表的なドナーから得られたデータと一致して、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＣＤ４＋Ｔ細胞のＭＡｄＣＡＭ－１／α４β７媒介同時刺激をほぼ完全に遮断し、アイソタイプコントロールＡｂには阻害効果は全くなかった。

【0211】

［実施例１５］
７．１５．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＶＣＡＭ－１リガンド遮断特異性
７．１５．１．材料及び方法
ＶＣＡＭ－１媒介細胞接着アッセイにおけるα４β７／ＶＣＡＭ－１相互作用に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの効果が評価された。

【0212】

ＶＣＡＭ－１リガンド遮断アッセイ
プレート（９６ウェル平底型、Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ ６５５０７７）を、コーティングバッファー（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、０．１％ＢＳＡ）を使用して４℃で一晩、２０μｇ／ｍＬのＶＣＡＭ－１ ｈＦｃ又はアイソタイプコントロール（最終濃度２μｇ／ウェル）を１００μＬ用いて１日目に被覆した。２日目、プレートは２００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、０．１％ＢＳＡ）で３回洗浄し、次に、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、１％ＢＳＡ）を使用して３７℃で１時間又はそれよりも長く遮断した。ブロッキングインキュベーション中、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、Ａｂ－ｎａｔａ及びアイソタイプコントロールの希釈液を調製し、ＨｕＴ７８細胞を収集した。抗体の２×開始濃度は４μｇ／ｍＬで調製し、次にアッセイ培地（ＩＭＤＭ、１％ＢＳＡ）中１対４倍段階希釈液を作った。ＨｕＴ７８細胞の数を数え、洗浄しアッセイ培地中２×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁し、これに最終濃度２ｍＭのＭｎＣｌ_２を添加し、１００，０００細胞を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに分散させた。次に、希釈した抗体を細胞に添加し、混合物は３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした。ＶＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートからのブロッキング液はデカントし、１００μＬの前インキュベートしたＨｕＴ７８細胞及びｍＡｂ混合物はＶＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートのそれぞれのウェル中に分配した。プレートは３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートし、次に、洗浄バッファーを使用して３回穏やかに洗浄した。洗浄後、１００μＬ／ウェルの混合物（５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬及び５０μＬのアッセイ培地を含有する）をそれぞれのウェルに添加した。プレートはオービタルシェーカー上に２分間置き、次にＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルをプロットし、グラフパッドプリズム７．０において４パラメータカーブフィット解析を使用してＩＣ_５０値を決定した。

【0213】

７．１５．２．結果
血液リンパ球の腸管ホーミングを可能にするＭＡｄＣＡＭ－１へのα４β７結合に加えて、α４β７は内皮細胞上で発現されるＶＣＡＭ－１にも結合できる（表３０）。

【0214】

【表30】

【0215】

ナタリズマブ、Ａｂ－ｎａｔａ抗α４ ｍＡｂは、ＶＣＡＭ－１へのα４β７及びα４β１結合を遮断することができるが、脳への循環リンパ球の輸送を遮断するせいで進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）を引き起こした。したがって、ＶＣＡＭ－１媒介細胞接着アッセイでのα４β７／ＶＣＡＭ－１相互作用に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの効果の評価は、Ａｂ－ｎａｔａを陽性対照として使用して調べるための非常に重要な安全パラメータであった。予想通り、Ａｂ－ｎａｔａは、ＶＣＡＭ－１媒介ＨｕＴ７８細胞接着を５６ｐＭの平均ＩＣ_５０値で遮断した。これとは対照的に、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＶＣＡＭ－１により媒介されるＨｕＴ７８細胞接着の検出できるほどの遮断を全く示さなかった（図１８）。

【0216】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはα４β７／ＭＡｄＣＡＭ－１相互作用を高い効力で選択的に遮断するが、α４β７／ＶＣＡＭ－１相互作用の阻害は全く示さない。

【0217】

［実施例１６］
７．１６．ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃＲｎに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合親和性
７．１６．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗体ＩｇＧ１対照であるトラスツズマブと比べて、組換えヒト及びカニクイザルＦｃγＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質のパネルへのその結合親和性についてＢＩＡｃｏｒｅにより評価した。

【0218】

ヒトＦｃγＲへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合も、種々の細胞表面ヒトＦｃγＲを発現するように操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を使用することによりフローサイトメトリーを介して評価した。

【0219】

ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、組換えヒト及びカニクイザルＦｃＲｎ ＥＣＤタンパク質を使用してＢＩＡｃｏｒｅによりｐＨ６．０及びｐＨ７．４で評価した（表３１）。

【0220】

【表31】

【0221】

ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合アッセイ
Ｈｉｓタグ付きヒトＦｃγＲに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合速度論は、抗Ｈｉｓ補足を使用して２５℃でＢｉａｃｏｒｅＴ２００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行うＳＰＲ測定により決定した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中２５μｇ／ｍＬまで希釈されたおおよそ１００００ＲＵのマウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ）を、標準アミンカップリングキットを製造業者の説明書に従って使用してＣＭ５バイオセンサーチップ中に固定化した。バイオセンサー表面の未反応部分は１Ｍのエタノールアミンで遮断した。フローセル１上の活性化及び非活性化表面は参照として使用された。チップ調製及び結合動力学測定はアッセイランニングバッファー、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中で行われた。次に、ヒト及びカニクイザルＦｃγＲは、補足レベル２５０～５００ＲＵに達するまでフローセル２上で補足された。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ試料は、５０μＬ／分の流速で１～５分間（ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａでは１分間、ヒトＦｃγＲＩＩＩａでは２分間並びにヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ＆カニクイザルＦｃγＲでは５分間）すべてのフローセル上に注入された。分析物濃度は、ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ、カニクイザルＦｃγＲＩＩＩでは０．７８～２００ｎＭ、ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩＩでは４６．９～１２０００ｎＭ並びにＦｃγＲＩＩでは７．８～４０００ｎＭ（２倍段階希釈）の範囲に及んだ。バッファーのみ注入はダブル参照のために含まれた。結合ＦｃγＲ解離は、１～５分間（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａでは１分間、ＦｃγＲＩＩＩａでは３分間及びＦｃγＲＩでは５分間）モニターされた。チップ表面は、８チャネルすべてにわたり流速１００μＬ／分で２秒間、注入された１００ｍＭのＨＣｌを用いて再生させた。同じＣＭ５チップを使用する３つの実験はそれぞれの試料について実行した。これら３実験の結果は平均された。

【0222】

ヒトＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ細胞結合アッセイ
ＣＨＯ－Ｋ１発現ｈＦｃγＲ細胞は１５０ｃｍ^２培養フラスコで生育し、特定量のフルオロフォア、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ^商標及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ^商標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を製造業者の説明書に従って負荷させ、それぞれの系について独特の蛍光フットプリント（バーコード法）を確立した。系を混合し、ＲＰＭＩ１６４０／２ｍＭのＬ－グルタミン／１０％の超低ＩｇＧ熱不活化ＦＢＳ（結合培地）中異なる濃度（０、０．０１、０．１、１、１０、５０、１００、及び２５０μｇ／ｍＬ）で単量体Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと一緒に４℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＰＢＳ、ｐＨ７．４（ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２）で２回洗浄し、細胞結合Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを検出するために、結合培地中のＡＦ６４７に連結した二次抗体（Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と一緒に４℃で１５分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＰＢＳ、ｐＨ７．４（ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２）でさらに２回洗浄した。細胞表面蛍光はフローサイトメトリーアナライザー（ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ）を使用して検出し記録した。記録された蛍光データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０（Ｔｒｉｓｔａｒ）を使用して解析され、ＣＨＯ－Ｋ１ ｈＦｃγＲ細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合はＡＦ６４７の蛍光の幾何平均として報告された（Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ濃度の関数としてのｇＭＦＩの結合曲線が作成された）。

【0223】

ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎ表面プラズモン結合アッセイ
ＦｃＲｎ結合アッセイでは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＣＭ５チップアミンカップリング上に製造業者のプロトコルに従って７５０ＲＵの密度まで直接固定化した。ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎ組換えタンパク質は、５．５～１２０００ｎＭ（３倍段階希釈）に及ぶ濃度で、５０μＬ／分の流速で１分間すべてのフローセル上に注入され、続いて１分間解離された。表面はＨＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ７．４の１５秒間の注入で再生させた。試料は調製され、２種類のランニングバッファーＭＥＳ ＥＰ＋ｐＨ６．０及びＨＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ７．４で流された。異なるＣＭ５チップを使用する３つの実験をそれぞれの試料について実行した（それぞれが２通り）。これら３実験の結果は平均させた。すべての試料に結合するヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）及びカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩからのデータは、一定のＲ_ｍａｘを有する１対１グローバル動力学モデルにフィットさせた。すべての試料に結合するヒトＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）、カニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃＲｎからのデータは、定常状態親和性モデルにフィットさせた。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン２．０を使用してＦｃγＲ及びＦｃＲｎデータをフィットさせた。

【0224】

７．１６．２．結果
ヒト及びカニクイザルＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ結合
結合動力学パラメータは表３２（ヒトについて）及び表３３（カニクイザルについて）にまとめられている。

【0225】

【表32】

【0226】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びトラスツズマブは、ｈＦｃγＲＩとｈＦｃγＲＩＩ（Ｈ１３１）の両方に類似する測定できるほどの結合親和性を、ｈＦｃγＲＩＩ（Ｒ１３１）及びｈＦｃγＲＩＩｂ受容体へのもっと弱い結合を有していた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びトラスツズマブは、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８／Ｖ１５８）に測定できるほどの結合親和性を有し、予想された通り、Ｖ１５８多形性バリアントにはより高い親和性を有していた。

【0227】

【表33】

【0228】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとトラスツズマブの両方が、カニクイザルＦｃγＲＩとカニクイザルＦｃγＲＩＩＩの両方への結合を見せたが、カニクイザルＦｃγＲＩＩａとカニクイザルＦｃγＲＩＩ受容体では、おそらくこれらの受容体へのその弱い結合のせいで測定できるほどの結合パラメータを決めることはできなかった。
ヒトＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ細胞結合アッセイ
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトＦｃγＲ１及びＦｃγＲＩＩａ（Ｖ１７６）多形性バリアントへの最も高い結合を示したが、他のヒトＦｃγＲ［ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１７６）及びＦｃγＲＩＩＩｂ］への結合は比較的低かった（図１９Ａ～１９Ｂ）。

【0229】

ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎ表面プラズモン結合アッセイ
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、酸性条件（ｐＨ６．０）下ではヒト及びカニクイザルＦｃＲｎへの測定できるほどの結合を見せたが、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）では測定できるほどの結合はなかった（表３４）。ＦｃＲｎ結合特性は対照（トラスツズマブ）に匹敵していた。

【0230】

【表34】

【0231】

［実施例１７］
７．１７．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性
７．１７．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、天然のα４β７／ＣＤ２０発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を標的細胞として、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）又はｈＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）を発現するレポータージャーカット細胞をエフェクター細胞として使用してｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性について評価した。このジャーカット細胞系は、レポーターとしてホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを有していた。抗ＣＤ２０ｍＡｂであるＡｂ－Ｒｉｔｕは、これらのアッセイでは陽性対照として使用した。

【0232】

さらに、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７／ＣＤ５２発現ＨｕＴ７８細胞を標的細胞として、ヒト一次ＮＫ細胞をエフェクター細胞として、Ｃａｍｐａｔｈ（抗ＣＤ５２）を陽性対照抗体として使用する細胞傷害性ベースのＡＤＣＣアッセイにおいて評価した。

【0233】

ＡＤＣＣレポーターアッセイ
標的α４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を生育し培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳ）に維持した。対数期細胞を収集し、数を数え、洗浄して、６×１０^５細胞／ｍＬストックでアッセイ培地（低ＩｇＧ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁し、使用準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ_２に置いた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及び対照ｍＡｂは３０μｇ／ｍＬの３×開始濃度で調製し、次に、Ｃｏｓｔａｒ３９５６希釈プレートに１対１００で段階（２ｐｔ．）希釈した。抗体（２５μＬ）は、プレートレイアウトに従って等容積の標的ＲＰＭＩ８８６６細胞（２５μＬ）と２通り混合した。エフェクタージャーカット細胞（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８バリアント及びＰｒｏｍｅｇａ^商標社製のホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定的に発現する）を急速解凍し、アッセイ培地中３×１０^６細胞／ｍＬに調整した。次に、ジャーカットエフェクター（２５μＬ）をＲＰＭＩ８８６６標的及び抗体を含有する９６ウェルアッセイプレートに添加した。対照ウェルは、培地単独、エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）単独、Ｅ＋Ｔ、Ｅ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）又はＴ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）を含んだ。すべてのウェルはプレートレイアウトに従ってウェル当たり７５μＬに調整した。最終細胞数は、５対１のＥ対Ｔ比に応じて、７５，０００ジャーカットエフェクター細胞／ウェル及び１５，０００ＲＰＭＩ８８６６標的細胞／ウェルであった。ウェル当たりの最終抗体濃度は、６７ｎＭ（１０μｇ／ｍＬ）、０．６７ｎＭ（０．１μｇ／ｍＬ）及び０．００６７ｎＭ（０．００１μｇ／ｍＬ）であった。プレートは３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートし、その間Ｂｉｏ－Ｇｌｏ^商標バッファー及び基質（Ｃａｔ７１１０）は使用に先立ってＲＴに平衡させた。インキュベーション終了時、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ基質はバッファーで元に戻して酵素／基質溶液（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬）を形成させた。等容積の７５μＬ／ウェルＢｉｏ－Ｇｌｏをすべてのウェルに添加した。次に、プレートをＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルは、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してＲＬＵとしてプロットした。

【0234】

ＡＤＣＰレポーターアッセイ
標的α４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を生育し培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳ）に維持した。対数期細胞を収集し、数を数え、洗浄して、２×１０^５細胞／ｍＬストックでアッセイ培地（低ＩｇＧ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁し、使用準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ_２に置いた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及び対照ｍＡｂは３０μｇ／ｍＬの３×開始濃度で調製し、次に、Ｃｏｓｔａｒ３９５６希釈プレートに１対１００で段階（２ｐｔ．）希釈した。抗体（２５μＬ）は、プレートレイアウトに従って等容積の標的細胞（２５μＬ）と２通り混合した。エフェクタージャーカット細胞（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｈ１３１バリアント及びＰｒｏｍｅｇａ^商標社製のホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定的に発現する）を急速解凍し、アッセイ培地中１×１０^６細胞／ｍＬに調整した。次に、ジャーカットエフェクター（２５μＬ）をＲＰＭＩ８８６６標的及び抗体を含有する９６ウェルアッセイプレートに添加した。対照ウェルは、培地単独、エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）単独、Ｅ＋Ｔ、Ｅ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）又はＴ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）を含んだ。すべてのウェルはプレートレイアウトに従ってウェル当たり７５μＬに調整した。最終細胞数は、５対１のＥ対Ｔ比に応じて、２５，０００ジャーカットエフェクター細胞／ウェル及び５，０００標的細胞／ウェルであった。ウェル当たりの最終抗体濃度は、６７ｎＭ（１０μｇ／ｍＬ）、０．６７ｎＭ（０．１μｇ／ｍＬ）及び０．００６７ｎＭ（０．００１μｇ／ｍＬ）であった。プレートは３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートし、その間Ｂｉｏ－Ｇｌｏ^商標バッファー及び基質（Ｃａｔ７１１０）は使用に先立ってＲＴに平衡させた。インキュベーション終了時、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ基質はバッファーで元に戻して酵素／基質溶液（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬）を形成させた。等容積の７５μＬ／ウェルＢｉｏ－Ｇｌｏをすべてのウェルに添加した。次に、プレートをＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルは、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してＲＬＵとしてプロットした。

【0235】

ＣＤＣアッセイ
ＲＰＭＩ８８６６細胞を生育し培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳ）に維持した。対数期細胞を収集し、数を数え、洗浄して、４×１０^６細胞／ｍＬストックでアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０マイナスフェノールレッド、Ｃａｔ１１８３５－０３０）に再懸濁し、使用準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ_２に置いた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及び対照ｍＡｂは、Ｃｏｓｔａｒ３９５６希釈プレートにおいて４５μｇ／ｍＬ及び０．４５μｇ／ｍＬの３×開始濃度で調製した。ヒトドナー血清（ＨＭＮ１９１６９及びＨＭＮ１９１７０）を冷ランニング水を使用して解凍し直ちに氷上に置いた。抗体、対照（２５μＬ）及び培地をアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９９）に添加した。ドナー血清（それぞれ２５μＬ）、標的細胞（２５μＬ）及び希釈ｍＡｂ（２５μＬ）を、３３％血清補体、１×１０^５細胞及び１５μｇ／ｍＬ ｍＡｂを含有するウェル当たり７５μＬの最終容積で混合した。次に、プレートは３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートした。インキュベーション後、１．５ｍｇ／ｍＬの５×ストック溶液での細胞透過性色素（Ｓｉｇｍａ；Ｒｅｓａｚｕｒｉｎナトリウム塩）を、ＤＰＢＳに１対５で希釈し、２５μＬの色素をそれぞれのウェルに添加した。プレートはさらに１６時間インキュベートし、次に、吸光度（５４５／６００）をＣｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーを使用して読み取った。パーセンテージ標的特異的細胞溶解は、式：１００－１００×［（ｍＡｂインキュベーションでの吸光度）／（対照吸光度）］を使用してＥｘｃｅｌで計算し、結果はグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してプロットした。

【0236】

ＡＤＣＣ細胞傷害性アッセイ
標的α４β７発現ＨｕＴ７８細胞を収集し、ＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２、１％ＢＳＡ）で２回洗浄し、１×１０^７細胞／ｍＬでＰＢＳに再懸濁し、次に、ＲＴで８分間、最終濃度２μＭでＣＦＳＥを用いて標識した。インキュベーション後、ＦＢＳを１０％最終濃度で添加して、標識化をクエンチした。細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地で２回洗浄し、次にＣＦＳＥ標識化ＨｕＴ７８細胞は、１０μｇ／ｍＬで２×濃度のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又は対照抗体の１００μＬと一緒に、９６ウェルＶ字型底プレートにおいて３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした。続いて、１００μＬの２．５×１０^５ＮＫ（ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８＋）エフェクター細胞（２００Ｕ／ｍＬでＩＬ－２と一緒に前インキュベートした）を５対１比で標的細胞に添加した。ウェル内容物は徹底的に混合し、続いてＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で５時間インキュベートした。ＮＫ及びＨｕＴ７８細胞混合物はＰＢＳで２回洗浄し、１μＬのＦＶＤ色素／ｍＬを含有する無アジド及び無タンパク質ＰＢＳを用いて１×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁し、ＲＴで２０分間インキュベートした。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％のＰＦＡの２００μＬに再懸濁し、プレートはＦＡＣＳ（ＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ）上で読み取った。フローデータ（ＦＣＳ ３．０ファイル）は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用することにより解析した。すべてのＨｕＴ７８標的細胞（ｌｉｖｅ及びｄｅａｄ）はゲート開閉させて全標的細胞集団内の％ｄｅａｄ標的を決定した。％ＡＤＣＣ計算に使用される式は、％ＡＤＣＣ＝１００×［（Ｅ＋Ｔ＋Ａｂ）混合物中の％ｄｅａｄ標的－（Ｅ＋Ｔ）ミックス中の％ｄｅａｄ標的］／［１００－（Ｅ＋Ｔ）ミックス中の％ｄｅａｄ標的］であった。パーセンテージＡＤＣＣは、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してグラフで示した。

【0237】

７．１７．２．結果
ＡＤＣＣレポーター活性、ＡＤＣＰレポーター活性及びＣＤＣ
予想通りに、Ａｂ－Ｒｉｔｕは強い濃度依存性ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を示したが、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びアイソタイプコントロールは、試験された３種の濃度（１０、０．１、０．００１μｇ／ｍＬ）ではこれらの活性のどれも示さなかった（図２０Ａ及び２０Ｂ）。３種の陰性対照アッセイ条件、すなわち、標的及びエフェクター単独、標的プラス抗体、並びにエフェクタープラス抗体では最小シグナルのみが検出された（データは示さず）。Ａｂ－Ｒｉｔｕは、ＲＰＭＩ８８６６細胞上、０．１５及び１５μｇ／ｍＬ（１００ｎＭ）で強いｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＤＣ活性も示し、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びアイソタイプコントロールは、２つのヒト血清ドナーを使用して対応する濃度でＣＤＣシグナルを示さなかった（図２１）。

【0238】

ＡＤＣＣ細胞傷害性
このｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、Ｃａｍｐａｔｈ（Ａｂ－Ａｌｅｍ）は標的細胞に対して強い細胞傷害性を示した。これとは対照的に、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、アッセイを、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８遺伝子型を用いて２人の異なるドナーから単離されたＮＫエフェクター細胞を使用して実施した場合、１０μｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）濃度ではいかなるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性も誘導しなかった（図２２）。したがって、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは上に示されるように（実施例１２）ヒトＦｃγＲに結合するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは非感染α４β７＋細胞に対して望ましくないＦｃ媒介ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性を誘導しない。

【0239】

［実施例１８］
７．１８．標的上のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合部位のホモロジーモデリング
７．１８．１．材料及び方法
α４β７へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合様式はホモロジーモデリングにより調べた。別の抗α４β７抗体ベドリズマブとの複合体中の組換えヒトα４β７細胞外ドメインタンパク質の結晶構造は、公表されている（Ｙｕら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１２年）。そのデータ及びＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＦａｂ領域の独特の配列に基づいて、ベンチマーク抗体ベドリズマブ及びＡＭＧ１８１と比べた候補抗体の結合様式のモデリングに取りかかった。

【0240】

７．１８．２．結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価データと一致して、ハイブリドーマＡｂ－ｍ１のヒト化バリアントでありＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの親であるＡｂ－ｈ１．９及び２種のベンチマークｍＡｂは、主にβ７サブユニットとの相互作用を通じて、しかし、僅かではあるが、α４サブユニットとも相互作用をしてα４β７に結合する。このモデルにより、α４β１への結合の欠如及びαＥβ７への非常に低い結合が説明される。興味深いことに、このモデルにより、Ａｂ－ｈ１．９がα４サブユニット上でわずかに多くの残基に結合する点で、Ａｂ－ｈ１．９と２つのベンチマークｍＡｂの間の微妙な違いが示唆される。モデルで明白である重複するエピトープにより、Ａｂ－ｈ１．９とベドリズマブは、その標的への結合を巡って競合するはずであると予想される。実際、ＦＡＣＳベースの結合競合研究では、Ａｂ－ｍ１は、α４β７＋細胞へのＡｂ－Ｖｅｄｏ結合と競合することができ、Ａｂ－ｍ１とＡｂ－Ｖｅｄｏは類似する結合エピトープに結合することを示していた（表１３）。

【0241】

７．１９．考察
ＨＩＶ＋及びＨＩＶ－個人由来の末梢ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上でのα４β７の発現レベルは同等であり、ＨＩＶ＋個人由来のＣＤ４＋Ｔ細胞でのα４β７発現が、出芽ＨＩＶビリオン中へのα４β７の組込みを支持できることを示唆している。

【0242】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、試験されたすべての実験室生育ＨＩＶ株及びＨＩＶ患者の試料のビリオンのエンベロープ上のα４β７に結合できる強力な抗α４β７抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンにより形成される免疫複合体は、そのＦｃドメインを通じて異なるＦｃγＲに結合でき、これは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが食作用によりＡＰＣに取り込まれて、ＨＩＶ制御のための提唱されている「予防接種効果」を誘導することができるステップであった。

【0243】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＨＩＶビリオンに結合するが、ＨＩＶ感染を中和せず、このことは、α４β７が宿主細胞上のウイルス受容体ではないという考えと一致している。ＨＩＶウイルスエンベロープ上の宿主タンパク質であるα４β７インテグリンを標的にすることにより、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ広域中和抗体などのウイルスエンベロープ中のＨＩＶウイルス性にコードされたｇｐ１２０／４１糖タンパク質を標的にする他の抗体と比べて耐性に対するより高い障壁を示す可能性がある。

【0244】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、Ｆａｂ依存性機構を通じてα４β７とＭａｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０などのそのリガンドの間の相互作用を破壊でき、ＭａｄＣＡＭ－１又はｇｐ１２０により媒介されるＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激を阻害し、これらの刺激された細胞でのＨＩＶ複製を潜在的に阻害する。

【0245】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の間の相互作用を破壊するその能力を通じて、Ｆａｂ媒介機構による細胞間ＨＩＶウイルス伝播を潜在的に阻害することができる。

【0246】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと比べた場合、Ａｂ－Ｖｅｄｏのほうが、ＨＩＶビリオンを補足しα４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の間の相互作用を破壊する活性が低いことを示した。さらに、Ａｂ－ＶｅｄｏはＨＩＶビリオンと結合して免疫複合体を形成することができたが、これらの免疫複合体は、Ｆｃ機能を低減するＡｂ－Ｖｅｄｏ Ｆｃドメインでの操作された突然変異のせいで、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴにより形成される複合体よりもはるかに低い親和性でＦｃγＲに結合した。

【0247】

ベドリズマブは、ＨＩＶ研究のための２つの臨床試験で中程度の効力を示した。この効力は、Ｆａｂ依存性に帰すことができる（例えば、ＭａｄＣＡＭ－１及びＨＩＶ ｇｐ１２０などのそのリガンドとの相互作用を破壊するα４β７への抗体結合、したがって、ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激及びこれらの刺激された細胞でのＨＩＶ複製、並びに細胞間ウイルス伝播を阻害する）が、Ｆｃ依存性作用機序に帰すことはできない。ＦｃγＲに対するベドリズマブの結合親和性が減少するため、ベドリズマブはＦｃ依存性機構を媒介することが不十分になる。これとは対照的に、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、無傷のＦｃ機能性を有しており、そのＦｃ依存性作用機序を通じて維持されたＨＩＶウイルス抑制を誘導するその能力ではベドリズマブとは明確に区別されうる。新たな耐久性のあるＨＩＶ特異的免疫応答（予防接種効果）を誘導するためには、ＡＰＣ上のＦｃγＲへのＨＩＶビリオンと抗α４β７抗体（無傷のＦｃドメインを有する）により形成される免疫複合体の結合が必要になる。実際、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＴＨＰ－１細胞においてα４β７被覆ビーズ又はα４β７発現ＧＦＰ＋ＶＬＰ（ウイルス様粒子）の取込みをα４β７－及びＦｃ依存的に媒介することができる。まとめると、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、Ｆｃ依存性又はＦａｂ依存性である機構を含む、ＨＩＶ制御のためのいくつかの提唱されている作用機序での活性を示している。したがって、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７に対するそのより高い親和性及び「予防接種効果」を誘導するその無傷のＦｃ機能性のために、ＨＩＶウイルス負荷の維持された低減のためにはベドリズマブよりも強力な作用物質であると予想される。

【0248】

網羅的なｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価からのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの主要な特質は表３５にまとめられている。

【0249】

【表35】

【0250】

Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７に結合するがα４β１には結合せずαＥβ７には最小限に結合するアンタゴニスト抗α４β７ヒトＩｇＧ１／κモノクローナル抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトとカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔサブセットの両方に強く結合し、優れたカニクイザル結合交差反応性を示す。しかし、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは齧歯動物ＰＢＭＣには結合しない。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７／ＶＣＡＭ－１相互作用を阻害せずにα４β７／ＭＡｄＣＡＭ－１相互作用を高い効力で選択的に遮断する。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞のＭＡｄＣＡＭ－１媒介同時刺激を遮断することができる。ヒトＩｇＧ１について予測されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで未感染α４β７＋細胞に対してＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性の引き金を引かずにヒトＦｃγＲに結合する（ｉｎ ｖｉｖｏでのＦｃ媒介「予防接種効果」）に不可欠な必要条件）。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴによるｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｆｃエフェクター活性の欠如は、抗体誘導標的内部移行に起因する減少した細胞表面α４β７発現により部分的に説明しうる。さらに、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＴＨＰ－１細胞においてα４β７被覆ビーズ又はα４β７発現ＧＦＰ＋ＶＬＰ（ウイルス様粒子）の取込みをα４β７依存的に及びＦｃ依存的に媒介することができる。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、臨床候補に必要な意図されたｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学的特性を見せる。

【0251】

本開示で提供されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ベドリズマブとは区別され、それから改良されている強力なα４β７選択的アンタゴニストである。Ａｂ－Ｖｅｄｏと比べたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの鍵となる特性は表３６～４０に示され表４１にまとめられている。

【0252】

【表36】

【0253】

【表37】

【0254】

【表38】

【0255】

表３９－ＢＩＡｃｏｒｅによるＡｂ－Ｖｅｄｏと比べたヒトＦｃγＲに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合親和性

【0256】

【表39】

【0257】

表４０－ＢＩＡｃｏｒｅによるＡｂ－Ｖｅｄｏと比べたカニクイザルＦｃγＲに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合親和性

【0258】

【表40】

【0259】

表４１－Ａｂ－Ｖｅｄｏと比べたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの鍵となる特性

【0260】

【表41】

【0261】

α４β７に対するそのより良好な結合親和性及びＦｃ媒介エフェクター機能の引き金を引かずにヒトＦｃγＲに結合するその能力などの、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの主要なパラメータは、ベドリズマブとの重要な区別要因であり、これらの特性はベドリズマブよりも改良された効力を駆動すると期待される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗α４β７臨床候補に必要なｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学的特性も有する。

【0262】

８．例示的実施形態
種々の特定の実施形態が説明され記載されており、一部は下に表されているが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の変更を加えることが可能であることは認識されている。
１．（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖領域；及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖領域を含む抗ヒトα４β７抗体であって、
ＶＨ ＣＤＲ＃１がＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨ（配列番号７２）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃２がＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧ（配列番号７３）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃３がＶＤＶ（配列番号７４）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃１がＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧ（配列番号７５）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃２がＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号７６）であり；及び
ＶＬ ＣＤＲ＃３がＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号７７）である、
抗ヒトα４β７抗体。
２．ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７０）
のＶＨ鎖領域；及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＳＦＫＬＬＩＹＨＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＹＡＱＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７１）
のＶＬ鎖領域
を含む、実施形態１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３．ヒト化されている、実施形態１又は２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４．ＩｇＧである、実施形態１～３のいずれかに記載の抗ヒトα４β７抗体。
５．カッパ軽定常領域を含む、実施形態１～４のいずれかに記載の抗ヒトα４β７抗体。
６．ＩｇＧ_１である、実施形態１～５のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
７．アミノ酸置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを有するバリアントＣＨ３ドメインを含む、実施形態１～６のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
８．配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、実施形態１～７のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
９．アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａを有するバリアントＣＨ２ドメインを含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
１０．アミノ酸置換Ｔ２５０Ｑを有するバリアントＣＨ２ドメイン、及び／又はアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌを有するバリアントＣＨ３ドメインを含む、実施形態１～９のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
１１．抗ヒトα４β７抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、抗体が、（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖領域；及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖領域を含み、
ＶＨ ＣＤＲ＃１がＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨ（配列番号７２）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃２がＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧ（配列番号７３）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃３がＶＤＶ（配列番号７４）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃１がＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧ（配列番号７５）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃２がＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号７６）であり；及び
ＶＬ ＣＤＲ＃３がＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号７７）である、
ポリヌクレオチド。
１２．実施形態１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１３．実施形態１２に記載のベクターをトランスフェクトされた真核宿主細胞。
１４．実施形態１１に記載のポリヌクレオチドを発現するように操作された真核宿主細胞。
１５．哺乳動物宿主細胞である、実施形態１３又は１４に記載の真核宿主細胞。
１６．抗ヒトα４β７抗体を産生する方法であって、（ａ）実施形態１５に記載の真核宿主細胞を培養するステップと（ｂ）抗ヒトα４β７抗体を回収するステップを含む方法。
１７．実施形態１２に記載のベクターで形質転換された原核宿主細胞。
１８．実施形態１７に記載のポリヌクレオチドを発現するように操作された原核宿主細胞。
１９．細菌宿主細胞である、実施形態１８に記載の原核宿主細胞。
２０．抗ヒトα４β７抗体を産生する方法であって、（ａ）実施形態１９に記載の原核宿主細胞を培養するステップと（ｂ）抗ヒトα４β７抗体を回収するステップを含む方法。
２１．ＨＩＶ感染対象においてＨＩＶ感染のウイルス抑制を誘導する方法であって、ある量の、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体を対象に投与するステップを含む方法。
２２．ウイルス抑制が免疫媒介される、実施形態２１に記載の方法。
２３．ＨＩＶ感染対象においてＨＩＶ感染を処置する方法であって、ある量の、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体を対象に投与するステップを含む方法。
２４．ＨＩＶを抑制する、抗ヒトα４β７抗体。
２５．ＨＩＶ複製及び／又はＨＩＶ感染を阻害する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２６．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７を不活化する及び／又はヒトα４β７の活性化を減少させる、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２７．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７の内部移行を誘導する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２８．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激を阻害する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２９．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激が、ＭＡｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０により媒介される、実施形態２８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３０．ＣＤ４ Ｔ細胞でのＨＩＶ複製を阻害する、実施形態２５に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３１．ＣＤ４ Ｔ細胞が、ＭＡｄＣＡＭ－１刺激ＣＤ４ Ｔ細胞又はＨＩＶ ｇｐ１２０刺激ＣＤ４ Ｔ細胞である、実施形態３０に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３２．α４β７とそのリガンドの少なくとも１つの相互作用を破壊する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３３．α４β７リガンドがＭＡｄＣＡＭ－１である、実施形態３２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３４．α４β７リガンドがＨＩＶ ｇｐ１２０である、実施形態３２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３５．ＨＩＶのｇｐ１２０媒介細胞間伝播を阻害する、実施形態３４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３６．ＨＩＶビリオンに結合する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３７．ＨＩＶビリオンへの抗体結合が免疫複合体を形成する、実施形態３６に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３８．免疫複合体が細胞上のＦｃγＲに結合する、実施形態３７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３９．免疫複合体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＦｃγＲに結合する、実施形態３７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４０．免疫複合体が食作用によりＡＰＣに取り込まれる、実施形態３９に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４１．ＨＩＶ特異的免疫応答を誘導する、実施形態４０に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４２．ＨＩＶに対する予防接種効果を誘導する、実施形態４０又は４１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４３．ＨＩＶ特異的免疫応答が、ＨＩＶ感染個人においてＨＩＶのウイルス制御をもたらす、実施形態４１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４４．ウイルス制御がウイルス負荷の減少をもたらす、実施形態４３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４５．ウイルス制御が、より低いウイルスセットポイントをもたらす、実施形態４３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４６．ウイルス制御が、抗レトロウイルス処置中断（ＡＴＩ）後のウイルスリバウンドの遅延をもたらす、実施形態４３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４７．Ａｂ－ｍ１、Ａｂ－ｃ１、Ａｂ－ｈ１．１、Ａｂ－ｈ１．２、Ａｂ－ｈ１．３、Ａｂ－ｈ１．４、Ａｂ－ｈ１．５、Ａｂ－ｈ１．６、Ａｂ－ｈ１．７、Ａｂ－ｈ１．８、Ａｂ－ｈ１．９、Ａｂ－ｈ１．９ａ、Ａｂ－ｈ１．９ｂ、Ａｂ－ｈ１．９ｃ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ若しくはＡｂ－ｈ１．９ｅから選択される抗体由来の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット又は可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を有する、実施形態２４～４６のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
４８．ＨＩＶを抑制する、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
４９．ＨＩＶ複製及び／又はＨＩＶ感染を阻害する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５０．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７を不活化する及び／又はヒトα４β７の活性化を減少させる、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５１．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７の内部移行を誘導する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５２．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激を阻害する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５３．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激が、ＭＡｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０により媒介される、実施形態５２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５４．ＣＤ４ Ｔ細胞でのＨＩＶ複製を阻害する、実施形態４９に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５５．ＣＤ４ Ｔ細胞が、ＭＡｄＣＡＭ－１刺激ＣＤ４ Ｔ細胞又はＨＩＶ ｇｐ１２０刺激ＣＤ４ Ｔ細胞である、実施形態５４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５６．α４β７とそのリガンドの少なくとも１つの相互作用を破壊する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５７．α４β７リガンドがＭＡｄＣＡＭ－１である、実施形態５６に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５８．α４β７リガンドがＨＩＶ ｇｐ１２０である、実施形態５６に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５９．ＨＩＶのｇｐ１２０媒介細胞間伝播を阻害する、実施形態５８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６０．ＨＩＶビリオンに結合する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６１．ＨＩＶビリオンへの抗体結合が免疫複合体を形成する、実施形態６０に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６２．免疫複合体が細胞上のＦｃγＲに結合する、実施形態６１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６３．免疫複合体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＦｃγＲに結合する、実施形態６１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６４．免疫複合体が食作用によりＡＰＣに取り込まれる、実施形態６３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６５．ＨＩＶ特異的免疫応答を誘導する、実施形態６４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６６．ＨＩＶに対する予防接種効果を誘導する、実施形態６４又は６５に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６７．ＨＩＶ特異的免疫応答が、ＨＩＶ感染個人においてＨＩＶのウイルス制御をもたらす、実施形態６４又は６５に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６８．ウイルス制御がウイルス負荷の減少をもたらす、実施形態６７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６９．ウイルス制御が、より低いウイルスセットポイントをもたらす、実施形態６７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
７０．ウイルス制御が、抗レトロウイルス処置中断（ＡＴＩ）後のウイルスリバウンドの遅延をもたらす、実施形態６７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
７１．先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体を含む医薬組成物。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G-1】

【図7G-2】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22】

【配列表】

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