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特許7408041水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法および評価システム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-22
(45)【発行日】2024-01-05
(54)【発明の名称】水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法および評価システム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20231225BHJP
G01N 33/18 20060101ALI20231225BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20231225BHJP
C12Q 1/18 20060101ALN20231225BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04
G01N33/18 B
G01N33/15 B
C12Q1/18
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2023081488
(22)【出願日】2023-05-17
(65)【公開番号】P2023177269
(43)【公開日】2023-12-13
【審査請求日】2023-05-17
(31)【優先権主張番号】202210618679.5
(32)【優先日】2022-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】521088468
【氏名又は名称】生態環境部南京環境科学研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】515190906
【氏名又は名称】南京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100216471
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬戸 麻希
(72)【発明者】
【氏名】王娜
(72)【発明者】
【氏名】施瑪麗
(72)【発明者】
【氏名】郭欣妍
(72)【発明者】
【氏名】張暁輝
(72)【発明者】
【氏名】倪▲に▼
(72)【発明者】
【氏名】袁青彬
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】特許第７００９６８８（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特開２００６－０３４９５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０２０－１９８８７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－１２５０３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５２１６８２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／０４
Ｇ０１Ｎ ３３／１８
Ｇ０１Ｎ ３３／１５
Ｃ１２Ｑ １／１８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ステップＳ１～Ｓ４を含み、ステップＳ１、環境監視：
ステップＳ１-１：目標流域における抗生物質の生産、使用および排出の背景調査を行
い、生態リスク評価目標抗生物質の監視リストを確立し、目標抗生物質の環境監視を行い
、前記目標流域は河川流域、海域および水機能領域を含み、
ステップＳ１-２：目標流域における目標抗生物質誘導体を監視し、目標抗生物質の副
産物反応や生物変換が発生した場合、目標抗生物質誘導体監視リストを確立し、目標抗生
物質誘導体の環境監視を行う必要があり、
ステップＳ２、抗生物質初期スクリーニング：ステップＳ１-１で得られた目標流域の目
標抗生物質およびステップＳ１-２で得られた目標流域の目標抗生物質誘導体を初期スク
リーニングし、ステップＳ２-１～Ｓ２-２のいずれかを満たす場合、ステップＳ３微生物
薬品耐性評価に移行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
ステップＳ２-１、オクタノール／水分配係数判定：目標抗生物質または目標抗生物質
誘導体のオクタノール／水分配係数Ｋｏｗを求め、取得したオクタノール／水分配係数Ｋ
ｏｗを１０の底を持つ対数値とし、ｌｇ Ｋｏｗ≧３．５の場合、この目標抗生物質また
は目標抗生物質誘導体が強脂溶性と判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移行して
継続的に評価し、
ステップＳ２-２、抗生物質環境濃度判定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の
環境濃度ＭＥＣを測定し、環境濃度ＭＥＣ≧１０の場合、この目標抗生物質または目標抗
生物質誘導体が連続的な入力源を有すると判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移
行して継続的に評価する必要があり、
ステップＳ３、微生物薬品耐性評価：薬品耐性リスク指数ＲＱＲを用いて目標流域中の微
生物群集の薬品耐性リスクを特徴付け、以下の式に示すように：
ＲＱＲ＝ＭＥＣ／ＰＮＥＣＲ、
式において、ＭＥＣはステップＳ２-２で測定された目標抗生物質または目標抗生物質誘
導体の環境濃度であり、ＰＮＥＣＲは目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度であり、以下の式に示すように：
ＰＮＥＣＲ＝ＭＩＣ／ＡＦ、
式において、ＭＩＣは目標流域中の微生物群集の最小発育阻止濃度であり、ＡＦは１０の
値を取る無次元評価要因であり、ＥＵＣＡＳＴデータベースから目標流域中の微生物群集
の最小発育阻止濃度ＭＩＣを決定し、目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度ＰＮＥＣＲを取得し、前記微生物群集は細菌、真菌または放線菌属を含み、
目標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルは、ＲＱＲ値の大きさに応じて、ＲＱＲ
＜０．０１でリスクなし、０．０１＜ＲＱＲ＜０．１で低リスク、０．１＜ＲＱＲ＜１で
中リスク、ＲＱＲ＞１で高リスクという４クラスに分けられ、ＲＱＲ＞０．１のとき、目
標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルが高いと見なされ、ステップＳ４高レベル
評価に移行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
ステップＳ４、高レベル評価：
ステップＳ４-１、環境微生物抽出：５０重量部の目標流域水試料をフィルター膜で濾
過し、前記フィルター膜の孔径は０．２～０．３μｍであり、濾過後、フィルター膜を面
積１５～２８ｍｍ２の断片に切断し、断片を容器に入れ、断片体積の１．２～１．５倍の
リン酸塩緩衝溶液を加え、容器に断片体積の２．５～３倍のガラスビーズを添加し、ボル
テックスで１５～２０ｍｉｎ振とうした後、フィルター膜とガラスビーズを濾過・除去し
て、細菌溶液上澄み液を得て用意し、
ステップＳ４-２、抗生物質勾配濃度培養：ステップＳ４-１で得られた細菌溶液の上澄
み液をそれぞれ５～６個の減菌済コニカルフラスコに加え、各減菌済コニカルフラスコに
は２．５～３重量部の細菌溶液上澄み液が含まれ、各減菌済コニカルフラスコに、堆積物
のバイオフィルム形成を模擬するためのスライドを３枚入れ、０．２～０．５重量部のＬ
Ｂ培地を加え、５～６個の異なる減菌済コニカルフラスコに異なる濃度の目標抗生物質ま
たは目標抗生物質誘導体を加え、５～６個の異なる減菌済コニカルフラスコ中の目標抗生
物質または目標抗生物質誘導体濃度はそれぞれ０、０．０１μｇ／Ｌ、０．１μｇ／Ｌ、
１μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌであり、２８～３３℃の室温条件下で１４日
間振とう反応させ、目標溶液を得、
ステップＳ４-３、ＤＮＡ抽出：ステップＳ４-２で得られた目標溶液から目標溶液中の
細菌ＤＮＡを抽出して、減菌済コニカルフラスコ中のスライド上の細菌をリン酸塩緩衝溶
液に収集して細菌ＤＮＡを抽出し、
ステップＳ４-４、耐性遺伝子測定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体に対応す
る耐性遺伝子を測定し、目標溶液中の細菌ＤＮＡまたは減菌済コニカルフラスコ中のスラ
イド上の細菌ＤＮＡの存在量を測定して耐性遺伝子の相対存在量の平均値Ｐを算出し、ス
テップＳ４前の耐性遺伝子の相対存在量の平均値Ｐ０を算出し、選択性係数Ｓを算出し、
以下の式に示すように：
Ｓ＝Ｉｎ（Ｐ／Ｐ０）
ステップＳ４-５、モデルフィッティング：抗生物質濃度Ｃを横座標とし、目標溶液中
の細菌ＤＮＡまたは減菌済コニカルフラスコ中のスライド上の細菌ＤＮＡに対応する選択
性係数Ｓを縦座標として、ｌｏｇｉｓｔｉｃモデルを用いてフィッティングし、Ｓ＝０の
とき、対応の抗生物質濃度ＣはＭＳＣ値であり、目標溶液中の細菌ＤＮＡまたは減菌済コ
ニカルフラスコ中のスライド上の細菌ＤＮＡのＭＳＣ値を比較し、小さいＭＳＣ値を管理
基準として選択し、このＭＳＣ値は、抗生物質濃度Ｃより高い抗生物質条件下で薬品耐性
遺伝子を有する微生物が濃縮され、その結果、微生物群集中の薬品耐性遺伝子の相対存在
量が増加する、
ことを特徴とする水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法。
【請求項2】
前記ステップＳ３は以下のステップをさらに含み、環境残留性評価：データベースクエリーとモデル予測方法を組み合わせて目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の半減期ｔ１
／２を求め、環境残留性レベルは半減期ｔ１／２値の大きさに応じて、ｔ１／２＜６０ｄ
で非残留性、６０ｄ＜ｔ１／２＜１８０ｄで残留性、ｔ１／２＞１８０ｄで高残留性とい
う３クラスに分けられ、ｔ１／２＞６０の場合、目標抗生物質または目標抗生物質誘導体
が環境残留性を有すると判定し、すなわち、目標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクＲ
ＱＲの値にかかわらず、ステップＳ４に移行して継続的に評価する必要がある、ことを特
徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ステップＳ４-１とＳ４-３中のリン酸塩緩衝溶液では、ＮａＣｌ溶液の質量濃度が１０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ溶液の質量濃度が０．２５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液の質量濃度が１
．６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４溶液の質量濃度が０．３ｇ／Ｌであり、残りは水であり、リン
酸塩緩衝溶液のｐＨは７．４である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ステップＳ４-１中のＬＢ培地では、トリプトンの質量濃度が１０ｇ／Ｌ、酵母粉末の質量濃度が５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムの質量濃度が１０ｇ／Ｌであり、残りは水である
、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、環境保護の分野に関し、具体的に、水環境中の残留抗生物質に対するマルチレ
ベルのリスク評価方法および評価システムに関する。
ベルのリスク評価方法および評価システムに関する。
【背景技術】
【0002】
抗生物質は、細菌を殺すことによって感染症を治療するために使用されるが、広く存在す
る生物群としての細菌も、殺されるリスクを回避するために、様々な形で抗生物質に対す
る耐性を獲得可能であり、この耐性は「細菌薬品耐性」と呼ばれ、薬品耐性能力を獲得し
た細菌は「薬品耐性細菌」と呼ばれる。
生態リスクとは、生態系が生態系に脅威を与える生態系外のあらゆる要素にさらされる可
能性のことで、ある地域における化学物質の排出、人間活動、自然災害などによって生態
系やその構成要素に悪影響を及ぼし、生態系の構造や機能にダメージを与え、生態系の安
全や健康を脅かす可能性があることを指す。
る生物群としての細菌も、殺されるリスクを回避するために、様々な形で抗生物質に対す
る耐性を獲得可能であり、この耐性は「細菌薬品耐性」と呼ばれ、薬品耐性能力を獲得し
た細菌は「薬品耐性細菌」と呼ばれる。
生態リスクとは、生態系が生態系に脅威を与える生態系外のあらゆる要素にさらされる可
能性のことで、ある地域における化学物質の排出、人間活動、自然災害などによって生態
系やその構成要素に悪影響を及ぼし、生態系の構造や機能にダメージを与え、生態系の安
全や健康を脅かす可能性があることを指す。
【発明の概要】
【0003】
上記の問題に対して、本発明は、水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク
評価方法を提供する。
本発明の技術的解決策は以下の通りである。
水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、以下のステップを含
み、
Ｓ１、環境監視：
Ｓ１-１：目標流域における抗生物質の生産、使用および排出の背景調査を行い、生態リ
スク評価目標抗生物質の監視リストを確立し、目標抗生物質の環境監視を行い、前記目標
流域は河川流域、海域および水機能領域を含み、
Ｓ１-２：目標流域における目標抗生物質誘導体を監視し、目標抗生物質の副産物反応や
生物変換が発生した場合、目標抗生物質誘導体監視リストを確立し、目標抗生物質誘導体
の環境監視を行う必要もあり、
Ｓ２、抗生物質初期スクリーニング：ステップＳ１-１で得られた目標流域の目標抗生物
質およびステップＳ１-２で得られた目標流域の目標抗生物質誘導体を初期スクリーニン
グし、Ｓ２-１～Ｓ２-２のいずれかを満たす場合、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移
行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
Ｓ２-１、オクタノール／水分配係数判定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体のオ
クタノール／水分配係数Ｋｏｗを求め、取得したオクタノール／水分配係数Ｋｏｗを１０
の底を持つ対数値とし、ｌｇ Ｋｏｗ≧３．５の場合、この目標抗生物質または目標抗生
物質誘導体が強脂溶性と判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移行して継続的に評
価し、
Ｓ２-２、抗生物質環境濃度判定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の環境濃度Ｍ
ＥＣを測定し、環境濃度ＭＥＣ≧１０の場合、この目標抗生物質または目標抗生物質誘導
体が連続的な入力源を有すると判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移行して継続
的に評価する必要があり、
Ｓ３、微生物薬品耐性評価：薬品耐性リスク指数ＲＱＲを用いて目標流域中の微生物群集
の薬品耐性リスクを特徴付け、以下の式に示すように：
ＲＱＲ＝ＭＥＣ／ＰＮＥＣＲ、
式において、ＭＥＣはステップＳ２-２で測定された目標抗生物質または目標抗生物質誘
導体の環境濃度であり、ＰＮＥＣＲは目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度であり、以下の式に示すように：
ＰＮＥＣＲ＝ＭＩＣ／ＡＦ、
式において、ＭＩＣは目標流域中の微生物群集の最小発育阻止濃度であり、ＡＦは１０の
値を取る無次元評価要因であり、ＥＵＣＡＳＴデータベースから目標流域中の微生物群集
の最小発育阻止濃度ＭＩＣを決定し、目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度ＰＮＥＣＲを取得し、前記微生物群集は細菌、真菌または放線菌属を含み、
目標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルは、ＲＱＲ値の大きさに応じて、ＲＱＲ
＜０．０１でリスクなし、０．０１＜ＲＱＲ＜０．１で低リスク、０．１＜ＲＱＲ＜１で
中リスク、ＲＱＲ＞１で高リスクという４クラスに分けられ、ＲＱＲ＞０．１のとき、目
標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルが高いと見なされ、ステップＳ４高レベル
評価に移行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
Ｓ４、高レベル評価：
Ｓ４-１、環境微生物抽出：５０重量部の目標流域水試料をフィルター膜で濾過し、前記
フィルター膜の孔径は０．２～０．３μｍであり、濾過後、フィルター膜を面積１５～２
８ｍｍ２の断片に切断し、断片を容器に入れ、断片体積の１．２～１．５倍のリン酸塩緩
衝溶液を加え、容器に断片体積の２．５～３倍のガラスビーズを添加し、ボルテックスで
１５～２０ｍｉｎ振とうした後、フィルター膜とガラスビーズを濾過・除去して、細菌溶
液上澄み液を得て用意し、
Ｓ４-２、抗生物質勾配濃度培養：ステップＳ４-１で得られた細菌溶液の上澄み液をそれ
ぞれ５～６個の減菌済コニカルフラスコに加え、各減菌済コニカルフラスコには２．５～
３重量部の細菌溶液上澄み液が含まれ、各減菌済コニカルフラスコに、堆積物のバイオフ
ィルム形成を模擬するためのスライドを３枚入れ、０．２～０．５重量部のＬＢ培地を加
え、５～６個の異なる減菌済コニカルフラスコに異なる濃度の目標抗生物質または目標抗
生物質誘導体を加え、５～６個の異なる減菌済コニカルフラスコ中の目標抗生物質または
目標抗生物質誘導体濃度はそれぞれ０、０．０１μｇ／Ｌ、０．１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ
、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌであり、２８～３３℃の室温条件下で１４日間振とう反
応させ、目標溶液を得、
Ｓ４-３、ＤＮＡ抽出：ステップＳ４-２で得られた目標溶液から目標溶液ＤＮＡを抽出す
る同時、減菌済コニカルフラスコ中のスライド上の細菌をリン酸塩緩衝溶液に収集して細
菌ＤＮＡを抽出し、
Ｓ４-４、耐性遺伝子測定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体に対応する耐性遺伝
子を測定し、目標溶液ＤＮＡまたは細菌ＤＮＡの存在量を測定して耐性遺伝子の相対存在
量の平均値Ｐを算出する同時に、ステップＳ４前の耐性遺伝子の相対存在量の平均値Ｐ０
を算出し、選択性係数Ｓを算出し、以下の式に示すように：
Ｓ＝Ｉｎ（Ｐ／Ｐ０）
Ｓ４-５、モデルフィッティング：抗生物質濃度Ｃを横座標とし、目標溶液ＤＮＡまたは
細菌ＤＮＡに対応する選択性係数Ｓを縦座標として、ｌｏｇｉｓｔｉｃモデルを用いてフ
ィッティングし、Ｓ＝０のとき、対応の抗生物質濃度ＣはＭＳＣ値であり、目標溶液ＤＮ
Ａまたは細菌ＤＮＡのＭＳＣ値を比較し、小さいＭＳＣ値を管理基準として選択し、この
ＭＳＣ値は、抗生物質濃度Ｃより高い抗生物質条件下で薬品耐性遺伝子を有する微生物が
濃縮され、その結果、微生物群集中の薬品耐性遺伝子の相対存在量が増加する。
本発明の一側面として、前記ステップＳ３は以下のステップをさらに含み、環境残留性評
価：データベースクエリーとモデル予測方法を組み合わせて目標抗生物質または目標抗生
物質誘導体の半減期ｔ１／２を求め、環境残留性レベルは半減期ｔ１／２値の大きさに応
じて、ｔ１／２＜６０ｄで非残留性、６０ｄ＜ｔ１／２＜１８０ｄで残留性、ｔ１／２＞
１８０ｄで高残留性という３クラスに分けられ、ｔ１／２＞６０の場合、目標抗生物質ま
たは目標抗生物質誘導体が環境残留性を有すると判定し、すなわち、目標流域中の微生物
群集の薬品耐性リスクＲＱＲの値にかかわらず、ステップＳ４に移行して継続的に評価す
る必要がある。環境残留性と微生物薬品耐性を組み合わせることにより、目標抗生物質ま
たは目標抗生物質誘導体が残留性と薬品耐性がある場合には高リスク評価を行い、残留性
がなく薬品耐性がある場合には適時に高レベルリスク評価を行うという、より正確な評価
方法を実現することができる。
本発明の一側面として、前記ステップＳ４-１とＳ４-３中のリン酸塩緩衝溶液では、Ｎａ
Ｃｌ溶液の質量濃度が１０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ溶液の質量濃度が０．２５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４溶液の質量濃度が１．６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４溶液の質量濃度が０．３ｇ／Ｌであり
、残りは水であり、リン酸塩緩衝溶液のｐＨは７．４である。このリン酸塩緩衝溶液は細
菌と相性が良い。
本発明の一側面として、前記ステップＳ４-１中のＬＢ培地では、トリプトンの質量濃度
が１０ｇ／Ｌ、酵母粉末の質量濃度が５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムの質量濃度が１０ｇ／Ｌ
であり、残りは水である。このＬＢ培地は細菌の培養に有効である。
本発明の一側面として、前記ステップＳ４-４では２～２０種類の耐性遺伝子を取る。
本発明は、上記方法で使用される、水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリス
ク評価システムをさらに提供し、この評価システムは、
目標流域内の目標抗生物質および目標抗生物質誘導体の種類および含有量を監視するため
に使用され、まず情報処理装置において目標流域内の目標抗生物質監視リスト、目標抗生
物質誘導体監視リストを作成し、その後目標抗生物質および目標抗生物質誘導体の監視を
実行する環境監視システムと、
情報処理装置上で実際に検出した目標抗生物質、目標抗生物質誘導体と、環境監視システ
ムにより建築された目標抗生物質監視リスト、目標抗生物質誘導体監視リストとを比較し
、実際に検出した目標抗生物質、目標抗生物質誘導体が環境監視システムにより建築され
た目標抗生物質監視リスト、目標抗生物質誘導体監視リストに属するかどうかを判定する
初期スクリーニングシステムと、
情報処理装置上で、前記初期スクリーニングシステムの判定結果がＹｅｓである目標抗生
物質、目標抗生物質誘導体に対して微生物薬品耐性評価を行う微生物薬品耐性評価システ
ムと、
情報処理装置上で微生物薬品耐性リスクレベルの高い目標抗生物質、目標抗生物質誘導体
をさらに評価して、制限または禁止する必要のある生態学的リスクの高い抗生物質種類を
特定する高レベル評価システムと、を備える。
評価方法を提供する。
本発明の技術的解決策は以下の通りである。
水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、以下のステップを含
み、
Ｓ１、環境監視：
Ｓ１-１：目標流域における抗生物質の生産、使用および排出の背景調査を行い、生態リ
スク評価目標抗生物質の監視リストを確立し、目標抗生物質の環境監視を行い、前記目標
流域は河川流域、海域および水機能領域を含み、
Ｓ１-２：目標流域における目標抗生物質誘導体を監視し、目標抗生物質の副産物反応や
生物変換が発生した場合、目標抗生物質誘導体監視リストを確立し、目標抗生物質誘導体
の環境監視を行う必要もあり、
Ｓ２、抗生物質初期スクリーニング：ステップＳ１-１で得られた目標流域の目標抗生物
質およびステップＳ１-２で得られた目標流域の目標抗生物質誘導体を初期スクリーニン
グし、Ｓ２-１～Ｓ２-２のいずれかを満たす場合、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移
行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
Ｓ２-１、オクタノール／水分配係数判定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体のオ
クタノール／水分配係数Ｋｏｗを求め、取得したオクタノール／水分配係数Ｋｏｗを１０
の底を持つ対数値とし、ｌｇ Ｋｏｗ≧３．５の場合、この目標抗生物質または目標抗生
物質誘導体が強脂溶性と判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移行して継続的に評
価し、
Ｓ２-２、抗生物質環境濃度判定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の環境濃度Ｍ
ＥＣを測定し、環境濃度ＭＥＣ≧１０の場合、この目標抗生物質または目標抗生物質誘導
体が連続的な入力源を有すると判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移行して継続
的に評価する必要があり、
Ｓ３、微生物薬品耐性評価：薬品耐性リスク指数ＲＱＲを用いて目標流域中の微生物群集
の薬品耐性リスクを特徴付け、以下の式に示すように：
ＲＱＲ＝ＭＥＣ／ＰＮＥＣＲ、
式において、ＭＥＣはステップＳ２-２で測定された目標抗生物質または目標抗生物質誘
導体の環境濃度であり、ＰＮＥＣＲは目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度であり、以下の式に示すように：
ＰＮＥＣＲ＝ＭＩＣ／ＡＦ、
式において、ＭＩＣは目標流域中の微生物群集の最小発育阻止濃度であり、ＡＦは１０の
値を取る無次元評価要因であり、ＥＵＣＡＳＴデータベースから目標流域中の微生物群集
の最小発育阻止濃度ＭＩＣを決定し、目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度ＰＮＥＣＲを取得し、前記微生物群集は細菌、真菌または放線菌属を含み、
目標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルは、ＲＱＲ値の大きさに応じて、ＲＱＲ
＜０．０１でリスクなし、０．０１＜ＲＱＲ＜０．１で低リスク、０．１＜ＲＱＲ＜１で
中リスク、ＲＱＲ＞１で高リスクという４クラスに分けられ、ＲＱＲ＞０．１のとき、目
標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルが高いと見なされ、ステップＳ４高レベル
評価に移行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
Ｓ４、高レベル評価：
Ｓ４-１、環境微生物抽出：５０重量部の目標流域水試料をフィルター膜で濾過し、前記
フィルター膜の孔径は０．２～０．３μｍであり、濾過後、フィルター膜を面積１５～２
８ｍｍ２の断片に切断し、断片を容器に入れ、断片体積の１．２～１．５倍のリン酸塩緩
衝溶液を加え、容器に断片体積の２．５～３倍のガラスビーズを添加し、ボルテックスで
１５～２０ｍｉｎ振とうした後、フィルター膜とガラスビーズを濾過・除去して、細菌溶
液上澄み液を得て用意し、
Ｓ４-２、抗生物質勾配濃度培養：ステップＳ４-１で得られた細菌溶液の上澄み液をそれ
ぞれ５～６個の減菌済コニカルフラスコに加え、各減菌済コニカルフラスコには２．５～
３重量部の細菌溶液上澄み液が含まれ、各減菌済コニカルフラスコに、堆積物のバイオフ
ィルム形成を模擬するためのスライドを３枚入れ、０．２～０．５重量部のＬＢ培地を加
え、５～６個の異なる減菌済コニカルフラスコに異なる濃度の目標抗生物質または目標抗
生物質誘導体を加え、５～６個の異なる減菌済コニカルフラスコ中の目標抗生物質または
目標抗生物質誘導体濃度はそれぞれ０、０．０１μｇ／Ｌ、０．１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ
、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌであり、２８～３３℃の室温条件下で１４日間振とう反
応させ、目標溶液を得、
Ｓ４-３、ＤＮＡ抽出：ステップＳ４-２で得られた目標溶液から目標溶液ＤＮＡを抽出す
る同時、減菌済コニカルフラスコ中のスライド上の細菌をリン酸塩緩衝溶液に収集して細
菌ＤＮＡを抽出し、
Ｓ４-４、耐性遺伝子測定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体に対応する耐性遺伝
子を測定し、目標溶液ＤＮＡまたは細菌ＤＮＡの存在量を測定して耐性遺伝子の相対存在
量の平均値Ｐを算出する同時に、ステップＳ４前の耐性遺伝子の相対存在量の平均値Ｐ０
を算出し、選択性係数Ｓを算出し、以下の式に示すように：
Ｓ＝Ｉｎ（Ｐ／Ｐ０）
Ｓ４-５、モデルフィッティング：抗生物質濃度Ｃを横座標とし、目標溶液ＤＮＡまたは
細菌ＤＮＡに対応する選択性係数Ｓを縦座標として、ｌｏｇｉｓｔｉｃモデルを用いてフ
ィッティングし、Ｓ＝０のとき、対応の抗生物質濃度ＣはＭＳＣ値であり、目標溶液ＤＮ
Ａまたは細菌ＤＮＡのＭＳＣ値を比較し、小さいＭＳＣ値を管理基準として選択し、この
ＭＳＣ値は、抗生物質濃度Ｃより高い抗生物質条件下で薬品耐性遺伝子を有する微生物が
濃縮され、その結果、微生物群集中の薬品耐性遺伝子の相対存在量が増加する。
本発明の一側面として、前記ステップＳ３は以下のステップをさらに含み、環境残留性評
価：データベースクエリーとモデル予測方法を組み合わせて目標抗生物質または目標抗生
物質誘導体の半減期ｔ１／２を求め、環境残留性レベルは半減期ｔ１／２値の大きさに応
じて、ｔ１／２＜６０ｄで非残留性、６０ｄ＜ｔ１／２＜１８０ｄで残留性、ｔ１／２＞
１８０ｄで高残留性という３クラスに分けられ、ｔ１／２＞６０の場合、目標抗生物質ま
たは目標抗生物質誘導体が環境残留性を有すると判定し、すなわち、目標流域中の微生物
群集の薬品耐性リスクＲＱＲの値にかかわらず、ステップＳ４に移行して継続的に評価す
る必要がある。環境残留性と微生物薬品耐性を組み合わせることにより、目標抗生物質ま
たは目標抗生物質誘導体が残留性と薬品耐性がある場合には高リスク評価を行い、残留性
がなく薬品耐性がある場合には適時に高レベルリスク評価を行うという、より正確な評価
方法を実現することができる。
本発明の一側面として、前記ステップＳ４-１とＳ４-３中のリン酸塩緩衝溶液では、Ｎａ
Ｃｌ溶液の質量濃度が１０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ溶液の質量濃度が０．２５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４溶液の質量濃度が１．６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４溶液の質量濃度が０．３ｇ／Ｌであり
、残りは水であり、リン酸塩緩衝溶液のｐＨは７．４である。このリン酸塩緩衝溶液は細
菌と相性が良い。
本発明の一側面として、前記ステップＳ４-１中のＬＢ培地では、トリプトンの質量濃度
が１０ｇ／Ｌ、酵母粉末の質量濃度が５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムの質量濃度が１０ｇ／Ｌ
であり、残りは水である。このＬＢ培地は細菌の培養に有効である。
本発明の一側面として、前記ステップＳ４-４では２～２０種類の耐性遺伝子を取る。
本発明は、上記方法で使用される、水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリス
ク評価システムをさらに提供し、この評価システムは、
目標流域内の目標抗生物質および目標抗生物質誘導体の種類および含有量を監視するため
に使用され、まず情報処理装置において目標流域内の目標抗生物質監視リスト、目標抗生
物質誘導体監視リストを作成し、その後目標抗生物質および目標抗生物質誘導体の監視を
実行する環境監視システムと、
情報処理装置上で実際に検出した目標抗生物質、目標抗生物質誘導体と、環境監視システ
ムにより建築された目標抗生物質監視リスト、目標抗生物質誘導体監視リストとを比較し
、実際に検出した目標抗生物質、目標抗生物質誘導体が環境監視システムにより建築され
た目標抗生物質監視リスト、目標抗生物質誘導体監視リストに属するかどうかを判定する
初期スクリーニングシステムと、
情報処理装置上で、前記初期スクリーニングシステムの判定結果がＹｅｓである目標抗生
物質、目標抗生物質誘導体に対して微生物薬品耐性評価を行う微生物薬品耐性評価システ
ムと、
情報処理装置上で微生物薬品耐性リスクレベルの高い目標抗生物質、目標抗生物質誘導体
をさらに評価して、制限または禁止する必要のある生態学的リスクの高い抗生物質種類を
特定する高レベル評価システムと、を備える。
【発明の効果】
【0004】
本発明は以下の有益な効果を有する。
（１）本発明の水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、リス
クを有する水環境目標抗生物質または目標抗生物質誘導体に対してカスケード評価を行い
、まず目標抗生物質または目標抗生物質誘導体を初期スクリーニングし、条件を満たせば
微生物薬品耐性評価に移行して次の評価を行い、薬品耐性の相違について、継続的に高レ
ベル評価およびリスク評価を行うか、または評価を終了し、最終的にＭＳＣ値を得、これ
は薬品耐性遺伝子を持つ微生物が対応の抗生物質濃度Ｃよりも高い抗生物質条件下で濃縮
され、微生物群集における薬品耐性遺伝子の相対存在量が増加することを示す。
（２）本発明の水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、環境
残留性と微生物薬品耐性を組み合わせることにより、目標抗生物質または目標抗生物質誘
導体が残留性と薬品耐性がある場合には高リスク評価を行い、残留性がなく薬品耐性があ
る場合には適時に高レベルリスク評価を行うという、より正確な評価方法を実現すること
ができる。
（３）本発明の水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、実験
方法により、ＭＳＣ値を正確に測定し、抗生物質濃度Ｃを横座標、目標溶液ＤＮＡまたは
細菌ＤＮＡに対応する選択性係数Ｓを縦座標とし、ｌｏｇｉｓｔｉｃモデルでフィッティ
ングして目標溶液ＤＮＡまたは細菌ＤＮＡのＭＳＣ値を得、その小さいＭＳＣ値を管理基
準とする。
（４）本発明の水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法で得られ
た評価結果は、水環境の連続監視、発生源分析および発生源管理において重要な役割を果
たし、評価結果によると、点源による汚染について調査・処罰、期限是正などの行政措置
を適用でき、面源による汚染について生態学的リスクの高い抗生物質種の使用を関連地域
で制限または禁止することができる。
（１）本発明の水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、リス
クを有する水環境目標抗生物質または目標抗生物質誘導体に対してカスケード評価を行い
、まず目標抗生物質または目標抗生物質誘導体を初期スクリーニングし、条件を満たせば
微生物薬品耐性評価に移行して次の評価を行い、薬品耐性の相違について、継続的に高レ
ベル評価およびリスク評価を行うか、または評価を終了し、最終的にＭＳＣ値を得、これ
は薬品耐性遺伝子を持つ微生物が対応の抗生物質濃度Ｃよりも高い抗生物質条件下で濃縮
され、微生物群集における薬品耐性遺伝子の相対存在量が増加することを示す。
（２）本発明の水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、環境
残留性と微生物薬品耐性を組み合わせることにより、目標抗生物質または目標抗生物質誘
導体が残留性と薬品耐性がある場合には高リスク評価を行い、残留性がなく薬品耐性があ
る場合には適時に高レベルリスク評価を行うという、より正確な評価方法を実現すること
ができる。
（３）本発明の水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、実験
方法により、ＭＳＣ値を正確に測定し、抗生物質濃度Ｃを横座標、目標溶液ＤＮＡまたは
細菌ＤＮＡに対応する選択性係数Ｓを縦座標とし、ｌｏｇｉｓｔｉｃモデルでフィッティ
ングして目標溶液ＤＮＡまたは細菌ＤＮＡのＭＳＣ値を得、その小さいＭＳＣ値を管理基
準とする。
（４）本発明の水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法で得られ
た評価結果は、水環境の連続監視、発生源分析および発生源管理において重要な役割を果
たし、評価結果によると、点源による汚染について調査・処罰、期限是正などの行政措置
を適用でき、面源による汚染について生態学的リスクの高い抗生物質種の使用を関連地域
で制限または禁止することができる。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【発明を実施するための形態】
【0006】
実施例１
水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、以下のステップを含
み、
Ｓ１、環境監視：
Ｓ１-１：目標流域における抗生物質の生産、使用および排出の背景調査を行い、生態リ
スク評価目標抗生物質の監視リストを確立し、目標抗生物質の環境監視を行い、前記目標
流域は河川流域であり、
Ｓ１-２：目標流域における目標抗生物質誘導体を監視し、目標抗生物質の副産物反応や
生物変換が発生した場合、目標抗生物質誘導体監視リストを確立し、目標抗生物質誘導体
の環境監視を行う必要もあり、
Ｓ２、抗生物質初期スクリーニング：ステップＳ１-１で得られた目標流域の目標抗生物
質およびステップＳ１-２で得られた目標流域の目標抗生物質誘導体を初期スクリーニン
グし、Ｓ２-１～Ｓ２-２のいずれかを満たす場合、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移
行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
Ｓ２-１、オクタノール／水分配係数判定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体のオ
クタノール／水分配係数Ｋｏｗを求め、取得したオクタノール／水分配係数Ｋｏｗを１０
の底を持つ対数値とし、ｌｇ Ｋｏｗ≧３．５の場合、この目標抗生物質または目標抗生
物質誘導体が強脂溶性と判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移行して継続的に評
価し、一部の抗生物質のｌｏｇ ｋｏｗ 値は表２に示され、
Ｓ２-２、抗生物質環境濃度判定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の環境濃度Ｍ
ＥＣを測定し、環境濃度ＭＥＣ≧１０の場合、この目標抗生物質または目標抗生物質誘導
体が連続的な入力源を有すると判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移行して継続
的に評価する必要があり、
Ｓ３、微生物薬品耐性評価：薬品耐性リスク指数ＲＱＲを用いて目標流域中の微生物群集
の薬品耐性リスクを特徴付け、微生物群集は細菌であり、以下の式に示すように：
ＲＱＲ＝ＭＥＣ／ＰＮＥＣＲ、
式において、ＭＥＣはステップＳ２-２で測定された目標抗生物質または目標抗生物質誘
導体の環境濃度であり、ＰＮＥＣＲは目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度であり、以下の式に示すように：
ＰＮＥＣＲ＝ＭＩＣ／ＡＦ、
式において、ＭＩＣは目標流域中の微生物群集の最小発育阻止濃度であり、ＡＦは１０の
値を取る無次元評価要因であり、ＥＵＣＡＳＴデータベースから目標流域中の微生物群集
の最小発育阻止濃度ＭＩＣを決定し、目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度ＰＮＥＣＲを取得し、一部の抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）と微生物薬品耐
性予測無効濃度（ＰＮＥＣｒ）は表３に示され、
目標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルは、ＲＱＲ値の大きさに応じて、ＲＱＲ
＜０．０１でリスクなし、０．０１＜ＲＱＲ＜０．１で低リスク、０．１＜ＲＱＲ＜１で
中リスク、ＲＱＲ＞１で高リスクという４クラスに分けられ、ＲＱＲ＞０．１のとき、目
標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルが高いと見なされ、ステップＳ４高レベル
評価に移行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
Ｓ４、高レベル評価：
Ｓ４-１、環境微生物抽出：５０重量部の目標流域水試料をフィルター膜で濾過し、フィ
ルター膜の孔径は０．２５μｍであり、濾過後、フィルター膜を面積２０ｍｍ２の断片に
切断し、断片を容器に入れ、断片体積の１．３倍のリン酸塩緩衝溶液を加え、リン酸塩緩
衝溶液では、ＮａＣｌ溶液の質量濃度が１０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ溶液の質量濃度が０．２５ｇ
／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液の質量濃度が１．６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４溶液の質量濃度が０
．３ｇ／Ｌであり、残りは水であり、リン酸塩緩衝溶液のｐＨは７．４であり、さらに、
容器に断片体積の２．８倍のガラスビーズを添加し、ボルテックスで１８ｍｉｎ振とうし
た後、フィルター膜とガラスビーズを濾過・除去して、細菌溶液上澄み液を得て用意し、
Ｓ４-２、抗生物質勾配濃度培養：ステップＳ４-１で得られた細菌溶液上澄み液をそれぞ
れ５個の減菌済コニカルフラスコに加え、各減菌済コニカルフラスコには２．７重量部の
細菌溶液上澄み液が含まれ、各減菌済コニカルフラスコに、堆積物のバイオフィルム形成
を模擬するためのスライドを３枚入れ、０．４重量部のＬＢ培地を加え、ＬＢ培地では、
トリプトンの質量濃度が１０ｇ／Ｌ、酵母粉末の質量濃度が５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムの
質量濃度が１０ｇ／Ｌであり、残りは水であり、さらに５個の異なる減菌済コニカルフラ
スコに異なる濃度の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体を加え、５個の異なる減菌済
コニカルフラスコ中の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の濃度はそれぞれ０．０１
μｇ／Ｌ、０．１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌであり、３０℃
の室温条件下で１４日間振とう反応させて目標溶液を得、
Ｓ４-３、ＤＮＡ抽出：ステップＳ４-２で得られた目標溶液から目標溶液ＤＮＡを抽出す
る同時に、減菌済コニカルフラスコ中のスライド上の細菌をリン酸塩緩衝溶液に収集して
細菌ＤＮＡを抽出し、
Ｓ４-４、耐性遺伝子測定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体に対応する耐性遺伝
子を測定し、耐性遺伝子は２～２０種を取り、２０種未満の場合最大値を取り、抗生物質
に対応する耐性遺伝子種類は表４に示され、目標溶液ＤＮＡまたは細菌ＤＮＡの存在量を
測定して耐性遺伝子の相対存在量の平均値Ｐを算出する同時に、ステップＳ４以前の耐性
遺伝子の相対存在量の平均値Ｐ０も算出し、以下の式に示すように選択性係数Ｓを算出し
：
Ｓ＝Ｉｎ（Ｐ／Ｐ０）
Ｓ４-５、モデルフィッティング：抗生物質濃度Ｃを横座標とし、目標溶液ＤＮＡまたは
細菌ＤＮＡに対応する選択性係数Ｓを縦座標として、ｌｏｇｉｓｔｉｃモデルを用いてフ
ィッティングし、Ｓ＝０のとき、対応の抗生物質濃度ＣはＭＳＣ値であり、目標溶液ＤＮ
Ａまたは細菌ＤＮＡのＭＳＣ値を比較し、小さいＭＳＣ値を管理基準として選択し、この
ＭＳＣ値は、抗生物質濃度Ｃより高い抗生物質条件下で薬品耐性遺伝子を有する微生物が
濃縮され、その結果、微生物群集中の薬品耐性遺伝子の相対存在量が増加する。
水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリスク評価方法は、以下のステップを含
み、
Ｓ１、環境監視：
Ｓ１-１：目標流域における抗生物質の生産、使用および排出の背景調査を行い、生態リ
スク評価目標抗生物質の監視リストを確立し、目標抗生物質の環境監視を行い、前記目標
流域は河川流域であり、
Ｓ１-２：目標流域における目標抗生物質誘導体を監視し、目標抗生物質の副産物反応や
生物変換が発生した場合、目標抗生物質誘導体監視リストを確立し、目標抗生物質誘導体
の環境監視を行う必要もあり、
Ｓ２、抗生物質初期スクリーニング：ステップＳ１-１で得られた目標流域の目標抗生物
質およびステップＳ１-２で得られた目標流域の目標抗生物質誘導体を初期スクリーニン
グし、Ｓ２-１～Ｓ２-２のいずれかを満たす場合、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移
行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
Ｓ２-１、オクタノール／水分配係数判定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体のオ
クタノール／水分配係数Ｋｏｗを求め、取得したオクタノール／水分配係数Ｋｏｗを１０
の底を持つ対数値とし、ｌｇ Ｋｏｗ≧３．５の場合、この目標抗生物質または目標抗生
物質誘導体が強脂溶性と判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移行して継続的に評
価し、一部の抗生物質のｌｏｇ ｋｏｗ 値は表２に示され、
Ｓ２-２、抗生物質環境濃度判定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の環境濃度Ｍ
ＥＣを測定し、環境濃度ＭＥＣ≧１０の場合、この目標抗生物質または目標抗生物質誘導
体が連続的な入力源を有すると判定し、ステップＳ３微生物薬品耐性評価に移行して継続
的に評価する必要があり、
Ｓ３、微生物薬品耐性評価：薬品耐性リスク指数ＲＱＲを用いて目標流域中の微生物群集
の薬品耐性リスクを特徴付け、微生物群集は細菌であり、以下の式に示すように：
ＲＱＲ＝ＭＥＣ／ＰＮＥＣＲ、
式において、ＭＥＣはステップＳ２-２で測定された目標抗生物質または目標抗生物質誘
導体の環境濃度であり、ＰＮＥＣＲは目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度であり、以下の式に示すように：
ＰＮＥＣＲ＝ＭＩＣ／ＡＦ、
式において、ＭＩＣは目標流域中の微生物群集の最小発育阻止濃度であり、ＡＦは１０の
値を取る無次元評価要因であり、ＥＵＣＡＳＴデータベースから目標流域中の微生物群集
の最小発育阻止濃度ＭＩＣを決定し、目標流域中の微生物群集の予測された薬品耐性無効
濃度ＰＮＥＣＲを取得し、一部の抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）と微生物薬品耐
性予測無効濃度（ＰＮＥＣｒ）は表３に示され、
目標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルは、ＲＱＲ値の大きさに応じて、ＲＱＲ
＜０．０１でリスクなし、０．０１＜ＲＱＲ＜０．１で低リスク、０．１＜ＲＱＲ＜１で
中リスク、ＲＱＲ＞１で高リスクという４クラスに分けられ、ＲＱＲ＞０．１のとき、目
標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクレベルが高いと見なされ、ステップＳ４高レベル
評価に移行して継続的に評価し、それ以外の場合、評価を終了し、
Ｓ４、高レベル評価：
Ｓ４-１、環境微生物抽出：５０重量部の目標流域水試料をフィルター膜で濾過し、フィ
ルター膜の孔径は０．２５μｍであり、濾過後、フィルター膜を面積２０ｍｍ２の断片に
切断し、断片を容器に入れ、断片体積の１．３倍のリン酸塩緩衝溶液を加え、リン酸塩緩
衝溶液では、ＮａＣｌ溶液の質量濃度が１０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ溶液の質量濃度が０．２５ｇ
／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液の質量濃度が１．６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４溶液の質量濃度が０
．３ｇ／Ｌであり、残りは水であり、リン酸塩緩衝溶液のｐＨは７．４であり、さらに、
容器に断片体積の２．８倍のガラスビーズを添加し、ボルテックスで１８ｍｉｎ振とうし
た後、フィルター膜とガラスビーズを濾過・除去して、細菌溶液上澄み液を得て用意し、
Ｓ４-２、抗生物質勾配濃度培養：ステップＳ４-１で得られた細菌溶液上澄み液をそれぞ
れ５個の減菌済コニカルフラスコに加え、各減菌済コニカルフラスコには２．７重量部の
細菌溶液上澄み液が含まれ、各減菌済コニカルフラスコに、堆積物のバイオフィルム形成
を模擬するためのスライドを３枚入れ、０．４重量部のＬＢ培地を加え、ＬＢ培地では、
トリプトンの質量濃度が１０ｇ／Ｌ、酵母粉末の質量濃度が５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムの
質量濃度が１０ｇ／Ｌであり、残りは水であり、さらに５個の異なる減菌済コニカルフラ
スコに異なる濃度の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体を加え、５個の異なる減菌済
コニカルフラスコ中の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の濃度はそれぞれ０．０１
μｇ／Ｌ、０．１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌであり、３０℃
の室温条件下で１４日間振とう反応させて目標溶液を得、
Ｓ４-３、ＤＮＡ抽出：ステップＳ４-２で得られた目標溶液から目標溶液ＤＮＡを抽出す
る同時に、減菌済コニカルフラスコ中のスライド上の細菌をリン酸塩緩衝溶液に収集して
細菌ＤＮＡを抽出し、
Ｓ４-４、耐性遺伝子測定：目標抗生物質または目標抗生物質誘導体に対応する耐性遺伝
子を測定し、耐性遺伝子は２～２０種を取り、２０種未満の場合最大値を取り、抗生物質
に対応する耐性遺伝子種類は表４に示され、目標溶液ＤＮＡまたは細菌ＤＮＡの存在量を
測定して耐性遺伝子の相対存在量の平均値Ｐを算出する同時に、ステップＳ４以前の耐性
遺伝子の相対存在量の平均値Ｐ０も算出し、以下の式に示すように選択性係数Ｓを算出し
：
Ｓ＝Ｉｎ（Ｐ／Ｐ０）
Ｓ４-５、モデルフィッティング：抗生物質濃度Ｃを横座標とし、目標溶液ＤＮＡまたは
細菌ＤＮＡに対応する選択性係数Ｓを縦座標として、ｌｏｇｉｓｔｉｃモデルを用いてフ
ィッティングし、Ｓ＝０のとき、対応の抗生物質濃度ＣはＭＳＣ値であり、目標溶液ＤＮ
Ａまたは細菌ＤＮＡのＭＳＣ値を比較し、小さいＭＳＣ値を管理基準として選択し、この
ＭＳＣ値は、抗生物質濃度Ｃより高い抗生物質条件下で薬品耐性遺伝子を有する微生物が
濃縮され、その結果、微生物群集中の薬品耐性遺伝子の相対存在量が増加する。
【0007】
実施例２
本実施例は、上記実施例１で用いた水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリス
ク評価システムであり、このシステムは、
目標流域内の目標抗生物質および目標抗生物質誘導体の種類および含有量を監視するため
に使用され、まず情報処理装置において目標流域内の目標抗生物質監視リスト、目標抗生
物質誘導体監視リストを作成し、その後目標抗生物質および目標抗生物質誘導体の監視を
実行する環境監視システムと、
情報処理装置上で実際に検出した目標抗生物質、目標抗生物質誘導体と、環境監視システ
ムにより建築された目標抗生物質監視リスト、目標抗生物質誘導体監視リストとを比較し
、実際に検出した目標抗生物質、目標抗生物質誘導体が環境監視システムにより建築され
た目標抗生物質監視リスト、目標抗生物質誘導体監視リストに属するかどうかを判定する
初期スクリーニングシステムと、
情報処理装置上で、前記初期スクリーニングシステムの判定結果がＹｅｓである目標抗生
物質、目標抗生物質誘導体に対して微生物薬品耐性評価を行う微生物薬品耐性評価システ
ムと、
情報処理装置上で微生物薬品耐性リスクレベルの高い目標抗生物質、目標抗生物質誘導体
をさらに評価して、制限または禁止する必要のある生態学的リスクの高い抗生物質種類を
特定する高レベル評価システムと、を備える。
本実施例は、上記実施例１で用いた水環境中の残留抗生物質に対するマルチレベルのリス
ク評価システムであり、このシステムは、
目標流域内の目標抗生物質および目標抗生物質誘導体の種類および含有量を監視するため
に使用され、まず情報処理装置において目標流域内の目標抗生物質監視リスト、目標抗生
物質誘導体監視リストを作成し、その後目標抗生物質および目標抗生物質誘導体の監視を
実行する環境監視システムと、
情報処理装置上で実際に検出した目標抗生物質、目標抗生物質誘導体と、環境監視システ
ムにより建築された目標抗生物質監視リスト、目標抗生物質誘導体監視リストとを比較し
、実際に検出した目標抗生物質、目標抗生物質誘導体が環境監視システムにより建築され
た目標抗生物質監視リスト、目標抗生物質誘導体監視リストに属するかどうかを判定する
初期スクリーニングシステムと、
情報処理装置上で、前記初期スクリーニングシステムの判定結果がＹｅｓである目標抗生
物質、目標抗生物質誘導体に対して微生物薬品耐性評価を行う微生物薬品耐性評価システ
ムと、
情報処理装置上で微生物薬品耐性リスクレベルの高い目標抗生物質、目標抗生物質誘導体
をさらに評価して、制限または禁止する必要のある生態学的リスクの高い抗生物質種類を
特定する高レベル評価システムと、を備える。
【0008】
実施例３
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
目標流域は海域である。
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
目標流域は海域である。
【0009】
実施例４
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
目標流域は水機能領域、例えば溜池である。
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
目標流域は水機能領域、例えば溜池である。
【0010】
実施例５
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ３中の微生物群集は真菌である。
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ３中の微生物群集は真菌である。
【0011】
実施例６
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ３中の微生物群集は放線菌属である。
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ３中の微生物群集は放線菌属である。
【0012】
実施例７
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ３は以下のステップをさらに含み、環境残留性評価：データベースクエリーと
モデル予測方法を組み合わせて目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の半減期ｔ１／２
を求め、環境残留性レベルは半減期ｔ１／２値の大きさに応じて、ｔ１／２＜６０ｄで非
残留性、６０ｄ＜ｔ１／２＜１８０ｄで残留性、ｔ１／２＞１８０ｄで高残留性という３
クラスに分けられ、ｔ１／２＞６０の場合、目標抗生物質または目標抗生物質誘導体が環
境残留性を有すると判定し、すなわち、目標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクＲＱＲ
の値にかかわらず、表５に示すように、ステップＳ４に移行して継続的に評価する必要が
ある。
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
ステップＳ３は以下のステップをさらに含み、環境残留性評価：データベースクエリーと
モデル予測方法を組み合わせて目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の半減期ｔ１／２
を求め、環境残留性レベルは半減期ｔ１／２値の大きさに応じて、ｔ１／２＜６０ｄで非
残留性、６０ｄ＜ｔ１／２＜１８０ｄで残留性、ｔ１／２＞１８０ｄで高残留性という３
クラスに分けられ、ｔ１／２＞６０の場合、目標抗生物質または目標抗生物質誘導体が環
境残留性を有すると判定し、すなわち、目標流域中の微生物群集の薬品耐性リスクＲＱＲ
の値にかかわらず、表５に示すように、ステップＳ４に移行して継続的に評価する必要が
ある。
【0013】
実施例８
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
Ｓ４-１、環境微生物抽出：５０重量部の目標流域水試料をフィルター膜で濾過し、フィ
ルター膜の孔径は０．２μｍであり、濾過後、フィルター膜を面積１５ｍｍ２の断片に切
断し、断片を容器に入れ、断片体積の１．２倍のリン酸塩緩衝溶液を加え、リン酸塩緩衝
溶液では、ＮａＣｌ溶液の質量濃度が１０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ溶液の質量濃度が０．２５ｇ／
Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液の質量濃度が１．６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４溶液の質量濃度が０．
３ｇ／Ｌであり、残りは水であり、リン酸塩緩衝溶液のｐＨは７．４であり、さらに容器
に断片体積の２．５倍のガラスビーズを添加し、ボルテックスで１５ｍｉｎ振とうした後
、フィルター膜とガラスビーズを濾過・除去して細菌溶液上澄み液を得て用意し、
Ｓ４-２、抗生物質勾配濃度培養：ステップＳ４-１で得られた細菌溶液上澄み液をそれぞ
れ５個の減菌済コニカルフラスコに加え、各減菌済コニカルフラスコには２．５重量部の
細菌溶液上澄み液が含まれ、各減菌済コニカルフラスコに、堆積物のバイオフィルム形成
を模擬するためのスライドを３枚入れ、０．２重量部のＬＢ培地を加え、ＬＢ培地では、
トリプトンの質量濃度が１０ｇ／Ｌ、酵母粉末の質量濃度が５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムの
質量濃度が１０ｇ／Ｌであり、残りは水であり、さらに６個の異なる減菌済コニカルフラ
スコに異なる濃度の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体を加え、６個の異なる減菌済
コニカルフラスコ中の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の濃度はそれぞれ０．０１
μｇ／Ｌ、０．１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌであり、２８℃
の室温条件下で１４日間振とう反応させて目標溶液を得る。
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
Ｓ４-１、環境微生物抽出：５０重量部の目標流域水試料をフィルター膜で濾過し、フィ
ルター膜の孔径は０．２μｍであり、濾過後、フィルター膜を面積１５ｍｍ２の断片に切
断し、断片を容器に入れ、断片体積の１．２倍のリン酸塩緩衝溶液を加え、リン酸塩緩衝
溶液では、ＮａＣｌ溶液の質量濃度が１０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ溶液の質量濃度が０．２５ｇ／
Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液の質量濃度が１．６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４溶液の質量濃度が０．
３ｇ／Ｌであり、残りは水であり、リン酸塩緩衝溶液のｐＨは７．４であり、さらに容器
に断片体積の２．５倍のガラスビーズを添加し、ボルテックスで１５ｍｉｎ振とうした後
、フィルター膜とガラスビーズを濾過・除去して細菌溶液上澄み液を得て用意し、
Ｓ４-２、抗生物質勾配濃度培養：ステップＳ４-１で得られた細菌溶液上澄み液をそれぞ
れ５個の減菌済コニカルフラスコに加え、各減菌済コニカルフラスコには２．５重量部の
細菌溶液上澄み液が含まれ、各減菌済コニカルフラスコに、堆積物のバイオフィルム形成
を模擬するためのスライドを３枚入れ、０．２重量部のＬＢ培地を加え、ＬＢ培地では、
トリプトンの質量濃度が１０ｇ／Ｌ、酵母粉末の質量濃度が５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムの
質量濃度が１０ｇ／Ｌであり、残りは水であり、さらに６個の異なる減菌済コニカルフラ
スコに異なる濃度の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体を加え、６個の異なる減菌済
コニカルフラスコ中の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の濃度はそれぞれ０．０１
μｇ／Ｌ、０．１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌであり、２８℃
の室温条件下で１４日間振とう反応させて目標溶液を得る。
【0014】
実施例９
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
Ｓ４-１、環境微生物抽出：５０重量部の目標流域水試料をフィルター膜で濾過し、フィ
ルター膜の孔径は０．３μｍであり、濾過後、フィルター膜を面積２８ｍｍ２の断片に切
断し、断片を容器に入れ、断片体積の１．５倍のリン酸塩緩衝溶液を加え、リン酸塩緩衝
溶液では、ＮａＣｌ溶液の質量濃度が１０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ溶液の質量濃度が０．２５ｇ／
Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液の質量濃度が１．６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４溶液の質量濃度が０．
３ｇ／Ｌであり、残りは水であり、リン酸塩緩衝溶液のｐＨは７．４であり、さらに、容
器に断片体積の３倍のガラスビーズを添加し、ボルテックスで２０ｍｉｎ振とうした後、
フィルター膜とガラスビーズを濾過・除去して、細菌溶液上澄み液を得て用意し、
Ｓ４-２、抗生物質勾配濃度培養：ステップＳ４-１で得られた細菌溶液上澄み液をそれぞ
れ６個の減菌済コニカルフラスコに加え、各減菌済コニカルフラスコには３重量部の細菌
溶液上澄み液が含まれ、各減菌済コニカルフラスコに、堆積物のバイオフィルム形成を模
擬するためのスライドを３枚入れ、０．５重量部のＬＢ培地を加え、ＬＢ培地では、トリ
プトンの質量濃度が１０ｇ／Ｌ、酵母粉末の質量濃度が５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムの質量
濃度が１０ｇ／Ｌであり、残りは水であり、さらに６個の異なる減菌済コニカルフラスコ
に異なる濃度の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体を加え、６個の異なる減菌済コニ
カルフラスコ中の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の濃度はそれぞれ０．０１μｇ
／Ｌ、０．１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌであり、３３℃の室
温条件下で１４日間振とう反応させて目標溶液を得る。
本実施例は、実施例１とは以下の点で異なり：
Ｓ４-１、環境微生物抽出：５０重量部の目標流域水試料をフィルター膜で濾過し、フィ
ルター膜の孔径は０．３μｍであり、濾過後、フィルター膜を面積２８ｍｍ２の断片に切
断し、断片を容器に入れ、断片体積の１．５倍のリン酸塩緩衝溶液を加え、リン酸塩緩衝
溶液では、ＮａＣｌ溶液の質量濃度が１０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ溶液の質量濃度が０．２５ｇ／
Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液の質量濃度が１．６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４溶液の質量濃度が０．
３ｇ／Ｌであり、残りは水であり、リン酸塩緩衝溶液のｐＨは７．４であり、さらに、容
器に断片体積の３倍のガラスビーズを添加し、ボルテックスで２０ｍｉｎ振とうした後、
フィルター膜とガラスビーズを濾過・除去して、細菌溶液上澄み液を得て用意し、
Ｓ４-２、抗生物質勾配濃度培養：ステップＳ４-１で得られた細菌溶液上澄み液をそれぞ
れ６個の減菌済コニカルフラスコに加え、各減菌済コニカルフラスコには３重量部の細菌
溶液上澄み液が含まれ、各減菌済コニカルフラスコに、堆積物のバイオフィルム形成を模
擬するためのスライドを３枚入れ、０．５重量部のＬＢ培地を加え、ＬＢ培地では、トリ
プトンの質量濃度が１０ｇ／Ｌ、酵母粉末の質量濃度が５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムの質量
濃度が１０ｇ／Ｌであり、残りは水であり、さらに６個の異なる減菌済コニカルフラスコ
に異なる濃度の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体を加え、６個の異なる減菌済コニ
カルフラスコ中の目標抗生物質または目標抗生物質誘導体の濃度はそれぞれ０．０１μｇ
／Ｌ、０．１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌであり、３３℃の室
温条件下で１４日間振とう反応させて目標溶液を得る。
【0015】
実験例
実施例１中の方法のパラメータを例にとると、目標抗生物質はテトラサイクリン、得られ
た目標抗生物質の濃度と選択性係数Ｓの対応関係図は図２に示され、この目標抗生物質は
目標溶液ＤＮＡの存在量から算出した耐性遺伝子の相対存在量の平均値Ｐを選択し、具体
的なパラメータは表１に示される。
実施例１中の方法のパラメータを例にとると、目標抗生物質はテトラサイクリン、得られ
た目標抗生物質の濃度と選択性係数Ｓの対応関係図は図２に示され、この目標抗生物質は
目標溶液ＤＮＡの存在量から算出した耐性遺伝子の相対存在量の平均値Ｐを選択し、具体
的なパラメータは表１に示される。
【図1】
【図2】
