特許 7408284 単純ヘルペスウイルスを治療するためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-22

(45)【発行日】2024-01-05

(54)【発明の名称】単純ヘルペスウイルスを治療するためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20231225BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20231225BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20231225BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231225BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20231225BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20231225BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231225BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20231225BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

A61K31/7105

A61K38/16

A61K48/00

A61P27/02

A61P31/22

C12N5/10

C12N15/86 Z ZNA

【請求項の数】 38

(21)【出願番号】P 2018542995

(86)(22)【出願日】2016-10-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2018-11-15

(86)【国際出願番号】 US2016059502

(87)【国際公開番号】W WO2017075475

(87)【国際公開日】2017-05-04

【審査請求日】2019-10-28

【審判番号】

【審判請求日】2022-01-21

(31)【優先権主張番号】62/249,071

(32)【優先日】2015-10-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/249,159

(32)【優先日】2015-10-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517372508

【氏名又は名称】エディタス・メディシン、インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】フリートラント， アリ イー．

(72)【発明者】

【氏名】オドネル， ペンローズ

(72)【発明者】

【氏名】バンクロット， デーヴィッド エー．

【合議体】

【審判長】長井 啓子

【審判官】飯室 里美

【審判官】松本 淳

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／１２６９２７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１５／０７００８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】ウイルス，２００１，Ｖｏｌ．５１，ｐ．２９－３６

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N

A61K

ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲノム編集のためのキットであって、
（ｉ）ＲＬ２遺伝子及びＲＳ１遺伝子からなる群から選択される単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子であって、前記標的指向性ドメインが、配列番号２３５１９、配列番号２３５８７、配列番号２３５８３、配列番号２３５８０、配列番号２３５７１、配列番号２３５６９、配列番号２３５２７、配列番号２３５３１、配列番号２３４８９、配列番号２３５３５、配列番号３３６３、配列番号３３６２、配列番号２５２２、配列番号２５１５、又は配列番号２４３から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡ分子；並びに
（ｉｉ）Ｃａｓ９分子
を含むキット。

【請求項2】

前記標的指向性ドメインは、ＨＳＶ標的位置の約５００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約１５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約５０ｂｐ、約２５ｂｐ、又は約１０ｂｐ以内に二本鎖切断又は一本鎖切断を形成し、それにより前記ＨＳＶウイルス遺伝子を変更するように構成されている、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

前記ＨＳＶウイルス遺伝子の前記変更は、前記ＨＳＶウイルス遺伝子をノックアウトすること、前記ＨＳＶウイルス遺伝子をノックダウンすること、又は前記ＨＳＶウイルス遺伝子を同時にノックアウト及びノックダウンすることを含む、請求項２に記載のキット。

【請求項4】

前記標的指向性ドメインは、前記ＨＳＶウイルス遺伝子のコード化領域を標的とするように構成されている、請求項１から３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項5】

前記Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項6】

前記化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、ＮＧＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、又は前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）又はＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５）のいずれかのＰＡＭを認識する、請求項５に記載のキット。

【請求項7】

前記Ｃａｓ９分子は、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子、及びｅｉＣａｓ９融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項8】

（ａ）前記ｅａＣａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含むが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含まないか又は顕著なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含まない；
（ｂ）前記ｅａＣａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである；
（ｃ）前記ｅａＣａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含むが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含まないか又は顕著なＨＮＨ様ドメイン切断活性を含まない；又は
（ｄ）前記ｅａＣａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである
請求項７に記載のキット。

【請求項9】

前記Ｃａｓ９分子は、野生型Ｃａｓ９分子、変異Ｃａｓ９分子、又はそれらの組合せを含み、任意選択的に、前記変異Ｃａｓ９分子は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ９８６、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、及びＮ５８０からなる群から選択される突然変異を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項10】

前記ｇＲＮＡ分子は、モジュール型ｇＲＮＡ分子又はキメラｇＲＮＡ分子である、請求項１から９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項11】

前記ｇＲＮＡ分子は、５’から３’に向かって、
標的指向性ドメイン、
第１の相補性ドメイン、
連結ドメイン、
第２の相補性ドメイン、
近位ドメイン、及び
尾部ドメイン
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項12】

前記連結ドメインは、長さが２５個ヌクレオチド以下である、請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

前記近位及び尾部ドメインは、合計で、長さが、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、又は少なくとも４０個のヌクレオチドである、請求項１１又は１２に記載のキット。

【請求項14】

２、３、又は４つのｇＲＮＡ分子を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項15】

細胞内の前記ＨＳＶウイルス遺伝子を変更するために使用され、任意選択的に、前記細胞は、ＨＳＶに感染している、請求項１から１４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項16】

ＲＬ２遺伝子及びＲＳ１遺伝子からなる群から選択されるＨＳＶウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子であって、前記標的指向性ドメインが、配列番号２３５１９、配列番号２３５８７、配列番号２３５８３、配列番号２３５８０、配列番号２３５７１、配列番号２３５６９、配列番号２３５２７、配列番号２３５３１、配列番号２３４８９、配列番号２３５３５、配列番号３３６３、配列番号３３６２、配列番号２５２２、配列番号２５１５、又は配列番号２４３から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡ分子を含む、組成物。

【請求項17】

１、２、３、又は４つのｇＲＮＡ分子を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

少なくとも１つのＣａｓ９分子をさらに含む、請求項１６又は１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記少なくとも１つのＣａｓ９分子は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記少なくとも１つのＣａｓ９分子は、野生型Ｃａｓ９分子、変異Ｃａｓ９分子、又はそれらの組合せを含む、請求項１８又は１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記変異Ｃａｓ９分子は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ９８６、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、及びＮ５８０からなる群から選択される突然変異を含む、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、ＮＧＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する；又は、前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）又はＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５）のいずれかのＰＡＭを認識する、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

細胞内の前記ＨＳＶウイルス遺伝子を変更するために使用され、任意選択的に、前記細胞は、ＨＳＶに感染している、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

インビトロでゲノム編集するためのベクターであって、ＲＬ２遺伝子及びＲＳ１遺伝子からなる群から選択されるＨＳＶウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドであって、前記標的指向性ドメインが、配列番号２３５１９、配列番号２３５８７、配列番号２３５８３、配列番号２３５８０、配列番号２３５７１、配列番号２３５６９、配列番号２３５２７、配列番号２３５３１、配列番号２３４８９、配列番号２３５３５、配列番号３３６３、配列番号３３６２、配列番号２５２２、配列番号２５１５、又は配列番号２４３から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項25】

Ｃａｓ９分子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２４に記載のベクター。

【請求項26】

少なくとも１つのＣａｓ９分子は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項２５に記載のベクター。

【請求項27】

少なくとも１つのＣａｓ９分子は、野生型Ｃａｓ９分子、変異Ｃａｓ９分子、又はそれらの組合せを含む、請求項２５又は２６に記載のベクター。

【請求項28】

前記変異Ｃａｓ９分子は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ９８６、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、及びＮ５８０からなる群から選択される突然変異を含む、請求項２７に記載のベクター。

【請求項29】

前記化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、ＮＧＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する、又は前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）又はＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５）のいずれかのＰＡＭを認識する、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項30】

前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項２４から２９のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項31】

細胞内の前記ＨＳＶウイルス遺伝子を変更するために使用され、任意選択的に、前記細胞は、ＨＳＶに感染している、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項32】

細胞内のＲＬ２遺伝子及びＲＳ１遺伝子からなる群から選択されるＨＳＶウイルス遺伝子を変更するためのインビトロ方法であって、前記細胞に、
（ｉ）前記ＨＳＶウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子、及び少なくともＣａｓ９分子を含むゲノム編集系、
（ｉｉ）前記ＨＳＶウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド、及びＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、又は
（ｉｉｉ）前記ＨＳＶウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子、及び少なくともＣａｓ９分子を含む組成物
のうちの１つを投与することを含み、
前記標的指向性ドメインが、配列番号２３５１９、配列番号２３５８７、配列番号２３５８３、配列番号２３５８０、配列番号２３５７１、配列番号２３５６９、配列番号２３５２７、配列番号２３５３１、配列番号２３４８９、配列番号２３５３５、配列番号３３６３、配列番号３３６２、配列番号２５２２、配列番号２５１５、又は配列番号２４３から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、インビトロ方法。

【請求項33】

前記変更は、前記ＨＳＶウイルス遺伝子をノックアウトすること、若しくは前記ＨＳＶウイルス遺伝子をノックダウンすること、又は前記ＨＳＶウイルス遺伝子を同時にノックアウト及びノックダウンすることを含む、請求項３２に記載のインビトロ方法。

【請求項34】

前記細胞は、ＨＳＶに感染している、請求項３２又は３３に記載のインビトロ方法。

【請求項35】

前記Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項３２から３４のいずれか一項に記載のインビトロ方法。

【請求項36】

ＲＬ２遺伝子及びＲＳ１遺伝子からなる群から選択されるＨＳＶウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子であって、前記標的指向性ドメインが、配列番号２３５１９、配列番号２３５８７、配列番号２３５８３、配列番号２３５８０、配列番号２３５７１、配列番号２３５６９、配列番号２３５２７、配列番号２３５３１、配列番号２３４８９、配列番号２３５３５、配列番号３３６３、配列番号３３６２、配列番号２５２２、配列番号２５１５、又は配列番号２４３から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡ分子。

【請求項37】

請求項１６から２３のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項２４から３１のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項38】

上皮細胞、神経細胞、及び視細胞からなる群から選択される、請求項３７に記載の細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／２４９０７１号、及び２０１５年１０月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／２４９１５９号の優先権を主張するものである。これら文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

政府の権利に関する宣言
本発明は、国立衛生研究所により交付された助成金第１Ｒ４３Ａ１１２０３０２－０１号に基づく政府支援によりなされたものである。政府は、本発明にある特定の権利を有する。

【0003】

配列表
本明細書は、配列表を参照する（２０１６年１０月２８日に「２０１６－１０－２８＿０８４１７７＿０１３３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名の．ｔｘｔファイルとして電子的に提出された）。この２０１６－１０－２８＿０８４１７７＿０１３３＿ＳＴ２５．ｔｘｔファイルは、２０１６年１０月２８日に生成され、サイズは、１１，１８９，３９６バイトである。配列表の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0004】

本開示は、標的核酸配列を編集するための、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連方法、組成物、及びゲノム編集系、並びに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に関連するそれらの応用に関する。

【背景技術】

【0005】

単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、例えば単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ－２）は、遍在性で感染力の強い病原体である。ＨＳＶ－１は、一般的に、口及び粘膜の間欠性有痛水疱形成を引き起こす。ＨＳＶ－２は、一般的に、性器部に間欠性有痛水疱形成を引き起こす。ＨＳＶは、生涯にわたる再発性のウイルス反応性の発作を引き起こす場合がある。

【0006】

人口の大半は、幼年期にＨＳＶ－１感染症を発症する。成年期までに米国人口の最大８０％がＨＳＶ－１に感染する。新たなＨＳＶ－１感染症は、１００人年当たり１．６症例の割合で生じる（Langenberg等、1999; New England Journal of Medicine 341:1432-1438）。ＨＳＶ－１感染症の最も重度な顕現症状としては、例えば、角膜炎、脳炎、及び脳膜炎が挙げられる。

【0007】

ＨＳＶ－２感染は、世界中で５億人を超える。各年、最大２３００万人が、新たに感染している。米国では、成人５人中およそ１人が、ＨＳＶ－２感染に血清反応陽性を示す（Xu等、第４２回米国感染症学会の抄録７３９、２００４年９月３０日）ＨＳＶ－２の発生率は増加している。１９７６年以来、米国における成人のＨＳＶ－２血清陽性の存在は３０％増加している（Fleming等、New England Journal of Medicine 1997; 337:1105-11）。ＨＳＶ－２による感染は、特に活動性病変を有する患者では、ＨＩＶ感染の獲得リスクを増加させる。

【0008】

ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２による感染は、恒久的である。ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２による初感染後、ウイルスは、宿主の生涯にわたって継続する潜伏感染を確立する。ＨＳＶ－１による初感染は、一般的に、唇、口、及び鼻を含む、口の粘膜の有痛水疱形成を引き起こす。ＨＳＶ－１初感染が、肛門性器部に影響を及ぼして、性器及び肛門部の粘膜の有痛水疱形成を引き起こすことは、それほど一般的ではない。ＨＳＶ－２による初感染は、一般的に、肛門性器部の粘膜の有痛水疱形成を引き起こす。ＨＳＶ－２初感染が、口に影響を及ぼして、唇、口、及び鼻の粘膜の有痛水疱形成を引き起こすことは、それほど一般的ではない。

【0009】

初感染後、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２は、全ての対象で潜伏感染を確立する。潜伏感染の確立後、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２の再活性化は、対象の生涯にわたって任意の時点で生じ得る。ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２の再活性化は、高齢者、並びにがんを有する個体、ＨＩＶ／ＡＩＤを有する個体、及び実質臓器移植又は造血幹細胞移植を受けた個体を含む免疫不全個体で生じる可能性がより高い。

【0010】

ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２は両方とも、眼ヘルペスを引き起こす。歴史的に、ＨＳＶ－１は、大多数の眼ヘルペス感染症の原因因子である。しかしながら、近年、ＨＳＶ－２関連眼感染症の発症率が、世界的に増加している。

【0011】

ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２による眼感染症は、眼の上皮に影響を及ぼし、角膜炎を引き起こす場合がある。角膜炎は、眼ヘルペスの最も一般的な形態である。ＨＳＶ関連角膜炎は、先進国世界の感染性失明の最も一般的な原因である（Dawson等、Suvey of Ophthalmology 1976; 21(2): 121-135）。世界的に、ＨＳＶ関連眼科疾患はおよそ１５０万症例が、ＨＳＶ関連失明又は重度単眼視力障害は４０，０００症例が、毎年発生している（Krawczyk等、Public Library of Science One 2015; 10(1): e0116800。Farooq及びShukla 2012; Survey of Ophthalmology 57(5): 448-462）。米国では、眼ＨＳＶ感染症の発症率は増加していると考えられる（Liesegangら、1989, Archives of Ophthalmology 107:1155-1159。Baratzら、2009, Investigations in Ophthalmologic Visual Science 50 e-abstract 5044）。米国では、上皮角膜炎は、１００，０００人年当たりの症例数が１５．６件であり、つまり１年当たりの症例数がおよそ５０，０００件である（Farooq及びShukla 2012; Survey of Ophthalmology 57(5): 448-462）。

【0012】

また、眼ヘルペスは、網膜に影響を及ぼし、網膜炎を引き起こす場合がある。ＨＳＶ関連網膜炎が生じる頻度は、ＨＳＶ関連角膜炎ほど高くないが、恒久的視覚損傷のリスクは遥かにより高い。ＨＳＶ関連網膜炎は、成体に影響を及ぼすことが最も多く、急性網膜壊死（ＡＲＮ）を引き起こす場合がある。ＡＲＮは、対象の５０％超に恒久的視覚損傷を引き起こす（Roy等、Ocular Immunology and Inflammation 2014; 22(3):170-174）。

【0013】

新生仔は、重度ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２感染症を発症する特別なリスクのある集団である。この疾患は、出産中に母親から胎仔へと伝染する。母子感染の可能性は、母親が妊娠中に、一次ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症を発症した場合、最も高い。新生仔ヘルペスの発症率は、１００，０００出産当たりおよそ４－３０件である（Brown ZA等、2003; Journal of the American Medical Association; 289(2): 203-209.Dinh T-H等、2008; Sexually Transmitted Disease; 35(1): 19-21）。新生仔は、重度ＨＳＶ関連角膜炎、網膜炎、脳炎、及び／又は脳膜炎を発症する場合がある。新生仔眼ヘルペスは、即時性の恒久的視力喪失をもたらす場合がある。眼ＨＳＶにより、新生仔は、後にＡＲＮを発症するリスクに曝される。ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２を治癒又は予防する治療法はない。主に急性感染中に療法剤が投与される。一次ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症は、アシクロビル、バラシクロビル、及びファムシクロビルを含む抗ウイルス療法剤で治療することができる。こうした療法剤は、ウイルス排出を低減し、疼痛を減少させ、病変の治癒時間を向上させることができる。再活性化された潜伏感染症は、治療せずに解消する場合があり（自然治癒する場合がある）、又は抗ウイルス療法剤で治療してもよい。抗ウイルス療法剤は、最近のＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症又は再活性化を有する母親の出産中を含むある特定の状況では、予防的に投与してもよい。

【0014】

ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２感染症を予防するためのワクチンが開発中である。しかしながら、比較臨床試験では、ワクチン接種効力は限定的である。ＨＳＶ－１感染症及びＨＳＶ－２感染症両用の最近のワクチンは、ＨＳＶ－１感染症の予防には３５％しか有効ではなかった（Belsheら、2012; New England Journal of Medicine 366(1): 34-43）。

【0015】

抗レトロウイルス療法剤の進歩にも関わらず、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２感染症を治療、予防、及び／又は低減する、特に、角膜炎及び網膜炎を含む、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２関連眼感染症を治療、予防、及び／又は低減する必要性が依然として存在する。ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２眼感染症を治癒、予防、又は治療することができる療法剤は、現行の標準治療よりも優れているだろう。

【発明の概要】

【0016】

本明細書で考察されている方法、ゲノム編集系、及び組成物は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症、例えば、眼感染症の治療、予防、及び／又は低減を提供する。

【0017】

本明細書で考察されている方法、ゲノム編集系、及び組成物を使用して、例えば、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２ウイルス遺伝子の一又は複数を変更（ノックアウト及び／又はノックダウン）することにより、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つをノックアウト及び／又はノックダウンすることにより、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ－１）及び／又は単純ヘルペス２型（ＨＳＶ－２）により引き起こされる眼感染症を含む単純ヘルペスウイルス眼感染症又はその症状の治療、予防、及び／又は低減を提供することができる。ＲＬ２は、ＬＡＴ遺伝子、並びに潜伏、再活性化、及び溶解感染中のＨＳＶ－１ウイルス遺伝子発現の制御に関連するオープンクロマチン領域を含む（J. Gen. Virol. 2008 Jan; 89 (Pt 1): 68-77）。

【0018】

本明細書で考察されている方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子をノックアウトすることにより、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２により引き起こされる眼感染症を含む単純ヘルペスウイルス眼感染症又はその症状の治療、予防、及び／又は低減を提供する。本明細書で考察されている方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子をノックダウンすることにより、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２により引き起こされる眼感染症を含む単純ヘルペスウイルス眼感染症又はその症状の治療、予防、及び／又は低減を提供する。本明細書で考察されている方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子を同時にノックアウト及びノックダウンすることにより、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２により引き起こされる眼感染症を含む単純ヘルペスウイルス眼感染症又はその症状の治療、予防、及び／又は低減を提供する。

【0019】

本明細書で考察されている方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子内の一又は複数の位置を変更して、それを破壊及び／又は感染細胞から消失させることにより、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２により引き起こされる眼感染症を含む単純ヘルペスウイルス眼感染症又はその症状の治療、予防、及び／又は低減を提供する。

【0020】

一態様では、本明細書で考察されている方法、ゲノム編集系、及び組成物を使用して、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つの発現を変更、例えばノックアウト又はノックダウンして、上記遺伝子、例えば上記遺伝子の非コード化又はコード化領域を変更することにより、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症を、治療、予防、及び／又は低減することができる。

【0021】

ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つのコード配列、例えばコード化領域（本明細書では、コード配列とも呼ばれる）を、発現の変更並びにノックアウト及び／又はノックダウンの標的とする。ある特定の実施態様では、コード化領域は、初期コード化領域、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つである。例えば、限定ではないが、本明細書で考察されている方法、ゲノム編集系、及び組成物を使用して、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つを変更し、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つコード配列、例えばイントロン又はエクソン配列を標的とすることにより、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症を、治療、予防、及び／又は低減する。ある特定の実施態様では、上記遺伝子、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／若しくはＬＡＴ遺伝子の１、２、若しくは３つのコード配列を標的として、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／若しくはＬＡＴ遺伝子の１、２、若しくは３つに、突然変異（例えば、挿入若しくは欠失）を含む変更を導入することにより、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／若しくはＬＡＴ遺伝子の１、２、若しくは３つをノックアウト及び／若しくはノックダウンして、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／若しくはＬＡＴ遺伝子の１、２、若しくは３つの発現を消失させ；並びに／又はＲＳ１、ＲＬ２、及び／若しくはＬＡＴ遺伝子の１、２、若しくは３つの一若しくは複数のコピーをノックアウトする。ある特定の実施態様では、本方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つに、挿入又は欠失を含む変更をもたらす。

【0022】

ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つの初期コード配列を標的として、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つをノックアウト又はノックダウンする。ある特定の実施態様では、標的化は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数のコピーに影響を及ぼす。ある特定の実施態様では、標的化ノックアウト又はノックダウン手法により、１つ、２つ、又は全ての機能性ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子産物の発現が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、本方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２、又は３つに、挿入又は欠失を含む変更をもたらす。

【0023】

別の態様では、本方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリアデニル化シグナル、及び／又はオープンクロマチン領域。ある特定の実施態様では、上記遺伝子、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の非コード配列を標的として、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子に、突然変異（例えば、挿入又は欠失）を含む変更を導入することにより、上記遺伝子をノックアウトし、例えば、上記遺伝子の発現を消失させ、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数のコピーをノックアウトする。ある特定の実施態様では、本方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子に、挿入又は欠失を含む変更をもたらす。

【0024】

ある特定の実施態様では、ＲＳ１遺伝子を変更（例えば、ノックアウト又はノックダウン）するとは、（１）ＲＳ１遺伝子発現を低減若しくは消失させること、（２）ＲＳ１遺伝子によりコードされるタンパク質、転写制御因子ＩＣＰ４の活性及び／若しくは機能を妨害すること、又は（３）転写制御因子ＩＣＰ４タンパク質の細胞内、血清内、及び／若しくは実質内レベルを低減若しくは消失させることを指す。

【0025】

ある特定の実施態様では、ＲＬ２遺伝子を変更（例えば、ノックアウト又はノックダウン）するとは、（１）ＲＬ２遺伝子発現を低減若しくは消失させること、（２）ＲＬ２遺伝子によりコードされるＩＣＰ０タンパク質の活性及び／若しくは機能を妨害すること、並びに／又は（３）ＩＣＰ０タンパク質の細胞内、血清内、及び／若しくは実質内レベルを低減若しくは消失させることを指す。

【0026】

ある特定の実施態様では、ＬＡＴ遺伝子を変更（例えば、ノックアウト又はノックダウン）するとは、（１）ＬＡＴ遺伝子発現を低減若しくは消失させること、（２）ＬＡＴ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性及び／若しくは機能を妨害すること、並びに／又は（３）ＬＡＴ遺伝子によりコードされるタンパク質の細胞内、血清内、及び／若しくは実質内レベルを低減若しくは消失させることを指す。

【0027】

ある特定の実施態様では、本開示の方法、ゲノム編集系、及び組成物は、Ｃａｓ９分子（例えば、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ９ニッカーゼ）又は下記に記載されているようなＣａｓ９－融合タンパク質により媒介される一又は複数のヌクレオチドの挿入又は欠失により、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子を破壊することを含む変更をもたらす。このタイプの変更は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子を「ノックアウトする」とも呼ばれる。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックアウトは、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子に、突然変異（例えば、挿入又は欠失）を含む変更を導入することにより、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数のコピーをノックアウトすることを含む。ある特定の実施態様では、変更は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子における挿入又は欠失を含む。ある特定の実施態様では、標的化ノックアウト手法は、例えば、Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）又はＣａｓ９－融合タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により媒介される。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質は、Ｃａｓ９変異体、例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＶＲＥＲ変異体である。ある特定の実施態様では、標的化ノックアウト手法により、機能性ＲＬ２遺伝子産物の発現が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、標的化ノックアウト手法により、機能性ＬＡＴ遺伝子産物の発現が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、標的化ノックアウト手法により、機能性ＲＳ１遺伝子産物の発現が低減又は消失される。

【0028】

ある特定の実施態様では、本開示の方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子にヌクレオチド挿入又は欠失を含まないＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の発現の変更をもたらす。このタイプの変更は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子を「ノックダウンする」とも呼ばれる。ある特定の実施態様では、この手法は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の発現の低減、減少、抑制、又は消失を生じさせる。ある特定の実施態様では、標的化ノックダウン手法は、Ｃａｓ９分子（例えば、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子）又はＣａｓ９－融合タンパク質（例えば、ｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写リプレッサードメイン又はクロマチン修飾タンパク質と融合されているｅｉＣａｓ９））を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系により媒介され、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の転写を変更する（例えば、転写をブロック、低減、又は減少させる）。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の非コード化領域（例えば、エンハンサー領域、プロモーター領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリアデニル化シグナル、及び／又はオープンクロマチン領域）を標的として、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の発現を変更する。ある特定の実施態様では、ＲＬ２遺伝子のオープンクロマチン領域を標的として、ＲＬ２遺伝子の発現を変更する。ある特定の実施態様では、転写調節領域、例えば、プロモーター領域（例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の転写を制御するプロモーター領域）を標的として、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の発現を変更（例えば、ノックダウン）する。ある特定の実施態様では、一又は複数のｇＲＮＡ分子は、ｅｉＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９融合タンパク質を、転写調節領域、例えばプロモーター領域（例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の転写を制御するプロモーター領域）の十分に近くへと標的化して、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の発現を低減、減少、又は抑制するように構成されている標的指向性ドメインを含む。ある特定の実施態様では、ＲＬ２遺伝子のコード化領域を標的として、ＲＬ２遺伝子の発現を変更（例えば、ノックダウン）する。ある特定の実施態様では、ＲＳ１遺伝子のコード化領域を標的として、ＲＳ１遺伝子の発現を変更（例えば、ノックダウン）する。ある特定の実施態様では、ＬＡＴ遺伝子のコード化領域を標的として、ＬＡＴ遺伝子の発現を変更（例えば、ノックダウン）する。ある特定の実施態様では、ｅｉＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９変異体、例えば、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＶＲＥＲ変異体である。ある特定の実施態様では、標的化ノックダウン手法により、機能性ＲＬ２遺伝子産物の発現が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、標的化ノックアウト手法により、機能性ＬＡＴ遺伝子産物の発現が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、標的化ノックアウト手法により、機能性ＲＳ１遺伝子産物の発現が低減又は消失される。

【0029】

ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックダウンは、ＨＳＶ感染症を治癒する。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックダウンは、ＨＳＶ感染症の機能的治癒をもたらす。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックダウンは、ＨＳＶ感染症に対する持続的ウイルス応答に結び付く。

【0030】

ある特定の実施態様では、対象ゲノムに組み込まれることが知られているＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の領域を、ノックダウンの標的とする。ある特定の実施態様では、対象ゲノムに組み込まれないことが知られているＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の領域を、ノックアウトの標的とする。ある特定の実施態様では、本方法は、対象ゲノムに組み込まれないＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の領域をノックアウトすることを含む。

【0031】

ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックアウト、ノックダウン、並びに同時ノックアウト及びノックダウンは、ＨＳＶ感染力、複製、パッケージングを低減することができ、したがってＨＳＶ感染症を治療、予防、及び／又は低減することができる。ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の発現のノックアウト、ノックダウン、並びに同時ノックアウト及びノックダウンは、以下のいずれかを単独で又は組合せで引き起こすことができる：ＨＳＶ ＤＮＡ産生の減少、ウイルス感染力の減少、ウイルス粒子のパッケージングの減少、ウイルス排出の減少、並びに／又はＲＳ１、ＲＬ２、及び／若しくはＬＡＴ遺伝子によりコードされるウイルスタンパク質、例えばＩＣＰ０及び／又はＩＣＰ４タンパク質の産生の減少。ある特定の実施態様では、本方法は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の２つの異なる領域を同時に１）ノックアウト及び２）ノックダウンすること、例えば、１）対象ゲノムに組み込まれるＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子の領域をノックダウンすること、及び２）対象ゲノムに組み込まれないＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子の異なる領域をノックアウトすることを含む。

【0032】

本開示の主題は、ＲＳ１遺伝子、ＲＬ２遺伝子、及びＬＡＴ遺伝子からなる群から選択される単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子；及びＣａｓ９分子を含むゲノム編集系を提供する。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、ＨＳＶ標的位置の約５００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約１５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約５０ｂｐ、約２５ｂｐ、又は約１０ｂｐ以内に二本鎖切断又は一本鎖切断を形成し、それにより上記ＨＳＶウイルス遺伝子を変更するように構成されている。ある特定の実施態様では、上記ＨＳＶウイルス遺伝子の変更は、上記ＨＳＶウイルス遺伝子をノックアウトすること、上記ＨＳＶウイルス遺伝子をノックダウンすること、並びに前記ＨＳＶウイルス遺伝子を同時にノックアウト及びノックダウンすることを含む。

【0033】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、ＨＳＶウイルス遺伝子のコード化領域又は非コード化領域を標的とするように構成されており、非コード化領域は、ＨＳＶウイルス遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、又はポリアデニル化シグナル領域を含み、コード化領域は、ＨＳＶウイルス遺伝子の初期コード化領域を含む。

【0034】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、配列番号２０８－５８７４９から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0035】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＲＳ１遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号２０８－２５０９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0036】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＲＳ１遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号７０９８－９２９２からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0037】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＲＬ２遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号２１３２４－２２７４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0038】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＲＬ２遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号２６６１３－２８０３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0039】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＬＡＴ遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号３１７３０－３２７４６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0040】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＬＡＴ遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号３５６１７－３６９２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0041】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＲＳ１遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号２５１０－７０７３からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0042】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＲＳ１遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号９２９３－１３６１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0043】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＲＬ２遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号２２７４５－２６６０１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0044】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＲＬ２遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号２８０３８－３１７２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0045】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＬＡＴ遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号３２７４７－３５６００からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0046】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＬＡＴ遺伝子をノックアウトし、標的指向性ドメインは、配列番号３６９２７－４０８７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0047】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＲＳ１遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号１３６３７－１４７９４からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0048】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＲＳ１遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号１７７５３－１８７８４からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0049】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＲＬ２遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号４０８８６－４２０７８からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0050】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＲＬ２遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号４９４９８－５０６５２からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0051】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＬＡＴ遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号４５３４０－４６４７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0052】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＬＡＴ遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号５３８５８－５５０５６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0053】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＲＳ１遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号１４７９５－１７７４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0054】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＲＳ１遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号１８７８５－２１３１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0055】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＲＬ２遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号４２０７９－４５３１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0056】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＲＬ２遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号５０６５３－５３８２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0057】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－１ ＬＡＴ遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号４６４８０－４９４７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0058】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子であり、ゲノム編集系は、ＨＳＶ－２ ＬＡＴ遺伝子をノックダウンし、標的指向性ドメインは、配列番号５５０５７－５８７３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は３つ以内のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0059】

ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子は、ＮＧＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する。

【0060】

ある特定の実施態様では、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）又はＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５）のいずれかのＰＡＭを認識する。

【0061】

本開示の主題は、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子の標的ドメイン（「標的配列」とも呼ばれる）に相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子、例えば、単離された又は非天然のｇＲＮＡ分子を提供する。本開示の主題は、そのようなｇＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。さらに、本開示の主題は、そのようなｇＲＮＡ分子を含むベクターを提供する。加えて、本開示の主題は、本開示のゲノム編集系、ベクター、又は組成物を含む細胞を提供する。ある特定の実施態様では、細胞は、上皮細胞、神経細胞、及び視細胞からなる群から選択される。

【0062】

ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の十分に近くに、切断事象、例えば二本鎖切断又は一本鎖切断をもたらして、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更、例えば、ＮＨＥＪに関連する変更を可能にするように構成されている。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、切断事象、例えば二本鎖又は一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように構成されている。切断、例えば二本鎖又は一本鎖切断は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流又は下流に配置されてもよい。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の５００ヌクレオチド以内に（例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、８０、６０、４０、２０、又は１０ヌクレオチド以内に）、二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される切断事象をもたらすように構成されている。

【0063】

ある特定の実施態様では、第２の標的指向性ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の十分に近くに、切断事象、例えば二本鎖切断又は一本鎖切断をもたらして、単独で又は第１のｇＲＮＡ分子により配置された切断との組合せのいずれかで、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更、例えば、ＮＨＥＪに関連する変更を可能にするように構成されている。ある特定の実施態様では、第１及び第２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、切断事象、例えば二本鎖又は一本鎖切断が、各々のｇＲＮＡ分子毎に独立して、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、切断、例えば二本鎖又は一本鎖切断は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の両側に配置される。ある特定の実施態様では、切断、例えば二本鎖又は一本鎖切断は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の一方の側、例えば上流又は下流に配置される。ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の５００ヌクレオチド以内に（例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、８０、６０、４０、２０、又は１０ヌクレオチド以内に）、二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される切断事象をもたらすように構成されている。

【0064】

ある特定の実施態様では、一本鎖切断には、下記で考察されているような第２のｇＲＮＡ分子により配置された追加の一本鎖切断が伴う。例えば、標的指向性ドメインは、切断事象、例えば２つの一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、第１及び第２のｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質、例えばＣａｓ９ニッカーゼを誘導する場合、一本鎖切断には、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更をもたらすように互いに対して十分に近い位置に、第２のｇＲＮＡ分子により配置された追加の一本鎖切断が伴うように構成されている。ある特定の実施態様では、例えば、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質がニッカーゼである場合、第１及び第２のｇＲＮＡ分子は、第２のｇＲＮＡ分子により配置された一本鎖切断が、第１のｇＲＮＡ分子により配置された切断の１０、２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチド以内であるように構成されている。ある特定の実施態様では、２つのｇＲＮＡ分子は、異なる鎖の同じ位置に又は互いの少数ヌクレオチド以内に切断を配置して、例えば本質的に二本鎖切断を模倣するように構成されている。

【0065】

ある特定の実施態様では、二本鎖切断には、下記で考察されているような第２のｇＲＮＡ分子により配置された追加の二本鎖切断が伴っていてもよい。例えば、第１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、二本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように構成されており、第２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、二本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の下流、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように構成されている。

【0066】

ある特定の実施態様では、二本鎖切断には、第２のｇＲＮＡ分子及び第３のｇＲＮＡ分子により配置された２つの追加の一本鎖切断が伴っていてもよい。例えば、第１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、二本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように構成されており、第２及び第３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、２つの一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置又はＨＳＶ ＲＳ１標的位置、の下流、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、第１、第２、及び第３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、切断事象、例えば二本鎖又は一本鎖切断が、各々のｇＲＮＡ分子毎に独立して配置されるように構成されている。

【0067】

ある特定の実施態様では、第１及び第２の一本鎖切断には、第３のｇＲＮＡ分子及び第４のｇＲＮＡ分子により配置された２つの追加の一本鎖切断が伴っていてもよい。例えば、第１及び第２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、２つの一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように構成されており、第３及び第４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、２つの一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の下流、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、第１、第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の５００ヌクレオチド以内に（例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、８０、６０、４０、２０、又は１０ヌクレオチド以内に）、二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される切断事象をもたらすように構成されている。

【0068】

ある特定の実施態様では、複数のｇＲＮＡを使用して、（１）近傍の２つの一本鎖切断；（２）例えば、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に隣接する２つの二本鎖切断（例えば、一片のＤＮＡを除去するための、例えば、欠失突然変異を生成するため、又は遺伝子に、例えばコード化領域に、例えば初期コード化領域に１つよりも多くのインデルを生成するため）；（３）ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に隣接する１つの二本鎖切断及び２つの対のニック（例えば、一片のＤＮＡを除去するための、例えば、欠失を挿入するため）；又は（４）一位置の各側に２つずつ、４つの一本鎖切断を生成する場合、それらは、同じＨＳＶ ＲＬ２標的位置又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置又はＨＳＶ ＲＳ１標的位置を標的とする。ある特定の実施態様では、複数のｇＲＮＡを使用して、１つよりも多くのＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置を標的としてもよい。

【0069】

ある特定の実施態様では、第１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメイン及び第２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的核酸分子の逆鎖に相補的である。ある特定の実施態様では、上記ｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側に向くように構成されている。

【0070】

ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的ドメインの、反復エレメント、例えばＡｌｕリピートを含むがそれらに限定されない、望ましくない標的染色体エレメントを回避するように構成されている。ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載のような第１、第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子であってもよい。

【0071】

ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、事前に選択されたヌクレオチド、例えばコード化領域のヌクレオチドが変更されないように、そのヌクレオチドから十分に遠くに切断事象を配置するように構成されている。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、エクソン配列の変更又は望ましくないスプライシング事象を回避するために、イントロン／エクソン境界又は天然スプライスシグナルから十分に遠くに、イントロン切断事象を配置するように構成されている。ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載のような第１、第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子であってもよい。

【0072】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ１ ＲＳ１標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号２０８－２５０９及び２５１０－７０７３から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0073】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ２ ＲＳ１標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号７０９８－９２９２及び９２９３－１３６１４から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0074】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ１ ＲＬ２標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号２１３２４－２２７４４及び２２７４５－２６６０１から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0075】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ２ ＲＬ２標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号２６６１３－２８０３７及び２８０３８－３１７２０から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0076】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ１ ＬＡＴ標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号３１７３０－３２７４６及び３２７４７－３５６００から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0077】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ２ ＬＡＴ標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号３５６１７－３６９２６及び３６９２７－４０８７１から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0078】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ１ ＲＳ１標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号１３６３７－１４７９４及び１４７９５－１７７４１から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0079】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ２ ＲＳ１標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号１７７５３－１８７８４及び１８７８５－２１３１１から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0080】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ１ ＲＬ２標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号４０８８６－４２０７８及び４２０７９－４５３１５から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0081】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ２ ＲＬ２標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号４９４９８－５０６５２及び５０６５３－５３８２４から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0082】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ１ ＬＡＴ標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号４５３４０－４６４７９及び４６４８０－４９４７９から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0083】

ある特定の実施態様では、ＨＳＶ２ ＬＡＴ標的ノックアウト位置を標的とするｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号５３８５８－５５０５６及び５５０５７－５８７３１から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか又は１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、若しくは５つ以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。

【0084】

ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子は、単分子の又はキメラのｇＲＮＡ分子である。

【0085】

ある特定の実施態様では、本開示のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のヌクレオチドである。

【0086】

ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’に向かって、標的指向性ドメイン（「コアドメイン」及び任意選択的に「二次的ドメイン」を含む）、第１の相補性ドメイン、連結ドメイン、第２の相補性ドメイン、及び近位ドメインを含む。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子は、尾部ドメインをさらに含む。ある特定の実施態様では、近位ドメイン及び尾部ドメインは、単一ドメインとして一緒になっている。

【0087】

ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子は、長さが２５個ヌクレオチド以下の連結ドメイン；長さが合計で少なくとも２０、３０、３５、又は４０個のヌクレオチドである近位及び尾部ドメイン；及び長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個ヌクレオチドと等しいか又はそれよりも大きな標的指向性ドメインを含む。

【0088】

切断事象、例えば二本鎖又は一本鎖切断は、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質により生成することができる。Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質は、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子、例えば、標的核酸に二本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子であってもよく、又は標的核酸に一本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子（例えば、ニッカーゼ分子）であってもよい。ある特定の実施態様では、ｅａＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９変異体であってもよい。例えば、限定ではないが、Ｃａｓ９変異体は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよく、又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよい。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＶＲＥＲ変異体である。Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９融合－タンパク質に加えて、本明細書で開示されている他のヌクレアーゼを使用して、切断事象を生成してもよい。

【0089】

ある特定の実施態様では、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９－融合タンパク質は、二本鎖切断を触媒する。

【0090】

ある特定の実施態様では、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９－融合タンパク質は、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含むが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していないか又は顕著なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない。この場合、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９－融合タンパク質は、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼであり、例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９－融合タンパク質は、Ｄ１０に突然変異、例えばＤ１０Ａを含む。ある特定の実施態様では、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９－融合タンパク質は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含むが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有しないか又は顕著なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない。ある特定の実施態様では、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９－融合タンパク質は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼであり、例えば、ｅａＣａｓ９分子は、Ｈ８４０に突然変異、例えばＨ８４０Ａを含む。ある特定の実施態様では、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９－融合タンパク質は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼであり、例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９－融合タンパク質は、Ｎ８６３に突然変異、例えばＮ８６３Ａを含む。

【0091】

ある特定の実施態様では、一本鎖切断は、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインが相補的である標的核酸の鎖に形成される。ある特定の実施態様では、一本鎖切断は、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインが相補的である鎖以外の標的核酸の鎖に形成される。

【0092】

さらに、本開示の主題は、（ａ）本開示のｇＲＮＡ分子、例えば、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸組成物、例えば、単離された又は非天然の核酸組成物、例えばＤＮＡを提供する。

【0093】

ある特定の実施態様では、核酸組成物は、（ｂ）本明細書に記載のようなＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、ｅｉＣａｓ９分子である。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、ｅａＣａｓ９分子である。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子、例えばｅｉＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９変異体、例えば、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよい。

【0094】

Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質は、ニッカーゼ分子、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子、或いはｅａＣａｓ９－融合タンパク質、例えば、標的核酸に二本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子若しくはｅａＣａｓ９－融合タンパク質、及び／又は標的核酸に一本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子若しくはｅａＣａｓ９－融合タンパク質であってもよい。ある特定の実施態様では、一本鎖切断は、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインが相補的である標的核酸の鎖に形成される。ある特定の実施態様では、一本鎖切断は、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインが相補的である鎖以外の標的核酸の鎖に形成される。

【0095】

ある特定の実施態様では、核酸組成物は、（ｃ）（ｉ）ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子の第２の標的配列に相補的な標的指向性ドメインを有する、本明細書に記載の第２のｇＲＮＡ分子をコードする第３のヌクレオチド配列、及び任意選択的に（ｃ）（ｉｉ）ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子の第３の標的配列に相補的な標的指向性ドメインを有する、本明細書に記載の第３のｇＲＮＡ分子をコードする配列、及び任意選択的に（ｃ）（ｉｉｉ）ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子の第４の標的配列に相補的な標的指向性ドメインを有する、本明細書に記載の第４のｇＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む。

【0096】

ある特定の実施態様では、（ａ）及び（ｂ）は、同じ核酸分子、例えば同じベクター、例えば同じウイルスベクター、例えば同じアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルス（ＬＶ）ベクターに存在している。ある特定の実施態様では、核酸分子は、ＬＶベクターである。ある特定の実施態様では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。記載されている組成物及び方法のいずれかに使用することができる例示的なＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ２ベクター、修飾ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、修飾ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ６ベクター、修飾ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ８ベクター、及びＡＡＶ９ベクターが挙げられる。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、ｅｉＣａｓ９分子である。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、ｅａＣａｓ９分子である。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子、例えば、ｅｉＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９変異体、例えば、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよい。

【0097】

ある特定の実施態様では、（ａ）は、第１の核酸分子、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクター又は第１のＬＶベクターに存在し、（ｂ）は、第２の核酸分子、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクター又は第２のＬＶベクターに存在する。第１及び第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。ある特定の実施態様では、第１及び第２の核酸分子は、ＬＶベクターであってもよい。

【0098】

ある特定の実施態様では、（ａ）及び（ｃ）（ｉ）は、１つの核酸分子、例えば１つのベクター、例えば１つのウイルスベクター、例えば１つのＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在する。ある特定の実施態様では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。ある特定の実施態様では、核酸分子は、ＬＶベクターである。ある特定の実施態様では、（ａ）及び（ｃ）（ｉ）は、異なるベクターに存在する。ある特定の実施態様では、（ａ）は、第１の核酸分子、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在し、（ｃ）（ｉ）は、第２の核酸分子、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクター又は第２のＬＶベクターに存在する。ある特定の実施態様では、第１及び第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターである。ある特定の実施態様では、第１及び第２の核酸分子は、ＬＶベクターである。

【0099】

ある特定の実施態様では、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）（ｉ）の各々は、１つの核酸分子、例えば１つのベクター、例えば１つのウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在する。ある特定の実施態様では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。ある特定の実施態様では、核酸分子は、ＬＶベクターである。ある特定の実施態様では、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）（ｉ）の１つは、第１の核酸分子、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクター又はＬＶベクターにコードされており、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）（ｉ）の第２及び第３は、第２の核酸分子、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクター又はＬＶベクターにコードされている。第１及び第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよく、又はＬＶベクターであってもよい。

【0100】

ある特定の実施態様では、（ａ）は、第１の核酸分子、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、第１のＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在し、（ｂ）及び（ｃ）（ｉ）は、第２の核酸分子、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在する。第１及び第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよく、又はＬＶベクターであってもよい。

【0101】

ある特定の実施態様では、（ｂ）は、第１の核酸分子、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在し、（ａ）及び（ｃ）（ｉ）は、第２の核酸分子、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在する。第１及び第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよく、又はＬＶベクターであってもよい。

【0102】

ある特定の実施態様では、（ｃ）（ｉ）は、第１の核酸分子、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在し、（ｂ）及び（ａ）は、第２の核酸分子、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在する。第１及び第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。ある特定の実施態様では、第１及び第２の核酸分子は、ＬＶベクターであってもよい。

【0103】

ある特定の実施態様では、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）（ｉ）の各々は、異なる核酸分子、例えば異なるベクター、例えば異なるウイルスベクター、例えば異なるＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在する。例えば、（ａ）は、第１の核酸分子にあってもよく、（ｂ）は、第２の核酸分子にあってもよく、（ｃ）（ｉ）は、第３の核酸分子にあってもよい。第１、第２、及び第３の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。ある特定の実施態様では、第１、第２、及び第３の核酸分子は、ＬＶベクターであってもよい。

【0104】

ある特定の実施態様では、第３及び／又は第４のｇＲＮＡ分子が存在する場合、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、及び（ｃ）（ｉｉｉ）の各々は、１つの核酸分子、例えば１つのベクター、例えば１つのウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在してもよい。ある特定の実施態様では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。ある特定の実施態様では、核酸分子は、ＬＶベクターである。ある特定の実施態様では、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、及び（ｃ）（ｉｉｉ）の各々は、異なる核酸分子、例えば異なるベクター、例えば異なるウイルスベクター、例えば異なるＡＡＶベクター又は異なるＬＶベクターに存在していてもよい。さらなる実施態様では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、及び（ｃ）（ｉｉｉ）の各々は、１つよりも多くの核酸分子に存在していてもよいが、５つ未満の核酸分子、例えばＡＡＶベクター又はＬＶベクターに存在していてもよい。

【0105】

ある特定の実施態様では、第２のｇＲＮＡ分子は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の十分に近くに、切断事象、例えば二本鎖切断又は一本鎖切断をもたらして、単独で又は第１のｇＲＮＡ分子により配置された切断との組合せのいずれかで、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更、例えば、ＮＨＥＪに関連する変更を可能にするように構成されている。

【0106】

ある特定の実施態様では、第３のｇＲＮＡ分子は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の十分に近くに、切断事象、例えば二本鎖切断又は一本鎖切断をもたらして、単独で又は第１の及び／若しくは第２のｇＲＮＡ分子により配置された切断との組合せのいずれかで、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更、例えば、ＮＨＥＪに関連する変更を可能にするように構成されている。

【0107】

ある特定の実施態様では、第４のｇＲＮＡ分子は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の十分に近くに、切断事象、例えば二本鎖切断又は一本鎖切断をもたらして、単独で又は第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、及び／若しくは第３のｇＲＮＡ分子により配置された切断との組合せのいずれかで、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更、例えば、ＮＨＥＪに関連する変更を可能にするように構成されている。

【0108】

ある特定の実施態様では、第２のｇＲＮＡは、第１のｇＲＮＡ分子と同じＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置を標的とするように選択される。ある特定の実施態様では、第３のｇＲＮＡ及び第４のｇＲＮＡは、第１及び第２のｇＲＮＡ分子と同じＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置を標的とするように選択される。

【0109】

第２、第３、及び第４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、配列番号２０８－５８７４９に示されているヌクレオチド配列から独立して選択することができる。第２、第３、又は第４のｇＲＮＡ分子は、モジュール型ｇＲＮＡ分子であってもよく、又はキメラｇＲＮＡ分子であってもよい。

【0110】

本明細書に記載の核酸組成物内に存在する一又は複数の核酸及び／又は核酸組成物は、（ａ）のｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター、例えば本明細書に記載のプロモーターを含んでいてもよい。核酸及び／又は核酸組成物は、（ｃ）の第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のプロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターをさらに含んでいてもよい。上記プロモーター及び第２のプロモーターは、互いに異なる。ある特定の実施態様では、上記プロモーター及び第２のプロモーターは同じである。

【0111】

本明細書に記載の核酸組成物は、（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターをさらに含んでいてもよい。

【0112】

本開示の主題は、（ａ）本開示のｇＲＮＡ分子、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子を含む組成物をさらに提供する。ある特定の実施態様では、組成物は、本明細書に記載のような（ｂ）Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）又はＣａｓ９－融合タンパク質をさらに含む。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子、例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９は、Ｃａｓ９変異体であってもよい。例えば、限定ではないが、Ｃａｓ９変異体は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよく、又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよい。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＶＲＥＲ変異体である。ある特定の実施態様では、組成物は、（ｃ）第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載のような第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子をさらに含む。ある特定の実施態様では、組成物は、医薬組成物である。本明細書に記載の組成物、例えば本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、対象のＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症を治療、予防、及び／又は低減するために使用することができる。

【0113】

本開示の主題は、細胞内のＲＳ１遺伝子、ＲＬ２遺伝子、及びＬＡＴ遺伝子からなる群から選択されるＨＳＶウイルス遺伝子を変更するための方法であって、細胞に、
（ｉ）ＨＳＶウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子、及び少なくともＣａｓ９分子を含むゲノム編集系、
（ｉｉ）ＨＳＶウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド、及びＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、又は
（ｉｉｉ）ＨＳＶウイルス遺伝子の標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子、及び少なくともＣａｓ９分子を含む組成物
のうち１つを投与することを含む方法をさらに提供する。

【0114】

別の態様では、本明細書には、細胞のＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子を変更するための、例えば、細胞の標的核酸の構造を変更するための、例えば、細胞の標的核酸の配列を変更するための方法であって、細胞を、（ａ）本開示のｇＲＮＡ分子；及び（ｂ）Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）又はＣａｓ９－融合タンパク質、例えば本明細書に記載のようなＣａｓ９分子；及び（ｃ）任意選択的に、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子を標的とする第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載のような第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子と接触させることを含む方法が開示されている。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９変異体であってもよい。

【0115】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２を罹患しているか又は発症する可能性の高い対象に由来する細胞と接触させることを含む。細胞は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に突然変異を有することから利益を得ると考えられる対象に由来していてもよい。

【0116】

ある特定の実施態様では、接触ステップは、インビボで実施してもよい。

【0117】

ある特定の実施態様では、本明細書に記載されているような細胞を変更するための方法は、接触ステップの前に、細胞のＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の配列に関する情報を獲得することを含む。細胞のＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の配列に関する情報の獲得は、ＲＳ１、ＲＬ２、若しくはＬＡＴ遺伝子の一又は複数、又はＲＳ１、ＲＬ２、若しくはＬＡＴ遺伝子の部分を配列決定することによるものであってもよい。

【0118】

ある特定の実施態様では、本方法の接触ステップは、細胞を、（ａ）（ｂ）、及び（ｃ）のうちの少なくとも１つを発現する核酸組成物、例えばベクター、例えばＡＡＶベクター又はＬＶベクターと接触させることを含む。ある特定の実施態様では、本方法の接触ステップは、細胞を、（ａ）（ｂ）、及び（ｃ）の各々を発現する核酸組成物、例えばベクター、例えばＡＡＶベクター又はＬＶベクターと接触させることを含む。ある特定の実施態様では、本方法の接触ステップは、細胞に、（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質と、（ａ）のｇＲＮＡ分子、並びに任意選択的に第２のｇＲＮＡ分子（ｃ）（ｉ）、並びにさらに任意選択的に第３のｇＲＮＡ分子（ｃ）（ｉｉ）及び／又は第４のｇＲＮＡ分子（ｃ）（ｉｉｉ）をコードする核酸組成物とを送達することを含む。

【0119】

ある特定の実施態様では、接触ステップは、細胞を、（ａ）（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）のうちの少なくとも１つを発現する核酸組成物、例えばベクター、例えばＡＡＶベクター又はＬＶベクターと接触させることを含む。ある特定の実施態様では、本方法の接触ステップは、細胞を、（ａ）（ｂ）、及び（ｃ）の各々を発現する核酸組成物、例えばベクター、例えばＡＡＶベクターと接触させることを含む。ある特定の実施態様では、本方法の接触ステップは、細胞に、（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質、（ａ）のｇＲＮＡ分子をコードする核酸組成物及び（ｄ）の鋳型核酸、並びに任意選択的に第２のｇＲＮＡ分子（ｃ）（ｉ）、並びにさらに任意選択的に第３のｇＲＮＡ分子（ｃ）（ｉv）及び／又は第４のｇＲＮＡ分子（ｃ）（ｉｉｉ）を送達することを含む。

【0120】

ある特定の実施態様では、接触ステップは、細胞を、本明細書に記載のような、核酸組成物、例えばベクター、例えばＡＡＶベクター、例えばＡＡＶ２ベクター、修飾ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、修飾ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ６ベクター、修飾ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ８ベクター、又はＡＡＶ９ベクターと接触させることを含む。ある特定の実施態様では、ベクターは、ＬＶベクターである。

【0121】

ある特定の実施態様では、接触させることは、細胞に、タンパク質又はｍＲＮＡとしての（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質、並びに（ａ）のｇＲＮＡ分子及び任意選択的に（ｃ）の第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子をコードする核酸組成物を送達することを含む。

【0122】

ある特定の実施態様では、接触ステップは、細胞に、タンパク質又はｍＲＮＡとしての（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質、ＲＮＡとしての（ａ）のｇＲＮＡ分子、並びに任意選択的にＲＮＡとしての（ｃ）の第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子を送達することを含む。

【0123】

ある特定の実施態様では、接触させることは、細胞に、ＲＮＡとしての（ａ）のｇＲＮＡ分子、任意選択的にＲＮＡとしての（ｃ）の第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子、並びに（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質をコードする核酸組成物を送達することを含む。

【0124】

本開示の主題は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２を罹患しているか又は発症する可能性が高い対象を、対象の標的核酸の構造、例えば配列を変更することにより、治療、予防、及び／又は低減するための方法であって、対象（又は対象に由来する細胞）を、
（ａ）本開示のｇＲＮＡ分子、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ分子；
（ｂ）Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）又はＣａｓ９－融合タンパク質、例えば、本明細書で開示されているＣａｓ９分子；並びに
任意選択的に（ｃ）（ｉ）ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子を標的とする第２のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で開示されている第２のｇＲＮＡ分子、及び
さらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉ）第３のｇＲＮＡ分子、及びまたさらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉｉ）ＲＬ２又はＬＡＴ又はＲＳ１遺伝子を標的とする第４のｇＲＮＡ、例えば、本明細書で開示されている第３及び第４のｇＲＮＡ分子
と接触させることを含む方法をさらに提供する。

【0125】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に、例えばＮＨＥＪにより、突然変異を導入することを含む。

【0126】

ある特定の実施態様では、対象の細胞を、インビボで（例えば、静脈内送達により）、（ａ）、（ｂ）、並びに任意選択的に（ｃ）（ｉ）、さらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉ）、及びまたさらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉｉ）と接触させる。

【0127】

ある特定の実施態様では、接触ステップは、対象を、本明細書に記載の核酸組成物、例えばベクター、例えばＡＡＶベクター又はＬＶベクター、例えば、（ａ）、（ｂ）、並びに任意選択的に（ｃ）（ｉ）、さらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉ）、及びまたさらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つをコードする核酸組成物と接触させることを含む。

【0128】

ある特定の実施態様では、接触ステップは、対象に、タンパク質又はｍＲＮＡとしての（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質と、（ａ）、並びに任意選択的に（ｃ）（ｉ）、さらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉ）、及びまたさらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉｉ）をコードする核酸組成物とを送達することを含む。

【0129】

ある特定の実施態様では、接触ステップは、対象に、タンパク質又はｍＲＮＡとしての（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質、ＲＮＡとしての（ａ）のｇＲＮＡ分子、並びに任意選択的にＲＮＡとしての（ｃ）（ｉ）の第２のｇＲＮＡ、さらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉ）、及びまたさらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉｉ）を送達することを含む。

【0130】

ある特定の実施態様では、接触ステップは、対象に、ＲＮＡとしての（ａ）のｇＲＮＡ分子、任意選択的にＲＮＡとしての（ｃ）（ｉ）の第２のｇＲＮＡ、さらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉ）、及びまたさらに任意選択的に（ｃ）（ｉｉｉ）、（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質をコードする核酸組成物を送達することを含む。

【0131】

本方法が、（１）ＮＨＥＪにより、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、若しくはＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に突然変異を導入すること、又は（２）ＲＳ１、ＲＬ２、及び／若しくはＬＡＴ遺伝子の一又は複数の発現を、例えばプロモーター領域を標的とすることによりノックダウンすることを含む場合、（ｂ）のＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質、及び少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、例えば、（ａ）のｇＲＮＡ分子が、接触ステップに含まれる。

【0132】

本開示の主題は、本明細書に記載のｇＲＮＡ分子、核酸組成物、又は組成物、並びに細胞、例えば、ＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２を有するか若しくは発症する可能性の高い対象、又はＨＳＶ ＲＬ２標的位置若しくはＨＳＶ ＬＡＴ標的位置若しくはＨＳＶ ＲＳ１標的位置での突然変異から利益を得ると考えられる対象に由来する細胞を含む反応混合物を提供する。

【0133】

本開示の主題は、（ａ）本明細書に記載のｇＲＮＡ分子又はｇＲＮＡ分子をコードする核酸組成物、及び以下の一又は複数を含むキットを提供する：
（ｂ）Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）又はＣａｓ９－融合タンパク質、例えば、本明細書に記載のＣａｓ９分子、又はＣａｓ９をコードする核酸若しくはｍＲＮＡ；
（ｃ）（ｉ）第２のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載の第２のｇＲＮＡ分子、又は（ｃ）（ｉ）をコードする核酸；
（ｃ）（ｉｉ）第３のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載の第３のｇＲＮＡ分子、又は（ｃ）（ｉｉ）をコードする核酸；又は
（ｃ）（ｉｉｉ）第４のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載の第４のｇＲＮＡ分子、又は（ｃ）（ｉｉｉ）をコードする核酸。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９変異体であってもよい。例えば、限定ではないが、Ｃａｓ９変異体は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよく、又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよい。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＶＲＥＲ変異体である。

【0134】

ある特定の実施態様では、キットは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、及び（ｃ）（ｉｉｉ）の一又は複数をコードする核酸、例えばＡＡＶベクター又はＬＶベクターを含む。

【0135】

本開示の主題は、例えば、本明細書に記載されているような、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症の発病又は進行を治療、予防、低減、又は遅延するための方法に従って、対象のＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症の発病又は進行を治療、予防、低減、又は遅延するために使用するためのｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載のｇＲＮＡ分子を提供する。

【0136】

ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）又はＣａｓ９－融合タンパク質、例えば、本明細書に記載のＣａｓ９分子と組み合わせて使用される。例えば、限定ではないが、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質は、Ｃａｓ９変異体である。例えば、限定ではないが、Ｃａｓ９変異体は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよく、又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよい。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＶＲＥＲ変異体である。それに加えて又はその代わりに、ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子は、第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載の第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子と組み合わせて使用される。

【0137】

本開示の主題は、例えば、本明細書に記載されているような、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症の発病又は進行を治療、予防、低減、又は遅延するための方法に従って、対象のＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２の発病又は進行を治療又は遅延するための医薬の製造における、ｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載のｇＲＮＡ分子の使用を提供する。

【0138】

ある特定の実施態様では、医薬は、Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）又はＣａｓ９－融合タンパク質、例えば、本明細書に記載のＣａｓ９分子を含む。それに加えて又はその代わりに、ある特定の実施態様では、医薬は、第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載の第２、第３、及び／又は第４のｇＲＮＡ分子を含む。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９変異体であってもよい。例えば、限定ではないが、Ｃａｓ９変異体は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよく、又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよい。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＶＲＥＲ変異体である。

【0139】

また、本明細書で開示されているような、ｇＲＮＡ分子、ゲノム編集系、方法、組成物、反応混合物、及びキットは、抑制性ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で開示されている抑制性ｇＲＮＡ分子を含んでいてもよい。

【0140】

別様に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似した又は等価な方法及び物質を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び物質は、下記に記載されている。本明細書で言及されている刊行物、特許出願、特許、及び他の文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、物質、方法、及び例は、説明のためのものに過ぎず、限定は意図されていない。

【0141】

数値及びアルファベットの見出し及び副見出しを含む見出しは、構成及び表示のためのものであり、限定は意図されていない。

【0142】

本発明の他の特徴及び利点は、発明を実施するための形態、図面、及び特許請求の範囲から明白であろう。

【図面の簡単な説明】

【0143】

【図1A】例示的なｇＲＮＡを示す図である。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））に部分的に由来する（又は部分的に配列がモデル化されている）、二重鎖構造としてのモジュール型ｇＲＮＡ分子（出現順にそれぞれ配列番号３９及び４０）を示す。

【図1B】例示的なｇＲＮＡを示す図である。二重鎖構造としての、化膿レンサ球菌に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子（配列番号４１）を示す。

【図1C】例示的なｇＲＮＡを示す図である。二重鎖構造としての、化膿レンサ球菌に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子（配列番号４２）を示す。

【図1D】例示的なｇＲＮＡを示す図である。二重鎖構造としての、化膿レンサ球菌に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子（配列番号４３）を示す。

【図1E】例示的なｇＲＮＡを示す図である。二重鎖構造としての、化膿レンサ球菌に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子（配列番号４４）を示す。

【図1F】例示的なｇＲＮＡを示す図である。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に部分的に由来する、二重鎖構造としてのモジュール型ｇＲＮＡ分子（出現順にそれぞれ配列番号４５及び４６）を示す。

【図1G】例示的なｇＲＮＡを示す図である。化膿レンサ球菌及びＳ．サーモフィルスのモジュール型ｇＲＮＡ分子（出現順にそれぞれ配列番号３９、４５、４７、及び４６）のアラインメントを示す。

【図1H】例示的なｇＲＮＡを示す図である。単分子ｇＲＮＡ分子の追加の例示的構造を示す。二重鎖構造としての、化膿レンサ球菌に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子（配列番号４２）の例示的な構造を示す。

【図1I】例示的なｇＲＮＡを示す図である。単分子ｇＲＮＡ分子の追加の例示的構造を示す。二重鎖構造としての、黄色ブドウ球菌に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子（配列番号３８）の例示的な構造を示す。

【図2A】Ｃａｓ９配列のアラインメントを描写する図である（Chylinski 2013）。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは囲まれており、「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；及びＬｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列をベースとしたコンセンサス配列である。全ての４つの配列で保存された残基は、１文字のアミノ酸略語で示され、「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見出される任意のアミノ酸を示し、「－」は、非存在を示す。

【図2B】Ｃａｓ９配列のアラインメントを描写する図である（Chylinski 2013）。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは囲まれており、「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；及びＬｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列をベースとしたコンセンサス配列である。全ての４つの配列で保存された残基は、１文字のアミノ酸略語で示され、「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見出される任意のアミノ酸を示し、「－」は、非存在を示す。

【図2C】Ｃａｓ９配列のアラインメントを描写する図である（Chylinski 2013）。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは囲まれており、「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；及びＬｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列をベースとしたコンセンサス配列である。全ての４つの配列で保存された残基は、１文字のアミノ酸略語で示され、「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見出される任意のアミノ酸を示し、「－」は、非存在を示す。

【図2D】Ｃａｓ９配列のアラインメントを描写する図である（Chylinski 2013）。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは囲まれており、「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；及びＬｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列をベースとしたコンセンサス配列である。全ての４つの配列で保存された残基は、１文字のアミノ酸略語で示され、「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見出される任意のアミノ酸を示し、「－」は、非存在を示す。

【図2E】Ｃａｓ９配列のアラインメントを描写する図である（Chylinski 2013）。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは囲まれており、「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；及びＬｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列をベースとしたコンセンサス配列である。全ての４つの配列で保存された残基は、１文字のアミノ酸略語で示され、「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見出される任意のアミノ酸を示し、「－」は、非存在を示す。

【図2F】Ｃａｓ９配列のアラインメントを描写する図である（Chylinski 2013）。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは囲まれており、「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；及びＬｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列をベースとしたコンセンサス配列である。全ての４つの配列で保存された残基は、１文字のアミノ酸略語で示され、「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見出される任意のアミノ酸を示し、「－」は、非存在を示す。

【図2G】Ｃａｓ９配列のアラインメントを描写する図である（Chylinski 2013）。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは囲まれており、「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは囲まれており、「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；及びＬｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列をベースとしたコンセンサス配列である。全ての４つの配列で保存された残基は、１文字のアミノ酸略語で示され、「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見出される任意のアミノ酸を示し、「－」は、非存在を示す。

【図3A】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に開示されたＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアラインメントを示す図である（配列番号５２－９５、１２０－１２３）。

【図3B】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に開示されたＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアラインメントを示す図である（配列番号５２－９５、１２０－１２３）。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を同定する。

【図4A】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に開示されたＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列の外れ値を除外したアラインメントを示す図である（配列番号５２－１２３）。

【図4B】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に開示されたＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列の外れ値を除外したアラインメントを示す図である（配列番号５２－１２３）。図４Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を同定する。

【図5A】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に開示されたＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアラインメントを示す図である（配列番号１２４－１９８）。

【図5B】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に開示されたＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアラインメントを示す図である（配列番号１２４－１９８）。

【図5C】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に開示されたＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアラインメントを示す図である（配列番号１２４－１９８）。図５Ｃの最後の行は、保存された残基を同定する。

【図6A】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に開示されたＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインの配列の外れ値を除外したアラインメントを示す図である（配列番号１２４－１４１、１４８、１４９、１５１－１５３、１６２、１６３、１６６－１７４、１７７－１８７、１９４－１９８）。

【図6B】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に開示されたＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインの配列の外れ値を除外したアラインメントを示す図である（配列番号１２４－１４１、１４８、１４９、１５１－１５３、１６２、１６３、１６６－１７４、１７７－１８７、１９４－１９８）。図６Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を同定する。

【図7】例示的なｇＲＮＡ配列（配列番号４２）を使用した、ｇＲＮＡドメイン用語体系を説明する図である。

【図8A】Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９のドメイン構成の概略図を提供する図である。図８Ａは、Ｃａｓ９の２つのローブ（認識（ＲＥＣ）及びヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ）に関連するアミノ酸位置を含むＣａｓ９ドメインの構成を示す。

【図8B】Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９のドメイン構成の概略図を提供する図である。図８Ｂは、８３種のＣａｓ９オーソログにわたる各ドメインのパーセント相同性を示す。

【図9】ｐＡＦ０２５プラスミドマップの概略図である。

【図10A】プラスミドｐＡＦ０２５中のＨＳＶ－１標的配列のＣａｓ９が媒介する切断を示す図である。（Ａ）は、表１８に列挙したｇＲＮＡによるＲＬ２／ＬＡＴのＨＳＶ１標的ノックダウンを示す（実施例３を参照）。

【図10B】プラスミドｐＡＦ０２５中のＨＳＶ－１標的配列のＣａｓ９が媒介する切断を示す図である。（Ｂ）は、表１９に列挙したＲＳ１のＨＳＶ１標的ノックダウンを示す（実施例３を参照）。

【発明を実施するための形態】

【0144】

開示を明瞭にするために、限定のためではないが、発明を実施するための形態を、以下のサブセクションに分割する：
１．定義
２．単純ヘルペスウイルス
３．ＨＳＶ関連眼感染症を治療、予防、及び／又は低減するための方法
４．ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子を変更するための方法
５．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
６．ｇＲＮＡを設計するための方法
７．Ｃａｓ９分子
８．候補分子の機能的な分析
９．ゲノム編集手法
１０．標的細胞
１１．送達、製剤化及び投与経路
１２．修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチド、及び核酸

【0145】

１．定義
本明細書で使用される場合、用語「約」又は「およそ」は、当業者により決定される、特定の値の許容される誤差範囲内であることを意味し、その値がどのように測定又は決定されたかに、つまり測定システムの限界に部分的に依存する場合がある。例えば、「約」は、当技術分野での１実施当たり、３標準偏差以内であることを意味してもよく、又は３標準偏差を超えていることを意味してもよい。或いは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、及びさらにより好ましくは最大１％の範囲を意味してもよい。或いは、特に生物学的な系又はプロセスの場合、この用語は、値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、及びより好ましくは２倍以内を意味する場合がある。

【0146】

本明細書で使用される場合、「ゲノム編集系」は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ編集活性を有する任意の系を指す。本開示のゲノム編集系は、天然ＣＲＩＳＰＲ系：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼから構成される少なくとも２つの成分を含む。これら２つの成分は、細胞内の特定の核酸配列と結合し、例えば、一本鎖切断（ＳＳＢ又はニック）、二本鎖切断（ＤＳＢ）、及び／又は点突然変異の一又は複数を製作することにより、その核酸配列の又はその核酸配列周辺のＤＮＡを編集することが可能な複合体を形成する。

【0147】

ゲノム編集系は、種々の実施態様では、（ａ）一又は複数のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体、及び（ｂ）細胞内で結合して、一又は複数のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成することが可能である、別々のＣａｓ９分子及びｇＲＮＡを含んでいてもよい。本開示によるゲノム編集系は、結合してＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成することができるＣａｓ９及び／又はｇＲＮＡのコード配列を含む一又は複数のヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）によりコードされていてもよく、遺伝子編集系をコードする一又は複数のヌクレオチドは、本明細書に記載のようなベクターにより運搬されてもよい。

【0148】

ある特定の実施態様では、ゲノム編集系は、ＲＳ１遺伝子、ＲＬ２遺伝子、及びＬＡＴ遺伝子からなる群から選択されるＨＳＶウイルス遺伝子を標的とする。本開示のゲノム編集系は、一又は複数のＨＳＶウイルス遺伝子、例えば、ＲＳ１遺伝子、ＲＬ２遺伝子、及び／又はＬＡＴ遺伝子を変更（ノックアウト又はノックダウン）するために使用することができる。

【0149】

ある特定の実施態様では、ゲノム編集系は、ＲＳ１遺伝子を標的とする。ある特定の実施態様では、ＲＳ１遺伝子は、ヒトＲＳ１遺伝子である。ある特定の実施態様では、ゲノム編集系は、ＲＬ２遺伝子を標的とする。ある特定の実施態様では、ＲＬ２遺伝子は、ヒトＲＬ２遺伝子である。ある特定の実施態様では、ゲノム編集系は、ＬＡＴ遺伝子を標的とする。ある特定の実施態様では、ＬＡＴ遺伝子は、ヒトＬＡＴ遺伝子である。ある特定の実施態様では、ゲノム編集系は、ＲＳ１、ＲＬ２、及びＬＡＴ遺伝子の２つ又は３つを標的とする。

【0150】

ある特定の実施態様では、ＲＳ１遺伝子を標的とするゲノム編集系は、ＲＳ１遺伝子の標的ドメイン（「標的配列」とも呼ばれる）に相補的な標的指向性ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子又はそれをコードするポリヌクレオチド、及び少なくとも１つのＣａｓ９分子又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様では、ＲＳ１遺伝子を標的とするゲノム編集系は、ＲＳ１遺伝子の第２の標的ドメインに相補的な標的指向性ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子、又はそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ＲＳ１遺伝子を標的とするゲノム編集系は、ＲＳ１遺伝子を標的とする第３及び第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでいてもよい。

【0151】

ある特定の実施態様では、ＲＬ２遺伝子を標的とするゲノム編集系は、ＲＬ２遺伝子の標的ドメインに相補的な標的指向性ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子又はそれをコードするポリヌクレオチド、及び少なくとも１つのＣａｓ９分子又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様では、ＲＬ２遺伝子を標的とするゲノム編集系は、ＲＬ２遺伝子の第２の標的ドメインに相補的な標的指向性ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子、又はそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ＲＬ２遺伝子を標的とするゲノム編集系は、ＲＬ２遺伝子を標的とする第３及び第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでいてもよい。

【0152】

ある特定の実施態様では、ＬＡＴ遺伝子を標的とするゲノム編集系は、ＬＡＴ遺伝子の標的ドメインに相補的な標的指向性ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子又はそれをコードするポリヌクレオチド、及び少なくとも１つのＣａｓ９分子又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様では、ＬＡＴ遺伝子を標的とするゲノム編集系は、ＬＡＴ遺伝子の第２の標的ドメインに相補的な標的指向性ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子、又はそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ＬＡＴ遺伝子を標的とするゲノム編集系は、ＬＡＴ遺伝子を標的とする第３及び第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでいてもよい。

【0153】

ある特定の実施態様では、ゲノム編集系は、細胞内で、又はインビトロ若しくはインビボ接触で実施される。ある特定の実施態様では、ゲノム編集系は、医薬、例えば一又は複数の標的遺伝子（例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子）を修飾するための医薬、又はＨＳＶ感染（ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染）を治療、予防、及び／又は低減するための医薬に使用される。ある特定の実施態様では、ゲノム編集系は、療法剤に使用される。

【0154】

「標的遺伝子」は、本明細書中に使用される場合、既知又は推定上の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施態様では、標的遺伝子は、ＨＳＶウイルス遺伝子である。本明細書で使用される場合、「ＨＳＶウイルス遺伝子」は、（ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２）ＲＳ１遺伝子、（ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２）ＲＬ２遺伝子、又は（ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２）ＬＡＴ遺伝子を指す。

【0155】

「ＨＳＶ１ ＲＳ１標的ノックアウト位置」は、本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ媒介性変更により変更すると、機能性ＲＳ１遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ１のＲＳ１遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＳ１遺伝子のコード化領域（例えば、初期コード化領域）にある。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＳ１遺伝子の非コード化領域にある。

【0156】

「ＨＳＶ２ ＲＳ１標的ノックアウト位置」は、本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ媒介性変更により変更すると、機能性ＲＳ１遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ２のＲＳ１遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＳ１遺伝子のコード化領域（例えば、初期コード化領域）にある。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＳ１遺伝子の非コード化領域にある。

【0157】

「ＨＳＶ ＲＳ１標的ノックアウト位置」は、本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ媒介性変更により変更すると、機能性ＲＳ１遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ（例えばＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２）のＲＳ１遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＳ１遺伝子のコード化領域（例えば、初期コード化領域）にある。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＳ１遺伝子の非コード化領域にある。

【0158】

「ＨＳＶ１ ＲＳ１標的ノックダウン位置」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とすると、機能性ＲＳ１遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ１のＲＳ１遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、転写が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＳ１遺伝子のプロモーター領域にある（例えば、ＲＳ１遺伝子のプロモーター領域内の位置が、ｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とされる）。

【0159】

「ＨＳＶ２ ＲＳ１標的ノックダウン位置」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とすると、機能性ＲＳ１遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ２のＲＳ１遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、転写が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＳ１遺伝子のプロモーター領域にある（例えば、ＲＳ１遺伝子のプロモーター領域内の位置が、ｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とされる）。

【0160】

「ＨＳＶ ＲＳ１標的ノックダウン位置」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とすると、機能性ＲＳ１遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ（例えばＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２）のＲＳ１遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、転写が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＳ１遺伝子のプロモーター領域にある（例えば、ＲＳ１遺伝子のプロモーター領域内の位置が、ｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とされる）。

【0161】

「ＨＳＶ ＲＳ１標的位置」は、本明細書で使用される場合、ＨＳＶ ＲＳ１標的ノックダウン位置及び／又はＨＳＶ ＲＳ１標的ノックアウト位置を含む。

【0162】

「ＨＳＶ１ ＲＬ２標的ノックアウト位置」は、本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ媒介性変更により変更すると、機能性ＲＬ２遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ１のＲＬ２遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＬ２遺伝子のコード化領域（例えば、初期コード化領域）にある。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＬ２遺伝子の非コード化領域にある。

【0163】

「ＨＳＶ２ ＲＬ２標的ノックアウト位置」は、本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ媒介性変更により変更すると、機能性ＲＬ２遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ２のＲＬ２遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＬ２遺伝子のコード化領域（例えば、初期コード化領域）にある。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＬ２遺伝子の非コード化領域にある。

【0164】

「ＨＳＶ ＲＬ２標的ノックアウト位置」は、本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ媒介性変更により変更すると、機能性ＲＬ２遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ（例えばＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２）のＲＬ２遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＬ２遺伝子のコード化領域（例えば、初期コード化領域）にある。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＬ２遺伝子の非コード化領域にある。

【0165】

「ＨＳＶ１ ＲＬ２標的ノックダウン位置」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とすると、機能性ＲＬ２遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ１のＲＬ２遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、転写が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＬ２遺伝子のプロモーター領域にある（例えば、ＲＬ２遺伝子のプロモーター領域内の位置が、ｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とされる）。

【0166】

「ＨＳＶ２ ＲＬ２標的ノックダウン位置」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とすると、機能性ＲＬ２遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ２のＲＬ２遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、転写が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＬ２遺伝子のプロモーター領域にある（例えば、ＲＬ２遺伝子のプロモーター領域内の位置が、ｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とされる）。

【0167】

「ＨＳＶ ＲＬ２標的ノックダウン位置」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とすると、機能性ＲＬ２遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ（例えばＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２）のＲＬ２遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、転写が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＲＬ２遺伝子のプロモーター領域にある（例えば、ＲＬ２遺伝子のプロモーター領域内の位置が、ｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とされる）。

【0168】

「ＨＳＶ ＲＬ２標的位置」は、本明細書で使用される場合、ＨＳＶ ＲＬ２標的ノックアウト位置及び／又はＨＳＶ ＲＬ２標的ノックダウン位置を含む。

【0169】

「ＨＳＶ１ ＬＡＴ標的ノックアウト位置」は、本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ媒介性変更により変更すると、機能性ＬＡＴ遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ１のＬＡＴ遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＬＡＴ遺伝子のコード化領域（例えば、初期コード化領域）にある。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＬＡＴ遺伝子の非コード化領域にある。

【0170】

「ＨＳＶ２ ＬＡＴ標的ノックアウト位置」は、本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ媒介性変更により変更すると、機能性ＬＡＴ遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ２のＬＡＴ遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＬＡＴ遺伝子のコード化領域（例えば、初期コード化領域）にある。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＬＡＴ遺伝子の非コード化領域にある。

【0171】

「ＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックアウト位置」は、本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ媒介性変更により変更すると、機能性ＬＡＴ遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ（例えば、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２）のＬＡＴ遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＬＡＴ遺伝子コード化領域、例えば、初期コード化領域にある。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＬＡＴ遺伝子の非コード化領域にある。

【0172】

「ＨＳＶ１ ＬＡＴ標的ノックダウン位置」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とすると、機能性ＬＡＴ遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ１のＬＡＴ遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、転写が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＬＡＴ遺伝子のプロモーター領域にある（例えば、ＬＡＴ遺伝子のプロモーター領域内の位置が、ｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とされる）。

【0173】

「ＨＳＶ２ ＬＡＴ標的ノックダウン位置」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とすると、機能性ＬＡＴ遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ２のＬＡＴ遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、転写が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＬＡＴ遺伝子のプロモーター領域にある（例えば、ＬＡＴ遺伝子のプロモーター領域内の位置が、ｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とされる）。

【0174】

「ＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックダウン位置」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とすると、機能性ＬＡＴ遺伝子産物の発現の低減又は消失がもたらされる、ＨＳＶ（例えばＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２）のＲＬ２遺伝子内の位置を指す。ある特定の実施態様では、転写が低減又は消失される。ある特定の実施態様では、上記位置は、ＬＡＴ遺伝子のプロモーター領域にある（例えば、ＬＡＴ遺伝子のプロモーター領域内の位置が、ｅｉＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により標的とされる）。

【0175】

「ＨＳＶ ＬＡＴ標的位置」は、本明細書で使用される場合、ＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックアウト位置及び／又はＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックダウン位置を指す。

【0176】

「ドメイン」は、本明細書で使用される場合、タンパク質又は核酸のセグメントを記述するために使用される。別様の指定がない限り、ドメインは、いかなる特定の機能的特性も有する必要はない。

【0177】

２つの配列間の相同性又は配列同一性（これら用語は、本明細書では同義的に使用される）の計算は、以下のように実施される。比較を最適化するために配列をアラインする（例えば、アラインメントを最適化するために、第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又両方にギャップを導入してもよく、比較のために非相同性配列を無視してもよい）。ギャップペナルティを１２に設定し、ギャップ伸長ペナルティを４に設定し、フレームシフトギャップペナルティを５に設定し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用した場合のベストスコアとして、最適アラインメントを決定する。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められている場合、その分子は、その位置が同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一性位置の数の割合である。

【0178】

「抑制性ｇＲＮＡ分子」は、本明細書で使用される場合、細胞又は対象内に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分をコードする配列を含む核酸に、標的ドメインに相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子を指す。制御ｇＲＮＡは、内因性の細胞又は対象配列を標的としない。ある特定の実施態様では、抑制性ｇＲＮＡ分子は、（ａ）Ｃａｓ９分子をコードする核酸；（ｂ）ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子を標的とする標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ（標的遺伝子ｇＲＮＡ）をコードする核酸；又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分をコードする１つよりも多くの核酸に、例えば（ａ）及び（ｂ）の両方に、標的配列と相補的な標的指向性ドメインを含む。ある特定の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分をコードする、例えば、Ｃａｓ９分子又は標的遺伝子ｇＲＮＡをコードする核酸分子は、抑制性ｇＲＮＡ標的指向性ドメインと相補的な１つよりも多くの標的ドメインを含む。ある特定の実施態様では、抑制性ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子と複合体を形成し、例えば切断により又は核酸との結合により、標的とされた核酸のＣａｓ９媒介性不活化をもたらし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系成分の産生の停止又は低減をもたらす。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、２つの複合体を形成する。１つは、標的遺伝子ｇＲＮＡと共にＣａｓ９分子を含む複合体であり、この複合体は、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子を変更することができる。もう１つは、抑制性ｇＲＮＡ分子と共にＣａｓ９分子を含む複合体であり、この複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系成分、例えばＣａｓ９分子又は標的遺伝子ｇＲＮＡ分子のさらなる産生を防止するように作用することができる。ある特定の実施態様では、抑制性ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体は、調節領域配列、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする配列、Ｃａｓ９分子の転写領域、エクソン、又はイントロンをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターに結合するか又はその切断を促進する。ある特定の実施態様では、抑制性ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体は、調節領域配列、例えば、ｇＲＮＡ分子、又はｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターに結合するか又はその切断を促進する。ある特定の実施態様では、抑制性ｇＲＮＡ、例えばＣａｓ９標的指向性抑制性ｇＲＮＡ分子、又は標的遺伝子ｇＲＮＡ－標的指向性抑制性ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体媒介性遺伝子標的化の効果を制限する。ある特定の実施態様では、抑制性ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体の活性に対して、経時的な発現レベルの、又は他の制限をも課す。ある特定の実施態様では、抑制性ｇＲＮＡは、オフターゲット活性又は他の望ましくない活性を低減する。ある特定の実施態様では、抑制性ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９系の成分の産生を阻害し、例えば、完全に又は実質的に完全に阻害し、それによりその活性を制限又は抑制する。

【0179】

「モジュレーター」は、本明細書で使用される場合、対象分子又は遺伝子配列の活性（例えば、酵素活性、転写活性、又は翻訳活性）、量、分布、又は構造を変更することができる実体、例えば薬物を指す。ある特定の実施態様では、モジュレーションは、切断すること、例えば共有結合若しくは非共有結合を切断すること、又は共有結合若しくは非共有結合を形成すること、例えば、ある部分を対象分子に結合させること含む。ある特定の実施態様では、モジュレーターは、対象分子の三次元、二次、三次、又は四次構造を変更する。モジュレーターは、対象活性を増加、減少、開始、又は消失させることができる。

【0180】

「大型分子」は、本明細書で使用される場合、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｋＤの分子量を有する分子を指す。大型分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、生物製剤、及び炭水化物が挙げられる。

【0181】

「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、１００個未満のアミノ酸残基を有する、アミノ酸のポリマーを指す。ある特定の実施態様では、「ポリペプチド」は、５０、２０、又は１０個未満のアミノ酸残基を有する。

【0182】

「Ｃａｓ９分子」又は「Ｃａｓ９ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協同して、標的ドメイン（「標的配列」とも呼ばれる）、ある特定の実施態様ではＰＡＭ配列を含む部位に局在することができる分子又はポリペプチドをそれぞれ指す。Ｃａｓ９分子及びＣａｓ９ポリペプチドとしては、天然Ｃａｓ９分子及びＣａｓ９ポリペプチドの両方、並びに、例えば少なくとも１つのアミノ酸残基が参照配列と異なる遺伝子操作、変更、又は修飾されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチド、例えば、最も類似する天然Ｃａｓ９分子が挙げられる。

【0183】

ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、ＮＧＧ ＰＡＭ配列を認識する野生型化膿レンサ球菌Ｃａｓ９である。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、ＮＧＡＧ ＰＡＭ配列、ＮＧＣＧ ＰＡＭ配列、ＮＧＧＧ ＰＡＭ配列、ＮＧＴＧ ＰＡＭ配列、ＮＧＡＡ ＰＡＭ配列、ＮＧＡＴ ＰＡＭ配列、又はＮＧＡＣ ＰＡＭ配列を認識する化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、ＮＧＣＧ ＰＡＭ配列、ＮＧＣＡ ＰＡＭ配列、ＮＧＣＴ ＰＡＭ配列、又はＮＧＣＣ ＰＡＭ配列を認識する化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ ＶＲＥＲ変異体である。ある特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は、ＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭ配列又はＮＮＧＲＲＶ ＰＡＭ配列を認識する野生型黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９である。

【0184】

「参照分子」は、本明細書で使用される場合、修飾又は候補分子が比較される分子を指す。例えば、参照Ｃａｓ９分子は、修飾又は候補Ｃａｓ９分子が比較されるＣａｓ９分子を指す。同様に、参照ｇＲＮＡは、修飾又は候補ｇＲＮＡが比較されるｇＲＮＡ分子を指す。修飾又は候補分子は、配列（例えば、修飾又は候補分子は、参照分子とＸ％の配列同一性又は相同性を有していてもよい）又は活性（例えば、修飾又は候補分子は、参照分子の活性のＸ％を有していてもよい）に基づいて、参照分子と比較してもよい。例えば、参照分子がＣａｓ９分子である場合、修飾又は候補分子は、参照Ｃａｓ９分子のヌクレアーゼ活性の１０％以下を有すると特徴付けることができる。参照Ｃａｓ９分子の例としては、天然未修飾Ｃａｓ９分子、例えば、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、又は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する天然Ｃａｓ９分子が挙げられる。ある特定の実施態様では、参照Ｃａｓ９分子は、それが比較されている修飾又は候補Ｃａｓ９分子と最も近い配列同一性又は相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。ある特定の実施態様では、参照Ｃａｓ９分子は、修飾又は候補Ｃａｓ９分子に到達するように突然変異がなされている天然又は既知配列を有する親分子である。

【0185】

「置き換え」又は「置き換えられる」は、分子の修飾に関して本明細書で使用される場合、過程を限定する必要はなく、置き換え実体が存在することを示すに過ぎない。

【0186】

「小分子」は、本明細書で使用される場合、約２ｋＤ未満、例えば約２ｋＤ未満、約１．５ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、又は約０．７５ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指す。

【0187】

「対象」は、本明細書で使用される場合、ヒト又は非ヒト動物のいずれを意味していてもよい。この用語は、これらに限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、げっ歯動物（例えば、マウス及びラット又はハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、及びヤギ）を含む。ある特定の実施態様では、対象はヒトである。他の実施態様では、対象は家禽である。

【0188】

「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、本明細書で使用される場合、（ａ）疾患を阻害すること、つまりその発症又は進行を停止又は防止すること、（ｂ）疾患を緩和すること、つまり疾患状態の退縮を引き起こすこと、（ｃ）疾患の一又は複数の症状を緩和すること、及び（ｄ）疾患を治癒することを含む、哺乳動物、例えばヒトの疾患の治療を意味する。

【0189】

「予防する」、「予防すること」、及び「予防」は、本明細書で使用される場合、（ａ）疾患を回避又は排除すること、（ｂ）疾患に対する素因に影響を及ぼすこと、（ｃ）疾患の少なくとも１つの症状の発症を予防又は遅延させることを含む、哺乳動物、例えばヒトの疾病の予防を意味する。

【0190】

「Ｘ」は、アミノ酸配列の状況にて本明細書で使用される場合、別様の指示がない限り、任意のアミノ酸（例えば、２０種の天然アミノ酸のいずれか）を指す。

【0191】

２．単純ヘルペスウイルス
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、少なくとも２つの型：単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ－２）に分類される。ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２は、それぞれ、ヒトヘルペスウイルス１（ＨＨＶ－１）及びヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ－２）としても知られている。

【0192】

ヘルペスウイルスの構造は、（エンベロープ）と呼ばれる脂質二分子膜で包まれている正２０面体タンパク質ケージ（カプシド）内に封入されている比較的大きな二本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムを含む。エンベロープは、テグメントを介してカプシドと接合している。この完全粒子は、ビリオンとしても知られている（Mettenleiterら、(2006) Curr. Opin. Microbiol. 9 (4): 423-429）。ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２は各々、それらのゲノム内に、少なくとも７４個の遺伝子（又はオープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）、又は９４個の推定ＯＲＦによる８４個ものユニークタンパク質コード遺伝子を含む（McGeochら、(2006) Virus Res. 117 (1): 90-104；Rajcaniら、(2004) Virus Genes 28 (3): 293-310）。これら遺伝子は、ウイルスのカプシド、テグメント、及びエンベロープの形成、並びにウイルスの複製及び感染力の調節に関与する様々なタンパク質をコードする。

【0193】

ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２のゲノムは複雑であり、各々が複数のウイルス遺伝子を含む２つのユニーク領域、つまりロングユニーク領域（ＵＬ）及びショートユニーク領域（ＵＳ）を含む。前初期遺伝子は、例えば、初期及び後期ウイルス遺伝子の発現を制御するタンパク質をコードする。初期遺伝子は、例えば、ＤＮＡ複製及びある特定のエンベロープ糖タンパク質の産生に関与する酵素をコードする。後期遺伝子は、例えば、ビリオン粒子を形成するタンパク質をコードする。ＨＳＶ遺伝子の転写は、感染宿主のＲＮＡポリメラーゼＩＩにより触媒される（McGeochら、(2006) Virus Res. 117 (1): 90-104）。

【0194】

宿主細胞内へのＨＳＶの侵入には、宿主細胞の表面にある受容体（例えば、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、ネクチン－１、又は３－Ｏ硫酸化ヘパラン硫酸）と、エンベロープウイルスの表面にあるいくつかの糖タンパク質（例えば、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）、及び糖タンパク質Ｌ（ｇＬ））との相互作用が関与する。エンベロープは、細胞表面の特定の受容体と結合すると、宿主細胞膜と融合して、細孔を形成し、ウイルスはそこから宿主細胞に侵入することになる。また、ウイルスは、受容体に結合した後にエンドサイトーシスされる場合があり、エンドソームで融合が生じ得る。ウイルスカプシドは、細胞質に侵入した後、細胞核に輸送される。カプシドは、核の核進入孔に付着すると、カプシドポータルからそのＤＮＡ内容物を放出する。細胞の感染後、例えば前初期、初期、及び後期の、ヘルペスウイルスタンパク質のカスケードがもたらされる。

【0195】

ＨＳＶは、休眠状態であるが、潜伏感染として知られている持続的形態で持続し得る。細胞の潜伏感染中、ＨＳＶは、潜伏関連転写物（ＬＡＴ）ＲＮＡを発現する。ＬＡＴは、宿主細胞ゲノムを制御し、自然な細胞死機序を妨害することができる。宿主細胞を維持することにより、ＬＡＴ発現は、ウイルスの蓄積場所を保存し、それにより、非潜伏に特徴的である、その後の通常は症候的な周期的再発又は「勃発」が可能になる。再発が症候的であるか否かに関わらず、ウイルス排出が生じて、さらなる感染がもたらされる。ヘルペスウイルスＤＮＡは、溶解感染に関連する遺伝子のトランス活性化因子であるＩＣＰ４をコードする遺伝子を含む（Pinnojiら、(2007) Virol. J. 4: 56）。ヒトニューロンタンパク質ニューロン制限的サイレンシング因子（ＮＲＳＦ）又はヒトリプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）は、ＩＣＰ４遺伝子を取り囲むエレメントに結合し、この遺伝子からの転写開始を防止するヒストン脱アセチル化を導くことができ、それにより、溶解サイクルに関与する他のウイルス遺伝子の転写が防止される（Pinnojiら、(2007) Virol. J. 4: 56；Bedadalaら、(2007) Cell Res. 17 (6): 546-555）。ＩＣＰ４タンパク質合成の阻害は、ＩＣＰ４遺伝子からＮＲＳＦを解離させるウイルスタンパク質ＩＣＰ０により元に戻し、したがってウイルスＤＮＡのサイレンシングを防止することができる（Roizmanら、(2005) Cell Cycle 4 (8): 1019-21）。

【0196】

２．１ ＨＳＶ感染
単純ヘルペスウイルスは、皮膚及び粘膜内の上皮細胞に感染することにより宿主に侵入する。最も一般的には、ＨＳＶ－１は、口、唇、及び鼻の上皮を含む、口腔咽頭部の上皮細胞に感染することにより宿主に侵入する。最も一般的には、ＨＳＶ－２は、性器及び肛門の上皮を含む、肛門性器部の上皮細胞に感染することにより宿主に侵入する。しかしながら、ＨＳＶ－１は、肛門性器部に一次感染する場合があり、ＨＳＶ－２は、口腔咽頭部に一次感染する場合がある。

【0197】

ＨＳＶ－１は、口及び粘膜の間欠性びらんを引き起こす。ＨＳＶ－１は、遍在性で感染力の強い病原体である。ＨＳＶ－１による初感染は、一般的に、唇及び口の粘膜の有痛水疱形成を引き起こす。

【0198】

ＨＳＶ－２は、性感染ウイルスである。ＨＳＶ－２は、最も一般的には、陰部ヘルペスとして知られている。ＨＳＶ－２による初感染は、一般的に、性器部に有痛水疱形成を引き起こす。この疾患は、生涯にわたる再発性のウイルス反応性発作を引き起こす。この疾患は、感染力が強く、特に活動性病変を有する患者では、ＨＩＶ感染の獲得リスクを増加させる。

【0199】

ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２感染症は、宿主の生涯にわたって持続する。初感染中、このウイルスは、口腔咽頭部及び肛門－性器部の細胞に感染して、影響を受けた領域に有痛小水疱を引き起こすことが最も多い。ＨＳＶ感染の再活性化は、口腔咽頭部又は肛門－性器部に生じることが最も多い。しかしながら、眼及び中枢神経系の再活性化感染症は、それぞれ失明及び恒久的な神経学的障害に結び付く場合があるため、最も重度で損傷性のＨＳＶ徴候である。一次及び再活性化感染症は、恒久的な神経学的後遺症及び失明を引き起こす場合がある。また、ＨＳＶ－２は、対象のＨＩＶ発症リスクを増加させる。ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症を治療、予防、及び／又は低減するための方法に対する多大な必要性が存在する。

【0200】

単純ヘルペスウイルスは、上皮細胞内で、ウイルス合成に必要な酵素及び結合タンパク質をコードする前初期遺伝子を産生する。初感染後、ウイルスは、感覚後根神経節（ＤＲＧ）への逆行性輸送により感覚神経軸索を移動する。ＨＳＶ－１は、主に三叉神経ＤＲＧに移動するが、初感染の部位に応じて他の感覚神経節に移動する場合がある。ＨＳＶ－２は、主に、仙骨内に位置する感覚ＤＲＧに移動するが、一次感染の部位に応じて他の感覚神経節に移動する場合がある。ＤＲＧ内で、ウイルスは潜伏感染を確立する。潜伏感染は、宿主の生涯にわたって持続する。ＤＲＧ細胞内で、ウイルスが脱殻し、ウイルスＤＮＡは、核内に輸送され、潜伏に関連する重要なウイルスＲＮＡが転写される（ＬＡＴ ＲＮＡを含む）。

【0201】

一次感染中、対象は、一般的には、４－１５日間継続する口腔部又は肛門－性器部の有痛水疱形成を経験する。びらんは、最も一般的には、ＨＳＶ－１一次感染では、唇、歯ぐき、及び鼻粘膜に関与する。それほど一般的ではないが、ＨＳＶ－１一次感染は、肛門－性器部に関与する場合がある。ＨＳＶ－２一次感染は、最も一般的には、膣、陰唇、頚部、陰茎、陰嚢、肛門、及び大腿付近の皮膚を含む、肛門－性器部に関与する。それほど一般的ではないが、ＨＳＶ－２一次感染は、口腔咽頭部に関与する。希ではあるが、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２一次感染症は、眼、中枢神経系、指及び爪の基部（疱疹性ひょう疽）に関与する場合がある。ＨＳＶ－１感染症は、主として唾液及び／又は性的活動を介して伝染する。ＨＳＶ－２感染症は、主として性的活動を介して伝染するが、唾液を介して伝染する場合もある。ＨＳＶ感染症の水疱は、破裂して、感染力の非常に強い透明な流体を放出する場合がある。一次感染症には、発熱、悪寒、及び筋肉痛を含むインフルエンザ様疾病が伴う。

【0202】

宿主免疫防御は、ＨＳＶ感染症と戦いにとって非常に重要である。病原体の認識及び除去には、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋細胞が関与する。ＨＩＶを有する対象、臓器移植後に免疫抑制剤が投与されている対象、及び免疫系が発達中である新生仔を含む、Ｔ細胞応答障害を有する対象は、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２感染症の最も重度の徴候を示しやすい。

【0203】

潜伏感染の再活性化は、一般的にそれほど重度ではなく、継続期間はより短い場合もある。ＨＳＶ－１感染症の再活性化は、口腔部に影響を及ぼすことが最も多いが、肛門－性器部、眼、中枢神経系（ＣＮＳ）、手指爪、及び咽頭部を含む、他の領域にも影響を及ぼす場合がある。ＨＳＶ－２感染の再活性化は、肛門－性器部に影響を及ぼすことが最も多いが、口腔部、眼、中枢神経系（ＣＮＳ）、手指爪、及び咽頭部を含む、他の領域にも影響を及ぼす場合がある。ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染のいずれの再活性化も、角膜炎（上皮角膜炎、間質性角膜炎、及び円板状角膜炎）を含む眼科疾患を引き起こす場合がある。一般的に、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２の眼科的徴候としては、疼痛、流涙、目の充血、及び光過敏が挙げられる。ほとんどのＨＳＶ関連眼感染は、恒久的な視覚損傷を起こさずに解消する。しかしながら、眼ヘルペス感染症は、希にではあるが、瘢痕化、細菌病原体による二次感染、及び希にではあるが失明を引き起こす場合がある。また、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症のいずれの再活性化も、網膜炎を引き起こす場合がある。ＨＳＶ関連網膜炎は、希ではあるが重度であり、恒久的失明のリスクは高い。

【0204】

新生仔は、重度ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２感染症を発症する特別なリスクのある集団である。この疾患は、出産中に母親から胎仔へと伝染する。母子感染の可能性は、母親が妊娠中に一次ＨＳＶ感染症を発症した場合、最も高い。新生仔ヘルペスの発症率は、１００，０００出産当たりおよそ４－３０件である。新生仔は、重度ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２脳炎及び／又は脳膜炎を発症する場合がある。抗ウイルス療法剤によりすぐに治療した場合でも、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２に感染した新生仔が恒久的な神経学的後遺症を有する率は、顕著である。ＨＳＶ脳炎又は脳膜炎を有する幼仔を、高用量の抗ウイルス療法剤で治療した研究では、死亡率が４％であることが見出され、生存者の６９％が、恒久的な神経学的後遺症を有していた（Kimberlinら、Pediatrics. 2001; 108: 230-238）。

【0205】

一次ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症は、アシクロビル、バラシクロビル、及びファムシクロビルを含む抗ウイルス療法剤で治療することができる。こうした療法剤は、ウイルス排出を低減し、疼痛を減少させ、病変の治癒時間を向上させることが実証されている。再活性化された潜伏感染症は、治療せずに解消する場合があり（自然治癒する場合がある）、又は抗ウイルス療法剤で治療してもよい。療法剤は、主に急性感染中に投与される。治癒的治療又は予防的治療は存在しない。療法剤は、最近のＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２に感染症又は再活性化を有する母親の出産中を含む、ある特定の状況では、予防的に投与される場合がある。

【0206】

ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症を予防する有効な療法剤は存在しない。活動性感染中の抗ウイルス療法剤の使用及びコンドームの使用は、感染率をおよそ５０％減少させる。

【0207】

ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）獲得率は、ＨＳＶ－２に血清反応陽性である対象で劇的に増加する。ＨＩＶ－１による感染リスクは、ＨＳＶ－２を有する対象で３倍を超えている。抗ウイルス剤は、ＨＩＶ獲得リスクの低減に効果がない。

【0208】

２．２ ＨＳＶ関連眼疾患
ＨＳＶ感染症、例えば、眼のＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症は、一次又は再活性化感染症のいずれの場合も、ＨＳＶ関連眼疾患と呼ばれる。ＨＳＶ関連眼疾患は、最も一般的には、角膜炎、間質性角膜炎、及び／又は円板状角膜炎として知られている前眼房の感染症を引き起こす。ＨＳＶ関連眼疾患は、より希だが、網膜炎として知られている後眼房の感染症を引き起こす場合がある。ＨＳＶ－１角膜炎は、鋭い痛みがあり、不快である。ＨＳＶ－１角膜炎は、希な例では、瘢痕化、細菌病原体による二次感染、及び希ではあるが失明を引き起こす場合がある。ＨＳＶ関連網膜炎は、ＨＳＶ関連眼疾患の希な徴候であるが、恒久的な視覚損傷のリスクは遙かにより高い。

【0209】

再活性化感染症は、三叉神経（第５脳神経）の眼枝に沿って眼内への、三叉神経節から眼内へのウイルスの順行性輸送により、眼で生じる。また、ウイルスの再活性化は、角膜内から生じる場合がある。三叉神経節内での潜伏は、２つの機序の１つにより確立される。第１に、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２は、眼（眼感染後の）から三叉神経節内への三叉神経に沿った逆行性輸送により移動する場合がある。或いは、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２は、口腔粘膜、性器部、又は他の外眼性部位に感染した後の血行性拡散により三叉神経節に拡散する場合がある。三叉神経節の潜伏感染を確立した後、ウイルスは、任意の時点で、特に免疫不全宿主の場合、三叉神経に沿った眼内への順行性移動により、感染を再確立することができる。

【0210】

眼ヘルペスは、後眼房に影響を及ぼす場合、網膜炎を引き起こす。成体では、ＨＳＶ網膜炎の大多数の症例は、ＨＳＶ－１が原因である（Peposeら、Ocular Infection and Immunity 1996; Mosby 1155-1168）。新生仔及び仔どもでは、ＨＳＶ網膜炎の大多数の症例は、ＨＳＶ－２が原因である（Peposeら、Ocular Infection and Immunity 1996; Mosby 1155-1168）。ＨＳＶ関連網膜炎は、急性網膜壊死（ＡＲＮ）に結び付く場合があり、急性網膜壊死は、治療しないと２週間以内に網膜を破壊することになる（Banerjee及びRouse, Human Herpesviruses 2007; Cambridge University Press, Chapter 35）。治療した場合でさえ、ＡＲＮ後の恒久的な視覚損傷リスクは、５０％を超える（Royら、Ocular Immunology and Inflammation 2014; 22(3): 170-174）。

【0211】

角膜炎は、眼ヘルペスの最も一般的な形態である。ＨＳＶ角膜炎は、樹枝状角膜炎、間質性角膜炎、眼瞼炎、及び結膜炎として顕在化する場合がある。ＨＳＶ関連角膜炎の大多数は、ＨＳＶ－１が原因であり、症例の５８％を占める（Dawsonら、Suvey of Ophthalmology 1976; 21(2): 121-135）。ＨＳＶ関連角膜炎症例の残り、つまり症例のおよそ４２％は、ＨＳＶ－２が占める。米国では、再発性又は一次ＨＳＶ関連角膜炎感染症の症例は、年間でおよそ４８，０００件である（Liesegangら、1989; 107(8): 1155-1159）。ＨＳＶ関連角膜炎の全症例のうち、対象のおよそ１．５－３％が、重度の恒久的な視力障害を経験する（Wilhelmusら、Archives of Ophthalmology 1981; 99(9): 1578-82）。対象のＨＳＶ関連眼疾患による恒久的な視覚損傷のリスクは、眼関連ＨＳＶ再活性化の回数が増加すると共に増加する。

【0212】

全体的に、間質性角膜炎は、角膜炎症例のおよそ１５％に相当し、角膜炎による恒久的な視覚損傷のリスクが最も高いことと関連している。間質性角膜炎は、瘢痕化及び不正乱視をもたらす。最近の眼ＨＳＶ感染症は、間質性感染症の発症リスクを増加させる。これは、以前に眼ＨＳＶ感染症を有していた対象が、再活性化時に恒久的な視覚損傷のリスクが高くなることを意味する。仔どもでは、角膜炎の全症例の最大６０％が、間質性角膜炎である。したがって、仔どもには、特に、ＨＳＶ関連角膜炎による恒久的な視覚損傷のリスクがある。１９５０－１９８２年の米国における遡及研究では、新たな又は再発性の間質性角膜炎の症例は、１００，０００人年当たりおよそ２．６症例であり、つまり、間質性角膜炎の年間症例は、およそ８，０００症例であることが判明した（Liesegangら、1989; 107(8): 1155-1159）。２００２年のフランスにおけるより最近の研究では、新たな又は再発性の間質性角膜炎症例の発症率は、１００，０００当たり９．６であると推定された（Labetoulleら、Ophthalmology 2005; 112(5):888-895）。ＨＳＶ関連角膜炎の発症率は、先進国世界では増加しつつある可能性がある（Farooq及びShukla 2012; Survey of Ophthalmology 57(5): 448-462）。

【0213】

本明細書に記載のゲノム編集系、組成物、及び方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２眼感染症を治療、予防、及び／又は低減するために使用することができ、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２眼感染症としては、これらに限定されないが、ＨＳＶ－１間質性角膜炎、ＨＳＶ－１樹枝状角膜炎、ＨＳＶ－１眼瞼炎、ＨＳＶ－１結膜炎、ＨＳＶ－１網膜炎、ＨＳＶ－２間質性角膜炎、ＨＳＶ－２樹枝状角膜炎、ＨＳＶ－２眼瞼炎、ＨＳＶ－２結膜炎、及びＨＳＶ－２網膜炎が挙げられる。

【0214】

３．ＨＳＶ関連眼感染症を治療、予防、及び／又は低減するための方法
本明細書には、本明細書に記載の方法、ゲノム編集系、及び組成物を使用して、ＨＳＶ関連眼感染症を治療、予防、及び／又は低減するために手法が開示されている。ＨＳＶ関連眼感染症は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染により引き起こされる場合がある。例えば、限定ではないが、本明細書に記載の方法、ゲノム編集系、組成物は、ＨＳＶ－１感染症、ＨＳＶ－２感染症、又はＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２感染症の両方を、治療、予防、及び／又は軽減するために使用することができる。

【0215】

ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２のＲＳ１、ＲＬ２、及びＬＡＴ遺伝子は、ウイルス感染、増殖、及び構築、並びに潜伏の維持及び潜伏からのウイルス再活性化に関連する。これら遺伝子のいずれかを単独で又は組合せでノックアウト又はノックダウンすることにより、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症を低減することができる。ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２ウイルスは、身体内の個別の局所領域にて潜伏を確立するため、無力化治療を潜伏領域に送達する局所送達に非常に適している。個別の領域（一又は複数）（例えば、三叉神経後根神経節、角膜、頚部後根神経節、又は仙椎後根神経節）の標的指向性ノックアウトは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２ウイルスを無力化することにより潜伏感染を低減又は消失させることができる。

【0216】

本明細書には、ウイルス遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることによりＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症を治療、予防、及び／又は低減するための手法が記載されている。本明細書に記載の方法は、以下のＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２コード遺伝子：ＲＬ２、ＬＡＴ、及びＲＳ１、又はそれらの任意の組合せ（例えば任意の単一の遺伝子、例えばＲＬ２、例えばＬＡＴ、例えばＲＳ１、又は任意の２つの遺伝子、例えばＲＬ２及びＬＡＴ、例えばＲＬ２及びＲＳ１、例えばＲＳ１及びＬＡＴ、又はこれら３つの遺伝子）をノックアウト又はノックダウンすることを含む。２つの変更事象（例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の発現のノックダウン又はノックアウト）がある場合、２つの変更事象は、順次に又は同時に生じてもよい。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックアウトは、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックダウンの前に生じる。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックアウトは、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックダウンと同時である。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックアウトは、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックダウンの後である。ある特定の実施態様では、変更の効果は相乗的である。

【0217】

ＲＬ２は、遺伝子ＩＣＰ０、遺伝子発現のトランス活性化因子である７７５個アミノ酸のタンパク質をコードする。ＲＬ２遺伝子は、ヘルペスウイルスにより発現される５つの前初期遺伝子の１つである。ＩＣＰ０は遅延初期及び後期遺伝子の発現の活性化に関与する（Lees-Millerら、1996, Journal of Virology 70(11): 7471-7477）。ＩＣＰ０は、神経毒性に関与すると考えられている。細胞培養では、ＩＣＰ０は、潜伏からの再活性化に必要であることが見出されている（Leibら、1989, Journal of Virology 63:759-768）。ＲＬ２を発現しない欠失突然変異体は、複製することができないことがインビトロで示されている（Sacks及びSchaffer 1987, Journal of Virology 61(3):829-839）。ある特定の実施態様では、ＲＬ２のノックアウトは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２が潜伏から再活性化する能力を無力化することができる。ある特定の実施態様では、ＲＬ２のノックアウト又はノックダウンは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２が複製する能力を無力化することができる。ある特定の実施態様では、ＲＬ２のノックアウト又はノックダウンは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２が感染する能力及び／又は神経組織で潜伏感染を確立する能力を無力化することができる。

【0218】

ＬＡＴは、潜伏期中にヘルペスウイルスにより発現される唯一の遺伝子をコードする。潜伏期は、ウイルスが、宿主組織、多くの場合、三叉神経節又は仙骨神経節を含む神経組織に静止感染を確立する時間である。ＬＡＴは、ヘルペスウイルス感染症の再活性化に関与し、ウイルスが、上皮及び他の組織に再感染することを可能にすると考えられている。ある特定の実施態様では、ＬＡＴのノックアウト又はノックダウンは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２遺伝子潜伏及び／又は再活性化を無力化し、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２が、潜伏感染を維持及び／又は潜伏感染後に再活性化する能力を妨害することができる。ある特定の実施態様では、ＬＡＴ発現のノックアウト又はノックダウンは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２による潜伏感染を消失させる。ある特定の実施態様では、ＬＡＴ発現のノックアウト又はノックダウンは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症を治療及び／又は治癒するための期間を短縮する。

【0219】

ＲＳ１は、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２による前初期遺伝子の発現に重要な役割を果たす。ＲＳ１は、ヘルペスウイルスにより発現される５つの前初期遺伝子の１つであり、主要な転写制御因子である。ＲＳ１は、ウイルスタンパク質ＩＣＰ４をコードする。ＩＣＰ４は、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２により産生される初期及び後期遺伝子の両方の全体的な発現の調節に重要である。ＲＳ１遺伝子は、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２で類似している。

【0220】

ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックアウト又はノックダウンは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２遺伝子発現を無力化し、ウイルス複製、構築、成熟、パッケージング、又は感染の一又は複数を低減する。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子発現のノックアウトは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症の継続期間を短縮する。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子発現のノックアウト又はノックダウンは、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症を治療又は治癒する。

【0221】

ある特定の実施態様では、眼関連ＨＳＶ再活性化の継続期間、回数、及び／又は頻度の低減は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２に感染した対象の恒久的な視覚損傷のリスクを減少させることができる。

【0222】

ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子を個々に又は組合せでノックアウト及び／又はノックダウンすることにより、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２を、抗ウイルス療法剤に、より感受性にすることができる。重要な遺伝子の突然変異は、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、及び他のウイルスを、抗ウイルス剤による治療に、より感受性にすることができる（Zhouら、Journal of Virology 2014; 88(19): 11121-11129）。ＲＬ２及びＬＡＴ及び／又はＲＳ１遺伝子を個々に又は組合せでノックアウト又はノックダウンすることは、抗ウイルス療法剤と組み合わせて、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症を治療、予防、及び／又は低減することができる。本明細書に記載の組成物及び方法を、抗ウイルス療法剤、例えば、本明細書に記載の別の抗ＨＳＶ－１療法剤又は抗ＨＳＶ－２療法剤と組み合わせて、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症を治療、予防、及び／又は低減することができる。

【0223】

１つの手法では、標的化ノックアウト又はノックダウンとして、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及びＬＡＴ遺伝子の１つ、２つ、又は３つを標的として、例えばウイルス遺伝子制御、ウイルス遺伝子転写、ウイルスゲノム複製、ウイルス潜伏遺伝子の発現、及びウイルスカプシド形成を含む、一又は複数のウイルス機能を阻害する。ある特定の実施態様では、上記手法は、１つのＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２遺伝子（例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子）をノックアウトすることを含む。ある特定の実施態様では、上記手法は、１つのＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２遺伝子（例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子）をノックダウンすることを含む。ある特定の実施態様では、上記手法は、２つのＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２遺伝子、例えばＲＬ２及びＬＡＴ遺伝子の両方、例えばＲＬ２及びＲＳ１遺伝子の両方、例えばＲＳ１及びＬＡＴ遺伝子の両方をノックアウトすることを含む。ある特定の実施態様では、上記手法は、２つのＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２遺伝子、例えばＲＬ２及びＬＡＴ遺伝子の両方、例えばＲＬ２及びＲＳ１遺伝子の両方、例えばＲＳ１及びＬＡＴ遺伝子の両方をノックダウンすることを含む。ある特定の実施態様では、上記手法は、３つのＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２遺伝子、例えば、ＲＬ２、ＬＡＴ及びＲＳ１遺伝子の３つを全てノックアウトすることを含む。ある特定の実施態様では、上記手法は、３つのＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２遺伝子、例えば、３つのＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子を全てノックダウンすることを含む。

【0224】

ある特定の実施態様では、一又は複数のウイルス機能、例えばウイルス遺伝子制御、ウイルス遺伝子転写、ウイルスゲノム複製、及びウイルスカプシド形成を阻害することにより、一次又は再発性感染症の継続期間を減少させるか、及び／又はウイルス粒子の排出を減少させる。また、対象は、疾病の継続期間の短縮、性的パートナーへの伝染リスクの減少、妊娠している場合は胎仔への伝染リスクの減少、並びに／又はＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２の完全なクリアランス（治癒）の可能性を経験する場合がある。

【0225】

一又は複数の標的遺伝子（例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子）の一又は複数のコピー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、又はそれよりも多くのコピー）のノックアウト又はノックダウンは、疾患発症前に、又は疾患発症後に、好ましくは疾患経過の初期に実施することができる。

【0226】

ある特定の実施態様では、本方法は、疾患発症前に対象の治療を開始することを含む。

【0227】

ある特定の実施態様では、本方法は、疾患発症後に対象の治療を開始することを含む。

【0228】

ある特定の実施態様では、本方法は、疾患発症後に、例えば、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症を発症した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２４、３６、４８カ月後、又はそれよりも後に、対象の治療を開始することを含む。ある特定の実施態様では、本方法は、疾患発症後に、例えば、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症を発症した１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、４０、５０、又は６０年後に、対象の治療を開始することを含む。

【0229】

ある特定の実施態様では、本方法は、疾患の進行期に、例えば急性期又は潜伏期中に、対象の治療を開始することを含む。ある特定の実施態様では、本方法は、中枢神経系、眼、口腔咽頭部、性器部、及び／又は他の領域に影響を及ぼす疾患の重症急性期に、対象の治療を開始することを含む。

【0230】

まとめると、疾患のどの病期で対象の治療を開始したとしても、疾患の治癒が向上し、疾患の継続期間が減少し、対象に有益であると予想される。

【0231】

ある特定の実施態様では、本方法は、疾患進行前に対象の治療を開始することを含む。ある特定の実施態様では、本方法は、疾患の初期段階に、例えば、対象がＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２と接触したか、又はＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２と接触したと考えられる時点で、対象の治療を開始することを含む。

【0232】

ある特定の実施態様では、本方法は、疾患進行前に対象の治療を開始することを含む。ある特定の実施態様では、本方法は、疾患の初期段階に、例えば、対象が、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症に陽性の検査結果が出たが、徴候又は症状を示していない時点で、対象の治療を開始することを含む。

【0233】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症に合致又は関連する以下の所見の一又は複数の出現時に治療を開始することを含む：発熱、頭痛、体の痛み、肛門性器の水疱形成、口腔内潰瘍形成、脳炎、又は角膜炎。

【0234】

ある特定の実施態様では、本方法は、例えば、幼仔、仔ども、成体、又は若年成体の、例えば口腔又は口腔咽頭部に又はその周辺に有痛水疱形成が出現した時点で、対象の治療を開始することを含む。

【0235】

ある特定の実施態様では、本方法は、例えば、幼仔、仔ども、成体、又は若年成体に、肛門－性器部の有痛水疱形成、性器潰瘍、及び／又は風邪様症状が出現した時点で、対象の治療を開始することを含む。

【0236】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２脳膜炎並びに／又はＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２脳炎が疑われる対象の治療を開始することを含む。

【0237】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２脳膜炎及び／又は脳炎と合致又は関連する以下の症状の一又は複数の出現時に治療を開始することを含む：発熱、頭痛、嘔吐、羞明、発作、意識レベル低下、嗜眠、又は傾眠。

【0238】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ脳膜炎及び／又は脳炎と合致又は関連する以下の徴候のいずれかの出現時に治療を開始することを含む：ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２のＣＳＦ培養陽性、ＣＳＦのＷＢＣ上昇、頚部硬直／ブルジンスキー徴候陽性。ある特定の実施態様では、本方法は、ＥＥＧ、ＣＳＦ試験、ＭＲＩ、ＣＳＦ検体のＰＣＲ、及び／又は脳生検検体のＰＣＲにおける、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２脳炎及び／又は脳膜炎と合致する徴候を示す患者の治療を開始することを含む。

【0239】

ある特定の実施態様では、本方法は、眼部ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２と合致又は関連する以下の症状のいずれかの出現時に治療を開始することを含む：疼痛、羞明、霧視、流涙、発赤／充血、視力喪失、飛蚊症、又は閃光。

【0240】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２角膜炎としても知られている眼部ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２と合致又は関連する以下の眼科的検査に関する所見のいずれかの出現時に治療を開始することを含む：角膜上皮の小さな隆起した透明な小胞；角膜表面の凸凹又は点状上皮びらん；濃厚間質浸潤液；潰瘍形成；壊死；局所性、多巣性、又はびまん性の細胞浸潤；免疫リング；新血管新生；又はあらゆるレベルの角膜のゴースト血管。

【0241】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２網膜炎又は急性網膜壊死と合致又は関連する以下の眼科的検査に関する所見のいずれかの出現時に治療を開始することを含む：視力低下；ブドウ膜炎；硝子体炎；強膜充血；前房及び／又は硝子体腔の炎症；硝子体のくもり；視神経浮腫；末梢網膜白化；網膜裂孔；網膜剥離；網膜壊死；細動脈鞘形成及び細動脈狭窄を含む、動脈病変を伴う閉塞性脈管障害の証拠。

【0242】

ある特定の実施態様では、本方法は、眼、口腔咽頭部、肛門－性器部、又は中枢神経系のいずれかのＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症と合致又は関連する症状及び／又は徴候の出現時に治療を開始することを含む。ある特定の実施態様では、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症が疑われる場合、疾患経過の初期にＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症の治療を開始することが有益である。

【0243】

ある特定の実施態様では、本方法は、子宮にて治療を開始することを含む。ある特定の実施態様では、対象は、母子感染のリスクが高い。

【0244】

ある特定の実施態様では、本方法は、活性ＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２感染症を有するか、又は最近の一次ＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２感染症を有する母親の場合、妊娠中に治療を始めることを含む。

【0245】

ある特定の実施態様では、本方法は、臓器移植前に又は臓器移植直後に治療を開始することを含む。

【0246】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２との接触が疑われる場合に、治療を開始することを含む。

【0247】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ脳炎又は脳膜炎が疑われる場合、予防的に治療を開始することを含む。

【0248】

ある特定の実施態様では、ＨＩＶ陽性対象及び移植後対象は両方とも、免疫不全により、ＨＳＶ脳炎及び脳膜炎を含む重度ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２活性化又は再活性化を経験する場合があることが考慮される。また、新生仔には、出産中の母子感染による重度ＨＳＶ脳炎のリスクがある。一又は複数のウイルス機能、例えばウイルス遺伝子制御、ウイルス遺伝子転写、ウイルスゲノム複製、及びウイルスカプシド形成の阻害は、重度ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症のリスクがある上記集団に、優れた防御を提供することができる。対象は、ＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２脳炎率の低下、並びに／又はＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２脳炎後の重度神経学的後遺症率の低下を経験する場合があり、それにより生活の質が著しく向上するだろう。

【0249】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症を罹患しているか又はＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症の重度徴候を発症するリスクのある対象、例えば、新生仔、ＨＩＶを有する対象、例えば臓器移植後に免疫抑制剤療法を受けている対象、がんを有する対象、化学療法を受けている対象、化学療法を受けている対象、放射線療法を受けている対象、放射線療法を受けることになる対象の治療を開始することを含む。

【0250】

ある特定の実施態様では、ＨＩＶ陽性対象及び移植後対象は両方とも、免疫不全により、ＨＳＶ脳炎及び脳膜炎を含む、重度ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２活性化又は再活性化を経験する場合がある。また、新生仔には、出産中の母子感染による重度ＨＳＶ脳炎のリスクがある。必須ウイルス機能、例えばウイルス遺伝子制御、ウイルス遺伝子転写、ウイルス潜伏遺伝子の発現、ウイルスゲノム複製、及びウイルスカプシド形成の阻害は、重度ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症のリスクがある上記集団に、優れた防御を提供することができる。対象は、ＨＳＶ－１及び／若しくはＨＳＶ－２脳炎率の低下、並びに／又はＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２脳炎後の重度神経学的後遺症率の低下を経験する場合があり、それにより生活の質が著しく向上するだろう。

【0251】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２に陽性の検査結果を示す対象の治療を開始することを含む。

【0252】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症に陽性の検査結果を示す対象の治療を開始することを含む。ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染症は、例えば、ウイルス培養、直接蛍光抗体研究、皮膚生検、ＰＣＲ、血液血清学的検査、ＣＳＦ血清学的検査、ＣＳＦ ＰＣＲ、又は脳生検を使用して検査することができる。ある特定の実施態様では、本方法は、診断的硝子体切除、網膜内生検、又は水性液体のＰＣＲ、硝子体試料のＰＣＲによりＨＳＶ－２感染症に陽性の検査結果を示す対象の治療を開始することを含む。

【0253】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２に接触し、ＨＳＶ感染症の重度続発症のリスクが高い対象の治療を開始することを含む。

【0254】

ある特定の実施態様では、細胞は、一又は複数の標的遺伝子、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子を編集することにより（例えば、突然変異を導入することにより）操作される。ある特定の実施態様では、一又は複数の標的遺伝子（例えば、本明細書に記載の一又は複数のＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子）の発現は、例えばインビボで、調節される。

【0255】

ある特定の実施態様では、本方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によりｇＲＮＡ分子を送達することを含む。ある特定の実施態様では、本方法は、レンチウイルス（ＬＶ）によりｇＲＮＡ分子を送達することを含む。ある特定の実施態様では、本方法は、ナノ粒子によりｇＲＮＡ分子を送達することを含む。

【0256】

ある特定の実施態様では、本方法は、対象に、第２の抗ウイルス療法剤又は治療剤、例えば、本明細書に記載の抗ＨＳＶ－１又は抗ＨＳＶ－２療法剤又は治療剤を投与することをさらに含む。本組成物及びもう一方の療法剤又は治療剤は、任意の順序で投与することができる。例えば、本明細書に記載の組成物は、一又は複数の追加の療法剤又は治療剤と同時に、その前に、又はその後で投与することができる。ある特定の実施態様では、２つ又はそれよりも多くの療法剤又は治療剤の効果は、相乗的である。例示的な抗ＨＳＶ－１及び抗ＨＳＶ－２療法剤及び治療剤としては、これらに限定されないが、アシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、ペンシクロビル、又はワクチンが挙げられる。

【0257】

４．ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子を変更するための方法
本明細書に開示されているように、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子は、本明細書に記載のようなゲノム編集系、組成物、及び方法により変更することができる。

【0258】

本明細書で考察されている方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更（例えば、ノックアウト又はノックダウン）を提供する。

【0259】

本明細書に開示されているように、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置は、例えば、本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を媒介とする方法、ゲノム編集系、及び組成物を使用して、遺伝子編集により、単独で又は組合せで変更することができる。ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更（例えば、ノックアウト又はノックダウン）は、例えば、
（１）ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子のノックアウト、
（ａ）ＲＳ１、ＲＬ２、若しくはＬＡＴ遺伝子の初期コード化領域の近傍又はＲＳ１、ＲＬ２、若しくはＬＡＴ遺伝子の初期コード化領域内での、一又は複数のヌクレオチドの挿入又は欠失（例えば、ＮＨＥＪ媒介性挿入又は欠失）、又は
（ｂ）ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子の少なくとも部分を含むゲノム配列（一又は複数）の欠失（例えば、ＮＨＥＪ媒介性欠失）、或いは
（２）非コード化領域、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子のプロモーター領域を標的とすることにより、ｅｉＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により媒介されるＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子のノックダウン
により達成することができる。

【0260】

手法は全て、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の変更（例えば、ノックアウト又はノックダウン）をもたらす。ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１つ又は両方の変更に関連する場合がある例示的な機序としては、これらに限定されないが、非相同末端結合（例えば、古典的又は選択的）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同組換え修復（例えば、内因性ドナー鋳型媒介性）、ＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーリング）、一本鎖アニーリング、又は一本鎖侵入が挙げられる。

【0261】

ある特定の実施態様では、本明細書に記載の方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の初期コード化領域の近くに、一又は複数の切断を導入する。ある特定の実施態様では、本明細書に記載の方法、ゲノム編集系、及び組成物は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の少なくとも部分に隣接するように２つ又はそれよりも多くの切断を導入する。２つ又はそれよりも多くの切断は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の少なくとも部分を含むゲノム配列を除去する（例えば、欠失させる）。ある特定の実施態様では、本明細書に記載の方法は、ＨＳＶ ＲＬ２及び／又はＨＳＶ ＬＡＴ及び／又はＲＳ１標的ノックダウン位置のプロモーター領域を標的とすることにより、ｅｉＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により媒介される、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のノックダウンを含む。本明細書に記載の方法は全て、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の変更（例えば、ノックアウト又はノックダウン）をもたらす。

【0262】

４．１ ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子にインデル又は欠失を導入することによる、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子のノックアウト
ある特定の実施態様では、本方法は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のＨＳＶ ＲＳ１標的ノックアウト位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的ノックアウト位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックアウト位置（例えば、初期コード化領域）の近傍に、一又は複数のヌクレオチドの挿入又は欠失を導入することを含む。本明細書中に記載されているように、ある特定の実施態様では、本方法は、切断誘導性インデルが、ＨＳＶ ＲＬ２標的ノックアウト位置又はＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックアウト位置（例えば、初期コード化領域）に及んでいると合理的に予想することができるように、ＨＳＶ ＲＬ２標的ノックアウト位置又はＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックアウト位置の初期コード化領域の十分に近くに（例えば、５’又は３’のいずれかに）、一又は複数の切断（例えば、一本鎖切断又は二本鎖切断）を導入することを含む。切断のＮＨＥＪ媒介性修復は、ＨＳＶ ＲＬ２標的ノックアウト位置若しくはＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックアウト位置の初期コード化領域の近傍に、又はＨＳＶ ＲＬ２標的ノックアウト位置若しくはＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックアウト位置の初期コード化領域内に、インデルのＮＨＥＪ媒介性導入を可能にする。

【0263】

ある特定の実施態様では、本方法は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の少なくとも部分を含むゲノム配列の欠失を導入することを含む。本明細書に記載されているように、一実施態様では、本方法は、２つの二本鎖切断を、ＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１標的位置の一方は５’に、他方は３’に（つまり、隣接して）導入することを含む。１つの実施態様では、２つのｇＲＮＡ、例えば単分子（若しくはキメラ）又はモジュール型ｇＲＮＡ分子は、２つの二本鎖切断を、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子のＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１標的ノックアウト位置の反対側に配置するように構成されている。

【0264】

ある特定の実施態様では、一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に導入される（例えば、１つのｇＲＮＡ分子により配置される）。ある特定の実施態様では、単一のｇＲＮＡ分子を（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼと共に）使用して、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に一本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流（例えば、上流２００ｂｐ以内）又は下流（例えば、下流２００ｂｐ以内）のいずれかに配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、切断は、反復エレメント、例えばＡｌｕリピート等の望ましくない標的染色体エレメントを回避するように配置される。

【0265】

ある特定の実施態様では、二本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に導入される（例えば、１つのｇＲＮＡ分子により配置される）。ある特定の実施態様では、単一のｇＲＮＡ分子を（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ以外のＣａｓ９ヌクレアーゼと共に）使用して、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に二本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、二本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流（例えば、上流２００ｂｐ以内）又は下流（例えば、下流２００ｂｐ以内）のいずれかに配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、切断は、反復エレメント、例えばＡｌｕリピート等の望ましくない標的染色体エレメントを回避するように配置される。

【0266】

ある特定の実施態様では、２つの一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に導入される（例えば、２つのｇＲＮＡ分子により配置される）。ある特定の実施態様では、２つのｇＲＮＡ分子を（例えば、１つ又は２つのＣａｓ９ニッカーゼと共に）使用して、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に２つの一本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、一本鎖切断の両方が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流（例えば、上流２００ｂｐ以内）又は下流（例えば、下流２００ｂｐ以内）に配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、２つのｇＲＮＡ分子を（例えば、２つのＣａｓ９ニッカーゼと共に）使用して、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に２つの一本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、１つの一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流（例えば、上流２００ｂｐ以内）に配置され、第２の一本鎖切断が、下流（例えば、下流２００ｂｐ以内）に配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、切断は、反復エレメント、例えばＡｌｕリピート等の望ましくない標的染色体エレメントを回避するように配置される。

【0267】

ある特定の実施態様では、２つの二本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に導入される（例えば、２つのｇＲＮＡ分子により配置される）。ある特定の実施態様では、２つのｇＲＮＡ分子を（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼではない１つ又は２つのＣａｓ９ヌクレアーゼと共に）使用して、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に隣接するように２つの二本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、１つの二本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流（例えば、上流２００ｂｐ以内）に配置され、第２の二本鎖切断が、下流（例えば、下流２００ｂｐ以内）に配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、切断は、反復エレメント、例えばＡｌｕリピート等の望ましくない標的染色体エレメントを回避するように配置される。

【0268】

ある特定の実施態様では、１つの二本鎖切断及び２つの一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に導入される（例えば、３つのｇＲＮＡ分子により配置される）。ある特定の実施態様では、３つのｇＲＮＡ分子を（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ以外のＣａｓ９ヌクレアーゼ及び１つ又は２つのＣａｓ９ニッカーゼと共に）使用して、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に隣接するように１つの二本鎖切断及び２つの一本鎖切断を生成する。例えば、ｇＲＮＡ分子は、二本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流又は下流（上流又は下流２００ｂｐ以内）に配置され、２つの一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の反対側の部位に、例えば、上流又は下流（例えば、上流又は下流２００ｂｐ以内）に配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、切断は、反復エレメント、例えばＡｌｕリピート等の望ましくない標的染色体エレメントを回避するように配置される。

【0269】

ある特定の実施態様では、４つの一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に又はその近傍に導入される（例えば、４つのｇＲＮＡ分子により配置される）。ある特定の実施態様では、４つのｇＲＮＡ分子を（例えば、１つ又はそれよりも多くのＣａｓ９ニッカーゼと共に）使用して、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に隣接するように４つの一本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、第１及び第２の一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の上流（例えば、上流２００ｂｐ以内）に、第３及び第４の一本鎖切断が、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の下流（例えば、下流２００ｂｐ以内）に配置されるように構成されている。ある特定の実施態様では、切断は、反復エレメント、例えばＡｌｕリピート等の望ましくない標的染色体エレメントを回避するように配置される。

【0270】

ある特定の実施態様では、２つ又はそれよりも多くの（例えば、３つ又は４つの）ｇＲＮＡ分子が、１つのＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質と共に使用される。ある特定の実施態様では、２つ又はそれよりも多くの（例えば、３つ又は４つの）ｇＲＮＡが、２つ又はそれよりも多くのＣａｓ９分子と共に使用される場合、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、他のＣａｓ９分子とは異なる種に由来する。例えば、２つのｇＲＮＡ分子が、２つのＣａｓ９分子と共に使用される場合、一方のＣａｓ９分子は、１つの種に由来していてもよく、他方のＣａｓ９分子は、異なる種に由来していてもよい。必要に応じて、両方のＣａｓ９種を使用して、一本鎖又は二本鎖切断を生成する。

【0271】

４．２． ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の少なくとも部分を含むゲノム配列又は複数のゲノム配列を欠失すること（例えば、ＮＨＥＪ媒介性欠失）による、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数のノックアウト
ある特定の実施態様では、本方法は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／若しくはＬＡＴ遺伝子の少なくとも部分を含むゲノム配列、又はＲＳ１、ＲＬ２、及び／若しくはＬＡＴ遺伝子の少なくとも部分を含む複数のゲノム配列を欠失すること（例えば、ＮＨＥＪ媒介性欠失）を含む。ある特定の実施態様では、本方法は、２つの二本鎖切断を、１つは、ＨＳＶ ＲＳ１標的ノックアウト位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的ノックアウト位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックアウト位置の５’に（つまり、隣接して）及び他方は３’に導入することを含む。ある特定の実施態様では、２つのｇＲＮＡ、例えば単分子（若しくはキメラ）又はモジュール型ｇＲＮＡ分子は、２つの二本鎖切断を、ＲＬ２遺伝子のＨＳＶ ＲＬ２標的ノックアウト位置の反対側に配置するように構成されている。ある特定の実施態様では、２つのｇＲＮＡ、例えば単分子（若しくはキメラ）又はモジュール型ｇＲＮＡ分子は、２つの二本鎖切断を、ＬＡＴ遺伝子のＨＳＶ ＬＡＴ標的ノックアウト位置の反対側に配置するように構成されている。ある特定の実施態様では、２つのｇＲＮＡ、例えば単分子（若しくはキメラ）又はモジュール型ｇＲＮＡ分子は、２つの二本鎖切断を、ＲＳ１遺伝子のＨＳＶ ＲＳ１標的ノックアウト位置の反対側に配置するように構成されている。

【0272】

４．３． 酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質により媒介される、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数のノックダウン
標的化ノックダウン手法により、機能性ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子産物の発現が低減又は消失される。本明細書に記載されているように、ある特定の実施態様では、標的化ノックダウンは、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子又はｅｉＣａｓ９－融合タンパク質（例えば、転写リプレッサードメイン又はクロマチン修飾タンパク質と融合されたｅｉＣａｓ９）が、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の１つ、２つ、又は３つを標的とすることにより媒介される。

【0273】

本明細書で考察されている方法及び組成物を使用し、転写調節領域、例えば、プロモーター領域（例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及びＬＡＴ遺伝子の一又は複数の転写を調節するプロモーター領域）を標的とすることにより、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数の発現を変更して、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症を治療又は予防することができる。ある特定の実施態様では、プロモーター領域を標的として、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数の発現をノックダウンする。標的化ノックダウン手法により、機能性ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子産物の発現が低減又は消失される。

【0274】

ある特定の実施態様では、一又は複数のｅｉＣａｓ９ｓを使用して、一又は複数の内因性転写因子の結合をブロックすることができる。ある特定の実施態様では、ｅｉＣａｓ９を、クロマチン修飾タンパク質に融合させてもよい。クロマチンの状態を変更することにより、標的遺伝子の発現の減少がもたらされる場合がある。一又は複数のクロマチン修飾タンパク質に融合されている一又は複数のｅｉＣａｓ９ｓを使用して、クロマチンの状態を変更することができる。

【0275】

ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数の発現のｅｉＣａｓ９媒介性低減は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ ＲＮＡの転写の低減及び／又は停止を引き起こす。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数の発現のｅｉＣａｓ９媒介性低減は、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子によりコードされているＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２タンパク質、例えば、ＩＣＰ０タンパク質及び／又はＬＡＴタンパク質及び／又は転写制御因子ＩＣＰ４タンパク質の翻訳の低減及び／又は停止に結び付く。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数の発現のｅｉＣａｓ９媒介性低減は、以下のいずれかを、単独で又は組合せでもたらす：ＨＳＶ ＤＮＡ産生の減少、ＨＳＶ排出の減少、ＨＳＶ複製の減少、ウイルス感染力の低下、ウイルス粒子パッケージングの減少、ウイルスタンパク質、例えばＩＣＰ０タンパク質、例えば転写制御因子ＩＣＰ４タンパク質の産生の減少。

【0276】

ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数のノックダウンは、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症を治癒する。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数のノックダウンは、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症の機能的治癒に結び付く。ある特定の実施態様では、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一又は複数のノックダウンは、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２感染症に対する持続的ウイルス応答に結び付く。急性発症中の標的化ノックダウン手法は、ウイルス排出、複製を減少させることができ、それは、炎症減少に結び付き、眼に対する損傷を減少させることができる。ある特定の実施態様では、ｅｉＣａｓ９分子は、本明細書に開示されているようなＣａｓ９変異体であってもよい。例えば、限定ではないが、Ｃａｓ９変異体は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよく、又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９変異体であってもよい。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様では、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体は、ＶＲＥＲ変異体である。

【0277】

５．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
ｇＲＮＡ分子は、この用語が本明細書で使用される場合、標的核酸と複合体を形成するｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子の特異的標的指向性又は誘導性を容易にする核酸を指す。ｇＲＮＡ分子は、単分子（単一ＲＮＡ分子を有する）（例えば、キメラ）であってもよく、又はモジュール型（１つよりも多くの、典型的には２つの別々のＲＮＡ分子）であってもよい。本明細書で提供されているｇＲＮＡ分子は、標的ドメイン（「標的配列」とも呼ばれる）と完全に又は部分的に相補的な核酸配列を含むか、からなるか、又はから本質的になる標的指向性ドメインを含む。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、第１の相補性ドメイン、連結ドメイン、第２の相補性ドメイン、近位ドメイン、尾部ドメイン、及び５’伸長ドメインを含む、一又は複数の追加のドメインをさらに含む。これらドメインの各々は、下記で詳細に考察されている。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子のドメインの一又は複数は、例えば化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、又はＳ．サーモフィルスに由来する天然配列と同一であるか又は配列相同性を共有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子のドメインの一又は複数は、例えば化膿レンサ球菌又は黄色ブドウ球菌に由来する天然配列と同一であるか又は配列相同性を共有するヌクレオチド配列を含む。

【0278】

いくつかの例示的なｇＲＮＡ構造は、図１Ａ－１Ｉに提供されている。ｇＲＮＡの三次元形態、又は活性形態の鎖内若しくは鎖間相互作用に関して、相補性の高い領域は、図１Ａ－１Ｉ及び本明細書で提供されている他の図では、二本鎖として示されることがある。図７には、ｇＲＮＡドメイン用語体系が、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来領域に１つのヘアーピンループを含む配列番号４２のｇＲＮＡ配列を使用して説明されている。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡは、この領域に、１つよりも多くの（例えば、２つ、３つ、又はそれよりも多くの）ヘアーピンループを含んでいてもよい（例えば、図１Ｈ－１Ｉを参照）。

【0279】

ある特定の実施態様では、単分子又はキメラｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’に向かって、
ＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１遺伝子の標的ドメインに相補的な標的指向性ドメイン、例えば、配列番号２０８－５８７４９から選択されるヌクレオチド配列を含む標的指向性ドメイン、
第１の相補性ドメイン、
連結ドメイン、
第２の相補性ドメイン（第１の相補性ドメインと相補的である）、
近位ドメイン、及び
任意選択的に尾部ドメイン
を含む。

【0280】

ある特定の実施態様では、モジュール型ｇＲＮＡは、
好ましくは、５’から３’に向かって、
ＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１遺伝子の標的ドメインに相補的な標的指向性ドメイン、例えば、配列番号２０８－５８７４９から選択されるヌクレオチド配列を含む標的指向性ドメイン、及び
第１の相補性ドメインを含む第１の鎖；並びに
好ましくは、５’から３’に向かって、
任意選択的に５’伸長ドメイン、
第２の相補性ドメイン、
近位ドメイン、及び
任意選択的に尾部ドメインを含む第２の鎖
を含む。

【0281】

５．１ 標的指向性ドメイン
標的指向性ドメイン（ガイド配列とも呼ばれることがある）は、ＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１遺伝子の標的核酸配列に相補的であるか又は部分的に相補的である核酸配列を含むか、からなるか、又はから本質的になる。標的指向性ドメインの全て又は部分が相補的であるか又は部分的に相補的であるＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１遺伝子の核酸配列は、本明細書では標的ドメインと呼ばれる。

【0282】

標的指向性ドメインを選択するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Fu 2014; Sternberg 2014を参照）。本明細書に記載の方法、組成物、及びキットに使用するための好適な標的指向性ドメインの例は、配列番号２０８－５８７４９に示されているヌクレオチド配列を含む。

【0283】

標的ドメインを含む標的核酸の鎖は、標的指向性ドメイン配列に相補的であるため、本明細書では相補鎖と呼ばれる。標的指向性ドメインは、ｇＲＮＡ分子の一部であるため、チミン（Ｔ）ではなくウラシル（Ｕ）塩基を含むが、ｇＲＮＡ分子をコードするあらゆるＤＮＡ分子は、ウラシルではなくチミンを含んでいてもよい。標的指向性ドメイン／標的ドメイン対では、標的指向性ドメインのウラシル塩基は、標的ドメインのアデニン塩基と対を形成することになる。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインと標的ドメインとの相補性の程度は、Ｃａｓ９分子が標的核酸を標的とすることを可能にするのに十分である。

【0284】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、コアドメイン及び任意選択的な二次的ドメインを含む。これら実施態様のある特定の態様では、コアドメインは、二次的ドメインの３’側に位置し、これら実施態様のある特定の態様では、コアドメインは、標的指向性ドメインの３’末端に又は近くに位置する。これら実施態様のある特定の態様では、コアドメインは、標的指向性ドメインの３’末端にある約８－約１３個のヌクレオチドからなるか又はから本質的になる。ある特定の実施態様では、コアドメインのみが、標的ドメインの対応する部分に相補的であるか又は部分的に相補的であり、これら実施態様のある特定の態様では、コアドメインは、標的ドメインの対応する部分と完全に相補的である。ある特定の実施態様では、二次的ドメインも、標的ドメインの部分に相補的であるか又は部分的に相補的である。ある特定の実施態様では、コアドメインは、標的ドメインのコアドメイン標的に相補的であるか又は部分的に相補的であり、二次的ドメインは、標的ドメインの二次的ドメイン標的に相補的であるか又は部分的に相補的である。ある特定の実施態様では、コアドメイン及び二次的ドメインは、標的ドメインのそれぞれの対応する部分と同じ程度の相補性を有する。ある特定の実施態様では、コアドメインとその標的との相補性の程度、及び二次的ドメインとその標的との相補性の程度は異なっていてもよい。これら実施態様のある特定の態様では、コアドメインは、二次的ドメインよりもその標的との相補性の程度が高くてもよく、他の態様では、二次的ドメインは、コアドメインよりも高い相補性の程度を有していてもよい。

【0285】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン及び／又は標的指向性ドメイン内のコアドメインは、長さが３－１００、５－１００、１０－１００、又は２０－１００個のヌクレオチドであり、これら実施態様のある特定の態様では、標的指向性ドメイン又はコアドメインは、長さが、３－１５、３－２０、５－２０、１０－２０、１５－２０、５－５０、１０－５０、又は２０－５０個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン及び／又は標的指向性ドメイン内のコアドメインは、長さが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン及び／又は標的指向性ドメイン内のコアドメインは、長さが、６＋／－２、７＋／－２、８＋／－２、９＋／－２、１０＋／－２、１０＋／－４、１０＋／－５、１１＋／－２、１２＋／－２、１３＋／－２、１４＋／－２、１５＋／－２、又は１６＋－２、２０＋／－５、３０＋／－５、４０＋／－５、５０＋／－５、６０＋／－５、７０＋／－５、８０＋／－５、９０＋／－５、又は１００＋／－５個のヌクレオチドである。

【0286】

標的指向性ドメインがコアドメインを含む、ある特定の実施態様では、コアドメインは、長さが、３－２０個のヌクレオチドであり、これら実施態様のある特定の態様では、コアドメインは、長さが、５－１５又は８－１３個のヌクレオチドである。標的指向性ドメインが二次的ドメインを含む、ある特定の実施態様では、二次的ドメインは、長さが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のヌクレオチドである。標的指向性ドメインが、長さが８－１３個のヌクレオチドであるコアドメインを含む、ある特定の実施態様では、それぞれ、標的指向性ドメインは、長さが、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、又は１６個のヌクレオチドであり、二次的ドメインは、長さが、１３－１８、１２－１７、１１－１６、１０－１５、９－１４、８－１３、７－１２、６－１１、５－１０、４－９、又は３－８個のヌクレオチドである。

【0287】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと完全に相補的である。同様に、標的指向性ドメインがコアドメイン及び／又は二次的ドメインを含む場合、ある特定の実施態様では、コアドメイン及び二次的ドメインの一方又は両方は、標的ドメインの対応する部分と完全に相補的である。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと部分的に相補的であり、標的指向性ドメインがコアドメイン及び／又は二次的ドメインを含むこれら実施態様のある特定の態様では、コアドメイン及び二次的ドメインの一方又は両方は、標的ドメインの対応する部分と部分的に相補的である。これら実施態様のある特定の態様では、標的指向性ドメイン又は標的指向性ドメイン内のコアドメイン若しくは標的指向性ドメインの核酸配列は、標的ドメインと、又は標的ドメインの対応する部分と、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％相補的である。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン及び／又は標的指向性ドメイン内のコア若しくは二次的ドメインは、標的ドメイン又はその部分と相補的でない一又は複数のヌクレオチドを含み、これら実施態様のある特定の態様では、標的指向性ドメイン及び／又は標的指向性ドメイン内のコア若しくは二次的ドメインは、標的ドメインと相補的ではない１、２、３、４、５、６、７、又は８個のヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様では、コアドメインは、標的ドメインの対応する部分と相補的ではない１、２、３、４、又は５個のヌクレオチドを含む。標的指向性ドメインが、標的ドメインと相補的ではない一又は複数のヌクレオチドを含む、ある特定の実施態様では、上記非相補性ヌクレオチドの一又は複数は、標的指向性ドメインの５’又は３’末端の５個ヌクレオチド以内に位置する。これら実施態様のある特定の態様では、標的指向性ドメインは、その５’末端、３’末端、又はその５’及び３’末端の両方の５個ヌクレオチド以内に、標的ドメインと相補的ではない１、２、３、４、又は５個ヌクレオチドを含む。標的指向性ドメインが、標的ドメインと相補的ではない２つ又はそれよりも多くのヌクレオチドを含む、ある特定の実施態様では、上記非相補性ヌクレオチドの２つ又はそれよりも多くは、互いに隣接しており、これら実施態様のある特定の態様では、２つ又はそれよりも多くの連続する非相補性ヌクレオチドは、標的指向性ドメインの５’又は３’末端の５個ヌクレオチド以内に位置する。ある特定の実施態様では、２つ又はそれよりも多くの連続する非相補性ヌクレオチドは両方とも、標的指向性ドメインの５’又は３’末端から５個ヌクレオチドよりも遠くに位置する。

【0288】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン、コアドメイン、及び／又は二次的ドメインは、一切の修飾を含まない。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン、コアドメイン、及び／又は二次的ドメイン、又はそれらの中の一若しくは複数のヌクレオチドは、これらに限定されないが、下記に示されている修飾を含む修飾を有する。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン、コアドメイン、及び／又は二次的ドメインの一又は複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボースの２’位における修飾）、例えば、２－アセチル化、例えば２’メチル化を含んでいてもよい。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾されていてもよい。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン、コアドメイン、及び／又は二次的ドメインの一又は複数のヌクレオチドの修飾は、標的指向性ドメイン及び／又は標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡを、より分解され難くするか、又はより生体適合にする、例えば、免疫原性を低下させる。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン及び／又はコア若しくは二次的ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ、又はそれよりも多くの修飾を含み、これら実施態様のある特定の態様では、標的指向性ドメイン及び／又はコア若しくは二次的ドメインは、それらのそれぞれの５’末端の５個ヌクレオチド以内に、１、２、３、又は４つの修飾、及び／又はそれらのそれぞれの３’末端の５個ヌクレオチド以内に、１、２、３、又は４つの修飾を含む。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメイン及び／又はコア若しくは二次的ドメインは、２つ又はそれよりも多くの連続するヌクレオチドに修飾を含む。

【0289】

標的指向性ドメインがコア及び二次的ドメインを含む、ある特定の実施態様では、コア及び二次的ドメインは、同数の修飾を含む。これら実施態様のある特定の態様では、両ドメインは修飾を含まない。他の実施態様では、コアドメインは、二次的ドメインよりも多くの修飾を含むか、又はその逆である。

【0290】

ある特定の実施態様では、コア又は二次的ドメイン内を含む、標的指向性ドメイン内の一又は複数のヌクレオチドの修飾は、標的指向性効果を妨害しないように選択される。それは、下記に示されているような系を使用して修飾候補を試験することにより評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、又は修飾の程度を有する標的指向性ドメイン候補を有するｇＲＮＡを、下記に示されているような系を使用して評価することができる。標的指向性ドメイン候補を、単独で又は一若しくは複数の他の変化候補と共にのいずれかで、選択した標的と共に機能することが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子系に配置し、評価することができる。

【0291】

ある特定の実施態様では、修飾ヌクレオチドの全てが、標的ドメインに存在する対応するヌクレオチドと相補的であり、ハイブリダイズすることが可能である。ある特定の実施態様では、１、２、３、４、５、６、７、又は８個、又はそれよりも多くの修飾ヌクレオチドは、標的ドメインに存在する対応するヌクレオチドに相補的でなく、又はハイブリダイズすることが可能でない。

【0292】

５．２ 第１及び第２の相補性ドメイン
第１及び第２の相補性（それぞれ、ｃｒＲＮＡ由来ヘアピン配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ由来ヘアピン配列とも呼ばれることがある）ドメインは、互いに完全に又は部分的に相補的である。ある特定の実施態様では、相補性の程度は、２つのドメインが、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するのに十分である。ある特定の実施態様では、第１の相補性ドメインと第２の相補性ドメインとの相補性の程度は、ｇＲＮＡの他の特性と併せて、Ｃａｓ９分子が標的核酸を標的とすることを可能にするのに十分である。第１及び第２の相補的ドメインの例は、図１Ａ－１Ｇに示されている。

【0293】

ある特定の実施態様では（例えば、図１Ａ－１Ｂを参照）、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、対応する相補性ドメインとの相補性を欠如する一又は複数のヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、対応する相補性ドメインとの相補性を有していない１、２、３、４、５、又は６個のヌクレオチドを含む。例えば、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドと対を形成しない１、２、３、４、５、又は６個のヌクレオチドを含んでいてもよい。ある特定の実施態様では、対応する相補性ドメインと相補的でない第１又は第２の相補性ドメインのヌクレオチドは、第１の相補性ドメインと第２の相補性ドメインとの間で形成される二本鎖からループアウトする。これら実施態様のある特定の態様では、非対合ループアウトは、第２の相補性ドメインに位置し、これら実施態様のある特定の態様では、非対合領域は、第２の相補性ドメインの５’末端から１、２、３、４、５、又は６個のヌクレオチドから始まる。

【0294】

ある特定の実施態様では、第１の相補性ドメインは、長さが、５－３０、５－２５、７－２５、５－２４、５－２３、７－２２、５－２２、５－２１、５－２０、７－１８、７－１５、９－１６、又は１０－１４個のヌクレオチドであり、これら実施態様のある特定の態様では、第１の相補性ドメインは、長さが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、第２の相補性ドメインは、長さが、５－２７、７－２７、７－２５、５－２４、５－２３、５－２２、５－２１、７－２０、５－２０、７－１８、７－１７、９－１６、又は１０－１４個のヌクレオチドであり、これら実施態様のある特定の態様では、第２の相補性ドメインは、長さが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、第１及び第２の相補性ドメインは、各々独立して、長さが、６＋／－２、７＋／－２、８＋／－２、９＋／－２、１０＋／－２、１１＋／－２、１２＋／－２、１３＋／－２、１４＋／－２、１５＋／－２、１６＋／－２、１７＋／－２、１８＋／－２、１９＋／－２、又は２０＋／－２、２１＋／－２、２２＋／－２、２３＋／－２、又は２４＋／－２個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインよりも長く、例えば、２、３、４、５、又は６個のヌクレオチドだけ長い。

【0295】

ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、各々独立して、３つのサブドメイン：５’から３’方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、及び３’サブドメインを含む。ある特定の実施態様では、第１の相補性ドメインの５’サブドメイン及び３’サブドメインは、それぞれ、第２の相補性ドメインの３’サブドメイン及び５’サブドメインと完全に又は部分的に相補的である。

【0296】

ある特定の実施態様では、第１の相補性ドメインの５’サブドメインは、長さが４－９個のヌクレオチドであり、これら実施態様のある特定の態様では、５’ドメインは、長さが４、５、６、７、８、又は９個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、第２の相補性ドメインの５’ドメインは、長さが、３－２５、４－２２、４－１８、又は４－１０個のヌクレオチドであり、これら実施態様のある特定の態様では、５’ドメインは、長さが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、第１の相補性ドメインの中央サブドメインは、長さが１、２、又は３個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、第２の相補性ドメインの中央サブドメインは、長さが１、２、３、４、又は５個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、第１の相補性ドメインの３’ドメインは、長さが、３－２５、４－２２、４－１８、又は４－１０個のヌクレオチドであり、これら実施態様のある特定の態様では、３’ドメインは、長さが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、第２の相補性ドメインの３’サブドメインは、長さが４－９個、例えば、４、５、６、７、８、又は９個のヌクレオチドである。

【0297】

第１及び／又は第２の相補性ドメインは、天然若しくは基準の第１及び／若しくは第２の相補性ドメインと相同性を共有していてもよく、又は天然若しくは基準の第１及び／若しくは第２の相補性ドメインに由来していてもよい。これら実施態様のある特定の態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、天然若しくは基準の第１及び／若しくは第２の相補性ドメインと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、若しくは約９５％の相同性を有しているか、又は１、２、３、４、５、若しくは６個以下のヌクレオチドが、天然若しくは基準の第１及び／若しくは第２の相補性ドメインと異なる。これら実施態様のある特定の態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、化膿レンサ球菌又は黄色ブドウ球菌に由来する第１及び／又は第２の相補性ドメインと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％相同性を有していてもよい。

【0298】

ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、一切の修飾を含んでいない。他の実施態様では、第１及び／若しくは第２の相補性ドメイン又はその中の一若しくは複数のヌクレオチドは、これらに限定されないが、下記に示されている修飾を含む修飾を有する。ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインの一又は複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボースの２’位における修飾）、例えば、２－アセチル化、例えば２’メチル化を含んでいてもよい。ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾されていてもよい。ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインの一又は複数のヌクレオチドの修飾は、第１及び／若しくは第２の相補性ドメイン又は第１及び／若しくは第２の相補性ドメインを含むｇＲＮＡを、より分解され難くするか、又はより生体適合にする、例えば、免疫原性を低下させる。ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、各々独立して、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ、又はそれよりも多くの修飾を含み、これら実施態様のある特定の態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、各々独立して、それらのそれぞれの５’末端、３’末端、又はそれらの５’及び３’末端の両方の５個ヌクレオチド以内に、１、２、３、又は４つの修飾を含む。ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、各々独立して、それらのそれぞれの５’末端、３’末端、又はそれらの５’及び３’末端の両方の５個ヌクレオチド以内に修飾を含まない。ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインは、２つ又はそれよりも多くの連続するヌクレオチドに修飾を含む。

【0299】

ある特定の実施態様では、第１及び／又は第２の相補性ドメインの一又は複数のヌクレオチドの修飾は、標的指向性効果を妨害しないように選択される。それは、下記に示されているような系で修飾候補を試験することにより評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、又は修飾の程度を有する第１及び／又は第２の相補性ドメイン候補を有するｇＲＮＡを、下記に示されているような系で評価することができる。相補性ドメイン候補を、単独で又は一若しくは複数の他の変化候補と共にのいずれかで、選択した標的と共に機能することが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子系に配置し、評価することができる。

【0300】

ある特定の実施態様では、第１及び第２の相補性ドメインにより形成される二本鎖領域は、長さが、あらゆるループアウト又は非対合ヌクレオチドは除外して、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ｂｐである。

【0301】

ある特定の実施態様では、第１及び第２の相補性ドメインは、二本鎖になると、１１対のヌクレオチドを含む（例えば、配列番号４８のｇＲＮＡを参照）。ある特定の実施態様では、第１及び第２の相補性ドメインは、二本鎖になると、１５対のヌクレオチドを含む（例えば、配列番号５０のｇＲＮＡを参照）。ある特定の実施態様では、第１及び第２の相補性ドメインは、二本鎖になると、１６対のヌクレオチドを含む（例えば、配列番号５１のｇＲＮＡを参照）。ある特定の実施態様では、第１及び第２の相補性ドメインは、二本鎖になると、２１対のヌクレオチドを含む（例えば、配列番号２９のｇＲＮＡを参照）。

【0302】

ある特定の実施態様では、一又は複数のヌクレオチドを、第１の相補性ドメインと第２の相補性ドメインとの間で交換して、ポリＵ配列を除去する。例えば、配列番号４８のｇＲＮＡのヌクレオチド２３及び４８又はヌクレオチド２６及び４５を交換して、それぞれ配列番号４９又は３１のｇＲＮＡを生成してもよい。同様に、配列番号２９のｇＲＮＡのヌクレオチド２３及び３９を、ヌクレオチド５０及び６８と交換して、配列番号３０のｇＲＮＡを生成してもよい。

【0303】

５．３ 連結ドメイン
連結ドメインは、単分子又はキメラｇＲＮＡの第１の相補性ドメインと第２の相補性ドメインとの間に配置されており、それらを連結する役目を果たす。図１Ｂ－１Ｅには、連結ドメインの例が提供されている。ある特定の実施態様では、連結ドメインの一部は、ｃｒＲＮＡ由来領域に由来し、別の一部は、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来領域に由来する。

【0304】

ある特定の実施態様では、連結ドメインは、第１及び第２の相補性ドメインを共有結合で連結する。これら実施態様のある特定の態様では、連結ドメインは、共有結合からなるか又は共有結合を含む。ある特定の実施態様では、連結ドメインは、第１及び第２の相補性ドメインを非共有結合で連結する。ある特定の実施態様では、連結ドメインは、長さが、１０個又はそれよりも少数のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドである。他の実施態様では、連結ドメインは、長さが、１０個よりも多くのヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個、又はそれよりも多くのヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、連結ドメインは、長さが、２－５０、２－４０、２－３０、２－２０、２－１０、２－５、１０－１００、１０－９０、１０－８０、１０－７０、１０－６０、１０－５０、１０－４０、１０－３０、１０－２０、１０－１５、２０－１００、２０－９０、２０－８０、２０－７０、２０－６０、２０－５０、２０－４０、２０－３０、又は２０－２５個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、連結ドメインは、長さが、１０＋／－５、２０＋／－５、２０＋／－１０、３０＋／－５、３０＋／－１０、４０＋／－５、４０＋／－１０、５０＋／－５、５０＋／－１０、６０＋／－５、６０＋／－１０、７０＋／－５、７０＋／－１０、８０＋／－５、８０＋／－１０、９０＋／－５、９０＋／－１０、１００＋／－５、又は１００＋／－１０個のヌクレオチドである。

【0305】

ある特定の実施態様では、連結ドメインは、天然配列、例えば、第２の相補性ドメインの５’にあるｔｒａｃｒＲＮＡの配列と相同性を共有するか又は由来する。ある特定の実施態様では、連結ドメインは、本明細書に開示されている連結ドメイン、例えば、図１Ｂ－１Ｅの連結ドメインと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９５％相同性を有するか、又は１、２、３、４、５、又は６個以下のヌクレオチドが異なる。

【0306】

ある特定の実施態様では、連結ドメインは一切の修飾を含まない。他の実施態様では、連結ドメイン又はその中の一若しくは複数のヌクレオチドは、これらに限定されないが、下記に示されている修飾を含む修飾を有する。ある特定の実施態様では、連結ドメインの一又は複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボースの２’位における修飾）、例えば、２－アセチル化、例えば２’メチル化を含んでいてもよい。ある特定の実施態様では、連結ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾されていてもよい。ある特定の実施態様では、連結ドメインの一又は複数のヌクレオチドの修飾は、連結ドメイン及び／又は連結ドメインを含むｇＲＮＡを、より分解され難くするか、又はより生体適合にする、例えば、免疫原性を低下させる。ある特定の実施態様では、連結ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８つ、又はそれよりも多くの修飾を含み、これら実施態様のある特定の態様では、連結ドメインは、その５’及び／又は３’末端の５個ヌクレオチド以内に、１、２、３、又は４つの修飾を含む。ある特定の実施態様では、連結ドメインは、２つ又はそれよりも多くの連続するヌクレオチドに修飾を含む。

【0307】

ある特定の実施態様では、連結ドメインの一又は複数のヌクレオチドの修飾は、標的指向性効果を妨害しないように選択される。それは、下記に示されているような系で修飾候補を試験することにより評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、又は修飾の程度を有する連結ドメイン候補を有するｇＲＮＡを、下記に示されているような系で評価することができる。連結ドメイン候補を、単独で又は一若しくは複数の他の変化候補と共にのいずれかで、選択した標的と共に機能することが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子系に配置し、評価することができる。

【0308】

ある特定の実施態様では、連結ドメインは、二本鎖領域を、典型的には、第１の相補性ドメインの３’末端及び／又は第２の相補性ドメインの５’末端に隣接して、又はその１、２、若しくは３個ヌクレオチド以内に含む。これら実施態様のある特定の態様では、連結領域の二本鎖領域は、長さが、１０＋／－５、１５＋／－５、２０＋／－５、２０＋／－１０、又は３０＋／－５ｂｐである。ある特定の実施態様では、連結ドメインの二本鎖領域は、長さが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ｂｐである。ある特定の実施態様では、連結ドメインの二本鎖領域を形成する配列は、完全に相補性である。他の実施態様では、二本鎖領域を形成する配列の一方又は両方は、もう一方の二本鎖配列と相補的でない一又は複数のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のヌクレオチド）を含む。

【0309】

５．４ ５’伸長ドメイン
ある特定の実施態様では、本明細書で開示されているようなモジュール型ｇＲＮＡは、５’伸長ドメイン、つまり、第２の相補性ドメインの５’に一又は複数の追加のヌクレオチドを含む（例えば、図１Ａを参照）。ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインは、長さが、２－１０個若しくはそれよりも多くの、２－９、２－８、２－７、２－６、２－５、又は２－４個のヌクレオチドであり、これら実施態様のある特定の態様では、５’伸長ドメインは、長さが、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個、又はそれよりも多くのヌクレオチドである。

【0310】

ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインヌクレオチドは、修飾、例えば、下記に提供されているタイプの修飾を含まない。しかしながら、ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインは、一又は複数の修飾、例えば、より分解を受け難くするか、又はより生体適合にする、例えば、免疫原性を低下させる修飾を含む。例として、５’伸長ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、又は下記に示されているような他の修飾で修飾することができる。ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインのヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボースの２’位における修飾）、例えば、２－アセチル化、例えば２’メチル化、又は下記に示されているような他の修飾を含んでいてもよい。

【0311】

ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、又は８つもの修飾を含むことができる。ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュール型ｇＲＮＡ分子では、その５’末端の５個ヌクレオチド以内に、１、２、３、又は４つもの修飾を含む。ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュール型ｇＲＮＡ分子では、その３’末端の５個ヌクレオチド以内に、１、２、３、又は４つもの修飾を含む。

【0312】

ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインは、２つの連続するヌクレオチドに、例えば、５’伸長ドメインの５’末端の５個ヌクレオチド以内であるか、５’伸長ドメインの３’末端の５個ヌクレオチド以内であるか、又は５’伸長ドメインの一方の若しくは両方の末端から５個ヌクレオチド若しくはそれよりも離れている２つの連続するヌクレオチドに修飾を含む。ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインの５’末端の５個ヌクレオチド以内、５’伸長ドメインの３’末端の５個ヌクレオチド以内、又は５’伸長ドメインの一方の若しくは両方の末端から５個ヌクレオチド若しくはそれよりも離れている領域内で、どの連続する２つのヌクレオチドも修飾されていない。ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインの５’末端の５個ヌクレオチド以内、５’伸長ドメインの３’末端の５個ヌクレオチド以内、又は５’伸長ドメインの一方の若しくは両方の末端から５個ヌクレオチド若しくはそれよりも離れている領域内で、どのヌクレオチドも修飾されていない。

【0313】

５’伸長ドメインの修飾は、ｇＲＮＡ分子効果を妨害しないように選択することができる。それは、下記に示されているような系で修飾候補を試験するにより評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、又は修飾の程度を有する５’伸長ドメイン候補を有するｇＲＮＡを、下記に示されているような系で評価することができる。５’伸長ドメイン候補を、単独で又は一若しくは複数の他の変化候補と共にのいずれかで、選択した標的と共に機能することが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子系に配置し、評価することができる。

【0314】

ある特定の実施態様では、５’伸長ドメインは、基準の５’伸長ドメイン、例えば、天然の、例えば、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、若しくはＳ．サーモフィルスの５’伸長ドメイン、又は本明細書に記載の、例えば、図１Ａ－１Ｇの５’伸長ドメインと、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、若しくは約９５％相同性を有するか、又は１、２、３、４、５、若しくは６個以下のヌクレオチドが異なる。

【0315】

５．５ 近位ドメイン
図１Ａ－１Ｇには、近位ドメインの例が提供されている。

【0316】

ある特定の実施態様では、近位ドメインは、長さが、５－２０個又はそれよりも多くのヌクレオチドであり、例えば、長さが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のヌクレオチドである。これら実施態様のある特定の態様では、近位ドメインは、長さが、６＋／－２、７＋／－２、８＋／－２、９＋／－２、１０＋／－２、１１＋／－２、１２＋／－２、１３＋／－２、１４＋／－２、１４＋／－２、１６＋／－２、１７＋／－２、１８＋／－２、１９＋／－２、又は２０＋／－２個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、近位ドメインは、長さが、５－２０、７－１８、９－１６、又は１０－１４個のヌクレオチドである。

【0317】

ある特定の実施態様では、近位ドメインは、天然の近位ドメインと相同性を共有していてもよく、又は天然の近位ドメインに由来していてもよい。これら実施態様のある特定の態様では、近位ドメインは、本明細書に開示されている近位ドメイン、例えば、図１Ａ－１Ｇに示されているものを含む、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、若しくはＳ．サーモフィルスの近位ドメインと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、若しくは約９５％相同性を有するか、又は１、２、３、４、５、若しくは６個以下のヌクレオチドが異なる。

【0318】

ある特定の実施態様では、近位ドメインは一切の修飾を含まない。他の実施態様では、近位ドメイン又はその中の一若しくは複数のヌクレオチドは、これらに限定されないが、下記に示されている修飾を含む修飾を有する。ある特定の実施態様では、近位ドメインの一又は複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボースの２’位における修飾）、例えば、２－アセチル化、例えば２’メチル化を含んでいてもよい。ある特定の実施態様では、近位ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾されていてもよい。ある特定の実施態様では、近位ドメインの一又は複数のヌクレオチドの修飾は、近位ドメイン及び／又は近位ドメインを含むｇＲＮＡを、より分解され難くするか、又はより生体適合にする、例えば、免疫原性を低下させる。ある特定の実施態様では、近位ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ、又はそれよりも多くの修飾を含み、これら実施態様のある特定の態様では、近位ドメインは、その５’及び／又は３’末端の５個ヌクレオチド以内に、１、２、３、又は４つの修飾を含む。ある特定の実施態様では、近位ドメインは、２つ又はそれよりも多くの連続するヌクレオチドに修飾を含む。

【0319】

ある特定の実施態様では、近位ドメインの一又は複数のヌクレオチドの修飾は、標的指向性効果を妨害しないように選択される。それは、下記に示されているような系で修飾候補を試験することにより評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、又は修飾の程度を有する近位ドメイン候補を有するｇＲＮＡを、下記に示されているような系で評価することができる。近位ドメイン候補を、単独で又は一若しくは複数の他の変化候補と共にのいずれかで、選択した標的と共に機能することが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子系に配置し、評価することができる。

【0320】

５．６ 尾部ドメイン
広範囲の尾部ドメインが、本明細書に開示されているｇＲＮＡ分子での使用に好適である。図１Ａ及び１Ｃ－１Ｇには、そのような尾部ドメインの例が提供されている。

【0321】

ある特定の実施態様では、尾部ドメインは存在しない。他の実施態様では、尾部ドメインは、長さが、１－１００個又はそれよりも多くのヌクレオチドであり、例えば、長さが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、尾部ドメインは、長さが、１－５、１－１０、１－１５、１－２０、１－５０、１０－１００、２０－１００、１０－９０、２０－９０、１０－８０、２０－８０、１０－７０、２０－７０、１０－６０、２０－６０、１０－５０、２０－５０、１０－４０、２０－４０、１０－３０、２０－３０、２０－２５、１０－２０、又は１０－１５個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、尾部ドメインは、長さが、５＋／－５、１０＋／－５、２０＋／－１０、２０＋／－５、２５＋／－１０、３０＋／－１０、３０＋／－５、４０＋／－１０、４０＋／－５、５０＋／－１０、５０＋／－５、６０＋／－１０、６０＋／－５、７０＋／－１０、７０＋／－５、８０＋／－１０、８０＋／－５、９０＋／－１０、９０＋／－５、１００＋／－１０、又は１００＋／－５個のヌクレオチドである。ある特定の実施態様では、尾部ドメインは、天然尾部ドメイン又は天然尾部ドメインの５’末端と相同性を共有していてもよく、又は由来していてもよい。これら実施態様のある特定の態様では、近位ドメインは、本明細書に開示されている尾部ドメイン、例えば、図１Ａ及び１Ｃ－１Ｇに示されているものを含む、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、又はＳ．サーモフィルスの天然尾部ドメインと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、若しくは約９５％相同性を有するか、又は１、２、３、４、５、若しくは６個以下のヌクレオチドが異なる。

【0322】

ある特定の実施態様では、尾部ドメインは、互いに相補的であり、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成する配列を含む。これら実施態様のある特定の態様では、尾部ドメインは、尾部二本鎖領域を形成することができる尾部二本鎖ドメインを含む。ある特定の実施態様では、尾部二本鎖領域は、長さが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ｂｐである。ある特定の実施態様では、尾部ドメインは、尾部二本鎖ドメインの３’に、二本鎖を形成しない一本鎖ドメインを含む。これら実施態様のある特定の態様では、一本鎖ドメインは、長さが、３－１０個のヌクレオチド、例えば、長さが、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又は４－６個のヌクレオチドである。

【0323】

ある特定の実施態様では、尾部ドメインは一切の修飾を含まない。他の実施態様では、尾部ドメイン又はその中の一若しくは複数のヌクレオチドは、これらに限定されないが、下記に示されている修飾を含む修飾を有する。ある特定の実施態様では、尾部ドメインの一又は複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボースの２’位における修飾）、例えば、２－アセチル化、例えば２’メチル化を含んでいてもよい。ある特定の実施態様では、尾部ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾されていてもよい。ある特定の実施態様では、尾部ドメインの一又は複数のヌクレオチドの修飾は、尾部ドメイン及び／又は尾部ドメインを含むｇＲＮＡを、より分解され難くするか、又はより生体適合にする、例えば、免疫原性を低下させる。ある特定の実施態様では、尾部ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ、若しくはそれよりも多くの修飾を含み、これら実施態様のある特定の態様では、尾部ドメインは、その５’及び／又は３’末端の５個ヌクレオチド以内に、１、２、３、又は４つの修飾を含む。ある特定の実施態様では、尾部ドメインは、２つ又はそれよりも多くの連続するヌクレオチドに修飾を含む。

【0324】

ある特定の実施態様では、尾部ドメインの一又は複数のヌクレオチドの修飾は、標的指向性効果を妨害しないように選択される。それは、下記に示されている修飾候補を試験することにより評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、又は修飾の程度を有する尾部ドメイン候補を有するｇＲＮＡを、下記に示されているような系を使用して評価することができる。尾部ドメイン候補を、単独で又は一若しくは複数の他の変化候補と共にのいずれかで、選択した標的と共に機能することが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子系に配置し、評価することができる。

【0325】

ある特定の実施態様では、尾部ドメインは、インビトロ又はインビボでの転写方法と関連するヌクレオチドを３’末端に含む。ｇＲＮＡのインビトロ転写にＴ７プロモーターが使用される場合、これらヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型の３’末端の前に存在する任意のヌクレオチドであってもよい。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子は、ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写することにより調製される３’ポリＡ尾部を含む。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインの５’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドであり、ＤＮＡ鋳型は、標的指向性ドメインに対応する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含み、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドではない。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインの５’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドではなく、ＤＮＡ鋳型は、標的指向性ドメインに対応する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含み、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流にあるグアニンヌクレオチドである。

【0326】

インビボ転写にＵ６プロモーターが使用される場合、これらヌクレオチドは、配列ＵＵＵＵＵＵであってもよい。Ｈ１プロモーターが転写に使用される場合、これらヌクレオチドは、配列ＵＵＵＵであってもよい。別のｐｏｌ－ＩＩＩプロモーターが使用される場合、これらヌクレオチドは、例えばｐｏｌ－ＩＩＩプロモーターの終止シグナルに応じて、種々の数のウラシル塩基であってもよく、又は別の塩基を含んでいてもよい。

【0327】

ある特定の実施態様では、近位及び尾部ドメインは一緒になって、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、又は３７に示されている配列を含むか、からなるか、又はから本質的になる。

【0328】

５．７ 例示的な単分子／キメラｇＲＮＡ
ある特定の実施態様では、本明細書に開示されているようなｇＲＮＡは、構造：５’［標的指向性ドメイン］－［第１の相補性ドメイン］－［連結ドメイン］－［第２の相補性ドメイン］－［近位ドメイン］－［尾部ドメイン］－３’を有し、
標的指向性ドメインは、コアドメイン及び任意選択的に二次的ドメインを含み、長さが１０－５０個のヌクレオチドであり、
第１の相補性ドメインは、長さが５－２５個のヌクレオチドであり、ある特定の実施態様では、本明細書で開示されている基準の第１の相補性ドメインと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％相同性を有し、
連結ドメインは、長さが１－５個のヌクレオチドであり、
第２の相補性ドメインは、長さが５－２７個のヌクレオチドであり、ある特定の実施態様では、本明細書で開示されている基準の第２の相補性ドメインと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％相同性を有し、
近位ドメインは、長さが５－２０個のヌクレオチドであり、ある特定の実施態様では、本明細書で開示されている基準の近位ドメインと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％相同性を有し、
尾部ドメインは存在しないか、又はヌクレオチド配列は、長さが１－５０個のヌクレオチドであり、ある特定の実施態様では、本明細書で開示されている基準の尾部ドメインと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％相同性を有する。

【0329】

ある特定の実施態様では、本明細書で開示されているような単分子ｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’に向かって、
例えば１０－５０個のヌクレオチドを含む標的指向性ドメイン、
例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のヌクレオチドを含む第１の相補性ドメイン、
連結ドメイン、
第２の相補性ドメイン、
近位ドメイン、及び
尾部ドメイン
を含み、
（ａ）近位及び尾部ドメインは、合計で、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含むか、
（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドがあるか、又は
（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドに相補的な、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドがある。

【0330】

ある特定の実施態様では、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の配列は、天然ｇＲＮＡの対応する配列と、又は本明細書に記載のｇＲＮＡと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％相同性を有する。

【0331】

ある特定の実施態様では、近位及び尾部ドメインは、合計で、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0332】

ある特定の実施態様では、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドがある。

【0333】

ある特定の実施態様では、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドがある。

【0334】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメイン又はその部分と相補的な又は部分的に相補的な、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個の連続するヌクレオチド）からなるか、から本質的になるか、又は含み、例えば、標的指向性ドメインは、長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のヌクレオチドである。これら実施態様のある特定の態様では、標的指向性ドメインは、標的指向性ドメインの全長、標的ドメインの全長、又は両方にわたって、標的ドメインと相補的である。

【0335】

ある特定の実施態様では、本明細書で開示されている単分子又はキメラｇＲＮＡ分子（標的指向性ドメイン、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、及び任意選択的に尾部ドメインを含む）は、配列番号４２に示されているアミノ酸配列を含み、標的指向性ドメインは、２０個のＮ（残基１－２０）として列挙されているが、長さは、１６から２６個までのヌクレオチドの範囲であってもよく、最後の６残基（残基９７－１０２）は、Ｕ６プロモーターの終止シグナルであるが、存在していなくともよく、又は数がより少なくてもよい。ある特定の実施態様では、単分子又はキメラｇＲＮＡ分子は、化膿レンサ球菌ｇＲＮＡ分子である。

【0336】

ある特定の実施態様では、本明細書で開示されている単分子又はキメラｇＲＮＡ分子（標的指向性ドメイン、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、及び任意選択的に尾部ドメインを含む）は、配列番号３８に示されているアミノ酸配列を含み、標的指向性ドメインは、２０個のＮ（残基１－２０）として列挙されているが、長さは、１６から２６個までのヌクレオチドの範囲であってもよく、最後の６残基（残基９７－１０２）は、Ｕ６プロモーターの終止シグナルであるが、存在していなくともよく、又は数がより少なくてもよい。ある特定の実施態様では、単分子又はキメラｇＲＮＡ分子は、黄色ブドウ球菌ｇＲＮＡ分子である。

【0337】

例示的キメラｇＲＮＡｓの配列及び構造は、図１Ｈ－１Ｉにも示されている。

【0338】

５．８ 例示的なモジュール型ｇＲＮＡ
ある特定の実施態様では、本明細書で開示されているモジュール型ｇＲＮＡは、
好ましくは、５’から３’に向かって、
例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のヌクレオチドを含む標的指向性ドメイン、
第１の相補性ドメインを含む第１の鎖；並びに
好ましくは、５’から３’に向かって、
任意選択的に５’伸長ドメイン、
第２の相補性ドメイン、
近位ドメイン、及び
尾部ドメインを含む第２の鎖
を含み、
（ａ）近位及び尾部ドメインは、合計で、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含むか、
（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドがあるか、又は
（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドに相補的な、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドがある。

【0339】

ある特定の実施態様では、（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の配列は、天然ｇＲＮＡの対応する配列と、又は本明細書に記載のｇＲＮＡと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％相同性を有する。

【0340】

ある特定の実施態様では、近位及び尾部ドメインは、合計で、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0341】

ある特定の実施態様では、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドがある。ある特定の実施態様では、第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドに相補的な、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドがある。

【0342】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個の連続するヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のヌクレオチドである。

【0343】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメイン又はその部分と相補的な、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個の連続するヌクレオチド）からなるか、から本質的になるか、又は含む。これら実施態様のある特定の態様では、標的指向性ドメインは、標的指向性ドメインの全長、標的ドメインの全長、又は両方にわたって、標的ドメインと相補的である。

【0344】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１６個のヌクレオチド（例えば、１６個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１６個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0345】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１６個のヌクレオチド（例えば、１６個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１６個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0346】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１６個のヌクレオチド（例えば、１６個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１６個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0347】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１７個のヌクレオチド（例えば、１７個の連続ヌクレオチド）を有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１７個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0348】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１７個のヌクレオチド（例えば、１７個の連続ヌクレオチド）を有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１７個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0349】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１７個のヌクレオチド（例えば、１７個の連続ヌクレオチド）を有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１７個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0350】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１８個のヌクレオチド（例えば、１８個の連続ヌクレオチド）を有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１８個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0351】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１８個のヌクレオチド（例えば、１８個の連続ヌクレオチド）を有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１８個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0352】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１８個のヌクレオチド（例えば、１８個の連続ヌクレオチド）を有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１８個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0353】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１９個のヌクレオチド（例えば、１９個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１９個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0354】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１９個のヌクレオチド（例えば、１９個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１９個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0355】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１９個のヌクレオチド（例えば、１９個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが１９個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0356】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２０個のヌクレオチド（例えば、２０個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２０個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0357】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２０個のヌクレオチド（例えば、２０個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２０個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0358】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２０個のヌクレオチド（例えば、２０個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２０個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0359】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２１個のヌクレオチド（例えば、２１個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２１個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0360】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２１個のヌクレオチド（例えば、２１個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２１個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0361】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２１個のヌクレオチド（例えば、２１個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２１個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0362】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２２個のヌクレオチド（例えば、２２個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２２個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0363】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２２個のヌクレオチド（例えば、２２個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２２個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0364】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２２個のヌクレオチド（例えば、２２個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２２個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0365】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２３個のヌクレオチド（例えば、２３個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２３個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0366】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２３個のヌクレオチド（例えば、２３個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２３個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0367】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２３個のヌクレオチド（例えば、２３個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２３個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0368】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２４個のヌクレオチド（例えば、２４個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２４個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0369】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２４個のヌクレオチド（例えば、２４個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２４個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0370】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２４個のヌクレオチド（例えば、２４個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２４個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0371】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２５個のヌクレオチド（例えば、２５個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２５個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0372】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２５個のヌクレオチド（例えば、２５個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２５個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0373】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２５個のヌクレオチド（例えば、２５個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２５個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0374】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２６個のヌクレオチド（例えば、２６個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２６個ヌクレオチドであり、近位及び尾部ドメインは、合計すると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドを含む。

【0375】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２６個のヌクレオチド（例えば、２６個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２６個ヌクレオチドであり、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３個のヌクレオチドが存在する。

【0376】

ある特定の実施態様では、標的指向性ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２６個のヌクレオチド（例えば、２６個の連続ヌクレオチド）を含むか、有するか、又はからなり、例えば、標的指向性ドメインは、長さが２６個ヌクレオチドであり、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４個のヌクレオチドが存在する。

【0377】

５．９ ｇＲＮＡ送達
本明細書で提供されている方法のある特定の実施態様では、本方法は、本明細書に記載のような一又は複数の（例えば、２、３、又は４つの）ｇＲＮＡ分子を送達することを含む。これら実施態様のある特定の態様では、ｇＲＮＡ分子は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は吸入により送達される。ある特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子は、ゲノム編集系のＣａｓ９分子と共に送達される。

【0378】

６． ｇＲＮＡを設計するための方法
本明細書に記載されているｇＲＮＡに使用するための標的指向性ドメインを選択、設計、及び検証するための方法が提供される。また、ｇＲＮＡに組み込むための例示的な標的指向性ドメインが、本明細書で提供されている。

【0379】

標的配列を選択及び検証するための方法並びにオフターゲット分析は、以前に記載されている（例えば、Mali 2013; Hsu 2013; Fu 2014; Heigwer 2014; Bae 2014; Xiao 2014を参照）。例えば、ソフトウェアツールを使用して、ユーザの標的配列に対応する潜在的標的指向性ドメインの選択を最適化し、例えば、ゲノムにわたる総オフターゲット活性を最小限に抑えることができる。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。化膿レンサ球菌Ｃａｓ９を使用して考え得る各標的指向性ドメインを選択する場合、ツールにより、ある特定の個数までの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）ミスマッチ塩基対を含むゲノムにわたるオフターゲット配列（ＮＡＧ又はＮＧＧ ＰＡＭのいずれかに先行する）を全て同定することができる。各オフターゲット配列の切断効率は、例えば、実験的に導出した重み付きスキームを使用して予測することができる。その後、考え得る各標的指向性ドメインを、その総予測オフターゲット切断に応じてランク付けする。上位ランクの標的指向性ドメインは、最大のオンターゲット切断及び最小のオフターゲット切断を有する可能性が高いものである。また、他の機能、例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築用の自動試薬設計、オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用のプライマー設計、及び次世代配列決定法によるオフターゲット切断のハイスループット検出及び定量化用のプライマー設計が、ツールに含まれていてもよい。標的指向性ドメイン候補及びそれら標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡは、当技術分野で公知であるか及び／又は本明細書に示されているような方法を使用して、機能的に評価することができる。

【0380】

非限定的な例として、ＤＮＡ配列探索アルゴリズムを使用して、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、及び髄膜炎菌Ｃａｓ９と共に使用するためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定した。化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌標的の場合、１７量体及び２０量体標的指向性ドメインを設計し、黄色ブドウ球菌標的の場合は、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、及び２４量体標的指向性ドメインを設計した。ｇＲＮＡ設計は、公開ツールｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒ（Bae 2014）に基づく特注ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して実施した。このソフトウェアは、ガイドのゲノムワイドオフターゲット傾向を算出した後、それらに得点を付ける。典型的には、１７から２４個までの長さの範囲のガイドの場合、完全一致から７つのミスマッチまでの範囲の一致が考慮される。オフターゲット部位を計算的決定したら、ウェブインターフェースを使用して、各ガイドの合計スコアを算出し、表形式出力に要約する。ＰＡＭ配列に隣接する潜在的標的部位の同定することに加えて、ソフトウェアは、選択した標的部位と、１、２、３つ、又は３つよりも多くのヌクレオチドが異なる全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。各遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をＵＣＳＣゲノムブラウザから得、公的に入手可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用して、配列を反復エレメントについてスクリーニングした。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復エレメント及び複雑さの低い領域について、入力ＤＮＡ配列を探索する。出力は、所与のクエリー配列に存在する反復に関する詳細な注釈である。

【0381】

同定後、標的指向性ドメインを、標的部位との距離、それらの直交性、及び５’Ｇの存在に基づいて（関連するＰＡＭ、例えば、野生型の化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子の場合は、ＮＧＧ ＰＡＭ；野生型の黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子の場合は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）若しくはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５）ＰＡＭ、又は野生型の髄膜炎菌Ｃａｓ９分子の場合は、ＮＮＮＮＧＡＴＴ若しくはＮＮＮＮＧＣＴＴ ＰＡＭ；化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ ＥＱＲ変異体の場合は、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＮＧＧＧ、ＮＧＴＧ、ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、及びＮＧＡＣからなる群から選択されるＰＡＭ；或いは化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ ＶＲＥＲ変異体の場合は、ＮＧＣＧ、ＮＧＣＡ、ＮＧＣＴ、及びＮＧＣＣからなる群から選択されるＰＡＭを含む、ヒトゲノムにおける類似一致を同定することに基づいて）ティアへとランク付けした。直交性は、標的配列とのミスマッチ数が最少であるヒトゲノムにおける配列の数を指す。「高レベルの直交性」又は「良好な直交性」は、例えば、ヒトゲノムに目的標的の他に同一配列を有しておらず、且つ標的配列に１つ又は２つのミスマッチを含む一切の配列を有していない２０量体標的指向性ドメインを指す場合がある。良好な直交性を有する標的指向性ドメインは、オフターゲットＤＮＡ切断を最小限にするために選択される。

【0382】

標的指向性ドメインは、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断及び二重ｇＲＮＡ対「ニッカーゼ」戦略の両方で同定された。標的指向性ドメインを選択するための、及びどの標的指向性ドメインを二重ｇＲＮＡ対「ニッカーゼ」戦略に使用することができるかを決定するための基準は、以下の２点を考慮することに基づく。
（１）ＰＡＭが外側を向き、Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９ニッカーゼによる切断が、５’オーバーハングをもたらすことができるように、標的指向性ドメイン対がＤＮＡに配向されていること、及び
（２）二重ニッカーゼ対による切断が、妥当な頻度で介在配列全体の欠失をもたらすことになると想定されること。しかしながら、また、二重ニッカーゼ対による切断は、ｇＲＮＡのうちの１つのみの部位にインデル突然変異をもたらす場合もある。対メンバー候補が配列全体を除去する効率の程度を、１つの標的指向性ドメインの標的部位にインデル突然変異が引き起こされることと比較して、試験することができる。

【0383】

６．１ ＨＳＶ－１ ＲＳ１遺伝子のノックアウトに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－１ ＲＳ１遺伝子をノックアウトするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0384】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌では、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であることに基づいて選択した。

【0385】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）であることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0386】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表１に要約されている。

【0387】

６．２ ＨＳＶ－２ ＲＳ１遺伝子のノックアウトに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－２ ＲＳ１遺伝子をノックアウトするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0388】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌では、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であることに基づいて選択した。

【0389】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0390】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表２に要約されている。

【0391】

６．３ ＨＳＶ－１ ＲＬ２遺伝子のノックアウトに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－１ ＲＬ２遺伝子をノックアウトするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0392】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌では、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であることに基づいて選択した。

【0393】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0394】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表３に要約されている。

【0395】

６．４ ＨＳＶ－２ ＲＬ２遺伝子のノックアウトに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－２ ＲＬ２遺伝子をノックアウトするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0396】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌では、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であることに基づいて選択した。

【0397】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、標的部位（例えば、開始コドン）の５００ｂｐ以内（例えば、下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位（例えば、開始コドン）との距離、例えば、コード配列の残り部分以内であること、例えば、コード配列の最初の５００ｂｐの下流（例えば、＋５００（開始コドンに対して）から終止コドンまでの任意の位置）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0398】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表４に要約されている。

【0399】

６．５ ＨＳＶ－１ ＬＡＴイントロンのノックアウトに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－１ ＬＡＴイントロンをノックアウトするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0400】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの残りの部分以内であること、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐの下流であることに基づいて選択した。

【0401】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの残りの部分以内であること、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐの下流であること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの残りの部分以内であること、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐの下流であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの残りの部分以内であること、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐの下流であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0402】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表５に要約されている。

【0403】

６．６ ＨＳＶ－２ ＬＡＴイントロンのノックアウトに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－２ ＬＡＴイントロン遺伝子をノックアウトするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0404】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの残りの部分以内であること、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐの下流であることに基づいて選択した。

【0405】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐ以内であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの残りの部分以内であること、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐの下流であること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの残りの部分以内であること、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐの下流であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、ＬＡＴイントロンの残りの部分以内であること、例えば、ＬＡＴイントロンの最初の５００ｂｐの下流であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0406】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表６に要約されている。

【0407】

６．７ ＨＳＶ－１ ＲＳ１遺伝子のノックダウンに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－１ ＲＳ１遺伝子をノックダウンするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0408】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長することに基づいて選択した。

【0409】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0410】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表７に要約されている。

【0411】

６．８ ＨＳＶ－２ ＲＳ１遺伝子のノックダウンに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－２ ＲＳ１遺伝子をノックダウンするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0412】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、開始コドンの追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、開始コドンの１ｋｂ上流及び下流に伸長することに基づいて選択した。

【0413】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、開始コドンの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、開始コドンの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、開始コドンの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0414】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表８に要約されている。

【0415】

６．９ ＨＳＶ－１ ＲＬ２遺伝子のノックダウンに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－１ ＲＬ２遺伝子をノックダウンするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0416】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長することに基づいて選択した。

【0417】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0418】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表９に要約されている。

【0419】

６．１０ ＨＳＶ－２ ＲＬ２遺伝子のノックダウンに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－２ ＲＬ２遺伝子をノックダウンするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、開始コドンの追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、開始コドンの１ｋｂ上流及び下流に伸長することに基づいて選択した。

【0420】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、開始コドンの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、開始コドンの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、開始コドンの追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、開始コドンの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0421】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表１０に要約されている。

【0422】

６．１１ ＨＳＶ－１ ＬＡＴ遺伝子のノックダウンに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－１ ＬＡＴ遺伝子をノックダウンするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0423】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長することに基づいて選択した。

【0424】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0425】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表１１に要約されている。

【0426】

６．１２ ＨＳＶ－２ ＬＡＴ遺伝子のノックダウンに使用される標的指向性ドメイン
本明細書に開示されている方法を用いてＨＳＶ－２ ＬＡＴ遺伝子をノックダウンするためのｇＲＮＡに使用される標的指向性ドメインを同定し、化膿レンサ球菌では５つのティア、黄色ブドウ球菌では７つのティア、及び髄膜炎菌では５つのティアへとランク付けした。

【0427】

化膿レンサ球菌及び髄膜炎菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）高レベルの直交性に基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）５’Ｇの存在に基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長することに基づいて選択した。

【0428】

黄色ブドウ球菌の場合、ティア１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、及び（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、（２）高レベルの直交性、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア３のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア４のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。ティア５のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、（２）５’Ｇの存在、及び（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア６のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択した。ティア７のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、（１）標的部位との距離、例えば、転写開始点（ＴＳＳ）の追加の５００ｂｐ以内（例えば、上流又は下流）であること、例えば、ＴＳＳの１ｋｂ上流及び下流に伸長すること、及び（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択した。なお、ティアは、非包括的である（各ｇＲＮＡは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づくｇＲＮＡは同定されなかった。

【0429】

なお、ティアは、非包括的である（各標的指向性ドメインは、戦略毎に１回だけ列挙されている）。ある特定の例では、特定のティアの基準に基づく標的指向性ドメインは同定されなかった。同定された標的指向性ドメインは、下記の表１２に要約されている。

【0430】

本明細書に記載されているｇＲＮＡ分子の一又は複数、例えば、表１－１２に記載されている標的指向性ドメインを含むものを、少なくとも１つのＣａｓ９分子（例えば、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子及び／又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子）と共に使用し、一本鎖又は二本鎖切断を形成することができ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用して、一本鎖切断を生成するか、又はＣａｓ９ヌクレアーゼ分子と共に使用して、二本鎖切断を生成することができる。

【0431】

ある特定の実施態様では、単一ｇＲＮＡ分子を使用し、Ｃａｓ９ニッカーゼを標的として、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ標的位置の近傍に一本鎖切断を生成する場合、例えば、このｇＲＮＡは、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ標的位置の上流（例えば、上流５００ｂｐ以内）又は下流（例えば、下流５００ｂｐ以内）のいずれかを標的とするために使用される。

【0432】

ある特定の実施態様では、単一ｇＲＮＡ分子を使用し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的として、ＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１標的位置の近傍に二本鎖切断を生成する場合、例えば、このｇＲＮＡは、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ標的位置の上流（例えば、上流５００ｂｐ以内）又は下流（例えば、下流５００ｂｐ以内）のいずれかを標的とするために使用される。

【0433】

ある特定の実施態様では、２つ又はそれよりも多くの（例えば、３つ又は４つの）ｇＲＮＡ分子を、１つのＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質と共に使用する。ある特定の実施態様では、２つ又はそれよりも多くの（例えば、３つ又は４つの）ｇＲＮＡを、２つ又はそれよりも多くのＣａｓ９分子又はＣａｓ９－融合タンパク質と共に使用する場合、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、他のＣａｓ９分子とは異なる種に由来する。２つのｇＲＮＡが、２つのＣａｓ９分子を標的とするために使用されるように設計されている場合、１つのＣａｓ９は、一方の種であってもよく、第２のＣａｓ９は、異なる種に由来していてもよい。必要に応じて、両方のＣａｓ９種を使用して、一本鎖又は二本鎖切断を生成する。

【0434】

表１－１２に記載されている任意の上流ｇＲＮＡは、表１－１２に記載されている任意の下流ｇＲＮＡと対を形成することができる。一方の種のＣａｓ９と共に使用するために設計されている上流ｇＲＮＡが、異なる種に由来するＣａｓ９と共に使用するために設計されている下流ｇＲＮＡと対を形成する場合、必要に応じて、両方のＣａｓ９種を使用して、一本鎖又は二本鎖切断を生成する。

【0435】

７．Ｃａｓ９分子
本明細書に記載される方法及び組成物において、様々な種のＣａｓ９分子を使用することができる。本明細書における開示の多くはＳ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス及び髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子を対象とするが、本明細書に列挙された他の種のＣａｓ９タンパク質に由来する、又はそれらに基づくＣａｓ９分子も同様に使用することができる。これらとしては、例えば、アシドボラックス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、シクリフィラス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミチイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリーナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラジリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンジダトス・プニセイスピリラム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マツルショッティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロプス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌、メチロシスティス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワージイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナツテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジギイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ビネアエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌラム（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、又はフェルミネフォロバクター・エイセニアエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）からのＣａｓ９分子が挙げられる。

【0436】

７．１ Ｃａｓ９ドメイン
結晶構造は、ガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合体）（Nishimasu 2014；Anders 2014）を用いて、２つの異なる天然細菌のＣａｓ９分子（Jinek 2014）及びＳ．ピオゲネスのＣａｓ９に関して決定された。

【0437】

天然Ｃａｓ９分子は、２つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブ及びヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み、これらのそれぞれは、本明細書に記載されるドメインをさらに含む。図８Ａ－８Ｂは、一次構造での重要なＣａｓ９ドメインの構成の概略図を提供する。この開示にわたり使用される各ドメインに包含されるドメインの名称及びアミノ酸残基の番号付けは、上述した通りである（Nishimasu 2014）。アミノ酸残基の番号付けは、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９を参照してなされている。

【0438】

ＲＥＣローブは、アルギニンリッチの架橋へリックス（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、及びＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣローブは、他の公知のタンパク質と構造的な類似性を共有しておらず、これは、ＲＥＣローブがＣａｓ９特異的な機能性ドメインであることを示す。ＢＨドメインは、長いαへリックスであり、アルギニンリッチな領域であり、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９の配列のアミノ酸６０－９３を含む。ＲＥＣ１ドメインは、リピートの認識：アンチリピート二重鎖、例えばｇＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡの認識にとって重要であり、したがって、標的配列を認識することによるＣａｓ９活性にとって重要である。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９の配列のアミノ酸９４から１７９及び３０８から７１７に、２つのＲＥＣ１モチーフを含む。これらの２つのＲＥＣ１ドメインは、直鎖状の一次構造ではＲＥＣ２ドメインで分離されているが、三次構造にアセンブルされてＲＥＣ１ドメインを形成する。またＲＥＣ２ドメイン又はその部分も、リピート：アンチリピート二重鎖の認識において役割を果たす場合がある。ＲＥＣ２ドメインは、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９の配列のアミノ酸１８０－３０７を含む。

【0439】

ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、及びＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスのインテグラーゼスーパーファミリーメンバーと構造的な類似性を共有しており、一本鎖、例えば標的核酸分子の非相補鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９の配列のそれぞれアミノ酸１－５９、７１８－７６９、及び９０９－１０９８における、３つのスプリットＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩ、これらは、一般的に当該技術分野でＲｕｖＣＩドメイン、又はＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインと称されることが多い）からアセンブルされる。ＲＥＣ１ドメインと類似して、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造では、他のドメインで直線的に分離されているが、しかしながら三次構造では、３つのＲｕｖＣモチーフがアセンブルし、ＲｕｖＣドメインを形成している。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造的な類似性を共有しており、一本鎖、例えば標的核酸分子の相補鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩモチーフとＩＩＩモチーフとの間に存在しており、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９の配列のアミノ酸７７５－９０８を構成する。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用しており、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９の配列のアミノ酸１０９９－１３６８を構成する。

【0440】

７．１．１ ＲｕｖＣ様ドメイン及びＨＮＨ様ドメイン
ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメイン及びＲｕｖＣ様ドメインを含み、これらの実施態様の特定のものにおいて、切断活性は、ＲｕｖＣ様ドメイン及びＨＮＨ様ドメインに依存する。Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ様ドメイン及びＨＮＨ様ドメインの一又は複数を含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ様ドメイン、例えば後述されるＲｕｖＣ様ドメイン、及び／又はＨＮＨ様ドメイン、例えば後述されるＨＮＨ様ドメインを含む。

【0441】

ＲｕｖＣ様ドメイン
ある特定の実施態様において、ＲｕｖＣ様ドメインは、一本鎖、例えば標的核酸分子の非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、１を超えるＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、１、２、３又はそれより多くのＲｕｖＣ様ドメイン）を含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、ＲｕｖＣ様ドメインは、少なくとも５、６、７、８アミノ酸の長さであるが、２０、１９、１８、１７、１６又は１５アミノ酸以下の長さである。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、約１０から２０アミノ酸、例えば約１５アミノ酸の長さのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含む。

【0442】

７．１．２ Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン
いくつかの天然Ｃａｓ９分子は、１を超えるＲｕｖＣ様ドメインを含み、切断は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに依存する。したがって、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでいてもよい。例示的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、後述される。

【0443】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｉ：
Ｄ－Ｘ_１－Ｇ－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｇ－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９（配列番号２０）
［式中、
Ｘ_１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、及びＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、及びＬから選択され）；
Ｘ_２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、及びＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、及びＩから選択され）；
Ｘ_３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、及びＦから選択され（例えば、Ａ又はＮ）；
Ｘ_４は、Ｓ、Ｙ、Ｎ、及びＦから選択され（例えば、Ｓ）；
Ｘ_５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、及びＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ及びＬから選択され）；
Ｘ_６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、及びＬから選択され（例えば、Ｗ）；
Ｘ_７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、及びＧから選択され（例えば、Ａ及びＳから選択され）；
Ｘ_８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、及びＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ及びＬから選択され）；
Ｘ_９は、あらゆるアミノ酸から選択されるか又は存在しない（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、及びＲから選択されるか、又は例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、及びΔから選択される）］
のアミノ酸配列を含むＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含む。

【0444】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２０の配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。

【0445】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能を有する。他の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能がない。

【0446】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＩ：
Ｄ－Ｘ_１－Ｇ－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｓ－Ｘ_５－Ｇ－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９、（配列番号２１）
［式中、
Ｘ_１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、及びＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、及びＬから選択され）；
Ｘ_２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、及びＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、及びＩから選択され）；
Ｘ_３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ及びＦから選択され（例えば、Ａ又はＮ）；
Ｘ_５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、及びＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ及びＬから選択され）；
Ｘ_６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、及びＬから選択され（例えば、Ｗ）；
Ｘ_７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、及びＧから選択され（例えば、Ａ及びＳから選択され）；
Ｘ_８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、及びＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ及びＬから選択され）；
Ｘ_９は、あらゆるアミノ酸から選択されるか又は存在しない（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、及びＲから選択されるか、又は例えばＴ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、及びΔから選択される）］
のアミノ酸配列を含むＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含む。

【0447】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２１の配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。

【0448】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ：
Ｄ－Ｉ－Ｇ－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｓ－Ｖ－Ｇ－Ｗ－Ａ－Ｘ_８－Ｘ_９（配列番号２２）
［式中、
Ｘ_２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、及びＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、及びＩから選択され）；
Ｘ_３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、及びＦから選択され（例えば、Ａ又はＮ）；
Ｘ_８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、及びＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ及びＬから選択され）；
Ｘ_９は、あらゆるアミノ酸から選択されるか又は存在しない（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、及びＲから選択されるか、又は例えばＴ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、及びΔから選択される）］
のアミノ酸配列を含む。

【0449】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２２の配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。

【0450】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＶ：
Ｄ－Ｉ－Ｇ－Ｔ－Ｎ－Ｓ－Ｖ－Ｇ－Ｗ－Ａ－Ｖ－Ｘ（配列番号２３）
［式中、
Ｘは、非極性アルキルアミノ酸又はヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、及びＴから選択される（例えば、Ｃａｓ９分子は、図２Ａ－２Ｇに示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン（Ｙとして描写されている）を含んでいてもよい）］
のアミノ酸配列を含む。

【0451】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２３の配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。

【0452】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、本明細書で開示された、例えば図３Ａ－３Ｂで開示されたＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。ある特定の実施態様において、図３Ａ－３Ｂで同定された高度に保存された残基の１つ、２つ、３つ又は全ては、存在する。

【0453】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、本明細書で開示された、例えば図４Ａ－４Ｂで開示されたＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。ある特定の実施態様において、図４Ａ－４Ｂで同定された高度に保存された残基の１つ、２つ、又は全ては、存在する。

【0454】

７．１．３ 追加のＲｕｖＣ様ドメイン
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに加えて、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、一又は複数の追加のＲｕｖＣ様ドメインを含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、２つの追加のＲｕｖＣ様ドメインを含む。ある特定の実施態様において、追加のＲｕｖＣ様ドメインは、少なくとも５アミノ酸の長さ、例えば１５アミノ酸未満の長さ、例えば、５から１０アミノ酸の長さ、例えば、８アミノ酸の長さである。

【0455】

追加のＲｕｖＣ様ドメインは、式Ｖ：
Ｉ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｅ－Ｘ_３－Ａ－Ｒ－Ｅ（配列番号１５）
［式中、
Ｘ_１は、Ｖ又はＨである；
Ｘ_２は、Ｉ、Ｌ又はＶである（例えば、Ｉ又はＶ）；及び
Ｘ_３は、Ｍ又はＴである］
のアミノ酸配列を含んでいてもよい。

【0456】

ある特定の実施態様において、追加のＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩ：
Ｉ－Ｖ－Ｘ_２－Ｅ－Ｍ－Ａ－Ｒ－Ｅ（配列番号１６）
［式中、
Ｘ_２は、Ｉ、Ｌ又はＶである（例えば、Ｉ又はＶ）（例えば、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ－２Ｇに示される追加のＲｕｖＣ様ドメイン（Ｂとして描写されている）を含んでいてもよい）］
のアミノ酸配列を含む。

【0457】

追加のＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩＩ：
Ｈ－Ｈ－Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ａ－Ｘ_２－Ｘ_３（配列番号１７）
［式中、
Ｘ_１は、Ｈ又はＬである；
Ｘ_２は、Ｒ又はＶであり；
Ｘ_３は、Ｅ又はＶである］
のアミノ酸配列を含んでいてもよい。

【0458】

ある特定の実施態様において、追加のＲｕｖＣ様ドメインは、アミノ酸配列：Ｈ－Ｈ－Ａ－Ｈ－Ｄ－Ａ－Ｙ－Ｌ（配列番号１８）を含む。

【0459】

ある特定の実施態様において、追加のＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１５－１８の配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。

【0460】

ある特定の実施態様において、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに隣接する配列は、式ＶＩＩＩ：
Ｋ－Ｘ_１’－Ｙ－Ｘ_２’－Ｘ_３’－Ｘ_４’－Ｚ－Ｔ－Ｄ－Ｘ_９’－Ｙ（配列番号１９）
［式中、
Ｘ_１’は、Ｋ及びＰから選択され；
Ｘ_２’は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ及びＬ）；
Ｘ_３’は、Ｇ、Ａ及びＳから選択され（例えば、Ｇ）；
Ｘ_４’は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、及びＦから選択され（例えば、Ｌ）；
Ｘ_９’は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＱから選択され；
Ｚは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインであり、例えば、上述したように、例えば５から２０アミノ酸を有するＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインである］
のアミノ酸配列を有する。

【0461】

７．１．４ ＨＮＨ様ドメイン
ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、一本鎖相補的ドメイン、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖を切断する。ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１５、２０、又は２５アミノ酸の長さ、ただし４０、３５、又は３０アミノ酸以下の長さであり、例えば、２０から３５アミノ酸の長さ、例えば２５から３０アミノ酸の長さである。例示的なＨＮＨ様ドメインは、後述される。

【0462】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＸ：
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｈ－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｐ－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ^９－Ｘ^１０－Ｘ^１１－Ｘ^１２－Ｘ^１３－Ｘ^１４－Ｘ^１５－Ｎ－Ｘ^１６－Ｘ^１７－Ｘ^１８－Ｘ^１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｎ（配列番号２５）
［式中、
Ｘ_１は、Ｄ、Ｅ、Ｑ及びＮから選択され（例えば、Ｄ及びＥ）；
Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、及びＫから選択され；
Ｘ_３は、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ_４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、及びＬから選択され（例えば、Ａ、Ｉ及びＶ）；
Ｘ_５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＷから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ及びＬ）；
Ｘ_６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＷから選択され；
Ｘ_７は、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｔ、及びＫから選択され（例えば、Ｓ及びＡ）；
Ｘ_８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、及びＱから選択され（例えば、Ｆ）；
Ｘ_９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、及びＧから選択され；
Ｘ_１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、及びＳから選択され；
Ｘ_１１は、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、及びＴから選択され（例えば、Ｄ）；
Ｘ_１２は、Ｄ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘ_１３は、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＲから選択され（例えば、Ｓ）；
Ｘ_１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、及びＨから選択され（例えば、Ｉ、Ｌ及びＦ）；
Ｘ_１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、及びＶから選択され；
Ｘ_１６は、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、及びＦから選択され（例えば、Ｌ、Ｒ及びＫ）；
Ｘ_１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ及びＴから選択され；
Ｘ_１８は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、及びＡから選択され（例えば、Ｌ及びＩ）；
Ｘ_１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、及びＡから選択され（例えば、Ｔ及びＶ）；
Ｘ_２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、及びＡから選択され；
Ｘ_２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、及びＬから選択され；
Ｘ_２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、及びＹから選択され；及び
Ｘ_２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、及びＦから選択される］
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含む。

【0463】

ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２５の配列と、少なくとも１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。

【0464】

ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、切断能を有する。ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、切断能がない。

【0465】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｘ：
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｈ－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｐ－Ｘ_６－Ｓ－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｄ－Ｄ－Ｓ－Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｎ－Ｋ－Ｖ－Ｌ－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｎ（配列番号２６）
［式中、
Ｘ_１は、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ_２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、及びＫから選択され；
Ｘ_３は、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ_４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、及びＬから選択され（例えば、Ａ、Ｉ及びＶ）；
Ｘ_５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＷから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ及びＬ）；
Ｘ_６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＷから選択され；
Ｘ_８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、及びＱから選択され（例えば、Ｆ）；
Ｘ_９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、及びＧから選択され；
Ｘ_１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、及びＳから選択され；
Ｘ_１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ及びＨから選択され（例えば、Ｉ、Ｌ及びＦ）；
Ｘ_１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、及びＶから選択され；
Ｘ_１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、及びＡから選択され（例えば、Ｔ及びＶ）；
Ｘ_２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、及びＡから選択され；
Ｘ_２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、及びＬから選択され；
Ｘ_２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、及びＹから選択され；及び
Ｘ_２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、及びＦから選択される］
のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含む。

【0466】

ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２６の配列と、１、２、３、４、又は５つの残基が異なっている。

【0467】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩ：
Ｘ_１－Ｖ－Ｘ_３－Ｈ－Ｉ－Ｖ－Ｐ－Ｘ_６－Ｓ－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｄ－Ｄ－Ｓ－Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｎ－Ｋ－Ｖ－Ｌ－Ｔ－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｎ（配列番号２７）
［式中、
Ｘ_１は、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ_３は、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ_６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、及びＷから選択され；
Ｘ_８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、及びＱから選択され（例えば、Ｆ）；
Ｘ_９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、及びＧから選択され；
Ｘ_１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、及びＳから選択され；
Ｘ_１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、及びＨから選択され（例えば、Ｉ、Ｌ及びＦ）；
Ｘ_１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、及びＶから選択され；
Ｘ_２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、及びＡから選択され；
Ｘ_２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、及びＬから選択され；
Ｘ_２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、及びＹから選択され；及び
Ｘ_２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、及びＦから選択される］
のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含む。

【0468】

ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２７の配列と、１、２、３、４、又は５つの残基が異なっている。

【0469】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩ：
Ｄ－Ｘ_２－Ｄ－Ｈ－Ｉ－Ｘ_５－Ｐ－Ｑ－Ｘ_７－Ｆ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｄ－Ｘ_１２－Ｓ－Ｉ－Ｄ－Ｎ－Ｘ_１６－Ｖ－Ｌ－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｓ－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｎ（配列番号２８）
［式中、
Ｘ_２は、Ｉ及びＶから選択され；
Ｘ_５は、Ｉ及びＶから選択され；
Ｘ_７は、Ａ及びＳから選択され；
Ｘ_９は、Ｉ及びＬから選択され；
Ｘ_１０は、Ｋ及びＴから選択され；
Ｘ_１２は、Ｄ及びＮから選択され；
Ｘ_１６は、Ｒ、Ｋ、及びＬから選択され；
Ｘ_１９は、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ_２０は、Ｓ、及びＲから選択され；
Ｘ_２２は、Ｋ、Ｄ、及びＡから選択され；
Ｘ_２３は、Ｅ、Ｋ、Ｇ、及びＮから選択される（例えば、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメインを含んでいてもよい）］
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含む。

【0470】

ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２８の配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。

【0471】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩＩ：
Ｌ－Ｙ－Ｙ－Ｌ－Ｑ－Ｎ－Ｇ－Ｘ_１’－Ｄ－Ｍ－Ｙ－Ｘ_２’－Ｘ_３’－Ｘ_４’－Ｘ_５’－Ｌ－Ｄ－Ｉ－Ｘ_６’－Ｘ_７’－Ｌ－Ｓ－Ｘ_８’－Ｙ－Ｚ－Ｎ－Ｒ－Ｘ_９’－Ｋ－Ｘ_１０’－Ｄ－Ｘ_１１’－Ｖ－Ｐ（配列番号２４）
［式中、
Ｘ_１’は、Ｋ及びＲから選択され；
Ｘ_２’は、Ｖ及びＴから選択され；
Ｘ_３’は、Ｇ及びＤから選択され；
Ｘ_４’は、Ｅ、Ｑ及びＤから選択され；
Ｘ_５’は、Ｅ及びＤから選択され；
Ｘ_６’は、Ｄ、Ｎ、及びＨから選択され；
Ｘ_７’は、Ｙ、Ｒ、及びＮから選択され；
Ｘ_８’は、Ｑ、Ｄ、及びＮから選択され；
Ｘ_９’は、Ｇ及びＥから選択され；
Ｘ_１０’は、Ｓ及びＧから選択され；
Ｘ_１１’は、Ｄ及びＮから選択され；
Ｚは、ＨＮＨ様ドメイン、例えば、上述したようなＨＮＨ様ドメインである］
のアミノ酸配列を含む。

【0472】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２４の配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっているアミノ酸配列を含む。

【0473】

ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、本明細書で開示された、例えば図５Ａ－５Ｃで開示されたＨＮＨ様ドメインの配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。ある特定の実施態様において、図５Ａ－５Ｃで同定された高度に保存された残基の１つ又は両方は、存在する。

【0474】

ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、本明細書で開示された、例えば図６Ａ－６Ｂで開示されたＨＮＨ様ドメインの配列と、１つの、ただし２、３、４、又は５つ以下の残基が異なっている。ある特定の実施態様において、図６Ａ－６Ｂで同定された高度に保存された残基の１つ、２つ、又は３つ全ては、存在する。

【0475】

７．２ Ｃａｓ９活性
ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸分子を切断することが可能である。典型的には、野生型Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子の両方の鎖を切断する。ヌクレアーゼの切断（又は他の特性）を変更するように、例えば、ニッカーゼであるか、又は標的核酸を切断する能力が欠如したＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドを提供するように、Ｃａｓ９分子及びＣａｓ９ポリペプチドを操作することができる。標的核酸分子を切断することが可能なＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書ではｅａＣａｓ９（酵素的に活性なＣａｓ９）分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドと称される。

【0476】

ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の酵素活性：
ニッカーゼ活性、すなわち核酸分子の一本鎖、例えば非相補鎖又は相補鎖を切断する能力；
二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を作り出す能力であって、ある特定の実施態様において、２つのニッカーゼ活性の存在である、能力；
エンドヌクレアーゼ活性；
エキソヌクレアーゼ活性；及び
ヘリカーゼ活性、すなわち二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力
の一又は複数を含む。

【0477】

ある特定の実施態様において、酵素的に活性なＣａｓ９（「ｅａＣａｓ９」）分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、両方のＤＮＡ鎖を切断し、二本鎖切断をもたらす。ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、１つの鎖のみ、例えば、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、又はｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖を切断する。ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性を含む。ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性を含む。ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性及びＲｕｖＣドメインに関連する切断活性を含む。ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性な、又は切断能を有するＨＮＨドメイン、及び不活性な、又は切断能がないＲｕｖＣドメインを含む。ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性な、又は切断能がないＨＮＨドメイン、及び活性な、又は切断能を有するＲｕｖＣドメインを含む。

【0478】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用する能力を有し、ｇＲＮＡ分子と共に、コア標的ドメインに局在するが、標的核酸を切断することができないか、又は効率的な速度で切断することができない。切断活性を有さない又は実質的な切断活性を有さないＣａｓ９分子は、本明細書では、酵素的に不活性なＣａｓ９（「ｅｉＣａｓ９」）分子又はｅｉＣａｓ９ポリペプチドと称される。例えば、ｅｉＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９ポリペプチドは、切断活性を欠如しているか、又は本明細書に記載されるアッセイによって測定した場合、実質的に参照Ｃａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９ポリペプチドの切断活性より低い切断活性、例えば、２０、１０、５、１又は０．１％未満の切断活性を有していてもよい。

【0479】

７．３ 標的化及びＰＡＭ
Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用することができ、ある特定の実施態様においてＰＡＭ配列である標的ドメインを含む部位に、ｇＲＮＡ分子と協調して局在する。ある特定の実施態様において、本発明の開示のＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチド（例えば、ｅａＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９）は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１５／０８９４６５号に開示されたｇＲＮＡを使用して標的化され得る。ある特定の実施態様において、国際公開第２０１５／０８９４６５号に開示されたｇＲＮＡを使用して標的化されるＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９である。ある特定の実施態様において、国際公開第２０１５／０８９４６５号に開示されたｇＲＮＡを使用して標的化されるＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓ．アウレウスのＣａｓ９である。

【0480】

ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドの、標的核酸と相互作用してそれを切断する能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。ある特定の実施態様において、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種からのｅａＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識することができる。ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧを認識し、標的核酸配列の、その配列から１から１０、例えば３から５ｂｐ上流の切断を指示する（例えば、Mali 2013を参照）。

【0481】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９ ＥＱＲ変異体又はＳ．ピオゲネスのＣａｓ９ ＶＲＥＲ変異体である。

【0482】

ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９ ＥＱＲ変異体は、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＮＧＧＧ、ＮＧＴＧ、ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ又はＮＧＡＣのＰＡＭ配列を認識し、その配列から１から１０、例えば３から５塩基対上流で標的核酸配列の切断を指示する。ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９ ＥＱＲ変異体は、ＮＧＡＧのＰＡＭ配列を認識し、その配列から１から１０、例えば３から５塩基対上流で標的核酸配列の切断を指示する。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ等、ＮＡＴＵＲＥ ２０１５；５２３（７５６１）：４８１－５を参照されたい。

【0483】

ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９ ＶＲＥＲ変異体は、ＮＧＣＧ、ＮＧＣＡ、ＮＧＣＴ ＰＡＭ、又はＮＧＣＣのＰＡＭ配列を認識し、その配列から１から１０、例えば３から５塩基対上流で標的核酸配列の切断を指示する。ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９ ＶＲＥＲ変異体は、ＮＧＣＧの配列モチーフを認識し、その配列から１から１０、例えば３から５塩基対上流で標的核酸配列の切断を指示する。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ等、ＮＡＴＵＲＥ ２０１５；５２３（７５６１）：４８１－５を参照されたい。

【0484】

ある特定の実施態様において、Ｓ．サーモフィラスのＣａｓ９分子は、ＮＧＧＮＧ（配列番号１９９）及び／又はＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝Ａ又はＴ）（配列番号２００）のＰＡＭ配列を認識し、これらの配列から１から１０、例えば、３から５ｂｐ上流で標的核酸配列の切断を指示する（例えば、Horvath 2010；Deveau 2008を参照） 。

【0485】

ある特定の実施態様において、Ｓ．ミュータンスのＣａｓ９分子は、ＮＧＧ及び／又はＮＡＡＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号２０１）のＰＡＭ配列を認識し、この配列から１から１０、例えば、３から５ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を指示する（例えば、Deveau 2008を参照）。

【0486】

ある特定の実施態様において、Ｓ．アウレウスのＣａｓ９分子は、ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号２０２）のＰＡＭ配列を認識し、その配列から１から１０、例えば３から５ｂｐ上流で標的核酸配列の切断を指示する。

【0487】

ある特定の実施態様において、Ｓ．アウレウスは、ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号２０３）のＰＡＭ配列を認識し、その配列から１から１０、例えば３から５ｂｐ上流で標的核酸配列の切断を指示する。ある特定の実施態様において、Ｓ．アウレウスのＣａｓ９分子は、ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号２０４）のＰＡＭ配列を認識し、その配列から１から１０、例えば３から５ｂｐ上流で標的核酸配列の切断を指示する。ある特定の実施態様において、Ｓ．アウレウスのＣａｓ９分子は、ＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号２０５）のＰＡＭ配列を認識し、その配列から１から１０、例えば３から５ｂｐ上流で標的核酸配列の切断を指示する。

【0488】

ある特定の実施態様において、髄膜炎菌のＣａｓ９分子は、ＮＮＮＮＧＡＴＴ又はＮＮＮＧＣＴＴのＰＡＭ配列を認識し、その配列から１から１０、例えば３から５塩基対上流で標的核酸配列の切断を指示する。例えば、Ｈｏｕ等、ＰＮＡＳ 初期版 ２０１３、１－６を参照されたい。

【0489】

Ｃａｓ９分子のＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば上述したような形質転換アッセイを使用して決定することができる（Jinek 2012）。上述の実施態様において、Ｎは、いずれのヌクレオチド残基であってもよく、例えばＡ、Ｇ、Ｃ、又はＴのいずれかであってもよい。

【0490】

本明細書で論じられるように、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＰＡＭの特異性を変更するように操作することができる。

【0491】

例示的な天然Ｃａｓ９分子がこれまでに記載されている（例えば、Chylinski 2013を参照）。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１の細菌ファミリー、クラスター２の細菌ファミリー、クラスター３の細菌ファミリー、クラスター４の細菌ファミリー、クラスター５の細菌ファミリー、クラスター６の細菌ファミリー、クラスター７の細菌ファミリー、クラスター８の細菌ファミリー、クラスター９の細菌ファミリー、クラスター１０の細菌ファミリー、クラスター１１の細菌ファミリー、クラスター１２の細菌ファミリー、クラスター１３の細菌ファミリー、クラスター１４の細菌ファミリー、クラスター１５の細菌ファミリー、クラスター１６の細菌ファミリー、クラスター１７の細菌ファミリー、クラスター１８の細菌ファミリー、クラスター１９の細菌ファミリー、クラスター２０の細菌ファミリー、クラスター２１の細菌ファミリー、クラスター２２の細菌ファミリー、クラスター２３の細菌ファミリー、クラスター２４の細菌ファミリー、クラスター２５の細菌ファミリー、クラスター２６の細菌ファミリー、クラスター２７の細菌ファミリー、クラスター２８の細菌ファミリー、クラスター２９の細菌ファミリー、クラスター３０の細菌ファミリー、クラスター３１の細菌ファミリー、クラスター３２の細菌ファミリー、クラスター３３の細菌ファミリー、クラスター３４の細菌ファミリー、クラスター３５の細菌ファミリー、クラスター３６の細菌ファミリー、クラスター３７の細菌ファミリー、クラスター３８の細菌ファミリー、クラスター３９の細菌ファミリー、クラスター４０の細菌ファミリー、クラスター４１の細菌ファミリー、クラスター４２の細菌ファミリー、クラスター４３の細菌ファミリー、クラスター４４の細菌ファミリー、クラスター４５の細菌ファミリー、クラスター４６の細菌ファミリー、クラスター４７の細菌ファミリー、クラスター４８の細菌ファミリー、クラスター４９の細菌ファミリー、クラスター５０の細菌ファミリー、クラスター５１の細菌ファミリー、クラスター５２の細菌ファミリー、クラスター５３の細菌ファミリー、クラスター５４の細菌ファミリー、クラスター５５の細菌ファミリー、クラスター５６の細菌ファミリー、クラスター５７の細菌ファミリー、クラスター５８の細菌ファミリー、クラスター５９の細菌ファミリー、クラスター６０の細菌ファミリー、クラスター６１の細菌ファミリー、クラスター６２の細菌ファミリー、クラスター６３の細菌ファミリー、クラスター６４の細菌ファミリー、クラスター６５の細菌ファミリー、クラスター６６の細菌ファミリー、クラスター６７の細菌ファミリー、クラスター６８の細菌ファミリー、クラスター６９の細菌ファミリー、クラスター７０の細菌ファミリー、クラスター７１の細菌ファミリー、クラスター７２の細菌ファミリー、クラスター７３の細菌ファミリー、クラスター７４の細菌ファミリー、クラスター７５の細菌ファミリー、クラスター７６の細菌ファミリー、クラスター７７の細菌ファミリー、又はクラスター７８の細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。

【0492】

例示的な天然Ｃａｓ９分子としては、クラスター１の細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。例としては、Ｓ．アウレウス、Ｓ．ピオゲネス（例えば、ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１及びＳＳＩ－１株）、Ｓ．サーモフィラス（例えば、ＬＭＤ－９株）、Ｓ．シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、ＳＰＩＮ ２００２６株）、Ｓ．ミュータンス（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ガロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－２０６９株）、Ｓ．エキネス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ ９８１２、ＭＧＣＳ１２４株）、Ｓ．ディスダラクチア（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ１２４株）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ ７００３３８株）、Ｓ．アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、Ｆ０２１１株）、Ｓ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス（例えば、Ｆ６８５４株）、リステリア・イノキュア（Ｌ．イノキュア、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、エンテロコッカス・イタリカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ１５９５２株）、又はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子が挙げられる。

【0493】

追加の例示的なＣａｓ９分子は、髄膜炎菌のＣａｓ９分子（Hou等、PNAS 初期版 2013、1-6）及びＳ．アウレウスのｃａｓ９分子である。

【0494】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、
本明細書に記載されるいずれかのＣａｓ９分子配列、又は天然Ｃａｓ９分子配列、例えば本明細書に列挙された（例えば、配列番号１、２、４－６、又は１２）若しくはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に記載された種からのＣａｓ９分子と、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の相同性を有するアミノ酸配列；
上記Ｃａｓ９分子と比較した場合、アミノ酸残基の約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、又は約４０％以下が異なっているアミノ酸配列；
上記Ｃａｓ９分子と、少なくとも１、２、５、１０又は２０アミノ酸、ただし１００、８０、７０、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下が異なっているアミノ酸配列；又は
上記Ｃａｓ９分子と同一なアミノ酸配列
を含む。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、以下の活性：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；又はｇＲＮＡ分子と共に標的核酸に局在化する能力の一又は複数を含む。

【0495】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ－２Ｇのコンセンサス配列のアミノ酸配列のいずれかを含み、「＊」は、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９分子のアミノ酸配列において対応する位置に見出されるあらゆるアミノ酸を示し、「－」は、非存在を示す。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列の配列と、少なくとも１つの、ただし２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下のアミノ酸残基が異なっている。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２の配列と、少なくとも１つの、ただし２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下のアミノ酸残基が異なっている。

【0496】

多数のＣａｓ９分子の配列の比較から、ある特定の領域が保存されていることが示される。これらは、以下の通りに同定される：
領域１（残基１から１８０、又は領域１’のケースでは残基１２０から１８０）
領域２（残基３６０から４８０）；
領域３（残基６６０から７２０）；
領域４（残基８１７から９００）；及び
領域５（残基９００から９６０）。

【0497】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、生物学的に活性な分子、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの活性を有するＣａｓ９分子を提供するのに十分な追加のＣａｓ９分子配列と共に、領域１－５を含む。ある特定の実施態様において、領域１－５のそれぞれは、独立して、本明細書に記載されるＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチド、例えば図２Ａ－２Ｇからの配列の対応する残基と、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の相同性を有する。

【0498】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、領域１と称されるアミノ酸配列を含み、領域１は、
Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１－１８０と（番号付けは、図２に記載のモチーフ配列に従っており、図２Ａ－２Ｇに記載の４つのＣａｓ９配列中の残基の５２％は保存されている）、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の相同性を有するか；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はリステリア・イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１－１８０と、少なくとも１、２、５、１０又は２０アミノ酸、ただし９０、８０、７０、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下が異なっているか；又は
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１－１８０と同一である。

【0499】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、領域１’と称されるアミノ酸配列を含み、領域１’は、
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０－１８０（図２に記載の４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％は保存されている）と、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の相同性を有するか；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０－１８０と、少なくとも１、２、又は５アミノ酸、ただし３５、３０、２５、２０又は１０アミノ酸以下が異なっているか；又は
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０－１８０と同一である。

【0500】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、領域２と称されるアミノ酸配列を含み、領域２は、
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０－４８０（図２に記載の４つのＣａｓ９配列中の残基の５２％は保存されている）と、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の相同性を有するか；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０－４８０と、少なくとも１、２、又は５アミノ酸、ただし３５、３０、２５、２０又は１０アミノ酸以下が異なっているか；又は
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０－４８０と同一である。

【0501】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、領域３と称されるアミノ酸配列を含み、領域３は、
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０－７２０（図２に記載の４つのＣａｓ９配列中の残基の５６％は保存されている）と、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の相同性を有するか；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０－７２０と、少なくとも１、２、又は５アミノ酸、ただし３５、３０、２５、２０又は１０アミノ酸以下が異なっているか；又は
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０－７２０と同一である。

【0502】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、領域４と称されるアミノ酸配列を含み、領域４は、
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７－９００（図２Ａ－２Ｇに記載の４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％は、保存されている）と、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の相同性を有するか；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７－９００と、少なくとも１、２、又は５アミノ酸、ただし３５、３０、２５、２０又は１０アミノ酸以下が異なっているか；又は
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７－９００と同一である。

【0503】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、領域５と称されるアミノ酸配列を含み、領域５は、
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００－９６０（図２Ａ－２Ｇに記載の４つのＣａｓ９配列中の残基の６０％は、保存されている）と、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の相同性を有するか；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００－９６０と、少なくとも１、２、又は５アミノ酸、ただし３５、３０、２５、２０又は１０アミノ酸以下が異なっているか；又は
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００－９６０と同一である。

【0504】

７．４ 操作された又は変更されたＣａｓ９
本明細書に記載されるＣａｓ９分子及びＣａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機能的に会合する能力；及び核酸上の部位（例えば、ＰＡＭ認識及び特異性）を標的化する（又はそこに局在する）能力などの多数の特性のいずれを有していてもよい。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、これらの特性の全て又はサブセットを含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用する能力を有し、ｇＲＮＡ分子と協調して核酸中の部位に局在する。他の活性、例えば、ＰＡＭの特異性、切断活性、又はヘリカーゼ活性は、Ｃａｓ９分子及びＣａｓ９ポリペプチドにおいてより広く変更が可能である。

【0505】

Ｃａｓ９分子は、操作されたＣａｓ９分子及び操作されたＣａｓ９ポリペプチドを含む（操作とは、この文脈で使用される場合、単にＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドが参照配列と異なっていることを意味し、プロセス又は起源の限定は意味しない）。操作されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、変更された酵素特性、例えば、変更されたヌクレアーゼ活性（天然又は他の参照Ｃａｓ９分子と比較した場合）、又は変更されたヘリカーゼ活性を含んでいてもよい。本明細書で論じられるように、操作されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性を有していてもよい（二本鎖ヌクレアーゼ活性とは対照的に）。ある特定の実施態様において、操作されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、そのサイズを変更する変更を有していてもよく、例えば、一又は複数の、又は全てのＣａｓ９活性に有意な作用を与えずに、例えば、そのサイズを低減するアミノ酸配列の欠失を有していてもよい。ある特定の実施態様において、操作されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を与える変更を含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、操作されたＣａｓ９分子は、内因性の野生型ＰＩドメインによって認識されるもの以外のＰＡＭ配列を認識するように変更される。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子からの配列において異なるが、一又は複数のＣａｓ９活性において有意な変更がないものでもよい。

【0506】

所望の特性を有するＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、多数の方法で作製することができ、例えば、所望の特性を有する変更されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドが提供されるような、親の、例えば天然Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドの変更で作製することができる。例えば、親のＣａｓ９分子、例えば天然又は操作されたＣａｓ９分子と比べた一又は複数の突然変異若しくは差を導入することができる。このような突然変異及び差は、置換（例えば、保存的置換又は非必須アミノ酸の置換）；挿入；又は欠失を含む。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、参照、例えば親のＣａｓ９分子と比べて、一又は複数の突然変異若しくは差、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０又は５０個の突然変異、ただし２００、１００、又は８０個未満の突然変異を含んでいてもよい。

【0507】

ある特定の実施態様において、一又は複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９活性に実質的な作用を有さない。ある特定の実施態様において、一又は複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９活性に実質的な作用を有する。

【0508】

７．５ 切断が修飾されたＣａｓ９
ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なっている切断特性、例えば、最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なっている切断特性を含む。例えば、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子、例えばＳ．ピオゲネスのＣａｓ９分子と、以下のように異なっていてもよい：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９分子）と比較した場合、二本鎖核酸の切断をモジュレートする、例えば減少又は増加させるその能力（エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ活性）；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９分子）と比較した場合、核酸の一本鎖、例えば核酸分子の非相補鎖又は核酸分子の相補鎖の切断をモジュレートする、例えば減少又は増加させるその能力（ニッカーゼ活性）；又は核酸分子、例えば二本鎖又は一本鎖核酸分子を切断する能力がなくなっていてもよい。

【0509】

ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の活性：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性、及びＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性の一又は複数を含む。

【0510】

ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性な、又は切断能を有するＨＮＨ様ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメイン、例えば、配列番号２４－２８）及び不活性な、又は切断能がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含む。例示的な不活性な、又は切断能がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸の突然変異を有していてもよく、例えば、図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列の９位におけるアスパラギン酸、又は配列番号２の１０位におけるアスパラギン酸が、例えばアラニンで置換されていてもよい。ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにおいて野生型と異なっており、標的核酸を切断しないか、又は有意に低い効率で、例えば本明細書に記載されるアッセイによって測定した場合、例えば参照Ｃａｓ９分子の切断活性の約２０％、約１０％、約５％、約１％又は約０．１％未満で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、天然非修飾のＣａｓ９分子、例えば天然Ｃａｓ９分子、例えばＳ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、又はＳ．サーモフィラスのＣａｓ９分子などであってもよい。ある特定の実施態様において、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性又は相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。

【0511】

ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性な、又は切断能がないＨＮＨドメイン及び活性な、又は切断能を有するＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン、例えば、配列番号１５－２３）を含む。例示的な不活性な、又は切断能がないＨＮＨ様ドメインは、以下の一又は複数における突然変異を有していてもよい：ＨＮＨ様ドメインにおけるヒスチジン、例えば図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列の８５６位に示されるヒスチジンが、例えばアラニンで置換されていてもよく；ＨＮＨ様ドメインにおける一又は複数のアスパラギン、例えば図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列の８７０位に示されるアスパラギン及び／又は図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列の８７９位に示されるアスパラギンが、例えばアラニンで置換されていてもよい。ある特定の実施態様において、ｅａＣａｓ９は、ＨＮＨ様ドメインにおいて野生型と異なっており、標的核酸を切断しないか、又は有意に低い効率で、例えば、本明細書に記載されるアッセイによって測定した場合、例えば参照Ｃａｓ９分子の切断活性の約２０％、約１０％、約５％、約１％又は約０．１％の効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、天然非修飾のＣａｓ９分子、例えば天然Ｃａｓ９分子、例えばＳ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、又はＳ．サーモフィラスのＣａｓ９分子などであってもよい。ある特定の実施態様において、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性又は相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。

【0512】

ある特定の実施態様において、例示的なＣａｓ９活性は、ＰＡＭの特異性、切断活性、及びヘリカーゼ活性の一又は複数を含む。突然変異は、例えば、一又は複数のＲｕｖＣドメイン、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣドメイン；ＨＮＨドメイン；ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインの外側の領域に存在していてもよい。ある特定の実施態様において、突然変異は、ＲｕｖＣドメインに存在する。ある特定の実施態様において、突然変異は、ＨＮＨドメインに存在する。ある特定の実施態様において、突然変異は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインの両方に存在する。

【0513】

Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９配列と比べてＲｕｖＣドメインにおいて生じ得る例示的な突然変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、及び／又はＤ９８６Ａが挙げられる。Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９配列と比べてＨＮＨドメインにおいて生じ得る例示的な突然変異としては、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及び／又はＮ８６３Ａが挙げられる。Ｓ．アウレウスのＣａｓ９配列と比べてＲｕｖＣドメインにおいて生じ得る例示的な突然変異としては、Ｄ１０Ａが挙げられる（例えば配列番号１０を参照）。Ｓ．アウレウスのＣａｓ９配列と比べてＨＮＨドメインにおいて生じ得る例示的な突然変異としては、Ｎ５８０Ａが挙げられる（例えば配列番号１１を参照）。

【0514】

特定の配列、例えば置換が、一又は複数の活性、例えば標的化活性、切断活性などに影響を与える可能性があるかどうかは、例えば突然変異が保存的であるかどうかを評価することによって評価又は予測することができる。ある特定の実施態様において、「非必須」アミノ酸残基は、Ｃａｓ９分子の文脈で使用される場合、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を失わせることなく、又はより好ましくは実質的に変更することなく、Ｃａｓ９分子、例えば天然Ｃａｓ９分子、例えばｅａＣａｓ９分子の野生型配列から変更することができる残基であり、それに対して「必須」アミノ酸残基を変化させることは、実質的な活性（例えば、切断活性）の損失を引き起こす。

【0515】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なっている切断特性、例えば、最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なっている切断特性を含む。例えば、Ｃａｓ９分子は、天然Ｃａｓ９分子、例えば、Ｓ．アウレウス又はＳ．ピオゲネスのＣａｓ９分子と、以下のように異なっていてもよい：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス又はＳ．ピオゲネスのＣａｓ９分子）と比較した場合、二本鎖切断における切断をモジュレートする、例えば減少又は増加させるその能力（エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ活性）；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス又はＳ．ピオゲネスのＣａｓ９分子）と比較した場合、核酸の一本鎖、例えば核酸分子の非相補鎖又は核酸分子の相補鎖の切断をモジュレートする、例えば減少又は増加させるその能力（ニッカーゼ活性）を含むか；又は核酸分子、例えば二本鎖又は一本鎖核酸分子を切断する能力がなくなっていてもよい。ある特定の実施態様において、ニッカーゼは、配列番号１０の配列（Ｄ１０Ａ）又は配列番号１１の配列（Ｎ５８０Ａ）を含む、Ｓ．アウレウスのＣａｓ９由来のニッカーゼである（Friedland 2015）。

【0516】

ある特定の実施態様において、変更されたＣａｓ９分子は、以下の活性：ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性、及びＲｕｖＣドメインに関連する切断活性の一又は複数を含むｅａＣａｓ９分子である。

【0517】

ある特定の実施態様において、変更されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、以下の配列：
図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列の固定された配列に対応する配列が、図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列における固定された残基の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、又は約２０％以下で異なっている配列；及び
図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列における「＊」によって同定された残基に対応する配列が、天然Ｃａｓ９分子、例えば、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、又はＬ．イノキュアのＣａｓ９分子の対応する配列と、「＊」の残基の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、又は約４０％以下で異なっている、配列
を含む。

【0518】

ある特定の実施態様において、変更されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列における「＊」によって表された一又は複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、又は２００アミノ酸残基）においてＳ．ピオゲネスの配列と異なる一又は複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する図２Ａ－２Ｇに開示されたＳ．ピオゲネスのＣａｓ９のアミノ酸配列を含む、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドである。

【0519】

ある特定の実施態様において、変更されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列における「＊」によって表された一又は複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、又は２００アミノ酸残基）においてＳ．サーモフィラスの配列と異なる一又は複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する図２Ａ－２Ｇに開示されたＳ．サーモフィラスのＣａｓ９のアミノ酸配列を含む、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドである。

【0520】

ある特定の実施態様において、変更されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列における「＊」によって表された一又は複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、又は２００アミノ酸残基）においてＳ．ミュータンスの配列と異なる一又は複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する図２Ａ－２Ｇに開示されたＳ．ミュータンスのＣａｓ９のアミノ酸配列を含む、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドである。

【0521】

ある特定の実施態様において、変更されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ－２Ｇに開示されたコンセンサス配列における「＊」によって表された一又は複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、又は２００アミノ酸残基）においてＬ．イノキュアの配列と異なる一又は複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する図２Ａ－２Ｇに開示されたＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列を含む、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドである。

【0522】

ある特定の実施態様において、変更されたＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチド、例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、２つ又はそれより多くの異なるＣａｓ９分子の融合体、例えば、異なる種の２つ又はそれより多くの天然Ｃａｓ９分子の融合体であってもよい。例えば、１つの種の天然Ｃａｓ９分子の断片が、第２の種のＣａｓ９分子の断片に融合していてもよい。一例として、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含むＳ．ピオゲネスのＣａｓ９分子の断片が、ＨＮＨ様ドメインを含むＳ．ピオゲネス（例えば、Ｓ．サーモフィラス）以外の種のＣａｓ９分子の断片に融合していてもよい。

【0523】

７．６ ＰＡＭ認識が変更されたか又はＰＡＭ認識がないＣａｓ９
天然Ｃａｓ９分子は、特異的なＰＡＭ配列、例えばＳ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラス、Ｓ．ミュータンス、及びＳ．アウレウスに関して、例えば上述されたＰＡＭ認識配列を認識することができる。

【0524】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と同じＰＡＭの特異性を有する。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子に関連していないＰＡＭの特異性、又はそれと最も近い配列相同性を有する天然Ｃａｓ９分子に関連していないＰＡＭの特異性を有する。例えば、天然Ｃａｓ９分子を変更して、例えばＰＡＭ認識を変更してもよく、例えば、オフターゲット部位を減少させる、及び／若しくは特異性を改善するために、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドが認識するＰＡＭ配列を変更してもよいし、又はＰＡＭ認識の必要性をなくしてもよい。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドを変更して、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さを増加させてもよいし、及び／又は同一性のレベルが高くなるまでＣａｓ９の特異性を改善してもよいし（例えば、ｇＲＮＡ配列とＰＡＭ配列との間で約９８％、約９９％又は約１００％のマッチ）、例えば、オフターゲット部位を減少させてもよいし、及び／又は特異性を増加させてもよい。ある特定の実施態様において、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０又は１５アミノ酸の長さである。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９の特異性は、ｇＲＮＡ配列とＰＡＭ配列との間で少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の相同性を必要とする。異なるＰＡＭ配列を認識する及び／又は低下したオフターゲット活性を有するＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、定向進化を使用して生成することができる。Ｃａｓ９分子の定向進化に使用することができる例示的な方法及び系は、記載されている（例えば、Esvelt 2011を参照）。候補Ｃａｓ９分子は、例えば後述される方法によって評価することができる。

【0525】

７．７ サイズが最適化されたＣａｓ９
本明細書に記載される操作されたＣａｓ９分子及び操作されたＣａｓ９ポリペプチドとしては、分子のサイズを低下させるがそれでもなお所望のＣａｓ９特性、例えば本質的に自然のコンフォメーション、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性、及び／又は標的核酸分子認識を保持する欠失を含むＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。一又は複数の欠失及び任意選択的に一又は複数のリンカーを含むＣａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドが本明細書で提供され、この場合、リンカーは、欠失の両側にあるアミノ酸残基間に配置される。参照Ｃａｓ９分子において好適な欠失を同定するための方法、欠失及びリンカーを有するＣａｓ９分子を生成するための方法、及びこのようなＣａｓ９分子を使用するための方法は、この文書を再検討すれば当該技術分野の当業者に明らかであると予想される。

【0526】

欠失を有するＣａｓ９分子、例えばＳ．アウレウス又はＳ．ピオゲネスのＣａｓ９分子は、対応する天然Ｃａｓ９分子より小さく、例えば、それより少ない数のアミノ酸を有する。より小さいサイズのＣａｓ９分子は、送達方法に関するフレキシビリティーを増加させることができ、それによってゲノム編集に関する有用性を増加させる。Ｃａｓ９分子は、結果生じる本明細書に記載されるＣａｓ９分子の活性に実質的に影響を与えない、又はそのような活性を減少させない一又は複数の欠失を含んでいてもよい。本明細書に記載される欠失を含むＣａｓ９分子に保持される活性としては、以下：
ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば非相補鎖又は相補鎖を切断する能力；
二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を作り出す能力であって、ある特定の実施態様において、２つのニッカーゼ活性の存在である、能力；
エンドヌクレアーゼ活性；
エキソヌクレアーゼ活性；
ヘリカーゼ活性、すなわち二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力；及び
核酸分子、例えば標的核酸又はｇＲＮＡの認識活性
の一又は複数が挙げられる。

【0527】

本明細書に記載されるＣａｓ９分子の活性は、本明細書に又は当該技術分野において記載される活性アッセイを使用して評価することができる。

【0528】

７．８ 欠失に好適な領域の同定
Ｃａｓ９分子の欠失に好適な領域は、様々な方法によって同定することができる。様々な細菌種からの天然オーソロガスなＣａｓ９分子は、選択されたＣａｓ９オーソログにわたりタンパク質の３次元コンフォメーションに関して保存のレベルを検査するために、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９（Nishimasu 2014）の結晶構造上にモデル化することができる。Ｃａｓ９活性に関与する領域、例えば標的核酸分子及び／又はｇＲＮＡとの接触面から空間的に遠位に配置された、あまり保存されていない領域又は保存されていない領域は、Ｃａｓ９活性に実質的に影響を及ぼしたり又はＣａｓ９活性を減少させたりしない欠失に関する候補である領域又はドメインとなる。

【0529】

７．９ Ｃａｓ９分子をコードする核酸
Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチド、例えばｅａＣａｓ９分子又はｅａＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸が本明細書で提供される。Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドをコードする例示的な核酸は、これまでに記載されている（例えば、Cong 2013; Wang 2013; Mali 2013; Jinek 2012を参照）。

【0530】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、合成核酸配列であってもよい。例えば、合成核酸分子は、例えば本明細書に記載されるように、化学的に修飾されていてもよい。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９のｍＲＮＡは、以下の特性：キャッピング、ポリアデニル化、５－メチルシチジン及び／又はシュードウリジンでの置換のうち一又は複数、例えば全てを有する。

【0531】

加えて、又は代替として、合成核酸配列は、コドンが最適化されていてもよく、例えば、少なくとも１つの共通していないコドン又はあまり共通していないコドンが、共通のコドンで置き換えられる。例えば、合成核酸は、最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡ、例えば、本明細書に記載される、例えば、哺乳動物発現系での発現に最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡの合成を指示することができる。

【0532】

加えて、又は代替として、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでいてもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。

【0533】

Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９分子をコードする例示的なコドンが最適化された核酸配列は、配列番号３に記載される。Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９分子の対応するアミノ酸配列は、配列番号２に記載される。ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９変異体である。ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９変異体は、配列番号２０８に記載の配列を有するＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９変異体は、配列番号２０９に記載の配列を有するＶＲＥＲ変異体である。

【0534】

Ｓ．アウレウスのＣａｓ９分子をコードする例示的なコドンが最適化された核酸配列は、配列番号７－９、２０６及び２０７に記載される。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｄ１０Ａ突然変異を含むＳ．アウレウスの突然変異Ｃａｓ９分子である。ある特定の実施態様において、Ｄ１０Ａ突然変異を含むＳ．アウレウスの突然変異Ｃａｓ９分子は、配列番号１０に記載の配列を有する。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｎ５８０突然変異を含むＳ．アウレウスの突然変異Ｃａｓ９分子である。ある特定の実施態様において、Ｎ５８０突然変異を含むＳ．アウレウスの突然変異Ｃａｓ９分子は、配列番号１１に記載の配列を有する。Ｓ．アウレウスのＣａｓ９分子のアミノ酸配列は、配列番号６に記載される。

【0535】

上記のＣａｓ９配列のいずれかがＣ末端でペプチド又はポリペプチドと融合している場合、終止コドンが除去され得ることが理解される。

【0536】

７．１０ 他のＣａｓ分子及びＣａｓポリペプチド
様々な種類のＣａｓ分子又はＣａｓポリペプチドを使用して、本明細書で開示された発明を実施することができる。ある特定の実施態様において、タイプＩＩのＣａｓ系のＣａｓ分子が使用される。ある特定の実施態様において、他のＣａｓ系のＣａｓ分子が使用される。例えば、タイプＩ又はタイプＩＩＩのＣａｓ分子を使用することができる。例示的なＣａｓ分子（及びＣａｓ系）がこれまでに記載されている（例えば、Haft 2005及びMakarova 2011を参照）。また例示的なＣａｓ分子（及びＣａｓ系）は、表１３にも示される。

【0537】

８．候補分子の機能的な分析
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当該技術分野で公知の方法によって、又は本明細書に記載されるようにして評価することができる。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価するための例示的な方法がこれまでに記載されている（Jinek 2012）。

【0538】

８．１ 結合及び切断アッセイ：Ｃａｓ９のエンドヌクレアーゼ活性の試験
標的核酸に結合して切断するＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の能力は、プラスミド切断アッセイで評価することができる。このアッセイにおいて、合成又はインビトロで転写されたｇＲＮＡ分子を、９５℃に加熱し、室温にゆっくり冷却させることによって、反応の前に予めアニールさせる。自然の又は制限消化で線形化したプラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））を、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２含有又は非含有のＣａｓ９プラスミド切断バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中で、精製したＣａｓ９タンパク質分子（５０－５００ｎＭ）及びｇＲＮＡ（５０－５００ｎＭ、１：１）と共に３７℃で６０分インキュベートする。５×ＤＮＡローディングバッファー（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）で反応を止め、０．８又は１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化する。得られた切断産物は、Ｃａｓ９分子が、両方のＤＮＡ鎖を切断するのか、又は２つの鎖のうち１つのみを切断するのかを示す。例えば、直鎖状ＤＮＡ産物は、両方のＤＮＡ鎖の切断を示す。ニックが入れられた開いた環状産物は、２つの鎖のうち１つのみの切断を示す。

【0539】

代替として、標的核酸に結合して切断するＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の能力は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイで評価することができる。このアッセイにおいて、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）を、５０μＬの反応液で、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファー中の５ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び～３－６ｐｍｏｌ（～２０－４０ｍＣｉ）の［γ－３２Ｐ］－ＡＴＰと共に３７℃で３０分インキュベートすることによって放射標識する。熱不活性化（６５℃で２０分間）の後、カラムを介して反応液を精製し、取り込まれなかった標識を除去する。標識されたオリゴヌクレオチドを等モル量の非標識相補的オリゴヌクレオチドと９５℃で３分アニーリングさせ、続いてゆっくり室温に冷却することによって、二重鎖基質（１００ｎＭ）が生成する。切断アッセイのために、ｇＲＮＡ分子を、９５℃で３０秒加熱し、続いて室温にゆっくり冷却することによってアニールさせる。Ｃａｓ９（５００ｎＭの最終濃度）を、切断アッセイバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）中のアニールしたｇＲＮＡ分子（５００ｎＭ）と共に総体積９μＬでプレインキュベートする。１μＬの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加によって反応を開始させ、３７℃で１時間インキュベートする。２０μＬのローディング色素（ホルムアミド中、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加によって反応液をクエンチし、９５℃で５分加熱する。切断産物を７Ｍ尿素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、ホスホイメージングによって可視化する。得られた切断産物は、相補鎖、非相補鎖、又は両方が切断されるのかどうかを示す。

【0540】

これらのアッセイの一方又は両方を使用して、候補ｇＲＮＡ分子又は候補Ｃａｓ９分子の適性を評価することができる。

【0541】

８．２ 結合アッセイ：Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合の試験
Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を評価するための例示的な方法は、これまでに、例えばＪｉｎｅｋ等、ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２；３３７（６０９６）：８１６－８２１に記載されている。

【0542】

例えば、電気泳動移動度シフトアッセイでは、脱イオン水中で各鎖（１０ｎｍｏｌ）を混合し、９５℃で３分加熱し、室温にゆっくり冷却することによって、標的ＤＮＡ二重鎖が形成される。全てのＤＮＡは、１×ＴＢＥを含有する８％天然ゲルで精製される。ＵＶシャドーイングによってＤＮＡバンドを可視化し、切り出し、ＤＥＰＣ処理したＨ_２Ｏにゲル断片を浸すことによって溶出させる。溶出したＤＮＡをエタノール沈殿させ、ＤＥＰＣ処理したＨ_２Ｏに溶解させる。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを３７℃で３０分使用して、ＤＮＡサンプルの５’末端を［γ－３２Ｐ］－ＡＴＰで標識する。ポリヌクレオチドキナーゼを６５℃で２０分熱変性させ、カラムを使用して取り込まれなかった放射標識を除去する。結合アッセイを、１０μＬの総体積で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ及び１０％グリセロールを含有するバッファー中で実行する。Ｃａｓ９タンパク質分子を、等モル量の予めアニールさせたｇＲＮＡ分子と共にプログラム化し、１００ｐＭから１μＭまで滴定する。放射標識したＤＮＡを、２０ｐＭの最終濃度まで添加する。サンプルを３７℃で１時間インキュベートし、４℃で１×ＴＢＥ及び５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する８％天然ポリアクリルアミドゲルで分離する。ゲルを乾燥させ、ホスホイメージングによってＤＮＡを可視化する。

【0543】

８．３ 示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）
Ｃａｓ９－ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、ＤＳＦを介して測定することができる。この技術は、結合ＲＮＡ分子、例えばｇＲＮＡの添加などの好都合な条件下で増加させることができるタンパク質の熱安定性を測定する。

【0544】

このアッセイは、２つの異なるプロトコール、すなわちｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質の最良の化学量論的な比率を試験する１つのプロトコール、及びＲＮＰ形成にとって最良の溶液条件を決定する別のプロトコールを使用して実行される。

【0545】

ＲＮＰ複合体を形成する最良の溶液を決定するために、Ｃａｓ９の２ｕＭ水溶液＋１０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ－６６５０）を３８４ウェルのプレートに分配する。次いで様々なｐＨ及び塩を有する溶液で希釈した等モル量のｇＲＮＡを添加する。室温で１０分インキュベートし、短時間の遠心分離で全ての気泡を除去した後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウェアを備えたＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に温度を１℃ずつ上昇させながら２０℃から９０℃への勾配を実行する。

【0546】

第２のアッセイは、上記のアッセイ１からの最適なバッファー中で様々な濃度のｇＲＮＡを２ｕＭのＣａｓ９と共に混合し、３８４ウェルのプレート中で室温で１０分インキュベートすることからなる。等体積の最適なバッファー＋１０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ－６６５０）を添加し、プレートをＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ接着剤（ＭＳＢ－１００１）で密封する。短時間の遠心分離で全ての気泡を除去した後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウェアを備えたＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に温度を１℃ずつ上昇させながら２０℃から９０℃への勾配を実行する。

【0547】

９．ゲノム編集手法
例えば本明細書に記載される手法又は経路の一又は複数を使用して、例えばＮＨＥＪを使用した、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子、例えば、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子の標的化された変更（例えば、ノックアウト）のための、組成物、ゲノム編集系及び方法が本明細書に記載される。また、ＲＳ１、ＲＬ２、及び／又はＬＡＴ遺伝子の標的化されたノックダウンのための方法も本明細書に記載される。

【0548】

９．１ 遺伝子標的化のためのＮＨＥＪ手法
本明細書で提供される方法のある特定の実施態様では、ＮＨＥＪが媒介する変更を使用して、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置を変更する。本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼによって誘導された非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して、遺伝子特異的なノックアウトを標的化することができる。またヌクレアーゼによって誘導されたＮＨＥＪを使用して、目的の遺伝子における配列挿入物を除去する（例えば、欠失させる）こともできる。

【0549】

ある特定の実施態様において、本明細書に記載される方法に関連するゲノム変更は、ヌクレアーゼによって誘導されたＮＨＥＪ及びＮＨＥＪ修復経路のエラーを生じやすい性質に頼っている。ＮＨＥＪは、２つの末端を一緒に結合させることによってＤＮＡ中の二本鎖切断を修復するが、一般的に、２つの適合性を有する末端が、正確にはそれらが二本鎖切断によって形成されているために完全にライゲートした場合のみ、元の配列が復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は酵素的なプロセシングの対象であることが多く、結果として、末端の再結合の前に一方又は両方の鎖でヌクレオチドの付加又は除去が生じる。それにより、ＮＨＥＪ修復部位のＤＮＡ配列における挿入及び／又は欠失（インデル）突然変異の存在がもたらされる。これらの突然変異の３分の２は、典型的には読み枠を変更し、それゆえに非機能性タンパク質を生産する。加えて、読み枠を維持するが、有意な量の配列を挿入したり又は欠失させたりする突然変異が、タンパク質の機能性を破壊することができる。重要な機能性ドメイン中の突然変異は、タンパク質の重要ではない領域中の突然変異ほど許容できない可能性があるため、これは遺伝子座依存性である。

【0550】

ＮＨＥＪによって生成したインデル突然変異は事実上予測不可能であるが、所与の切断部位において、ある特定のインデル配列が好まれ、おそらくマイクロホモロジーを有する小さい領域のために集団中で過剰に存在する。欠失の長さは、広く変更することができ、最も一般的には１－５０ｂｐの範囲であるが、１００－２００ｂｐより長い長さに達していてもよい。挿入は、より短い傾向があり、切断部位に隣接して取り囲む配列の短い重複を含むことが多い。しかしながら、大きい挿入が達成される場合もあり、これらのケースにおいて、挿入された配列はしばしば、ゲノムの他の領域又は細胞中に存在するプラスミドＤＮＡに由来したものであった。

【0551】

ＮＨＥＪは、突然変異誘発性のプロセスであるため、特異的な最終配列の生成が必要ではない限り、小さい配列モチーフ（例えば、長さが５０ヌクレオチド未満又はそれに等しいモチーフ）を欠失させるのにも使用することができる。標的配列に近い二本鎖切断が標的化される場合、ＮＨＥＪ修復によって生じた欠失突然変異が不要なヌクレオチドに及ぶことが多く、それにより不要なヌクレオチドが除去される。より大きいＤＮＡセグメントの欠失のために、２つの二本鎖切断を導入すること、すなわち配列のそれぞれの側に１つずつ二本鎖切断を導入することにより、末端間にＮＨＥＪを引き起こして、介在配列全体を除去することができる。この方法で、数百キロベースもの大きさのＤＮＡセグメントを欠失させることができる。これらの手法の両方は、特異的なＤＮＡ配列を欠失させるのに使用することができるが、ＮＨＥＪのエラーを生じやすい性質のために、それでもなお修復部位においてインデル突然変異が生じる場合がある。

【0552】

両方の二本鎖を切断するｅａＣａｓ９分子及び一本鎖、又はニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子は、本明細書に記載される方法及び組成物において、ＮＨＥＪが媒介するインデルを生成するのに使用することができる。目的の遺伝子の初期コード化領域に標的化されたＮＨＥＪが媒介するインデルを使用して、目的の遺伝子をノックアウトする（すなわち、目的の遺伝子の発現をなくす）ことができる。例えば、目的の遺伝子の初期コード化領域は、コード配列の第１のエクソン内の転写開始部位直後の配列、又は転写開始部位の５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００又は５０ｂｐ未満）の配列を含む。

【0553】

９．１．１ 標的位置に対する二本鎖又は一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪが媒介するインデルを誘導する目的でｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を生成するある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ、例えば単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡ分子は、１つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチドの近傍に配置するように構成されている。ある特定の実施態様において、切断部位は、標的位置から０－３０ｂｐの間（例えば、標的位置から、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｂｐ未満）である。

【0554】

ＮＨＥＪが媒介するインデルを誘導する目的でＣａｓ９ニッカーゼと複合体化した２つのｇＲＮＡが２つの一本鎖切断を誘導するある特定の実施態様において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡは、標的位置のヌクレオチドのＮＨＥＪ修復をもたらすように２つの一本鎖切断を配置するように構成されている。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、異なる鎖の同じ位置に又は互いの少数ヌクレオチド内に切断を配置して、本質的に二本鎖切断を模倣するように構成されている。ある特定の実施態様において、より近いニックは、標的位置から０－３０ｂｐの間（例えば、標的位置から、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｂｐ未満）であり、２つのニックは、互いに２５－５５ｂｐ以内（例えば、２５から５０、２５から４５、２５から４０、２５から３５、２５から３０、５０から５５、４５から５５、４０から５５、３５から５５、３０から５５、３０から５０、３５から５０、４０から５０、４５から５０、３５から４５、又は４０から４５ｂｐの間）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０ｂｐ以下）離れている。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、一本鎖切断が標的位置のヌクレオチドのいずれかの側に存在するように構成されている。

【0555】

両方の二本鎖を切断するｅａＣａｓ９分子及び一本鎖、又はニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子は、本明細書に記載される方法及び組成物において、標的位置の両方の側の切断を生成するのに使用することができる。二本鎖又は対になった一本鎖の切断を標的位置の両方の側で生成して、２つの切断間の核酸配列（例えば、欠失した状態の２つの切断の間の領域）を除去することができる。ある特定の実施態様において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両方の側に配置するように構成されている。代替の実施態様において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡとｃａｓ９ヌクレアーゼとの複合体）を配置するように構成され、標的位置のどちらの側にも２つの一本鎖切断又は対になった一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡとＣａｓ９ニッカーゼとの複合体）を配置するように構成されている。ある特定の実施態様において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡは、標的位置のどちらの側にも一本鎖切断の２つの対（すなわち、２つのｇＲＮＡとＣａｓ９ニッカーゼとの複合体の２つの対）が生成するように構成されている。二本鎖切断又は対になったより近い２つの一本鎖ニックは、理想的には標的位置の０－５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０又は２５ｂｐ以下）であってもよい。ニッカーゼが使用される場合、対になった２つのニックは、互いに２５－５５ｂｐ以内（例えば、２５から５０、２５から４５、２５から４０、２５から３５、２５から３０、５０から５５、４５から５５、４０から５５、３５から５５、３０から５５、３０から５０、３５から５０、４０から５０、４５から５０、３５から４５、又は４０から４５ｂｐの間）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｂｐ以下）離れている。

【0556】

９．２ ＨＤＲ修復、ＨＤＲが媒介するノックイン、及び鋳型核酸
本明細書で提供される方法のある特定の実施態様において、ＨＤＲが媒介する配列変更は、外因的に提供される鋳型核酸（本明細書では、ドナーコンストラクトとも称される）を使用して、ＲＳ１、ＲＬ２又はＬＡＴ遺伝子中の一又は複数のヌクレオチドの配列を変更するのに使用される。ある特定の実施態様において、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置のＨＤＲが媒介する変更は、外因的に提供されるドナー鋳型又は鋳型核酸を用いたＨＤＲによって起こる。例えば、ドナーコンストラクト又は鋳型核酸は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更をもたらす。ある特定の実施態様において、プラスミドドナーは、相同組換えのための鋳型として使用される。ある特定の実施態様において、一本鎖ドナー鋳型は、標的配列とドナー鋳型との間のＨＤＲの代替方法（例えば、一本鎖アニーリング）によるＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更のための鋳型として使用される。ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置のドナー鋳型により実行される変更は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断又は２つの一本鎖切断を含んでいてもよい。

【0557】

ある特定の実施態様において、ＨＤＲが媒介する配列変更は、外因的に提供される鋳型核酸を使用しないで、ＲＳ１、ＲＬ２又はＬＡＴ遺伝子中の一又は複数のヌクレオチドの配列を変更するのに使用される。ある特定の実施態様において、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更は、内因性のゲノムドナー配列を用いたＨＤＲによって起こる。例えば、内因性のゲノムドナー配列は、ＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１標的位置の変更をもたらす。ある特定の実施態様において、内因性のゲノムドナー配列は、標的配列と同じ染色体に配置される。ある特定の実施態様において、内因性のゲノムドナー配列は、標的配列と異なる染色体に配置される。内因性のゲノムドナー配列によるＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断又は２つの一本鎖切断を含んでいてもよい。

【0558】

本明細書で提供される方法のある特定の実施態様において、ＨＤＲが媒介する変更は、ＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１遺伝子中の単一のヌクレオチドを変更するのに使用される。これらの実施態様は、１つの二本鎖切断又は２つの一本鎖切断のいずれかを利用する場合がある。ある特定の実施態様において、単一のヌクレオチド変更は、（１）１つの二本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）切断が標的位置のそれぞれの側で起こる２つの二本鎖切断、（４）二本鎖切断と２つの一本鎖切断とが標的位置のそれぞれの側で起こる１つの二本鎖切断及び２つの一本鎖切断、（５）一本鎖切断の対が標的位置のそれぞれの側で起こる４つの一本鎖切断、又は（６）１つの一本鎖切断を使用して取り込まれる。

【0559】

一本鎖鋳型核酸（例えば、ドナー鋳型）が使用されるある特定の実施態様において、標的位置は、代替のＨＤＲによって変更されてもよい。

【0560】

ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置のドナー鋳型により実行される変更は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、ニック、二本鎖切断、又は２つの一本鎖切断、例えば標的核酸の各鎖につき１つの一本鎖切断を含んでいてもよい。標的核酸に切断を導入した後、切断末端で切除がなされ、結果として一本鎖のオーバーハングを有するＤＮＡ領域が生じる。

【0561】

規範的なＨＤＲでは、標的核酸に対する相同配列を含む二本鎖ドナー鋳型が導入されるが、この二本鎖ドナー鋳型は、標的核酸に直接取り込まれるか、又は標的核酸の配列を変えるための鋳型として使用されるかのいずれでもよい。切断での切除の後、修復は、異なる経路によって、例えば二重のホリディジャンクションモデル（又は二本鎖切断修復、すなわちＤＳＢＲ経路）又は合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）経路によって進行させることができる。二重のホリディジャンクションモデルでは、標的核酸の２つの一本鎖オーバーハングによるドナー鋳型中の相同配列への鎖侵入が起こり、結果として２つのホリディジャンクションを有する中間体の形成が生じる。ジャンクションは、侵入鎖の末端から新しいＤＮＡが合成されるにつれて移動して、切除の結果生じるギャップを満たす。新たに合成されたＤＮＡの末端が切除された末端にライゲートされると、ジャンクションが分解され、結果として標的核酸の変更が生じる。ジャンクションが分解するときにドナー鋳型との交差が起こる可能性がある。ＳＤＳＡ経路では、１つのみの一本鎖オーバーハングがドナー鋳型に侵入し、侵入鎖の末端から新しいＤＮＡが合成されて、切除の結果生じるギャップを満たす。次いで新たに合成されたＤＮＡは残存する一本鎖オーバーハングにアニールし、新しいＤＮＡが合成されて、ギャップを満たし、鎖がライゲートされて、変更されたＤＮＡ二重鎖が産生される。

【0562】

代替ＨＤＲにおいて、一本鎖ドナー鋳型、例えば鋳型核酸が導入される。所望の標的位置を変更するための標的核酸におけるニック、一本鎖切断、又は二本鎖切断は、Ｃａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子によって媒介され、切断における切除は、一本鎖オーバーハングを出現させるためになされる。ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置を変更するために鋳型核酸の配列を取り込むことは、典型的には、上述したようにＳＤＳＡ経路によってなされる。

【0563】

鋳型核酸に関する追加の詳細は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５７９０５における「鋳型核酸」というタイトルのセクションＩＶで提供されている。

【0564】

ある特定の実施態様において、二本鎖切断は、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性、及びＲｕｖＣ様ドメイン、例えばＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を有するＣａｓ９分子、例えば野生型Ｃａｓ９によって実行される。このような実施態様は、単一のｇＲＮＡのみを必要とする。

【0565】

ある特定の実施態様において、１つの一本鎖切断、又はニックは、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９ニッカーゼ（例えばＤ１０Ａ Ｃａｓ９ニッカーゼなど）によって実行される。ニックが入れられた標的核酸は、ａｌｔ－ＨＤＲのための基質であり得る。

【0566】

ある特定の実施態様において、２つの一本鎖切断、又はニックは、ニッカーゼ活性、例えば、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性又はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を有するＣａｓ９分子によって実行される。このような実施態様は通常、２つのｇＲＮＡ、すなわち各一本鎖切断の配置につき１つずつのｇＲＮＡを必要とする。ある特定の実施態様において、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断するが、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖は切断しない。ある特定の実施態様において、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断しないが、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖を切断する。

【0567】

ある特定の実施態様において、ニッカーゼは、ＨＮＨ活性を有し、例えば、ＲｕｖＣ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えばＤ１０に突然変異を有する、例えばＤ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子（例えば配列番号１０を参照）である。Ｄ１０Ａは、ＲｕｖＣを不活性化し、それゆえにＣａｓ９ニッカーゼは、ＨＮＨ活性（のみ）を有し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば、その上にＮＧＧ ＰＡＭを有さない相補鎖）で切断を行うことができる。ある特定の実施態様において、Ｈ８４０突然変異、例えばＨ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子は、ニッカーゼとして使用することができる。Ｈ８４０Ａは、ＨＮＨを不活性化し、それゆえにＣａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（例えば、ＮＧＧ ＰＡＭを有し、その配列がｇＲＮＡと同一である鎖）で切断を行う。ある特定の実施態様において、Ｎ８６３突然変異、例えばＮ８６３Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子は、ニッカーゼとして使用することができる。Ｎ８６３Ａは、ＨＮＨを不活性化し、それゆえにＣａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（ＮＧＧ ＰＡＭを有し、その配列がｇＲＮＡと同一である鎖）で切断を行う。ある特定の実施態様において、Ｎ５８０突然変異、例えばＮ５８０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子は、ニッカーゼとして使用することができる。Ｎ５８０Ａは、ＨＮＨを不活性化し、それゆえにＣａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（ＮＧＧ ＰＡＭを有し、その配列がｇＲＮＡと同一である鎖）で切断を行う。

【0568】

２つの一本鎖ニックを配置するためにニッカーゼ及び２つのｇＲＮＡが使用されるある特定の実施態様において、１つのニックが標的核酸のプラス鎖上にあり、１つのニックが標的核酸のマイナス鎖上にある。ＰＡＭは、外側に面していてもよい。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが約０－５０、０－１００、又は０－２００ヌクレオチド離れるように選択することができる。ある特定の実施態様において、２つのｇＲＮＡの標的指向性ドメインに相補的な標的配列間にオーバーラップはない。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、オーバーラップしておらず、５０、１００、又は２００ヌクレオチド離れている。ある特定の実施態様において、２つのｇＲＮＡの使用は、例えばオフターゲット結合を減少させることによって特異性を増加させることができる（Ran 2013）。

【0569】

ある特定の実施態様において、単一のニックは、ＨＤＲ、例えばａｌｔ－ＨＤＲを誘導するのに使用することができる。ある特定の実施態様において、単一のニックは、所与の切断部位においてＮＨＥＪに対するＨＲの比率を増加させるのに使用することができる。ある特定の実施態様において、一本鎖切断は、前記ｇＲＮＡの標的指向性ドメインが相補的である標的核酸の鎖中に形成される。ある特定の実施態様において、一本鎖切断は、前記ｇＲＮＡの標的指向性ドメインが相補的である鎖以外の標的核酸の鎖中に形成される。

【0570】

９．２．１ 標的位置に対する二本鎖又は一本鎖切断の配置
鎖の１つにおける二本鎖切断又は一本鎖切断は、所望の領域中に変更が産生されているＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に十分近いと予想される。ある特定の実施態様において、その距離は、５０、１００、２００、３００、３５０又は４００ヌクレオチド以下である。ある特定の実施態様において、末端切除中にエキソヌクレアーゼが媒介する除去に供される領域内に標的位置が存在するように、切断は、標的位置に十分近いと予想される。ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置と切断との距離が大きすぎると、変更が求められる配列が末端切除に含まれない可能性があり、それゆえにそのような配列が変更されない可能性があるが、これは、ある特定の実施態様において、ドナー配列、外因的に提供されるドナー配列又は内因性のゲノムドナー配列のどちらかが、末端切除領域内の配列の変更にのみ使用されるためである。

【0571】

ある特定の実施態様において、本明細書に記載される方法は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の近くに一又は複数の切断を導入する。これらの実施態様のある特定のものにおいて、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置に隣接する２つ又はそれより多くの切断が導入される。２つ又はそれより多くの切断は、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置を含むゲノム配列を除去する（例えば、欠失させる）。本明細書に記載される全ての方法は、ＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子内のＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の変更をもたらす。

【0572】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ標的指向性ドメインは、切断事象、例えば二本鎖又は一本鎖切断を、変更、例えば突然変異が求められる領域の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置するように構成されている。切断、例えば二本鎖又は一本鎖切断は、変更、例えば突然変異が求められる領域の上流又は下流に配置されていてもよい。ある特定の実施態様において、切断は、変更が求められる領域内、例えば少なくとも２つの突然変異ヌクレオチドによって画定される領域内に配置される。ある特定の実施態様において、切断は、変更が求められる領域に直接隣接して、例えば突然変異のすぐ上流又は下流に配置される。

【0573】

ある特定の実施態様において、以下で論じられるように、一本鎖切断には、第２のｇＲＮＡ分子により配置された追加の一本鎖切断が伴う。標的指向性ドメインは、例えば、切断事象、例えば２つの一本鎖切断が、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ヌクレオチド以内に配置されるように結合する。ある特定の実施態様において、第１及び第２のｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９ニッカーゼをガイドする場合、一本鎖切断には、互いに十分近い第２のｇＲＮＡにより配置された追加の一本鎖切断が伴うように構成され、それにより所望の領域の変更を得ることができる。ある特定の実施態様において、第１及び第２のｇＲＮＡ分子は、例えばＣａｓ９がニッカーゼである場合、前記第２のｇＲＮＡにより配置された一本鎖切断が前記第１のｇＲＮＡ分子により配置された切断の１０、２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチド以内であるように構成されている。ある特定の実施態様において、２つのｇＲＮＡ分子は、異なる鎖の同じ位置に又は互いの少数ヌクレオチド内に切断を配置して、例えば本質的に二本鎖切断を模倣するように構成されている。

【0574】

ＨＤＲが媒介する配列変更を誘導する目的でｇＲＮＡ（単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡ）及びＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を誘導するある特定の実施態様において、切断部位は、標的位置から、０－２００ｂｐの間（例えば、０から１７５、０から１５０、０から１２５、０から１００、０から７５、０から５０、０から２５、２５から２００、２５から１７５、２５から１５０、２５から１２５、２５から１００、２５から７５、２５から５０、５０から２００、５０から１７５、５０から１５０、５０から１２５、５０から１００、５０から７５、７５から２００、７５から１７５、７５から１５０、７５から１２５、７５から１００ｂｐ）である。ある特定の実施態様において、切断部位は、標的位置から、０－１００ｂｐの間（例えば、０から７５、０から５０、０から２５、２５から１００、２５から７５、２５から５０、５０から１００、５０から７５又は７５から１００ｂｐ）である。

【0575】

ある特定の実施態様において、オーバーハングと共に切断を生成するのにニッカーゼを使用することによって、ＨＤＲを促進することができる。理論に拘束されることは望まないが、オーバーハングの一本鎖の性質は、例えばＮＨＥＪとは対照的に、ＨＤＲによって切断を修復する細胞の可能性を強化することができる。特異的に、ある特定の実施態様において、第１のニッカーゼを第１の標的配列に標的化する第１のｇＲＮＡと、第１の標的配列とは逆のＤＮＡ鎖上にあり、第１のニックからオフセットされている第２の標的配列に、第２のニッカーゼを標的化する第２のｇＲＮＡとを選択することによって、ＨＤＲは促進される。

【0576】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、予め選択されたヌクレオチドから十分に離れてヌクレオチドが変更されない切断事象を配置するように構成されている。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、エクソンを有する配列の変更又は不要なスプライシング事象を回避するために、イントロン／エクソンの境界、又は天然スプライスシグナルから十分に離れてイントロンの切断事象を配置するように構成されている。ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、第１、第２、第３及び／又は第４のｇＲＮＡ分子であり得る。

【0577】

９．２．２ 互いに関連する第１の切断及び第２の切断の配置
ある特定の実施態様において、以下で論じられるように、二本鎖切断には、第２のｇＲＮＡ分子により配置された追加の二本鎖切断が伴ってもよい。

【0578】

ある特定の実施態様において、二本鎖切断には、第２のｇＲＮＡ分子及び第３のｇＲＮＡ分子により配置された２つの追加の一本鎖切断が伴ってもよい。

【0579】

ある特定の実施態様において、第１及び第２の一本鎖切断には、第３のｇＲＮＡ分子及び第４のｇＲＮＡ分子によって配置された２つの追加の一本鎖切断が伴ってもよい。

【0580】

２つ又はそれより多くの切断事象、例えば標的核酸中の二本鎖又は一本鎖切断を配置するのに２つ又はそれより多くのｇＲＮＡが使用される場合、２つ又はそれより多くの切断事象は、同一又は異なるＣａｓ９タンパク質によってなされてもよい。例えば、２つの二本鎖切断を配置するのに２つのｇＲＮＡが使用される場合、両方の二本鎖切断を作り出すのに単一のＣａｓ９ヌクレアーゼを使用することができる。２つ又はそれより多くの一本鎖切断（ニック）を配置するのに２つ又はそれより多くのｇＲＮＡが使用される場合、２つ又はそれより多くのニックを作り出すのに単一のＣａｓ９ニッカーゼを使用することができる。少なくとも１つの二本鎖切断及び少なくとも１つの一本鎖切断を配置するのに２つ又はそれより多くのｇＲＮＡが使用される場合、２つのＣａｓ９タンパク質を使用することができ、ここで２つのＣａｓ９タンパク質は、例えば、１つはＣａｓ９ヌクレアーゼであり、１つはＣａｓ９ニッカーゼである。ある特定の実施態様において、２つ又はそれより多くのＣａｓ９タンパク質を使用して、２つ又はそれより多くのＣａｓ９タンパク質を逐次的に送達することにより、標的核酸中の所望の位置における一本鎖切断の特異性に対する二本鎖切断の特異性を制御することができる。

【0581】

ある特定の実施態様において、第１のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメイン及び第２のｇＲＮＡ分子の標的指向性ドメインは、標的核酸分子の逆の鎖に相補的である。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側に向くように構成されている。

【0582】

ある特定の実施態様において、２つのｇＲＮＡは、互いに予め選択された距離の２つの位置でＣａｓ９が媒介する切断を指示するように選択される。ある特定の実施態様において、２つの切断点は、標的核酸の逆の鎖にある。ある特定の実施態様において、２つの切断点は、平滑末端化された切断を形成し、他の実施態様において、２つの切断点は、ＤＮＡ末端が１つ又は２つのオーバーハング（例えば、一又は複数の５’オーバーハング及び／又は一又は複数の３’オーバーハング）を含むようにオフセットされる。ある特定の実施態様において、各切断事象は、ニックである。ある特定の実施態様において、ニックは、それらが二本鎖切断機構によって認識される切断を形成するのに十分な程度に互いに近い（例えばＳＳＢｒ機構によって認識されるのとは対照的に）。ある特定の実施態様において、ニックは、それらがＨＤＲの基質であるオーバーハングを作り出すのに十分な程度に離れており、すなわち切断の配置は、数回の切除を経たＤＮＡ基質を模倣する。例えば、ある特定の実施態様において、ニックは、前進的な切除のための基質であるオーバーハングが作り出されるように間隔を開けている。ある特定の実施態様において、２つの切断は、互いの２５－６５ヌクレオチド以内で間隔を開けている。２つの切断は、例えば、互いの約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又は６５ヌクレオチドであり得る。２つの切断は、例えば、互いの少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又は６５ヌクレオチドであり得る。２つの切断は、例えば、互いの最大で約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又は６５ヌクレオチドであり得る。ある特定の実施態様において、２つの切断は、互いの約２５－３０、３０－３５、３５－４０、４０－４５、４５－５０、５０－５５、５５－６０、又は６０－６５ヌクレオチドである。

【0583】

ある特定の実施態様において、切除された切断を模倣する切断は、３’オーバーハング（例えば、ＤＳＢ及びニックによって生成したものであり、ここでニックは、３’オーバーハングを残す）、５’オーバーハング（例えば、ＤＳＢ及びニックによって生成したものであり、ここでニックは、５’オーバーハングを残す）、３’及び５’オーバーハング（例えば、３つの切断によって生成したもの）、２つの３’オーバーハング（例えば、互いにオフセットしている２つのニックによって生成したもの）、又は２つの５’オーバーハング（例えば、互いにオフセットしている２つのニックによって生成したもの）を含む。

【0584】

ＨＤＲが媒介する変更を誘導する目的で、Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化した２つのｇＲＮＡ（独立して、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡ）が２つの一本鎖切断を誘導するある特定の実施態様において、より近いニックは、標的位置から、０－２００ｂｐの間（例えば、０から１７５、０から１５０、０から１２５、０から１００、０から７５、０から５０、０から２５、２５から２００、２５から１７５、２５から１５０、２５から１２５、２５から１００、２５から７５、２５から５０、５０から２００、５０から１７５、５０から１５０、５０から１２５、５０から１００、５０から７５、７５から２００、７５から１７５、７５から１５０、７５から１２５、又は７５から１００ｂｐ）であり、２つのニックは、理想的には、互いの２５－６５ｂｐ以内（例えば、２５から５０、２５から４５、２５から４０、２５から３５、２５から３０、３０から５５、３０から５０、３０から４５、３０から４０、３０から３５、３５から５５、３５から５０、３５から４５、３５から４０、４０から５５、４０から５０、４０から４５ｂｐ、４５から５０ｂｐ、５０から５５ｂｐ、５５から６０ｂｐ、又は６０から６５ｂｐ）であり、互いに１００ｂｐ以下離れていてもよい（例えば、互いに９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、又は５ｂｐ以下離れている）。ある特定の実施態様において、切断部位は、標的位置から、０－１００ｂｐの間（例えば、０から７５、０から５０、０から２５、２５から１００、２５から７５、２５から５０、５０から１００、５０から７５、又は７５から１００ｂｐ）である。

【0585】

ある特定の実施態様において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両方の側に配置するように構成されている。ある特定の実施態様において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡとｃａｓ９ヌクレアーゼとの複合体）を配置するように構成され、標的位置のどちらの側にも２つの一本鎖切断又は対になった一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡとＣａｓ９ニッカーゼとの複合体）を配置するように構成されている。ある特定の実施態様において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡは、標的位置のどちらの側にも一本鎖切断の２つの対（すなわち、２つのｇＲＮＡとＣａｓ９ニッカーゼとの複合体の２つの対）が生成するように構成されている。二本鎖切断又は対になったより近い２つの一本鎖ニックは、理想的には標的位置の０－５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０又は２５ｂｐ以下）であってもよい。ニッカーゼが使用される場合、対になった２つのニックは、ある特定の実施態様において、互いの２５－６５ｂｐ以内（例えば、２５から５５、２５から５０、２５から４５、２５から４０、２５から３５、２５から３０、５０から５５、４５から５５、４０から５５、３５から５５、３０から５５、３０から５０、３５から５０、４０から５０、４５から５０、３５から４５、４０から４５ｂｐ、４５から５０ｂｐ、５０から５５ｂｐ、５５から６０ｂｐ、又は６０から６５ｂｐの間）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０又は１０ｂｐ以下）離れている。

【0586】

Ｃａｓ９分子を切断に標的化するのに２つのｇＲＮＡが使用される場合、Ｃａｓ９分子の異なる組合せが想定される。ある特定の実施態様において、第１のｇＲＮＡは、第１のＣａｓ９分子を第１の標的位置に標的化するのに使用され、第２のｇＲＮＡは、第２のＣａｓ９分子を第２の標的位置に標的化するのに使用される。ある特定の実施態様において、第１のＣａｓ９分子は、標的核酸の第１の鎖にニックを作り出し、第２のＣａｓ９分子は、逆の鎖にニックを作り出し、結果として二本鎖切断（例えば、平滑末端化された切断又はオーバーハングを有する切断）が起こる。

【0587】

１つの一本鎖切断を１つの鎖に標的化し、第２の一本鎖切断を逆の鎖に標的化するために、ニッカーゼの異なる組合せを選択することができる。組合せを選択する場合、１つの活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼと、１つの活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼとが存在することを考慮に入れてもよい。ある特定の実施態様において、ＲｕｖＣ様ドメインは、標的核酸分子の非相補鎖を切断する。ある特定の実施態様において、ＨＮＨ様ドメインは、一本鎖相補的ドメイン、例えば二本鎖核酸分子の相補鎖を切断する。一般的に、両方のＣａｓ９分子が同じ活性ドメインを有する（例えば、両方が活性ＲｕｖＣドメインを有するか、又は両方が活性ＨＮＨドメインを有する）場合、標的の逆の鎖に結合する２つのｇＲＮＡを選択することができる。より詳細には、ある特定の実施態様において、第１のｇＲＮＡは、標的核酸の第１の鎖と相補的であり、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼと結合し、そのニッカーゼに、その第１のｇＲＮＡに非相補的な鎖、すなわち標的核酸の第２の鎖を切断させる。第２のｇＲＮＡは、標的核酸の第２の鎖と相補的であり、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼと結合し、そのニッカーゼに、その第２のｇＲＮＡに非相補的な鎖、すなわち標的核酸の第１の鎖を切断させる。逆に言えば、ある特定の実施態様において、第１のｇＲＮＡは、標的核酸の第１の鎖と相補的であり、活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼと結合し、そのニッカーゼに、その第１のｇＲＮＡに相補的な鎖、すなわち標的核酸の第１の鎖を切断させる。第２のｇＲＮＡは、標的核酸の第２の鎖と相補的であり、活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼと結合し、そのニッカーゼに、その第２のｇＲＮＡに相補的な鎖、すなわち標的核酸の第２の鎖を切断させる。別のアレンジメントにおいて、１つのＣａｓ９分子が活性ＲｕｖＣ様ドメインを有し、他のＣａｓ９分子が活性ＨＮＨドメインを有する場合、両方のＣａｓ９分子のｇＲＮＡが標的核酸の同じ鎖に相補的であってもよく、それにより、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するＣａｓ９分子が非相補鎖を切断することができ、ＨＮＨドメインを有するＣａｓ９分子が相補鎖を切断することができ、結果として二本鎖切断が生じる。

【0588】

９．２．３ ドナー鋳型の相同性アーム
例えば切除された一本鎖オーバーハングによるドナー鋳型内の相補的領域の発見を可能にするために、相同性アームは、少なくとも末端切除が起こる可能性がある領域まで伸長すると予想される。全体の長さは、例えばプラスミドのサイズ又はウイルスパッケージングの限界などのパラメーターによって限定され得る。ある特定の実施態様において、相同性アームは、繰り返しの要素、例えばＡｌｕリピート又はＬＩＮＥリピートまで伸長しない。

【0589】

例示的な相同性アームの長さとしては、少なくとも５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、又は５０００ヌクレオチドが挙げられる。ある特定の実施態様において、相同性アームの長さは、５０－１００、１００－２５０、２５０－５００、５００－７５０、７５０－１０００、１０００－２０００、２０００－３０００、３０００－４０００、又は４０００－５０００ヌクレオチドである。

【0590】

鋳型核酸は、この用語が本明細書で使用される場合、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の構造を変更するのにＣａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子と共に使用することができる核酸配列を指す。ある特定の実施態様において、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置は、一又は複数のヌクレオチドが付加される標的核酸上の、２つのヌクレオチド間の部位、例えば隣接するヌクレオチド間の部位であってもよい。代替として、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置は、鋳型核酸によって変更される一又は複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。

【0591】

ある特定の実施態様において、標的核酸は、典型的には切断部位又は切断部位の近くに、鋳型核酸の配列の一部又は全てを有するように修飾される。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、一本鎖である。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、二本鎖である。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、ＤＮＡ、例えば二本鎖ＤＮＡである。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、一本鎖ＤＮＡである。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡと同じベクターバックボーン、例えばＡＡＶゲノム、プラスミドＤＮＡ上にコードされている。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、インビボでベクターバックボーンから切り出され、例えば、鋳型核酸は、ｇＲＮＡ認識配列が隣接する。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、内因性のゲノム配列を含む。

【0592】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、ＨＤＲ事象に参加することによって標的位置の構造を変更する。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、標的位置の配列を変更する。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、修飾された、又は天然に存在しない塩基の標的核酸への取り込みをもたらす。

【0593】

典型的には、鋳型配列は、標的配列が媒介する破損又は標的配列との触媒による組換えを受ける。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、ｅａＣａｓ９が媒介する切断事象によって切断される標的配列上の部位に対応する配列を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、第１のＣａｓ９が媒介する事象で切断される標的配列上の第１の部位、及び第２のＣａｓ９が媒介する事象で切断される標的配列上の第２の部位の両方に対応する配列を含む。

【0594】

鋳型核酸は、典型的には、以下の成分：
［５’相同性アーム］－［置き換え配列］－［３’相同性アーム］
を含む。

【0595】

相同性アームは染色体への組換えをもたらし、したがって望ましくない要素、例えば突然変異又はシグネチャーを、置き換え配列で置き換える。ある特定の実施態様において、相同性アームは、最も遠位の切断部位に隣接する。

【0596】

ある特定の実施態様において、５’相同性アームの３’末端は、置き換え配列の５’末端の隣の位置にある。ある特定の実施態様において、５’相同性アームは、置き換え配列の５’末端から、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、又は５０００ヌクレオチド５’に伸長していてもよい。

【0597】

ある特定の実施態様において、３’相同性アームの５’末端は、置き換え配列の３’末端の隣の位置にある。ある特定の実施態様において、３’相同性アームは、置き換え配列の３’末端から、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、又は５０００ヌクレオチド３’に伸長していてもよい。

【0598】

ある特定の実施態様において、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置における一又は複数のヌクレオチドを変更するために、相同性アーム、例えば５’及び３’相同性アームがそれぞれ、最も遠位のｇＲＮＡに隣接する配列の約１０００ｂｐ（例えば、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置のいずれかの側における配列の１０００ｂｐ）を含んでいてもよい。

【0599】

ある特定の実施態様において、一方又は両方の相同性アームは、ある特定の配列リピート要素、例えばＡｌｕリピート又はＬＩＮＥ要素などを回避するために、短くなっていてもよい。例えば、５’相同性アームは、配列リピート要素を回避するために、短くなっていてもよい。ある特定の実施態様において、３’相同性アームは、配列リピート要素を回避するために、短くなっていてもよい。ある特定の実施態様において、５’及び３’相同性アームの両方は、ある特定の配列リピート要素などを回避するために、短くなっていてもよい。

【0600】

ある特定の実施態様において、ＨＳＶ ＲＳ１標的位置、ＨＳＶ ＲＬ２標的位置、又はＨＳＶ ＬＡＴ標的位置の配列を変更するための鋳型核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）として使用するために設計されてもよい。ｓｓＯＤＮを使用する場合、５’及び３’相同性アームの長さは、約２００ｂｐまでの範囲であってもよく、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００ｂｐの長さである。それより長い相同性アームも、ｓｓＯＤＮに関してオリゴヌクレオチド合成を改善し続けるために可能である。ある特定の実施態様において、それより長い相同性アームは、化学合成以外の方法によって、例えば、長い二本鎖核酸を変性させ鎖の１つを精製することによって、例えば、固体基質に固定された鎖特異的配列に関する親和性によって作製される。

【0601】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸が、相同性部分をニックの５’方向に（すなわち、ニックが入れられた鎖の５’方向に）伸長させた場合、ａｌｔ－ＨＤＲは、より効率的に進行する。したがって、ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、より長い相同性アーム及びより短い相同性アームを有し、より長い相同性アームは、ニックの５’にアニールすることができる。ある特定の実施態様において、ニックの５’方向にアニールすることができるアームは、ニックから、又は置き換え配列の５’若しくは３’末端から、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、又は５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施態様において、ニックの５’方向にアニールすることができるアームは、ニックの３’方向にアニールすることができるアームより、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、又は約５０％長い。ある特定の実施態様において、ニックの５’方向にアニールすることができるアームは、ニックの３’方向にアニールすることができるアームより、少なくとも２倍、３倍、４倍、又は５倍長い。ｓｓＤＮＡ鋳型が無傷の鎖又はニックが入れられた鎖にアニールできるかどうかに応じて、ニックの５’方向にアニールする相同性アームは、それぞれｓｓＤＮＡ鋳型の５’末端又はｓｓＤＮＡ鋳型の３’末端にあってもよい。

【0602】

同様に、ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、鋳型核酸がニックの５’方向に相同性部分を伸長させるように、５’相同性アーム、置き換え配列、及び３’相同性アームを有する。例えば、５’相同性アーム及び３’相同性アームは、実質的に同じ長さであってもよいが、置き換え配列は、ニックの３’方向よりもニックの５’方向にさらに伸長していてもよい。ある特定の実施態様において、置き換え配列は、ニックの３’末端よりもニックの５’末端に、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、２倍、３倍、４倍、又は５倍さらに伸長する。

【0603】

ある特定の実施態様において、ａｌｔ－ＨＤＲは、鋳型核酸の中心にニックがある場合、より効率的に進行する。したがって、ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、本質的に同じサイズの２つの相同性アームを有する。例えば、鋳型核酸の第１の相同性アームは、鋳型核酸の第２の相同性アームの約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％以内の長さを有していてもよい。

【0604】

同様に、ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、鋳型核酸がニックのいずれかの側で実質的に同じ距離伸長するように、５’相同性アーム、置き換え配列、及び３’相同性アームを有する。例えば、相同性アームは、異なる長さを有していてもよいが、置き換え配列は、これを相殺するように選択されてもよい。例えば、置き換え配列は、ニックの３’方向に伸長するよりも長くニックから５’方向にさらに伸長していてもよいが、ニックの相同性アームの５’は、これを相殺するためにニックの相同性アームの３’より短い。その逆も可能であり、例えば、置き換え配列は、ニックの５’方向に伸長するよりも長くニックから３’方向にさらに伸長していてもよいが、ニックの相同性アームの３’は、これを相殺するためにニックの相同性アームの５’より短い。

【0605】

９．２．４ 鋳型核酸
ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、二本鎖である。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、一本鎖である。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、一本鎖部分及び二本鎖部分を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、ニック及び／又は置き換え配列のいずれかの側に、約５０から１００ｂｐ、例えば、５５から９５、６０から９０、６５から８５、又は７０から８０ｂｐの相同性を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｂｐの、ニック若しくは置き換え配列の相同性部分の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。

【0606】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約１５０から２００ｂｐ、例えば、１５５から１９５、１６０から１９０、１６５から１８５、又は１７０から１８０ｂｐの、ニック及び／又は置き換え配列の相同性部分の３’を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、又は２００ｂｐの、ニック又は置き換え配列の相同性部分の３’を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、又は１０ｂｐ未満の、ニック又は置き換え配列の相同性部分の５’を含む。

【0607】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約１５０から２００ｂｐ、例えば、１５５から１９５、１６０から１９０、１６５から１８５、又は１７０から１８０ｂｐの、ニック及び／又は置き換え配列の相同性部分の５’を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、又は２００ｂｐの、ニック又は置き換え配列の相同性部分の５’を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、又は１０ｂｐ未満の、ニック又は置き換え配列の相同性部分の３’を含む。

【0608】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、例えば、付加され得る、又は標的核酸中の変化の鋳型になり得る一又は複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。他の実施態様において、鋳型核酸は、標的位置を修飾するのに使用できるヌクレオチド配列を含む。

【0609】

鋳型核酸は、置き換え配列を含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、５’相同性アームを含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、３’相同性アームを含む。

【0610】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、直鎖状二本鎖ＤＮＡである。その長さは、例えば、約１５０－２００ｂｐ、例えば、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｂｐであり得る。その長さは、例えば、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｂｐであり得る。ある特定の実施態様において、その長さは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｂｐを超えない。ある特定の実施態様において、二本鎖鋳型核酸は、約１６０ｂｐ、例えば、約１５５－１６５、１５０－１７０、１４０－１８０、１３０－１９０、１２０－２００、１１０－２１０、１００－２２０、９０－２３０、又は８０－２４０ｂｐの長さを有する。

【0611】

鋳型核酸は、直鎖状一本鎖ＤＮＡであってもよい。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、（ｉ）標的核酸のニックが入れられた鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖ＤＮＡ、（ｉｉ）標的核酸の無傷の鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖ＤＮＡ、（ｉｉｉ）標的核酸のプラス鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖ＤＮＡ、（ｉｖ）標的核酸のマイナス鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖ＤＮＡ、又は前述したものの１つより多くである。その長さは、例えば、約１５０－２００ヌクレオチド、例えば、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ヌクレオチドであり得る。その長さは、例えば、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ヌクレオチドであり得る。ある特定の実施態様において、長さは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ヌクレオチドを超えない。ある特定の実施態様において、一本鎖鋳型核酸は、約１６０ヌクレオチド、例えば、約１５５－１６５、１５０－１７０、１４０－１８０、１３０－１９０、１２０－２００、１１０－２１０、１００－２２０、９０－２３０、又は８０－２４０ヌクレオチドの長さを有する。

【0612】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、環状二本鎖ＤＮＡ、例えばプラスミドである。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、置き換え配列及び／又はニックのいずれかの側において、約５００から１０００ｂｐの相同性を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ｂｐの、ニック若しくは置き換え配列の相同性部分の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ｂｐの、ニック若しくは置き換え配列の相同性部分の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ｂｐ以下の、ニック若しくは置き換え配列の相同性部分の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。

【0613】

ある特定の実施態様において、一方又は両方の相同性アームは、ある特定の配列リピート要素、例えばＡｌｕリピート、ＬＩＮＥ要素などを回避するために、短くなっていてもよい。例えば、５’相同性アームは、配列リピート要素を回避するために、短くなっていてもよいし、一方で３’相同性アームは、配列リピート要素を回避するために、短くなっていてもよい。ある特定の実施態様において、５’及び３’相同性アームの両方は、ある特定の配列リピート要素などを回避するために、短くなっていてもよい。

【0614】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、アデノウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターであり、例えばｓｓＤＮＡ分子は、ＡＡＶカプシド中へのパッケージングを可能にする長さ及び配列を有する。ベクターは、例えば５ｋｂ未満であってもよく、カプシドへのパッケージングを促進するＩＴＲ配列を含有していてもよい。ベクターは、統合欠陥性である。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、置き換え配列及び／又はニックのいずれかの側において、約１５０から１０００ヌクレオチドの相同性を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチドの、ニック若しくは置き換え配列の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、少なくとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチドの、ニック若しくは置き換え配列の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、最大で１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチドの、ニック若しくは置き換え配列の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。

【0615】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、レンチウイルスベクター、例えば、ＩＤＬＶ（統合欠陥性のレンチウイルス）である。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、置き換え配列及び／又はニックのいずれかの側において、約５００から１０００ｂｐの相同性を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ｂｐの、ニック若しくは置き換え配列の相同性部分の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ｂｐの、ニック若しくは置き換え配列の相同性部分の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ｂｐ以下の、ニック若しくは置き換え配列の相同性部分の５’、ニック若しくは置き換え配列の３’、又はニック若しくは置き換え配列の５’及び３’の両方を含む。

【0616】

ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、Ｃａｓ９が鋳型核酸を認識しそれを切断しないように、一又は複数の突然変異、例えばサイレント突然変異を含む。鋳型核酸は、変更しようとする細胞のゲノム中の対応する配列と比べて、例えば少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、又は３０個のサイレント突然変異を含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、変更しようとする細胞のゲノム中の対応する配列と比べて、最大で２、３、４、５、１０、２０、３０、又は５０個のサイレント突然変異を含む。ある特定の実施態様において、ｃＤＮＡは、Ｃａｓ９が鋳型核酸を認識しそれを切断しないように、一又は複数の突然変異、例えばサイレント突然変異を含む。鋳型核酸は、変更しようとする細胞のゲノム中の対応する配列と比べて、例えば少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、又は３０個のサイレント突然変異を含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、変更しようとする細胞のゲノム中の対応する配列と比べて、最大で２、３、４、５、１０、２０、３０、又は５０個のサイレント突然変異を含む。

【0617】

ある特定の実施態様において、５’及び３’相同性アームはそれぞれ、置き換え配列に対応するヌクレオチドに隣接する配列の長さを含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する置き換え配列を含み、ここで５’相同性アーム及び３’相同性アームは、それぞれ独立して、１０又はそれより多くの、２０又はそれより多くの、５０又はそれより多くの、１００又はそれより多くの、１５０又はそれより多くの、２００又はそれより多くの、２５０又はそれより多くの、３００又はそれより多くの、３５０又はそれより多くの、４００又はそれより多くの、４５０又はそれより多くの、５００又はそれより多くの、５５０又はそれより多くの、６００又はそれより多くの、６５０又はそれより多くの、７００又はそれより多くの、７５０又はそれより多くの、８００又はそれより多くの、８５０又はそれより多くの、９００又はそれより多くの、１０００又はそれより多くの、１１００又はそれより多くの、１２００又はそれより多くの、１３００又はそれより多くの、１４００又はそれより多くの、１５００又はそれより多くの、１６００又はそれより多くの、１７００又はそれより多くの、１８００又はそれより多くの、１９００又はそれより多くの、又は２０００又はそれより多くのヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する置き換え配列を含み、ここで５’相同性アーム及び３’相同性アームは、それぞれ独立して、少なくとも５０、１００、又は１５０ヌクレオチドを含むが、繰り返しの要素を含むほど長くない。ある特定の実施態様において、鋳型核酸は、それぞれ独立して５から１００、１０から１５０、又は２０から１５０ヌクレオチドを含む５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する置き換え配列を含む。ある特定の実施態様において、置き換え配列は、任意選択的に、プロモーター及び／又はポリＡシグナルを含んでいてもよい。

【0618】

９．３ 一本鎖アニーリング
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、標的核酸中に存在する２つのリピート配列間の二本鎖切断を修復する別のＤＮＡ修復プロセスである。ＳＳＡ経路によって利用されるリピート配列は、一般的に、３０ヌクレオチドより大きい長さを有する。切断末端での切除は、標的核酸の両方の鎖にリピート配列を出現させるためになされる。切除後、リピート配列を含有する一本鎖オーバーハングは、リピート配列の不適切なアニーリング、例えばそれ自体へのアニーリングを防ぐために、ＲＰＡタンパク質でコーティングされる。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上のリピート配列のそれぞれに結合し、相補的リピート配列のアニーリングが可能になるように配列を並べる。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖のフラップは切断される。新しいＤＮＡ合成が全てのギャップを埋め、ライゲーションがＤＮＡ二重鎖を復元する。プロセシングの結果として、２つのリピート間のＤＮＡ配列が欠失する。欠失の長さは、利用される２つのリピートの配置、及び切除の経路又はプロセシビリティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）などの多くの因子に依存する場合がある。

【0619】

ＨＤＲ経路とは対照的に、ＳＳＡは、標的核酸配列を変更するのに鋳型核酸を必要としない。その代わりに、相補的リピート配列が利用される。

【0620】

９．４ 他のＤＮＡ修復経路
９．４．１ ＳＳＢＲ（一本鎖切断修復）
ゲノム中の一本鎖切断（ＳＳＢ）は、上記で論じられたＤＳＢ修復メカニズムとは異なるメカニズムであるＳＳＢＲ経路によって修復される。ＳＳＢＲ経路は、４つの主要な段階：ＳＳＢ検出、ＤＮＡ末端プロセシング、ＤＮＡギャップの充填、及びＤＮＡライゲーションを有する。より詳細な説明はＣａｌｄｅｃｏｔｔ ２００８に示されており、ここでは要約を示す。

【0621】

第１の段階において、ＳＳＢが生じると、ＰＡＲＰ１及び／又はＰＡＲＰ２が切断を認識し、修復機構を動員する。ＤＮＡ切断におけるＰＡＲＰ１の結合及び活性は一過性であり、損傷部位におけるＳＳＢｒタンパク質複合体の限局的な蓄積又は安定性を促進することによってＳＳＢｒを促進するようである。ほぼ間違いなく、これらのＳＳＢｒタンパク質の中でも最も重要なものは、ＸＲＣＣ１であり、これは、ＤＮＡ３’及び５’末端のクリーニングに関与するタンパク質などのＳＳＢｒプロセスの複数の酵素的な成分と相互作用する、それを安定化させる、及びそれを刺激する分子の足場として機能する。例えば、ＸＲＣＣ１は、末端プロセシングを促進する数種のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼベータ、ＰＮＫ、並びに３つのヌクレアーゼ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、及びＡＰＬＦ）と相互作用する。ＡＰＥ１は、エンドヌクレアーゼ活性を有する。ＡＰＬＦは、エンドヌクレアーゼ及び３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を示す。ＡＰＴＸは、エンドヌクレアーゼ及び３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有する。

【0622】

全てではないとしてもほとんどのＳＳＢの３’及び／又は５’末端は「損傷を受けている」ため、この末端プロセシングはＳＳＢＲの重要な段階である。末端プロセシングは、一般的に、末端がライゲーション可能になるように、損傷を受けた３’末端をヒドロキシル化された状態に復元すること、及び／又は損傷を受けた５’末端をリン酸部分に復元することを含む。損傷を受けた３’末端をプロセシングできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、及びＴＤＰ１が挙げられる。損傷を受けた５’末端をプロセシングできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＤＮＡポリメラーゼベータ、及びＡＰＴＸが挙げられる。またＬＩＧ３（ＤＮＡリガーゼＩＩＩ）も、末端プロセシングに関与する可能性がある。末端がクリーニングされると、ギャップの充填を起こすことができる。

【0623】

ＤＮＡギャップ充填の段階で、典型的に存在するタンパク質は、ＰＡＲＰ１、ＤＮＡポリメラーゼベータ、ＸＲＣＣ１、ＦＥＮ１（フラップエンドヌクレアーゼ１）、ＤＮＡポリメラーゼデルタ／エプシロン、ＰＣＮＡ、及びＬＩＧ１である。２つのギャップ充填方法、すなわちショートパッチ修復及びロングパッチ修復がある。ショートパッチ修復は、失われている単一のヌクレオチドの挿入を含む。一部のＳＳＢでは、「ギャップ充填」は、２つ又はそれより多くのヌクレオチドの入れ替えを継続することができる（１２塩基までの入れ替えが報告されている）。ＦＥＮ１は、入れ替えられた５’残基を除去するエンドヌクレアーゼである。Ｐｏｌβなどの複数のＤＮＡポリメラーゼがＳＳＢの修復に関与しており、ＤＮＡポリメラーゼの選択は、ＳＳＢの源及びタイプの影響を受ける。

【0624】

第４の段階において、ＬＩＧ１（リガーゼＩ）又はＬＩＧ３（リガーゼＩＩＩ）などのＤＮＡリガーゼが、末端の結合を触媒する。ショートパッチ修復はリガーゼＩＩＩを使用し、ロングパッチ修復はリガーゼＩを使用する。

【0625】

ＳＳＢＲは、時には、複製と共役している。この経路は、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、ＥＲＣＣ１、及びＦＥＮ１の一又は複数を含み得る。ＳＳＢＲを促進する可能性がある追加の因子としては、ａＰＡＲＰ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＧ、ＸＲＣＣ１、ＤＮＡポリメラーゼｂ、ＤＮＡポリメラーゼｄ、ＤＮＡポリメラーゼｅ、ＰＣＮＡ、ＬＩＧ１、ＰＮＫ、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、ＡＰＬＦ、ＴＤＰ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、及びＥＲＣＣ１が挙げられる。

【0626】

９．４．２ ＭＭＲ（ミスマッチ修復）
細胞は、３つの除去修復経路：ＭＭＲ、ＢＥＲ、及びＮＥＲを含有する。除去修復経路は、典型的にはＤＮＡの１つの鎖における損傷部位を認識し、次いでエキソ／エンドヌクレアーゼが損傷部位を除去し、１－３０ヌクレオチドのギャップを残し、それに続いてＤＮＡポリメラーゼによってギャップが充填され、最終的にリガーゼでシールされるという共通の特徴を有する。より完全な図は、Ｌｉ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）１８：８５－９８に示されており、ここでは要約を提供する。

【0627】

ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、誤って対合したＤＮＡ 塩基に作動する。

【0628】

ＭＳＨ２／６又はＭＳＨ２／３複合体の両方は、ミスマッチ認識及び修復の開始において重要な役割を果たすＡＴＰアーゼ活性を有する。ＭＳＨ２／６は、塩基－塩基ミスマッチを優先的に認識し、１又は２ヌクレオチドの誤った対合を同定するが、ＭＳＨ２／３は、より大きいＩＤの誤った対合を優先的に認識する。

【0629】

ｈＭＬＨ１は、ｈＰＭＳ２とヘテロ二量体化して、ＡＴＰアーゼ活性を有し、ＭＭＲの複数の工程にとって重要なｈＭｕｔＬαを形成する。ｈＭＬＨ１は、ＥＸＯ１を含む３’ニックにより指示されるＭＭＲにおいて重要な役割を果たすＰＣＮＡ／複製因子Ｃ（ＲＦＣ）依存性エンドヌクレアーゼ活性を有する。（ＥＸＯ１は、ＨＲ及びＭＭＲの両方に参加するものである）。ｈＭＬＨ１は、ミスマッチによって引き起こされる切り出しの終結を調節する。リガーゼＩは、この経路に関連するリガーゼである。ＭＭＲを促進する可能性がある追加の因子としては、ＥＸＯ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ３、ＤＮＡＰｏｌｄ、ＲＰＡ、ＨＭＧＢ１、ＲＦＣ、及びＤＮＡリガーゼＩが挙げられる。

【0630】

９．４．３ 塩基除去修復（ＢＥＲ）
塩基除去修復（ＢＥＲ）経路は、細胞周期にわたり活性であり、主としてゲノムから小さいへリックスを歪めない塩基損傷部位を除去することに関与する。対照的に、関連するヌクレオチド除去修復経路（次のセクションで論じられる）は、嵩高なへリックスを歪める損傷部位を修復する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９、６１９－６３１（Ａｕｇｕｓｔ ２００８）に示されており、ここでは要約を示す。

【0631】

ＤＮＡ塩基が損傷すると、塩基除去修復（ＢＥＲ）が始まり、そのプロセスは、５つの主要な工程：（ａ）損傷を受けたＤＮＡ塩基の除去；（ｂ）それに続く塩基部位の切開；（ｃ）ＤＮＡ末端のクリーンアップ；（ｄ）修復ギャップへの所望のヌクレオチドの挿入；及び（ｅ）ＤＮＡ骨格中の残存するニックのライゲーションに簡易化することができる。これらの最後の工程は、ＳＳＢＲに類似している。

【0632】

第１の工程において、損傷特異的なＤＮＡグリコシラーゼは、塩基を糖リン酸骨格に連結するＮ－グリコシド結合の切断を介して損傷を受けた塩基を切り出す。次いで関連するリアーゼ活性を有するＡＰエンドヌクレアーゼ－１（ＡＰＥ１）又は二官能性ＤＮＡグリコシラーゼがホスホジエステル骨格を切開し、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）を作り出した。ＢＥＲの第３の工程は、ＤＮＡ末端のクリーンアップを含む。ＢＥＲの第４の工程は、修復ギャップに新しい相補的ヌクレオチドを付加するＰｏｌβによって行われ、最終的な工程で、ＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩが、ＤＮＡ骨格中の残存するニックをシールする。これにより、ショートパッチＢＥＲ経路が完了し、損傷を受けたＤＮＡ塩基の大多数（～８０％）が修復される。しかしながら、工程３における５’末端が末端プロセシング活性に耐性である場合、Ｐｏｌβによる１つのヌクレオチド挿入後、次いで複製型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌδ／εへのポリメラーゼスイッチが起こり、次いで～２－８つより多くのヌクレオチドがＤＮＡ修復ギャップに付加される。これは、プロセシビリティー因子である増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）と共にフラップエンドヌクレアーゼ－１（ＦＥＮ－１）によって認識され切り出される５’フラップ構造を作り出す。次いでＤＮＡリガーゼＩがＤＮＡ骨格中の残存するニックをシールし、ロングパッチＢＥＲを完了させる。ＢＥＲ経路を促進する可能性がある追加の因子としては、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰＥ１、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ、Ｐｏｌｅ、ＸＲＣＣ１、リガーゼＩＩＩ、ＦＥＮ－１、ＰＣＮＡ、ＲＥＣＱＬ４、ＷＲＮ、ＭＹＨ、ＰＮＫＰ、及びＡＰＴＸが挙げられる。

【0633】

９．４．４ ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）
ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）は、ＤＮＡから嵩高なへリックスを歪める損傷部位を除去する重要な切り出しメカニズムである。ＮＥＲに関する追加の詳細は、Ｍａｒｔｅｉｊｎ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５、４６５－４８１（２０１４）に示されており、ここでは要約を示す。ＮＥＲは、２つのより小さい経路：グローバルゲノムＮＥＲ（ＧＧ－ＮＥＲ）及び転写共役修復ＮＥＲ（ＴＣ－ＮＥＲ）を包含する広範な経路である。ＧＧ－ＮＥＲ及びＴＣ－ＮＥＲは、ＤＮＡ傷害の認識に異なる因子を使用する。しかしながら、それらは、損傷部位の切開、修復、及びライゲーションに同じ機構を利用する。

【0634】

損傷が認識されたら、細胞は、損傷部位を含有する短い一本鎖ＤＮＡセグメントを除去する。エンドヌクレアーゼＸＰＦ／ＥＲＣＣ１及びＸＰＧ（ＥＲＣＣ５によってコードされる）は、損傷部位のいずれかの側において、損傷を受けた鎖を切断することによって損傷部位を除去し、結果として２２－３０ヌクレオチドの一本鎖ギャップが生じる。次に、細胞は、ＤＮＡギャップ充填の合成及びライゲーションを実行する。このプロセスに関与するものは、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ＤＮＡ Ｐｏｌδ、ＤＮＡ Ｐｏｌε又はＤＮＡ Ｐｏｌκ、及びＤＮＡリガーゼＩ又はＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩである。複製細胞は、ＤＮＡ ｐｏｌε及びＤＮＡリガーゼＩを使用する傾向があるが、非複製細胞は、ライゲーション工程を実行するために、ＤＮＡ Ｐｏｌδ、ＤＮＡ Ｐｏｌκ、及びＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩ複合体を使用する傾向がある。

【0635】

ＮＥＲは、以下の因子：ＸＰＡ－Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ－Ｇ、及びＬＩＧ１を含み得る。転写共役ＮＥＲ（ＴＣ－ＮＥＲ）は、以下の因子：ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＧ、ＥＲＣＣ１、及びＴＴＤＡを含み得る。ＮＥＲ修復経路を促進する可能性がある追加の因子としては、ＸＰＡ－Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ－Ｇ、ＬＩＧ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＴＴＤＡ、ＵＶＳＳＡ、ＵＳＰ７、ＣＥＴＮ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＵＶ－ＤＤＢ、ＣＡＫ部分複合体、ＲＰＡ、及びＰＣＮＡが挙げられる。

【0636】

９．４．５ 鎖間架橋（ＩＣＬ）
ＩＣＬ修復経路と呼ばれる特定の経路は、鎖間架橋を修復する。鎖間架橋、又は異なるＤＮＡ鎖における塩基間の共有結合による架橋は、複製又は転写中に起こる可能性がある。ＩＣＬ修復は、複数の修復プロセスの調整、特には、核酸分解活性、損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）、及びＨＤＲの調整を含む。架橋された塩基のいずれかの側におけるＩＣＬを切り出すためにヌクレアーゼが動員され、一方でＴＬＳ及びＨＤＲは、切断された鎖を修復するように調整される。ＩＣＬ修復は、以下の因子：エンドヌクレアーゼ、例えば、ＸＰＦ及びＲＡＤ５１Ｃ、エンドヌクレアーゼ、例えばＲＡＤ５１など、損傷乗り越えポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼゼータ及びＲｅｖ１）、及びファンコーニ貧血（ＦＡ）タンパク質、例えば、ＦａｎｃＪを含み得る。

【0637】

９．４．６ 他の経路
哺乳動物には、数種の他のＤＮＡ修復経路が存在する。

【0638】

損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）は、欠陥のある複製事象の後に残った一本鎖切断を修復するための経路であり、損傷乗り越えポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡ ｐｏｌβ及びＲｅｖ１を含む。

【0639】

エラーのない複製後修復（ＰＲＲ）は、欠陥のある複製事象の後に残った一本鎖切断を修復するための別の経路である。

【0640】

９．５ 標的化されたノックダウン
ＤＮＡレベルで遺伝子（例えば、ａＲＳ１、ＲＬ２、又はＬＡＴ遺伝子）を突然変異させることにより発現を永続的になくすＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが媒介する遺伝子ノックアウトとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓノックダウンは、人工転写因子の使用を介した遺伝子発現の一時的な低減を可能にする。Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ切断ドメインの両方において主要な残基を突然変異させること（例えばＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ突然変異）は、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９、またデッド（ｄｅａｄ）Ｃａｓ９又はｄＣａｓ９としても公知）分子の生成をもたらす。触媒的に不活性なＣａｓ９は、ｇＲＮＡと複合体を形成し、そのｇＲＮＡの標的指向性ドメインによって特定されたＤＮＡ配列に局在するが、標的ＤＮＡを切断しない。エフェクタードメイン、例えば転写抑制ドメインへのｄＣａｓ９の融合は、ｇＲＮＡによって特定されたあらゆるＤＮＡ部位へのエフェクターの補充を可能にする。酵素的に不活性な（ｅｉＣａｓ９）Ｃａｓ９分子それ自体は、コード配列における初期領域に動員されれば、転写をブロックすることができるが、転写抑制ドメイン（例えばＫＲＡＢ、ＳＩＤ又はＥＲＤ）をＣａｓ９に融合させ、標的ノックダウン位置に、例えば開始コドンの３’の配列の１０００ｂｐ以内に、又は遺伝子（例えば、ＲＬ２、ＬＡＴ、又はＲＳ１遺伝子）の開始コドンの５’のプロモーター領域の５００ｂｐ以内にそれを補充することによって、よりロバストな抑制を達成することができる。プロモーターのＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）を標的化することにより、これらの領域がＣａｓ９タンパク質により接近しやすくなり、さらに内因性転写因子のための部位を内包する可能性もより高くなることから、より効率的な遺伝子の抑制又は活性化をもたらす可能性がある。特に遺伝子抑制のために、内因性転写因子の結合部位をブロックすることが、遺伝子発現の下方調節に役立つと予想される。ある特定の実施態様において、一又は複数のｅｉＣａｓ９分子を使用して、一又は複数の内因性転写因子の結合をブロックすることができる。ある特定の実施態様において、ｅｉＣａｓ９分子は、タンパク質を修飾するクロマチンに融合していてもよい。クロマチンの状態を変更することは、標的遺伝子の発現低下をもたらすことができる。タンパク質を修飾する一又は複数のクロマチンに融合した一又は複数のｅｉＣａｓ９分子を使用して、クロマチンの状態を変更することができる。

【0641】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、公知の転写応答要素（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、公知の上流活性化配列（ＵＡＳ）、及び／又は標的ＤＮＡの発現を制御できると推測される未知の若しくは公知の機能を有する配列に標的化され得る。

【0642】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが媒介する遺伝子ノックダウンは、不要な対立遺伝子の発現又は転写を低減させるのに使用することができる。ある特定の実施態様において、遺伝子の永続的な破壊は、理想的ではない。これらの実施態様において、部位特異的な抑制が、発現を一時的に低減したり又はなくしたりするのに使用することができる。ある特定の実施態様において、Ｃａｓリプレッサーのオフターゲット作用は、Ｃａｓヌクレアーゼのオフターゲット作用ほど深刻ではない場合があるが、これは、ヌクレアーゼはあらゆるＤＮＡ配列を切断して突然変異を引き起こすことができるが、それに対してＣａｓリプレッサーは、活発に転写された遺伝子のプロモーター領域を標的化する場合にのみ作用をもたらすことができるためである。しかしながら、ヌクレアーゼが媒介するノックアウトは永続的である一方で、抑制は、Ｃａｓリプレッサーが細胞中に存在する期間しか持続しない可能性がある。リプレッサーが存在しなくなったら、内因性転写因子及び遺伝子調節要素が、発現をその天然状態まで回復させる可能性がある。

【0643】

９．６ ゲノム編集方法におけるｇＲＮＡの例
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子を、二本鎖切断又は一本鎖切断を生成するＣａｓ９分子と共に使用して、標的核酸、例えば標的位置又は標的遺伝学的シグネチャーの配列を変更することができる。これらの方法において有用なｇＲＮＡ分子は、後述される。

【0644】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ、例えばキメラｇＲＮＡは、以下の特性の一又は複数を含むように構成されている；
（ａ）ｇＲＮＡ、例えばキメラｇＲＮＡが、例えば二本鎖切断を作製するＣａｓ９分子を標的化する場合、二本鎖切断を、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００ヌクレオチド以内に、又は（ｉｉ）標的位置が末端切除領域以内にあるほど十分に近くに配置できること、；
（ｂ）ｇＲＮＡ、例えばキメラｇＲＮＡが、少なくとも１６ヌクレオチドの標的指向性ドメイン、例えば（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、又は（ｘｉ）２６ヌクレオチドの標的指向性ドメインを有すること；及び
（ｃ）（ｉ）近位及び尾部ドメインが、一緒になったとき、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチド、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌の尾部及び近位ドメイン、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチドを含むこと；
（ｃ）（ｉｉ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチド、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌のｇＲＮＡの対応する配列、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチドが存在すること；
（ｃ）（ｉｉｉ）それに対応する第１の相補性ドメインのヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４ヌクレオチド、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌のｇＲＮＡの対応する配列、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４ヌクレオチドが存在すること；
（ｃ）（ｉｖ）尾部ドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドの長さであること、例えばそれが、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌の尾部ドメイン、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドを含むこと；又は
（ｃ）（ｖ）尾部ドメインが、天然尾部ドメイン、例えば天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、又は髄膜炎菌の尾部ドメインの対応する部分の１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド又は全てを含むこと。

【0645】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、以下の特性：ａ及びｂ（ｉ）；ａ及びｂ（ｉｉ）；ａ及びｂ（ｉｉｉ）；ａ及びｂ（ｉｖ）；ａ及びｂ（ｖ）；ａ及びｂ（ｖｉ）；ａ及びｂ（ｖｉｉ）；ａ及びｂ（ｖｉｉｉ）；ａ及びｂ（ｉｘ）；ａ及びｂ（ｘ）；ａ及びｂ（ｘｉ）；ａ及びｃ；ａ、ｂ、及びｃ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、又はｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、及びｃ（ｉｉ）を含むように構成されている。

【0646】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ、例えばキメラｇＲＮＡは、以下の特性の一又は複数を含むように構成されている；
（ａ）ｇＲＮＡの一方又は両方が、例えば一本鎖切断を作製するＣａｓ９分子を標的化する場合、一本鎖切断を、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００ヌクレオチド以内に、又は（ｉｉ）標的位置が末端切除領域以内にあるほど十分に近くに配置できること；
（ｂ）一方又は両方が、少なくとも１６ヌクレオチドのx、例えば（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、又は（ｘｉ）２６ヌクレオチドの標的指向性ドメインを有すること；及び
（ｃ）（ｉ）近位及び尾部ドメインが、一緒になったとき、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチド、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌の尾部及び近位ドメイン、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチドを含むこと；
（ｃ）（ｉｉ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチド、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌のｇＲＮＡの対応する配列、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチドが存在すること；
（ｃ）（ｉｉｉ）それに対応する第１の相補性ドメインのヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４ヌクレオチド、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌のｇＲＮＡの対応する配列、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４ヌクレオチドが存在すること；
（ｃ）（ｉｖ）尾部ドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドの長さであること、例えばそれが、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌の尾部ドメイン、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドを含むこと；又は
（ｃ）（ｖ）尾部ドメインが、天然尾部ドメイン、例えば天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、又は髄膜炎菌の尾部ドメインの対応する部分の１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド又は全てを含むこと。

【0647】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、以下の特性：ａ及びｂ（ｉ）；ａ及びｂ（ｉｉ）；ａ及びｂ（ｉｉｉ）；ａ及びｂ（ｉｖ）；ａ及びｂ（ｖ）；ａ及びｂ（ｖｉ）；ａ及びｂ（ｖｉｉ）；ａ及びｂ（ｖｉｉｉ）；ａ及びｂ（ｉｘ）；ａ及びｂ（ｘ）；ａ及びｂ（ｘｉ）；ａ及びｃ；ａ、ｂ、及びｃ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、及びｃ（ｉｉ）を含むように構成されている。

【0648】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、ＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えばＲｕｖＣ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えばＤ１０に突然変異を有する、例えばＤ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えばＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えば、８４０に突然変異を有する、例えばＨ８４０Ａを有するＣａｓ９分子と共に使用される。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えばＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えば、Ｎ８６３に突然変異を有する、例えばＮ８６３Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えばＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えば、Ｎ５８０に突然変異を有する、例えばＮ５８０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。

【0649】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡの対、例えば第１及び第２のｇＲＮＡを含むキメラｇＲＮＡの対は、以下の特性の一又は複数を含むように構成されている；
（ａ）ｇＲＮＡの一方又は両方が、例えば一本鎖切断を作製するＣａｓ９分子を標的化する場合、一本鎖切断を、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００ヌクレオチド以内に、又は（ｉｉ）標的位置が末端切除領域以内にあるほど十分に近くに配置できること；
（ｂ）一方又は両方が、少なくとも１６ヌクレオチドの標的指向性ドメイン、例えば（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、又は（ｘｉ）２６ヌクレオチドの標的指向性ドメインを有すること；
（ｃ）（ｉ）近位及び尾部ドメインが、一緒になったとき、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチド、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌の尾部及び近位ドメイン、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチドを含むこと；
（ｃ）（ｉｉ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチド、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌のｇＲＮＡの対応する配列、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、又は５３ヌクレオチドが存在すること；
（ｃ）（ｉｉｉ）それに対応する第１の相補性ドメインのヌクレオチドに相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４ヌクレオチド、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌のｇＲＮＡの対応する配列、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、又は５４ヌクレオチドが存在すること；
（ｃ）（ｉｖ）尾部ドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドの長さであること、例えばそれが、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、若しくは髄膜炎菌の尾部ドメイン、又はそれらと１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以下が異なっている配列からの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドを含むこと；又は
（ｃ）（ｖ）尾部ドメインが、天然尾部ドメイン、例えば天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、又は髄膜炎菌の尾部ドメインの対応する部分の１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド又は全てを含むこと；
（ｄ）ｇＲＮＡが、標的核酸にハイブリダイズする場合、それらが、０－５０、０－１００、０－２００、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０又は少なくとも５０ヌクレオチドで分離されるように構成されていること；
（ｅ）第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡによって作製された切断が、異なる鎖上にあること；及び
（ｆ）ＰＡＭが外側に面していること。

【0650】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡの一方又は両方は、以下の特性：ａ及びｂ（ｉ）；ａ及びｂ（ｉｉ）；ａ及びｂ（ｉｉｉ）；ａ及びｂ（ｉｖ）；ａ及びｂ（ｖ）；ａ及びｂ（ｖｉ）；ａ及びｂ（ｖｉｉ）；ａ及びｂ（ｖｉｉｉ）；ａ及びｂ（ｉｘ）；ａ及びｂ（ｘ）；ａ及びｂ（ｘｉ）；ａ及びｃ；ａ、ｂ、及びｃ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、ｄ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、及びｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、及びｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、及びｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、及びｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、ｄ、及びｅを含むように構成されている。

【0651】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、ＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えばＲｕｖＣ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えばＤ１０に突然変異を有する、例えばＤ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えばＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えば、Ｈ８４０に突然変異を有する、例えばＨ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えばＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えば、Ｎ８６３に突然変異を有する、例えばＮ８６３Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えばＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えば、Ｎ５８０に突然変異を有する、例えばＮ５８０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。

【0652】

１０．標的細胞
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）又はＣａｓ９融合タンパク質及びｇＲＮＡ分子、例えばＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、細胞を操作する、例えば多種多様の細胞における標的核酸を編集するのに使用することができる。

【0653】

ある特定の実施態様において、細胞は、一又は複数の標的遺伝子、例えばＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２遺伝子、例えばＲＳ１、ＲＬ２及び／又はＬＡＴ遺伝子の１つ、２つ、又は３つを編集すること（例えば、そこに突然変異を導入すること）によって操作される。ある特定の実施態様において、細胞を、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２で感染させる。ある特定の実施態様において、細胞は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２感染を有する対象由来である。ある特定の実施態様において、細胞又は対象は、ＨＳＶ－１及び／又はＨＳＶ－２の潜伏感染を有する。ある特定の実施態様において、一又は複数の標的遺伝子（例えば、本明細書に記載される一又は複数の標的遺伝子、例えばＲＳ１、ＲＬ２及び／又はＬＡＴ遺伝子の１つ、２つ、又は３つ）の発現が、例えばインビボでモジュレートされる。

【0654】

本明細書に記載されるＣａｓ９及びｇＲＮＡ分子は、標的細胞、例えば本明細書に記載される細胞に送達することができる。ある特定の実施態様において、標的細胞は、上皮細胞であり、例えば、中咽頭の上皮細胞（例えば鼻、歯肉、唇、舌又は咽頭の上皮細胞など）、指若しくは指の爪の基部の上皮細胞、又は肛門－性器部の上皮細胞（例えば陰茎、陰嚢、陰門、膣、頚部、肛門又は大腿部の上皮細胞など）である。ある特定の実施態様において、標的細胞は、ニューロン性細胞であり、例えば、脳神経節ニューロン（例えば三叉神経節ニューロン、例えば、動眼神経の神経節ニューロン、例えば、外転神経の神経節ニューロン、例えば滑車神経の神経節ニューロン）、例えば頸神経節ニューロン、例えば仙骨神経の神経節ニューロン、感覚神経節ニューロン、皮質ニューロン、小脳ニューロン又は海馬ニューロンである。ある特定の実施態様において、標的細胞は、視細胞であり、例えば眼の上皮細胞、例えば眼瞼の上皮細胞、例えば結膜細胞、例えば結膜上皮細胞、例えば角膜実質細胞、例えば角膜縁の細胞、例えば角膜上皮細胞、例えば角膜間質細胞、例えば毛様体の細胞、例えば強膜の細胞、例えばレンズの細胞、例えば脈絡膜の細胞、例えば網膜細胞、例えば桿体光受容体細胞、例えば錐体光受容体細胞、例えば網膜色素上皮細胞、例えば水平細胞、例えば無軸索細胞、例えば神経節細胞である。

【0655】

１１．送達、製剤化及び投与経路
成分、例えばＣａｓ９分子、一又は複数のｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体）、及びドナー鋳型核酸、又は３つ全ては、様々な形態で送達、製剤化、又は投与することができる。例えば表１４及び１５を参照されたい。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子、一又は複数のｇＲＮＡ分子（例えば、２つのｇＲＮＡ分子）は、ゲノム編集系において一緒に存在する。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子をコードする配列、及び２つ又はそれより多くの（例えば、２、３、４、又はそれより多くの）異なるｇＲＮＡ分子をコードする配列は、同じ核酸分子、例えばＡＡＶベクター上に存在する。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子をコードする２つの配列、及び２つ又はそれより多くの（例えば、２、３、４、又はそれより多くの）異なるｇＲＮＡ分子をコードする配列は、同じ核酸分子、例えばＡＡＶベクター上に存在する。Ｃａｓ９又はｇＲＮＡ成分が、送達のためのＤＮＡとしてコードされている場合、ＤＮＡは、典型的には制御領域を含んでいてもよく、例えば発現を実行するためのプロモーターを含む。Ｃａｓ９分子配列に有用なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＥＦ－１ａ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、及びＣＡＧ、骨格アルファアクチンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、ジストロフィンプロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、及び平滑筋アクチンプロモーターが挙げられる。ある特定の実施態様において、プロモーターは、構成的プロモーターである。ある特定の実施態様において、プロモーターは、組織特異的なプロモーターである。ｇＲＮＡに有用なプロモーターとしては、Ｔ７．Ｈ１、ＥＦ－１ａ、７ＳＫ、Ｕ６、Ｕ１及びｔＲＮＡプロモーターが挙げられる。成分の発現を調整するために、類似の又は類似していない強度を有するプロモーターを選択することができる。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、例えばＳＶ４０ＮＬＳを含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子をコードする配列は、少なくとも２つの核局在化シグナルを含む。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子又はｇＲＮＡ分子のためのプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、又は細胞特異的プロモーターであってもよい。表１４は、どのように成分を製剤化、送達、又は投与できるかの例を提供する。

【0656】

表１５に、Ｃａｓ系の成分、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子成分及びｇＲＮＡ分子成分のための様々な送達方法を要約する。

【0657】

１１．１ Ｃａｓ９分子及び／又は一又は複数のｇＲＮＡ分子のＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）、ｇＲＮＡ分子、ドナー鋳型核酸、又はそれらの（例えば、２つの又は全ての）あらゆる組合せをコードする核酸組成物は、当該技術分野で公知の方法によって、又は本明細書に記載されるようにして、対象に投与したり又は細胞に送達したりすることができる。例えば、Ｃａｓ９をコードする及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、加えてドナー鋳型核酸は、例えば、ベクター（例えば、ウイルス又は非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡ又はＤＮＡ複合体を使用する）、又はそれらの組合せによって送達することができる。

【0658】

Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）及び／又はｇＲＮＡ分子をコードする核酸組成物は、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートされていてもよい。ドナー鋳型分子も同様に、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートされていてもよい。

【0659】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルス又はプラスミド）によって送達される。

【0660】

ベクターは、Ｃａｓ９分子及び／若しくはｇＲＮＡ分子、並びに／又は標的化される領域（例えば、標的配列）に対して高い相同性を有するドナー鋳型をコードする配列を含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、ドナー鋳型は、標的配列の全て又は一部を含む。例示的なドナー鋳型は、修復鋳型、例えば遺伝子補正鋳型、又は遺伝子突然変異鋳型、例えば、点突然変異（例えば、単一ヌクレオチド（ｎｔ）置換）鋳型）である。ベクターはまた、例えばＣａｓ９分子配列に融合したシグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、又はミトコンドリア局在化のための）をコードする配列を含んでいてもよい。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合した核局在化配列（例えば、ＳＶ４０由来）を含んでいてもよい。

【0661】

一又は複数の調節／制御要素、例えばプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、及びスプライスアクセプター又はドナーがベクターに含まれていてもよい。ある特定の実施態様において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）によって認識される。他の実施態様において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）によって認識される。ある特定の実施態様において、プロモーターは、調節されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。ある特定の実施態様において、プロモーターは、構成的プロモーターである。ある特定の実施態様において、プロモーターは、組織特異的なプロモーターである。ある特定の実施態様において、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。ある特定の実施態様において、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。

【0662】

ある特定の実施態様において、ベクター又は送達ビヒクルは、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルス生成のための）である。ある特定の実施態様において、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡウイルス）である。ある特定の実施態様において、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。ある特定の実施態様において、ウイルスは、分裂細胞に感染する。他の実施態様において、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。例示的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる。

【0663】

ある特定の実施態様において、ウイルスは、分裂細胞に感染する。他の実施態様において、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。ある特定の実施態様において、ウイルスは、分裂及び非分裂細胞の両方に感染する。ある特定の実施態様において、ウイルスは、宿主ゲノムに統合されていてもよい。ある特定の実施態様において、ウイルスは、例えばヒトで低下した免疫性を有するように操作される。ある特定の実施態様において、ウイルスは、複製能を有する。他の実施態様において、ウイルスは、複製欠損性であり、例えば、他の遺伝子で置き換えられた又は欠失した、ビリオン複製及び／又はパッケージングの追加ラウンドに必要な遺伝子のための一又は複数のコード化領域を有する。ある特定の実施態様において、ウイルスは、一又は複数のＣａｓ９分子及び／又は一又は複数のｇＲＮＡ分子の一過性発現を引き起こす。他の実施態様において、ウイルスは、長期にわたる、例えば、少なくとも１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、９カ月、１年、２年の、若しくは永続的な、一又は複数のＣａｓ９及び／又は一又は複数のｇＲＮＡ分子の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング容量は、例えば、少なくとも約４ｋｂから少なくとも約３０ｋｂまで様々であってもよく、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、又は５０ｋｂである。

【0664】

ある特定の実施態様において、ウイルスベクターは、特異的な細胞型又は組織を認識する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替のウイルスエンべロープ糖タンパク質を有するシュードタイプウイルスベクター；細胞型特異的な受容体を有する操作されたウイルスベクター（例えばペプチドリガンド、単鎖抗体、又は増殖因子などの標的化リガンドを取り入れるための、例えば一又は複数のウイルスエンべロープ糖タンパク質の遺伝学的修飾）；及び／又は一方の末端がウイルス糖タンパク質を認識し、他方の末端が標的細胞表面の部分を認識する二重特異性を有する分子架橋（例えば、リガンド－受容体、モノクローナル抗体、アビジン－ビオチン及び化学的なコンジュゲーション）を有するように操作されたウイルスベクターであってもよい。

【0665】

例示的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる。

【0666】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードする配列は、組換えレトロウイルスによって送達される。ある特定の実施態様において、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、逆転写酵素、例えば宿主ゲノムへの統合を可能にする逆転写酵素を含む。ある特定の実施態様において、レトロウイルスは、複製能を有する。他の実施態様において、レトロウイルスは、複製欠損性であり、例えば、他の遺伝子で置き換えられた、又は欠失した、ビリオン複製及びパッケージングの追加ラウンドに必要な遺伝子のための一又は複数のコード化領域を有する。

【0667】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達される。ある特定の実施態様において、ドナー鋳型核酸は、組換えレトロウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、複製欠損性であり、例えばウイルス複製に必要な一又は複数の遺伝子を含まない。

【0668】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスによって送達される。ある特定の実施態様において、ドナー鋳型核酸は、組換えアデノウイルスによって送達される。ある特定の実施態様において、アデノウイルスは、ヒトにおいて低下した免疫性を有するように操作される。

【0669】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えＡＡＶによって送達される。ある特定の実施態様において、ドナー鋳型核酸は、組換えＡＡＶによって送達される。ある特定の実施態様において、ＡＡＶは、宿主細胞、例えば本明細書に記載される標的細胞のゲノムにそのゲノムを取り込ませない。ある特定の実施態様において、ＡＡＶは、宿主細胞、例えば本明細書に記載される標的細胞のゲノムにそのゲノムの少なくとも一部を取り込ませることができる。ある特定の実施態様において、ＡＡＶは、自己相補的なアデノ関連ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、一緒にアニールして二本鎖ＤＮＡを形成する両方の鎖をパッケージングしているｓｃＡＡＶである。開示された方法で使用することができるＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、修飾されたＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ及び／又はＳ６６２Ｖでの修飾）、ＡＡＶ３、修飾されたＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ及び／又はＴ４９２Ｖでの修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、修飾されたＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖ及び／又はＴ４９２Ｖでの修飾）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０が挙げられ、さらに、シュードタイプＡＡＶ、例えばＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／６なども、開示された方法で使用することができる。ある特定の実施態様において、本明細書に記載される方法で使用することができるＡＡＶカプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１、又はＡＡＶ７ｍ８からのカプシド配列である。

【0670】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸配列は、再操作されたＡＡＶカプシドに送達され、例えば、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、又はＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１からのカプシド配列と、約５０％又はそれより高い、例えば、約６０％又はそれより高い、約７０％又はそれより高い、約８０％又はそれより高い、約９０％又はそれより高い、又は約９５％又はそれより高い配列相同性を有する再操作されたＡＡＶカプシドに送達される。

【0671】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸配列は、キメラＡＡＶカプシドによって送達される。ある特定の実施態様において、ドナー鋳型核酸は、キメラＡＡＶカプシドによって送達される。例示的なキメラＡＡＶカプシドとしては、これらに限定されないが、ＡＡＶ９ｉ１、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、又はＡＡＶ８Ｇ９が挙げられる。

【0672】

ある特定の実施態様において、ＡＡＶは、自己相補的なアデノ関連ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、一緒にアニールして二本鎖ＤＮＡを形成する両方の鎖をパッケージングしているｓｃＡＡＶである。

【0673】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ハイブリッドウイルス、例えば本明細書に記載されるウイルスの一又は複数のハイブリッドによって送達される。ある特定の実施態様において、ハイブリッドウイルスは、ＡＡＶ（例えば、あらゆるＡＡＶ血清型を有する）と、ボカウイルス、Ｂ１９ウイルス、ブタＡＡＶ、ガチョウＡＡＶ、ネコＡＡＶ、イヌＡＡＶ、又はＭＶＭとのハイブリッドである。

【0674】

パッケージング細胞は、標的細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するのに使用される。例示的なパッケージング細胞としては、アデノウイルスをパッケージングできる２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングできるψ２又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは通常、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングとそれに続く宿主又は標的細胞（適切な場合）への統合に必要な最小のウイルス配列を含有しており、他のウイルス配列は、発現させようとするタンパク質、例えばＣａｓ９分子に関する成分、例えば２つのＣａｓ９成分をコードする発現カセットで置き換えられる。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主又は標的細胞での遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。失われたウイルスの機能は、「Ｔｒｉｐｌｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」に記載されているように、パッケージング細胞株及び／又はアデノウイルスからのＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子を含有するプラスミド、及びＡＡＶからのＲｅｐ及びＣａｐ遺伝子をコードするプラスミドによって、トランス型で供給することができる。その後、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするがＩＴＲ配列が欠失したヘルパープラスミドを含有する細胞株中に、ウイルスＤＮＡがパッケージングされる。ある特定の実施態様において、ウイルスＤＮＡは、アデノウイルスからのＥ１Ａ及び／又はＥ１Ｂ遺伝子を含有するプロデューサー細胞株中にパッケージングされる。さらに細胞株を、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染させる。ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス又はＨＳＶ）又はヘルパープラスミドは、ＡＡＶベクターの複製、及びＩＴＲを有するヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列が欠如しているために有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスでの汚染は、例えばアデノウイルスがＡＡＶより高い感受性を示す熱処理によって低減することができる。

【0675】

ある特定の実施態様において、ウイルスベクターは、細胞型及び／又は組織タイプの認識が可能である。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替のウイルスエンべロープ糖タンパク質を有するシュードタイプウイルスベクター；細胞型特異的な受容体を有する操作されたウイルスベクター（例えばペプチドリガンド、単鎖抗体、増殖因子などの標的化リガンドを取り入れるための、例えばウイルスエンべロープ糖タンパク質の遺伝学的修飾）；及び／又は一方の末端がウイルス糖タンパク質を認識し、他方の末端が標的細胞表面の部分を認識する二重特異性を有する分子架橋（例えば、リガンド－受容体、モノクローナル抗体、アビジン－ビオチン及び化学的なコンジュゲーション）を有するように操作されたウイルスベクターであってもよい。

【0676】

ある特定の実施態様において、ウイルスベクターは、細胞型特異的な発現を達成する。例えば、組織特異的プロモーターは、導入遺伝子（Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ）の発現を標的細胞にだけ制限するように構築することができる。またベクターの特異性も、導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存性の制御によって媒介され得る。ある特定の実施態様において、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合効率を増加させている。例えば、融合能を有するヘマグルチン（ＨＡ）などの融合タンパク質を取り込むことにより、細胞へのウイルス取り込みを増加させることができる。ある特定の実施態様において、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、核のエンベロープの破壊を必要とし（細胞分裂中に）、それゆえに非分裂細胞に感染できないウイルスは、ウイルスのマトリックスタンパク質中に核局在化ペプチドを取り込ませて非増殖細胞の形質導入が可能になるように変更されてもよい。

【0677】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸配列は、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡ又はＤＮＡ複合体を使用する）によって送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機的に修飾されたシリカ又はケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、エレクトロポレーション、一過性の細胞圧縮又はスクイージング（例えば、Lee等、2012、Nano Lett 12: 6322-27に記載された通り）、ジーンガン、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介トランスフェクション、デンドリマー、無機ナノ粒子、リン酸カルシウム、又はそれらの組合せによって送達することができる。

【0678】

ある特定の実施態様において、エレクトロポレーションを介した送達は、カートリッジ、チャンバー又はキュベット中で、細胞を、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合すること、及び規定の持続時間及び振幅の一又は複数の電気的インパルスを適用することを含む。ある特定の実施態様において、エレクトロポレーションを介した送達は、カートリッジ、チャンバー又はキュベットに混合物を供給するデバイス（例えばポンプ）に接続された容器中で細胞がＣａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合される系を使用して実行され、ここで一又は複数の規定の持続時間及び振幅の電気的インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される。

【0679】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸配列は、ベクターベースの方法と非ベクターベースの方法との組合せによって送達される。ある特定の実施態様において、ドナー鋳型核酸は、ベクターベースの方法と非ベクターベースの方法との組合せによって送達される。例えば、ビロソームを、不活性化ウイルス（例えば、ＨＩＶ又はインフルエンザウイルス）と混合されたリポソームと併用すると、例えば呼吸器上皮細胞において、ウイルス又はリポソーム方法のいずれか単独より効率的な遺伝子移入をもたらすことができる。

【0680】

ある特定の実施態様において、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターである。ある特定の実施態様において、非ウイルスベクターは、無機ナノ粒子である。例示的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁気ナノ粒子（例えば、Ｆｅ_３ＭｎＯ_２）及びシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの結合（例えば、コンジュゲーション又は閉じ込め）を可能にする正電荷を有するポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）とコンジュゲートされていてもよい。ある特定の実施態様において、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子（例えば、ナノ粒子内部へのペイロードの閉じ込め）である。例示的な有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされた中性ヘルパー脂質を共に含むカチオン脂質、及びプロタミン、及び脂質膜でコーティングされた核酸複合体を含有するＳＮＡＬＰリポソームが挙げられる。

【0681】

以下の表１６に、遺伝子移入のための例示的な脂質を示す。

【0682】

以下の表１７に、遺伝子移入のための例示的なポリマーを示す。

【0683】

ある特定の実施態様において、ビヒクルは、ナノ粒子及びリポソーム、例えば、細胞特異的な抗原、モノクローナル抗体、単鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖類（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））、及び細胞透過性ペプチドの標的細胞の更新を増加させるように標的化された修飾を有する。ある特定の実施態様において、ビヒクルは、融合性でありエンドソームを不安定化するペプチド／ポリマーを使用する。ある特定の実施態様において、ビヒクルは、酸によって誘発されるコンフォメーション変化（例えば、カーゴのエンドソーム回避を促進するための）を受ける。ある特定の実施態様において、例えば細胞区画中での放出のために、刺激によって切断可能なポリマーが使用される。例えば、還元性の細胞環境中で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーを使用することができる。

【0684】

ある特定の実施態様において、送達ビヒクルは、生物学的な非ウイルス送達ビヒクルである。ある特定の実施態様において、ビヒクルは、弱毒化した細菌（例えば、浸潤性であるが病原及び導入遺伝子の発現を防ぐために弱毒化されるように、天然に又は人工的に操作された細菌（例えば、リステリア・モノサイトゲネス、ある特定のサルモネラ属の株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、及び改変された大腸菌）、特異的な組織を標的化するための栄養及び組織特異的親和性を有する細菌、標的の組織特異性を変更するための修飾された表面タンパク質を有する細菌）である。ある特定の実施態様において、ビヒクルは、遺伝子修飾されたバクテリオファージ（例えば、大きいパッケージング容量、より低い免疫原性を有する、哺乳動物プラスミドを維持する配列を含有する、標的化するリガンドを取り込んでいる、操作されたファージ）である。ある特定の実施態様において、ビヒクルは、哺乳動物ウイルス様粒子である。例えば、修飾されたウイルス粒子を生成することができる（例えば、「空の」粒子の精製、それに続くエクスビボにおける所望のカーゴを用いたウイルスアセンブリによって）。またビヒクルは、標的組織特異性を変更するために標的化リガンドを取り込むようにも操作することができる。ある特定の実施態様において、ビヒクルは、生物学的なリポソームである。例えば、生物学的なリポソームは、ヒト細胞由来のリン脂質ベースの粒子（例えば、赤血球ゴーストであり、これは、球状構造に分解した対象由来の赤血球であり（例えば、組織の標的化は、様々な組織又は細胞特異的リガンドの結合によって達成できる）、又は分泌性エキソゾーム、すなわちエンドサイトーシスの起点を有する対象（すなわち患者）由来の膜結合型ナノベシクル（３０－１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から産生することができ、それゆえにリガンド標的化の必要なく細胞に取り込ませることができる）である。

【0685】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ系の成分、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子の成分若しくは成分及び／又はｇＲＮＡ分子の成分若しくは成分以外の一又は複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。ある特定の実施態様において、核酸分子は、Ｃａｓ系の成分の一又は複数が送達されるのと同時に送達される。ある特定の実施態様において、核酸分子は、Ｃａｓ系の成分の一又は複数が送達される前又は後に（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日、３日、１週間、２週間、又は４週間未満）送達される。ある特定の実施態様において、核酸分子は、Ｃａｓ系の成分の一又は複数、例えばＣａｓ９分子の成分及び／又はｇＲＮＡ分子の成分が送達される手段とは異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子は、ウイルスベクター、例えば統合欠陥性のレンチウイルスによって送達することができ、Ｃａｓ９分子の成分（複数可）及び／又はｇＲＮＡ分子の成分（複数可）は、例えば、核酸（例えばＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減できるようなエレクトロポレーションによって送達することができる。ある特定の実施態様において、核酸分子は、治療用タンパク質、例えば本明細書に記載されるタンパク質をコードする。ある特定の実施態様において、核酸分子は、ＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるＲＮＡ分子をコードする。

【0686】

１１．２ Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）及び／又はｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡは、細胞、例えば本明細書に記載される標的細胞に、当該技術分野で公知の方法によって、又は本明細書に記載されるようにして送達することができる。例えば、Ｃａｓ９をコードする及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、一過性の細胞圧縮又はスクイージング（例えば、Lee等、2012、Nano Lett 12: 6322-27に記載された通り）、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、又はそれらの組合せによって送達することができる。Ｃａｓ９をコードする及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進するための分子にコンジュゲートされていてもよい。

【0687】

ある特定の実施態様において、エレクトロポレーションを介した送達は、カートリッジ、チャンバー又はキュベット中で、細胞を、Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９融合タンパク質）をコードするＲＮＡ及び／又はｇＲＮＡ分子とドナー鋳型核酸分子あり又はなしで混合すること、及び規定の持続時間及び振幅の一又は複数の電気的インパルスを適用することを含む。ある特定の実施態様において、エレクトロポレーションを介した送達は、カートリッジ、チャンバー又はキュベットに混合物を供給するデバイス（例えばポンプ）に接続された容器中で、細胞が、Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９融合タンパク質）をコードするＲＮＡ及び／又はｇＲＮＡ分子と、ドナー鋳型核酸分子あり又はなしで混合される系を使用して実行され、ここで一又は複数の規定の持続時間及び振幅の電気的インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される。Ｃａｓ９をコードする及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進するための分子にコンジュゲートされていてもよい。

【0688】

１１．３ Ｃａｓ９分子タンパク質の送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）は、当該技術分野で公知の方法によって、又は本明細書に記載されるようにして細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、一過性の細胞圧縮又はスクイージング（例えば、Lee等、2012、Nano Lett 12: 6322-27に記載された通り）、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、又はそれらの組合せによって送達することができる。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ又はｇＲＮＡを伴っていてもよい。Ｃａｓ９タンパク質は、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子にコンジュゲートされていてもよい。

【0689】

ある特定の実施態様において、エレクトロポレーションを介した送達は、カートリッジ、チャンバー又はキュベット中で、細胞を、Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９融合タンパク質）及び／又はｇＲＮＡ分子と、ドナー核酸あり又はなしで混合すること、及び規定の持続時間及び振幅の一又は複数の電気的インパルスを適用することを含む。ある特定の実施態様において、エレクトロポレーションを介した送達は、カートリッジ、チャンバー又はキュベットに混合物を供給するデバイス（例えばポンプ）に接続された容器中で細胞がＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９融合タンパク質）及び／又はｇＲＮＡ分子と混合される系を使用して実行され、ここで一又は複数の規定の持続時間及び振幅の電気的インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される。Ｃａｓ９をコードする及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進するための分子にコンジュゲートされていてもよい。

【0690】

１１．４ Ｃａｓ９分子タンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＰ送達
ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）送達を介して標的細胞に送達される。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子は、タンパク質として提供され、ｇＲＮＡ分子は転写又は合成されたＲＮＡとして提供される。ｇＲＮＡ分子は、化学合成によって生成することができる。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、標的細胞への送達前に、好適な条件下でＣａｓ９分子タンパク質とのＲＮＰ複合体を形成する。ＲＮＰ複合体は、当該技術分野で公知のあらゆる好適な方法によって、例えば、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、タンパク質又はＤＮＡベースのシャトル、機械的な力、又は液圧の力によって、標的細胞に送達することができる。ある特定の実施態様において、ＲＮＰ複合体は、エレクトロポレーションによって標的細胞に送達される。

【0691】

１１．５ 投与経路
全身性の投与様式としては、経口及び非経口経路が挙げられる。非経口経路としては、例として、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内及び腹腔内経路が挙げられる。全身的に投与される成分は、上皮又はニューロン性細胞に成分を標的化するように修飾又は製剤化されていてもよい。

【0692】

局所投与様式としては、例として、髄腔内、脊髄内、脳室内、及び実質内（例えば、脳実質又は脊髄に）が挙げられる。

【0693】

ある特定の実施態様において、局所投与様式としては、三叉神経のレベルにおける後根神経節への実質内投与が挙げられる。ある特定の実施態様において、局所投与様式としては、仙骨神経の神経節のレベルにおける後根神経節への実質内投与が挙げられる。ある特定の実施態様において、局所投与様式としては、腰神経節のレベルにおける後根神経節への実質内投与が挙げられる。ある特定の実施態様において、局所投与様式としては、胸部神経節のレベルにおける後根神経節への実質内投与が挙げられる。ある特定の実施態様において、局所投与様式としては、頸神経節、例えば上頸神経節、例えば中頸神経節、例えば下頸神経節のレベルにおける後根神経節への実質内投与が挙げられる。ある特定の実施態様において、局所投与様式としては、脳神経節、例えば脳神経節Ｉ－ＸＩＩのレベルにおける後根神経節への実質内投与が挙げられる。

【0694】

ある特定の実施態様において、より有意に少ない量の成分（全身的な手法と比較して）が、局所的に投与される場合、全身投与（例えば、静脈内）される場合と比較して作用を発揮する可能性がある。局所投与様式は、治療的有効量の成分が全身投与される場合に起こり得る毒性の副作用発生の可能性を低減するか又はなくすことができる。

【0695】

ある特定の実施態様において、本明細書に記載される成分は、上皮細胞、例えば中咽頭の上皮細胞（例えば鼻、歯肉、唇、舌又は咽頭の上皮細胞など）、指又は指の爪の基部の上皮細胞、又は肛門－性器部の上皮細胞（例えば陰茎、陰門、膣又は肛門の上皮細胞など）に送達される。ある特定の実施態様において、本明細書に記載される成分は、眼（例えば、角膜上皮、例えば角膜実質、例えば上及び下眼瞼の上皮、例えばレンズなど）に送達される。

【0696】

投与は、定期的なボーラスとして、又は内部リザーバ若しくは外部リザーバからの（例えば静脈内バッグからの）連続的注入として提供されてもよい。成分は、局所的に、例えば持続放出薬物送達デバイスからの連続放出によって投与されてもよい。

【0697】

投与は、内部リザーバからの（例えば、眼内又は眼外の位置に配置されたインプラント（米国特許第５４４３５０５号及び５７６６２４２号を参照）からの）又は外部リザーバからの（例えば静脈内バッグからの）連続的注入として提供されてもよい。成分は、局所的に、例えば、眼の内壁に固定化された持続放出薬物送達デバイスからの、又は脈絡膜への標的化された経強膜制御放出を介した連続放出によって投与されてもよい（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／００２０７、ＰＣＴ／ＵＳ０２／１４２７９、Ambati等(2000) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41:1181-1185、及びAmbati等(2000) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41:1186-1191を参照）。成分を眼の内部に局所投与するのに好適な様々なデバイスが当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第６２５１０９０号、６２９９８９５号、６４１６７７７号、６４１３５４０号、及びＰＣＴ／ＵＳ００／２８１８７を参照されたい。

【0698】

ある特定の実施態様において、成分は、長期にわたる放出を許容するように製剤化されてもよい。放出系としては、生分解性材料又は取り込まれた成分を拡散によって放出する材料のマトリックスを挙げることができる。成分は、放出系内で均一に又は不均一に分配されていてもよい。様々な放出系が有用であり得るが、しかしながら適切な系の選択は、特定の適用によって必要な放出速度に依存すると予想される。非分解性及び分解性放出系の両方を使用することができる。好適な放出系としては、ポリマー及びポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、又は無機及び有機の賦形剤及び希釈剤、例えば、これらに限定されないが、炭酸カルシウム及び糖（例えば、トレハロース）などが挙げられる。放出系は、天然又は合成であり得る。しかしながら、合成放出系が好ましく、なぜなら一般的にそれらは、より信頼性が高く、より再現可能であり、より高度に規定された放出プロファイルを生じるためである。放出系材料は、異なる分子量を有する成分が、材料を介した拡散又は材料の分解によって放出されるように選択することができる。

【0699】

代表的な合成生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリアミド、例えばポリ（アミノ酸）及びポリ（ペプチド）など；ポリエステル、例えばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、及びポリ（カプロラクトン）など；ポリ（無水物）；ポリオルトエステル；ポリカーボネート；並びにそれらの化学的誘導体（置換、化学基、例えばアルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者によって常套的に作製される他の修飾）、コポリマー並びにそれらの混合物が挙げられる。代表的な合成非分解性ポリマーとしては、例えば、ポリエーテル、例えばポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、及びポリ（テトラメチレンオキシド）など；ビニルポリマー、ポリアクリレート及びポリメタクリレート、例えばメチル、エチル、他のアルキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸及びメタクリル酸など、並びに例えばポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、及びポリ（酢酸ビニル）などの他のもの；ポリ（ウレタン）；セルロース及びその誘導体、例えばアルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース、及び様々な酢酸セルロースなど；ポリシロキサン；並びにそれらのあらゆる化学的誘導体（置換、化学基、例えばアルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者によって常套的に作製される他の修飾）、コポリマー並びにそれらの混合物が挙げられる。

【0700】

ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）ミクロスフェアも、注射に使用することができる。典型的には、ミクロスフェアは、中空のスフェアを形成するように構造化された乳酸及びグリコール酸のポリマーで構成されている。スフェアは、およそ１５－３０ミクロンの直径であってもよく、本明細書に記載される成分をローディングすることができる。

【0701】

１１．６ 成分の二峰性又は差次的な送達
Ｃａｓ系の成分、例えばＣａｓ９分子又はＣａｓ９融合タンパク質の成分及びｇＲＮＡ分子の成分の別個の送達、より特定には異なる様式での成分の送達は、例えば組織特異性及び安全性を改善することによって、性能を強化することができる。ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９変異体である。例えば、これらに限定されないが、Ｃａｓ９変異体は、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９変異体又はＳ．アウレウスのＣａｓ９変異体であってもよい。ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９変異体は、ＥＱＲ変異体である。ある特定の実施態様において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９変異体は、ＶＲＥＲ変異体である。

【0702】

ある特定の実施態様において、Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９分子）又はＣａｓ９融合タンパク質及びｇＲＮＡ分子は、異なる様式によって、又は時には本明細書で差次的な様式と称される様式によって送達される。異なる又は差次的な様式は、本明細書で使用される場合、対象の成分の分子、例えばＣａｓ９分子、又はｇＲＮＡ分子に異なる薬力学的又は薬物動態学的特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば選択された区画、組織、又は臓器中に、異なる組織分布、異なる半減期、又は異なる一時的な分布をもたらすことができる。

【0703】

いくつかの送達様式、例えば、細胞中、又は細胞の子孫中で存続する核酸ベクターによる送達、例えば細胞の核酸への自律的な複製又は挿入による送達は、より持続的な成分の発現及び成分の存在をもたらす。例としては、ウイルス、例えばアデノ関連ウイルス又はレンチウイルスによる送達が挙げられる。

【0704】

例として、成分、例えばＣａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子は、体内における、又は特定の区画、組織若しくは臓器中における送達される成分の結果生じる半減期又は持続性の点で異なる様式によって送達することができる。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、このような様式によって送達することができる。Ｃａｓ９分子の成分は、体内における、又は特定の区画又は組織若しくは臓器中における持続性又は曝露をより少なくする様式によって送達することができる。

【0705】

より一般的には、ある特定の実施態様において、第１の送達様式は、第１の成分を送達するのに使用され、第２の送達様式は、第２の成分を送達するのに使用される。第１の送達様式は、第１の薬力学的又は薬物動態学的特性を付与する。第１の薬力学的特性は、例えば、体内、区画、組織又は臓器中における成分又は成分をコードする核酸の分布、持続性、又は曝露であり得る。第２の送達様式は、第２の薬力学的又は薬物動態学的特性を付与する。第２の薬力学的特性は、例えば、体内、区画、組織又は臓器中における成分又は成分をコードする核酸の分布、持続性、又は曝露であり得る。

【0706】

ある特定の実施態様において、第１の薬力学的又は薬物動態学的特性、例えば、分布、持続性又は曝露は、第２の薬力学的又は薬物動態学的特性より制限される。

【0707】

ある特定の実施態様において、第１の送達様式は、薬力学的又は薬物動態学的特性、例えば分布、持続性又は曝露を最適化する、例えば最小化するように選択される。

【0708】

ある特定の実施態様において、第２の送達様式は、薬力学的又は薬物動態学的特性、例えば分布、持続性又は曝露を最適化する、例えば最大にするように選択される。

【0709】

ある特定の実施態様において、第１の送達様式は、比較的持続的な要素、例えば核酸、例えばプラスミド又はウイルスベクター、例えばＡＡＶ又はレンチウイルスの使用を含む。このようなベクターは比較的持続的であるため、それらから転写された生成物は、比較的持続的であると予想される。

【0710】

ある特定の実施態様において、第２の送達様式は、比較的一過性の要素、例えばＲＮＡ又はタンパク質を含む。

【0711】

ある特定の実施態様において、第１の成分は、ｇＲＮＡを含み、送達様式は、比較的持続的であり、例えばｇＲＮＡは、プラスミド又はウイルスベクター、例えばＡＡＶ又はレンチウイルスから転写される。これらの遺伝子はタンパク質産物をコードしておらず、ｇＲＮＡは単独で作用できないため、このような遺伝子の転写は、生理的な重要性はほとんどないと予想される。第２の成分、Ｃａｓ９分子（例えばｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）は、一過性の方式で、例えばｍＲＮＡ又はタンパク質として送達され、完全なＣａｓ９分子/ｇＲＮＡ分子複合体のみが存在し、短期間で活性であることを確実にする。

【0712】

さらに成分は、異なる分子形態で、又は安全性及び組織特異性を強化するように互いに補い合う異なる送達ベクターを用いて送達することができる。

【0713】

差次的な送達様式の使用は、性能、安全性及び有効性を強化することができる。例えば、最終的に起こるオフターゲット修飾を低減することができる。あまり持続的ではない様式による免疫原性の成分、例えばＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９又はｅｉＣａｓ９分子）又はＣａｓ９融合タンパク質の送達は、バクテリア由来Ｃａｓ酵素からのペプチドがＭＨＣ分子によって細胞表面上に提示されると、免疫原性を低減することができる。２部構成の送達系は、これらの欠点を軽減することができる。

【0714】

差次的な送達様式は、成分を異なるがオーバーラップする標的領域に送達するのに使用することができる。活性複合体の形成は、標的領域のオーバーラップの外側で最小化される。したがって、ある特定の実施態様において、第１の成分、例えばｇＲＮＡ分子は、第１の空間的な分布、例えば組織分布をもたらす第１の送達様式によって送達される。第２の成分、例えばＣａｓ９分子（例えばｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）は、第２の空間的な分布、例えば組織分布をもたらす第２の送達様式によって送達される。ある特定の実施態様において、第１の様式は、リポソーム、ナノ粒子、例えば、ポリマーナノ粒子、及び核酸、例えばウイルスベクターから選択される第１の要素を含む。第２の様式は、所定の群から選択される第２の要素を含む。ある特定の実施態様において、第１の送達様式は、第１の標的化する要素、例えば細胞特異的な受容体又は抗体を含み、第２の送達様式はその要素を含まない。実施態様において、第２の送達様式は、第２の標的化する要素、例えば第２の細胞特異的な受容体又は第２の抗体を含む。

【0715】

Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子又はｅｉＣａｓ９分子）をウイルス送達ベクター、リポソーム、又はポリマーナノ粒子で送達すると、単一の組織のみを標的化することが望ましい可能性がある場合でも、複数の組織に送達され複数の組織で治療活性が生じる可能性がある。２部構成の送達系は、この問題を解決し、組織特異性を強化することができる。ｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子は、異なるがオーバーラップする組織親和性を有する別々の運搬手段にパッケージングされる場合、両方のベクターによって標的化される組織でのみ、十分機能的な複合体が形成される。

【0716】

１１．７ エクスビボの送達
ある特定の実施態様において、表１４に記載されるゲノム編集系の各成分を細胞に導入し、次いでこれを例えば対象に導入し、細胞を対象から取り出し、エクスビボで操作し、次いで対象に導入する。成分を導入する方法としては、例えば表１５に記載される送達方法のいずれかを挙げることができる。

【0717】

１２．修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチド、及び核酸
修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドが、核酸中に、例えば特にｇＲＮＡ中に存在していてもよく、さらにはＲＮＡの他の形態、例えばｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、又はｓｉＲＮＡ中にも存在していてもよい。本明細書に記載される場合、「ヌクレオシド」は、五炭糖分子（ペントース又はリボース）又はそれらの誘導体、及び有機塩基、プリン若しくはピリミジン、又はそれらの誘導体を含有する化合物と定義される。本明細書に記載される場合、「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。

【0718】

修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、
（ｉ）ホスホジエステル骨格結合中の、結合していないリン酸と酸素の一方若しくは両方及び／又は結合しているリン酸と酸素の一若しくは複数の、変更、例えば置き換え；
（ｉｉ）リボースの糖の成分、例えばリボースの糖における２’ヒドロキシルの成分の変更、例えば置き換え；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーでの大規模な置き換え；
（ｉｖ）天然核酸塩基の修飾又は置き換え；
（ｖ）リボース－リン酸骨格の置き換え又は修飾；
（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾若しくは置き換え又は部分のコンジュゲーション；及び
（ｖｉｉ）糖の修飾
の一又は複数を含んでいてもよい。

【0719】

上記で列挙した修飾を組み合わせて、２つ、３つ、４つ、又はそれより多くの修飾を有し得る修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドを提供することができる。例えば、修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドは、修飾された糖及び修飾された核酸塩基を有していてもよい。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡの塩基毎に修飾されており、例えば、全ての塩基が修飾されたリン酸基を有し、例えば全てがホスホロチオエート基である。ある特定の実施態様において、単分子又はモジュラーｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、又は実質的に全てが、ホスホロチオエート基で置き換えられている。

【0720】

ある特定の実施態様において、修飾されたヌクレオチド、例えば修飾を有するヌクレオチドは、本明細書に記載される場合、核酸、例えば「修飾された核酸」に取り込まれていてもよい。ある特定の実施態様において、修飾された核酸は、１つ、２つ、３又はそれより多くの修飾されたヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様において、修飾された核酸中の位置の、少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％）が、修飾されたヌクレオチドである。

【0721】

非修飾の核酸は、例えば細胞のヌクレアーゼによる分解を受けやすい場合がある。例えば、ヌクレアーゼは、核酸ホスホジエステル結合を加水分解することができる。したがって、ある特定の実施態様において、本明細書に記載される修飾された核酸は、例えばヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、一又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含有していてもよい。

【0722】

ある特定の実施態様において、本明細書に記載される修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオチド、及び修飾された核酸は、インビボ及びエクスビボの両方で細胞の集団に導入される場合、自然免疫応答の低減を示す可能性がある。用語「自然免疫応答」は、一般的にウイルス又は細菌起源の一本鎖核酸などの外因性核酸に対する細胞応答を含み、サイトカイン発現及び放出の誘導、特にインターフェロン、及び細胞死を含む。ある特定の実施態様において、本明細書に記載される修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオチド、及び修飾された核酸は、主溝の相互作用パートナーと核酸との結合を破壊することができる。ある特定の実施態様において、本明細書に記載される修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオチド、及び修飾された核酸は、インビボ及びエクスビボの両方で細胞の集団に導入される場合、自然免疫応答の低減を示し、さらに主溝の相互作用パートナーと核酸との結合を破壊することもできる。

【0723】

１２．１ 化学基の定義
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖状又は分岐状の飽和した炭化水素基を指すことを意味する。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ－プロピル及びイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１から約２０、２から約２０、１から約１２、１から約８、１から約６、１から約４、又は１から約３個の炭素原子を含有していてもよい。

【0724】

「アリール」は、本明細書で使用される場合、単環式又は多環式（例えば、２、３又は４つの縮合環を有する）芳香族炭化水素、例えばフェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどを指す。ある特定の実施態様において、アリール基は、６から約２０個の炭素原子を有する。

【0725】

「アルケニル」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。

【0726】

「アルキニル」は、本明細書で使用される場合、２－１２個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状の炭化水素鎖を指し、一又は複数の三重結合を有することを特徴とする。アルキニル基の例としては、これらに限定されないが、エチニル、プロパルギル、及び３－ヘキシニルが挙げられる。

【0727】

「アリールアルキル」又は「アラルキル」は、本明細書で使用される場合、アルキルの水素原子がアリール基で置き換えられたアルキル部分を指す。アラルキルとしては、１つを超える水素原子がアリール基で置き換えられた基が挙げられる。「アリールアルキル」又は「アラルキル」の例としては、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、９－フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル基が挙げられる。

【0728】

「シクロアルキル」は、本明細書で使用される場合、３から１２個の炭素を有する、環式、二環式、三環式、又は多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。

【0729】

「ヘテロシクリル」は、本明細書で使用される場合、複素環式環系の一価の基を指す。代表的なヘテロシクリルとしては、これらに限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル（ｏｘａｚｅｐｉｎｙｌ）、チアゼピニル、及びモルホリニルが挙げられる。

【0730】

「ヘテロアリール」は、本明細書で使用される場合、ヘテロ芳香環系の一価の基を指す。ヘテロアリール部分の例としては、これらに限定されないが、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、及びプテリジニルが挙げられる。

【0731】

１２．２ リン酸骨格の修飾
１２．２．１ リン酸基
ある特定の実施態様において、修飾されたヌクレオチドのリン酸基は、酸素の一又は複数を異なる置換基で置き換えることによって修飾されていてもよい。さらに、修飾されたヌクレオチド、例えば修飾された核酸中に存在する修飾されたヌクレオチドは、非修飾のリン酸部分の本明細書に記載されるような修飾されたリン酸での大規模な置き換えを含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカー又は非相称的な電荷分布を有する電荷を有するリンカーのいずれかをもたらす変更を含んでいてもよい。

【0732】

修飾されたリン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸塩、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ホスホロアミデート、アルキル又はホスホン酸アリール 及び リン酸トリエステルが挙げられる。ある特定の実施態様において、リン酸骨格部分中の架橋されていないリン酸と酸素原子の一方は、以下の群：硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ_３（式中Ｒは、例えば水素、アルキル、又はアリールであってもよい）、Ｃ（例えばアルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ_２（式中Ｒは、例えば水素、アルキル、又はアリールであってもよい）、又はＯＲ（式中Ｒは、例えばアルキル又はアリールであってもよい）のいずれかで置き換えられていてもよい。非修飾のリン酸基中のリン原子は、非キラルである。しかしながら、架橋されていない酸素の１つを上記した原子又は原子の基の１つで置き換えることは、リン原子をキラルにする可能性があり、すなわちこの方法で修飾されたリン酸基中のリン原子は不斉中心である。不斉リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書ではＲｐ）又は「Ｓ」配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有していてもよい。

【0733】

ホスホロジチオエートは、硫黄で置き換えられた架橋されていない酸素の両方を有する。ホスホロジチオエートにおけるリン中心は非キラルであり、そのためオリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成は妨げられる。ある特定の実施態様において、一方又は両方の架橋されていない酸素への修飾としてはまた、架橋されていない酸素を、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、及びＯＲから独立して選択される基（Ｒは、例えばアルキル又はアリールであってもよい）で置き換えることも挙げることができる。

【0734】

リン酸リンカーはまた、架橋酸素（すなわち、ホスフェートをヌクレオシドに結合させる酸素）を、窒素（架橋されたホスホロアミデート）、硫黄（架橋されたホスホロチオエート）及び炭素（架橋されたメチレンホスホネート）で置き換えることによっても修飾することができる。置き換えは、いずれかの結合している酸素でなされてもよいし、又は両方の結合している酸素でなされてもよい。

【0735】

１２．２．２ リン酸基の置き換え
リン酸基は、リンを含有しないコネクターで置き換えられていてもよい。ある特定の実施態様において、電荷を有するリン酸基は、中性部分で置き換えられていてもよい。

【0736】

リン酸基を置き換えることができる部分の例としては、これらに限定されないが、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ及びメチレンオキシメチルイミノを挙げることができる。

【0737】

１２．２．３ リボリン酸骨格の置き換え
リン酸リンカー及びリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド又はヌクレオチドサロゲートで置き換えられた、核酸を模倣できる足場も構築することができる。ある特定の実施態様において、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留することができる。例としては、これらに限定されないが、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートを挙げることができる。

【0738】

１２．３ 糖の修飾
修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドは、糖基への一又は複数の修飾を含んでいてもよい。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、様々な「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾されていてもよいし又はそれらで置き換えられていてもよい。ある特定の実施態様において、２’ヒドロキシル基への修飾は、ヒドロキシルが脱プロトン化されて２’－アルコキシドイオンの形成を不可能にするため、核酸の安定性を強化することができる。２’－アルコキシドは、リンカーのリン原子への分子内の求核攻撃によって分解を触媒することができる。

【0739】

「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（又は、式中「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であってもよい）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＲ（式中Ｒは、例えば、Ｈ又は置換されていてもよいアルキルであってもよく、ｎは、０から２０（例えば、０から４、０から８、０から１０、０から１６、１から４、１から８、１から１０、１から１６、１から２０、２から４、２から８、２から１０、２から１６、２から２０、４から８、４から１０、４から１６、及び４から２０）の整数であってもよい。ある特定の実施態様において、「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾としては、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を挙げることができ、これは、２’ヒドロキシルが、例えばＣ_１－６アルキレン又はＣ_１－６ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に接続することができ、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、又はアミノ架橋；Ｏ－アミノ（式中アミノは、例えばＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであってもよい）及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－アミノ（式中アミノは、例えばＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであってもよい）を挙げることができる。ある特定の実施態様において、「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、例えばＰＥＧ誘導体）を挙げることができる。

【0740】

「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、例えば部分的にｄｓのＲＮＡのオーバーハング部分における、デオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、又はヨード）；アミノ（式中アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸であってもよい）；ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２－アミノ（式中アミノは、例えば本明細書に記載される通りであってもよい）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であってもよい）、シアノ；メルカプト；アルキル－チオ－アルキル；チオアルコキシ；並びにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを挙げることができ、これらは、例えば本明細書に記載されるようなアミノで置換されていてもよい。

【0741】

糖基はまた、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置と逆の立体化学的配置を有する一又は複数の炭素を含有していてもよい。したがって、修飾された核酸は、糖として例えばアラビノースを含有するヌクレオチドを含んでいてもよい。ヌクレオチド「単量体」は、糖の１’位におけるアルファ結合、例えばアルファ－ヌクレオシドを有していてもよい。修飾された核酸はまた、Ｃ－１’に核酸塩基がない「脱塩基」糖を含んでいてもよい。これらの脱塩基糖はさらに、成分である糖原子の一又は複数において修飾されていてもよい。修飾された核酸はまた、Ｌ型の一又は複数の糖、例えばＬ－ヌクレオシドを含んでいてもよい。

【0742】

一般的に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基のリボースを含む。例示的な修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドとしては、これらに限定されないが、リボース中の酸素の置き換え（例えば、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、又はアルキレン、例えばメチレン又はエチレンなどでの置き換え）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニル又はシクロヘキセニルで置き換えるため）；リボースの環の縮小（例えば、シクロブタン又はオキセタンの４員環を形成するため）；リボースの環の拡張（例えば、追加の炭素又はヘテロ原子、例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホルアミデート骨格も有するモルホリノなどを有する６又は７員環を形成するため）を挙げることができる。ある特定の実施態様において、修飾されたヌクレオチドとしては、多環式の形態（例えば、トリシクロ；及び「アンロック」の形態、例えばグリコール核酸（ＧＮＡ）など（例えば、Ｒ－ＧＮＡ又はＳ－ＧＮＡ、ここでリボースは、ホスホジエステル結合に取り付けられたグリコール単位で置き換えられている）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ここでリボースは、α－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置き換えられている）を挙げることができる。

【0743】

１２．４ 核酸塩基における修飾
修飾された核酸に取り込まれ得る本明細書に記載される修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドとしては、修飾された核酸塩基を挙げることができる。核酸塩基の例としては、これらに限定されないが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。これらの核酸塩基が修飾されるか又は全体が置き換えられて、修飾された核酸に取り込まれ得る修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドを提供することができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリン又はピリミジンアナログから独立して選択することができる。ある特定の実施態様において、核酸塩基としては、例えば、塩基の天然誘導体及び合成誘導体を挙げることができる。

【0744】

１２．４．１ ウラシル
ある特定の実施態様において、修飾された核酸塩基は、修飾されたウラシルである。例示的な修飾されたウラシルを有する核酸塩基及びヌクレオシドとしては、これらに限定されないが、シュードウリジン（ψ）、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ^５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨード－ウリジン又は５－ブロモ－ウリジン）、３－メチル－ウリジン（ｍ^３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ^５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ^５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ^５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ^５Ｕ）、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ^５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ^５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ^５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ^５Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ^５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｃｍ^５Ｕ）、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ^５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、５－メチル－ウリジン（ｍ^５Ｕ、すなわち核酸塩基デオキシチミンを有する）、１－メチル－シュードウリジン（ｍ^１ψ）、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ^５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ^１ｓ^４ψ）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ^３ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ^５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ^３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ^３ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ^５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン（ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、キサンチン、及びヒポキサンチンが挙げられる。

【0745】

１２．４．２ シトシン
ある特定の実施態様において、修飾された核酸塩基は、修飾されたシトシンである。例示的な修飾されたシトシンを有する核酸塩基及びヌクレオシドとしては、これらに限定されないが、５－アザ－シチジン、６－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン（ｍ^３Ｃ）、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃｔ）、５－ホルミル－シチジン（ｆ^５Ｃ）、Ｎ４－メチル－シチジン（ｍ^４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ^５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ^５Ｃ）、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、リシジン（ｋ^２Ｃ）、α－チオ－シチジン、２’－Ｏ－メチル－シチジン（Ｃｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ^５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ａｃ^４Ｃｍ）、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ^４Ｃｍ）、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ｆ^５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチル－シチジン（ｍ^４ _２Ｃｍ）、１－チオ－シチジン、２’－Ｆ－アラ－シチジン、２’－Ｆ－シチジン、及び２’－ＯＨ－アラ－シチジンが挙げられる。

【0746】

１２．４．３ アデニン
ある特定の実施態様において、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。例示的な修飾されたアデニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドとしては、これらに限定されないが、２－アミノ－プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロロ－プリン）、２－アミノ－６－メチル－プリン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシン、７－デアザ－８－アザ－アデノシン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチル－アデノシン（ｍ^１Ａ）、２－メチル－アデノシン（ｍ^２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ^６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍｓ２ｍ^６Ａ）、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｉ^６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｍｓ^２ｉ^６Ａ）、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ^６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ^６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデノシン（ｇ^６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｔ^６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｍ^６ｔ^６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ^２ｇ^６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン（ｍ^６ _２Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｈｎ^６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｈｎ^６Ａ）、Ｎ６－アセチル－アデノシン（ａｃ^６Ａ）、７－メチル－アデノシン、２－メチルチオ－アデノシン、２－メトキシ－アデノシン、α－チオ－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－アデノシン（Ａｍ）、Ｎ^６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ^６Ａｍ）、Ｎ^６－メチル－２’－デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン（ｍ^６ _２Ａｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ^１Ａｍ）、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、２’－Ｆ－アラ－アデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－アラ－アデノシン、及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデノシンが挙げられる。

【0747】

１２．４．４ グアニン
ある特定の実施態様において、修飾された核酸塩基は、修飾されたグアニンである。例示的な修飾されたグアニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドとしては、これらに限定されないが、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ^１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４－デメチル－ワイオシン（ｉｍＧ－１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ_２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、不完全修飾型（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７－デアザ－グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル－クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル－クエオシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ_０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ_１）、アルカエオシン（Ｇ^＋）、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン（ｍ^７Ｇ）、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチル－イノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチル－グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２－メチル－グアノシン（ｍ^２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアノシン（ｍ^２ _２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン（ｍ^２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン（ｍ^２，２，７Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、α－チオ－グアノシン、２’－Ｏ－メチル－グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ^２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ^２ _２Ｇｍ）、１－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ^２，７Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチル－イノシン（Ｉｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－イノシン（ｍ’Ｉｍ）、Ｏ^６－フェニル－２’－デオキシイノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、１－チオ－グアノシン、Ｏ^６－メチル－グアノシン、Ｏ^６－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－Ｆ－アラ－グアノシン、及び２’－Ｆ－グアノシンが挙げられる。

【0748】

１２．５ 例示的な修飾されたｇＲＮＡｓ
ある特定の実施態様において、修飾された核酸は、修飾されたｇＲＮＡであってもよい。配列番号２０８から５８７４９から選択されるヌクレオチド配列を含む標的指向性ドメインを含むあらゆるｇＲＮＡを含む本明細書に記載されるｇＲＮＡはいずれも、このセクションに従って修飾されていてもよいことが理解されると予想される。

【0749】

上記で論じられたように、一過性で発現又は送達される核酸は、例えば細胞のヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。したがって、一形態において、本明細書に記載される修飾されたｇＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する一又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含有していてもよい。ある特定の実施態様において、明細書に記載されるある特定の修飾されたｇＲＮＡ分子本は、細胞の集団、特に本明細書で開示された細胞の集団に導入される場合、自然免疫応答の低減を示す可能性がある。上述したように、用語「自然免疫応答」は、一般的にウイルス又は細菌起源の一本鎖核酸などの外因性核酸に対する細胞応答を含み、サイトカイン発現及び放出の誘導、特にインターフェロン、及び細胞死を含む。

【0750】

このセクションで論じられた例示的な修飾のいくつかは、ｇＲＮＡ配列内のあらゆる位置に含まれていてもよいが、ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端又はその近くに（例えば、その５’末端の１－１０、１－５、又は１－２ヌクレオチド以内に）修飾を含む。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、その３’末端又はその近くに（例えば、その３’末端の１－１０、１－５、又は１－２ヌクレオチド以内に）修飾を含む。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端又はその近くと、その３’末端又はその近くとの両方に修飾を含む。

【0751】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、５’三リン酸基が欠如している。ある特定の実施態様において、標的指向性ドメインの５’末端は、５’三リン酸基が欠如している。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、５’ｃａｐを含む。ある特定の実施態様において、標的指向性ドメインの５’末端は、５’ｃａｐを含む。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、５’三リン酸基が欠如している。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、標的指向性ドメインを含み、標的指向性ドメインの５’末端は、５’三リン酸基が欠如している。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、５’ｃａｐを含む。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、標的指向性ドメインを含み、標的指向性ドメインの５’末端は、５’ｃａｐを含む。

【0752】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡの５’末端は、真核生物ｍＲＮＡのｃａｐ構造又はｃａｐアナログ（例えば、これらに限定されないが、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ ｃａｐアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ ｃａｐアナログ、又は３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースｃａｐアナログ（ＡＲＣＡ））を含むことによって修飾される。ある特定の実施態様において、５’ｃａｐは、５’－５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りに連結された修飾されたグアニンヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様において、５’ｃａｐアナログは、５’－５’三リン酸結合を介して連結された２つの修飾されていてもよいグアニンヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：

を有し、式中：
Ｂ^１及びＢ^１’のそれぞれは、独立して、

であり；
各Ｒ^１は、独立して、フェニル又は６員のヘテロアリールで置換されていてもよいＣ_１－４アルキルであり；
Ｒ^２、Ｒ^２’、及びＲ^３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、又はＯ－Ｃ_１－４アルキルであり；
Ｘ、Ｙ、及びＺのそれぞれは、独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｘ’及びＹ’のそれぞれは、独立して、Ｏ又はＣＨ_２である。

【0753】

ある特定の実施態様において、各Ｒ^１は、独立して、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＨ_３、又は－ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５である。

【0754】

ある特定の実施態様において、Ｒ^１は、－ＣＨ_３である。

【0755】

ある特定の実施態様において、Ｂ^１’は、

である。

【0756】

ある特定の実施態様において、Ｒ^２、Ｒ^２’、及びＲ^３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＯＨ、又はＯ－ＣＨ_３である。

【0757】

ある特定の実施態様において、Ｘ、Ｙ、及びＺのそれぞれは、Ｏである。

【0758】

ある特定の実施態様において、Ｘ’及びＹ’は、Ｏである。

【0759】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：

を有する。

【0760】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：

を有する。

【0761】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：

を有する。

【0762】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：

を有する。

【0763】

ある特定の実施態様において、Ｘは、Ｓであり、Ｙ及びＺは、Ｏである。

【0764】

ある特定の実施態様において、Ｙは、Ｓであり、Ｘ及びＺは、Ｏである。

【0765】

ある特定の実施態様において、Ｚは、Ｓであり、Ｘ及びＹは、Ｏである。

【0766】

ある特定の実施態様において、ホスホロチオエートは、Ｓｐジアステレオマーである。

【0767】

ある特定の実施態様において、Ｘ’は、ＣＨ_２であり、Ｙ’は、Ｏである。

【0768】

ある特定の実施態様において、Ｘ’は、Ｏであり、Ｙ’は、ＣＨ_２である。

【0769】

ある特定の実施態様において、５’ｃａｐは、修飾されていてもよい５’－５’四リン酸結合を介して連結された２つの修飾されていてもよいグアニンヌクレオチドを含む。

【0770】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：

を有し、式中：
Ｂ^１及びＢ^１’のそれぞれは、独立して、

であり、
各Ｒ^１は、独立して、フェニル又は６員のヘテロアリールで置換されていてもよいＣ_１－４アルキルであり；
Ｒ^２、Ｒ^２’、及びＲ^３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、又はＯ－Ｃ_１－４アルキルであり；
Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺのそれぞれは、独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｘ’、Ｙ’、及びＺ’のそれぞれは、独立して、Ｏ又はＣＨ_２である。

【0771】

ある特定の実施態様において、各Ｒ^１は、独立して、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＨ_３、又は－ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５である。

【0772】

ある特定の実施態様において、Ｒ^１は、－ＣＨ_３である。

【0773】

ある特定の実施態様において、Ｂ^１’は、

である。

【0774】

ある特定の実施態様において、Ｒ^２、Ｒ^２’、及びＲ^３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＯＨ、又はＯ－ＣＨ_３である。

【0775】

ある特定の実施態様において、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺのそれぞれは、Ｏである。

【0776】

ある特定の実施態様において、Ｘ’、Ｙ’、及びＺ’のそれぞれは、Ｏである。

【0777】

ある特定の実施態様において、Ｘ’は、ＣＨ_２であり、Ｙ’及びＺ’は、Ｏである。

【0778】

ある特定の実施態様において、Ｙ’は、ＣＨ_２であり、Ｘ’及びＺ’は、Ｏである。

【0779】

ある特定の実施態様において、Ｚ’は、ＣＨ_２であり、Ｘ’及びＹ’は、Ｏである。

【0780】

ある特定の実施態様において、５’ｃａｐは、修飾されていてもよい５’－５’五リン酸結合を介して連結された、２つの修飾されていてもよいグアニンヌクレオチドを含む。

【0781】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：

を有し、式中：
Ｂ^１及びＢ^１’のそれぞれは、独立して、

であり、
各Ｒ^１は、独立して、フェニル又は６員のヘテロアリールで置換されていてもよいＣ_１－４アルキルであり；
Ｒ^２、Ｒ^２’、及びＲ^３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、又はＯ－Ｃ_１－４アルキルであり；
Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺのそれぞれは、独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｗ’、Ｘ’、Ｙ’、及びＺ’のそれぞれは、独立して、Ｏ又はＣＨ_２である。

【0782】

ある特定の実施態様において、各Ｒ^１は、独立して、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＨ_３、又は－ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５である。

【0783】

ある特定の実施態様において、Ｒ^１は、－ＣＨ_３である。

【0784】

ある特定の実施態様において、Ｂ^１’は、

である。

【0785】

ある特定の実施態様において、Ｒ^２、Ｒ^２’、及びＲ^３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＯＨ、又はＯ－ＣＨ_３である。

【0786】

ある特定の実施態様において、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺのそれぞれは、Ｏである。

【0787】

ある特定の実施態様において、Ｗ’、Ｘ’、Ｙ’、及びＺ’のそれぞれは、Ｏである。

【0788】

用語「５’ｃａｐ」は、本明細書で使用される場合、従来のｍＲＮＡの５’ｃａｐ構造に加えて、これらの類似体も包含する。例えば、上記で示された化学構造に包含される５’ｃａｐ構造に加えて、例えば、メチレン－ビス（ホスホネート）部分を有する四リン酸類似体（例えば、Rydzik, A M等(2009) Org Biomol Chem 7(22):4763-76を参照）、架橋されていない酸素が硫黄で置換された類似体（例えば、Grudzien-Nogalska, E.等(2007) RNA 13(10): 1745-1755を参照）、Ｎ７－ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（例えば、Grudzien, E.等(2004) RNA 10(9): 1479-1487を参照）、又はアンチリバースｃａｐ類似体（例えば、米国特許第７０７４５９６号、並びにJemielity, J.等(2003) RNA 9(9): 1108-1122及びStepinski, J.等(2001) RNA 7(10):1486-1495を参照）を使用することが可能である。また本出願は、ＯＨ又はＯＭｅの代わりにハロゲン基を有するｃａｐ類似体（例えば、米国特許第８３０４５２９号を参照）；少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合を有するｃａｐ類似体（例えば、米国特許第８１５３７７３号及びKowalska, J.等(2008) RNA 14(6): 1119-1131を参照）；及び少なくとも１つのボラノホスフェート又はホスホロセレノエート結合を有するｃａｐ類似体（例えば、米国特許第８５１９１１０号を参照）；及びアルキニル誘導体化５’ｃａｐ類似体（例えば、米国特許第８９６９５４５号を参照）の使用も包含する。

【0789】

一般的に、５’ｃａｐは、化学合成又はインビトロでのｇＲＮＡ転写のいずれかの間に含めることができる。ある特定の実施態様において、５’ｃａｐが使用されず、その代わりにｇＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたｇＲＮＡ）が、５’三リン酸基を除去するためのホスファターゼ（例えば、ウシ腸由来アルカリホスファターゼ）での処理によって修飾される。

【0790】

ここで開示された主題は、３’ポリＡ尾部（本明細書ではポリＡトラクトとも称される）を含むｇＲＮＡを使用することによる遺伝子編集のための方法、ゲノム編集系及び組成物も提供する。このようなｇＲＮＡは、例えば、ｇＲＮＡ分子前駆体のインビトロでの転写後にポリアデノシンポリメラーゼを使用してｇＲＮＡ分子前駆体にポリＡ尾部を付加することによって調製することができる。例えば、ある特定の実施態様において、ポリＡ尾部は、例えば大腸菌ポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）などのポリメラーゼを使用して酵素的に付加されてもよい。またポリＡ尾部を含むｇＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロでの転写によって調製することもできる。ある特定の実施態様において、既定の長さを有するポリＡ尾部は、ＤＮＡ鋳型にコードされており、ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなど）を介したｇＲＮＡを用いて転写されてもよい。ポリＡ尾部を有するｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡ分子前駆体に相補的なスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチド使用又は不使用のＲＮＡリガーゼ又はＤＮＡリガーゼ及びポリＡオリゴヌクレオチドを使用して、インビトロでの転写後にポリＡオリゴヌクレオチドをｇＲＮＡ分子前駆体にライゲートすることによって調製することもできる。例えば、ある特定の実施態様において、既定の長さのポリＡ尾部は、合成オリゴヌクレオチドとして合成され、ガイドＲＮＡに相補的なスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチド使用又は不使用のＲＮＡリガーゼ又はＤＮＡリガーゼのいずれか、及びポリＡオリゴヌクレオチドを用いてｇＲＮＡの３’末端にライゲートされる。またポリＡ尾部を含むｇＲＮＡは、一又は複数のスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチド使用又は不使用のＲＮＡリガーゼ又はＤＮＡリガーゼのいずれかによって一緒にライゲートした１つ又は数個の断片中に合成的に調製することもできる。

【0791】

ある特定の実施態様において、ポリＡ尾部は、５０個より少ないアデニンヌクレオチド、例えば、４５個より少ないアデニンヌクレオチド、４０個より少ないアデニンヌクレオチド、３５個より少ないアデニンヌクレオチド、３０個より少ないアデニンヌクレオチド、２５個より少ないアデニンヌクレオチド又は２０個より少ないアデニンヌクレオチドで構成されている。ある特定の実施態様において、ポリＡ尾部は、５から５０個の間のアデニンヌクレオチド、例えば５から４０個の間のアデニンヌクレオチド、５から３０個の間のアデニンヌクレオチド、１０から５０個の間のアデニンヌクレオチド、又は１５から２５個の間のアデニンヌクレオチドで構成されている。ある特定の実施態様において、ポリＡ尾部は、約２０個のアデニンヌクレオチドで構成されている。

【0792】

ここで開示された主題はまた、本明細書に記載される一又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含むｇＲＮＡを使用することによる遺伝子編集のための方法、ゲノム編集系及び組成物（例えば、エクスビボでの遺伝子編集）も提供する。

【0793】

このセクションで論じられた例示的な修飾のいくつかは、ｇＲＮＡ配列内のあらゆる位置に含まれていてもよいが、ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、その５’末端又はその近くに（例えば、その５’末端の１－１０、１－５、又は１－２ヌクレオチド以内に）修飾を含む。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、その３’末端又はその近くに（例えば、その３’末端の１－１０、１－５、又は１－２ヌクレオチド以内に）修飾を含む。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、その５’末端又はその近くと、その３’末端又はその近くとの両方に修飾を含む。

【0794】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子（例えば、インビトロで転写されたｇＲＮＡ）は、真核細胞中で発現された遺伝子からの標的ドメインと相補的な標的指向性ドメインを含み、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端で修飾されており、３’ポリＡ尾部を含む。ｇＲＮＡ分子は、例えば、５’三リン酸基が欠如していてもよい（例えば、標的指向性ドメインの５’末端は、５’三リン酸基が欠如している）。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたｇＲＮＡ）は、５’三リン酸基を除去するためのホスファターゼ（例えば、ウシ腸由来アルカリホスファターゼ）での処理によって修飾されており、本明細書に記載される３’ポリＡ尾部を含む。代替として、ｇＲＮＡ分子は、５’ｃａｐを含んでいてもよい（例えば、標的指向性ドメインの５’末端は、５’ｃａｐを含む）。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたｇＲＮＡ）は、５’ｃａｐ構造又はｃａｐアナログ及び本明細書に記載される３’ポリＡ尾部の両方を含有する。ある特定の実施態様において、５’ｃａｐは、５’－５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りに連結された修飾されたグアニンヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様において、５’ｃａｐは、修飾されていてもよい５’－５’三リン酸結合を介して連結された２つの修飾されていてもよいグアニンヌクレオチド（例えば、上述した通り）を含む。ある特定の実施態様において、ポリＡ尾部は、５から５０個の間のアデニンヌクレオチド、例えば５から４０個の間のアデニンヌクレオチド、５から３０個の間のアデニンヌクレオチド、１０から５０個の間のアデニンヌクレオチド、１５から２５個の間のアデニンヌクレオチド、３０個より少ないアデニンヌクレオチド、２５個より少ないアデニンヌクレオチド又は約２０個のアデニンヌクレオチドで構成されている。

【0795】

ある特定の実施態様において、ここで開示された主題は、真核細胞中で発現された遺伝子からの標的ドメインと相補的な標的指向性ドメインを含むｇＲＮＡ分子であって、３０個より少ないアデニンヌクレオチド（例えば、２５個より少ないアデニンヌクレオチド、１５から２５個の間のアデニンヌクレオチド、又は約２０個のアデニンヌクレオチド）で構成されている３’ポリＡ尾部を含む、ｇＲＮＡ分子を提供する。ある特定の実施態様において、これらのｇＲＮＡ分子は、それらの５’末端でさらに修飾されている（例えば、ｇＲＮＡ分子は、５’三リン酸基を除去するためのホスファターゼでの処理によって修飾されているか、又は本明細書に記載される５’ｃａｐを含むように修飾されている）。

【0796】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、３’末端のＵリボースで修飾されていてもよい。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡの５’末端及び３’末端のＵリボースが、修飾されている（例えば、ｇＲＮＡは、５’三リン酸基を除去するためのホスファターゼでの処理によって修飾されているか、又は本明細書に記載される５’ｃａｐを含むように修飾されている）。

【0797】

例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基がアルデヒド基に酸化され、それに伴いリボース環が開環されて、以下に示すような修飾されたヌクレオシドを得ることができる。

式中「Ｕ」は、非修飾の又は修飾されたウリジンであってもよい。

【0798】

ある特定の実施態様において、３’末端のＵは、以下に示すようにして２’３’環状リン酸で修飾されていてもよい。

式中「Ｕ」は、非修飾の又は修飾されたウリジンであってもよい。

【0799】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載される修飾されたヌクレオチドの一又は複数を取り込むことによって分解に対して安定化されていてもよい３’ヌクレオチドを含有していてもよい。この実施態様において、例えば、ウリジンは、修飾されたウリジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、及び５－ブロモウリジンで、又は本明細書に記載される修飾されたウリジンのいずれかで置き換えられていてもよく、アデノシン、シチジン及びグアノシンは、修飾されたアデノシン、シチジン及びグアノシンで、例えば８位での修飾、例えば８－ブロモグアノシンで、又は本明細書に記載される修飾されたアデノシン、シチジン若しくはグアノシンのいずれかで置き換えられていてもよい。

【0800】

ある特定の実施態様において、糖が修飾されたリボヌクレオチドが、ｇＲＮＡに取り込まれていてもよく、例えば２’ＯＨ－基が、Ｈ、－ＯＲ、－Ｒ（式中Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であってもよい）、ハロ、－ＳＨ、－ＳＲ（式中Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であってもよい）、アミノ（式中アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロ環アミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸であってもよい）；又はシアノ（－ＣＮ）から選択される基で置き換えられている。ある特定の実施態様において、リン酸骨格は、本明細書に記載されるように、例えばホスホチオエート基で修飾されていてもよい。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡのヌクレオチドの一又は複数は、それぞれ独立して修飾された又は非修飾のヌクレオチドであってもよく、このようなヌクレオチドとしては、これらに限定されないが、２’－糖が修飾された、例えば２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、又は２’－フルオロが修飾された、例えば２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチル、アデノシン（Ａ）、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチル、シチジン（Ｃ）、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチル、ウリジン（Ｕ）、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチル、グアノシン（Ｇ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びそれらのあらゆる組合せなどが挙げられる。

【0801】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、２’ＯＨ－基が、同じリボース糖の４’炭素に、例えばＣ１－６アルキレン又はＣ１－６ヘテロアルキレン架橋によって接続されていてもよい「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよく、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、又はアミノ架橋；Ｏ－アミノ（式中アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロ環アミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであってもよい）及びアミノアルコキシ又はＯ（ＣＨ_２）_ｎ－アミノ（式中アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロ環アミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであってもよい）を挙げることができる。

【0802】

ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよく、ここで修飾されたヌクレオチドは、多環式（例えば、トリシクロ；及び「アンロック」の形態、例えばグリコール核酸（ＧＮＡ）など（例えば、Ｒ－ＧＮＡ又はＳ－ＧＮＡ、ここでリボースは、ホスホジエステル結合に取り付けられたグリコール単位で置き換えられている）、又はトレオース核酸（ＴＮＡ、ここでリボースは、α－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置き換えられている）である。

【0803】

一般的に、ｇＲＮＡ分子は、糖基のリボースを含み、これは酸素を有する５員環である。例示的な修飾されたｇＲＮＡは、これらに限定されないが、リボース中の酸素の置き換え（例えば、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、又はアルキレン、例えばメチレン又はエチレンなどでの置き換え）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニル又はシクロヘキセニルで置き換えるため）；リボースの環の縮小（例えば、シクロブタン又はオキセタンの４員環を形成するため）；リボースの環の拡張（例えば、追加の炭素又はヘテロ原子、例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホルアミデート骨格も有するモルホリノなどを有する６又は７員環を形成するため）を含んでいてもよい。糖アナログの変更の大部分は２’位に局在しているが、４’位などの他の部位も修飾に適している。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡは、４’－Ｓ、４’－Ｓｅ又は４’－Ｃ－アミノメチル－２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。

【0804】

ある特定の実施態様において、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン、が、ｇＲＮＡに取り込まれていてもよい。ある特定の実施態様において、Ｏ－及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンが、ｇＲＮＡに取り込まれていてもよい。ある特定の実施態様において、ｇＲＮＡ分子中のヌクレオチドの一若しくは複数又は全てが、デオキシヌクレオチドである。

【0805】

１２．６ ｍｉＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、天然細胞性の１９－２５ヌクレオチド長さを有する非コードＲＮＡである。それらは、例えばｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中の適切なｍｉＲＮＡ結合部位を有する核酸分子に結合し、遺伝子発現を下方調節する。ある特定の実施態様において、この下方調節は、核酸分子の安定性を低減すること又は翻訳を阻害することのいずれかによって起こる。本明細書で開示されたＲＮＡ種、例えばＣａｓ９をコードするｍＲＮＡは、例えばその３’ＵＴＲ中にｍｉＲＮＡ結合部位を含んでいてもよい。ｍｉＲＮＡ結合部位は、選択された細胞型における発現の下方調節を促進するように選択することができる。例として、肝臓中に豊富に存在するマイクロＲＮＡであるｍｉＲ－１２２のための結合部位の取り込みは、肝臓中で目的の遺伝子の発現を阻害することができる。

【実施例】

【0806】

以下の実施例は、単なる例示であり、本発明の範囲又は内容を限定することは決して目的としない。

【0807】

実施例１： 候補ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の評価
候補ｇＲＮＡの適性は、この実施例に記載されたようにして評価することができる。キメラｇＲＮＡについて記載されているが、この手法は、モジュラーｇＲＮＡを評価するのにも使用することができる。

【0808】

ベクターへのｇＲＮＡのクローニング
各ｇＲＮＡにつきオーバーラップするオリゴヌクレオチドの対を設計して得る。オリゴヌクレオチドをアニールし、上流にＵ６プロモーター及び残部の長いキメラｇＲＮＡの配列を含有する消化したベクターバックボーンにライゲートする。プラスミドの配列を検証し、十分な量のトランスフェクション品質のＤＮＡが生成されるように予備調製する。インビボでの転写を駆動させるために（例えばＨ１プロモーター）又はインビトロでの転写のために（例えば、Ｔ７プロモーター）代替のプロモーターを使用してもよい。

【0809】

直鎖状ｄｓＤＮＡ分子（ＳＴＩＴＣＨＲ）におけるｇＲＮＡのクローニング
各ｇＲＮＡにつき単一のオリゴヌクレオチドを設計して得る。Ｕ６プロモーター及びｇＲＮＡ足場（例えばｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡに由来する配列、例えば第１の相補性ドメイン；連結ドメイン；第２の相補性ドメイン；近位ドメイン；及び尾部ドメインを含む、例えば、標的指向性ドメインを除く全てを含む）を、別々にＰＣＲ増幅し、ｄｓＤＮＡ分子として精製する。ＰＣＲ反応には、ｇＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチド中で特定された標的指向性ドメインによって連結されたＵ６とｇＲＮＡ足場とを一緒にまとめる。得られたｄｓＤＮＡ分子（ＳＴＩＴＣＨＲ生成物）を、トランスフェクションのために精製する。インビボでの転写を駆動させるために（例えば、Ｈ１プロモーター）、又はインビトロでの転写のために（例えば、Ｔ７プロモーター）、代替のプロモーターを使用することができる。あらゆる細菌種からのＣａｓ９に適合するｇＲＮＡを作り出すのに、あらゆるｇＲＮＡ足場を使用することができる。

【0810】

試験しようとする各ｇＲＮＡを、Ｃａｓ９を発現するプラスミド及び少量のＧＦＰ発現プラスミドと共にヒト細胞にトランスフェクトする。予備実験において、これらの細胞は、不死化ヒト細胞株、例えば２９３Ｔ、Ｋ５６２又はＵ２ＯＳなどであってもよい。代替として、初代ヒト細胞を使用することができる。このケースにおいて、細胞は、結果として生じる治療的な細胞標的にとって重要な場合がある。可能性のある治療標的細胞集団に類似した初代細胞の使用は、内因性のクロマチン及び遺伝子発現の状況下における遺伝子標的化率に関する重要な情報を提供することができる。

【0811】

トランスフェクションは、脂質トランスフェクション（例えばリポフェクトアミン又はＦｕｇｅｎｅなど）を使用して、又はエレクトロポレーション（例えばＬｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎなど）によって実行することができる。トランスフェクション後、ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡検査法又はフローサイトメトリーのいずれかによって決定して、一貫した高レベルのトランスフェクションを確認することができる。これらの予備的なトランスフェクションは、異なるｇＲＮＡ及び異なる標的化手法（１７－ｍｅｒ、２０－ｍｅｒ、ヌクレアーゼ、二重のニッカーゼなど）を含んでいてもよく、どのｇＲＮＡ／ｇＲＮＡの組合せが最大の活性を生じるかを決定することができる。

【0812】

各ｇＲＮＡでの切断効率は、Ｔ７Ｅ１タイプのアッセイ又は配列決定によって標的遺伝子座におけるＮＨＥＪによって誘導されたインデル形成を測定することによって査定することができる。代替として、他のミスマッチ感受性酵素、例えばＣｅｌＩ／Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼなども使用することができる。

【0813】

Ｔ７Ｅ１アッセイに関して、ＰＣＲアンプリコンは、およそ５００－７００ｂｐであり、アンプリコン中に目的の切断部位が非対称的に配置される。増幅、精製及びＰＣＲ産物のサイズ検証後、ＤＮＡを変性させ、９５℃に加熱し、次いでゆっくり冷却することにより再びハイブリダイズさせる。次いでハイブリダイズしたＰＣＲ産物を、不完全にマッチしたＤＮＡを認識して切断するＴ７エンドヌクレアーゼＩ（又は他のミスマッチ感受性酵素）で消化する。アンプリコンを変性させ再びアニールさせるときに元の鋳型ＤＮＡ中にインデルが存在する場合、これは、異なるインデルを内包するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを引き起こし、それゆえに完全にマッチしていない二本鎖ＤＮＡが生じる。消化産物は、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動によって可視化することができる。以下の方程式：％ＮＨＥＪ＝（１－（１－切断されたものの割合）^１／２）を使用して、切断されるＤＮＡの割合（切断産物の密度を、切断産物及び切断されていない産物の密度で割った値）を使用して、ＮＨＥＪのパーセントを推測することができる。Ｔ７Ｅ１アッセイは、約２－５％のＮＨＥＪまでの感度を有する。

【0814】

Ｔ７Ｅ１アッセイの代わりに、又はそれに加えて、配列決定を使用することができる。サンガー配列決定の場合、精製されたＰＣＲアンプリコンを、プラスミド骨格にクローニングし、形質転換し、ミニプレップで処理し、単一のプライマーを用いて配列決定する。サンガー配列決定は、Ｔ７Ｅ１によってＮＨＥＪ率を決定した後にインデルの正確な性質を決定するのに使用することができる。

【0815】

また配列決定も、次世代配列決定技術を使用して実行することができる。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは、３００－５００ｂｐであってもよく、目的の切断部位は非対称的に配置される。ＰＣＲ後、例えばハイスループット配列決定（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ）で使用するために、次世代配列決定のアダプター及びバーコード（例えばＩｌｌｕｍｉｎａマルチプレックスアダプター及びインデックス）をアンプリコンの末端に付加することができる。この方法は、極めて低いＮＨＥＪ率の検出を可能にする。

【0816】

実施例２： ＮＨＥＪによる遺伝子標的化の評価
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのＮＨＥＪを誘導するｇＲＮＡを選択することができる。このケースにおいて、細胞は、対象の疾患に由来する細胞であり、それゆえに重要な突然変異を有する。

【0817】

トランスフェクション後（通常、トランスフェクション後２－３日）、トランスフェクトされた細胞のバルクの集団からゲノムＤＮＡを単離して、ＰＣＲを使用して標的領域を増幅することができる。ＰＣＲ後、所望の突然変異（標的遺伝子のノックアウト又は標的配列モチーフの除去のいずれか）を生成するための遺伝子標的化効率は、配列決定によって決定することができる。サンガー配列決定の場合、ＰＣＲアンプリコンは、５００－７００ｂｐの長さであってもよい。次世代配列決定の場合、ＰＣＲアンプリコンは、３００－５００ｂｐの長さであってもよい。目標が遺伝子の機能をノックアウトすることである場合、配列決定は、何パーセントのウイルスコピーが、遺伝子の機能を破壊すると予想されるフレームシフト又は大きい欠失若しくは挿入を引き起こすＮＨＥＪによって誘導されたインデルを受けたかを評価するのに使用することができる。目標が特異的な配列モチーフを除去することである場合、配列決定は、何パーセントのウイルスコピーが、この配列に及ぶＮＨＥＪによって誘導された欠失を受けたかを評価するのに使用することができる。

【0818】

実施例３： 合成ＨＳＶ－１コンストラクトを標的化する個々のｇＲＮＡの活性の評価
レポーターとしてＨＳＶ－１配列を含有するプラスミドを構築して、標的ＤＮＡのＣａｓ９媒介切断を測定した。このレポータープラスミド、ｐＡＦ０２５は、ＣＭＶプロモーターによって駆動する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。標的ＨＳＶ－１配列を、ＧＦＰと共にそのＮ末端でフレーム内に挿入し、それらの間にＰ２Ａ自己切断ペプチド配列を配置した。

【0819】

公共のツールであるｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒをベースとした特注のガイドＲＮＡ設計ソフトウェアを使用してｇＲＮＡ分子を同定した（Bae等、Bioinformatics. 2014; 30(10): 1473-1475）。この実施例で試験された、並びに表１８及び１９に列挙した各ｇＲＮＡ分子をＳＴＩＴＣＨＲ生成物として生成し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に、Ｓ．アウレウスのＣａｓ９を発現するプラスミド（ｐＡＦ００３）と共にトランスフェクトした。ｐＡＦ００３プラスミドは、Ｓ．アウレウスのＣａｓ９をコードしており、ＣＭＶプロモーターによって駆動するＮ末端及びＣ末端の核局在化シグナル（ＮＬＳ）及びＣ末端の三重のｆｌａｇタグを有する。ｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするＤＮＡを、Ｍｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ－２９３トランスフェクション試薬によって、標的プラスミドｐＡＦ０２５と共に細胞に導入した。トランスフェクションから２日後に、細胞をトリプシン処理によってそれらの増殖プレートから除去し、ＰＢＳバッファー中で洗浄し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターで分析した。

【0820】

図９は、ｐＡＦ０２５のプラスミドマップを示す。図１０Ａ－１０Ｂは、プラスミドｐＡＦ０２５中のＨＳＶ－１標的配列のＣａｓ９媒介切断による、トランスフェクトされた細胞集団の平均蛍光発光（又は相対蛍光単位、ＲＦＵ）によって測定した場合のＧＦＰ発現の低減を示す。表１８に、図１０Ａに示されるｇＲＮＡを列挙し、表１９に、図１０Ｂに示されるｇＲＮＡを列挙した。

【0821】

参照による組み込み
本明細書で述べられた全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個々に参照により組み入れられることが示されたのと同等に、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合、本明細書に記載のあらゆる定義を含めて本出願が優先される。

【0822】

均等物
当業者は、常套的な実験を使用するだけで、本明細書に記載される発明の具体的な実施態様の多くの均等物を認識するか又は確認が可能であると予想される。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【配列表】

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