特許 7408838 コドン最適化されたＧＬＡ遺伝子およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-22

(45)【発行日】2024-01-05

(54)【発明の名称】コドン最適化されたＧＬＡ遺伝子およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20231225BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20231225BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231225BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20231225BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231225BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231225BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20231225BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N7/01 ZNA

C12N5/10

C12N15/56

A61K35/76

A61K48/00

A61P3/00

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2022564246

(86)(22)【出願日】2021-04-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-18

(86)【国際出願番号】 US2021029146

(87)【国際公開番号】W WO2021222094

(87)【国際公開日】2021-11-04

【審査請求日】2022-12-09

(31)【優先権主張番号】63/114,195

(32)【優先日】2020-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/016,207

(32)【優先日】2020-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】518402130

【氏名又は名称】４ディー モレキュラー セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】キルン， デイビッド エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】コッターマン， メリッサ

(72)【発明者】

【氏名】フランシス， ピーター

(72)【発明者】

【氏名】シェーファー， デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】シマンスキ， ポール

(72)【発明者】

【氏名】ウィットルジー， ケビン

【審査官】鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０６０４５４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１８－５２０６４６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ７／００－７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を含むバリアントＡＡＶカプシドタンパク質および、（ｉｉ）ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸であって、前記核酸はヒト細胞における発現のためにコドン最適化されており、前記核酸が配列番号１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記核酸は、ＡＧＡ活性を有するタンパク質をコードし、前記核酸は、宿主細胞において、同じ条件下の前記宿主細胞における配列番号３の野生型ＧＬＡヌクレオチド配列よりも高い発現レベルで発現される、異種核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項2】

前記バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号４として記載されるアミノ酸配列の全長と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項3】

前記バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号４として記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項4】

前記ｒＡＡＶが、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項5】

前記ｒＡＡＶが、５’から３’に、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１に記載されるヌクレオチド配列、（ｄ）ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む宿主細胞。

【請求項7】

前記宿主細胞がＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ２１細胞もしくはＶｅｒｏ細胞であり、および／または前記宿主細胞が懸濁培養もしくは接着培養で成長され、または前記宿主細胞が心筋細胞もしくは骨格筋細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。

【請求項8】

請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項9】

ファブリー病の処置における使用のための、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記医薬組成物が、静脈内および／または筋肉内注射により投与される、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項11】

前記医薬組成物が、少なくとも１×１０^１２ｖｇ／ｋｇの前記ｒＡＡＶの単回静脈内注射として投与される、請求項１０に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項12】

前記医薬組成物が、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの前記ｒＡＡＶの単回静脈内投与として投与される、請求項１０または１１に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項13】

ファブリー病の処置のための医薬の製造のための、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記医薬組成物が、静脈内および／または筋肉内注射のためのものである、請求項１３に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

発明の背景
ファブリー病は、ＧＬＡ遺伝子（α－ガラクトシダーゼＡ、ＡＧＡをコードする）における変異が、低減されたまたは存在しないＡＧＡ酵素活性および結果として生じるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の蓄積を生じる、Ｘ連鎖障害である。Ｇｂ３は、心筋細胞および内皮細胞（腎臓／心臓／ニューロン）にとって細胞毒性であるとみなされ、有意な罹患率および短縮された平均余命を生じる。組換えＡＧＡ（ＥＲＴ）の投与は、一部の組織において疾患進行を緩徐化するようである。例えば心臓における、細胞中への不十分な取込みにおそらくは起因して、重大な医療上の要求が依然として満たされていない。さらに、心血管疾患は、ファブリー病における死亡率の最も一般的な原因であり続けている（全ての既知の死亡の７５％）。したがって、Ｇｂ３を低減させ、それにより、臨床転帰を改善する、ＧＬＡを細胞自律的に発現する重要な組織に標的化された永続的な処置、例えば、単回投与の静脈内遺伝子治療への切実な必要性が存在する。

【0002】

心遺伝子治療に関する１つの障害は、静脈内投与後のヒト心筋細胞の不十分な形質導入である。開発中の現行のＡＡＶベクターは、主に肝臓に移動し、心臓組織には標的化されない。野生型ＡＡＶ１は、臨床的に評価されてきたが、最終的には、偽薬と比較して、再発性心不全事象の一次エンドポイントにおける改善を生じなかった。新規心臓標的化ＡＡＶバリアントは、ファブリー病心筋症の有効な処置を提供し得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

発明の概要
ヒトガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡ）タンパク質をコードするコドン最適化された核酸分子が開示される。一態様では、本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＡＧＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、配列番号１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸が提供される。関連の実施形態では、核酸は、別段同一な細胞における、野生型ＧＬＡ核酸配列（例えば、配列番号３）の発現のレベルと比較してより高いレベルで発現される。配列番号３（コンセンサスＣＤＳ配列番号ＣＣＤＳ１４４８４．１；www.uniprot.org/uniprot/Q7X1P3）は以下に示される：

【化1】

【0004】

一部の態様では、本明細書に記載されるコドン最適化された核酸分子は、野生型ＧＬＡ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１６９．３；配列番号３）のものと比べて増加したヒトコドン適応指数を有する。一部の実施形態では、コドン最適化された核酸分子は、少なくとも約０．８０、少なくとも約０．８３、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．８８、少なくとも約０．９０、少なくとも約０．９２または少なくとも約０．９３のヒトコドン適応指数を有する。

【0005】

ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号３中のＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較してより高い、Ｇ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージを含有する。他の実施形態では、核酸は、少なくとも約４９％、少なくとも約５１％、少なくとも約５３％、少なくとも約５５％、少なくとも約５７％、少なくとも約５７．９％である、または約５７．９％である、Ｇ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージを含有する。関連の実施形態では、核酸は、約４９％と６０％との間、約５０％と５９％との間、約５５％と５９％との間または約５７％と約５９％との間である、Ｇ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージを含有する。

【0006】

他の実施形態では、核酸は、配列番号３と比べて、以下の１つまたは複数の最適化されたパラメーターを含む：最適なコドンの頻度；直列反復配列の最大長さにおける低減；制限酵素の除去、シス作用性エレメントの除去、および不安定化エレメントの除去。別の実施形態では、核酸は、少なくとも１つの転写制御配列、好ましくは、その核酸にとって異種の転写制御配列に、機能的に連結される。一部の態様では、転写制御配列は、例えば心筋細胞または骨格筋細胞において核酸の細胞特異的発現を生じる、細胞特異的または組織特異的プロモーターである。他の態様では、転写制御配列は、多くの細胞型において核酸の類似の発現レベルを生じる構成的プロモーター（例えば、ＣＡＧ、ＣＢＡ（ニワトリベータアクチン）またはＣＭＶプロモーター）である。好ましい実施形態では、転写制御配列は、Miyazaki et al., Gene 79(2):269-77 (1989)に記載されるように、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）ニワトリベータ－アクチン遺伝子のプロモーター、第１のエクソンおよび第１のイントロンならびに（ｉｉｉ）ウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含むＣＡＧプロモーターを含む。特に好ましい実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号５の配列を含むか、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む。

【化2】

【化3】

【0007】

関連の実施形態では、発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現カセットが、本明細書で提供される。

【0008】

関連の実施形態では、配列番号１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターが、本明細書で提供される。好ましい実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）発現ベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ネイティブカプシド（例えば、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型６またはＡＡＶ血清型８のカプシド）を含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ネイティブＡＡＶカプシドと比べて改変された（例えば、１つもしくは複数のペプチド挿入ならびに／あるいは１つもしくは複数のアミノ酸置換（例えば、チロシンからフェニルアラニンへの）および／またはアミノ酸挿入もしくはアミノ酸欠失を含む）（例えば、血清型１、２、６または８のＡＡＶカプシドと比べて１つまたは複数の改変を含む）カプシドを含む。特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号４またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一な配列のカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。

【0009】

別の実施形態では、配列番号１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞が、本明細書で提供される。一部の態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＶ２７細胞が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物細胞である。他の態様では、宿主細胞は、心筋細胞または骨格筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格筋線維芽細胞、骨格筋サテライト細胞、心筋細胞、心線維芽細胞、心前駆細胞、平滑筋細胞内皮および／または横隔膜筋肉細胞）である。関連の実施形態では、本開示は、配列番号２のポリペプチドが核酸分子によって発現される条件下で宿主細胞を培養するステップを含む、配列番号２のポリペプチドの発現を増加させる方法であって、ポリペプチドの発現が、配列番号３のヌクレオチド配列（比較対象配列）を含む参照核酸を含む、同じ条件下で培養した宿主細胞と比べて増加される、方法を提供する。

【0010】

別の実施形態では、本開示は、ヒト対象において配列番号２のポリペプチドの発現を増加させる方法であって、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、またはかかるヌクレオチド配列を含むベクターを対象に投与するステップを含み、ポリペプチドの発現が、配列番号３のヌクレオチド配列（比較対象配列）を含む参照核酸分子またはかかる参照核酸分子を含むベクターと比べて増加される、方法を提供する。

【0011】

一部の実施形態では、本開示は、ヒト対象において不十分なＧＬＡ活性に関連する障害を処置する方法であって、本明細書で開示される核酸分子またはベクターを対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、障害は、ファブリー病である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ファブリー病線維芽細胞には存在しないＡＧＡタンパク質。野生型およびファブリー病に罹患した線維芽細胞のウエスタンブロット解析が示される。ファブリー線維芽細胞の溶解物は、ＡＧＡタンパク質発現（４９ｋＤａ）を欠如し、これは、それらの疾患変異（Ｗ１６２Ｘ）を指し示す。試料を、総タンパク質に対して正規化し、ゲル上に均等にローディングした。左端は標準的なタンパク質ラダーである。ｈｒＡＧＡ：ヒト組換えＡＧＡ、ＷＴ：野生型、ＡＧＡ：アルファガラクトシダーゼ、ｋＤａ：キロダルトン。

【0013】

【図2】ファブリー病に罹患した人工多能性幹細胞の特徴付け。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へと再プログラミングされたファブリー病に罹患した線維芽細胞（図２Ａ）は、非常に重要な多能性転写因子、Ｎａｎｏｇ（左、赤色）、Ｏｃｔ ４（中央、緑色）およびＳｏｘ２（右、赤色）、ＤＡＰＩ（核、青色）を発現する（上パネル）。ファブリーｉＰＳＣは、３つ全ての胚葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉へと分化し、各胚葉に対応する系列マーカー、それぞれ、β－チューブリンＩＩＩ（左、緑色）、ＨＮＦ－α（中央、赤色）およびα－平滑筋アクチン（左、赤色）を発現した；ＤＡＰＩ（核、青色）（下パネル）。スケールバー＝１００μｍ。ＨＮＦ４ａ：肝細胞核因子４アルファ。ファブリーｉＰＳＣの核型解析は、正常なヒト男性のバンディングおよび染色体編成を示す（図２Ｂ）。

【0014】

【図3】ファブリー病に罹患した人工多能性幹細胞由来の心筋細胞の特徴付け。心筋細胞への、ファブリー病に罹患したｉＰＳＣの分化は、フローサイトメトリーによって試験し、ＩｇＧ対照を使用してゲートした場合、９７％のｃＴＮＴ陽性細胞の集団を生じた。散布図は、ゲーティングスキームを示すための代表的なプロットである（図３Ａ）。ｃＴＮＴ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）核染色による免疫細胞化学後のファブリーｉＰＳＣ心筋細胞の代表的な画像（図３Ｂ）。スケールバー＝１００μｍ。ｃＴＮＴ：心筋トロポニンＴ、心筋細胞マーカー。ｎ＝３、生物学的複製。

【0015】

【図4】（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子による、ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ－心筋細胞の形質導入は、ＡＧＡタンパク質の発現をもたらす。免疫細胞化学（ＩＣＣ）は、ＡＡＶで形質導入したファブリーｉＰＳＣ心筋細胞における、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現（緑色）、アルファ－ガラクトシダーゼの発現（赤色）、およびＨｏｅｃｈｓｔによる核対比染色（青色）を示した（図４Ａ）。ＡＡＶで形質導入したファブリーｉＰＳＣ心筋細胞を、ｃＴｎＴおよびアルファ－ガラクトシダーゼで共染色して、ＡＧＡを発現するファブリーｉＰＳＣ心筋細胞のパーセントを決定した（図４Ｂ）。ＡＡＶによる形質導入後のファブリーｉＰＳＣ心筋細胞のウエスタンブロット解析によって見られたＡＧＡタンパク質のロバストな発現（図４Ｃ）。ＡＧＡ：アルファガラクトシダーゼ、ＭＯＩ：感染多重度、ＮＴ：形質導入されていない、Ｇｂ３：グロボトリアオシルセラミド、ｎ＝３、エラーバー±標準偏差；^＊＊＊＊ＮＴと比較してｐ＜０．０００１、††ＭＯＩ ２５と比較してｐ＜０．００１、†ＭＯＩ ２５と比較してｐ＜０．０１、ＮＴに対して一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキー事後比較。

【0016】

【図5】ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ－心筋細胞における、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶによる形質導入後の、増強されたＡＧＡ活性。ＡＡＶで形質導入したファブリーｉＰＳＣ心筋細胞は、ＡＧＡ活性における用量依存的増加を示した。３つの生物学的複製を、各実施についてキットおよびプレートリーダー内の固有の変動性に起因して個々に定量する。技術的複製を、各実験内で実施した（図５Ａ）。グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３、ピンク色）およびＨｏｅｃｈｓｔによる核対比染色（青色）のＩＣＣ（図５Ｂ）。ＡＧＡ＝アルファガラクトシダーゼ、ＭＯＩ＝感染多重度、ＮＴ＝形質導入されていない、Ｇｂ３＝グロボトリアオシルセラミド、ｎ＝３、エラーバー±標準偏差；^＊＊＊＊ＮＴと比較してｐ＜０．０００１、^＊＊＊ＮＴと比較してｐ＜０．００４、^＊＊ＮＴと比較してｐ＝０．００５、††††ＭＯＩ ２５と比較してｐ＜０．０００１、†††ＭＯＩ ２５と比較してｐ＝０．０００１、††ＭＯＩ ２５と比較してｐ＜０．００４；†ＭＯＩ ２５と比較してｐ＜０．０２、＃ＭＯＩ １００と比較してｐ＜０．０２。ＮＴに対して一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキー事後比較。

【0017】

【図6】ファブリー病に罹患した人工多能性幹細胞由来の内皮細胞の特徴付け。図６Ａ：フローサイトメトリーによって試験し、ＩｇＧ対照を使用してゲートした場合、内皮細胞へのファブリー病ｉＰＳＣの分化の２１日目に、９９．２％のＣＤ３１陽性細胞および８７．９％のＣＤ１４４陽性の集団が生じた。図６Ｂ：ベクター特徴付けにおいて使用した培養物における、免疫細胞化学によるＣＤ３１（緑色）発現。細胞をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。スケールバー＝１００μＭ。

【0018】

【図7】（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶによるファブリー病ｉＰＳＣ－内皮細胞の形質導入は、フローおよびウエスタンによる、外因性ＡＧＡの発現をもたらす。図７Ａは、ｒＡＡＶで形質導入したファブリー内皮細胞における形質導入の４日後の生存ＣＤ３１^＋／ＣＤ１４４^＋集団におけるＡＧＡタンパク質のフローサイトメトリーによる発現を例示する。図７Ｂ：ｒＡＡＶによる形質導入後のファブリーｉＰＳＣ由来の内皮細胞のウエスタンブロット解析によって見られたＡＧＡタンパク質のロバストな発現。ヒストグラムでのバンドデンシトメトリー。ＡＧＡ＝アルファガラクトシダーゼ、ＭＯＩ＝感染多重度、ＮＴ＝形質導入されていない、Ｇｂ３＝グロボトリアオシルセラミド、ｎ＝３、エラーバー＝標準偏差；^＊＊＊＊先行するＭＯＩと比較してｐ＜０．０００１、^＊先行するＭＯＩと比較してｐ＜０．０５、ＮＴに対して一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキー事後比較。

【0019】

【図8】ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ－内皮細胞における、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶによる形質導入後の、増強されたＡＧＡ活性。図８Ａ：ＡＧＡ活性を、形質導入の４日後に、ＡＧＡ活性アッセイによって定量した。ｒＡＡＶで形質導入したファブリーｉＰＳＣ－ＥＣは、形質導入されていないファブリー内皮細胞よりも多くのＡＧＡ活性を有した。図８Ｂ：グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３、ピンク色）陽性細胞およびＤＡＰＩによる核対比染色（青色）のＩＣＣ。ＧＬＡ＝アルファガラクトシダーゼ、ＭＯＩ＝感染多重度、ＮＴ＝形質導入されていない、Ｇｂ３＝グロボトリアオシルセラミド、ｎ＝３、エラーバー＝標準偏差；^＊先行するＭＯＩと比較してｐ＜０．０５または^＊＊先行するＭＯＩと比較してｐ＜０．００１（上から下に、５００、１００、５０およびＮＴ）、一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキー事後。各々、３つの実験的複製および３つの技術的複製。

【0020】

【図9】ファブリー病のマウスモデルにおける、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号５のＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶによる形質導入後のＡＧＡ活性。図９Ａ：単回静脈内投与後の野生型およびファブリーマウス血漿中のＡＧＡ活性。図９Ｂ：単回静脈内投与後の野生型およびファブリーマウス組織中のＡＧＡ活性。平均±標準偏差；^＊ビヒクル－ＷＴと比較してｐ＜０．０１、＃ビヒクル－ＫＯと比較してｐ＜０．０１。ＷＴ＝野生型マウス、ＫＯ＝ファブリー病マウス（ノックアウト）。

【0021】

【図10】（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号５のＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶの単回ＩＶ投与の８週間後の、正常（ＷＴ）またはファブリー（ＫＯ）マウスの組織におけるＩＨＣによるＡＧＡの検出。ＡＧＡについてのＩＨＣ染色（暗褐色）を示す、４つの組織（心臓、腎臓、肝臓および小腸）の代表的な画像。各組織についてのＩＨＣ染色は、ビヒクルで処置した野生型マウスまたはビヒクルで処置したファブリーマウスと比較して、ファブリー病のマウスモデルにおいて、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号５のＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶの単回静脈内投与の後の、ＡＧＡ検出における用量依存的増加を示す。ＩＨＣを、１群当たりｎ＝３匹の動物から収集した組織に対して実施した。

【0022】

【図11】血漿中のｌｙｓｏＧｂ３レベル。以前の図に記載された（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶの単回ＩＶ投与後の血漿中のｌｙｓｏＧｂ３低減。１群当たり合計ｎ＝１５匹の、ビヒクルで処置したＣ５７ＢＬ／６（ＷＴ）もしくはＧＬＡヌル（ＫＯ）動物、または配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡを保有するｒＡＡＶの指し示された用量で処置したＧＬＡヌル動物のいずれか由来の血漿において測定したｌｙｓｏＧｂ３（ｍ／ｚ ７８６）およびそのアナログ（ｍ／ｚ ７８４、ｍ／ｚ ８０２およびｍ／ｚ ８０４）の平均総濃度。エラーバーは、標準偏差を指し示す。^＊は、ビヒクル処置したＧＬＡヌルと比較してＰ＜０．０１を指し示す。

【0023】

【図12】組織中のＧｂ３解析。組織を、ＩＶ注射の５６日後に、ビヒクルまたは（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶ（以前の図に記載されている）の漸増用量で処置したＣ５７ＢＬ／６（ＷＴ）またはＧＬＡ－ヌル（ＫＯ）マウスから、ｎ＝６匹（心臓）またはｎ＝１２匹（腎臓、小腸、肝臓）から収集した。棒は、測定された全てのＧｂ３種の平均応答比を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。^＊は、群２（「ＫＯ－ビヒクル」）と比較した場合のＰ＜０．００５を指し示す。

【0024】

【図13】図１３は、指定された用量の各々における、４Ｄ－３１０（（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶ）の単回静脈内投与後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のＧＬＡ活性をグラフで記述する。

【0025】

【図14】図１４は、指定された用量の各々における、４Ｄ－３１０（（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶ）の単回静脈内投与後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの指定された組織中のＧＬＡ活性をグラフで記述する。

【0026】

【図15】図１５は、非ヒト霊長類への指定された用量の４Ｄ－３１０、ビヒクル対照またはＣ１０２．ＥＧＦＰ（配列番号４のカプシドタンパク質を含むカプシドおよびＥＧＦＰをコードする核酸を含むｒＡＡＶ）の単回静脈内投与後の重要なファブリー組織への４Ｄ－３１０の生体内分布（ｑＰＣＲによる）を例示する。

【0027】

【図16】図１６は、指定された用量の各々における４Ｄ－３１０の単回静脈内投与後の、投与量によって整理したＮＨＰの血漿中のＡＧＡを例示する。

【0028】

【図17】図１７は、指定された用量の各々における４Ｄ－３１０の単回静脈内投与後の、動物によって整理したＮＨＰの血漿中のＡＧＡを例示する。

【0029】

【図18】図１８は、指定された用量の各々における４Ｄ－３１０の単回静脈内投与後の、投与量によって整理したファブリー関連ＮＨＰ組織中のＡＧＡにおける変化倍数（ビヒクル対照との比較）を例示する。

【0030】

【図19】図１９は、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量における４Ｄ－３１０の単回静脈内投与後の、動物によって整理したファブリー関連ＮＨＰ組織中のＡＧＡにおける変化倍数（ビヒクル対照との比較）を例示する。

【0031】

【図20】図２０は、非ヒト霊長類への４Ｄ－３１０の指定された用量の単回静脈内投与後の、ＧＬＡ ＲＮＡ発現の生体内分布（ＲＴ－ｑＰＣＲによる）を例示する。

【0032】

【図21】５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量における単回ＩＶ投与後の、ビヒクル処置したまたは４Ｄ－３１０処置したＮＨＰの心臓組織中のＡＧＡのＩＨＣ検出。図２１Ａは、左心室中のＡＧＡ活性を示す；図２１Ｂは、心室中隔中のＡＧＡ活性を示す。

【0033】

【図22】５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量における単回ＩＶ投与後の、ビヒクル処置したまたは４Ｄ－３１０処置したＮＨＰの肝臓（図２２Ａ）および腎臓（図２２Ｂ）組織中のＡＧＡのＩＨＣ検出。ビヒクル動物における高い内因性レベルを超える、処置した動物におけるＡＧＡ活性の上方調節が示される。

【発明を実施するための形態】

【0034】

発明の詳細な説明
定義

【0035】

「コドン適応指数」は、本明細書で使用される場合、コドン使用バイアスの尺度を指す。コドン適応指数（ＣＡＩ）は、遺伝子の参照セットに関しての、所与のタンパク質コード遺伝子配列の偏差を測定する（Sharp P M and Li W H, Nucleic Acids Res. 15(3):1281-95 (1987)）。ＣＡＩは、遺伝子配列の長さ（コドンで測定した）にわたる、各コドンに関連付けられた重みの幾何平均を決定することによって計算される：

【数1】

各アミノ酸について、ＣＡＩにおけるそのコドンの各々の重みは、そのアミノ酸についての、コドンの観察された頻度（ｆｉ）と同義のコドンの頻度（ｆｊ）との間の比として計算される：

【数2】

【0036】

用語「単離された」は、その元の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生物学的材料（細胞、核酸またはタンパク質）を指定する。例えば、植物または動物中に天然の状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されていないが、それがその中に天然に存在する隣接する核酸から分離された同じポリヌクレオチドは、「単離された」とみなされる。

【0037】

本明細書で使用される場合、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸へと翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は、典型的には、アミノ酸へと翻訳されないが、コード領域の一部とみなすことができ、しかし、任意の隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドンおよび得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳停止コドンによって、典型的には決定される。２つまたはそれよりも多くのコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば、単一のベクター上に、または別々のポリヌクレオチド構築物中に、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在し得る。すると、単一のベクターは、単一のコード領域だけを含有し得る、または２つもしくはそれよりも多くのコード領域を含み得るという結果になる。

【0038】

本明細書で使用される場合、用語「調節領域」は、コード領域の上流（５’非コード配列）、内側または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節領域には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム－ループ構造が含まれ得る。コード領域が真核生物細胞における発現を意図したものである場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が通常、コード配列の３’側に位置する。

【0039】

本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」と相互交換可能であり、ヌクレオチドのポリマーが意図される。

【0040】

遺伝子産物、例えばポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数のコード領域に作動可能に関連したプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な関連状態では、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域は、遺伝子産物の発現を調節領域（複数可）の影響下または制御下に置くような方法で、１つまたは複数の調節領域に関連している。例えば、プロモーター機能の誘導が、コード領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、およびプロモーターとコード領域との間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示するプロモーターの能力を妨害することも、ＤＮＡ鋳型が転写される能力を妨害することもない場合、コード領域とプロモーターとは、「作動可能に関連している」。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルもまた、遺伝子産物発現を指示するために、コード領域に作動可能に関連し得る。

【0041】

「転写制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを指す。種々の転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、例えば、サイトメガロウイルス（イントロン－Ａと併せた、最初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントであるがこれらに限定されない、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が含まれるがこれらに限定されない。他の転写制御領域には、脊椎動物遺伝子由来のもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギベータ－グロビン、ならびに真核生物細胞における遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が含まれる。

【0042】

同様に、種々の翻訳制御エレメントが、当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム進入部位、即ちＩＲＥＳ）が含まれるがこれらに限定されない。

【0043】

用語「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。これには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物へのポリヌクレオチドの転写、およびポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれるがこれらに限定されない。発現により、「遺伝子産物」が産生される。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物には、転写後改変、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、または翻訳後改変、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合もしくはタンパク質分解性切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。

【0044】

「ベクター」は、核酸のクローニングおよび／または宿主細胞中への核酸の移入のためのあらゆる任意の輸送手段を指す。ベクターは、結合したセグメントの複製をもたらすように、別の核酸セグメントを結合させることができる、レプリコンであり得る。用語「ベクター」は、核酸を細胞中にｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで導入するためのウイルスビヒクルおよび非ウイルスビヒクルの両方を含む。例えば、プラスミド、改変された真核生物ウイルスまたは改変された細菌ウイルスが含まれる多数のベクターが、当該分野で公知であり使用される。適切なベクター中へのポリヌクレオチドの挿入は、適したポリヌクレオチド断片を、相補的な付着末端を有する選ばれたベクター中にライゲーションすることによって達成され得る。

【0045】

ベクターは、ベクターを取り込んだ細胞の選択または同定を提供する選択可能なマーカーまたはレポーターをコードするように操作され得る。選択可能なマーカーまたはレポーターの発現は、ベクターを取り込み、そのベクター上に含有される他のコード領域を発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。当該分野で公知であり使用される選択可能なマーカー遺伝子の例には、以下が含まれる：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子；および表現型マーカーとして使用される遺伝子、即ち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンテニル（isopentanyl）トランスフェラーゼ遺伝子など。当該分野で公知であり使用されるレポーターの例には、以下が含まれる：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など。選択可能なマーカーは、レポーターともみなされ得る。

【0046】

使用され得る真核生物ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ－タンパク質複合体およびバイオポリマーが含まれる。

【0047】

「プロモーター」および「プロモーター配列」は、相互交換可能に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体がネイティブ遺伝子に由来していてもよく、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されていてもよく、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階において、または異なる環境的もしくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることが、当業者に理解される。ほとんどの時点におけるほとんどの細胞型において遺伝子が発現されるようにするプロモーターは一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞型において遺伝子が発現されるようにするプロモーターは一般に、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。特定の発生段階または細胞分化段階において遺伝子が発現されるようにするプロモーターは一般に、「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する作用物質（agent）、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処置後に誘導され、遺伝子が発現されるようにするプロモーターは一般に、「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合において、調節配列の正確な境界は完全には定義されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識される。

【0048】

用語「プラスミド」は、細胞の中枢代謝の一部ではない遺伝子を保有する場合が多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外エレメントを指す。かかるエレメントは、任意の供給源に由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、直線状、環状またはスーパーコイル状の、自律的に複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得、それにおいて、いくつかのヌクレオチド配列が、プロモーター断片と選択された遺伝子産物のためのＤＮＡ配列とを適した３’非翻訳配列と共に細胞中に導入することが可能な独自の構造に繋がれまたは組み換えられている。

【0049】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定のパーセント「配列同一性」を有し、これは、アラインされた場合に、塩基またはアミノ酸のそのパーセンテージが、２つの配列を比較した場合に同じであることを意味している。配列類似性は、いくつかの異なる様式で決定され得る。配列同一性を決定するために、配列は、ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータープログラムを使用してアラインされ得る。別のアラインメントアルゴリズムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージにおいて利用可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技法は、Methodsin Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc.に記載されている。配列中にギャップを許容するアラインメントプログラムが、特に目的とされる。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント中にギャップを許容するアルゴリズムの１つの型である。Meth.Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムが、配列をアラインするために利用され得る。J.Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)を参照されたい。

【0050】

用語「４Ｄ－３１０」は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸を有するカプシドタンパク質を含むカプシドおよび（ｉｉ）配列番号６として記載されるヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む組換えＡＡＶビリオンを指す。配列番号６のヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含むＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む。

【0051】

用語「４Ｄ－Ｃ１０２」または「Ｃ１０２」は、配列番号４のアミノ酸配列を含むバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を指す。

【0052】

用語「ＧＬＡ」および「ＡＧＡ」は、アルファ－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子およびコードされたタンパク質を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。

【0053】

一実施形態では、本発明は、配列番号２のポリペプチド（４２９アミノ酸からなり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１４４４８．１およびＵ７８０２７において利用可能なヒトＡＧＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む改変された核酸分子を提供し、その核酸配列は、コドン最適化されている。別の実施形態では、配列番号２のポリペプチドをコードし、コドン最適化に供される出発核酸配列は、配列番号３として記載されるヌクレオチド配列を有する。好ましい実施形態では、配列番号２のポリペプチドをコードする配列は、ヒト発現のためにコドン最適化される。配列番号１は、ヒト発現のために最適化された、配列番号３のコドン最適化されたバージョンである：

【化4】

【0054】

配列番号１のヌクレオチド配列は、ＴＡＡ停止コドンを含む。代替的な実施形態では、配列番号１の最初の１２８７ヌクレオチドを含み、異なる停止コドン（例えば、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わるヌクレオチド配列。

【0055】

一態様では、本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＡＧＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する：

【化5】

【0056】

用語「コドン最適化された」は、種々の宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指す場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなしに宿主生物の典型的なコドン使用を反映するような、核酸分子の遺伝子またはコード領域中のコドンの変更を指す。かかる最適化は、少なくとも１つ、または１つよりも多くの、または有意な数のコドンを、その生物の遺伝子においてより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンで置き換えることを含む。

【0057】

任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列におけるゆれ（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、その遺伝子をコードする配列におけるバリエーションを可能にする。各コドンは、３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは、４つの特定の塩基に制限されるので、ヌクレオチドの６４個の可能な組合せが存在し、そのうち６１個がアミノ酸をコードする（残り３個のコドンは、翻訳を終わらせるシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード」は、本明細書で表１として再現される。結果として、多くのアミノ酸は、１つよりも多くのコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは、４つのトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは、６つのトリプレットによってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンは、たった１つのトリプレットによってコードされる。この縮重性は、ＤＮＡ塩基組成が、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなしに広い範囲にわたって変動するのを可能にする。
TABLE-US-00001 表1 標準的な遺伝コード T C A G T TTTPhe (F) TCT Ser (S) TAT Tyr (Y) TGT Cys (C) TTC Phe (F) TCC Ser (S) TAC Tyr (Y)TGC TTA Leu (L) TCA Ser (S) TAA 停止 TGA 停止 TTG Leu (L) TCG Ser (S) TAG 停止 TGGTrp (W) C CTT Leu (L) CCT Pro (P) CAT His (H) CGT Arg (R) CTC Leu (L) CCC Pro(P) CAC His (H) CGC Arg (R) CTA Leu (L) CCA Pro (P) CAA Gln (Q) CGA Arg (R) CTGLeu (L) CCG Pro (P) CAG Gln (Q) CGG Arg (R) A ATT Ile (I) ACT Thr (T) AAT Asn(N) AGT Ser (S) ATC Ile (I) ACC Thr (T) AAC Asn (N) AGC Ser (S) ATA Ile (I) ACAThr (T) AAA Lys (K) AGA Arg (R) ATG Met (M) ACG Thr (T) AAG Lys (K) AGG Arg (R)G GTT Val (V) GCT Ala (A) GAT Asp (D) GGT Gly (G) GTC Val (V) GCC Ala (A) GACAsp (D) GGC Gly (G) GTA Val (V) GCA Ala (A) GAA Glu (E) GGA Gly (G) GTG Val (V)GCG Ala (A) GAG Glu (E) GGG Gly (G)

【0058】

多くの生物は、成長中のペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンの使用について偏りを示す。生物間でのコドン使用における差異である、コドン優先度またはコドンバイアスは、遺伝コードの縮重性によってもたらされ、多くの生物において十分に報告されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関する場合が多く、そしてこれは、とりわけ、翻訳されているコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために適合するようにされ得る。

【0059】

広範な種々の動物、植物および微生物種にとって利用可能な多数の遺伝子配列を考慮して、コドン使用の相対的頻度が計算されてきた。コドン使用表は利用可能であり、例えば、www.kazusa.or.jp/codon/（２０１２年６月１８日にアクセス）において利用可能な「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」である。Nakamura,Y., et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照されたい。

【0060】

所与のポリペプチド配列をコードするのに最適化された頻度でコドンをランダムに割り当てることは、各アミノ酸についてコドン頻度を計算し、次いで、コドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることによって、手動で実施され得る。さらに、種々のアルゴリズムおよびコンピューターソフトウェアプログラムが、最適な配列を計算するために使用され得る。

【0061】

非ウイルスベクター

【0062】

一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された核酸を含む非ウイルスベクター（例えば、発現プラスミド）が提供される。好ましくは、非ウイルスベクターは、配列番号１の核酸配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を含むプラスミドである。

【0063】

ウイルスベクター

【0064】

好ましい実施形態では、本明細書に記載される改変された（コドン最適化された）核酸を含むウイルスベクターが提供される。好ましくは、ウイルスベクターは、発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号１の核酸配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を含む。適切なウイルスベクターの例には、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれるがこれらに限定されない。

【0065】

好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスゲノムの一部分、例えば、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が欠失され、ならびに／または改変されたＧＬＡ遺伝子配列およびその関連する発現制御配列によって置き換えられたＡＡＶゲノムを含む。改変されたヒトＧＬＡ遺伝子配列は、典型的には、ウイルスｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードする核酸の代わりに、ウイルス複製に適当な１つまたは２つのＡＡＶ ＴＲまたはＴＲエレメントに隣接して挿入される（即ち、ＡＡＶ ＴＲまたはＴＲエレメントに挟まれる）（Xiao et al., 1997, J. Virol. 71(2): 941-948）。標的細胞における改変されたＧＬＡ遺伝子配列の組織特異的発現を促進する際の使用のために適切な他の調節配列もまた含められ得る。

【0066】

当業者は、導入遺伝子を含み、ウイルス複製に必要なウイルスタンパク質（例えば、ｃａｐおよびｒｅｐ）を欠如するＡＡＶベクターが、かかるタンパク質がウイルスの複製およびパッケージングのために必要であるために、複製することができないことを理解する。ヘルパーウイルスには、典型的には、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスが含まれる。あるいは、以下で考察されるように、ヘルパー機能（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡ）は、種々のヘルパーエレメントをコードする１つもしくは複数の核酸でパッケージング細胞をトランスフェクトすることによってを含めて（including by transfecting the cell）パッケージング細胞に提供され得、および／または細胞は、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含み得る。例えば、ＨＥＫ ２９３は、ヒト細胞をアデノウイルス５ ＤＮＡで形質転換することによって生成され、現在、Ｅ１およびＥ３が含まれるがこれらに限定されないいくつかのアデノウイルス遺伝子を発現する（例えば、Grahamet al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59-72を参照されたい）。したがって、これらのヘルパー機能は、例えば、それらをコードするプラスミドによってそれらを細胞に供給することを必要とせずに、ＨＥＫ ２９３パッケージング細胞によって提供され得る。

【0067】

ウイルスベクターは、任意の適切な核酸構築物、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物であり得、一本鎖、二本鎖または二重鎖（即ち、ＷＯ２００１／９２５５１に記載されるように自己相補的）であり得る。

【0068】

パッケージングされたウイルスベクターのウイルスカプシド成分は、パルボウイルスカプシドであり得る。ＡＡＶ Ｃａｐおよびキメラカプシドが好ましい。例えば、ウイルスカプシドは、ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、および現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶであり得る。例えば、Fields et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4.sup.th ed.,Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。

【0069】

一部の実施形態では、パッケージングされたウイルスベクターのウイルスカプシド成分は、ネイティブＡＡＶカプシドのバリアントである（即ち、ネイティブＡＡＶカプシドと比べて１つまたは複数の改変を含む）。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８カプシドのバリアントである。好ましい実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ２カプシドのバリアント、例えば、ＰＣＴ出願番号ＵＳ１８／５１８１２（ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ２０１９／０６０４５４（例えば、配列番号４３～６１のうちいずれかのアミノ酸配列を含む）に記載されるものであり、その内容は、参照によって本明細書に取り込まれる。特に好ましい実施形態では、カプシドは、以下のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含む：

【化6】

【化7】

【0070】

ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全な相補体は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、完全な相補体ではないＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を含み得、またはＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全な相補体が提供され得る。

【0071】

さらに別の実施形態では、本発明は、治療的ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療における使用のための祖先ＡＡＶベクターの使用を提供する。具体的には、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで誘導された配列を、ｄｅ ｎｏｖｏ合成し、生物学的活性について特徴付けた。この試みは、９つの機能的な推定祖先ＡＡＶの生成ならびにＡＡＶ血清型１、２、８および９の予測された祖先であるＡｎｃ８０の同定をもたらした（Zinn et al., 2015, Cell Reports 12:1056-1068）。ウイルス粒子へとアセンブルすることに加えた、かかる祖先配列の予測および合成は、ＷＯ２０１５／０５４６５３に記載された方法を使用することによって達成され得、その内容は、参照によって本明細書に取り込まれる。特に、祖先ウイルス配列からアセンブルされたウイルス粒子の使用は、現代のウイルスまたはその部分よりも、今日のヒト集団における既存の免疫に対して感受性の低減を呈し得る。

【0072】

本発明は、本発明のパッケージングされたウイルスベクターを産生するために培養され得る「宿主細胞」によって包含されるパッケージング細胞を含む。本発明のパッケージング細胞には一般に、異種の（１）ウイルスベクター機能（複数可）、（２）パッケージング機能（複数可）および（３）ヘルパー機能（複数可）を有する細胞が含まれる。これらのコンポーネント機能の各々は、次のセクションにおいて考察される。

【0073】

最初に、ベクターは、当業者に公知のいくつかの方法によって作製され得る（例えば、ＷＯ２０１３／０６３３７９を参照されたい）。好ましい方法は、Grieger, et al. 2015, Molecular Therapy 24(2):287-297に記載されており、その内容は、全ての目的のために参照によって本明細書に取り込まれる。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞の効率的なトランスフェクションを、出発点として使用し、ここで、適格な臨床的マスター細胞バンクからの接着性ＨＥＫ２９３細胞系を使用して、迅速かつスケーラブルなｒＡＡＶ産生を可能にする振盪フラスコおよびＷＡＶＥバイオリアクターにおいて、動物性成分非含有の懸濁条件で成長させる。三重トランスフェクション法（例えば、ＷＯ９６／４０２４０）を使用して、懸濁ＨＥＫ２９３細胞系は、トランスフェクションの４８時間後に回収される場合、１０^５ベクターゲノム含有粒子（ｖｇ）／細胞よりも高いまたは１０^１４ｖｇ／Ｌよりも高い細胞培養物を生成する。より具体的には、三重トランスフェクションは、パッケージング細胞が３つのプラスミドでトランスフェクトされるという事実を指す：１つのプラスミドは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードし、別のプラスミドは、種々のヘルパー機能（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶタンパク質、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡ）をコードし、別のプラスミドは、導入遺伝子およびその種々の制御エレメント（例えば、改変されたＧＬＡ遺伝子およびＣＡＧプロモーター）をコードする。

【0074】

所望の収量を達成するために、いくつかの変数、例えば、成長およびトランスフェクションの両方を支持する適合性無血清懸濁培地の選択、トランスフェクション試薬、トランスフェクション条件および細胞密度の選択が、最適化される。ＡＡＶ血清型１～６、８、９および種々のキメラカプシドの高純度ベクター調製物を生じる、イオン交換クロマトグラフィー法に基づく汎用的な精製戦略もまた開発された。このユーザーフレンドリーなプロセスは、１週間以内に完了し得、満たされた粒子の空の粒子に対する高い比（＞９０％の満たされた粒子）を生じ、臨床適用に適切な精製後収量（＞１×１０^１３ｖｇ／Ｌ）および純度を提供し、全ての血清型およびキメラ粒子に関して汎用的である。このスケーラブルな製造技術は、網膜血管新生（ＡＡＶ２）、血友病Ｂ（ｓｃＡＡＶ８）、巨大軸索ニューロパチー（ｓｃＡＡＶ９）および網膜色素変性症（ＡＡＶ２）のためのＧＭＰ第Ｉ相臨床ＡＡＶベクターを製造するために利用されており、これらは患者に投与されてきた。さらに、トランスフェクション後の多数の時点において培養培地からｒＡＡＶを回収することを必然的に伴う灌流方法を実行することによる、全体的ベクター産生における最低５倍の増加。

【0075】

パッケージング細胞は、パッケージング機能およびベクター機能と共に、ウイルスベクター機能を含む。ウイルスベクター機能は、典型的には、パルボウイルスゲノムの一部分、例えば、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失され、改変されたＧＬＡ配列およびその関連する発現制御配列によって置き換えられたＡＡＶゲノムを含む。ウイルスベクター機能は、パッケージングのためのウイルスベクターの複製を生じるのに十分な発現制御配列を含む。典型的には、ウイルスベクターは、パルボウイルスゲノムの一部分、例えば、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失され、導入遺伝子およびその関連する発現制御配列によって置き換えられたＡＡＶゲノムを含む。導入遺伝子は、典型的には、欠失されたウイルスｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦの代わりに、２つのＡＡＶ ＴＲに挟まれている。適した発現制御配列、例えば、組織特異的プロモーター、および標的細胞における導入遺伝子の組織特異的発現を促進する際の使用のために適切な他の調節配列が含められる。導入遺伝子は、典型的には、治療的ポリペプチドまたはマーカーポリペプチドを産生するために発現され得る核酸配列である。

【0076】

ウイルスベクターにおける使用のために選択された末端反復（ＴＲ（複数可））（分離可能なおよび分離可能でない）は、好ましくは、ＡＡＶ配列であり、血清型１、２、３、４、５および６が好ましい。ＴＲが所望の機能、例えば、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどを媒介する限り、分離可能なＡＡＶ ＴＲは、野生型ＴＲ配列を有する必要はない（例えば、野生型配列は、挿入、欠失、短縮またはミスセンス変異によって変更され得る）。ＴＲは、ＡＡＶ逆位末端反復として機能する合成配列、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載される「二重－Ｄ配列」であり得、その全開示は、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。典型的には、必ずではないが、ＴＲは、同じパルボウイルス由来である、例えば、両方のＴＲ配列がＡＡＶ２由来である。

【0077】

パッケージング機能は、カプシド成分を含む。カプシド成分は、好ましくは、パルボウイルスカプシド、例えば、ＡＡＶカプシドまたはキメラＡＡＶカプシド機能由来である。適切なパルボウイルスのウイルスカプシド成分の例は、パルボウイルス科、例えば、自律的パルボウイルスまたはディペンドウイルス由来のカプシド成分である。例えば、カプシド成分は、ＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ Ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２ＮおよびＡＡＶ－ＬＫ０３、ならびにまだ同定されていないまたは非ヒト霊長類供給源由来の他の新規カプシドから選択され得る。カプシド成分は、２つまたはそれよりも多くのＡＡＶカプシド由来の成分を含み得る。

【0078】

パッケージングされたウイルスベクターは、一般に、ベクターＤＮＡのパッケージングおよび形質導入された細胞における改変されたＧＬＡ遺伝子配列の引き続く発現を生じるのに十分な、本明細書で「導入遺伝子」または「導入遺伝子発現カセット」と呼ばれる、ＴＲエレメントに挟まれた改変されたＧＬＡ遺伝子配列および発現制御配列を含む。ウイルスベクター機能は、例えば、プラスミドまたはアンプリコンの成分として細胞に供給され得る。ウイルスベクター機能は、細胞系内で染色体外に存在し得る、および／または細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれ得る。

【0079】

電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが含まれるがこれらに限定されない、ウイルスベクター機能を保有するヌクレオチド配列を複製およびパッケージングのための細胞宿主中に導入する任意の方法が援用され得る。ウイルスベクター機能がウイルスベクターを使用するトランスフェクションによって提供される実施形態では、ウイルス感染を引き起こすための標準的な方法が使用され得る。

【0080】

パッケージング機能は、ウイルスベクターの複製およびパッケージングのための遺伝子を含む。したがって、例えば、パッケージング機能は、ウイルス遺伝子発現、ウイルスベクター複製、組み込まれた状態からのウイルスベクターのレスキュー、ウイルス遺伝子発現、およびウイルス粒子へのウイルスベクターのパッケージングのために必要な機能を、必要に応じて含み得る。パッケージング機能は、遺伝子構築物、例えば、プラスミドもしくはアンプリコン、バキュロウイルス、またはＨＳＶヘルパー構築物を使用して、パッケージング細胞に一緒にまたは別々に供給され得る。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在し得るが、好ましくは、細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれる。例には、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。

【0081】

ヘルパー機能は、ウイルスベクターのパッケージングを開始するために要求されるパッケージング細胞の活動性感染を確立するために必要なヘルパーウイルスエレメントを含む。例には、ウイルスベクターのパッケージングを生じさせるのに十分な、アデノウイルス、バキュロウイルスおよび／またはヘルペスウイルスに由来する機能が含まれる。例えば、アデノウイルスヘルパー機能は、典型的には、アデノウイルス成分Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡを含む。パッケージング機能は、要求されるウイルスによるパッケージング細胞の感染によって供給され得る。パッケージング機能は、遺伝子構築物、例えば、プラスミドまたはアンプリコンを使用して、パッケージング細胞に一緒にまたは別々に供給され得る。例えば、Rabinowitz et al., 2002, J. Virol. 76:791に記載されるｐＸＲヘルパープラスミドおよびGrimmet al., 1998, Human Gene Therapy 9:2745-2760に記載されるｐＤＧプラスミドを参照されたい。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在し得るが、好ましくは、細胞の染色体ＤＮＡ（例えば、ＨＥＫ２９３細胞中のＥ１またはＥ３）中に組み込まれる。

【0082】

任意の適切なヘルパーウイルス機能が援用され得る。例えば、パッケージング細胞が昆虫細胞である場合、バキュロウイルスがヘルパーウイルスとして機能し得る。ヘルペスウイルスもまた、ＡＡＶパッケージング方法におけるヘルパーウイルスとして使用され得る。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、よりスケーラブルなＡＡＶベクター産生スキームを有利に促進し得る。

【0083】

電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが含まれるがこれらに限定されない、ヘルパー機能を保有するヌクレオチド配列を複製およびパッケージングのための細胞宿主中に導入する任意の方法が援用され得る。ヘルパー機能が、ウイルスベクターを使用するトランスフェクションまたはヘルパーウイルスを使用する感染によって提供される実施形態では、ウイルス感染を引き起こすための標準的な方法が使用され得る。

【0084】

当該分野で公知の任意の適切な許容性細胞またはパッケージング細胞が、パッケージングされたウイルスベクターの産生において援用され得る。哺乳動物細胞または昆虫細胞が好ましい。本発明の実施におけるパッケージング細胞の産生のために有用な細胞の例には、例えば、ヒト細胞系、例えば、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ ２９３細胞（これらは、構成的プロモーターの制御下で機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｂ－５０または任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、およびＨＴ１０８０細胞系が含まれる。一態様では、パッケージング細胞は、懸濁培養で成長させることが可能であり、より好ましくは、細胞は、無血清培養で成長させることが可能である。一実施形態では、パッケージング細胞は、無血清培地中で懸濁下で成長するＨＥＫ２９３である。別の実施形態では、パッケージング細胞は、米国特許第９，４４１，２０６号に記載され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ １３２７４として寄託されたＨＥＫ２９３細胞である。ＷＯ２００２／４６３５９に開示されたものが含まれるがそれらに限定されない多数のｒＡＡＶパッケージング細胞系が、当該分野で公知である。別の態様では、パッケージング細胞は、セルスタックの形態で培養される（例えば、ＨＥＫ２９３細胞を播種した１０層のセルスタック）。

【0085】

パッケージング細胞としての使用のための細胞系には、昆虫細胞系が含まれる。ＡＡＶの複製を可能にし、培養物中で維持され得る任意の昆虫細胞が、本発明に従って使用され得る。例には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、例えば、Ｓｆ９もしくはＳｆ２１細胞系、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．細胞系、または蚊細胞系、例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来の細胞系が含まれる。好ましい細胞系は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞系である。以下の参考文献が、異種ポリペプチドの発現のための昆虫細胞の使用、核酸をかかる細胞中に導入する方法、および培養物中でかかる細胞を維持する方法に関するそれらの教示について、本明細書に取り込まれる：Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, N J (1995)；O'Reillyet al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press(1994)；Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828；Kajigaya et al., 1991,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-4650；Ruffing et al., 1992, J. Virol.66:6922-6930；Kimbauer et al., 1996, Virol. 219:37-44; Zhao et al., 2000, Virol.272:382-393；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、米国特許第６，２０４，０５９号。

【0086】

本発明に従うウイルスカプシドは、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、バキュロウイルスからの発現によって、産生され得る（Brown et al., (1994) Virology 198:477-488）。さらなる代替法として、本発明のウイルスベクターは、例えば、Urabeet al., 2002, Human Gene Therapy 13:1935-1943によって記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するためにバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞において産生され得る。

【0087】

別の態様では、本発明は、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ産生の方法を提供し、ここで、バキュロウイルスパッケージングシステムまたはベクターは、これらの遺伝子を、バキュロウイルスベクターのポリヘドリンコード領域中に操作し、宿主細胞中へのトランスフェクションによってウイルス組換え体を産生することによって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード領域を保有するように構築され得る。特に、ＡＡＶのためにバキュロウイルス産生を使用する場合、好ましくは、ＡＡＶ ＤＮＡベクター産物は、ＡＡＶ ＩＴＲへの変異を使用することのない、自己相補的なＡＡＶ様分子である。これは、機能的Ｒｅｐ酵素活性の欠如による、自己相補的なＤＮＡ分子を生じる昆虫細胞における非効率的なＡＡＶ ｒｅｐニッキングの副産物であるようである。宿主細胞は、バキュロウイルス感染した細胞であり、またはバキュロウイルスヘルパー機能をコードするさらなる核酸がその中に導入されており、またはその中にこれらのバキュロウイルスヘルパー機能を含む。これらのバキュロウイルスのウイルスは、ＡＡＶ成分を発現し得、引き続いて、カプシドの産生を促進し得る。

【0088】

産生の間に、パッケージング細胞は、一般に、ウイルスベクターの複製およびパッケージングを生じるのに十分なヘルパー機能およびパッケージング機能と共に、１つまたは複数のウイルスベクター機能を含む。これらの種々の機能は、遺伝子構築物、例えば、プラスミドまたはアンプリコンを使用して、パッケージング細胞に一緒にまたは別々に供給され得、細胞系内で染色体外に存在し得る、または細胞の染色体中に組み込まれ得る。

【0089】

染色体外に取り込まれたもしくは細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた１つもしくは複数のベクター機能を有する細胞系、染色体外に取り込まれたもしくは細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた１つもしくは複数のパッケージング機能を有する細胞系、または染色体外に取り込まれたもしくは細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれたヘルパー機能を有する細胞系など、細胞には、既に取り込まれた述べられた機能のうちいずれか１つまたは複数が供給され得る。

【0090】

ｒＡＡＶベクターは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配などの、当該分野で標準的な方法によって精製され得る。ｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該分野で公知であり、これには、Clark et al., 1999, Human Gene Therapy 10(6):1031-1039；Schenpp andClark, 2002, Methods Mol. Med. 69:427-443；米国特許第６，５６６，１１８号およびＷＯ９８／０９６５７に記載される方法が含まれる。

【0091】

処置方法

【0092】

ある特定の実施形態では、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一なもしくは１００％同一なヌクレオチド配列を有する核酸、またはかかる核酸と少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物の治療有効量をファブリー病の処置を必要とする対象に投与することによる、かかる対象におけるかかる処置のための方法が提供される。一部の態様では、配列番号１と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を有する核酸は、対象におけるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）のレベルを低減させるのに有効な量で対象に投与される。

【0093】

関連の態様では、ファブリー病の処置における使用のための、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一なまたは１００％同一なヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。

【0094】

他の関連の態様では、医薬の製造のための、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一なまたは１００％同一なヌクレオチド配列を含む核酸の使用が提供される。

【0095】

他の関連の態様では、ファブリー病の処置のための医薬の製造のための、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一なまたは１００％同一なヌクレオチド配列を含む核酸の使用が提供される。

【0096】

一部の態様では、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一なまたは１００％同一なヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結される。

【0097】

好ましい実施形態では、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸の治療有効量を、ファブリー病を処置することを必要とする対象に投与するステップを含む、またはかかる核酸を含む医薬組成物を上記対象に投与することによる、ファブリー病を処置するための方法が提供される。

【0098】

他の実施形態では、ファブリー病の処置における使用のための、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。一部の態様では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一な、または１００％同一な配列を含む。

【0099】

他の実施形態では、ファブリー病の処置のための医薬の製造のための、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸の使用が提供される。

【0100】

関連の態様では、ファブリー病の処置における使用のための、またはファブリー病の処置のための医薬の製造における使用のための、（ｉ）発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一なまたは１００％同一なヌクレオチド配列を有する核酸および（ｉｉ）ネイティブもしくはバリアントＡＡＶカプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオン、またはかかるｒＡＡＶを含む医薬組成物が提供される。

【0101】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ネイティブＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８カプシドを含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８と比べて１つまたは複数の改変を含むバリアントＡＡＶカプシドを含む。好ましい実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号４の配列またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む。

【0102】

好ましい実施形態では、ファブリー病の処置におけるまたはファブリー病の処置のための医薬の製造のためのｒＡＡＶの使用が提供され、ｒＡＡＶは、（ｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸および（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号６のヌクレオチド配列を含む核酸および（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。一部の態様では、ｒＡＡＶは、筋肉内および／または血管内（例えば、静脈内）注射によって投与される。特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、単回静脈内投与として投与される。

【0103】

他の態様では、必要に応じて発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一なまたは１００％同一なヌクレオチド配列を有する核酸と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。一部の実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号５と少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一な配列を含む、または配列番号５と同一である。

【0104】

他の態様では、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と、（ｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸および（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むカプシドを含む感染性ｒＡＡＶとを含む医薬組成物が提供される。関連の態様では、感染性ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むカプシドならびに（ｉｉ）５’から３’に、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）請求項３に記載の核酸、（ｄ）ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む。特に好ましい実施形態では、感染性ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むカプシドおよび（ｉｉ）配列番号６の配列またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む核酸を含む：

【化8】

【化9】

【化10】

【0105】

一部の好ましい実施形態では、ファブリー病を有するヒト対象には、薬学的に許容される担体と、（ｉ）配列番号４として記載されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるカプシドタンパク質を含むカプシドおよび（ｉｉ）配列番号６の配列を含む異種核酸を含むｒＡＡＶベクターとを含む、医薬組成物が投与され、対象には、１つまたはそれより多くの用量のｒＡＡＶベクターが投与され、各用量は、約１×１０^１２～約１×１０^１５ベクター粒子／ｋｇもしくはベクターゲノム／ｋｇ、１×１０^１２～１×１０^１５ベクター粒子もしくはベクターゲノム、または約１×１０^１２、約２×１０^１２、３×１０^１２、約４×１０^１２、約５×１０^１２、約６×１０^１２、約７×１０^１２、約８×１０^１２、約９×１０^１２、約１×１０^１３、約２×１０^１３、約３×１０^１３、約４×１０^１３、約５×１０^１３、約６×１０^１３、約７×１０^１３、約８×１０^１３、約９×１０^１３、約１×１０^１４、約２×１０^１４、約３×１０^１４、約４×１０^１４、約５×１０^１４、約６×１０^１４、約７×１０^１４、約８×１０^１４、約９×１０^１４もしくは約１×１０^１５ベクター粒子／ｋｇもしくはベクターゲノム／ｋｇを含む。一部の特に好ましい態様では、対象には、１つまたはそれより多くの用量のｒＡＡＶが投与され、各用量は、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、例えば、約３×１０^１２、約１×１０^１３、３×１０^１３または約５×１０^１３ベクター粒子／ｋｇまたはベクターゲノム／ｋｇを含む。一部の特に好ましい実施形態では、医薬組成物は、単回静脈内注射を介して、ファブリー病を有するヒトに投与され、単回静脈内注射は、ヒト対象におけるファブリー病を処置するのに有効である。他の実施形態では、医薬組成物は、単回筋肉内注射を介して、ファブリー病を有するヒトに投与される。

【0106】

一部の好ましい実施形態では、薬学的に許容される担体と、（ｉ）配列番号４として記載されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるカプシドタンパク質を含むカプシドおよび（ｉｉ）配列番号６の配列を含む異種核酸を含むｒＡＡＶベクターとを含む、医薬組成物が提供され、この医薬組成物は、１×１０^１０～１×１０^１７ベクター粒子もしくはベクターゲノム、１×１０^１３～１×１０^１６ベクター粒子もしくはベクターゲノム、または約１×１０^１３、約２×１０^１３、３×１０^１３、約４×１０^１３、約５×１０^１３、約６×１０^１３、約７×１０^１３、約８×１０^１３、約９×１０^１３、約１×１０^１４、約２×１０^１４、約３×１０^１４、約４×１０^１４、約５×１０^１４、約６×１０^１４、約７×１０^１４、約８×１０^１４、約９×１０^１４、約１×１０^１５、約２×１０^１５、約３×１０^１５、約４×１０^１５、約５×１０^１５、約６×１０^１５、約７×１０^１５、約８×１０^１５、約９×１０^１５、約１×１０^１６、約５×１０^１６もしくは約８×１０^１６ベクター粒子もしくはベクターゲノムを含む。

【実施例】

【0107】

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示しており、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。本発明は、その好ましい実施形態に関して記載されてきたが、その種々の改変が、本出願を読んだ当業者に明らかとなる。
（実施例１）
ＧＬＡ ｃＤＮＡ配列のコドン最適化

【0108】

内因性ＧＬＡ分泌シグナルを含むヒトＧＬＡオープンリーディングフレームｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１６９．３；配列番号３）を、ヒト発現のためにコドン最適化した。最適化アルゴリズムは、コドン使用バイアス、ＧＣ含量、ＣｐＧジヌクレオチド含量、陰性ＣｐＧ島、ｍＲＮＡ二次構造、ＲＮＡ不安定性モチーフ、潜在スプライシング部位、未成熟ポリアデニル化部位、内部カイ部位およびリボソーム結合部位、ならびに反復配列が含まれるがこれらに限定されないパラメーターを含んだ。

【0109】

ヒトにおけるコドン使用バイアスを、コドン適応指数（ＣＡＩ）を０．７５から０．９３にアップグレードすることによって変化させた。平均ＧＣ含量を、ネイティブ配列における４８．６％から、最適化された配列における５７．９％へと最適化して、ｍＲＮＡの半減期を延長させた。ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性に影響を与えるステム－ループ構造を、最適化された配列において破壊した。さらに、負のシス作用性部位をスクリーニングし、欠失させて、ヒト細胞における遺伝子の発現を最適化し、いくつかの制限酵素部位を欠失させた。

【0110】

配列番号１として本明細書で示される、得られたコドン最適化されたヌクレオチド配列は、改善されたコドン使用、変更されたＧＣ含量、より良いｍＲＮＡ安定性、および負のシス作用性エレメントの改変を含む。
（実施例２）
コドン最適化されたＧＬＡ ｃＤＮＡ配列は、ファブリー病を有する患者由来の心筋細胞においてより高いレベルで発現される

【0111】

ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系を生成して、ヒトファブリー病患者に由来する罹患ヒト心筋細胞における配列番号１のヌクレオチド配列を有するヒトＧＬＡ核酸の発現、および疾患表現型の機能的修正を評価した。

【0112】

材料および方法

【0113】

線維芽細胞の細胞培養および人工多能性幹細胞系への再プログラミング

【0114】

非罹患線維芽細胞または男性のヒトファブリー病の線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むイーグル改変必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。再プログラミングのために、細胞を、０．０５％トリプシンを使用して継代し、６ウェル組織培養プレート中に１ｃｍ^２当たり２．５×１０^４細胞の密度でプレーティングした。細胞を、正常酸素圧条件において３７℃、５％ＣＯ_２で保った。

【0115】

罹患線維芽細胞の細胞再プログラミングを、製造業者の指示（Ｓｉｍｐｌｉｃｏｎ ＲＮＡ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｋｉｔ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って、Ｏｃｔ４－Ｋｌｆ４－Ｓｏｘ２－Ｇｌｉｓ１ポリシストロン性転写物の単一のＲＮＡトランスフェクションによって実施した。１０日目に、およそ５×１０^４～１×１０^５の再プログラミングされた細胞を、ヒトｉＰＳＣ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｂｏｏｓｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ＩＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充したＢ１８Ｒタンパク質（２００ｎｇ／ｍＬ）含有するマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）順化培地において、成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に再プレーティングした。２０日目に、変更された形態（morphology）および小さいコロニーを形成する能力によって認識される、再プログラミングされた細胞を、ｍＴｅＳＲ－１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移した。およそ２００細胞またはそれよりも大きいコロニーを手動で単離し、ｍＴｅＳＲ－１培地中でＭａｔｒｉｇｅｌコーティングされたプレート上にプレーティングした。ファブリー－ｉＰＳＣ系を、単一のコロニーから拡大増殖させた。ファブリー－ｉＰＳＣ系を、ｍＴｅＳＲ－１維持培地中でＭａｔｒｉｇｅｌ上で培養し、Ｇｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、４～５日毎に７０～８０％コンフルエンスで継代培養した。３つ全ての胚葉へのランダムな分化を確実にするために、ｉＰＳＣ胚様体（ＥＢ）を、懸濁培養中で１週間形成させ、次いで、１．４μＬ／１００ｍＬ培地のベータ－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に１×ＧｌｕｔａＭａｘ、１×非必須アミノ酸を含有するＤＭＥＭ中２０％のノックアウト血清代替物中で、さらに４週間にわたって接着条件において分化させた。心分化において使用したｉＰＳＣクローンを、会社のプロトコールに従って、標準的な核型決定のためにＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓに提出した。

【0116】

ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ心筋細胞の分化

【0117】

ファブリーｉＰＳＣを、成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた３つの１２ウェルプレート中に、ｍＴｅＳＲ－１中２５，０００細胞／ｃｍ^２で播種した。コンフルエンシーに達した時点で、培養物を、インスリンなしのＢ２７補助物質を含むＲＭＰＩ １６４０（ＲＢ－、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中でのＷｎｔ経路の逐次のＧＳＫ３βおよびＰｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害に供した。６日目に、細胞に、ＲＭＰＩ １６４０プラスＢ２７補助物質（ＲＢ＋、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を与えた。１５日目までに目に見える拍動を呈したファブリー病に罹患した心筋細胞を、ＲＢ＋中で、ＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングされた１２ウェルプレート中に、１：２の比で継代した。継代後、ファブリー心筋細胞を、以前に公開された分化パラダイム（Lian et al., PNAS, 109(27):E1848-57）に従って、グルコース欠乏を介して精製した。最初の拍動は、継代の７日後に出現した。精製の２週間後、ファブリー病に罹患した心筋細胞を、細胞特徴付けのため、ならびに、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号５のＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子による形質導入のために使用した。

【0118】

ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ心筋細胞の形質導入

【0119】

心筋細胞を、実験プレート中への継代の１４日後に、ｒＡＡＶで形質導入した。形質導入の当日、３つのウェルを回収して、細胞計数を得た。細胞を、細胞計数およびウイルス力価に基づいて、２５、１００、２５０の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。ビヒクルを、最も高い体積で添加した。細胞を、ウイルスと共に４８時間インキュベートし、次いで、培地交換を受けさせた。培地を、形質導入の６日後の回収まで、一日おきに（every day other day）交換した。

【0120】

免疫細胞化学（ＩＣＣ）

【0121】

ｉＰＳＣおよび胚葉ＩＣＣ

【0122】

ｉＰＳＣまたは３０日齢のプレーティングしたＥＢを、マグネシウムもカルシウムも含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ－／－）で１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定した。次いで、細胞を、ＰＢＳ－／－で３回洗浄し、ＰＢＳ－／－中０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中の２％ウシ血清アルブミンおよび５％ヤギ血清を用いて３０分間ブロッキングした。Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－２またはβ－チューブリンＩＩ、ＨＮＦ－αおよびα－ＳＭＡ一次抗体を、室温で２時間インキュベートし、その後、ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）二次抗体を室温で１時間インキュベートした。細胞をＤＡＰＩで対比染色して核を可視化し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ．Ａ１倒立顕微鏡で撮像した。

【0123】

心筋細胞ＩＣＣ

【0124】

感染の６日後に、細胞をＰＢＳ－／－で１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定した。次いで、細胞を、ＰＢＳ－／－で３回洗浄し、ＰＢＳ－／－中０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中の２％ウシ血清アルブミンおよび５％ヤギ血清を用いて３０分間ブロッキングした。アルファガラクトシダーゼＡに対する一次抗体（Ａｂｎｏｖａ）および心筋トロポニンＴに対する一次抗体（ｃＴＮＴ、Ｒ＆Ｄ）を、ブロッキング溶液中で細胞と共に室温で２時間インキュベートし、その後、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－５５５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。さらに、コンジュゲートされたＣＤ７７（Ｇｂ３）－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ＢＤ）を、ブロッキング緩衝液中で、固定された細胞と共に１時間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、ＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色して核を可視化し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ．Ａ１倒立顕微鏡で撮像した。

【0125】

ウエスタンブロット

【0126】

感染の６日後に、細胞を０．０５％トリプシンを用いて浮き上がらせ（lifted）、３００×ｇで５分間ペレット化した。溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液プラスプロテアーゼ阻害剤を使用して作製した。溶解物を、氷上で１５分間インキュベートし、２１，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を収集し、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を実行して、タンパク質濃度を決定した。濃度を正規化し、ゲルに均等にローディングした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、４～１２％ポリアクリルアミドゲルを使用して、２００ボルトで３０分間泳動した。タンパク質を、０．２μｍニトロセルロースメンブレンに移し、抗アルファガラクトシダーゼＡ（Ａｔｌａｓ）抗ＧＡＰＤＨ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）抗体でプローブし、その後、種特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体で一晩プローブした。高感度化学発光基質を使用して、タンパク質バンドを発色させ、バンド検出を、ＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ上で捕捉した。

【0127】

ＡＧＡ活性アッセイ

【0128】

ＡＧＡ活性アッセイを、アルファ－ガラクトシダーゼ合成蛍光分析基質（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｋ４０７）を用いて実施した。ＡＧＡ活性アッセイを、以下の変更点を伴って、製造業者のプロトコールに従って実施した。細胞を、０．２５％トリプシンを使用して解離させ、３００×ｇで３分間遠心分離した。細胞を、アルファ－ガラクトシダーゼ緩衝液で溶解し、氷上で１０分間インキュベートした。試料を、１２，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離し、上清を－８０℃で貯蔵した。次の日、試料を氷上で解凍し、ＢＣＡアッセイを介したタンパク質定量を実施して、解析の間のタンパク質濃度正規化を可能にした。ＡＧＡ活性アッセイ反応物を、室温で１時間インキュベートし、適した体積の停止緩衝液を使用して停止させた。ＡＧＡ活性アッセイ反応物を、ＡＧＡ標準曲線の最高濃度にゲインを設定して、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で３６０励起／４４５発光において即座に読み取った。

【0129】

表2.抗体のリスト

【表2】

【0130】

結果および考察

【0131】

ファブリー病に罹患した人工多能性幹細胞の誘導および特徴付け

【0132】

ＧＬＡ遺伝子における変異（ＡＧＡタンパク質活性の非存在を典型的には生じる十分に記載された病原性変異であるＷ１６２Ｘ）を有するファブリー患者線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。再プログラミングの前に、ＡＧＡタンパク質レベルを、ウエスタンブロットを介して検出して、疾患表現型を確認した。正常線維芽細胞系および組換えヒトＡＧＡタンパク質を、ＡＧＡタンパク質レベルについての陽性対照として使用した。ファブリー病に罹患した線維芽細胞は、野生型（ＷＴ）線維芽細胞と比較して、ＡＧＡタンパク質の欠如を呈した（図１）。この疾患特徴の確認の後、再プログラミングを開始した。

【0133】

ファブリー患者線維芽細胞を、Ｓｉｍｐｌｉｃｏｎ ＲＮＡ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｋｉｔを使用して再プログラミングして、ヒトファブリー病細胞モデルを創出した。線維芽細胞を、ＲＮＡレプリコンを含有する多能性因子でトランスフェクトし、小さい幹細胞コロニーが出現するまで、製造業者の指示に従って培養した。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）コロニーを、クローン的に拡大増殖させ、多能性転写因子発現について特徴付けた。再プログラミングされたファブリーｉＰＳＣコロニーは、３つの非常に重要な多能性転写因子であるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の陽性発現および適度な局在化を示した（図２Ａ、上パネル）。多能性タンパク質を発現することに加えて、ｉＰＳＣは、各胚葉へと分化することができるはずである。ファブリーｉＰＳＣから形成された胚様体の自発的分化の後、３つ全ての胚葉が、外胚葉はβ－チューブリンＩＩＩによって、内胚葉はＨＮＦ－αによって、中胚葉はα－平滑筋アクチンによって検出された。ファブリーｉＰＳＣが、再プログラミングの間に起こり得る染色体異常を含有しないことを確実にするために、核型解析を実施した。異常は検出されなかった（図２Ｂ）。

【0134】

ファブリー病に罹患した人工多能性幹細胞由来の心筋細胞の特徴付け

【0135】

ファブリーｉＰＳＣを心筋細胞へと分化させて、臨床的に適切な細胞型におけるファブリー病のモデルを開発した。生成された心筋細胞は、分化のおおよそ７日後に拍動し始め、エンドポイント解析まで拍動し続けた（データは示さず）。フローサイトメトリーおよび免疫細胞化学をファブリーｉＰＳＣ心筋細胞に対して実施して、心特異的マーカー（cardiac specific maker）である心筋トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）を使用して純度を試験した。分化により、９７％のｃＴＮＴ陽性細胞が生じ（図３Ａ）、これは、免疫細胞化学染色によって確認された（図３Ｂ）。

【0136】

ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ－心筋細胞における、配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡ遺伝子を保有するｒＡＡＶによる形質導入は、ＡＧＡのロバストなタンパク質発現をもたらす

【0137】

ファブリーｉＰＳＣ心筋細胞を、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号５のＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶ粒子の形質導入の前に、実験プレートへの播種後１４日間培養した。ファブリーｉＰＳＣ心筋細胞を、２５、１００または５００のＭＯＩで形質導入した。用量を、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結したＥＦＧＰ遺伝子を含む核酸を含むｒＡＡＶを使用した以前の形質導入効率データから決定した。細胞を、形質導入の６日後に回収した。重要なことに、形質導入されていないファブリーｉＰＳＣ心筋細胞は、ＩＣＣ、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットによって、ＡＧＡタンパク質の欠如を呈し、これにより、かかる細胞は、配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡ遺伝子の導入後のＡＧＡの発現レベルおよび活性を試験するための適切な疾患モデルになった。形質導入されていない細胞の免疫細胞化学（ＩＣＣ）は、ＡＧＡタンパク質発現の欠如を示したが、ｒＡＡＶで形質導入した細胞は、ロバストなＡＧＡ染色を呈した（図４Ａ）。

【0138】

細胞を、フローサイトメトリーのためにも回収し、生存能、ＡＧＡおよびｃＴＮＴについて染色した。ＡＧＡの発現を有した成熟心筋細胞（ｃＴＮＴ陽性）を指し示す二重陽性集団を定量した（図４Ｂ）。顕著な用量依存的ＡＧＡタンパク質発現応答が、成熟心筋細胞において、ｒＡＡＶによる形質導入後に観察された。わずか２５のＭＯＩが、６７％のｃＴＮＴおよびＡＧＡ二重陽性細胞（ｃＴＮＴ＋／ＡＧＡ＋）をもたらし、これは、ｒＡＡＶが、ファブリーｉＰＳＣ心筋細胞をロバストに形質導入することができ、コドン最適化された導入遺伝子ペイロードを発現することができることを指し示している。１００のＭＯＩは、８９％のｃＴＮＴ＋／ＡＧＡ＋をもたらし、２５０のＭＯＩは、二重陽性集団を９３％まで増加させた。

【0139】

総タンパク質を、ウエスタンブロットのために形質導入されたファブリーｉＰＳＣ心筋細胞から抽出して、細胞溶解物中の総ＡＧＡタンパク質を試験した。形質導入されていない細胞は、疾患表現型の指標であるＡＧＡタンパク質を欠如した。ｒＡＡＶで形質導入したファブリーｉＰＳＣ心筋細胞は、抗ＡＧＡ抗体を用いてプローブした後、４９ｋＤａの正確なサイズに、強いＡＧＡタンパク質発現を示した（図４Ｃ）。

【0140】

ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ－心筋細胞におけるｒＡＡＶ形質導入後の、増強されたＡＧＡ活性

【0141】

形質導入されたファブリーｉＰＳＣ心筋細胞を、アルファ－ガラクトシダーゼ緩衝液で溶解し、そのアルファ結合の切断性に関してアルファ－ガラクトシダーゼ活性を定量するために使用した。ファブリーｉＰＳＣ心筋細胞試料を、アルファ－ガラクトシダーゼ特異的合成基質と共に１時間インキュベートして、切断された基質の量を蛍光分析的に定量した。データにより、ファブリーｉＰＳＣ心筋細胞における、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）配列番号５のＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶの形質導入後の、ＡＧＡ活性における用量依存的な増加が明らかになった（図５Ａ）。

【0142】

ファブリー病の顕著な特徴となる病理学は、細胞のＧｂ３蓄積である（Waldek etal., Life expectancy and cause of death in males and females with Fabrydisease: findings from the Fabry Registry. Genetics in Medicine : OfficialJournal of the American College of Medical Genetics, 11(11), 790-796 (2009)）。形質導入されていないファブリーｉＰＳＣ心筋細胞には、Ｇｂ３免疫染色および蛍光顕微鏡検査を介して観察された実質的なＧｂ３の細胞蓄積が存在した（図５Ｂ、左上パネル）。２５ほどの低さのＭＯＩでのｒＡＡＶの形質導入は、Ｇｂ３免疫染色における減少を介して可視化されるＧｂ３蓄積を大幅に低減させた（図５Ｂ）。

【0143】

結論

【0144】

Ｇｂ３を低減させ、それにより、臨床転帰を改善する、ＧＬＡを細胞自律的に発現する重要な組織に標的化された永続的な処置、例えば、単回投与の静脈内遺伝子治療薬への、切実かつ差し迫った必要性が存在する。実験データは、配列番号４のカプシドタンパク質を含むカプシドを有するＡＡＶを介した、配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡ遺伝子の送達が、ファブリー病の重要な臓器、特に心組織を効率的に標的化することを実証している。ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ心筋細胞におけるこのＡＡＶの形質導入は、基底レベルを十分に上回って、迅速な細胞自律的な用量関連のＡＧＡタンパク質発現および活性を細胞内で生じた。ＡＧＡ活性における増加は、その蓄積がヒトにおけるファブリー病の病理発生の中核を成すとみなされるＧｂ３のクリアランスを生じた。
（実施例３）
コドン最適化されたＧＬＡ ｃＤＮＡ配列は、ファブリー病を有する患者由来の内皮細胞において、より高いレベルで発現される

【0145】

材料および方法

【0146】

内皮分化

【0147】

ファブリーｉＰＳＣを、分化の前に、６ウェルプレート中で維持し、３～４日毎に継代培養した。２つの１２ウェルプレートを、成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で事前コーティングした。ファブリーｉＰＳＣを、ｍＴＥＳＲ１中で８０～１００％コンフルエンシーになるまで成長させた。適した密度に達した時点で、培養物を、逐次のＧＳＫ３βおよびＶＥＧＦ活性化に供し、その後、以前に公開された分化パラダイム（Chalet Meylan, L., Patsch, C., & Thoma, E. (2015). Endothelialcells differentiation from hPSCs. Protocol Exchange.https://doi.org/10.1038/protex.2015.055）に従って、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で拡大増殖させた。６日目に、内皮細胞を、磁気細胞選別によって精製し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５×１０^６アリコートで凍結させた。内皮細胞を、ＶＥＧＦ_１６５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ（１×）培地中で、フィブロネクチンコーティングされたプレート上に１ｃｍ^２当たり２．６Ｅ＋４細胞で解凍した。内皮細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ細胞剥離溶液を使用して解凍した５日後に、１：２分割した。

【0148】

内皮細胞形質導入

【0149】

内皮細胞を、播種の４日後に、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶで形質導入した。形質導入の２４時間後、培地を吸引し、新たなＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ（１×）培地を添加した。培地を一日おきに交換した。３つのウェルを回収して、細胞計数を得た。細胞を、細胞計数およびウイルス力価に基づいて、５０、１００、５００および１０００の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。体積が最も高いＭＯＩの体積と等価になるように、ビヒクルを添加した。細胞を２４時間インキュベートし、次いで、培地交換を受けさせた。培地を、形質導入の４日後の回収まで、一日おきに交換した。

【0150】

免疫細胞化学のために、１０μＭのＧｂ３（Ｍａｔｒｅｙａ、ＬＬＣ．）を、ウイルスと共に１日前に、形質導入後のすべての飼料（feeding）に添加して、ファブリー病に関連するＧｂ３の蓄積を促進した。

【0151】

免疫細胞化学（ＩＣＣ）

【0152】

ファブリーｉＰＳＣ内皮ＩＣＣ

【0153】

細胞培養に対するある特定の改変を行って、ｒＡＡＶによる形質導入に応答したＧｂ３検出を可能にした。最初に、細胞を、フィブロネクチン－コーティングされたガラスチャンバースライド（ＬａｂＴｅｋ）上で培養した。細胞に、２日前に、形質導入の際に、およびウイルスのウォッシュアウトの際に、１０μＭのＧｂ３をローディングした。感染の４日後に、細胞を、マグネシウムもカルシウムも含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ－／－）で１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で１時間固定した。次いで、細胞をＰＢＳ－／－で３回洗浄し、ＰＢＳ－／－中０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中の２％ウシ血清アルブミンおよび５％ヤギ血清を用いて３０分間ブロッキングした。ＡＧＡに対する１：１００希釈した一次抗体（Ａｂｎｏｖａ Ｈ００００２７１７－Ｂ０１Ｐ、カスタムＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｏｉｔｉｎコンジュゲート）を、ブロッキング溶液中で細胞と共に室温で２時間インキュベートした。細胞を、ＤＡＰＩで対比染色して核を可視化し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ．Ａ１倒立顕微鏡で撮像した。さらに、コンジュゲートＢＤクローンｂ５ｂ ＣＤ７７－Ａｌｅｘａ－６４７（ＢＤ ５６３６３２）およびＭｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ３１－ＦＩＴＣを、ＩＣＣブロッキング緩衝液中の１：１００の抗体と共に固定培養物を１時間インキュベートすることによって使用した。

【0154】

ウエスタンブロット

【0155】

形質導入の４日後に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを用いて浮き上がらせ、３００×ｇで５分間ペレット化した。溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）プラスプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を使用して作製した。溶解物を、氷上で１５分間インキュベートし、２１，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を収集し、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を実行して、タンパク質濃度を決定した。濃度を正規化した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、４～１２％ポリアクリルアミドゲルを使用して、２００Ｖで３０分間泳動した。タンパク質を、０．２ｕｍニトロセルロースメンブレンに移し、抗ＡＧＡ（Ａｔｌａｓ、ＨＰＡ０００２３７、１：２００）および抗ＧＡＰＤＨ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５１７４、１：５０００）抗体でプローブし、その後、種特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体で一晩プローブした。高感度化学発光を使用して、タンパク質バンドを発色させ、バンド検出を、ＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ上で捕捉した。バンド定量を、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌソフトウェアおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して解析した。

【0156】

ＡＧＡ活性アッセイ

【0157】

ＡＧＡ活性アッセイを、アルファ－ガラクトシダーゼ合成蛍光分析基質（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｋ４０７）を用いて実施した。ＡＧＡ活性アッセイを、以下の変更点を伴って、製造業者のプロトコールに従って実施した。簡潔に述べると、使用済みの培地を収集し、液体窒素を使用して瞬間凍結した。細胞を、トリプシン０．０５％を使用して解離させ、３００×ｇで３分間遠心分離して、上清を除去した。次いで、細胞をＡＧＡ緩衝液で溶解し、氷上で１０分間インキュベートした。試料を、１２，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離した。上清を収集し、－８０℃で貯蔵した。次の日、試料を氷上で解凍し、ＢＣＡアッセイを介したタンパク質定量を、ＡＧＡ活性アッセイに加えて実施した。ＡＧＡ反応時間は１時間であり、試料を、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で３６０励起／４４５発光において読み取り、ゲインを、ＡＧＡ標準曲線の最高濃度に設定した。

【0158】

表3-抗体のリスト

【表3】

【0159】

結果

【0160】

ファブリー病に罹患した人工多能性幹細胞由来の内皮細胞の特徴付け

【0161】

ファブリーｉＰＳＣを内皮細胞へと分化させて、ファブリー病において冒される細胞型の適切なモデルを生成した。生成された内皮細胞を、６日目にＣＤ１４４についてのＭＡＣＳによって精製した。フローサイトメトリーおよび免疫細胞化学を、ファブリーｉＰＳＣ内皮細胞に対して実施して、内皮特異的マーカー（endothelial-specific maker）であるＣＤ３１を使用して純度を試験した。分化は、９９．２％のＣＤ３１陽性細胞を生じ（図６Ａ）、これは、形質膜における免疫細胞化学染色によって確認された（図６Ｂ）。

【0162】

ファブリー病ｉＰＳＣ－内皮細胞における、配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡを保有するｒＡＡＶによる形質導入は、ロバストなＡＧＡタンパク質発現をもたらす

【0163】

ファブリーｉＰＳＣ内皮細胞を、５０、１００、５００および１０００のＭＯＩにおける、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶの形質導入の前に、解凍から１１日間にわたって培養した。用量を、ＣＡＧプロモーターの制御下にＥＧＦＰを保有する、別段同一なｒＡＡＶを使用して、形質導入効率データから決定した。細胞を、形質導入の４日後に回収した。フローサイトメトリーは、ＡＧＡ陽性細胞における用量依存的増加を示し（図７Ａ）、形質導入されていない細胞の免疫細胞化学（ＩＣＣ）は、ＡＧＡタンパク質発現の欠如を示したが、ｒＡＡＶで形質導入した細胞は、ロバストなＡＧＡ染色を呈した（図８Ｂ）。

【0164】

タンパク質を、ウエスタンブロッティングのために、形質導入されたファブリーｉＰＳＣ由来の内皮細胞から抽出して、総ＡＧＡタンパク質を試験した。形質導入されていない細胞は、ＩＣＣによって実証されたように、ＡＧＡタンパク質を欠如した。しかし、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶで形質導入したファブリーｉＰＳＣ内皮細胞は、抗ＡＧＡ抗体を用いてプローブした後、４９ｋＤａの正確なサイズに、強いＡＧＡタンパク質バンドを示した（図７Ｂ）。バンド密度を決定した（図７Ｂ）。ｒＡＡＶによる形質導入は、形質導入されていない細胞と比較して、両方のＭＯＩについて、総ＡＧＡタンパク質を有意に増加させた。

【0165】

ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ－内皮細胞における、（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶによる形質導入後の、増強されたＡＧＡ活性

【0166】

形質導入されたファブリーｉＰＳＣ内皮細胞を、ＡＧＡ緩衝液（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、ＬＬＣ．）で溶解し、ＡＧＡ活性を定量するために使用した。ファブリーｉＰＳＣ内皮細胞試料を、ＡＧＡ特異的合成基質と共に１時間インキュベートして、切断された基質の量を蛍光分析的に定量した。データは、ｒＡＡＶで形質導入したファブリーｉＰＳＣ内皮細胞が、ファブリーｉＰＳＣ内皮細胞と比較して増強されたＡＧＡ活性を有したことを明らかにしている。図８Ａおよび８Ｂを参照されたい。

【0167】

結論

【0168】

ファブリー病に罹患したｉＰＳＣ内皮細胞における、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶの形質導入は、基底レベルを有意に上回る、迅速な細胞自律的な用量依存的ＡＧＡタンパク質発現および細胞内活性を生じた。コドン最適化されたＧＬＡ導入遺伝子の発現を介したＡＧＡ活性における増加は、その蓄積がヒトにおけるファブリー病の病理発生の中核を成すとみなされるＧｂ３のクリアランスを生じた。
（実施例４）
ファブリーマウスモデルの血漿および組織における、配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡから発現されたＡＧＡの発現および機能的解析

【0169】

材料および方法

【0170】

ｉｎ ｖｉｖｏ研究設計および試料収集

【0171】

１０～１１週齢のファブリーモデルＢ６；１２９－Ｇｌａ^{ｔｍ１Ｋｕｌ}／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ番号００３５３５）（本明細書で以下ＧＬＡ－ヌルと呼ぶ）または正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含有するダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中の（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶの１×１０^１２、１×１０^１３もしくは５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、またはビヒクルのみの、単回静脈内尾静脈注射を１日目に受けた（表４を参照されたい）。死亡率、臨床観察、体重、飼料消費、ＡＧＡ活性およびＧｂ３基質蓄積についての生物分析の解析、ならびに肉眼的剖検所見を評価した。さらに、マウスのサブセット（１群当たりｎ＝３匹）由来の組織を処理し、免疫組織化学（ＩＨＣ）によってＡＧＡの発現および局在化について試験した。

【0172】

血液試料（１日目、１５日目および２９日目）または取得可能な最大限（５６日目のみ）を、血漿中のα－ガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡ）活性および／またはＧｂ３基質蓄積の決定のために、二酸化炭素吸入（５６日目のみ）後に、上顎静脈または大静脈を介して全ての動物から収集した。血液試料を収集し、血漿へと処理し、試料を検査するまで、－６０℃～－９０℃で貯蔵した。血漿を、１日目、１５日目および２９日目の投与の前に、ならびに５６日目の研究終結時に、ＡＧＡ活性について解析した。血漿Ｇｂ３およびｌｙｓｏＧｂ３レベルを、５６日目に解析した。心臓、腎臓、肝臓および小腸の試料もまた、研究終結時に収集し、ＡＧＡ活性およびＧｂ３基質レベルについて解析した。各群中の動物のサブセット由来の選択された組織（心臓、肝臓、腎臓および小腸）の代表的な試料を収集し、１０％中性緩衝ホルマリン（組織の２０～３０倍の体積）中で即座に保存した。組織を、室温でおよそ４８時間（±１時間）固定し、次いで、７０％エタノールに移した。

【0173】

表4 ファブリーマウス用量範囲および有効性研究のための処置群のスキーム

【表4】

【0174】

血漿および組織活性解析

【0175】

ＡＧＡ酵素活性を、検証されたアッセイを使用して、４－メチルウンベリフェロンの産生を介して検出および定量した。簡潔に述べると、試料を、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する活性緩衝液中に希釈し、室温で１時間インキュベートした。蛍光発光を、３６６励起／４５０～４７５発光での蛍光検出を備えたプレートリーダーを使用して定量し、標準曲線と比較した。組織試料内の総タンパク質を、ＢＣＡアッセイを使用して定量した。

【0176】

血漿基質解析

【0177】

血漿中のｌｙｓｏＧｂ３（ｍ／ｚ ７８６）およびそのアナログ（ｍ／ｚ ７８４、ｍ／ｚ ８０２およびｍ／ｚ ８０４）、ならびにＧｂ３およびそのアイソフォーム（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：１およびＣ２４：０）を、記載されたように（Boutin & Auray-Blais, 2014, Analytical Chemistry, 86(7),3476-3483. //doi.org/10.1021/ac404000d；Provencal et al. 2016, Bioanalysis,8(17), 1793-1807. https://doi.org/10.4155/bio-2016-0116）解析した。簡潔に述べると、用量の５６日後に採取した血漿試料（４２日の試料を、保存しアーカイブしたが、解析はしなかった）を、内部標準としてのグリシン化された（ｇｌｙｃｉｎａｔｅｄ）ｌｙｓｏＧｂ３（Ｍａｔｒｅｙａ ＬＬＣ；Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）でスパイクし、混合モード強カチオン交換（ＭＣＸ）カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用する固相抽出によって精製した。収集された相を、窒素ストリーム下で乾燥させ、５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸中で再構成し、ＢＥＨ Ｃ１８カラムを使用するＡｃｑｕｉｔｙ Ｉ－Ｃｌａｓｓ超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に注入し、ｌｙｓｏＧｂ３を、Ｘｅｖｏ ＴＱ－Ｓ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）三重四重極タンデム質量分析計を使用して、スパイクインした内部標準（グリシン化－ｌｙｓｏＧｂ３）と同時に検出した。

【0178】

Ｇｂ３解析のために、血漿試料を、内部標準としてのＧｂ３（Ｃ１８：０Ｄ３）（Ｍａｔｒｅｙａ ＬＬＣ；Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）でスパイクし、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルによる液－液抽出によって精製した。試料を、水酸化カリウムで鹸化し、酢酸で中和し、遠心分離し、有機層を収集し、窒素のストリーム下で乾燥させた。試料を再構成し、Ｚｏｒｂａｘ Ｂｏｎｕｓ－ＲＰ Ｇｕａｒｄカラムカートリッジ（４．６×１２．５ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＡｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ ２７９５システム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に注入した。次いで、分析物を、Ｑｕａｔｔｒｏマイクロ三重四重極タンデム質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、スパイクインした内部標準と同時に検出した。

【0179】

組織基質解析

【0180】

ファブリー病の処置のために重要な組織中のＧｂ３アイソフォームおよびアナログ（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：１）を、記載されたように（Provencal et al. 2016, Bioanalysis, 8(17), 1793-1807.https://doi.org/10.4155/bio-2016-0116）解析した。簡潔に述べると、強化チューブ中の凍結した心臓、腎臓、肝臓、小腸および脾臓の組織試料を解凍し、５つのセラミックビーズを各チューブに添加し、試料を、Ｂｅａｄ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ １２ビーズミルホモジナイザー（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｋｅｎｎｅｓａｗ、ＧＡ）を使用してメタノール中でホモジナイズした。次いで、溶解物を、上記のように、血漿試料と同じ様式で抽出および解析した。全ての組織を、１群当たりｎ＝１２匹の動物から収集したが、他の６匹の動物からのＡＧＡ活性解析を可能にするための組織サイズの制限に起因して、１群当たりｎ＝６匹の動物から収集した心臓は除く。各処置群からの残り３匹の動物を、免疫組織化学解析に使用した。

【0181】

データは、Ｇｂ３内部標準（Ｇｂ３（Ｃ１８：０Ｄ_３））のピーク面積によって除算した、試料分析物の質量分析計ピーク面積の比である応答比として表される。各組織について、６種全てのＧｂ３アイソフォーム／アナログの総応答比を試験した。この比の性質に起因して、この応答比に帰せられる単位は存在しない。

【0182】

統計分析

【0183】

統計分析は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ－Ｍａｔｔａｗａｎ（Ｍａｔｔａｗａｎ、ＭＩ）の生物統計学グループが実施した。データ解析を、全てのｌｙｓｏＧｂ３およびＧｂ３アイソフォーム／アナログの集計値に対して実施して、データが広範囲にわたるＡＧＡ基質を捕捉していたことを確実にした。血漿ｌｙｓｏＧｂ３データセットおよび組織Ｇｂ３データセットの両方における全ての「検出されない」（Ｎ．Ｄ．）値は、データ解析の目的のために、ゼロの値を有するとして対処した。感度解析を、それらのＮ．Ｄ．値の代わりにＬＬＯＤ（検出下限）値を使用して実施した。

【0184】

群分散の均一性および残差の正規性を評価するための検査を、０．０１有意水準で実施した。Ｇｂ３データ解析のために使用した実験単位は、個々の動物であった。

【0185】

生データを、各時間間隔内で表にし、平均および標準偏差を、群単位で各エンドポイントについて計算した。各エンドポイントについて、処置群を、以下に概説する解析を使用して対照群と比較した。一部のエンドポイントについてのデータを、必要に応じて、指定された解析を実施する前に、対数変換またはランク変換のいずれかによって変換した。

【0186】

表5 計算した統計的比較

【表5】

【0187】

変動性を実証するエンドポイントおよび／またはパラメーター（各収集間隔内の）について、全ての群について標本サイズが３またはそれよりも大きい場合、システムは、データがおよそ正規であるかどうか、または対数変換を使用すべきかランク変換を使用すべきかを考えるために、残差の正規性および分散の均一性を検査した。ルビーン検定を使用して、群分散の均一性を評価し、シャピロ－ウィルク検定を使用して、残差の正規性を検査した。

【0188】

生データに対して、ルビーン検定が有意でなく（ｐ≧０．０１）、シャピロ－ウィルク検定が有意でなかった（ｐ≧０．０１）場合、正規分布を使用した。ルビーン検定が有意であった（ｐ＜０．０１）か、またはシャピロ－ウィルク検定が有意であった（ｐ＜０．０１）かのいずれかの場合、分散の正規性および均一性を、データに対して対数変換を使用して検査した。

【0189】

対数変換されたデータに対して、ルビーン検定が有意でなく（ｐ≧０．０１）、シャピロ－ウィルク検定が有意でなかった（ｐ≧０．０１）場合、対数正規分布を使用した。ルビーン検定が有意であった（ｐ＜０．０１）か、またはシャピロ－ウィルク検定が有意であった（ｐ＜０．０１）かのいずれかの場合、ランク変換をデータに対して使用した。

【0190】

適した変換されたデータを使用する一元配置分散分析を使用して、処置の効果について各エンドポイントを検査した（Edwards & Berry, 1987, Biometrics, 43(4), 913-928）。

【0191】

処置効果が有意であった（ｐ＜０．０５）場合、線形対比を、上記のような処置群のペアワイズ比較のために構築した。これらのペアワイズ比較の結果を、ＥｄｗａｒｄｓおよびＢｅｒｒｙの方法（Edwards & Berry, 1987, Biometrics, 43(4), 913-928.）を使用する多重比較のための調整後に、０．０５および０．０１有意水準で報告した。全ての検定は、特に指し示さない限り、両側検定であった。

【0192】

結果および考察

【0193】

血漿および組織ＡＧＡ解析

【0194】

上記ｒＡＡＶの（（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む）単回ＩＶ投与は、評価した全ての時点において、血漿ＡＧＡ活性における一貫した用量依存的増加を生じた（図９Ａ）。これらの増加は、研究の８週間の持続時間にわたって維持された（図９Ａ）。

【0195】

研究終結時に、ＡＧＡ活性における増加が、ビヒクル処置したマウスと比較して、腎臓および小腸において検出され、より高いレベルが、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの高用量で心臓において記録された（図９Ｂ）。肝臓では、高いＡＧＡ活性レベルが、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇで処置したマウスおよび５×１０^１３ｖｇ／ｋｇで処置したマウスの両方において観察された（図９Ｂ）。これらのデータは、上記ｒＡＡＶの（（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む）単回ＩＶ投与が、特に、１×１０^１３およびそれよりも高い用量で、血漿中でのＡＧＡ活性の有意な発現を生じることを示唆している。有意な発現は、心臓および肝臓でも、投与の８週間後まで見られた。組織中のＡＧＡ発現を視覚的に確認するために、心臓、腎臓、小腸および肝臓を収集し、固定し、パラフィン包埋し、上記のようにＡＧＡについてのＩＨＣに供した。ＡＧＡ発現における用量依存的増加が、試験した全ての組織において観察された（図１０）。

【0196】

血漿ｌｙｓｏＧｂ３解析

【0197】

上記ｒＡＡＶの（（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む）単回ＩＶ投与は、投与の８週間後に、血漿中の総ｌｙｓｏＧｂ３レベルの全てのレベルにおいて、用量依存的かつ有意な（Ｐ＜０．０１）低減を生じた。ｌｙｓｏＧｂ３の４つの異なるアナログを試験し、それらの質量電荷比（ｍ／ｚ）によって表した：ｍ／ｚ ７８６、ｍ／ｚ ７８４、ｍ／ｚ ８０２およびｍ／ｚ ８０４。全てのアナログの集計変化を一緒に試験すると、ｌｙｓｏＧｂ３は、ｒＡＡＶの全ての用量レベルにおいて、実質的に低減された。

【0198】

野生型マウスは、血漿中で検出されたわずか２．１１±０．２６ｎＭのｌｙｓｏＧｂ３を呈するが、ビヒクル処置したファブリーマウスは、４７７．３７±８８．５ｎＭよりも大きい、血漿中での有意なｌｙｓｏＧｂ３蓄積を有する（図１１）。１×１０^１２ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの単回の低いＩＶ用量は、ファブリーマウス血漿中のｌｙｓｏＧｂ３の濃度を、５８％よりも大きく、１９７．５±１２４．５ｎＭまで低減させた（Ｐ＜０．０１）。１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの中間用量は、１９．１±１３．４６ｎＭまでの、ファブリーマウスにおける血漿ｌｙｓｏＧｂ３の９６％の低減を生じた（Ｐ＜０．０１）。ｒＡＡＶの用量を５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまでさらに増加させることで、１０．５７±１３．８５ｎＭへの、ｌｙｓｏＧｂ３における類似の低減が生じた（Ｐ＜０．０１）。全てのアナログの集計した変化からのデータは、以下の表６にまとめられる：

【0199】

表6 IV注射後56日目の血漿lysoGb3レベル

【表6】

【0200】

血漿中のＧｂ３およびＧｂ３アナログもまた試験したが、血漿中では、ｌｙｓｏＧｂ３が、臨床疾患について基質のより適切な形態であるので（Boutin & Auray-Blais, 2014, Analytical Chemistry, 86(7),3476-3483. //doi.org/10.1021/ac404000d）、ｌｙｓｏＧｂ３データのみを本明細書で考察する。

【0201】

組織Ｇｂ３解析

【0202】

試験した全ての組織は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６と比べて、ＧＬＡ－ヌルファブリーマウスにおいて有意に多い量のＧｂ３を呈し、これにより、ファブリー病表現型に関連するＡＧＡ基質の予期された蓄積が確認された。全ての組織中で、全ての用量レベルにおいて、ｒＡＡＶの単回ＩＶ投与による処置後に、Ｇｂ３の用量依存的低減が存在する。心臓、腎臓、肝臓および小腸からの具体的な結果は以下に記載される。脾臓もまた収集および解析したが、脾臓は、ファブリー病にとって臨床的に非常に重要ではないので、それらの結果は本明細書では考察しない。組織Ｇｂ３データは、Ｇｂ３内部標準（Ｇｂ３（Ｃ１８：０Ｄ_３））のピーク面積によって除算した、試料分析物の質量分析計ピーク面積の比である応答比として表される。

【0203】

心臓Ｇｂ３解析

【0204】

野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、心臓において２．９±０．２の応答比を呈するが、ＧＬＡ－ヌルファブリーマウスは、２８５．５±５６．５において、測定された有意な基質蓄積を示す（Ｐ＜０．０１）。ｒＡＡＶの単回ＩＶ注射は、ファブリーマウスにおいて、Ｇｂ３の用量依存的クリアランスを生じる（図１２）。１×１０^１２ｖｇ／ｋｇの低用量は、心臓のＧｂ３含量を、３０．１±３０．５まで、８９．４％低減させた。１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの中間用量レベルは、Ｇｂ３レベルを、９６％よりも大きく、９．９±３．７まで低減させた。５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの高用量は、４．４±２．２まで、９８％よりも多くのＧｂ３を取り除いた。これらの結果は、１群当たりｎ＝６匹の動物の平均を表す。心臓における全てのＧｂ３低減が、群２（ビヒクル処置したＧＬＡ－ヌル）と比較して、統計的に有意（Ｐ＜０．０１）であった。

【0205】

腎臓Ｇｂ３解析

【0206】

ビヒクル処置した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、２５±４．１の応答比を示すが、ＧＬＡ－ヌルファブリーマウスは、３７３±７１を示す。ｒＡＡＶの単回ＩＶ投与は、Ｇｂ３の用量依存的かつ統計的に有意な（Ｐ＜０．０１）クリアランスを生じ、それぞれ１×１０^１２、１×１０^１３または５×１０^１３ｖｇ／ｋｇによる処置の５６日後に、２８．３％、７４．４％および９０．７％の低減を示した。中間用量および高用量レベルでの腎臓中でのＧｂ３低減は、群２（ビヒクル処置したＧＬＡ－ヌル）と比較して統計的に有意（Ｐ＜０．０１）であった。低用量の１×１０^１２ｖｇ／ｋｇは、有意には到達しなかったものの（Ｐ＝０．０５３７）、治療用生成物は、この低用量レベルであっても、Ｇｂ３における傾向のある低減を呈している（図１２）。

【0207】

肝臓Ｇｂ３解析

【0208】

野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＧＬＡ－ヌルファブリーマウスの肝臓溶解物中の、応答比で測定したＧｂ３レベルは、それぞれ２．９±０．５および３７７±７５であった。肝臓Ｇｂ３蓄積は、低用量のｒＡＡＶによってであっても、ほとんど完全に取り除かれた（図１２）。１×１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量は、２６±２４までの、Ｇｂ３の９３．１％の低減を生じた。１×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの中間用量および高用量は、ほぼ完全な（＞９９％の）基質クリアランスを生じ、それぞれ２．６±０．５および２．５±０．３の野生型レベルに戻った。

【0209】

小腸Ｇｂ３解析

【0210】

小腸は、ＧＬＡ－ヌルファブリーマウスにおいて、Ｇｂ３のはるかに高い蓄積を示し、１１６４±２７６の応答比を示したが、わずか３．４±０．３が、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの小腸において検出された。ｒＡＡＶの単回ＩＶ投与は、ビヒクル処置したＧＬＡ－ヌルのクリアランスと比べて、全ての用量レベルにおいて用量依存的かつ有意な（Ｐ＜０．０１）クリアランスを生じた（図１２）。１×１０^１２、１×１０^１３または５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量レベルは、それぞれ、Ｇｂ３における３３．６％（７７２±１４８）、７３％（３１４±１９０）および９４．８％（６０±５９）の低減を生じた。

【0211】

表7 コドン最適化されたGLAを保有するrAAVによるIV処置の56日後に収集した組織におけるGb3低減の概要

【表7-1】

【表7-2】

【0212】

結論

【0213】

ファブリー病は、臓器および組織におけるＧｂ３およびｌｙｓｏＧｂ３基質分子の蓄積によって引き起こされる。この研究は、配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡを保有するｒＡＡＶの単回用量の、マウスモデルにおけるファブリー病のための処置としてＡＧＡを発現しＧｂ３を異化する能力を評価した。この研究の結果は、血漿および試験した全ての組織中のＧｂ３およびｌｙｓｏＧｂ３における有意な低減を実証している。１×１０^１２ｖｇ／ｋｇの低用量は、心臓および肝臓の両方において高度に活性であり、各臓器において８９％よりも大きい基質低減をもたらす。この低用量は、小腸において３３．４％の基質低減を生み出し、腎臓における低減は、腎臓でのデータにおいて変動性が見られたものの、その結果が統計的有意性に到達しないような低減であった。１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの中間用量は、心臓における９６％よりも大きい基質低減、肝臓のほぼ完全な（＞９９％の）クリアランス、腎臓における７４．４％の低減および小腸の７３％の低減を生じ、これは、検査した全ての組織において、高度に活性かつ有意な用量である。５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの高用量は、心臓における９８％よりも大きい基質クリアランス、腎臓における９０％よりも大きいクリアランス、小腸におけるほぼ９５％のクリアランス、および肝臓における９９％よりも大きいクリアランスを生じた。検査した全ての用量は、ファブリーマウスモデルにおいて活性かつ有効であり、一部の場合には、野生型レベルまたはその近傍のレベルまで、蓄積したＡＧＡ基質レベルを低減させた。
（実施例５）
野生型マウスの血漿および組織における、配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡから発現されたＡＧＡの発現および機能的解析

【0214】

実験的にナイーブなＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（投与の開始時に８週齢）における、静脈内注射による（ｉ）配列番号４のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡを含む配列番号６の核酸を含むｒＡＡＶ（４Ｄ－３１０）の単回投与非ＧＬＰ急性忍容性研究を実施した。単回ＩＶ注射（尾静脈を介する）後の最大耐用量（ＭＴＤ）を決定した。

【0215】

研究設計は、以下の表８に提供される：
表8:

【表8】

【0216】

血液試料を、血漿中のＧＬＡ活性の決定のために、上顎血管を介して全ての生存動物から、１日目（投与前）に、ならびに１５日目、２９日目および４３日目の同じ時刻に収集した。

【0217】

死後研究評価を、３０日目に安楽死させた１匹の動物、および予定された最終的な剖検時（投与の約６週間後）の全ての生存動物に対して実施した。心臓、肝臓（左側葉）、腎臓（左）および小腸（十二指腸、回腸および空腸の匹敵するサイズの区域）を、全ての動物から単離し、ＧＬＡ活性について評価した。

【0218】

投与後、全ての処置した血漿試料は、対照動物のＧＬＡ活性を有意に上回るＧＬＡ活性を有した（１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量についてはビヒクル対照を超える１２００倍の増加、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量についてはビヒクル対照を超える５０００倍の増加、および１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量についてはビヒクル対照を超える２６，０００倍の増加を例示する図１３を参照されたい）。さらに、各々のより高い用量は、より低い用量（複数可）を有意に上回る血漿ＧＬＡ活性を有した。同じ傾向（用量応答性）が、収集した全ての組織において観察された（図１４を参照されたい）。集合的に考えると、このデータは、各用量での４Ｄ－３１０の単回ＩＶ投与の後の、ＧＬＡの明らかな発現および得られたＧＬＡ活性を実証している。特に、ファブリー病の処置のために最も適切な組織には、十二指腸、心臓、回腸、空腸、心臓、腎臓および肝臓組織があり、ＧＬＡバイオリアクターとして機能する肝臓におけるＧＬＡの発現が伴う。

【0219】

４Ｄ－３１０処置した動物の血漿中のＧＬＡ値の概要は、以下の表９に提供される：
表9:

【表9-1】

【表9-2】

【0220】

この研究では、４Ｄ－３１０関連の肉眼での観察は存在しなかった。この研究では、全身性のまたは局所的な毒性の、４Ｄ－３１０関連の臨床観察は存在せず、体重における４Ｄ－３１０関連の変化も飼料消費に対する影響も観察されなかった。この研究では、４Ｄ－３１０関連の死亡している状態は存在しなかった。

【0221】

雄性マウスへの１．０×１０^１３、５×１０^１３および１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの単回静脈内投与後に評価したいずれのパラメーターに対しても、４Ｄ－３１０関連の有害効果は存在しなかったので、無作用量（ＮＯＥＬ）および最大耐用量は、検査した最高用量である１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇであると決定された。
（実施例６）
全身性投与された４Ｄ－３１０（配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡを有する核酸を含む）の毒性および生体内分布

【0222】

１４日および９１または９２日の観察期間が後に続く、尾静脈を介した単回静脈内注射を介してＣ５７ＢＬ／６（ｗｔ）マウスに投与された４Ｄ－３１０の潜在的毒性および組織生体内分布を調査した。研究設計は、以下の表１０に提供される：
表10:

【表10】

^a 各剖検の日に、動物を以下のように指定した:臨床化学パラメーターおよび顕微鏡試験のために5匹/群;血液学パラメーターのために5匹/群;抗カプシドおよび抗ペイロード抗薬物抗体解析のために5匹/群;GLA活性解析ならびに組織および全血qPCRおよびRT-qPCRのために7匹/群。
^b 追加の動物/処置群に、可能な代替として投与した。代替として使用されない場合、追加の動物は92±1日目の間隔で安楽死させ処分した。

【0223】

以下のパラメーターおよびエンドポイントを、この研究において評価した：死亡率、臨床観察、体重、および飼料消費、検眼鏡試験、臨床病理学パラメーター（血液学および臨床化学）、抗カプシドおよび抗ペイロード抗薬物抗体解析、ＧＬＡ活性解析、生体内分布解析（組織および全血のｑＰＣＲおよびＲＴ－ｑＰＣＲ）、肉眼的剖検所見、臓器重量ならびに病理組織学的試験。

【0224】

４Ｄ－３１０関連の死亡率も、全身性のまたは直接的な局所的毒性の臨床的兆候も存在せず、体重、飼料消費、検眼鏡試験、臨床病理学パラメーター、臓器重量または肉眼的剖検所見に対するいずれの影響も存在しなかった。

【0225】

全ての４Ｄ－３１０（これは、配列番号４の４Ｄ－Ｃ１０２カプシドタンパク質を含む）処置した動物は、決定されたスクリーニングカットポイントを上回ることに基づいて、抗４Ｄ－Ｃ１０２カプシド抗体について陽性とスクリーニングされた。しかし、全ての４Ｄ－３１０処置した動物が陽性とスクリーニングされてはいるが、１６／３０個の試料のみが、確認カットポイントに対する評価後に陽性と確認された。これら１６個の確認された陽性試料は、以下の用量レベル内訳を有した：１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇにおいて７／１０、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇにおいて５／１０、および１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇにおいて４／１０。抗カプシド抗体応答に対する見かけの用量相関は存在しなかった。

【0226】

ある割合の動物は、４Ｄ－３１０による投与後に研究において抗カプシド抗体を発達させたが、明らかな用量相関は存在しなかった。全ての対照動物をスクリーニングしたところ、抗４Ｄ－Ｃ１０２カプシド抗体について陰性であることが確認された。全ての処置した動物が陰性であることが見出されたので、４Ｄ－３１０処置は、抗アルファガラクトシダーゼＡ抗体の形成を生じなかった。４Ｄ－３１０による処置は、対照群と比較した場合に、研究の持続時間を通じて存在した、血漿ＧＬＡ活性における用量依存的かつ統計的に有意な増加を生じた。ほとんどの処置群はまた、統計的に有意な様式で、前の用量群よりも高かった。

【0227】

用量および時点の両方について観察されたベクターゲノムのレベルが最も高いのは、心臓、肝臓、肺、腎臓および注射部位である。全ての群の脳および脊髄において検出された４Ｄ－３１０ベクターＤＮＡの濃度は、以前に言及された組織と比較して、全体的により低かった。最も高いレベルの４Ｄ－３１０ベクターＤＮＡが肝臓試料において検出された生体内分布解析と同様に、ベクター由来の遺伝子発現が、肝臓試料において最高濃度で観察され、次が心臓、肺および注射部位試料であった。

【0228】

肝臓試料内では、４Ｄ－３１０発現は、１μｇの総ＲＮＡ当たり４４，６６２，８８１コピーを有する心臓試料と比較して、１μｇの総ＲＮＡ当たり６４５，２９３，６２０コピーで、およそ１４倍高かった。精巣試料は、同じ時点および用量レベルにおける生体内分布解析において検出されたわずか１，８８４コピーの４Ｄ－３１０ベクターＤＮＡと比較して、１μｇの総ＲＮＡ当たり平均２，８８８，００１コピーで、異常に増加したレベルの遺伝子発現を示した。これは、４Ｄ－３１０発現が、他の５匹の動物間でのわずか４４６，５４１コピーの平均に対して１５，０９５，２９９コピーであった、動物４０４３に直接帰せられ得る。さらに、動物４０４３は、生体内分布解析の間に検出された１，４４３コピーの４Ｄ－３１０ベクターＤＮＡの個々の計数のみを有し、研究の持続時間を通じて臨床的／獣医学的所見を有さなかった。したがって、動物の全体的健康への影響は存在しなかったので、異常に高いレベルの遺伝子発現は、非有害とみなした。

【0229】

全体的なベクター由来の４Ｄ－３１０遺伝子発現は、全ての組織において記録され、最高濃度は、肝臓、心臓、肺および注射部位試料において記録された。４Ｄ－３１０の肉眼での所見は存在しなかった。≧５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇにおける最小限から軽度の注射部位血管周囲／血管炎症を除き、４Ｄ－３１０関連の顕微鏡所見は存在しなかった。この所見は、９２±１日目の動物では存在せず、可逆的とみなされた。

【0230】

１μｇの組織ベクターＤＮＡ当たりの平均コピーの概要は、以下の表１１にまとめられる。
表11:

【表11】

【0231】

最も高いレベルの４Ｄ－３１０ベクターＤＮＡが肝臓試料において検出された生体内分布解析と同様に、ベクター由来の遺伝子発現が、肝臓試料において最高濃度で観察され、次が心臓、肺および注射部位試料であった。肝臓試料内では、４Ｄ－３１０発現は、１μｇの総ＲＮＡ当たり４４，６６２，８８１コピーを有する心臓試料と比較して、１μｇの総ＲＮＡ当たり６４５，２９３，６２０コピーで、およそ１４倍高かった。

【0232】

全体的なベクター由来の４Ｄ－３１０遺伝子発現は、全ての組織において記録され、最高濃度は、肝臓、心臓、肺および注射部位試料において記録された。１μｇの組織ベクターＲＮＡ当たりの平均コピーの概要は、以下の表１２にまとめられる。
表12:

【表12】

【0233】

結論として、４Ｄ－３１０の単回静脈内投与の後、評価したいずれのパラメーターでも、有害効果は記録されなかった。結果として、局所的および全身性の毒性についての無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）は、検査した最高用量レベルである１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇであった。

【0234】

（実施例７）
非ヒト霊長類への４Ｄ－３１０のＩＶ投与についての研究

【0235】

４Ｄ－３１０および４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ（４Ｄ－３１０と同じカプシドおよびＣＡＧプロモーターに作動可能に連結したＥＧＦＰをコードする異種核酸を有するｒＡＡＶ）の毒性、薬力学および生体内分布を、ヒト臨床試験の前に、単回静脈内（注入）投与後にカニクイザルにおいて評価した。研究設計は、以下の表１３に示される：
表13:

【表13】

【0236】

カニクイザルに、配列番号４のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド内に各々含まれる２つの異なる導入遺伝子：ＧＬＡ（配列番号１のもの）（群２～４）もしくはＥＧＦＰ（群５）のいずれか、または単回のビヒクル対照（群１）を投与した。顕著に明瞭な安全性プロファイルが、４Ｄ－３１０（配列番号１のコドン最適化されたＧＬＡおよび配列番号４のカプシドを含む）処置した動物で観察された。高トランスアミナーゼ血症が、ＥＧＦＰ投与した動物のみにおいて観察された。

【0237】

全ての動物に、試験物品投与の２週間前に開始して研究終結まで、免疫抑制薬を投与した。この抑制レジメンは、臨床診療と合わせることを意図したものであった。簡潔に述べると、－１５日目から２８日目まで、酢酸メチルプレドニゾロン（４０ｍｇ／ｋｇ）を、群２、３および４の全ての動物に、筋肉内注射を介して毎週１回投与した。用量を、２９日目から４２日目にかけて２０ｍｇ／ｋｇに半減させ、４３日目から５６日目にかけて再度１０ｍｇ／ｋｇに半減させた。免疫抑制投与は、予定された最終的な剖検の週には要求しなかった。－１４日目から２９日目まで、酢酸メチルプレドニゾロン（４０ｍｇ／ｋｇ）を、群１および５の全ての動物に、ＩＭ注射を介して毎週１回投与した。免疫抑制を、研究獣医の裁量で、（最大８０ｍｇ／ｋｇ／週まで）増加させ、または減少させた。１６日目に、群５の１匹の雄は、さらなる用量（４０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。

【0238】

ビヒクルおよび試験物品を、４Ｄ－３１０については０（ビヒクル）、３．０×１０^１２、１．０×１０^１３、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの、および４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ．ＥＧＦＰについては５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量レベルでのＩＶ注入を介して、研究の間に１回投与し、３ｍＬ／分の速度で投与した。投与の最初の日を、各個々の動物について１日目と指定した。

【0239】

ＩＶ経路は、ヒト対象における４Ｄ－３１０の意図した投与経路である。用量レベルを、マウスにおける別々の用量設定安全性／有効性研究に基づいて選択し、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量は、全て安全であることが示された。

【0240】

ＧＬＡ血漿試料収集のために、血液試料（およそ３ｍＬ）を、以下の表１４のスケジュールに従って、ＧＬＡ解析のために大腿静脈を介して全ての動物から収集した：
表14:

【表14】

X =試料が収集された

【0241】

抗ＡＡＶ評価のために、血液試料（およそ５ｍＬ）を、以下の表１５のスケジュールに従って、大腿静脈を介して全ての動物から収集した：
表15:

【表15】

X =試料が収集された

【0242】

ｑＰＣＲ解析のための組織試料（脾臓（５０～８０ｍｇ／試料）以外の各組織試料について、１００～１８０ｍｇ）を収集し、２つの試料に分割し、液体窒素で瞬間凍結させ、分析するまで凍結貯蔵した。ＤＮＡ組織の収集および評価は、以下の表１６に従った：
表16:

【表16-1】

【表16-2】

^a 全ての収集を完了するのに不十分な臓器/組織の場合、DNA解析のための一次試料を優先した
^b 両方の半球について、標準的なBolon etal., 2013のブロッキングスキームに従った(2セットの標準的なブロック)。右半球のみを、顕微鏡評価のためのスライドへと処理した。
(p) =近位; (d) =遠位; (L) =左側; (R) =右側。

【0243】

群１～４由来のＤＮＡ１組織を、ｑＰＣＲによってベクター生体内分布について解析した。群５由来のＤＮＡ２組織を、ｑＰＣＲによってベクター生体内分布について解析した。

【0244】

以下の表１７に従って、種々のカニクイザル組織における４Ｄ－３１０の遺伝子発現を決定するためのＲＴ－ｑＰＣＲ解析のための組織試料（利用可能な場合、各組織試料について１００～１８０ｍｇ）を収集し、２つの試料に分割した：
表17:

【表17-1】

【表17-2】

^a 全ての収集を完了するのに不十分な臓器/組織の場合、IHC、タンパク質、DNAおよびRNA解析のための一次試料が優先される
^b 両方の半球について、標準的なBolon etal., 2013のブロッキングスキームに従う(2セットの標準的なブロック)。右半球のみを、顕微鏡評価のためのスライドへと処理する。
(p) =近位; (d) =遠位; (L) =左側; (R) =右側。

【0245】

ＲＮＡを、４Ｄ－３１０に特異的なＲＮＡ配列の検出および定量のために、組織試料から抽出し、定量し、次いで、ＲＴ－ｑＰＣＲによって解析した。簡潔に述べると、ＲＴ－ｑＰＣＲ解析のために収集した試料を、１．５ｍＬのＲＮＡＬａｔｅｒを事前に充填したラベル付きの２ｍＬ微量遠心低温管中に完全に浸した。試料を、湿った氷上に置き、ＲＮＡＬａｔｅｒ中で少なくとも２４時間にわたって最大で１週間まで冷蔵貯蔵し（２℃～８℃）、次いで、遺伝子発現解析（ＲＴ ｑＰＣＲ）まで、ＲＮＡＬａｔｅｒを除去して凍結貯蔵した（－６０℃～－９０℃）。群１～４の動物由来の全てのＤＮＡ１試料を、ドライアイス上で、解析のためにＣｏｖａｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、Ｉｎｄｉａｎａに発送した。群５由来の全てのＤＮＡ２試料を、解析のために試験施設の生物分析実験室に移した。

【0246】

群１～４由来のＲＮＡ１組織を、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＧＬＡ遺伝子発現について解析した。群５由来のＲＮＡ２組織を、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＧＦＰ遺伝子発現について解析した。

【0247】

タンパク質組織収集 － 試料（利用可能な場合、各組織試料について１００～１８０ｍｇ）を、液体窒素（ＬＮ２）中で急速凍結させ、凍結貯蔵した（－６０℃～－９０℃）。タンパク質１組織を、以下の表１８に従って、ＧＬＡ活性について解析した：
表18:

【表18-1】

【表18-2】

^a 全ての収集を完了するのに不十分な臓器/組織の場合、IHC、タンパク質、DNAおよびRNA解析のための一次試料を優先した。
^b 両方の半球について、標準的なBolon et al., 2013のブロッキングスキームに従った (2セットの標準的なブロック)。右半球のみを、顕微鏡評価のためのスライドへと処理した。(p) =近位; (d) =遠位; (L) =左側; (R) =右側

【0248】

タンパク質２組織を、ＥＬＩＳＡによってＧＦＰについて解析した。

【0249】

組織学および免疫組織化学（ＩＨＣ）のために、各指定された組織の試料を収集および処理した。試料を、中性緩衝ホルマリン中で２４～４８時間固定し、必要に応じて最大で７２時間にわたって７０％ＥｔＯＨに移し、組織学およびＩＨＣのためのブロックステージへと処理した。組織の形態学／解剖学的完全性を保存するための試みを行った。各指定された組織からのホルマリン固定パラフィン包埋ブロックのサブセットを、スポンサーに発送した。スライドを、ＩＨＣ評価のために調製および染色した。

【0250】

抗ガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ抗体ＲＵＯ（カタログ番号０５２６６３１９００１）中に希釈した１０ｕｇ／ｍＬの最終濃度で、組換えウサギ抗ヒトモノクローナル抗ガラクトシダーゼアルファ抗体（ＡｂｃａｍクローンＥＰ５８５８、カタログ番号ａｂ１６８３４１）を使用して実施した。ＧＬＡ ＩＨＣを、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣｈｒｏｍｏＭａｐ ＤＡＢ ＲＵＯ（カタログ番号０５２６６６４５００１）、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＨＱ ＲＵＯ（カタログ番号０７０１７８１２００１）およびＲｏｃｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｎｔｉ－ＨＱ ＨＲＰ ＲＵＯ（カタログ番号０７０１７９３６００１）検出試薬を使用して、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＵＬＴＲＡ自動染色機プラットフォーム上で実施した。

【0251】

ＧＬＡ ＩＨＣアッセイ抗原回復を、Ｒｏｃｈｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＣＣ１）抗原回復溶液（カタログ番号９５０－１２４）を使用して１００℃で３２分間実施した。ＧＬＡ ＩＨＣ一次抗体およびウサギＩｇＧアイソタイプ対照抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒａｂｂｉｔ（ＤＡ１Ｅ）ｍＡｂ ＩｇＧ ＸＰアイソタイプ対照カタログ番号３９００）を、室温で３２分間インキュベートした。ＧＬＡ ＩＨＣアッセイ二次抗体およびＨＲＰポリマー検出試薬を各々、室温で１６分間インキュベートした。スライドを、Ｒｏｃｈｅ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（カタログ番号０５２６６７２６００１）を使用して８分間、およびＲｏｃｈｅ Ｂｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号０５２６６７６９００１）を使用して８分間、室温で対比染色した。Ｒｏｃｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＵＬＴＲＡ機器から取り出した後、スライドを、Ｄａｗｎ液体石鹸を含むＤＩ水中でリンスして、残留油を除去する。次いで、ＧＬＡ ＩＨＣスライドを、段階的エタノール／キシレンを介して脱水し、Ｌｅｉｃａ ＸＬおよびＣＶ５０３０染色機／カバースリッパー機器を使用してカバースリップする。次いで、ＧＬＡ ＩＨＣスライドを、Ｍｉｋｒｏｓｃａｎ ＳＬ２機器および関連するＱ２イメージングソフトウェアを使用して、高解像度全スライド画像に変換した。ＧＬＡ ＩＨＣスライドは、有資格の病理学者が評価した。代表的な画像を、ＱｕＰａｔｈおよびＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアを使用して捕捉した。

【0252】

以下のパラメーターおよびエンドポイントを、この研究において評価した：死亡率、臨床的兆候、体重、体重変化、眼科学試験、臨床病理学パラメーター（血液学、凝固および臨床化学）、肉眼的剖検所見、臓器重量および病理組織学的試験。さらに、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）およびアルファ－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）についてのＤＮＡ（ｑＰＣＲ）、ＲＮＡ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）およびタンパク質（血漿および／または組織）分布を実施して、試験物品の生体内分布および相対的遺伝子発現効率を評価した。予備的免疫組織化学（ＩＨＣ）評価もまた実施した。

【0253】

結果

【0254】

死亡率 － 全ての動物が予定された剖検まで生存した。

【0255】

詳細な臨床／獣医学的観察 － 明らかな４Ｄ－３１０関連の臨床的兆候も４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ関連の臨床的兆候も存在しなかった。

【0256】

体重および体重増加 － 体重においても体重増加においても、４Ｄ－３１０関連の変化も４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ関連の変化も存在しなかった。わずかな増加および／または減少が、処置期間の間に全ての群の動物において観察され、この種についての正常変動内とみなされた。

【0257】

眼科学試験 － ４Ｄ－３１０関連の影響も４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ関連の影響も、検眼鏡試験において記録されなかった。記録された観察は、この齢および種の動物について予期された病理学を代表しており、試験物品関連とはみなされない。

【0258】

血液学 － いずれの用量レベルにおいても、血液学エンドポイントに対する４Ｄ－３１０関連の影響も４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ関連の影響も存在しなかった。

【0259】

凝固 － 凝固エンドポイントに対する明らかな４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ関連の影響は存在しなかった。

【0260】

ｑＰＣＲ ＧＬＡ（ＤＮＡ）＿生体内分布解析

【0261】

各試料中に存在する４Ｄ－３１０ベクターＤＮＡの量を、ｑＰＣＲで解析した２つのスパイクしていない複製の平均から計算した。結果を、解析した１μｇＤＮＡ当たりに存在する４Ｄ－３１０のコピーとして報告する（任意の希釈倍率および０．２μｇ／μＬを下回る濃度で調整した）。群１は、ビヒクル／対照群である。ビヒクル処置した動物（動物ＩＤ１００１）由来の全ての検査した試料は、ＧＬＡ ＤＮＡについて＜ＬＯＤ（検出限界）であることが見出された。３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０を投与した動物では、ＧＬＡ ＤＮＡは、以下で言及する試料を除く検査した全ての組織試料について、１μｇの総ＤＮＡ当たり５１．７２（動物２００３の空腸）コピーから６，３０９，０８８．７５（動物２００２の肝臓右葉）コピーまでの範囲で、陽性検出された。動物２００１および２００３の左精巣、ならびに動物２００２および２００３の腰髄は、＜ＬＯＱであることが見出された。残りの組織が利用可能でないことに起因して、動物２００２の心臓、左心房についての結果は報告されていない。動物２００２の頸動脈についての結果は、スポンサーの依頼により実行した失敗した抽出からのＤＮＡを解析することによって得た。１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０を投与した動物では、ＧＬＡ ＤＮＡは、検査した全ての組織試料において陽性として見出された。得られた検査結果は、１μｇの総ＤＮＡ当たり１７８．６５（動物３００２の空腸）コピーから３，３７９，１０９．３０（動物３００１の肝臓左葉）コピーまでの範囲である。動物３００２および３００３の肝臓右葉および肝臓左葉の元の検査結果は、＞ＵＬＯＱ（定量上限）であることが見出され、これらの組織試料から抽出したＤＮＡを、さらなる１：１０希釈を実施して再検査した。

【0262】

５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０を投与した動物では、ＧＬＡ ＤＮＡは、検査した全ての組織試料において陽性として見出された。得られた検査結果は、１μｇの総ＤＮＡ当たり１６８．８６（動物４００３の精巣）コピーから２１，１１６，３１１．４６（動物４００１の肝臓右葉）コピーまでの範囲である。動物４００１、４００２および４００３の肝臓右葉および肝臓左葉の元の検査結果は、全て＞ＵＬＯＱであることが見出された。これらの組織試料から抽出したＤＮＡを、さらなる１：５０（４００１について）、１：２０（４００２について）および１：２５（４００３について）希釈を実施して再検査した。

【0263】

非ヒト霊長類への３×１０^１２ｖｇ／ｋｇのＩＶ投与後の重要なファブリー組織への４Ｄ－３１０のｑＰＣＲ分布は、図１５に示され、肝臓への用量応答的な生体内分布が達成された。これらのデータは、ＩＶ送達された４Ｄ－３１０が、心臓および腎臓を含む、ファブリー病病理学の重要な組織に首尾よく局在化することを実証している。これらのデータはまた、可溶性治療タンパク質の全身性の発現のための標的としての肝臓における用量応答的な発現を支持している。

【0264】

ＧＬＡ血漿定量

【0265】

１日目（投与前）、１５日目、２９日目、４３日目および剖検の日に３．０×１０^１２～５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０を投与した動物由来の合計５０個の血漿試料を、適格な方法を使用してＧＬＡ活性について解析した。較正標準および品質管理試料からの結果は、報告された全ての濃度について、この方法の許容される性能を実証した。

【0266】

ＧＬＡレベルは、投与の前（１日目）には、全ての動物にわたって同等であった。１５日目までに、血漿ＧＬＡレベルは、３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０で３匹の動物中１匹において（最大で２３．６倍）、１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０で３匹の動物中３匹において（最大で８．１倍）および５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０で３匹の動物中３匹において（最大で１５２．２倍）増加した。血漿ＧＬＡレベルは、１５日目から剖検の日まで、概して類似（１５日目の値のおよそ２．５倍以内）であった。このデータは、以下にまとめられる：

【表20-1】

【表20-2】

【0267】

図１６は、用量によってグループ分けした、４Ｄ－３１０の単回静脈内投与後のＮＨＰの血漿中のＡＧＡを示す（ビヒクル処置した対照と比べて、血漿ＡＧＡレベルにおける５４．７倍の増加が、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量において観察された）。動物番号２００２における高いＡＧＡレベルは、低用量群平均を、中間用量群平均よりも高いものにした。他の点では、用量依存性が観察された。評価した全ての用量群における４Ｄ－３１０の送達は、内因性ＡＧＡレベル（ビヒクル）を上回る血漿ＡＧＡレベルを生じ、これは、首尾よい遺伝子送達および４Ｄ－３１０産物からの遺伝子発現を実証している。

【0268】

図１７は、４Ｄ－３１０の単回静脈内投与後の個々の動物における血漿ＡＧＡレベルを示す。動物２００２は、予想外に高い血漿ＡＧＡ活性を有する － この動物は、肝臓において高いＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を有する。４Ｄ－３１０の送達は、全ての個々の動物について、内因性ＡＧＡレベル（ビヒクル）を上回る血漿ＡＧＡレベルを生じ、これは、首尾よい遺伝子送達および４Ｄ－３１０産物からの遺伝子発現を実証している。

【0269】

ＧＬＡタンパク質組織生体内分布解析

【0270】

ホルマリン固定しパラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）細胞ペレットおよび組織における、抗原回復条件、一次抗体および検出条件を含むアッセイ条件のマトリクスを用いて複数の市販のＧＬＡ抗体をスクリーニングすることによって、抗ガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを開発した。ＧＬＡ ＩＨＣアッセイの特異度および感度を、野生型ＨＥＫ２９３Ｔおよび４Ｄ－３１０トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞および４Ｄ－３１０処置したファブリーマウス組織の評価によって決定した。

【0271】

４Ｄ－３１０処置したホルマリン固定しパラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）非ヒト霊長類（ＮＨＰ）組織試料を、ＧＬＡ ＩＨＣ発現について評価した。品質管理のため、および実行間での一貫した結果を確実にするために、対照細胞ペレットを、各実験実行に含めた。ウサギＩｇＧアイソタイプ抗体対照を、ＧＬＡ ＩＨＣアッセイの特異性を確実にするために、各組織試料について含めた。

【0272】

低レベルの内因性ＧＬＡ発現が、ビヒクル処置した組織において観察された。ＧＬＡ ＩＨＣ発現における増加が、全ての用量レベル（３×１０^１２、１×１０^１３および５×１０^１３）で、４Ｄ－３１０処置したＮＨＰの心臓組織において観察された。ＧＬＡ発現における増加は、５×１０^１３の用量レベルでは、４Ｄ－３１０処置したＮＨＰの肝臓組織のみにおいて観察された。ＩＨＣによる、より低い用量レベルでの検出は、ビヒクル処置した動物において見られた発現に基づくと、高い内因性肝臓発現によって混乱する可能性があった。ＮＨＰの骨格筋でも横隔膜でも腎臓でも大動脈でも頸動脈でも小腸でも、組織試料においてＧＬＡ ＩＨＣ染色における増加は観察されなかった。結果は、外部の有資格の病理学者が検証し、細胞型を同定した。

【0273】

４Ｄ－３１０を投与した動物での研究終結時に、ビヒクル対照に対する、ＧＬＡ発現における増加は、肝臓、頸動脈、心臓（左心室自由壁および左心房を含む）、肺、大動脈、骨格筋のサブセット（三角筋、大胸筋および横隔膜を含む）、腎臓および脳（左半球）に限定された。ＧＬＡの最も高い発現は、肝臓（最大で２１．１倍）、頸動脈（最大で１５．５倍）、左心室自由壁（最大で１２．２倍）および肺（最大で１０．１倍）において見られた。より低いレベルのＧＬＡ発現（＜１０倍）が、大動脈（最大で７．４倍）、三角筋（最大で４．３倍）、横隔膜（最大で３．７倍）、大胸筋（最大で３．４倍）、腎臓（２．５倍）、大腿二頭筋（２．５倍）、脳（最大で２．４倍）、左心房（２．２倍）において記録された。ＧＬＡにおける上昇は、時折用量応答的であったが、常にではなかった。これらの変化は、４Ｄ－３１０関連とみなされた。全ての他の組織は、対照の２倍未満であり、したがって、上昇したＧＬＡ発現を有するとはみなされなかった。４Ｄ－３１０を投与した動物からの相対的ＧＬＡ組織発現の概要は、以下の表１９で見出すことができる：
表19:

【表19】

【0274】

図１８～１９から理解できるように、ＮＨＰへの４Ｄ－３１０の静脈内送達は、ビヒクルのみで処置した対照ＮＨＰと比較して、ファブリー関連組織中のＡＧＡ発現における有意な増加を生じた。したがって、４Ｄ－３１０の送達は、治療的に適切な組織における首尾よい遺伝子送達および４Ｄ－３１０産物からの遺伝子発現を生じた。上昇したＡＧＡ発現が、高用量動物の心臓において示される（図１９）。

【0275】

ＲＴ－ｑＰＣＲ（ＲＮＡ）遺伝子発現解析

【0276】

群１（ビヒクル／対照）の動物由来の検査した全ての試料は、予期されたように、４Ｄ－３１０について＜ＬＯＤであることが見出された。

【0277】

群２の動物（それらは、３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０を受けた）では、４Ｄ－３１０ ＲＮＡは、以下の試料を除く検査した全ての組織試料について、 μｇの総ＲＮＡ当たり６３０．６８（動物２００１の精巣左）コピーから１９，７４４，４５２．２３（動物２００２の肝臓左葉）コピーまでの範囲で陽性検出された：（１）動物２００１の三角筋遠位、横隔膜左、横隔膜右、大胸筋および大腿二頭筋遠位ならびに脳小脳、空腸、頸動脈、胸髄、腰髄および肺は、＜ＬＯＤであることが見出された、（２）動物２００１の脳、脳幹は、＜ＬＯＱであることが見出された、（３）動物２００２の三角筋遠位および大腿二頭筋遠位は、＜ＬＯＤであることが見出された、（４）動物２００２の三角筋近位、大胸筋近位、大腿二頭筋近位、空腸、ＤＲＧの残り全て右および胸髄は、＜ＬＯＱであることが見出された、（５）動物２００３の横隔膜左、横隔膜右、大胸筋近位、大胸筋遠位、大腿二頭筋遠位、坐骨神経および腰髄は、＜ＬＯＤであることが見出された、（６）動物２００３の三角筋近位、大腿二頭筋近位、脳右半球、脳小脳、ＤＲＧの残り全て右および精巣左は、＜ＬＯＱであることが見出された。これらの試料について測定された陰性の総ＲＮＡ濃度に起因して、動物２００２の坐骨神経および腰髄について、１μｇの総ＲＮＡ当たりのコピーの結果は報告されていない。

【0278】

群３の動物（それらは、１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０を受けた）では、４Ｄ－３１０ ＲＮＡは、検査した全ての組織試料において陽性として見出された。得られた検査結果は、以下を除く検査した全ての組織試料の、 ｇの総ＲＮＡ当たり７６５．２７（動物３００３の空腸）コピーから１０，３８７，８８６．０８（動物３００２の大動脈）コピーまでの範囲である：（１）動物３００１の三角筋近位、三角筋遠位、横隔膜左、大胸筋近位、大胸筋遠位、上腕三頭筋（Triceps Branchii）近位、上腕三頭筋遠位、大腿二頭筋近位、大腿二頭筋遠位、坐骨神経および腰髄は、＜ＬＯＤであることが見出された、（２）動物３００１の横隔膜右は、１μｇのＲＮＡ当たりの利用可能なコピーの結果を有さなかった、（３）動物３００１の脳、脳幹および肺は、＜ＬＯＱであることが見出された、（４）動物３００２の横隔膜右、大胸筋近位、空腸、坐骨神経、肺および腰髄は、＜ＬＯＤであることが見出された、（５）動物３００２の大腿二頭筋遠位および脳脳幹は、＜ＬＯＱであることが見出された、（６）動物３００３のＤＲＧの残り全て右は、＜ＬＯＱであることが見出された。

【0279】

群４の動物（それらは、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０を受けた）では、４Ｄ－３１０ ＲＮＡは、検査した全ての組織試料において陽性として見出された。得られた検査結果は、以下を除き、１μｇの総ＲＮＡ当たり９３０．５１（動物４００１の上腕三頭筋近位）コピーから１２７，６０２，８３８．２２（動物４００２の心臓、心室中隔）コピーまでの範囲である：（１）動物４００１の脳小脳、空腸および坐骨神経は、＜ＬＯＤであることが見出された、（２）動物４００１についての頸動脈は、＜ＬＯＱであることが見出された、（３）動物４００１の脳左半球、脳右半球、脳脳幹、ＤＲＧの残り全て右および肺は、陰性の総ＲＮＡ濃度を有し、したがって、これらの試料について、１μｇのＲＮＡ当たりのコピーの結果は利用可能でない、（４）動物４００２の横隔膜左および大腿二頭筋近位は、＜ＬＯＤであることが見出された、（５）動物４００２の空腸および坐骨神経は、＜ＬＯＱであることが見出された、（６）動物４００３の大腿二頭筋遠位および坐骨神経は、＜ＬＯＤであることが見出された、（７）動物４００３の三角筋近位、大胸筋近位および空腸は、＜ＬＯＱであることが見出された。

【0280】

存在する場合、手動で精製されたＲＮＡ試料の使用とＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴシステムを使用して精製されたＲＮＡ試料の使用との間の差異を同定するための橋渡し評価は、両方の方法が、その方法の正確さに対しても精度に対しても影響を有さず、類似の結果を生じたことを実証した。異なるＱＣ型間でのアッセイ間の正確さは、全てのＱＣレベルについて、２％と２０％との間のＱｔｙ％ＣＶ値を生じたが、アッセイ間の精度Ｑｔｙ％ＲＥ結果は、全てのＱＣ濃度にわたって、－６％から－２％までの範囲であった。

【0281】

静脈内注入のおよそ５２日後、最も高いレベルのベクター由来の遺伝子発現を示す組織は、左心室自由壁および心室中隔心臓試料、肝臓左葉および肝臓右葉、頸動脈血管ならびに右心室心臓試料であった。左心室自由壁および心室中隔心臓試料は、分析した１０ｎｇの総ＲＮＡ当たり５．４８×１０^３コピーおよび５．４６×１０^３コピーの平均を生じたが、６つ全ての肝臓試料にわたる平均濃度は、３．５９×１０^３コピーであった。頸動脈血管および右心室心臓試料は、それぞれ、３．３３×１０^３コピーおよび１．７８×１０^３コピーを生じた。残りの組織試料の大部分は、最小限のベクター由来の遺伝子発現からベクター由来の遺伝子発現なしまでを生じ、検査した試料の３／４よりも多くが、定量限界（the limit or quantitation）であったまたはそれを下回った。ウイルスベクターの存在についてのみ検査する生体内分布結果を遺伝子発現結果と比較した場合、著しい対照が明らかである。生体内分布データからは、肝臓試料中の検出されたベクターのレベルは、左心室自由壁試料についての８．６９×１０^４コピーおよび心室中隔試料からの９．１２×１０^４コピーと比較して、１μｇの試料ＤＮＡ当たり５．７５×１０^６コピーで、６０倍よりも大きく高かった。逆に、観察された遺伝子発現のレベルは、肝臓試料と比較して、２つの心臓試料においておよそ１．５倍高かった。頸動脈血管および右心室心臓試料は、肝臓試料中の約１２８倍および約６９倍高いベクターレベルで、類似の結果を示したが、遺伝子発現レベルは、血管試料と肝臓試料との間ではおよそ等しく、右心室心臓試料と比較して肝臓試料において、２倍高いだけであった。ベクターＤＮＡは、全ての動物の非転写肝臓試料中で検出された。ベクターＤＮＡのこの混入は、標的配列遺伝子発現のおよそ１％～１２％を占める。ベクター混入は、解析した残りの試料のいずれにおいても検出されなかった。ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１の発現レベルは、各動物の個々の組織にわたって一貫しており、ＲＮＡ試料の全体的完全性が確認された。

【0282】

図２０から理解できるように、ＮＨＰへの４Ｄ－３１０の指定された用量の各々の単回静脈内投与は、共にファブリー病を処置するための重要な臓器である心臓および肝臓において観察された一貫した発現で、ＧＬＡ ＲＮＡ発現をもたらす。

【0283】

肉眼的病理学

【0284】

４Ｄ－３１０関連の肉眼での所見も４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ関連の肉眼での所見も存在しなかった。５．０×１０^１３で４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰを与えた全ての試験物品動物（test article animals）および単回のビヒクル対照動物における肉眼での所見は、四頭筋（両側または片側）中の白色の異物からなった。４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰを与えた動物のうち１匹（動物番号５００３）は、四頭筋中に片側膿瘍もまた有した。これらは、対照および４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ処置した動物において起こったので、おそらくは手順関連であった。３．０×１０^１２の低用量の４Ｄ－３１０を与えた１匹の動物（動物番号２００２）は、右後脚／肢中に、皮下組織の浮腫を有した。後者の変化は、片側の局在化した変化であったので、直接的には試験物品関連でない可能性があった。肉眼的変化は、プロトコールに従い、顕微鏡的には評価しなかった。

【0285】

病理組織学

【0286】

明らかな４Ｄ－３１０関連の顕微鏡所見も４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ関連の顕微鏡所見も存在しなかった。いくつかの所見が、動物の組織において見出されたが、明らかな試験物品相関は存在しなかった。４Ｄ－３１０および４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ処置した動物ならびにビヒクル対照において記録された所見は、心臓、種々の骨格筋、および坐骨神経を含む種々の組織の外膜における単核細胞の最小限の浸潤物からなった。さらに、最小限の単核浸潤物は、４Ｄ－３１０処置した動物の脳の髄膜において存在したが、４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ処置動物においてもビヒクル対照動物においても存在しなかった。４Ｄ－３１０処置したサルにおいて記録された他の所見には、種々の骨格筋における最小限の筋線維変性または再生（典型的には限局性）、肺における最小限の肺胞マクロファージ凝集、および肝細胞の最小限の（多巣性）空胞形成が含まれた。これらは、典型的には、低い発生率のものであり、発生率においても分布においても重症度においても、用量関連の傾向は存在しなかった。さらに、これらの最小限の変化は、種についての背景所見として存在し得、したがって、試験物品関連とはみなされなかった。これらの所見のいずれも、有害とはみなされない。心臓冠状溝、大動脈外膜および骨格筋外膜を含む、４Ｄ－３１０処置した動物の種々の組織の脂肪組織において、脂肪壊死が起こり、発生率においても重症度においても、明らかな用量相関は存在しなかった。重症度は、最小限から中等度であり、用量関連ではなかった。脂肪壊死は、本発明者らの実験室において高用量メチルプレドニゾロン処置の結果として記録されてきた、または偶発的な背景変化として記録され得る。メチルプレドニゾロン処置は、試験物品の免疫原性応答を制御するために使用した。

【0287】

散在性ニューロンの神経細胞体のオートファジー（細胞質希薄化）が、４Ｄ－３１０の各用量において、１匹の動物の後根神経節において記録された。重症度は、最小限から軽度であったが、用量関連ではなかった。この変化は、カニクイザルにおける背景所見であり（Butt M. et al., 2019）（Pardo I. et al., 2019）、試験物品関連とはみなされない。全ての他の顕微鏡観察は、偶発的とみなされ、試験物品関連とはみなされなかった。これらの観察は、種についての公知の背景所見であり、低い発生率のものであり、対照および試験物品処置した動物について類似の発生率および重症度のものであり、ならびに／または用量応答相関を有さなかった。

【0288】

毒性学 － ４Ｄ－３１０または４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰのＩＶ投与に関連する変化は、臨床病理学に対する影響に限定された。５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０および４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰの単回ＩＶ投与の後、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性における、それぞれ最小限から際立った増加までが存在した。４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰを投与した動物では、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性および総ビリルビン濃度における、並行した最小限から中等度の増加が存在した。これらの変化は、１４日目に最も顕著であったが、後の区間では部分的から完全に解消した。これらの変化は、４Ｄ－３１０および４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ関連であるとみなされ、肝細胞効果および／または肝胆道効果を指し示した。顕微鏡相関物は、終結時には観察されなかった。

【0289】

また、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰでは、２１日目の平均尿素窒素濃度における一過性の最小限の減少、および３５日目に始まるアルブミン濃度における最小限から軽度の減少が存在し、これらは、４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰ関連とみなされた。上で考察した肝細胞効果は、これらの変化に寄与し得る。≧３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０では、７日目にクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性における一過性の最小限から軽度の増加が存在し、これは、４Ｄ－３１０関連とみなされ、軽微な筋肉効果を指し示した。顕微鏡相関物は、終結時には観察されなかった。

【0290】

ＧＬＡの薬力学および生体内分布 － 循環（血漿）ＧＬＡタンパク質は、１５日目（検査した最初の投与後時点）に始まって終結まで、いくらか用量応答的な様式で上昇した。１５日目までに、血漿ＧＬＡレベルは、３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０で３匹の動物中１匹において（最大で２３．６倍）、１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０で３匹の動物中３匹において（最大で８．１倍）および５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０で３匹の動物中３匹において（最大で１５２．２倍）増加した。血漿ＧＬＡレベルは、１５日目から剖検の日まで、概して類似（１５日目の値のおよそ２．５倍以内）であった。４Ｄ－３１０を投与した動物での研究終結時に、ＧＬＡ ＤＮＡは、検査したほとんどの組織において、いくらか用量応答的な様式で見出された。３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０を投与した動物では、１ｕｇのＤＮＡ当たりのベクターコピーは、５１．７２から６．３×１０^６までの範囲であり、組織の小さいサブセットが、検出不能なレベルのＧＬＡ ＤＮＡを有した。１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０では、ＧＬＡ ＤＮＡは、１７８から３．４×１０^６までの範囲の、１ｕｇのＤＮＡ当たりのコピーで、アッセイした全ての組織において見出された。同様に、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－３１０では、ＧＬＡ ＤＮＡは、１６８から２１．１×１０^６までの範囲の、１ｕｇのＤＮＡ当たりのコピーで、アッセイした全ての組織において検出可能であった。

【0291】

翻訳を、肝臓、頸動脈、心臓（左心室自由壁および左心房を含む）、肺、大動脈、骨格筋のサブセット（三角筋、大胸筋および横隔膜）、腎臓および脳（左半球）を含む組織のサブセットにおける検出可能なＧＬＡタンパク質によって確認した。図２１Ａ～Ｂおよび２２Ａ～Ｂを参照されたい。ＧＬＡの最も高い発現は、肝臓（最大で２１．１倍）、頸動脈（最大で１５．５倍）、左心室自由壁（最大で１２．２倍）および肺（最大で１０．１倍）において見られた。より低いレベルのＧＬＡ発現（＜１０倍）は、大動脈（最大で７．４倍）、三角筋（最大で４．３倍）、横隔膜（最大で３．７倍）、大胸筋（最大で３．４倍）、腎臓（２．５倍）、大腿二頭筋（２．５倍）、脳（最大で２．４倍）、左心房（２．２倍）において記録された。ＧＬＡにおける上昇は、時折用量応答的であったが、常にではなかった。

【0292】

ＥＧＦＰの薬力学および生体内分布 － ５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰを投与した動物での研究終結時に、ＥＧＦＰ ＤＮＡは、検査したほとんどの組織において見出され、最も高いレベルのベクター由来の遺伝子発現を示す組織は、左心室自由壁および心室中隔（心臓）、肝臓左葉および肝臓右葉、頸動脈血管、ならびに右心室（心臓）であった。観察された遺伝子発現（ＲＮＡ）のレベルは、肝臓試料と比較して、２つの心臓試料においておよそ１．５倍高かった。頸動脈血管および右心室心臓試料は、肝臓試料中の約１２８倍および約６９倍高いＤＮＡベクターレベルで、類似の結果を示したが、遺伝子発現レベルは、血管試料と肝臓試料との間ではおよそ等しく、右心室心臓試料と比較して肝臓試料において、２倍高いだけであった。ＧＦＰタンパク質の翻訳は、アッセイしたほとんどの組織において観察され、一般に、生体内分布および遺伝子発現データと一致した。ＧＦＰの最も高い発現（際立った増加）は、心臓（最大で８，９５６，５０３倍）、血管（最大で２２，９９１倍）および肝臓（最大で５，１９４倍）において見られた。それぞれ、上に２４７倍、９８９倍および３４７倍の、中等度のＧＦＰ発現が、腎臓、三角筋および横隔膜筋肉において記録された。脳、神経、舌、脊髄、二頭筋および三頭筋（bicep and tricep muscles）において、最小限の発現が観察された。併せて考えると、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ（４Ｄ－３１０について検査した最高用量、および４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰについて検査した唯一の用量）までの、４Ｄ－３１０または４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰの単回のＩＶ注入は、種々の組織、最も顕著には、肝臓、心臓および血管において、測定可能なベクターＤＮＡ、遺伝子発現（ＲＮＡおよびタンパク質）を伴って、雄性カニクイザルにおいて、十分に耐容性が示された。いずれの有害な変化も欠如していることに起因して、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量レベルは、この研究の条件下で、４Ｄ－３１０または４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰの両方について無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）であると決定された。

【0293】

結論

【0294】

５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ（４Ｄ－３１０について検査した最高用量、および４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰについて検査した唯一の用量）までの、４Ｄ－３１０または４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧＥＧＦＰの単回静脈内注入は、種々の組織、最も顕著には、肝臓、心臓および血管において、測定可能なベクターＤＮＡ、遺伝子発現（ＲＮＡおよびタンパク質）を伴って、雄性カニクイザルにおいて、十分に耐容性が示された。いずれの有害な変化も欠如していることに起因して、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量レベルは、この研究の条件下で、４Ｄ－３１０および４Ｄ－Ｃ１０２．ＣＡＧ－ＥＧＦＰの両方について無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）であると決定された。

【0295】

ベクターゲノム、ＲＮＡメッセージおよび機能的タンパク質は、特に、高い（５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）用量で、心臓において観察された。ベクターゲノムおよびＲＮＡメッセージは、相関するようであった。ＲＮＡメッセージおよびＡＧＡ活性もまた相関するようであった。ファブリー関連組織におけるＡＧＡ活性データを、ＩＨＣによって確認した。ＥＧＦＰを用いて測定したＲＮＡメッセージおよびタンパク質のレベルは、ＧＬＡを用いて測定したレベルよりも低かった。

【0296】

本発明の材料および方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなしに、本明細書に記載される方法にバリエーションが適用され得ることが、当業者に明らかである。当業者に明らかな全てのかかる同様の代替物および改変は、本発明の精神、範囲および概念の内であるとみなされる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ヒトにおける発現のためにコドン最適化されたヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡ）タンパク質をコードする核酸であって、配列番号１として記載されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれと少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含み、別段同一な細胞における、配列番号３の野生型ＧＬＡヌクレオチド配列の発現のレベルと比較してより高いレベルで発現される、核酸。
(項目２)
前記ヌクレオチド配列が、少なくとも約０．８０、少なくとも約０．８３、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．８８、少なくとも約０．９０、少なくとも約０．９２、少なくとも約０．９３、または約０．８０～約０．９９、もしくは約０．８５～約０．９９、もしくは約０．８８～約０．９９、もしくは約０．９０～約０．９９、もしくは約０．９３～約０．９９のコドン適応指数を有する、項目１に記載の核酸。
(項目３)
配列番号１として記載されるヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の核酸。
(項目４)
項目１から３のいずれか一項に記載の核酸と、前記核酸配列に作動可能に連結した、前記核酸配列にとって異種である発現制御配列とを含む、発現カセット。
(項目５)
前記発現制御配列が構成的プロモーターである、項目４に記載の発現カセット。
(項目６)
前記発現制御配列が、筋肉細胞における前記核酸の優先的な発現を指示するプロモーターである、項目４に記載の発現カセット。
(項目７)
項目１から３のいずれか一項に記載の核酸または項目４から６のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。
(項目８)
組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）ベクターである、項目７に記載のベクター。
(項目９)
前記ｒＡＡＶベクターが、血清型１、２、６もしくは８のＡＡＶカプシド、またはそれらのバリアントを含む、項目８に記載のベクター。
(項目１０)
前記ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２カプシドまたはそのバリアントを含む、項目９に記載のベクター。
(項目１１)
前記ＡＡＶ２カプシドバリアントが、配列番号４の配列を含む、項目１０に記載のベクター。
(項目１２)
前記ｒＡＡＶベクターが、５’から３’に、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）項目３に記載の核酸、（ｄ）ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む、項目１１に記載のベクター。
(項目１３)
前記ｒＡＡＶが、配列番号６として記載される配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列を含む、項目１２に記載のベクター。
(項目１４)
項目１から３のいずれか一項に記載の核酸または項目４から６のいずれか一項に記載の発現カセットまたは項目７から１３のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
(項目１５)
哺乳動物細胞である、項目１４に記載の宿主細胞。
(項目１６)
ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ２１細胞もしくはＶｅｒｏ細胞であり、および／または懸濁培養もしくは接着培養で成長され、および／または心筋細胞もしくは骨格筋細胞である、項目１４または１５に記載の宿主細胞。
(項目１７)
ファブリー病を処置するための医薬の製造における、項目１から３のいずれか一項に記載の核酸または項目７から１３のいずれか一項に記載のベクターの使用であって、好ましくは、前記核酸またはベクターが、対象におけるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）のレベルを低減させるのに有効な量での投与のためである、使用。
(項目１８)
ファブリー病を処置するための医薬の製造における、（ｉ）配列番号４の配列を有するカプシドタンパク質を含むカプシドおよび（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む感染性ｒＡＡＶの使用であって、好ましくは、前記核酸が、配列番号６と記載されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも８０％同一な配列を含むかまたはそれからなり、必要に応じて、前記ｒＡＡＶが、約１０ ^１２ ～約１０ ^１４ ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ、または約１×１０ ^１３ 、３×１０ ^１３ もしくは５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇの、１つまたはそれより多くの用量で投与され、好ましくは、前記ｒＡＡＶが、単回静脈内注射による投与のためである、使用。
(項目１９)
前記核酸またはベクターが、静脈内および／または筋肉内注射による投与のために製剤化されている、項目１７または１８に記載の使用。
(項目２０)
哺乳動物におけるＡＧＡの減少したレベルによって媒介される疾患または状態を処置するための医薬の製造における、項目１から３のいずれか一項に記載の核酸または項目７から１３のいずれか一項に記載のベクターの使用。
(項目２１)
哺乳動物においてＡＧＡのレベルを増加させるための医薬の製造における、項目１から３のいずれか一項に記載の核酸または項目７から１３のいずれか一項に記載のベクターの使用。
(項目２２)
発現制御配列に必要に応じて作動可能に連結した、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一なヌクレオチド配列を有する核酸と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
(項目２３)
ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、項目２２に記載の医薬組成物。
(項目２４)
少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と、（ｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結した配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸および（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むカプシドを含む感染性ｒＡＡＶとを含む、医薬組成物。
(項目２５)
前記核酸が、配列番号６として記載されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含むかまたはそれからなる、項目２４に記載の医薬組成物。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

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