特許 7409659 新規サイトカイン、発現キット、およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-25

(45)【発行日】2024-01-09

(54)【発明の名称】新規サイトカイン、発現キット、およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20231226BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231226BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231226BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20231226BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20231226BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231226BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20231226BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20231226BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231226BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20231226BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20231226BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20231226BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20231226BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20231226BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C07K19/00

C12Q1/06

C12N15/24

A61P35/00

A61P43/00 105

A61K38/20

A61K38/17

A61K47/64

A61K47/55

A61K48/00

G01N33/68

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

C07K14/54

C07K14/705

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020102867

(22)【出願日】2020-06-15

(65)【公開番号】P2021023280

(43)【公開日】2021-02-22

【審査請求日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】P 2019140552

(32)【優先日】2019-07-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】505457994

【氏名又は名称】学校法人東京医科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100129137

【弁理士】

【氏名又は名称】中山 ゆみ

(72)【発明者】

【氏名】善本 隆之

(72)【発明者】

【氏名】溝口 出

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 英哲

【審査官】太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】The Journal of Immunology，2014年06月15日，Vol. 192, No. 12，p. 6028-6036，doi:10.4049/jimmunol.1400159

【文献】scientific reports，2021年03月04日，11, 5266，doi:10.1038/s41598-021-84624-9

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子であることを特徴とする新規サイトカイン。

【請求項2】

ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子として、ｐ１９を発現する発現ベクターと、ＣＤ５Ｌを発現する発現ベクターとを含むことを特徴とする新規サイトカインの発現キット。

【請求項3】

ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子として、ｐ１９遺伝子とＣＤ５Ｌ遺伝子とのキメラ遺伝子を発現する発現ベクターを含むことを特徴とする新規サイトカインの発現キット。

【請求項4】

生体サンプルについて、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子の発現量を検出する工程を含み、
前記発現量と評価基準との比較によって、前記生体サンプルが多発性硬化症に罹患している可能性を試験する試験方法。

【請求項5】

候補物質と請求項１記載の新規サイトカインとを共存させ、前記候補物質と前記新規サイトカインとの結合を検出し、前記新規サイトカインと結合する候補物質を、多発性硬化症に対する治療薬候補として選択することを特徴とする、多発性硬化症に対する治療薬候補のスクリーニング方法。

【請求項6】

請求項２または３に記載の新規サイトカインの発現キットを宿主に導入し、候補物質存在下における前記発現キットの発現を検出し、前記候補物質非存在下における前記発現キットの発現と比較して、前記発現キットの発現を有意に抑制する候補物質を、多発性硬化症に対する治療薬候補として選択することを特徴とする、多発性硬化症に対する治療薬候補のスクリーニング方法。

【請求項7】

ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子である請求項１に記載の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む請求項２または３に記載の新規サイトカインの発現キットを含むことを特徴とする抗がん剤。

【請求項8】

ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子である請求項１に記載の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む請求項２または３に記載の新規サイトカインの発現キットを含むことを特徴とするＧＭ－ＣＦＳ産生促進剤。

【請求項9】

ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子である請求項１に記載の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む請求項２または３に記載の新規サイトカインの発現キットを投与し、投与対象が非ヒト動物であることを特徴とするＧＭ－ＣＦＳの産生促進方法。

【請求項10】

ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子である請求項１に記載の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む請求項２または３に記載の新規サイトカインの発現キットを投与し、投与形態が、in vitroであることを特徴とするＧＭ－ＣＦＳの産生促進方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規サイトカイン、発現キット、多発性硬化症の罹患可能性を試験する試験方法、抗がん剤、ＧＭ-ＣＦＳの産生促進方法に関する。

【背景技術】

【0002】

自己免疫性疾患、炎症性疾患等の様々な疾患において、サイトカインが関与することが知られている。しかしながら、特定の疾患に対して、どのようなサイトカインが、どのように関与しているかについては、いまだ未知の点があり、活発な研究が行われている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

そこで、本発明は、新たなサイトカインの提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0004】

前記目的を達成するために、本発明の新規サイトカインは、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子であることを特徴とする。

【0005】

本発明の新規サイトカインの発現キットは、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含むことを特徴とする。

【0006】

本発明の多発性硬化症の罹患可能性を試験する試験方法は、生体サンプルについて、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子の発現量を検出する工程を含み、前記発現量と評価基準との比較によって、前記生体サンプルが多発性硬化症に罹患している可能性を試験方法である。

【0007】

本発明の多発性硬化症に対する治療薬候補のスクリーニング方法は、候補物質と前記本発明の新規サイトカインとを共存させ、前記候補物質と前記新規サイトカインとの結合を検出し、前記新規サイトカインと結合する候補物質を、多発性硬化症に対する治療薬候補として選択することを特徴とする。

【0008】

本発明の多発性硬化症に対する治療薬候補のスクリーニング方法は、前記本発明の新規サイトカインの発現キットを宿主に導入し、候補物質存在下における前記発現キットの発現を検出し、前記候補物質非存在下における前記発現キットの発現と比較して、前記発現キットの発現を有意に抑制する候補物質を、多発性硬化症に対する治療薬候補として選択することを特徴とする。

【0009】

本発明の抗がん剤は、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子である前記本発明の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む前記本発明の新規サイトカインの発現キットを含むことを特徴とする。

【0010】

本発明のがんの治療方法は、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子である前記本発明の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む前記本発明の新規サイトカインの発現キットを投与することを特徴とする。

【0011】

本発明のＧＭ－ＣＦＳ産生促進剤は、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子である前記本発明の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む前記本発明の新規サイトカインの発現キットを含むことを特徴とする。

【0012】

本発明のＧＭ-ＣＦＳの産生促進方法は、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子である前記本発明の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む前記本発明の新規サイトカインの発現キットを投与することを特徴とする。

【発明の効果】

【0013】

本発明は、本発明者らによって新たに見出されたサイトカインである。本発明の新規サイトカインによれば、例えば、多発性硬化症の罹患可能性を試験したり、がんの治療に利用することができる。このことから、本発明は、例えば、医療分野において非常に有用といえる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１はｐ１９およびＣＤ５Ｌを発現させたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞の細胞溶解液および培養上清を免疫沈降反応後、ウェスタンブロッティングで両者の会合を検討した結果である。

【図2】図２は、Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖を^３Ｈ－チミジン取り込み（ｃｐｍ）で測定したグラフである。

【図3】図３は、活性化して血清飢餓状態にしたＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５のリン酸化誘導能を解析したウェスタンブロッティングの結果を示す。

【図4】図４は、ＭＯＧペプチドで免疫後の結果であり、左が、野生型マウスとＣＤ４^＋Ｔ細胞特異的ｐ１９遺伝子欠損マウスのクリニカルスコアであり、右が、脳脊髄に浸潤したサイトカイン産生ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。

【図5】図５は、ＭＯＧ３５－５５ペプチドで免疫後の結果であり、左が、野生型マウスとＣＤ５Ｌ遺伝子欠損マウスのクリニカルスコアであり、右が、脳脊髄に浸潤したサイトカイン産生ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。

【図6】図６は、左が、血清中のｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子の濃度を示し、右が、血清中のＣＤ５Ｌの濃度を示す。

【図7】図７は、マウスメラノーマ細胞の形質転換体を注射したマウスにおける腫瘍の体積を示すグラフである。

【図8】図８は、ＣＤ５Ｌ遺伝子欠損ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＧＭ－ＣＳＦ濃度の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

＜サイトカイン＞
本発明の新規サイトカインは、前述のように、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子であることを特徴とする。本発明の新規サイトカインは、ｐ１９サブユニットとＣＤ５Ｌサブユニットとのヘテロ二量体ということもできる。

【0016】

本発明の新規サイトカインにおいて、ｐ１９は、インターロイキン（ＩＬ－２３）のサブユニット（ＩＬ－２３ｐ１９）である。ｐ１９の由来は、特に制限されず、例えば、後述する各種方法の対象と同じ種類の動物由来であることが好ましい。前記由来は、例えば、ヒトまたは非ヒト動物があげられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、ウシ、ラクダ等があげられる。ヒト由来ｐ１９のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、データベースにおいて、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿０１６５８４．３に登録されている。

【0017】

本発明の新規サイトカインにおいて、ＣＤ５Ｌは、ＣＤ５抗原様分子（ＣＤ５ antigen-like）である。ＣＤ５Ｌの由来は、特に制限されず、例えば、後述する各種方法の対象と同じ種類の動物由来であることが好ましい。前記由来は、例えば、前述と同様である。ヒト由来ＣＤ５Ｌのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、データベースにおいて、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１３４７６９８．２に登録されている。

【0018】

本発明の新規サイトカインは、例えば、ｐ１９とＣＤＬ５とを共存させることによって、前記会合分子（ヘテロ二量体）として形成できる。例えば、ｐ１９とＣＤ５Ｌとが独立した分子であり、且つ、両分子が会合することによって、前記会合分子が形成されてもよいし（以下、「ｐ１９＋ＣＤＬ５」ともいう）、ｐ１９とＣＤＬ５とが、直接的または間接的に連結した１つ分子であり、且つ、分子内でｐ１９とＣＤ５Ｌとが会合することによって、前記会合分子が形成されてもよい（以下、「ｐ１９／ＣＤＬ５」ともいう）。

【0019】

前者（ｐ１９＋ＣＤＬ５）の場合、例えば、使用前または使用時に、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを共存させて、会合分子を形成してもよい。また、例えば、使用前までｐ１９とＣＤ５Ｌとを別個に取扱い、同時に同じ場所に投与することで両者を会合させてもよいし、別個に（すなわち時間差で）同じ場所に投与することで両者を会合させてもよい。同じ場所とは、例えば、投与する際の場所でもよいし、投与によって投与された物質がデリバリーされる場所であってもよい。また、前記投与は、例えば、ｐ１９およびＣＤ５Ｌそのものの投与でもよいし、後述するような、ｐ１９を発現する遺伝子（ｐ１９遺伝子）およびＣＤ５Ｌを発現する遺伝子（ＣＤ５Ｌ遺伝子）の投与であり、投与後に、ｐ１９およびＣＤ５Ｌが発現され、会合分子を形成してもよい。

【0020】

一方、後者（ｐ１９／ＣＤＬ５）の場合、間接的な連結は、例えば、リンカーを介した連結であり、前記リンカーの種類は、特に制限されず、例えば、アミノ酸、またはペプチド等があげられる。また、前記連結の方向は、特に制限されず、例えば、前記リンカーを介して、ｐ１９のＣ末端にＣＤ５ＬのＮ末端が連結してもよいし、ＣＤ５ＬのＣ末端にｐ１９のＮ末端が連結してもよい。ｐ１９とＣＤ５Ｌとが連結した連結分子は、例えば、使用前から会合分子を形成してもよいし、使用時において会合分子を形成してもよいし、投与された場所で会合分子を形成してもよい。前記投与は、例えば、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの連結分子そのものの投与でもよいし、ｐ１９遺伝子とＣＤ５Ｌ遺伝子とのキメラ遺伝子（組み換え遺伝子）の投与であり、投与後に、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの連結分子が発現され、分子内での会合により会合分子を形成してもよい。

【0021】

前記連結分子におけるリンカーの長さは、特に制限されず、分子内でｐ１９とＣＤ５Ｌとが会合できればよい。前記リンカーがペプチドの場合、その長さ（アミノ酸残基数）は、下限が、例えば、１個以上、１０個以上であり、上限が、例えば、１００個以下、８０個以下、５０個以下、３０個以下である。

【0022】

＜発現キット＞
本発明の発現キットは、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含むことを特徴とする、前記本発明の新規サイトカインの発現キットである。本発明は、ｐ１９とＣＤ５Ｌとが会合可能に発現するように、ｐ１９遺伝子とＣＤ５Ｌ遺伝子とを含んでいればよく、その他の構成および条件は、特に制限されない。

【0023】

本発明の発現キットは、例えば、ｐ１９遺伝子とＣＤ５Ｌ遺伝子とが、それぞれ別個の発現系で制御された形態でもよいし、ｐ１９遺伝子およびＣＤ５Ｌ遺伝子の発現が、同じ発現系で制御された形態でもよい。

【0024】

前者の場合、例えば、ｐ１９を発現する発現ベクターと、ＣＤ５Ｌを発現する発現ベクターとを含む形態があげられる。ｐ１９を発現する発現ベクターは、例えば、ベクターにｐ１９遺伝子が発現可能に連結されており、ＣＤ５Ｌを発現する発現ベクターは、例えば、ベクターにＣＤ５Ｌ遺伝子が発現可能に連結されている。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、投与する対象に基づいて宿主ベクター系を考慮して選択でき、具体例として、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる（以下、同様）。

【0025】

後者の場合、例えば、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを発現する発現ベクターを含む形態があげられる。前記発現ベクターは、例えば、同じベクターにｐ１９遺伝子およびＣＤ５Ｌ遺伝子が発現可能に連結されている。ｐ１９遺伝子とＣＤ５Ｌ遺伝子とは、例えば、前記ベクター内において、別個に発現が制御されてもよいし、共に発現が制御されてもよい。また、前記発現ベクターは、例えば、ｐ１９遺伝子とＣＤ５Ｌ遺伝子とのキメラ遺伝子が発現可能に連結されてもよい。前記キメラ遺伝子は、例えば、ｐ１９遺伝子とＣＤ５Ｌ遺伝子とが、リンカーをコードする遺伝子を介して連結された遺伝子である。前記リンカーをコードする遺伝子は、例えば、ｐ１９遺伝子およびＣＤ５Ｌ遺伝子の読み枠を変更しない長さである。

【0026】

＜多発性硬化症の罹患可能性を試験する試験方法＞
本発明の試験方法は、生体サンプルについて、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子（本発明の新規サイトカイン）の発現量を検出する工程を含み、前記発現量と評価基準との比較によって、前記生体サンプルが多発性硬化症に罹患している可能性を試験する方法である。本発明において、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子であるサイトカインまたはその発現量は、マーカ（指標）とも言える。

【0027】

前記会合分子の発現量を検出することにより、多発性硬化症の他に、例えば、自己免疫脳脊髄炎、炎症性腸疾患、乾癬、関節リウマチ等の罹患可能性を試験することもできる。なお、以下の説明において、多発性硬化症は、例えば、これらの他の疾患に読み替え可能である。

【0028】

前記生体サンプルは、例えば、生体から採取したサンプルであり、その種類は、特に制限されず、例えば、血液、細胞、組織等があげられ、前記サンプルは、例えば、生体の腕や足、骨、各臓器等から採取できる。前記生体の種類は、特に制限されず、例えば、ヒト、または前述のような非ヒト動物があげられる。

【0029】

前記会合分子の発現量の検出方法は、特に制限されず、例えば、タンパク質としての発現量の検出でもよいし、ｍＲＮＡとしての発現量の検出でもよい。タンパク質の検出方法は、特に制限されず、例えば、抗体を用いたＥＬＩＳＡ等の方法等が利用できる。また、ｍＲＮＡの検出方法は、特に制限されず、例えば、プライマーおよびプローブ等を用いた逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等の遺伝子増幅方法等が利用できる。以下、前記会合分子（本願発明の新規サイトカイン）の発現量とは、例えば、タンパク質としての発現量、ｍＲＮＡとしての発現量のいずれにも読み替え可能である。

【0030】

前記評価基準は、特に制限されず、例えば、自己免疫性脳脊髄炎であることがわかっている罹患患者について、前記会合分子の発現量を求めておき、これを評価基準とすることができる。また、自己免疫性脳脊髄炎の罹患患者は、例えば、その病態の程度で分類し、その分類ごとに前記会合分子の発現量を求めておき、これらを分類に紐付けた評価基準としてもよい。さらに、前記評価基準は、例えば、自己免疫性脳脊髄炎に罹患していない正常者についても、前記会合物質の発現量を求めておき、これを正常であることの評価基準としてもよい。このようにして前記評価基準を設定することで、例えば、目的の前記生体サンプルの前記会合分子の発現量と、各評価基準の前記会合分子の発現量との比較により、自己免疫性脳脊髄炎の罹患可能性があるか否か、自己免疫性脳脊髄炎の病態の程度がどの分類に属するか等を、容易に試験できる。

【0031】

本発明の診断方法は、多発性硬化症の診断方法であり、生体サンプルのｍＲＮＡについて、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子（本発明の新規サイトカイン）の発現量を検出する工程と、前記発現量から、評価基準に基づいて、前記生体サンプルが多発性硬化症に罹患している可能性を判断する工程とを含む、ことを特徴とする。本発明の診断方法は、前記本発明の試験方法の記載を援用できる。

【0032】

前述のように、本発明の新規サイトカインは、前記多発性硬化症のマーカとなるため、例えば、本発明の新規サイトカインに対する抗体（中和剤ともいう）、前記新規サイトカインの発現を抑制する発現抑制剤等は、前記新規サイトカインの機能を抑制したり、その発現を抑制できることから、前記多発性硬化症の治療薬として利用できる。前記発現抑制剤は、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス等の核酸物質等があげられる。また、本発明の新規サイトカインと候補物質とを共存させ、前記新規サイトカインとの結合の有無を検出し、前記新規サイトカインと結合する候補物質を、前記多発性硬化症に対する治療薬候補としてスクリーニングすることもできる。

【0033】

＜多発性硬化症に対する治療薬候補のスクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、多発性硬化症に対する治療薬候補のスクリーニング方法であり、候補物質と前記本発明の新規サイトカインとを共存させ、前記候補物質と前記新規サイトカインとの結合を検出し、前記新規サイトカインと結合する候補物質を、多発性硬化症に対する治療薬候補として選択することを特徴とする。この方法によれば、前記新規サイトカインと結合する候補物質は、前記新規サイトカインに対する中和物質としての治療薬候補として選択できる。前記候補物質の種類は、特に制限されず、例えば、抗体またはその断片（抗原結合断片）等が例示できる。

【0034】

本発明のスクリーニング方法は、多発性硬化症に対する治療薬候補のスクリーニング方法であり、前記本発明の新規サイトカインの発現キットを宿主に導入し、候補物質存在下における前記発現キットの発現を検出し、候補物質非存在下における前記発現キットの発現と比較して、前記発現キットの発現を有意に抑制する候補物質を、多発性硬化症に対する治療薬候補として選択することを特徴とする。本発明のスクリーニング方法において、前記発現の抑制は、例えば、最終的にｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子である前記本発明の新規サイトカインの発現が抑制される形態であればよく、具体例として、転写の抑制、翻訳の抑制、転写物の分解、または翻訳物の分解等があげられる。すなわち、例えば、ｐ１９遺伝子およびＣＤ５Ｌ遺伝子の少なくとも一方について、または、前記キメラ遺伝子について、転写が抑制されてもよいし、転写物からの翻訳が抑制されてもよいし、転写は行われるが得られた転写物の一部または全部が分解されてもよいし、転写物から翻訳は行われるが得られた翻訳物の一部または全部が分解されてもよい。前記候補物質の種類は、特に制限されず、例えば、siRNA等のＲＮＡ干渉を行う核酸物質等があげられる。

【0035】

＜抗がん剤等＞
本発明の抗がん剤は、ｐ１９およびＣＤ５Ｌとの会合分子である前記本発明の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む前記本発明の新規サイトカインの発現キットを含むことを特徴とする。

【0036】

本発明のがんの治療方法は、ｐ１９およびＣＤ５Ｌとの会合分子である前記本発明の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む前記本発明の新規サイトカインの発現キットを投与することを特徴とする。

【0037】

本発明の新規サイトカインは、例えば、がんの治療に使用できる。また、本発明の発現キットは、本発明の新規サイトカインを発現することによって、同様に、がんの治療に使用できる。がんの種類は、特に制限されず、例えば、メラノーマ、前立腺がん、肝臓がん、大腸がん、乳がん、肺がん、血液がん等があげられる。

【0038】

投与する生体の種類は、特に制限されず、例えば、前述のような、ヒトおよび非ヒト動物があげられる。また、投与する部位は、特に制限されず、例えば、がんが発生している部位、がんが発生している部位にまで物質をデリバリーできる部位等である。投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与、非経口投与等であり、前記非経口投与は、例えば、注射、点滴等があげられる。

【0039】

本発明の新規サイトカインおよび本発明の発現キットの投与量は、特に制限されず、例えば、投与対象となる生体の大きさ、年齢、がんの進行度合い等に応じて、適宜決定できる。

【0040】

本発明のＧＭ－ＣＦＳ産生促進剤は、ｐ１９およびＣＤ５Ｌとの会合分子である前記本発明の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む前記本発明の新規サイトカインの発現キットを含むことを特徴とする。

【0041】

本発明のＧＭ－ＣＦＳの産生促進方法は、ｐ１９およびＣＤ５Ｌとの会合分子である前記本発明の新規サイトカイン、または、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを会合可能に発現する遺伝子を含む前記本発明の新規サイトカインの発現キットを投与することを特徴とする。

【0042】

本発明の新規サイトカインは、例えば、ＧＭ－ＣＦＳの産生を促進することができ、その結果、前述のようながんの治療に利用ができる。また、本発明の発現キットは、本発明の新規サイトカインを発現することによって、同様に、ＧＭ－ＣＦＳの産生の促進に使用できる。

【0043】

投与は、例えば、in vivo、in vitro、ex vivoのいずれでもよい。生体に投与する場合、その種類は、特に制限されず、例えば、前述のような、ヒトおよび非ヒト動物があげられ、投与する部位も、特に制限されず、例えば、産生を促進させたい場所、産生を促進させたい場所にまで物質をデリバリーできる部位等である。投与方法は、特に制限されず、例えば、前述と同様に、経口投与、非経口投与等である。

【0044】

本発明の新規サイトカイン、すなわち、ｐ１９およびＣＤ５Ｌとの会合分子は、がんの治療に使用するための会合分子、または、ＧＭ－ＣＦＳの産生の促進に使用するための会合分子ともいえる。

【実施例】

【0045】

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。

【0046】

［実施例１］
本発明の新規サイトカインについて、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合の確認、サイトカインとしての機能の確認を行った。

【0047】

（１）発現および会合の確認
マウス由来ｐ１９ ｃＤＮＡを、Ｃ末端に３×ＦＬＡＧ－エピトープタグ配列が付加されるp3FLAG-CMV-14ベクター(Sigma-Aldrich社)に連結し、ｐ１９発現ベクターを調製した。ｃ-ＭＹＣタグ配列が付加されるマウス由来ＣＤ５Ｌ発現ベクターは、市販品（pCMV3-CD5L-c-MYC、Sino Biological社）を使用した。前記ｐ１９発現ベクターおよび前記ＣＤ５Ｌ発現ベクターを、ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３細胞に由来する２９３－Ｆ細胞株に導入し、無血清のFreeStyle 293発現培地（商品名、Invitrogen社）を用いて、３日間、懸濁培養した。そして、培養後、培養液から細胞を回収し、さらに、細胞溶解を行った上で、遠心分離により、細胞溶解物と上清とに分離した。そして、細胞溶解物と上清とを、それぞれ別個に、抗ＦＬＡＧ抗体 (M2、Sigma-Aldrich社)および抗ｃ－ＭＹＣ抗体(9E10、Santa Cruz社)による免疫沈降に供し、さらに、それぞれ反対の抗体を用いてウェスタンブロティングを行った。細胞の培養条件は、５％ ＣＯ_２、９５％空気、３７℃とした（以下、同様）。

【0048】

これらの結果を図１に示す。図１は、ｐ１９およびＣＤ５Ｌを発現させたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞のウェスタンブロッティングの結果であり、細胞溶解画分と上清画分の結果を示す。図において、ｉｎｐｕｔは、免疫沈降反応による分離前のサンプルであり、Ｃｏｎｔｒｏｌは、それぞれの免疫沈降反応に用いた抗体のコントロール抗体である。図１に示すように、細胞溶解分画および上清分画共に、コントロール抗体では共沈されるバンドが、わずかか殆ど検出されず（左から２レーン目と５レーン目）、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降反応よりＣＤ５Ｌ－ｃ－ＭＹＣのバンド（上の段左から３レーン目と６レーン目）が検出され、反対に、抗ｃ－ＭＹＣ抗体によりｐ１９－ＦＬＡＧのバンド（下の段左から３レーン目と６レーン目）が検出され共沈されることから、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの両方が発現し、且つ、ｐ１９とＣＤ５Ｌとが会合していることが確認できた。

【0049】

（２）サイトカインの機能の確認
（２－１）Ｂａ／Ｆ３細胞に対する増殖能
サイトカインは、そのレセプターを強制発現したＩＬ－３依存性のマウスｐｒｏ－Ｂ細胞株Ｂａ／Ｆ３細胞を増殖させることが知られている。そこで、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子が、Ｂａ／Ｆ３細胞を増殖させるか否かを確認した。Ｂａ／Ｆ３細胞としては、gp130/IL‐12Rβ1/IL‐12Rβ2/IL‐23Rαを強制発現した細胞を使用した。このＢａ／Ｆ３細胞の培養は、１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２３の存在下、１０％ＦＢＳ、５０μｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタノール、および１００μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０を使用した。

【0050】

発現ベクターを単独または組合せて、前記（１）と同様にして、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、３日間培養を行った。培養後の上清を、上記のＢａ／Ｆ３細胞の培養液に、１０％（ｖ／ｖ）または３０％（ｖ／ｖ）となるように添加して、３日間培養を行い、その増殖活性を、ＤＮＡへの^３Ｈ－チミジンの取り込みの測定により評価した。取り込みの測定は、FilterMate cell harvester(PerkinElmer社)およびTopCount マイクロプレートシンチレーションカウンター(PerkinElmer社)を用いて行った。チミジンの取り込み（ｃｐｍ）は、平均±SD (n = 3)として算出した。P値は、両側ステューデントｔ検定で決定した。

【0051】

これらの結果を図２に示す。図２は、^３Ｈ－チミジン取り込み（ｃｐｍ）を示すグラフであり、縦軸が、^３Ｈ－チミジン取り込み量（ｃｐｍ）を示し、グラフ下は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入したベクターの種類を示す。「Vector alone」は、ｃＤＮＡ未導入のp3×FLAG-CMV-14ベクター(Sigma-Aldrich社)のみ、「ｐ１９」は、マウス由来ｐ１９ ｃＤＮＡを連結したp3×FLAG-CMV-14ベクター(Sigma-Aldrich社)、「ＣＤ５Ｌ」は、前記（１）で使用したpCMV3-CD5L-c-MYC（Sino Biological社）、「ｐ１９＋ＣＤ５Ｌ」は、マウス由来ｐ１９ ｃＤＮＡを連結したp3×FLAG-CMV-14ベクター(Sigma-Aldrich社)とpCMV3-CD5L-c-MYC（Sino Biological社）との混合物、「ｐ１９／ＣＤ５Ｌ」は、マウス由来ＣＤ５Ｌ ｃＤＮＡ、リンカー(Gly₄Ser)₃のコード配列、およびマウス由来ｐ１９ ｃＤＮＡを、この順序で１本鎖に連結したp3×FLAG-CMV-14ベクター(Sigma-Aldrich社)、「ｐ４０／ＣＤ５Ｌ」は、マウス由来ＣＤ５Ｌ ｃＤＮＡ、リンカー(Gly₄Ser)₃のコード配列、およびマウス由来ｐ４０ ｃＤＮＡを、この順序で1本鎖に連結したp3×FLAG-CMV-14ベクター(Sigma-Aldrich社)、「ｐ１９＋ｐ４０」は、ＩＬ－２３が産生されるポジティブコントロールとして用いたマウス由来ｐ１９ ｃＤＮＡを連結したp3×FLAG-CMV-14ベクター(Sigma-Aldrich社)とマウス由来ｐ４０ ｃＤＮＡを連結したp3×FLAG-CMV-14ベクター(Sigma-Aldrich社)との混合物の使用を意味する。図２において、Ｐ値は、*P < 0.05で表した。

【0052】

図２に示すように、「ｐ１９＋ＣＤ５Ｌ」は、ｐ１９とＣＤ５Ｌとが共発現され、また「ｐ１９／ＣＤ５Ｌ」は、ｐ１９とＣＤ５Ｌとを1本鎖融合タンパク質として発現し、会合分子を形成することによって、ポジティブコントロールの「ｐ１９＋ｐ４０」と同様に、著しい増殖が確認できた。一方、「ｐ１９」、「ＣＤ５Ｌ」は、単独では増殖が確認されず、「ｐ４０／ＣＤ５Ｌ」も、増殖が確認されなかった。

【0053】

（２－２）ＳＴＡＴ５のリン酸化能
サイトカインは、ＳＴＡＴをリン酸化することが知られている。そこで、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子が、どのＳＴＡＴをリン酸化するか否かを調べた。

【0054】

前記（２－１）の「ｐ１９／ＣＤ５Ｌ」発現ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、５％ＦＣＳを含むDMEM培地（Invitrogen社）で３日間培養し、上清を回収した。HiTRap NHS活性化HPカラム(GE Healthcare社)と抗ｐ１９抗体(G23-8、Bio X Cell社、または、Ｒ＆Ｄ)とを用いて調製した抗１９アフィニティゲルのアフィニティカラムを用いて、ｐ１９とＣＤ５Ｌとが連結されたタンパク質（ＣＤ５Ｌ／ｐ１９タンパク質）を精製した。

【0055】

WT C57BL/6マウス（Sankyo Labo Service社）から脾臓細胞を摘出し、AutoMACS Pro（ミルテニー社）を用いて、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離した。ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞の培養は、１０％ ＦＢＳ、５０μｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタノール、および１００μg／ｍＬカナマイシン(明治製菓)を含むＲＰＭＩ１６４０(Sigma-Aldrich社)を使用した。ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞（５×１０^５細胞／ｍＬ）を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたプレートを用いて、前記抗体で刺激を与えて３日間培養した。培養後、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を洗浄し、６時間血清飢餓状態とした。その後、精製した前記ＣＤ５Ｌ／ｐ１９タンパク質を、１０ｎｇ／ｍＬとなるように培地に添加して、２０分間再度刺激を与えた。そして、抗ｐＹ－ＳＴＡＴ１抗体(Cell Signaling)、抗ＳＴＡＴ１抗体(Transduction Laboratories)、抗ｐＹ－ＳＴＡＴ３抗体(Cell Signaling)、抗ＳＴＡＴ３抗体(Santa Cruz)、抗ｐＹ－ＳＴＡＴ５抗体(Cell Signaling)、抗ＳＴＡＴ５抗体(Santa Cruz)を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。

【0056】

なお、ネガティブコントロールとして、タンパク質未添加の系（－）、マウス由来ｐ１９タンパク質を単独で添加した系（ｐ１９）、マウス由来ＣＤ５Ｌタンパク質を単独で添加した系（ＣＤ５Ｌ）、ＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３のリン酸化誘導のポジティブコントロールとしてＩＬ－２７、ＳＴＡＴ５のリン酸化誘導のポジティブコントロールとしてＩＬ－２を添加した系（ＩＬ－２７またはＩＬ－２）についても、同様に、ウェスタンブロッティングを行った。

【0057】

これらの結果を図３に示す。図３は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞のウェスタンブロッティングの結果を示す。図３に示すように、ｐ１９とＣＤ５Ｌとが分子内で会合したｐ１９／ＣＤ５Ｌタンパク質を添加した場合、ポジティブコントロールであるＩＬ－２と同様に、ＳＴＡＴ５のリン酸化が確認できた。ＳＴＡＴ１やＳＴＡＴ３のリン酸化は殆ど見られなかった。なお、図３において、右端レーンは、ポジティブコントロールであり、ＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３のリン酸化についてはＩＬ－２７で刺激した結果であり、ＳＴＡＴ５のリン酸化についてはＩＬ－２で刺激した結果である。

【0058】

前記（２－１）および（２－２）に示すように、ｐ１９／ＣＤ５Ｌタンパク質は、サイトカインであることを示すＢａ／Ｆ３細胞に対する増殖能とＳＴＡＴ５のリン酸化能の両方を示した。このことから、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子は、サイトカインであることが確認できた。

【0059】

［実施例２］
本発明の新規サイトカインが、多発性硬化症の発症に重要であること、そのマーカとなることを確認した。具体的には、多発性硬化症のマウスモデルとして一般的に使用されているＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）を用いて、以下の実験を行った。

【0060】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞特異的ｐ１９遺伝子欠損マウス（ＣＤ４－Ｃｒｅ／ｐ１９^flox/flox）は、ＣＤ４－Ｃｒｅ－Ｔｇマウス(Jackson Laboratory社)とｐ１９^flox/floxマウス（Dr. P. Thakkerより分与）とを交配させて作製した。CRISPR/Cas9法により作製されたＣＤ５Ｌ遺伝子欠損マウス（CD5L KO）は、東京大学宮崎徹先生より分与された。前記野生型のマウス（ＷＴ）と、ＣＤ４－Ｃｒｅ／ｐ１９^flox/floxマウス、およびＣＤ５Ｌ ＫＯマウスに、ＭＯＧ３５－５５ペプチド(Sigma-Aldrich社)１５０μｇを皮下注射して、免疫した（０日目）。前記ＭＯＧ３５－５５ペプチドは、５ｍｇ／ｍＬ Ｈ３７ＲＡを含有する完全フロイントアジュバント(Difco Laboratories社)で乳化したものを使用した。免疫後のマウスについて、臨床徴候を以下の基準にしたがってスコア化した。また、免疫後０日目と２日目に、百日咳毒素(List Biological Laboratories社)２００ｎｇを静脈内投与し、０、７、１４日目に血清を採取した。そして、前記血清中のｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子（ヘテロ二量体）、および単独のＣＤ５Ｌを検出した。前記会合分子の検出は、捕捉抗体として抗ｐ１９抗体(5B2、eBioscience社)、検出抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－結合抗ＣＤ５Ｌ抗体(Sino Biological社)、スタンダードタンパク質として精製した組換えｐ１９／ＣＤ５Ｌタンパク質を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。臨床徴候観察後、脳脊髄に浸潤した単核球細胞を単離し、サイトカインの細胞内染色によりその割合をFACSCantoII（BD Biosciences）を用いて解析した。Ｐ値は、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001で表した。
スコア０：臨床徴候なし
スコア１：尾の完全下垂
スコア２：後肢脱力
スコア３：後肢麻痺
スコア４：死亡

【0061】

図４と図５の左図は、クリニカルスコアを示すグラフであり、右図がサイトカインの細胞内染色の結果、図６は、左図が、血清中のｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子の濃度を示し、右図が、血清中のＣＤ５Ｌの濃度を示す。ＷＴマウスは、図４および図５の左図に示すように、免疫後、経時的にクリニカルスコアが悪化し続け、図６に示すように、血清中の前記会合分子の濃度も、経時的に増加した。この時、ＣＤ５Ｌの濃度には、ほぼ変化が見られなかった。他方、ＣＤ４^＋Ｔ細胞特異的ｐ１９遺伝子欠損マウス、および、ＣＤ５Ｌ ＫＯマウスでは、図４と図５に示すように、免疫後、クリニカルスコアの悪化は抑制され、脳脊髄内に浸潤したＧＭ－ＣＳＦ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合も減少した。ＣＤ５Ｌ ＫＯマウスでは、図６に示すように、血清中の前記会合分子もほぼ検出されなくなった。これらの結果から、前記ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子の増加が、多発性硬化症の罹患およびその程度を間接に示し、前記会合分子が、多発性硬化症のマーカとなることが確認できた。さらに、ＣＤ４^＋Ｔ細胞特異的ｐ１９遺伝子欠損マウス、および、ＣＤ５Ｌ ＫＯマウスのいずれのマウスにおいても、ＧＭ－ＣＳＦ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合が減少し、ＥＡＥの発症が軽減されたことより、前記会合分子がＧＭ－ＣＳＦ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞への分化を増強し、ＥＡＥ発症を促進する可能性が確認された。前記ＧＭ－ＣＳＦ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞への分化の増強が確認されたことから、前記会合分子は、ＧＭ－ＣＳＦの産生細胞への分化の促進剤となること、また、分化の促進を介してＧＭ－ＣＳＦ産生の促進剤になることがわかった。

【0062】

［実施例３］
本発明の新規サイトカインが、メラノーマの改善剤となるとなることを確認した。

【0063】

マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０に、前記実施例１（２－１）のベクターを導入した。前記マウスメラノーマ細胞株の培養は、１０% ＦＢＳおよび１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０を使用した。そして、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Sankyo Labo Service社、ｎ＝５）の右側腹部に、前記ベクターを導入したマウスメラノーマ細胞の形質転換体（１×１０^６細胞/マウス）を皮下注射した。そして、腫瘍の増殖を電子カリパスでモニターし、下記式から腫瘍の体積を算出した。Ｐ値は、*P < 0.05で表した。
腫瘍の体積（ｍｍ^３）＝０．５（ａｂ^２）
ａ：長径
ｂ：短径

【0064】

これらの結果を、図７に示す。図７は、マウスメラノーマ細胞の形質転換体を注射したマウスにおける腫瘍の体積を示すグラフである。図７に示すように、「Vector」、「ｐ１９」、「ＣＤ５Ｌ」の形質転換体を注入したマウスは、経時的に腫瘍の増大が見られたが、「ＣＤ５Ｌ／ｐ１９」のｐ１９とＣＤ５Ｌとを1本鎖融合タンパク質として発現した形質転換体を注入したマウスは、腫瘍の増大が有意に抑制された。この結果から、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子によって、メラノーマを抑制できることがわかった。これは、ｐ１９とＣＤ５Ｌとの会合分子によって、ＧＭ－ＣＳＦの産生が促進され、その抗腫瘍効果によって、メラノーマが抑制されたと考えられる。

【0065】

［実施例４］
ｐ１９とＣＤ５Ｌとが連結した組換え体について、ＧＭ－ＣＳＦ産生を促進することを確認した。

【0066】

前記実施例１（２－１）の「ｐ１９」発現ベクター、「ＣＤ５Ｌ」発現ベクター、「ｐ１９／ＣＤ５Ｌ」発現ベクターを用い、前記実施例１（２－２）と同様にして、前記発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して培養を行い、それぞれの上清から、ｐ１９タンパク質、ＣＤ５Ｌタンパク質、ｐ１９／ＣＤ５Ｌタンパク質を精製した。

【0067】

つぎに、ＣＤ５Ｌ遺伝子欠損ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞（５×１０^５細胞／ｍＬ）を、抗ＩＬ－１２抗体、抗ＩＦＮ－γ抗体および抗ＩＬ－４抗体の存在下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティング（固相化）されたプレートを用いて、前記固相化抗体で刺激を与え、３日間培養した。前記刺激する際、組換えｐ１９タンパク質、ＣＤ５Ｌタンパク質、またはｐ１９／ＣＤ５Ｌタンパク質を１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。なお、コントールとして、組み換えタンパク質無添加で同様の処理を行った。培養条件は、前記実施例１（２－２）と同様とした。そして、培養３日後に、上清を回収し、ＧＭ－ＣＳＦの産生を、抗ＧＭ－ＣＦＳ抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定した。

【0068】

これらの結果を、図８に示す。図８は、ＧＭ－ＣＳＦ濃度の結果を示すグラフである。図８に示すように、組換えタンパク質未添加のコントロール、ｐ１９単独添加、ＣＤ５Ｌ単独添加と比較して、ｐ１９／ＣＤ５Ｌの添加によって、ＧＭ－ＣＳＦ産生が有意に増強することがわかった。

【0069】

以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。

【0070】

この出願は、２０１９年７月３１日に出願された日本出願特願２０１９－１４０５５２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

【産業上の利用可能性】

【0071】

本発明は、本発明者らによって新たに見出されたサイトカインである。本発明の新規サイトカインによれば、例えば、多発性硬化症の罹患可能性を試験したり、がんの治療に利用することができる。このことから、本発明は、例えば、医療分野において非常に有用といえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】