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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-25
(45)【発行日】2024-01-09
(54)【発明の名称】二重特異性抗体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20231226BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231226BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20231226BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231226BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231226BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231226BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20231226BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231226BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231226BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231226BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/13 ZNA
C12N15/85 Z
C07K19/00
C07K16/28
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61P35/00
A61P35/02
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021525317
(86)(22)【出願日】2019-09-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 CN2019108057
(87)【国際公開番号】W WO2020088164
(87)【国際公開日】2020-05-07
【審査請求日】2022-03-01
(31)【優先権主張番号】201811294887.4
(32)【優先日】2018-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】511182437
【氏名又は名称】山▲東▼新▲時▼代▲薬▼▲業▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＮＥＷ ＴＩＭＥ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１，Ｎｏｒｔｈ Ｏｕｔｅｒ Ｒｉｎｇ Ｒｏａｄ，Ｆｅｉｘｉａｎ Ｃｏｕｎｔｒｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２７３４００，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】李強
(72)【発明者】
【氏名】賈世香
(72)【発明者】
【氏名】趙麗麗
(72)【発明者】
【氏名】張貴民
(72)【発明者】
【氏名】劉忠
(72)【発明者】
【氏名】馬心魯
(72)【発明者】
【氏名】厳源
(72)【発明者】
【氏名】李振宇
(72)【発明者】
【氏名】胡興霞
(72)【発明者】
【氏名】張玉華
(72)【発明者】
【氏名】李斌
【審査官】白井 美香保
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１７－１８６３０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１０６６８４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１８／１３８１７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５１１５２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５２００８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０６３１７２２６（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５３７９６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１７２９８１（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Cancer Science，2015年，Vol.106, No.5，p.512-521, supporting information p.1-3
【文献】Cancer Cell，2017年，Vol.31，p.396-410
【文献】mAbs，2012年，Vol.4, No.2，p.267-273
【文献】Leukemia，2017年，Vol.31，p.1743-1751
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
二本の同じポリペプチド鎖を共有結合で結合して四価ホモ二量体を形成する二重特異性抗体であって、各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示され、
各ポリペプチド鎖が、腫瘍抗原ＢＣＭＡと特異的に結合する第一の一本鎖Ｆｖ（抗－ＢＣＭＡ ＳｃＦｖ）、リンカーペプチドＬ２、エフェクター細胞抗原ＣＤ３と特異的に結合する第二の一本鎖Ｆｖ（抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖ）、及びＦｃ断片によって順に直列接続して構成され、
前記抗－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖと前記抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖの内部のＶＨとＶＬとの間は、それぞれ（ＧＧＧＧＳ） ３ によって接続され、
抗－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖのＶＨとＶＬアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示され、
抗ＣＤ３－ｓｃＦｖのＶＨとＶＬアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示され、
前記リンカーペプチドＬ２は、可撓性ペプチドと剛性ペプチドからなり、可撓性ペプチドは、いずれもＧ ２ （ＧＧＧＧＳ） ３ であり、剛性ペプチドは、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳである、二重特異性抗体。
【請求項2】
前記Ｆｃ断片は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰエフェクター機能を有しない、ことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
前記抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ヒト又はカニクイザル又はアカゲザルのＣＤ３と特異的に結合することができる、ことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
前記二重特異性抗体は、ヒトＢＣＭＡとＣＤ３に結合することを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
請求項１に記載の二重特異性抗体をコードする、ことを特徴とする、ＤＮＡ分子。
【請求項6】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すようなヌクレオシド配列を有する、ことを特徴とする、請求項５に記載のＤＮＡ分子。
【請求項7】
請求項５に記載のＤＮＡ分子又は請求項６に記載のＤＮＡ分子を含む、ことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項8】
宿主細胞であって、請求項７に記載の発現ベクターが導入されており、前記宿主細胞は、原核細胞又は酵母又は哺乳動物細胞である、ことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項9】
前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である、ことを特徴とする、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項10】
前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞である、ことを特徴とする、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項11】
請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体及び薬用賦形剤及び／又はベクター及び／又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項12】
（ａ）二重特異性抗体の融合遺伝子を取得し、二重特異性抗体の発現ベクターを構築するステップと、（ｂ）遺伝子工学方法によって上記発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトするステップと、
（ｃ）前記二重特異性抗体の生成が許可される条件下で上記宿主細胞を培養するステップと、
（ｄ）生成される抗体を分離、精製するステップと、を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を調製する方法。
【請求項13】
形質細胞障害、ＢＣＭＡ発現に関する他のＢ細胞障害又は自己免疫性疾患を治療又は改善するための医薬であって、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含み、前記形質細胞障害は、多発性骨髄腫、形質細胞腫、形質細胞白血病、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髓外形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫、重鎖病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン病又は鬱滞性多発性骨髄腫を含む、医薬。
【請求項14】
形質細胞障害を治療又は改善するための医薬であって、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含み、前記形質細胞障害は、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髓外形質細胞腫、又は鬱滞性多発性骨髄腫を含む、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫学分野に関し、さらに具体的には、Ｔ細胞を媒介して殺傷させる抗ＣＤ３二重特異性抗体、及びこのような抗体の用途、特に、それが癌症治療における用途に関する。
【背景技術】
【0002】
多発性骨髄腫は、二番目によく見られる血液システム悪性腫瘍であり、その骨髓内のモノクローナル形質細胞の制御されない増殖は、モノクローナル免疫グロブリンと免疫阻害の過剰生成、及び骨溶解と終末器官損傷を引き起こす。現在では、二つの単クローン性抗体の臨床使用が承認されており、過去十年間、多発性骨髄腫治療方案は、患者の生存率を著しく向上させた。それにもかかわらず、従来の治療方案は、特に、現在の治療法に対して耐性を有する再発／難治性の患者に対して、現在の治療ニーズを満たしていない。
【0003】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、高度形質細胞特異性抗原であり、Ｂ細胞の成熟と形質細胞への分化を調節する方面で、増殖誘導配位子（ＡＰＲＩＬ）に関与することによって重要な役割を果たしている。ＢＣＭＡ発現は、Ｂ細胞系譜に限られ且つ主に形質細胞と形質芽細胞に存在し、且つ一定の程度で記憶Ｂ細胞に存在するが、外周とナイーブＢ細胞には実質的に存在せず、他の正常組織細胞での発現が見られない。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫細胞にも発現し且つ白血病とリンパ腫に関与する。そのファミリーメンバーのＴＡＣＩ（膜貫通活性化剤とシクロフィリン受容体配位子相互作用物）とＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体）と共に、ＢＣＭＡは、体液免疫、Ｂ細胞発育及びインビボ定常状態の異なる方面を調節する。ＢＣＭＡの発現は、Ｂ－細胞分化作用のより後期に現れ且つ骨髓における形質芽細胞と形質細胞の長期生存に有利である。マウス内のＢＣＭＡ遺伝子の標的欠失のため、骨髓内の長寿形質細胞の数量が著しく減少し、ＢＣＭＡがその生存に対して重要性を有することが示めされる。ＢＣＭＡ過発現、又は多発性骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡのＡＰＲＩＬへの刺激によって、キー免疫チェックポイント分子を直接上昇させることができ、これは、骨髄微小環境の免疫阻害に役立つ可能性がある。
【0004】
細胞免疫プロセスにおいて、Ｔリンパ球は、重要な役割を果たしている。Ｔ細胞によって媒介される細胞免疫は、主にＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）によって細胞表面の主要組織相容性複合体（ＭＨＣ）によって提示される抗原ペプチドを特異的に認識し、さらにＴ細胞の細胞内信号をアクティブ化し、該標的細胞に対して特異的な殺傷を行う。これは、インビボ病変の細胞を適時に除去し、腫瘍の発生を予防するのに重要な役割を果たしている。多数の癌細胞表面のＭＨＣの発現が低下し、ひいては欠失するため、腫瘍細胞は、免疫殺傷を逃れることができ、それにより腫瘍が発生する。
【0005】
Ｔ細胞結合二重特異性抗体（Ｔ ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＴＣＢｓ）は、アクティブ化される細胞毒性Ｔ細胞を腫瘍にリダイレクトする非常に効果的な方式を代表する。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体の一部として、成熟Ｔ細胞に発現し、ＴＣＲ認識抗原によって生成された活性化信号を形質導入することができる。ＴＣＢｓは、同時に表面腫瘍抗原とＴ細胞受容体のＣＤ３εサブユニットと結合し、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間に一つの物理的接続を提供し、それにより静止のＴ細胞を効果的にアクティブ化して腫瘍細胞を殺傷させ、腫瘍治療の效果を達成することができる（Ｓｍｉｔｓ Ｎ Ｃ、Ｓｅｎｔｍａｎ Ｃ Ｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１６：ＪＣＯ６４９９７０．）。Ｔ細胞二重特異性バイパスＴＣＲ抗原認識とＴ細胞活性化の共刺激要求のため、それらは、腫瘍特異性免疫への需要を解消し、且つ腫瘍微小環境内にＴ細胞が直面する多くの障害を克服した。
【0006】
近年、二つの異なる半抗体を正確に組み立てるという問題を解決するために、科学者たちは、複数の構造の二重特異性抗体を設計して開発した。全体的に纏めると二種類あり、一種類の二重特異性抗体は、Ｆｃ領域を含まず、ＢｉＴＥ、ＤＡＲＴ、ＴｒａｎｄＡｂｓ、ｂｉ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ等を含む。この種類の構造の二重抗体の利点は、分子量が小さく、原核細胞内に発現でき、正確に組み立てるという問題を考慮する必要がないことである。欠点は、抗体Ｆｃ段がなく、分子量が比較的に低いため、その半減期が比較的に短く、且つこのような形式の二重抗体が極めて重合しやすく、安定性が低く、且つ発現量が低いため、臨床応用が一定の制限を受けることである。別の種類の二重特異性抗体は、Ｆｃドメインを保留し、例えばＴｒｉｏｍａｂｓ、ｋｉｈ ＩｇＧ、Ｃｒｏｓｓ－ｍａｂ、ｏｒｔｈｏＦａｂ ＩｇＧ、ＤＶＤ ＩｇＧ、ＩｇＧ ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２－Ｆｃ等の配置である。この種類の二重抗体は、ＩｇＧ様構造を形成し、分子構造が比較的に大きく、且つＦｃＲｎによって媒介されるエンドサイトーシスと再循環プロセスは、それにさらに長い半減期を備えさせ、またＦｃによって媒介される一部又は全部のエフェクター機能を保留しており、例えば抗体依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）及び抗体依存細胞貪食（ＡＤＣＰ）である。しかしながら、このような二重抗体は、ミスマッチ生成物の生成を完全に根絶することができず、任意のミスマッチ分子の残留画分は、いずれも生成物から分離しにくく、且つこのような方法は、二つの抗体配列に対して大量の突然変異等の遺伝子工学改造を行うことができ、簡単、通用の目的を達成することができない。
【0007】
このため、本発明は、製品の半減期、安定性、安全性及び生産可能性の面で、改善性能を有するＢＣＭＡ二重特異性分子を開発することを目的とする。
【発明の概要】
【0008】
本発明の目的は、インビボで腫瘍細胞を著しく阻害し又は殺傷することができ、低発現ＢＣＭＡの正常細胞に対する非特異的殺傷作用が著しく低減し、またエフェクター細胞の過剰活性化による毒副作用の制御性が増加し、且つその物理化学特性とインビボ安定性がいずれも著しく向上する標的免疫エフェクター細胞抗原ＣＤ３と腫瘍抗原ＢＣＭＡの四価ホモ二量体型二重特異性抗体分子を提供することである。
【0009】
具体的には、本発明の第一の方面は、二重特異性抗体を開示する。前記二重特異性抗体分子は、二本の同じポリペプチド鎖を共有結合で結合して四価ホモ二量体を形成し、各のポリペプチド鎖は、Ｎ端からＣ端まで、腫瘍抗原ＢＣＭＡと特異的に結合する第一の一本鎖Ｆｖと、エフェクター細胞抗原ＣＤ３と特異的に結合する第二の一本鎖Ｆｖと、Ｆｃ断片とを順に含み、第一と第二の一本鎖Ｆｖがリンカーペプチドによって接続され、第二の一本鎖ＦｖがＦｃ断片に直接接続されるか、またはリンカーペプチドによって接続され、且つ前記Ｆｃ断片は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ等のエフェクター機能を有しない。
【0010】
そのうち、前記第一の一本鎖Ｆｖは、ＶＨドメインとＶＬドメインを含み、且つリンカーペプチドＬ１によって接続され、且つ前記リンカーペプチドＬ１のアミノ酸配列は、（ＧＧＧＧＸ）ｎであり、Ｘは、Ｓｅｒ又はＡｌａを含み、ｎは、１～５の自然数であり、Ｘは、好ましくはＳｅｒであり、ｎは、好ましくは３である。
【0011】
本発明の一つの好ましい実施例では、前記リンカーペプチドＬ１のアミノ酸配列は、（ＧＧＧＧＳ）３であり、他の好ましい実施例方案では、前記リンカーペプチドＬ１のアミノ酸配列は、（ＧＧＧＧＳ）１又は（ＧＧＧＧＳ）２又は（ＧＧＧＧＳ）４又は（ＧＧＧＧＳ）５又は（ＧＧＧＧＡ）１又は（ＧＧＧＧＡ）２又は（ＧＧＧＧＡ）３又は（ＧＧＧＧＡ）４又は（ＧＧＧＧＡ）５をさらに含む。
【0012】
好ましくは、前記第一の一本鎖Ｆｖは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含むＶＨドメイン、及び
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６にそれぞれ示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含むＶＬドメイン、を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含むＶＨドメイン、及び
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６にそれぞれ示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含むＶＬドメイン、を含む。
【0013】
更に好ましくは、前記第一の一本鎖Ｆｖは、
（１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＶＨドメイン、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有し又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列、及び
（２）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＶＬドメイン、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有し又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含む。そのうち、本発明の前記第一の一本鎖Ｆｖと第二の一本鎖Ｆｖとを接続するリンカーペプチドＬ２は、可撓性ペプチドと剛性ペプチドからなる。
（１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＶＨドメイン、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有し又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列、及び
（２）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＶＬドメイン、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有し又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含む。そのうち、本発明の前記第一の一本鎖Ｆｖと第二の一本鎖Ｆｖとを接続するリンカーペプチドＬ２は、可撓性ペプチドと剛性ペプチドからなる。
【0014】
さらに、前記可撓性ペプチドは、２つ以上のアミノ酸を含み、且つ好ましくは、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｌａ（Ａ）及びＴｈｒ（Ｔ）から選択される。更に好ましくは、前記可撓性ペプチドは、Ｇ残基とＳ残基を含む。最も好ましくは、前記可撓性ペプチドのアミノ酸の構成構造の一般式は、ＧｘＳｙ（ＧＧＧＧＳ）ｚであり、式中、ｘ、ｙ及びｚは、０以上の整数であり、且つｘ＋ｙ＋ｚ≧１である。例えば、一つの好ましい実施例では、前記可撓性ペプチドのアミノ酸配列は、Ｇ２（ＧＧＧＧＳ）３である。
【0015】
さらに、前記剛性ペプチドは、天然ヒト絨毛ゴナドトロピンβのサブユニットカルボキシ末端の第１１８～１４５位のアミノ酸からなる全長配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すように）又はそのトランケーション断片（以下では、ＣＴＰと総称される）に由来する。好ましくは、ＣＴＰ１剛性ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ Ｎ端の１０個のアミノ酸、すなわちＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳを含み、又はＣＴＰ２剛性ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ Ｃ端の１４個のアミノ酸、すなわちＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱを含み、ＣＴＰ３剛性ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ Ｎ端の１６個のアミノ酸、すなわちＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲを含み、ＣＴＰ４剛性ペプチドは、２８個のアミノ酸を含み且つヒト絨毛ゴナドトロピンβのサブユニットの第１１８位から開始し、第１４５位で終止し、すなわちＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱである。
【0016】
本発明の一つの好ましい実施例では、前記剛性ペプチドは、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳであり、すなわちＣＴＰ１剛性ペプチドである。他の好ましい実施方案では、剛性ペプチド配列は、ＣＴＰ２（ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ）、ＣＴＰ３（ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲ）、ＣＴＰ４（ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ）をさらに含む。
【0017】
本発明の一つの好ましい実施例では、前記リンカーペプチドＬ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示され、その可撓性ペプチドのアミノ酸構成は、Ｇ２（ＧＧＧＧＳ）３であり、その剛性ペプチドのアミノ酸構成は、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳであり、すなわちＣＴＰ１剛性ペプチドである。
【0018】
そのうち、二重特異性抗体の第二の一本鎖Ｆｖは、ＣＤ３と特異的に結合し、インビトＦＡＣＳ結合分析測定内に５０ｎＭよりも大きく、又は１００ｎＭよりも大きく、又は３００ｎＭよりも大きく、又は５００ｎＭよりも大きいＥＣ５０値でエフェクター細胞と結合し、更に好ましくは、前記二重特異性抗体の第二の一本鎖Ｆｖは、ヒトＣＤ３と結合できるだけでなく、さらにカニクイザル又はアカゲザルのＣＤ３と特異的に結合することができる。本発明の一つの好ましい実施例では、前記二重特異性抗体は、１３２．３ｎＭのＥＣ５０値でエフェクター細胞と特異的に結合する。
【0019】
好ましくは、前記第二の一本鎖Ｆｖは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、１２及び１３にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列し又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含むＶＨドメイン、及び
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１５及び１６にそれぞれ示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含むＶＬドメイン、を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、１２及び１３にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列し又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含むＶＨドメイン、及び
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１５及び１６にそれぞれ示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列を含むＶＬドメイン、を含む。
【0020】
更に好ましくは、前記第二の一本鎖Ｆｖは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示すＶＨドメイン、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有し又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列、及び
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すＶＬドメイン、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有し又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列、を含む。
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すＶＬドメイン、又は上記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％の類似性を有し又は一つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的置換））を有する配列、を含む。
【0021】
好ましくは、前記第二の一本鎖ＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインは、リンカーペプチドＬ３によって接続され、前記ＶＨ、Ｌ３及びＶＬは、ＶＨ－Ｌ３－ＶＬ又はＶＬ－Ｌ３－ＶＨの順序で配列され、且つ前記リンカーペプチドＬ３のアミノ酸配列は、（ＧＧＧＧＸ）ｎであり、Ｘは、Ｓｅｒ又はＡｌａから選択され、ｎは、１～５の自然数であり、Ｘは、好ましくはＳｅｒであり、ｎは、好ましくは３である。
【0022】
本発明の一つの好ましい実施例では、前記リンカーペプチドＬ３のアミノ酸配列は、（ＧＧＧＧＳ）３であり、他の好ましい実施例方案では、前記リンカーペプチドＬ３のアミノ酸配列は、（ＧＧＧＧＳ）１又は（ＧＧＧＧＳ）２又は（ＧＧＧＧＳ）４又は（ＧＧＧＧＳ）５又は（ＧＧＧＧＡ）１又は（ＧＧＧＧＡ）２又は（ＧＧＧＧＡ）３又は（ＧＧＧＧＡ）４又は（ＧＧＧＧＡ）５をさらに含む。
【0023】
そのうち、本発明の前記Ｆｃ断片は、第二の一本鎖Ｆｖに直接又はリンカーペプチドＬ４によって接続され、且つ前記リンカーペプチドＬ４は、１～２０個のアミノ酸を含み、且つ好ましくは、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｌａ（Ａ）及びＴｈｒ（Ｔ）のうちの複数のアミノ酸から選択され、より好ましくは、前記リンカーペプチドＬ４は、Ｇｌｙ（Ｇ）とＳｅｒ（Ｓ）から選択され、更に好ましくは、前記リンカーペプチドＬ４構成は、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎ＝１、２、３又は４である。本発明の一つの好ましい実施例では、前記Ｆｃ断片は、第二の一本鎖Ｆｖに直接接続される。他の好ましい実施例では、前記Ｆｃ断片は、リンカーペプチドＬ４によって第二の一本鎖Ｆｖに接続され、リンカーペプチドＬ４アミノ酸配列は、（ＧＧＧＧＳ）１又は（ＧＧＧＧＳ）２又は（ＧＧＧＧＳ）３又は（ＧＧＧＧＳ）４を含む。
【0024】
本発明の前記Ｆｃ断片は、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に由来するヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、例えば、いくつかの実施方案では、本発明の前記Ｆｃ断片は、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ及びＩｇＥから選択される重鎖定常領域、特に例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域、更に特にヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域に由来し、且つ、前記Ｆｃ断片は、その由来する天然配列と比べて、一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば、多くとも２０個、多くとも１５個、多くとも１０個、又は多くとも５個の置換、欠失又は付加）を有する。
【0025】
前記Ｆｃ断片のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示され、それは、その由来する天然配列と比べて、ＥＵ番号付けシステムに基づいて決定されるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｎ２９７Ａ／Ｐ３３１Ｓ／Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌという６個のアミノ酸の置換を有し、且つＥＵ番号付けシステムに基づいて決定されるＫ４４７を欠失又は削除した。ＥＵ番号付けシステムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍ．
【0026】
いくつかの好ましい実施方案では、前記Ｆｃ断片が変更され、例えば突然変異され、それによって本発明の前記二重特異性抗体分子の性質を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、エフェクター細胞機能又は補体機能のうちの一つ又はより多くの特性を変更する）。
【0027】
例えば、本発明によって提供される二重特異性抗体は、変更されるエフェクター機能（例えば低減又は解消）を有するアミノ酸の置換、欠失又は付加のＦｃ変異体を含む。抗体のＦｃ領域は、例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ等の複数の重要なエフェクター機能を媒介する。抗体のＦｃ領域におけるアミノ酸残基を置換することによって、エフェクター配位子（例えばＦｃγＲ又は補体Ｃ１ｑ）に対する抗体の親和性を変更し、それによりエフェクター機能を変更する方法は、本分野の既知のものである（例えば、ＥＰ ３８８、１５１Ａ１、ＵＳ ５６４、８２６０、ＵＳ ５６２、４８２１、Ｎａｔｓｕｍｅ Ａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６８：３８６３－３８７２、２００８、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６６：２５７１－２５７５、２００１、Ｌａｚａｒ ＧＡら、ＰＮＡＳ、１０３：４００５－４０１０、２００６、Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬら、ＪＢＣ、２７６：６５９１－６６０４、２００１、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ＪＢら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６７：８８８２－８８９０、２００７、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ＪＢら、Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｅ．Ｒｅｇｕｌ．、４８：１５２－１６４、２００８、Ａｌｅｇｒｅ ＭＬら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：３４６１－３４６８、１９９２、及びＫａｎｅｋｏ Ｅら、Ｂｉｏｄｒｕｇｓ、２５：１－１１、２０１１を参照する）。本発明のいくつかの好ましい実施例では、抗体定常領域上のアミノ酸Ｌ２３５（ＥＵ番号）に対して修飾を行ってＦｃ受容体相互作用を変更し、例えばＬ２３５Ｅ又はＬ２３５Ａである。別の好ましい実施例では、抗体定常領域上のアミノ酸２３４と２３５に対して同時に修飾を行い、例えばＬ２３４ＡとＬ２３５Ａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）（ＥＵ番号）である。
【0028】
例えば、本発明によって提供される二重特異性抗体は、延長される循環半減期を有するアミノ酸の置換、欠失又は付加のＦｃ変異体を含んでもよい。研究により、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ又はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌは、いずれも霊長類動物における抗体の半減期を延長することができることが分かった。新生児受容体（ＦｃＲｎ）との結合親和性が補強されるＦｃ変異体に含まれるより多くの突然変異部位は、中国発明特許ＣＮ ２０１２８００６６６６３．２、ＵＳ ２００５／００１４９３４Ａ１、ＷＯ ９７／４３３１６、ＵＳ ５，８６９，０４６、ＵＳ ５，７４７，０３、ＷＯ ９６／３２４７８を参照してもよい。本発明のいくつかの好ましい実施例では、抗体定常領域上のアミノ酸Ｍ４２８（ＥＵ番号）に対して修飾を行ってＦｃＲｎ受容体の結合親和性を補強し、例えばＭ４２８Ｌである。別の好ましい実施例では、抗体定常領域上のアミノ酸２５０と４２８（ＥＵ番号）に対して同時に修飾を行い、例えばＴ２５０ＱとＭ４２８Ｌ（Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ）である。
【0029】
例えば、本発明によって提供される二重特異性抗体は、低減又は解消できるＦｃグリコシル化を有するアミノ酸の置換、欠失又は付加のＦｃ変異体を含んでもよい。例えば、Ｆｃ変異体は、アミノ酸部位２９７（ＥＵ番号）に正常に存在するＮ－結合グリカンが低減するグリコシル化を含む。Ｎ２９７位グリコシル化は、ＩｇＧの活性に大きな影響を与え、該部位グリコシル化が除去される場合、ＩｇＧ分子ＣＨ２の上半分のコンフォメーションに影響を与え、それによりＦｃγＲｓに対する結合能力を喪失し、抗体に相関する生物活性に影響を与える。本発明のいくつかの好ましい実施例では、ヒトＩｇＧ定常領域上のアミノ酸Ｎ２９７（ＥＵ番号）に対して修飾を行って抗体のグリコシル化を避け、例えばＮ２９７Ａである。
【0030】
例えば、本発明によって提供される二重特異性抗体は、電荷異質性を解消するアミノ酸の置換、欠失又は付加のＦｃ変異体を含んでもよい。エンジニアリング細胞発現プロセス中に発生する複数の翻訳後修飾は、いずれも単クローン性抗体の電荷異質性を引き起こし、ＩｇＧ抗体Ｃ末端のリジンの不均一性は、そのうちの一個の主要な原因であり、重鎖Ｃ端のリジンＫは、抗体の生産プロセス中に一定の比率の欠失が現れる可能性があり、それにより電荷異質性を引き起こし、それにより抗体の安定性、有效性、免疫原性又は薬代動力学に影響を与える。本発明のいくつかの好ましい実施例では、ＩｇＧ抗体Ｃ末端のＫ４４７（ＥＵ番号）を除去又は欠失し、抗体の電荷異質性を解消し、発現生成物の均一性を向上させる。
【0031】
野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が含まれる二重特異性抗体と比べて、本発明によって提供される二重特異性抗体に含まれるＦｃ断片は、ヒトＦｃγＲｓ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩａ）とＣ１ｑの少なくとも一つに対して低減する親和性が現れ、減少されるエフェクター細胞機能又は補体機能を有する。例えば、本発明の一つの好ましい実施例では、二重特異性抗体に含まれるＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ１に由来し、且つＬ２３４ＡとＬ２３５Ａ置換（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を有し、ＦｃγＲＩに対して低減する結合能力が現れ、なお、本発明によって提供される二重特異性抗体に含まれる前記Ｆｃ断片は、他の一つ又は複数の特性（例えば、ＦｃＲｎ受容体との結合能力、抗体グリコシル化又は抗体電荷異質性等）を変更させるアミノ酸置換を含んでもよい。例えば、本発明の一つの好ましい実施例では、前記Ｆｃ断片のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示され、それは、その由来する天然配列と比べて、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｔ２５０Ｑ／Ｎ２９７Ａ／Ｐ３３１Ｓ／Ｍ４２８Ｌのアミノ酸置換を有し、且つＫ４４７が欠失又は削除される。
【0032】
本発明の前記二重特異性抗体分子は、二本の同じポリペプチド鎖からＦｃ断片ヒンジ領域の鎖間ジスフィルド結合によって四価ホモ二量体を形成し、各本のポリペプチド鎖は、Ｎ端からＣ端まで順に抗－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、リンカーペプチド、抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖ及びＦｃ断片からなる。
本発明一つの好ましい実施例では、前記二重特異性抗体は、ヒトＢＣＭＡとＣＤ３に結合し、そのアミノ酸配列は、以下の通りである。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される配列、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される配列と比べて、一つ又は複数の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５個の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列。
本発明一つの好ましい実施例では、前記二重特異性抗体は、ヒトＢＣＭＡとＣＤ３に結合し、そのアミノ酸配列は、以下の通りである。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される配列、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される配列と比べて、一つ又は複数の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５個の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列。
【0033】
いくつかの好ましい実施方案では、（２）に記載の置換は、保存置換である。
【0034】
本発明の第二の方面は、上記二重特異性抗体をコードするＤＮＡ分子を提供する。
【0035】
本発明の好ましい実施例では、上記二重特異性抗体をコードするＤＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すようなヌクレオシド配列である。
【0036】
本発明の第三の方面は、上記ＤＮＡ分子を含むベクターを提供する。
【0037】
本発明の第四の方面は、上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、原核細胞、酵母又は哺乳動物細胞を含み、好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞又は他の哺乳動物細胞であり、さらに好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【0038】
本発明の第五の方面は、医薬組成物を提供する。前記組成物は、上記二重特異性抗体及び薬用賦形剤及び／又はベクター及び／又は希釈剤を含む。
【0039】
本発明の第六の方面はさらに、本発明の前記二重特異性抗体を調製する方法を提供する。それは、
（ａ）二重特異性抗体の融合遺伝子を取得し、二重特異性抗体の発現ベクターを構築するステップと、
（ｂ）遺伝子工学方法によって上記発現ベクターを宿主細胞内にトランスフェクトするステップと、
（ｃ）前記二重特異性抗体の生成が許可される条件下で上記宿主細胞を培養するステップと、
（ｄ）生成される前記抗体を分離、精製するステップと、を含む。
（ａ）二重特異性抗体の融合遺伝子を取得し、二重特異性抗体の発現ベクターを構築するステップと、
（ｂ）遺伝子工学方法によって上記発現ベクターを宿主細胞内にトランスフェクトするステップと、
（ｃ）前記二重特異性抗体の生成が許可される条件下で上記宿主細胞を培養するステップと、
（ｄ）生成される前記抗体を分離、精製するステップと、を含む。
【0040】
そのうち、ステップ（ａ）における前記発現ベクターは、プラスミド、細菌及び病毒のうちの一つ又は複数から選択され、好ましくは、前記発現ベクターは、プラスミドであり、更に好ましくは、前記発現ベクターは、ＰＣＤＮＡ３．１であり、
【0041】
そのうち、ステップ（ｂ）は、遺伝子工学方法によって、構築されるベクターを宿主細胞内にトランスフェクトし、前記宿主細胞は、原核細胞、酵母又は哺乳動物細胞を含み、好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞又は他の哺乳動物細胞であり、さらに好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【0042】
そのうち、ステップ（ｄ）は、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィとイオン交換、疏水クロマトグラフィ又はモレキュラーシーブ方法を含む通常の免疫グロブリン精製方法によって、前記二重特異性抗体を分離し、精製する。
【0043】
本発明の第七の方面は、前記二重特異性抗体が形質細胞障害から選択され、ＢＣＭＡ発現に関する他のＢ細胞障害と自己免疫性疾患を治療し又は改善するための薬物における用途を提供する。そのうち、前記形質細胞障害は、多発性骨髄腫、形質細胞腫、形質細胞白血病、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髓外形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫、重鎖病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン病及び鬱滞性多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。
【0044】
本発明に開示される技術的解決手段は、以下の有益な技術的效果を取得した。
１、本発明によって提供される二重特異性抗体は、弱発現又は低発現ＢＣＭＡの正常細胞と結合しにくく、非特異的殺傷を減少するが、過発現又は高発現ＢＣＭＡの細胞に対する結合特異性が著しく低下せず、良好なインビボ殺傷效果を示している。これより、標的抗原が腫瘍細胞にしか発現せず、又は本発明の前記二重特異性抗体が過発現標的抗原の腫瘍細胞のみと特異的に結合している場合、免疫エフェクター細胞の制限性が標的細胞組織内にのみアクティブ化されることにより、前記二重特異性抗体による正常細胞への非特異的殺傷及び細胞因子の随伴放出が最小限に抑えられ、臨床治療におけるその毒副作用を低減させることができることが分かった。
２、本発明によって提供される二重特異性抗体によって選択される抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖは、微弱な結合親和性（ＥＣ５０値が５０ ｎＭよりも大きく、又は１００ｎＭよりも大きく、又は３００ｎＭよりも大きく、又は５００ｎＭよりも大きい）でエフェクター細胞と特異的に結合し、なお、抗－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖとＦｃの間に埋め込まれており、且つそのＮ端に位置するリンカーペプチドＬ３に含まれるＣＴＰ剛性ペプチドとそのＣ端に位置するＦｃ断片は、いずれも抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖの抗原結合ドメインを部分的に「被覆」又は「遮蔽」し、このような立体効果は、それをより微弱な結合親和性（例えば１μＭよりも大きい）でＣＤ３と結合させ、これは、それがＴ細胞に対する活性化刺激能力を弱めるため、細胞因子の過度放出を制限するため、より高い安全性を有する。
３、本発明によって提供される二重特異性抗体は、二価抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖを創造的に採用し、これは、前記二重特異性抗体が配置設計上で従来の技術で一般的に採用される異種ダイマー型（含まれる抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖが一価である）の非対称構造を回避するため、重鎖間ミスマッチの問題も存在せず、下流精製ステップを簡略化し、且つ意外に、インビト細胞結合試験内に抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖとＴ細胞との非特異的結合が観察されておらず、且つ細胞アクティブ化程度（ＩＬ－２等の細胞因子の放出）が安全、効果的な範囲内に制御され、すなわち本発明によって採用される二価抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖ構造は、Ｔ細胞の過剰活性化を非抗原依存的に誘導することを引き起こしておらず、二価抗－ＣＤ３ドメインを含む他の二重特異性抗体に対して、Ｔ細胞が制御不能に過剰アクティブ化されることは、一般的であるため、抗－ＣＤ３二重特異性抗体が設計される時に、一般的には二価抗－ＣＤ３構造の導入を避ける。
４、本発明によって提供される二重特異性抗体に含まれる修飾されるＦｃ断片は、ＦｃγＲ結合能力を有せず、ＦｃγＲによって媒介されるＴ細胞の全身的なアクティブ化を避けるため、免疫エフェクター細胞が標的細胞組織内のみに制限的にアクティブ化されることを許可する。
５、本発明によって提供される二重特異性抗体は、ホモ二量体型であり、重鎖及び軽鎖ミスマッチの問題が存在せず、下流生産プロセスが安定的で、精製ステップが簡単で効率的で、発現生成物が均一で、且つその物理化学特性とインビボ安定性がいずれも著しく向上する。
１、本発明によって提供される二重特異性抗体は、弱発現又は低発現ＢＣＭＡの正常細胞と結合しにくく、非特異的殺傷を減少するが、過発現又は高発現ＢＣＭＡの細胞に対する結合特異性が著しく低下せず、良好なインビボ殺傷效果を示している。これより、標的抗原が腫瘍細胞にしか発現せず、又は本発明の前記二重特異性抗体が過発現標的抗原の腫瘍細胞のみと特異的に結合している場合、免疫エフェクター細胞の制限性が標的細胞組織内にのみアクティブ化されることにより、前記二重特異性抗体による正常細胞への非特異的殺傷及び細胞因子の随伴放出が最小限に抑えられ、臨床治療におけるその毒副作用を低減させることができることが分かった。
２、本発明によって提供される二重特異性抗体によって選択される抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖは、微弱な結合親和性（ＥＣ５０値が５０ ｎＭよりも大きく、又は１００ｎＭよりも大きく、又は３００ｎＭよりも大きく、又は５００ｎＭよりも大きい）でエフェクター細胞と特異的に結合し、なお、抗－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖとＦｃの間に埋め込まれており、且つそのＮ端に位置するリンカーペプチドＬ３に含まれるＣＴＰ剛性ペプチドとそのＣ端に位置するＦｃ断片は、いずれも抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖの抗原結合ドメインを部分的に「被覆」又は「遮蔽」し、このような立体効果は、それをより微弱な結合親和性（例えば１μＭよりも大きい）でＣＤ３と結合させ、これは、それがＴ細胞に対する活性化刺激能力を弱めるため、細胞因子の過度放出を制限するため、より高い安全性を有する。
３、本発明によって提供される二重特異性抗体は、二価抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖを創造的に採用し、これは、前記二重特異性抗体が配置設計上で従来の技術で一般的に採用される異種ダイマー型（含まれる抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖが一価である）の非対称構造を回避するため、重鎖間ミスマッチの問題も存在せず、下流精製ステップを簡略化し、且つ意外に、インビト細胞結合試験内に抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖとＴ細胞との非特異的結合が観察されておらず、且つ細胞アクティブ化程度（ＩＬ－２等の細胞因子の放出）が安全、効果的な範囲内に制御され、すなわち本発明によって採用される二価抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖ構造は、Ｔ細胞の過剰活性化を非抗原依存的に誘導することを引き起こしておらず、二価抗－ＣＤ３ドメインを含む他の二重特異性抗体に対して、Ｔ細胞が制御不能に過剰アクティブ化されることは、一般的であるため、抗－ＣＤ３二重特異性抗体が設計される時に、一般的には二価抗－ＣＤ３構造の導入を避ける。
４、本発明によって提供される二重特異性抗体に含まれる修飾されるＦｃ断片は、ＦｃγＲ結合能力を有せず、ＦｃγＲによって媒介されるＴ細胞の全身的なアクティブ化を避けるため、免疫エフェクター細胞が標的細胞組織内のみに制限的にアクティブ化されることを許可する。
５、本発明によって提供される二重特異性抗体は、ホモ二量体型であり、重鎖及び軽鎖ミスマッチの問題が存在せず、下流生産プロセスが安定的で、精製ステップが簡単で効率的で、発現生成物が均一で、且つその物理化学特性とインビボ安定性がいずれも著しく向上する。
【0045】
【0046】
本発明において、特に説明されていない限り、本明細書で使用される科学ｔ技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。本発明で使用される抗体又はその断片は、本分野の既知の通常技術、例えばアミノ酸欠失、挿入、置換、増加、及び／又は組み換え及び／又は他の修飾方法を単独で又は組み合わせて使用してさらに修飾することができる。抗体のアミノ酸配列に基づいてそのＤＮＡ配列内にこのような修飾を導入する方法は、当業者にとって周知のことであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、分子クローン：実験マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．である。言及された修飾は、好ましくは核酸レベルで行われる。また、本発明をよりよく理解するために、以下では、関連用語の定義と解釈を提供する。
【0047】
「ＢＣＭＡ」は、Ｂ細胞成熟抗原であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーに属し、成熟Ｂリンパ球内に優先的に発現し、且つ形質芽細胞（すなわち、形質細胞前駆体）及び形質細胞の表面に発現する。脾臓、リンパ節、胸腺、副腎及び肝臓内でいずれもＢＣＭＡのＲＮＡを検出でき、複数のＢ細胞株が成熟した後、そのＢＣＭＡ ｍＲＮＡのレベルも増加する。ＢＣＭＡは、白血病、リンパ腫（例えばホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、自己免疫性疾患（例えば全身性エリテマトーデス）等の複数の疾患に関係があり、このため、相関Ｂ細胞疾患に関する潜在的な標的とすることができる。ＢＣＭＡ標的点に対する適応症は、他の従来の技術内に発見された及び将来に発見される相関疾患又は病症をさらに含む。該用語は、ＢＣＭＡの任意の変異体、アイソフォーム、及び種ホモログをさらに含み、それは、細胞－腫瘍細胞を含む－自然に発現され、又はＢＣＭＡ遺伝子又はｃＤＮＡでトランスフェクトされる細胞によって発現される。
【0048】
ＣＤ３分子は、Ｔ細胞膜上の重要な分化抗原であり、成熟Ｔ細胞の特徴的なマーカーであり、６本のペプチド鎖からなり、非共有結合でＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）とＴＣＲ－ＣＤ３複合体を構成し、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体の細胞基質内の組み立てに関与するだけでなく、さらに各ポリペプチド鎖細胞基質領域の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）によって抗原刺激信号を伝達する。ＣＤ３分子の主要な機能は、ＴＣＲ構造を安定化し、Ｔ細胞活性化信号を伝達し、ＴＣＲが抗原を特異的に認識し且つ結合した後、ＣＤ３が信号をＴ細胞基質内に形質導入し、Ｔ細胞活性化を誘導する第一の信号とすることに参与し、Ｔ細胞抗原認識と免疫応答生成プロセスにおいて極めて重要な役割を有することである。
【0049】
「ＣＤ３」とは、Ｔ細胞受容体複合体の一部として、三つの異なる鎖ＣＤ３ε、ＣＤ３δとＣＤ３γからなるものである。ＣＤ３がＴ細胞上で例えば抗ＣＤ３抗体による固定化作用によって生成した集中（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）によってもたされるＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体によって媒介される活性化と類似しているが、ＴＣＲクローンの特異性に依存しない。ほとんどの抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３ε鎖を認識する。本発明のＴ細胞表面受容体ＣＤ３を特異的に認識する第二の機能ドメインは、ＣＤ３抗体を特異的に認識できる限り、具体的な制限を受けず、例えば、以下の特許に言及されたＣＤ３抗体であるが、これらに限定されない。ＵＳ７，９９４，２８９、ＵＳ６，７５０，３２５、ＵＳ６，７０６，２６５、ＵＳ５，９６８，５０９、ＵＳ８，０７６，４５９、ＵＳ７，７２８，１１４、ＵＳ２０１００１８３６１５。好ましくは、本発明で使用される抗ヒトＣＤ３抗体は、カニクイザル及び／又はアカゲザルと交差反応性を有し、例えば、ＷＯ ２０１６１３０７２６、ＵＳ ２００５０１７６０２８、ＷＯ ２００７０４２２６１又はＷＯ ２００８１１９５６５であるが、これらに限定されない特許中に言及された抗ヒトＣＤ３抗体である。該用語は、任意のＣＤ３変異体、アイソフォーム、誘導体及び種ホモログをさらに含み、それは、細胞によって自然に発現され、又は前述の鎖をコードする遺伝子又はｃＤＮＡでトランスフェクトされる細胞に発現される。
【0050】
「抗体」という用語は、具体的には、単クローン性抗体、ポリクロナール抗体及び抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体とヒト化抗体を含む。「抗原結合断片」は、任意の既知の技術、例えば酵素溶解、ペプチド合成及び組み換え技術によって提供される断片を含む。いくつかの抗原結合断片は、親抗体分子の抗原結合特異性を保持する完全な抗体部分からなる。例えば、抗原結合断片は、既知の特定抗原と結合することが知られている抗体の少なくとも一つの可変領域（重鎖又は軽鎖可変領域）又は一つ又は複数のＣＤＲを含んでもよい。適正な抗原結合断片の実例は、二重特異性抗体と一本鎖分子及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、ＦａｂｃとＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、単独の抗体軽鎖、単独の抗体重鎖、抗体鎖又はＣＤＲと他のタンパク質との間のキメラ融合物、タンパク質骨格、重鎖単体又はダイマー、軽鎖単体又はダイマー、一つの重鎖と一つの軽鎖からなるダイマー、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインによるもの、又はＷＯ２００７０５９７８２に記載の一価抗体、ヒンジ領域上のジスフィルド結合によって接続される二つのＦａｂ断片を含む二価断片、基本的にＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、基本的に抗体シングルアームのＶＬとＶＨドメインからなるＦｖ断片、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、３４１：５４４－５４）、基本的にＶＨドメインからなり、ドメイン抗体とも呼ばれるもの（Ｈｏｌｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３、２１（１１）：４８４－９０）、又はナノ体（Ｒｅｖｅｔｓら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ、５（１）：１１１－２４）、分離の相補性決定領域（ＣＤＲ）等を含むが、これらに限定されない。すべての抗体アイソタイプは、抗原結合断片を生成するために用いることができる。また、抗原結合断片は、非抗体タンパク質フレームワークを含んでもよく、それは、ポリペプチド断片を既定の関心のある抗原（例えばタンパク質骨格）の親和性が付与される配向にうまく組み込むことができる。完全抗体の酵素的切断又は化学的切断によって、抗原結合断片を組換えて生成し又は生成することができる。「抗体又はその抗原結合断片」という用語は、既定の抗原結合断片が、フレーズに言及された抗体の一つ又は複数のアミノ酸断片に組み込まれていることを示すために用いることができる。
【0051】
「超可変領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「相補性決定領域」という用語は、抗原結合を担当する抗体アミノ酸残基であり、非連続的なアミノ酸配列である。ＣＤＲ領域配列は、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａとＡｂＭ方法で定義されてもよく、又は当分野でよく知られている任意のＣＤＲ領域の配列によって決定される方法によって同定される可変領域内のアミノ酸残基である。例えば、超可変領域は、以下のアミノ酸残基を含む。配列対比によって画定される「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基であり、例えば、軽鎖可変ドメインの２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）と８９－９７（Ｌ３）位の残基と重鎖可変ドメインの３１－３５（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）と９５－１０２（Ｈ３）位の残基、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫目的物のタンパク質配列）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．を参照する。及び／又は構造に基づいて画定される「超可変ループ」（ＨＶＬ）に由来する残基であり、例えば、軽鎖可変ドメインの２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）と９１－９６（Ｌ３）位の残基と重鎖可変ドメインの２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）と９６－１０１（Ｈ３）位の残基、ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１－９１７、１９８７を参照する。「フレームワーク」残基又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。いくつかの実施方案では、本発明の抗体又はその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、好ましくはＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴ番号付けシステムによって決定される。当業者は、配列自体を超える任意の実験データに依存することなく、各種のシステムを任意の可変ドメイン配列に明示的に付与することができる。例えば、既定抗体のＫａｂａｔ残基の番号付けシステム方式は、抗体配列と各種の「標準」番号配列との相同性領域を対比することによって決定することができる。本明細書によって提供される配列の番号に基づき、配列リストにおける任意の可変領域配列の番号付けシステム方式が完全に当業者の通常技術の範囲内にあることを決定する。
【0052】
「一本鎖Ｆｖ抗体」（又は「ｓｃＦｖ抗体」）という用語は、抗体のＶＨとＶＬドメインを含む抗体断片であり、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって接続される重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の組み換えタンパク質であり、リンかーは、これらの二つのドメインを架橋して抗原結合部位を形成させ、リンカー配列は、一般的には可撓性ペプチドからなり、例えば、Ｇ２（ＧＧＧＧＳ）３であるがそれに限られない。ｓｃＦｖの大きさは、一般的には一つの完全な抗体の１／６である。一本鎖抗体は、好ましくは一つのヌクレオシド鎖によってコードされる一本のアミノ酸鎖配列である。ｓｃＦｖ総説に対して、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ （１９９４）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（単クローン性抗体薬理学）、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇとＭｏｏｒｅ編集長、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第２６９－３１５ページを参照してもよい。国際特許出願公開番号ＷＯ ８８／０１６４９と米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２６０，２０３号を参照してもよい。
【0053】
「Ｆａｂ断片」という用語は、一本の軽鎖と一本の重鎖のＣＨ１及び可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスフィルド結合を形成することができない。「Ｆａｂ抗体」の大きさは、完全な抗体の１／３であり、それは、一つの抗原結合部位のみを含む。
【0054】
「Ｆａｂ’断片」という用語は、一本の軽鎖と一本の重鎖のＶＨドメインとＣＨ１ドメイン及びＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の定常領域部分を含む。
【0055】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、二本の軽鎖と二本の重鎖のＶＨドメインとＣＨ１ドメイン及びＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の定常領域部分を含み、それによって二本の重鎖の間に鎖間ジスフィルド結合を形成する。このため、Ｆ（ａｂ′）２断片は、二本の重鎖間のジスフィルド結合によって一緒に保持される二個のＦａｂ′断片からなる。
【0056】
「Ｆｃ」領域という用語は、抗体重鎖定常領域断片であり、それは、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【0057】
「Ｆｖ領域」という用語は、重鎖と軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域が欠けており、は、完全な抗原認識と結合部位を含む最小断片である。
【0058】
「Ｆｄ断片」という用語は、一本の重鎖のＣＨ１及び可変領域からなり、Ｆａｂ断片の軽鎖を除去した後に残った重鎖部分である。
【0059】
「ジスフィルド結合安定性タンパク（ｄｓＦｖ）」という用語は、ＶＨとＶＬ領域に一つのシステイン突然変異点をそれぞれ導入し、それによりＶＨとＶＬとの間にジスフィルド結合を形成して構造安定性を実現する。
【0060】
「リンカーペプチド」という用語は、二つのポリペプチドを接続するペプチドであり、そのうち、前記リンカーペプチドは、二つの免疫グロブリン可変領域又は一つの可変領域であってもよい。リンカーペプチドの長さは、０－３０個のアミノ酸又は０－４０個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施方案では、リンカーペプチドは、０－２５、０－２０又は０－１８個のアミノ酸長であってもよい。いくつかの実施方案では、リンカーペプチドは、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５個のアミノ酸長以下のペプチドであってもよい。他の実施方案では、リンカーペプチドは、０－２５、５－１５、１０－２０、１５－２０、２０－３０又は３０－４０個のアミノ酸長であってもよい。他の実施方案では、リンカーペプチドは、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸長であってもよい。リンカーペプチドは、当業者が既知のものである。リンカーペプチドの調製は、本分野の任意の方法を採用してもよい。例えば、リンカーペプチドは、合成由来のものであってもよい。
【0061】
「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部ヒンジ領域、中間ヒンジ領域、及び／又は下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はその変異体又は断片のうちの少なくとも一つを含む。例えば、本出願で使用される抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを有するポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、少なくとも一部のヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを有するポリペプチド、ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、少なくとも一部のヒンジドメイン及びＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖、又はＣＨ１ドメイン、少なくとも一部のヒンジ構造、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖を含んでもよい。別の実施例では、本出願のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖を含む。また、本出願で使用される抗体は、少なくとも一部のＣＨ２ドメイン（例えば、全て又は一部のＣＨ２ドメイン）が欠ける可能性がある。前述したように、当業者が理解すべきことは、重鎖定常領域は、変更される可能性があり、それによってそれらは、アミノ酸配列で、自然に存在する免疫グロブリン分子と異なる。
【0062】
「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記軽鎖定常領域は、定常ｋａｐｐａドメインと定常ｌａｍｂｄａドメインのうちの少なくとも一つを含む。
【0063】
「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ基末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第一の（ほとんどがアミノ基末端）定常領域を含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに近接し且つ免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ基末端である。
【0064】
「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接続する重鎖分子の部分を含む。該ヒンジ領域は、約２５個の残基を含み且つ可撓性のものであり、それにより二つのＮ－末端抗原結合領域を独立して移動させる。ヒンジ領域は、上部、中部、及び下部ヒンジドメインという三つの異なるドメインに分けられてもよい（Ｒｏｕｘ ＫＨら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：４０８３、１９９８）。
【0065】
「ジスフィルド結合」という用語は、二つの硫原子の間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、チオール基を含み、該チオール基は、第二のチオール基とジスフィルド結合又は架橋を形成することができる。ほとんどの自然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１とＣＫ領域は、ジスフィルド結合によって接続され且つ二つの重鎖は、二つのジスフィルド結合によって接続され、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの使用に対応する２３９と２４２箇所（位置２２６又は２２９、ＥＵ番号付けシステム）において接続される。
【0066】
「結合」は、抗原上の特定表位とそれに対応する抗体との間の親和性相互作用を定義し、一般的には「特異性認識」と理解されてもよい。「特異性認識」の意味は、本発明の二重特異性抗体が標的抗原以外の任意のポリペプチドと交差反応せず、又は基本的に交差反応しないこと、特異性の程度が免疫学技術によって判断されてもよく、免疫ブロット、免疫親和性クロマトグラフィ、フローサイトメトリ等を含むが、これらに限定されないことである。本発明において、特異性認識は、好ましくはフローサイトメトリによって決定され、具体的な場合に特異性認識の標準は、当業者がそれが把握している本分野の常識によって判断されてもよい。
【0067】
「二重特異性抗体」という用語は、本発明の二重特異性抗体であり、例えば抗Ｈｅｒ２抗体又はその抗原結合断片は、誘導化し又は別の機能性分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えばＴＡＡ、細胞因子及び細胞表面受容体）に接続して少なくとも二つの異なる結合部位又は標的分子と結合する二重特異性分子を生成する。本発明の二重特異性分子を作成するために、本発明の抗体を一つ又は複数の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチド又は結合模擬物に機能的に接続し（例えば化学カップリング、遺伝子融合、非共价結合又は他の方式によって）、それにより二重特異性分子を生成することができる。例えば、「二重特異性抗体」は、得られる抗体が二個の異なる抗原を認識するように、二つの可変ドメイン又はｓｃＦｖ単位を含むことである。本分野の既知の二重特異性抗体の多くの異なる形式と用途（Ｃｈａｍｅｓ Ｐら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．、１２：．２７６、２００９、Ｓｐｉｅｓｓ Ｃら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６７：９５－１０６、２０１５）。
【0068】
「ｈＣＧ－βカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）」という用語は、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβ－サブユニットカルボキシ末端に由来する一セグメントの短ペプチドである。生殖に相関する四種類のポリペプチド類ホルモン卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、同じα－サブユニットとそれぞれ特異的なβ－サブユニットを含む。他の三種類のホルモンと比べて、ｈＣＧのインビボ半減期が明らかに延長しており、それは、主にそのβ－サブユニット上に特有のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）に由来する。ＣＴＰは、３７個のアミノ酸残基を含み、それは、４つのＯ－グリコシル化部位を有し、糖側鎖末端は、シアル酸残基である。マイナス帯電で、高度にシアリル化するＣＴＰは、腎臓のそれに対する除去作用に抵抗し、それによりタンパクのインビボの半減期を延長することができる（Ｆａｒｅｓ ＦＡら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４３０４－４３０８、１９９２）。
【0069】
「グリコシル化」という用語は、オリゴ糖（接続される２つ以上の単糖、例えば接続される２個から約１２個の単糖を含む炭水化合物）が付着して糖タンパク質を形成することを意味する。オリゴ糖側鎖は、一般的にはＮ－又はＯ－接続によって糖タンパクの骨格に接続される。本明細書に開示される抗体のオリゴ糖は、一般的には、Ｎ－接続のオリゴ糖として、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに接続される。「Ｎ－接続のグリコシル化」は、炭水化合物類の部分が糖タンパク質鎖のアスパラギン残基に接続されることである。例えば、当業者は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤのＣＨ２ドメインにおける、残基２９７にＮ－接続のグリコシル化に役立つ各単一部位を認識することができる。
【0070】
ホモ抗体は、他方で、本発明の抗体に含まれる重鎖と軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸配列は、本明細書に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列と相同性であり、且つその中に記載の抗体は、本発明に記載の、例えばＨｅｒ２×ＣＤ３二重特異性抗体の所望の機能的特性を保持している。
【0071】
保存修飾を有する抗体は、「保存修飾」という用語は、アミノ酸修飾が該アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響せず又は変更しないことを意味する。このような保存修飾は、アミノ酸の置換、付加及び欠失を含む。修飾は、本分野の既知の標準技術、例えば定点突然変異誘発とＰＣＲ媒介の利点によって、本発明の抗体内に導入することができる。保存アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることを意味する。本分野では、類似する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーについて、詳しく説明されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、同一の側鎖ファミリーに由来の他のアミノ酸残基で本発明の抗体のＣＤＲ領域における一つ又は複数のアミノ酸残基を置換することができる。
【0072】
新生児受容体（ＦｃＲｎ）との結合親和性が変更するＦｃ変異体は、ここで使用される「ＦｃＲｎ」は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合する少なくとも一部がＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパクである。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サルを含むが、これらに限定されない任意の生物に由来することができる。機能性ＦｃＲｎタンパクは、重鎖と軽鎖とよく呼ばれる二本のポリペプチドを含み、軽鎖は、β－２－ミクログロブリンであり、重鎖は、ＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。
【0073】
本発明は、ＦｃＲｎへの結合が調節された抗体（調節は、結合の増加及び低減を含む）に関する。例えば、ある場合に、増加する結合は、細胞が抗体を再循環させ、且つそれによって、例えば治療抗体の半減期を延長する。ある場合、ＦｃＲｎ結合を低減させることは、必要にかなうものであり、例えば放射線マーカーを含む診断抗体又は治療抗体として使用される。また、ＦｃＲｎへの結合が増加を示すとともに、他のＦｃ受容体、例えばＦｃγＲｓへの結合が変更される抗体は、本発明に用いることができる。
【0074】
本出願は、ＦｃＲｎへの結合力を調節するアミノ酸修飾を含む抗体に関する。特別な意味を有するのは、比較的に低いｐＨで、ＦｃＲｎへの結合親和性が増加を示し、より高いｐＨで、結合が、基本的に変更される、Ｆｃ領域を最小限に含む抗体又はその機能的変異体を示さない。
【0075】
新生児受容体（ＦｃＲｎ）との結合親和性が補強されるＦｃ変異体は、ＩｇＧの血漿半減期がＦｃＲｎとの結合に依存し、一般的にはｐＨ６．０で結合し、ｐＨ７．４（血漿ｐＨ）で解離する。両者の結合部位への検討により、ＩｇＧ上のＦｃＲｎと結合する部位をｐＨ６．０で結合能が増加するように改造する。ＦｃＲｎ結合に重要なヒトＦｃγドメインのいくつかの残基の突然変異は、血清半減期を増加させることができることが証明された。Ｔ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｖ３０８、Ｅ３８０、Ｍ４２８及びＮ４３４（ＥＵ番号）における突然変異は、ＦｃＲｎ結合親和性を増加させ又は低減させることができることが報告されている（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ＤＣら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：７１５－７２５、２００７）。韓国特許番号ＫＲ１０－１０２７４２７は、増加するＦｃＲｎ結合親和性を有するトラスツズマブ（ハーセプチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）変異体を開示し、且つこれらの変異体は、２５７Ｃ、２５７Ｍ、２５７Ｌ、２５７Ｎ、２５７Ｙ、２７９Ｑ、２７９Ｙ、３０８Ｆ及び３０８Ｙから選択される一つ又は複数のアミノ酸修飾を含む。韓国特許公開番号ＫＲ ２０１０－００９９１７９は、ベバシズマブ（アバスチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）変異体を提供し、且つこれらの変異体は、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４Ｓ及びＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓに含まれるアミノ酸修飾によって増加するインビボ半減期を示す。なお、ＨｉｎｔｏｎらもＴ２５０ＱとＭ４２８Ｌ２の変異体がそれぞれＦｃＲｎとの結合を３と７倍増加させることを発見した。同時に２つの部位を突然変異する場合、結合が２８倍増加する。アカゲザルのインビボで、Ｍ４２８Ｌ又はＴ２５０ＱＭ／４２８Ｌ突然変異体は、血漿半減期が２倍増加することを示す（Ｈｉｎｔｏｎ ＰＲら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７６：３４６－３５６、２００６）。より多くの、新生児受容体（ＦｃＲｎ）との結合親和性が補強されるＦｃ変異体に含まれる突然変異部位は、中国発明特許ＣＮ ２０１２８００６６６６３．２を参照してもよい。なお、研究により、五種類のヒト化抗体のＦｃセグメントに対してＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ突然変異を行うことは、ＦｃとＦｃＲｎとの相互作用を改善するだけでなく、さらにその後のインビボ薬物動態学試験において、皮下注射投薬により、Ｆｃ突然変異抗体が野生型抗体と比べて薬物動態学パラメータが改善され、例えばインビボ暴露量の増加、除去率の低減、皮下生体利用性の向上が発見された（Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ Ａら、ＭＡｂｓ．Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ、４：２６７－２７３、２０１２）。
【0076】
本発明の抗体とＦｃＲｎとの親和性の補強を引き起こすことができる他の突然変異点は、２２６、２２７、２３０、２３３、２３９、２４１、２４３、２４６、２５９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２７６、２８４、２８５、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９４、２９８、２９９、３０１、３０２、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１５、３１７、３２０、３２２、３２５、３２７、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４２、３４３、３４５、３４７、３５０、３５２、３５４、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３６２、３６９、３７０、３７１、３７５、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０３、４０４、４０８、４１１、４１２、４１４、４１５、４１６、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２４、４２６、４３３、４３８、４３９、４４０、４４３、４４４、４４５、４４６のアミノ酸修飾を含むが、これらに限定されず、そのうち、Ｆｃ領域においてアミノ酸の番号は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスの番号である。
【0077】
ＦｃＲｎとの結合親和性が補強されるＦｃ変異体は、他のすべての公知のアミノ酸修飾部位及びまだ発見されていないアミノ酸修飾部位をさらに含む。
【0078】
選択可能な実施形態では、ＩｇＧ変異体を最適化してそれに増加し又は低減するＦｃＲｎ親和性、及び増加し又は低減するヒトＦｃγＲを備えさせ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びそれらの対立遺伝子変異を含むＦｃγＲＩＩＩｂ親和性を含むが、これらに限定されない。
【0079】
優先的に、ＩｇＧ変異体のＦｃ配位子特異性は、その治療的応用を決定する。所定ＩｇＧ変異体が治療するための目的は、標的抗原のエピトープ又は形式、及び治療対象の疾患又は適応症に依存する。ほとんどの標的と適応症にとって、補強されるＦｃＲｎ結合は、より好ましく、補強されるＦｃＲｎ結合は、血清半減期の延長を引き起こすことができるためである。比較的に長い血清半減期は、治療時に比較的に低い頻度と剤量で投薬することを許可する。反復投薬を必要とする適応症を反応させるために該治療剤を適用する場合、このような特性は、特に好ましい。いくつかの標的と適応症にとって、変異体Ｆｃが増加する除去又は低減する血清半減期を有することが必要な場合、例えば、Ｆｃポリペプチドがイメージング剤又は放射線治療剤として使用される場合、低減するＦｃＲｎ親和性は、特に好ましい。
【0080】
半減期を延長するＦｃ変更は、本明細書に記載の「半減期を延長するＦｃ変更」とは、同じＦｃポリペプチドを含むが、変更された類似するＦｃタンパク質を含まない半減期と比べて、Ｆｃポリペプチド鎖において、変更されたＦｃポリペプチド鎖のタンパク質を含むインビボ半減期を延長する変更である。前記変更は、二重特異性抗体の一部とするＦｃポリペプチド鎖に含まれてもよい。変更Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（第２５０位のスレオニンがグルタミンに変更され、第２５２位のメチオニンがチロシンに変更され、第２５４位のセリンがスレオニンに変更され、第２５６位のスレオニンがグルタミン酸に変更され、ＥＵ番号に基づいて番号を付ける）は、半減期を延長するＦｃ変更であり、且つ連合し、単独し又は任意に組み合わせて使用することができる。これらの変更及び他のいくつかの変更は、米国特許第７，０８３，７８４号に詳細に記述されている。米国特許第７，０８３，７８４号は、このような変更を引用の方式で本明細書に組み込む。
【0081】
同様に、Ｍ４２８ＬとＮ４３４Ｓは、半減期を延長するＦｃ変更であり、且つ連合し、単独し又は任意に組み合わせて使用することができる。これらの変更及び他のいくつかの変更は、米国特許出願公開第２０１０／０２３４５７５号と米国特許第７，６７０，６００号に詳細に記述されている。米国特許出願公開第２０１０／０２３４５７５号と米国特許第７，６７０，６００号に記述されているこのような変更される部分は、引用の方式で本明細書に組み込まれる。
【0082】
なお、本明細書の意味で、２５０、２５１、２５２、２５９、３０７、３０８、３３２、３７８、３８０、４２８、４３０、４３４、４３６の部位のうちの一つでの任意の置換は、半減期を延長するＦｃ変更であると考えられてもよい。これらの変更におけるそれぞれ又はこれらの変更の組み合わせは、本明細書に記載の二重特異性抗体の半減期を延長するために用いることができる。半減期を延長するために用いることができる他の変更は、２０１２年１２月１７日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０７０１４６（公開番号：ＷＯ ２０１３／０９６２２１）に詳細に記述されている。この出願に記述されている上記変更される部分は、引用の形式で本明細書に組み込まれる。
【0083】
半減期を延長するＦｃ変更は、公知の技術及び将来に発見される可能性のある部位及びその修飾をさらに含む。
【0084】
Ｆｃは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含むが、これらに限定されない任意の生物に由来することができる。
【0085】
二重特異性抗体をコードする核酸、本明細書に記述されている治療剤と抗体又は抗体断片を使用し、当業者は、機能的に等価な核酸（例えば、配列が異なるり、コードが同じエフェクター部分又は抗体配列の核酸）を含む複数のクローンを容易に構築することができる。このため、本発明は、二重特異性抗体と、抗体、抗体断片と抱合体及びそれらの融合タンパク質をコードする核酸と、核酸変異体と、誘導体と、種ホモログとを提供する。
【0086】
本分野では、ＶＨ、ＶＬ、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４領域を含む免疫グロブリン領域をコードする核酸配列の多くが既知されている。例えば、Ｋａｂａｔら．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１を参照する。本明細書で提供される教示に基づき、当業者は、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸配列を構築するために、前記核酸配列及び／又は本分野の既知の他の核酸配列を結合することができる。本発明の二重特異性抗体をコードする例示的なヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む。
【0087】
なお、本明細書と他の場所で提供されるアミノ酸配列及び本分野の常識に基づき、当業者は、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸配列を決定することができる。従来の特定のアミノ酸配列をコードするクローンＤＮＡ断片を製造する方法に加えて、現在では、ＤＮＡ ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）とＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ、ＵＳＡ）などのような会社は、一般的には化学合成を採用して任意の所望の順序で配列される遺伝子サイズのＤＮＡを製造し、それにより前記ＤＮＡを製造するプロセスを簡略化する。
【0088】
二重特異性抗体を調製する方法は、本分野の任意の既知の方法を採用して本発明の二重特異性抗体を調製することができる。二重特異性抗体を初期に構築する方法は、化学架橋法又はヘテロ接合ハイブリドーマ又は四価体腫瘍法を有する（例えば、Ｓｔａｅｒｚ ＵＤら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：６２８－３１、１９８５、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７－５４０、１９８３、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ Ｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６０：１６８６－１７０１、１９８４）。化学カップリング法は、２つの異なる単クローン性抗体を化学カップリングの方式で接続し、二重特異性単クローン性抗体を調製する。例えば、二種類の異なる単クローン性抗体の化学的結合であり、又は例えば、二つのＦａｂ断片のような二つの抗体断片の化学的結合である。ヘテロ接合-ハイブリドーマ法は、細胞ハイブリッド法又は三元ハイブリドーマの方式によって二重特異性単クローン性抗体を生成し、これらの細胞ハイブリドーマ又は三元ハイブリドーマは、確立されたハイブリドーマによって融合され、又は確立されたハイブリドーマと、マウスから得られたリンパ球とを融合させて得られる。これらの技術は、ＢｉＡｂの製造に用いられるが、抗原結合部位を含む異なる組み合わせの混合集団の生成、タンパク質発現方面の困難さ、ターゲットＢｉＡｂの精製の必要性、低収率、製造費用の高さなどのような様々な発生する問題は、このような複合体の使用を困難にしている。
【0089】
最近の方法は、遺伝子工学によって改造された構築物を利用し、それは、不必要な副生成物を除去するために完全に精製することなく、単一のＢｉＡｂの均質な生成物を生成することができる。このような構築物は、タンデムｓｃＦｖ、二抗体、タンデム二抗体、二可変ドメイン抗体及びＣｈ１／Ｃｋドメイン又はＤＮＬＴＭのようなプリミティブを使用するヘテロ二量体を含む（Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．、１２：２７６－８３、２００９、Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ、１：５３９－４７）。関連する精製技術は、公知である。
【0090】
さらに単一リンパ球抗体方法を使用して、特異性抗体を生成するために選択される単一リンパ球から生成される免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングして発現させることにより、抗体を生成することができ、例えばＢａｂｃｏｏｋ Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：７８４３－７８４８、１９９６、ＷＯ ９２／０２５５１、ＷＯ ２００４／０５１２６８とＷＯ ２００４／１０６３７７に記載の方法である。
【0091】
例えば、宿主を免疫するための、又はパニングするための、例えばファージディスプレイ（又は酵母細胞又は細菌細胞の表面での発現）のための抗体を生成するための抗原ポリペプチドは、本分野でよく知られている方法によって、発現系を含む遺伝工学で改造された宿主細胞から調製されてもよく、又は天然生物由来から回収されてもよい。例えば、二重特異性抗体の一本又は二本のポリペプチド鎖をコードする核酸は、複数の既知の方法（例えば、転化、トランスフェクト、エレクトロポレーション、核酸で被覆される微粒子による衝撃など）によって培養される宿主細胞に導入することができる。いくつかの実施方案では、二重特異性抗体をコードする核酸は、宿主細胞に導入される前に、宿主細胞内での発現に適するベクターに挿入されてもよい。典型的な前記ベクターは、挿入される核酸をＲＮＡとタンパク質レベルで発現することを可能にする配列エレメントを含んでもよい。
【0092】
前記ベクターは、本分野で公知であり、且つ多くは、商業的に入手可能である。前記核酸を含む宿主細胞は、細胞に該核酸を発現させることができる条件下で培養することができ、且つ得られるＢｉＡｂは、細胞集団又は培地から収集することができる。選択的に、ＢｉＡｂは、インビボで生産されてもよく、例えば、植物の葉の中（例えばＳｃｈｅｌｌｅｒ Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９：５７３－５７７、２００１とそのうちに引用される参照文献を参照する）、鳥の卵の中（例えばＺｈｕ Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：１１５９－１１６９、２００５とそのうちに引用される参照文献を参照する）、又は哺乳動物の乳の中（例えばＬａｉｂｌｅ Ｇら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．、２５：３１５、２０１２を参照する）。
【0093】
使用可能な多種の宿主細胞は、例えば、原核細胞、真核細胞、細菌細胞（例えば大腸菌又はバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、真菌細胞（例えば出芽酵母又はピキア酵母）、昆虫細胞（例えば草地ヨトウ細胞を含む鱗翅目昆虫細胞）又は哺乳動物細胞（例えば中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、小ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞、Ｈｅｌａ細胞、ヒト肝細胞癌細胞又は２９３細胞など）を含む。
【0094】
二重特異性抗体は、二重特異性抗原の免疫原性製剤によって、適正な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、又は他の哺乳動物であり、トランスジェニックとノックアウトされた上記他の哺乳動物を含む）を免疫することによって調製することができる。適正な免疫原性製剤は、例えば化学的に合成され又は組換え発現される二重特異性抗原であってもよい。前記製剤はアジュバント、例えばフロイント完全アジュバント又は不完全アジュバント又は類似する免疫刺激化合物をさらに含んでもよい。且つ、抗体を調製するために用いられる場合、特にインビボ免疫の方法で用いられる場合、本発明の二重特異性抗原は、単独で使用されてもよく、又は好ましくは、ベクタータンパク質とのコンジュゲートとして使用されてもよい。このような抗体応答を補強する方法は、本分野において公知である。必要な抗体に応じて、異なる動物宿主を用いてインビボ免疫を行うことができる。有用な内因性抗原を自己発現する宿主を用いてもよく、または有用な内因性抗原を欠損させた宿主を用いてもよい。
【0095】
二重特異性抗体は、以上に記載の方法を組み合わせることによって調製することができる。
【0096】
本発明の前記二重特異性抗体分子は、各標的についての単クローン性抗体（ＭＡｂ）とすることができる。いくつかの実施方案では、抗体は、キメラ、ヒト化又は完全ヒトである。
【0097】
単クローン性抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５－４９７、１９７５）、三源ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ Ｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２、１９８３）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ＳＰＣら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ７７－９６、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）のような本分野の既知の任意の方法によって調製することができる。
【0098】
本発明の二重特異性抗体又はその部分は、通常の免疫学的分析方法、例えば、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学によって、これらの抗原のいずれか一つ又はすべてを（例えば、血清又は血漿のような生体サンプルの中で）検出するために用いることができる。本発明は、生体サンプルにおける抗原を検出する方法を提供し、該方法は、前記生体試料を、前記抗原を特異的に認識できる本発明の二重特異性抗体、又は抗原結合断片と接触させ、且つ抗原に結合する抗体又はその部分、又は非結合抗体又はその部分を検出することにより、前記生体サンプルにおける前記抗原を検出することを含む。前記抗体は、検出可能な物質で直接又は間接的に マークすることによって、結合又は非結合抗体を検出しやすい。適正な検出可能な物質は、複数の酵素、修復基、蛍光物質、発光物質及び放射性物質を含む。適正な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼを含み、適正な修復基複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含み、適正な蛍光物質の例は、７－ヒドロキシクマリン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアン酸塩、アルカリ性シャリジンＢ、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、スルファニルクロリド又はフィコエリシンを含み、発光物質の例は、３－アミノフタルイル環状ヒドラジンを含み、適正な放射性物質の例は、Ｉ１２５、Ｉ１３１、３５Ｓ又は３Ｈを含む。
【0099】
医薬組成物は、本発明の二重特異性抗体、又は本出願の抗体をコードする核酸又はポリヌクレオチドは、医薬組成物又は無菌組成物の調製、例えば、二重特異性抗体と医薬的に許容可能なベクター、賦形剤又は安定剤との混合に応用することができる。医薬組成物は、一つ又は組み合わせの（例えば二つ又はより多く異なる）本発明の二重特異性抗体を含んでもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する相補的活性を有する抗体又は抗体断片（又は免疫抱合体）の組み合わせを含んでもよい。治療と診断剤の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液又は懸濁液の形式で、薬学的に許容可能なベクター、賦形剤又は安定剤と混合することによって調製することができる。
【0100】
「薬学的に許容可能な」という用語は、分子本体、分子断片、又は組成物が動物又はヒトに適切に投与される時、それらは、不利な、アレルギー的な、又はその他の不良反応を生じないことを意味する。薬学的に許容可能なベクター又はその成分とすることができるいくつかの物質の具体的な例は、糖類（例えば乳糖）、デンプン、セルロース及びその誘導体、植物油、ゼラチン、多価アルコール（例えばプロピレングリコール）、アルギン酸等を含む。
【0101】
二重特異性抗体、又は本出願の抗体をコードする核酸又はポリヌクレオチドは、上記薬学的に許容可能なベクター又はその成分のいくつかの物質に接続されてもよく（免疫複合体として）又はそれらと分けて適用されてもよい。後者の場合、二重特異性抗体、又は本出願の抗体をコードする核酸又はポリヌクレオチドは、上記薬学的に受容可能なベクター又はその成分のいくつかの物質の前、後、又はそれらと併用して適用されてもよく、又は他の既知の療法（例えば抗がん療法、例えば放射線）と併用して適用されてもよい。
【0102】
本発明の組成物は、複数の形式であってもよい。それは、例えば、液体、半固体及び固体の剤量形式、例えば、液体溶液（例えば、注射可能と不融化の溶液）分散剤又は懸濁剤錠剤、丸剤、粉剤、リポソーム及び座剤を含む。好ましい方式は、適用方式と治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、注入可能又は不融化の溶液であり、例えば、他の抗体でヒトに対して受動免疫を行うことに類似する組成物である。適用経路は、経口、直腸、経粘膜、経腸、胃腸外、筋肉内、皮下、皮内、髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹き込み、局部、皮膚、経皮又は動脈内を含む様々な形式を有してもよい。好ましい適用形式は、腸管外（例えば、静脈内、皮下、腹膜内、筋内）である。好ましい実施方案では、前記抗体は、静脉内注入又は注射によって適用される。別の好ましい実施方案では、前記抗体は、肌内又は皮下によって適用される。
【0103】
以上の組み合わせ方法、治療方法及び投与方法は、公知であり、将来に発展する可能性がある組み合わせ、治療及び適用方法をさらに含む。
【0104】
本発明の医薬組成物は、二種類の医薬の組み合わせであってもよく、市販されている類似機能と同じ製品又は治療効果を増加させる製品の組み合わせであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0105】
【図1】、ＡＰ１６３精製サンプルのＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出結果である。
【図2】、ＡＰ１６３精製サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動結果である。
【図3】、二重特異性抗体がＢＣＭＡ陽性細胞と結合する能力の測定である。
【図4】、二重特異性抗体が異なるＴ細胞と結合する能力の測定である。
【図5】、二重特異性抗体が同時に標的細胞とエフェクター細胞と結合する能力の測定である。
【図6】、二重特異性抗体の媒介によるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞のアクティブ化である。
【図7】、二重特異性抗体活性化報告遺伝子細胞株Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の能力測定である。
【図8】、二重特異性抗体がＴ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させる能力の測定である。
【図9】、異なるエフェクター対標的比で二重特異性抗体がＴ細胞を媒介してＢＣＭＡ陽性細胞を殺傷させる能力の測定である。
【図10】、ＮＰＧマウスの皮下でヒトＣＩＫ細胞とヒト骨髄腫細胞ＲＰＭＩ－８２２６移植腫瘍を共同接種するモデルにおける二重特異性抗体のインビボ腫瘍阻害効果である。注：矢印は、各回の投薬時間を表し、＊＊＊は、有意差が存在することを表す。
【図11】、ＮＰＧマウスの皮下でヒトＣＩＫ細胞とヒトＢｕｒｋｋｉｔ’ｓリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞移植腫瘍を共同接種するモデルにおける二重特異性抗体のインビボ腫瘍阻害効果である。注：矢印は、各回の投薬時間を表し、＊＊＊は、有意差が存在することを表す。
【発明を実施するための形態】
【0106】
以下の実施例によって本発明をさらに説明し、前記実施例は、更なる制限と解釈すべきではない。ここで、全出願において引用されたすべての添付図面とすべての参照文献、特許及び開示された特許出願の内容を参照として本明細書に明示的に取り込む。
【0107】
以下の各実施例では、実験用の材料は、購入でき、また従来の開示された技術を参照して調製でき、由来と規格が明示されていないものは、すべて市販で入手でき、詳細に記述されていない各種のプロセスと方法は、当分野に周知の通常の方法である。
【0108】
実施例１、二重特異性抗体分子発現ベクターの構築
二重特異性抗体ＡＰ１６３は、抗－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、リンカーペプチドＬ２、抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖ及びＦｃ断片から順に直列接続して構成され、抗－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖと抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖの内部のＶＨとＶＬとの間は、それぞれリンカーペプチドＬ１とＬ３によって接続される。ＡＰ１６３に含まれるＢＣＭＡに対するｓｃＦｖのＶＨとＶＬアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す通りである。ＡＰ１６３に含まれる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖのＶＨとＶＬアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示され、且つＶＨとＶＬとの間は、（ＧＧＧＧＳ）３によって接続される。ＡＰ１６３に含まれるＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ１に由来し、且つ複数のアミノ酸の置換を有し、それぞれは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｐ３３１Ｓ及びＭ４２８Ｌ（ＥＵ番号）であり、またＦｃ断片Ｃ末端のＫ４４７（ＥＵ番号）を削除／欠失した。そのリンカーペプチド（Ｌ２）は、可撓性ペプチドと剛性ペプチドからなり、可撓性ペプチドは、いずれもＧ２（ＧＧＧＧＳ）３であり、剛性ペプチドは、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳである。各ｓｃＦｖの内部のリンカーペプチドＬ１とＬ３の構成は、いずれも（ＧＧＧＧＳ）３である。
通常の分子生物学的方法で上記二重特異性抗体のコード遺伝子を合成し、且つ得られる融合遺伝子のコードｃＤＮＡをそれぞれＰＣＤＮＡ３．１によって改造された後の真核発現プラスミドｐＣＭＡＢ２Ｍの対応する酵素切断部位の間に挿入する。プラスミドｐＣＭＡＢ２Ｍは、選択的マーカーをさらに含み、それにより細菌においてカナマイシン耐性を有することができ、哺乳動物細胞においてＧ４１８耐性を有することができる。また、宿主細胞がＤＨＦＲ遺伝子発現欠損型である場合、ｐＣＭＡＢ２Ｍ発現ベクターは、マウスのジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含み、それによりメトトレキサート（ＭＴＸ）が存在する時に、目的遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子を共増幅することができる（米国特許ＵＳ４，３９９，２１６を参照する）。
二重特異性抗体ＡＰ１６３は、抗－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、リンカーペプチドＬ２、抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖ及びＦｃ断片から順に直列接続して構成され、抗－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖと抗－ＣＤ３ ｓｃＦｖの内部のＶＨとＶＬとの間は、それぞれリンカーペプチドＬ１とＬ３によって接続される。ＡＰ１６３に含まれるＢＣＭＡに対するｓｃＦｖのＶＨとＶＬアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す通りである。ＡＰ１６３に含まれる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖのＶＨとＶＬアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示され、且つＶＨとＶＬとの間は、（ＧＧＧＧＳ）３によって接続される。ＡＰ１６３に含まれるＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ１に由来し、且つ複数のアミノ酸の置換を有し、それぞれは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｐ３３１Ｓ及びＭ４２８Ｌ（ＥＵ番号）であり、またＦｃ断片Ｃ末端のＫ４４７（ＥＵ番号）を削除／欠失した。そのリンカーペプチド（Ｌ２）は、可撓性ペプチドと剛性ペプチドからなり、可撓性ペプチドは、いずれもＧ２（ＧＧＧＧＳ）３であり、剛性ペプチドは、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳである。各ｓｃＦｖの内部のリンカーペプチドＬ１とＬ３の構成は、いずれも（ＧＧＧＧＳ）３である。
通常の分子生物学的方法で上記二重特異性抗体のコード遺伝子を合成し、且つ得られる融合遺伝子のコードｃＤＮＡをそれぞれＰＣＤＮＡ３．１によって改造された後の真核発現プラスミドｐＣＭＡＢ２Ｍの対応する酵素切断部位の間に挿入する。プラスミドｐＣＭＡＢ２Ｍは、選択的マーカーをさらに含み、それにより細菌においてカナマイシン耐性を有することができ、哺乳動物細胞においてＧ４１８耐性を有することができる。また、宿主細胞がＤＨＦＲ遺伝子発現欠損型である場合、ｐＣＭＡＢ２Ｍ発現ベクターは、マウスのジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含み、それによりメトトレキサート（ＭＴＸ）が存在する時に、目的遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子を共増幅することができる（米国特許ＵＳ４，３９９，２１６を参照する）。
【0109】
実施例２、二重特異性抗体分子の発現
上記構築された発現プラスミドを哺乳動物宿主細胞系にトランスフェクトし、それによって二重特異性抗体を発現する。宿主細胞系は、ＤＨＦＲ酵素欠損型ＣＨＯ－細胞（米国特許ＵＳ ４，８１８，６７９を参照する）であり、本実施例では、宿主細胞は、ＣＨＯ誘導細胞株ＤＸＢ１１を選択する。
一つの好ましいトランスフェクト方法は、エレクトロポレーションであり、リン酸カルシウム共沈降、脂質トランスフェクトを含む他の方法を使用してもよい。エレクトロポレーションにおいて、３００Ｖの電界と１５００ μＦｄの電気容量に設定されるＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレータ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で、キュベット内の５×１０７個の細胞に５０μｇの発現ベクタープラスミドＤＮＡを加える。トランスフェクトした２日間の後、培地を０．６ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む生長培地に変更する。極限希釈でトランスフェクタントをサブクローニングし、且つＥＬＩＳＡ法で各細胞系の分泌率を測定する。二重特異性抗体を高レベルで発現する細胞株をスクリーニングする。
ＭＴＸ医薬によって阻害されるＤＨＦＲ遺伝子で共増幅を行い、その操作ステップは主に、漸増する濃度ＭＴＸを含む生長培地において、ＤＨＦＲ遺伝子でトランスフェクトされる融合タンパク遺伝子を共増幅することを含む。ＤＨＦＲ発現陽性のサブクローンを極限希釈し、段階的に加圧し且つ最大で６μＭであるＭＴＸ培地において成長できるトランスフェクタントをスクリーニングし、その分泌率を測定し、外来タンパクを高発現する細胞系をスクリーニングする。分泌率が５（好ましくは約１５である）μｇ／１０６を超える（即ち百万）個の細胞／２４ｈの細胞系を、無血清培地を用いて適応懸濁培養を行う。細胞上清を收集し、且つ二重特異性抗体を分離精製する。
上記構築された発現プラスミドを哺乳動物宿主細胞系にトランスフェクトし、それによって二重特異性抗体を発現する。宿主細胞系は、ＤＨＦＲ酵素欠損型ＣＨＯ－細胞（米国特許ＵＳ ４，８１８，６７９を参照する）であり、本実施例では、宿主細胞は、ＣＨＯ誘導細胞株ＤＸＢ１１を選択する。
一つの好ましいトランスフェクト方法は、エレクトロポレーションであり、リン酸カルシウム共沈降、脂質トランスフェクトを含む他の方法を使用してもよい。エレクトロポレーションにおいて、３００Ｖの電界と１５００ μＦｄの電気容量に設定されるＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレータ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で、キュベット内の５×１０７個の細胞に５０μｇの発現ベクタープラスミドＤＮＡを加える。トランスフェクトした２日間の後、培地を０．６ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む生長培地に変更する。極限希釈でトランスフェクタントをサブクローニングし、且つＥＬＩＳＡ法で各細胞系の分泌率を測定する。二重特異性抗体を高レベルで発現する細胞株をスクリーニングする。
ＭＴＸ医薬によって阻害されるＤＨＦＲ遺伝子で共増幅を行い、その操作ステップは主に、漸増する濃度ＭＴＸを含む生長培地において、ＤＨＦＲ遺伝子でトランスフェクトされる融合タンパク遺伝子を共増幅することを含む。ＤＨＦＲ発現陽性のサブクローンを極限希釈し、段階的に加圧し且つ最大で６μＭであるＭＴＸ培地において成長できるトランスフェクタントをスクリーニングし、その分泌率を測定し、外来タンパクを高発現する細胞系をスクリーニングする。分泌率が５（好ましくは約１５である）μｇ／１０６を超える（即ち百万）個の細胞／２４ｈの細胞系を、無血清培地を用いて適応懸濁培養を行う。細胞上清を收集し、且つ二重特異性抗体を分離精製する。
【0110】
実施例３、二重特異性抗体の精製
三段階クロマトグラフィ法を採用して二重特異性抗体ＡＰ１６３を精製する。それぞれは、親和性クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ及びアニオン交換クロマトグラフィ（本実施例で採用されるタンパク精製計は、米国ＧＥ社のＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５Ｍである。本実施例で採用される試薬は、いずれも国薬集団化学試薬有限会社から購入され、純度は、いずれも分析レベルである）。
ステップ１、親和性クロマトグラフィ：ＧＥ社のＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅアフィニティークロマトグラフィ媒体（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ社から購入される）またはその他の市販のア親和性クロマトグラフィ媒体（例えば、ボグロン社のＤｉａｍｏｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａなど）を採用し、サンプルの捕獲、濃縮及び一部の汚染物の除去を行う。まず平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で平衡し、清澄した後の発酵液を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速でサンプリングし、積載量が２０ｍｇ／ｍｌ以下であり、サンプリングが完了した後、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で平衡し、結合していない成分を洗浄し、除染ｂｕｆｆｅｒ１（５０ｍＭ ＮａＡｃ－ＨＡｃ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で洗浄し、一部の汚染物質を除去し、除染ｂｕｆｆｅｒ２（５０ｍＭ ＮａＡｃ－ＨＡｃ、ｐＨ５．０）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で平衡し、その後、溶出ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ ＮａＡｃ－ＨＡｃ、ｐＨ３．５）を用いて、ターゲット生成物を１００ｃｍ／ｈ以下の線形流速で溶出し、ターゲットピークを収集する。
ステップ２、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ：ＢＩＯ－ＲＡＤ社のＣＨＴ ＴｙｐｅIIまたは他の市販のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ媒体（ＣＨＴ ＴｙｐｅII、ＢＩＯ－ＲＡＤ社から購入される）を使用して中間精製を行い、重合体の含有量を低減させるために用いられる。ターゲットタンパクが重合した後、重合体と単体との間に、電荷特性及びカルシウムイオンキレートを含む性質上の差異が存在しており、我々は、電荷特性などの差異を用いて両者を分離する。まず、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ ７．０）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で平衡し、ステップ１の親和性クロマトグラフィで分離して得られるターゲットタンパクをｐＨ ７．０に調整した後、サンプリングし、積載量を＜５ｍｇ／ｍｌに制御し、サンプリングが完了した後、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．０）を用いて、クロマトグラフィカラムを１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で３～５個のカラム体積（ＣＶ）を洗浄し、最後に、ターゲットタンパクの溶出を行い、溶出ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、１Ｍ ＮａＣＬ、ｐＨ７．０）を用いて、０～５０％の勾配で溶出し、１０個のカラム体積（ＣＶ）を１００ｃｍ／ｈ以下の線形流速で溶出し、溶出成分をセグメント化して採取し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを個別に検査に送る。単体パーセンテージが９５％よりも大きい標的成分を組み合わせて次のクロマトグラフィを行う。
ステップ３、アニオン交換クロマトグラフィ：ボグロン社のＱ－ＨＰまたはその他の市販のアニオン交換クロマトグラフィ媒体（Ｑ－ＨＰ、ボグロン社から購入される）（例えばＧＥのＱＨＰ、ＴＯＳＯＨのＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０、天地人和のＤＥＡＥ Ｂｅａｄｓ ６ＦＦ、賽分科学技術のＧｅｎｅｒｉｋ ＭＣ－Ｑ、ＭｅｒｃｋのＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、ＰａｌｌのＱ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ）を用いて精密精製を行い、さらにＨＣＰ、ＤＮＡなどの汚染物質を除去する。まず、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣＬ、ｐＨ ７．０）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で洗浄し、ステップ２のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィで分離して得られるターゲットタンパクをサンプリングし、貫流を収集し、サンプリングが完了し、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣＬ、ｐＨ ７．０）を用いて、クロマトグラフィカラムを１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で３～５個のカラム体積（ＣＶ）を洗浄し、貫流成分を収集し、それぞれサンプルを送ってタンパク含有量、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び電気泳動検出を行う。
サンプルのＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度結果及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動結果は、それぞれ図１と図２に示され、そのうちＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果は、三段階クロマトグラフィの後の二重特異性抗体のメインピーク純度が９５％以上に達し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動バンド型が予想に合致し、非還元電気泳動（１８０ＫＤａ）が還元した後に鮮明な（９０ＫＤａ）一本鎖バンドを得ることができることを示す。
三段階クロマトグラフィ法を採用して二重特異性抗体ＡＰ１６３を精製する。それぞれは、親和性クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ及びアニオン交換クロマトグラフィ（本実施例で採用されるタンパク精製計は、米国ＧＥ社のＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５Ｍである。本実施例で採用される試薬は、いずれも国薬集団化学試薬有限会社から購入され、純度は、いずれも分析レベルである）。
ステップ１、親和性クロマトグラフィ：ＧＥ社のＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅアフィニティークロマトグラフィ媒体（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ社から購入される）またはその他の市販のア親和性クロマトグラフィ媒体（例えば、ボグロン社のＤｉａｍｏｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａなど）を採用し、サンプルの捕獲、濃縮及び一部の汚染物の除去を行う。まず平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で平衡し、清澄した後の発酵液を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速でサンプリングし、積載量が２０ｍｇ／ｍｌ以下であり、サンプリングが完了した後、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で平衡し、結合していない成分を洗浄し、除染ｂｕｆｆｅｒ１（５０ｍＭ ＮａＡｃ－ＨＡｃ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で洗浄し、一部の汚染物質を除去し、除染ｂｕｆｆｅｒ２（５０ｍＭ ＮａＡｃ－ＨＡｃ、ｐＨ５．０）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で平衡し、その後、溶出ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ ＮａＡｃ－ＨＡｃ、ｐＨ３．５）を用いて、ターゲット生成物を１００ｃｍ／ｈ以下の線形流速で溶出し、ターゲットピークを収集する。
ステップ２、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ：ＢＩＯ－ＲＡＤ社のＣＨＴ ＴｙｐｅIIまたは他の市販のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ媒体（ＣＨＴ ＴｙｐｅII、ＢＩＯ－ＲＡＤ社から購入される）を使用して中間精製を行い、重合体の含有量を低減させるために用いられる。ターゲットタンパクが重合した後、重合体と単体との間に、電荷特性及びカルシウムイオンキレートを含む性質上の差異が存在しており、我々は、電荷特性などの差異を用いて両者を分離する。まず、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ ７．０）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で平衡し、ステップ１の親和性クロマトグラフィで分離して得られるターゲットタンパクをｐＨ ７．０に調整した後、サンプリングし、積載量を＜５ｍｇ／ｍｌに制御し、サンプリングが完了した後、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．０）を用いて、クロマトグラフィカラムを１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で３～５個のカラム体積（ＣＶ）を洗浄し、最後に、ターゲットタンパクの溶出を行い、溶出ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＰＢ、１Ｍ ＮａＣＬ、ｐＨ７．０）を用いて、０～５０％の勾配で溶出し、１０個のカラム体積（ＣＶ）を１００ｃｍ／ｈ以下の線形流速で溶出し、溶出成分をセグメント化して採取し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを個別に検査に送る。単体パーセンテージが９５％よりも大きい標的成分を組み合わせて次のクロマトグラフィを行う。
ステップ３、アニオン交換クロマトグラフィ：ボグロン社のＱ－ＨＰまたはその他の市販のアニオン交換クロマトグラフィ媒体（Ｑ－ＨＰ、ボグロン社から購入される）（例えばＧＥのＱＨＰ、ＴＯＳＯＨのＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０、天地人和のＤＥＡＥ Ｂｅａｄｓ ６ＦＦ、賽分科学技術のＧｅｎｅｒｉｋ ＭＣ－Ｑ、ＭｅｒｃｋのＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、ＰａｌｌのＱ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ）を用いて精密精製を行い、さらにＨＣＰ、ＤＮＡなどの汚染物質を除去する。まず、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣＬ、ｐＨ ７．０）を用いて、クロマトグラフィカラム３～５個のカラム体積（ＣＶ）を１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で洗浄し、ステップ２のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィで分離して得られるターゲットタンパクをサンプリングし、貫流を収集し、サンプリングが完了し、平衡ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣＬ、ｐＨ ７．０）を用いて、クロマトグラフィカラムを１００～２００ｃｍ／ｈの線形流速で３～５個のカラム体積（ＣＶ）を洗浄し、貫流成分を収集し、それぞれサンプルを送ってタンパク含有量、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び電気泳動検出を行う。
サンプルのＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度結果及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動結果は、それぞれ図１と図２に示され、そのうちＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果は、三段階クロマトグラフィの後の二重特異性抗体のメインピーク純度が９５％以上に達し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動バンド型が予想に合致し、非還元電気泳動（１８０ＫＤａ）が還元した後に鮮明な（９０ＫＤａ）一本鎖バンドを得ることができることを示す。
【0111】
実施例４、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のインビト生物学機能評価
（１）二重特異性抗体がＢＣＭＡ陽性細胞とＴ細胞との結合活性
ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞、ヒトＪｕｒｋａｔ－ＬＵＣ細胞、ヒトＴリンパ球性白血病ＨＵＴ－７８細胞、ヒト骨髄腫ＭＭ．１Ｓ細胞、ヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞、ヒトＴ細胞及びカニクイザルＴ細胞を培養し、細胞を遠心分離して収集して１％のＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝液）で再懸濁し、それぞれ細胞密度を２×１０６個／ｍｌに調整し、９６ウェルプレートに置き、ウェルあたり１００μｌである。測定対象の二重特異性抗体ＡＰ１６３に対して段階希釈を行い、ウェルあたり１００μｌであり、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで１ｈインキュベートする。遠心分離し、ウェルあたり２００μｌの１％のＤＰＢＳを加えて２回洗浄した後に遠心分離して上清を除去し、ウェルあたり１００μｌの蛍光二抗（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体）を加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで１ｈインキュベートする。遠心分離して上清を除去し、１％のＤＰＢＳでプレートを二回洗浄し、ウェルあたり１００μｌの１％のＤＰＢＳを加えて再懸濁し、フローサイトメトリで信号強度を検出する。さらに、平均蛍光強度をＹ軸として、抗体濃度をＸ軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、ＡＰ１６３とＢＣＭＡ＋細胞及びＣＤ３＋細胞との結合活性を計算する。
図３、図４に示すように、細胞レベルで、ＡＰ１６３は、ＢＣＭＡ陽性の細胞と特異的に高度に結合し、且つ用量効果関係を有するとともに、ＡＰ１６３は、ヒトＴ細胞とカニクイザルＴ細胞といずれも特異的に高度に結合することができ、且つ用量効果関係を有する。
（２）二重特異性抗体とヒトサル種属ＣＤ３とＢＣＭＡタンパクとの結合能力及び交差反応性の測定
抗原を被覆するヒトとサルのＣＤ３、ＢＣＭＡをＰＢＳでそれぞれ０．１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートに加え、１００μｌ／ウェルであり、２－８℃で一晩被覆する。プレートにおける液体を捨て、脱脂粉乳を含むＰＢＳＴを加えて室温で２ｈ閉鎖した後、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄する。測定対象の二重特異性抗体を４倍希釈して合計で１２個の勾配があり、濃度ごとに２個の重複ウェルであり、１００μｌ／ウェルを９６ウェルプレートに加え、室温で２ｈインキュベートする。結合していない二重特異性抗体をＰＢＳＴで洗浄除去し、ビオチン化したヒトＢＣＭＡタンパク又はヒトＣＤ３タンパクを０．１μｇ／ｍｌに希釈し、ＨＲＰ標識のストレプトアビジン（ＢＤ、商品番号５５４０６６）を１：１０００で混合して９６ウェルプレートに加え、１００μｌ／ウェルであり、室温で１ｈインキュベートする。その後、９６ウェルプレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢを加え、１００μｌ／ウェルであり、室温で２－３ｍｉｎ遮光して発色させ、続いて１Ｍ のＨＣＬを加えて発色反応を終止する。マイクロプレートリーダでＯＤ４５０ｎｍの吸光値を検出する。サンプル濃度対数値を横座標として、吸光度値を縦座標として、四パラメータ非線形回帰、可変スロープ方程を行う。二重特異性抗体が抗原と結合するＥＣ５０値を計算する。実験結果は、表１に示すように、二重特異性抗体がヒト源ＣＤ３とＢＣＭＡタンパク、カニクイザル源ＣＤ３とＢＣＭＡタンパクと結合するＥＣ５０値の差異が非常に小さく、二重特異性抗体は、異なる種属抗原との結合能力が基本的に同じである。
（３）二重特異性抗体が同時に標的細胞とエフェクター細胞と結合する能力の測定
正常に培養されるヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞は、標的細胞として、ＰＫＨ２６染色試薬で染色標識し、１６４０完全培地で細胞を再懸濁し、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに加える。二重特異性抗体を培地で段階希釈し、５０μｌ／ウェルで加える。標的細胞数の５倍のエフェクター細胞（増幅培養するＴ細胞）を５０μｌ／ウェルで加える。３７℃で、５％のＣＯ２インキュベータで１ｈインキュベートし、測定対象のサンプルと細胞を十分に混合し、且つ架橋反応を発生させる。ＤＰＢＳで９６ウェルプレートを洗浄し、フローサイトメトリーで機器を扱って検出し、Ｔ細胞を捕捉すると、ＰＫＨ２６信号付きのＴ細胞は、ブリッジが発生する細胞であり、データを統計してブリッジ比率を計算する。図５から見られるように、ＡＰ１６３は、腫瘍細胞と標的細胞に特異的にブリッジ反応を発生させることができ、且つ用量効果関係を有する。
（４）二重特異性抗体の媒介によるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞のアクティブ化
健康な自発献血者３名を募集し、末梢血を採取し且つＰＢＭＣを抽出し、ＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット及びＣＤ８＋Ｔ細胞分離キットを利用し、ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を選別して濃縮し、１０％のＦＢＳを含む１６４０完全培地で細胞を再懸濁し、細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに加える。ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を培養し、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、ウェルあたり５０μｌを加える。二重特異性抗体に対して段階希釈を行い、５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで２４ｈインキュベートする。遠心分離して上清液を取り、ＥＬＩＳＡ法顆粒酵素検出キットを採用して上清における顆粒酵素放出量を検出する。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、二重特異性抗体がＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞を媒介してアクティブ化させるＥＣ５０を計算する。
図６と表２に示すように、ＡＰ１６３は、３名の健康なボランティアのＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させる時に顆粒酵素を放出し、且つ用量効果関係を呈することができる。
（５）二重特異性抗体がＴ細胞を活性化する能力の評価
ＮＦＡＴ ＲＥ報告遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入される）は、二重特異性抗体とＢＣＭＡ陽性細胞が同時に存在する場合、ルシフェラーゼ酵素を過発現することができ、ルシフェラーゼ酵素の活性を検出することによってＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の活性化程度を定量する。具体的には、Ｈ９２９細胞を遠心分離して再懸濁し、細胞密度を２×１０５個／ｍｌに調整し、４０μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに加える。ＮＦＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞密度を２×１０６個／ｍｌに調整、ウェルあたり４０μｌを加える。二重特異性抗体ＡＰ１６３を培地で５０μｇ／ｍＬに希釈し、１０倍希釈した後、ウェルあたり２０μｌを加え、３７℃で、５％ＣＯ２のインキュベータで４８ｈインキュベートする。プレートを洗浄した後、それぞれ１００μｌ／ウェルのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ(R)Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを加え、５ｍｉｎ反応した後、マイクロプレートリーダで冷発光値を検出する。二重特異性抗体の濃度をＸ軸として、フルオレセイン強度をＹ軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、二重特異性抗体がＴ細胞を活性化するＥＣ５０を計算する。
図７に示すように、ＡＰ１６３は、ＮＦＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を特異的に活性化することができ、ＥＣ５０値は、３．１６１ｎｇ／ｍｌであり、且つその濃度は、信号強度に比例する。
（６）二重特異性抗体がＴ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させる能力
ヒト、カニクイザルのＴ細胞を培養し、細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルでそれぞれ９６ウェル細胞培養プレートに加える。正常に培養されるヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を標的細胞として、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで加える。その後ウェルあたり５０μｌの段階希釈後の二重特異性抗体ＡＰ１６３を加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで２４ｈインキュベートする。ウェルあたり４０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ試薬を加え、室温で３ｍｉｎ遮光して静置し、多機能マイクロプレートリーダを応用してＲＬＵ値を検出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、二重特異性抗体がＴ細胞を媒介してＨ９２９細胞を殺傷させるＥＣ５０値を計算する。
図８に示すように、ＡＰ１６３は、ヒトＴ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させるＥＣ５０値は、０．２３９ｐＭであり、カニクイザルＴ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させるＥＣ５０値は、０．２７８ｐＭである。ＡＰ１６３は、ヒトとカニクイザルのＴ細胞を特異的に媒介して腫瘍細胞を殺傷させることができ、ＢＣＭＡ高発現のＨ９２９細胞は、著しい殺傷作用を示し、且つ用量効果関係を呈する。
（７）二重特異性抗体による細胞因子放出の評価
二重特異性抗体が単独してまたは標的細胞に依存してＴ細胞を活性化して細胞因子の放出を引き起こす能力を評価する。
初代Ｔ細胞を培養し、細胞を遠心分離して収集して１％のＰＢＳＢで再懸濁し、それぞれ細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調整して９６ウェルプレートに置き、９０μｌ／ウェルである。ＣＤ３を認識する母本マブＡＢ３１４（具体的にはＷＯ２００７０４２２６１特許文献を参照する）と二重特異性抗体ＡＰ１６３をそれぞれ培地で１００００ｎｇ／ｍＬに希釈し、１０倍段階希釈した後、１０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで培養する。それぞれ２４ｈと４８ｈインキュベートする時に培養上清液を取り、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭヒトＴｈ１／Ｔｈ２キットで検出分析し、フローサイトメトリで信号強度を検出する。細胞因子濃度をＹ軸として、抗体濃度をＸ軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、ＡＢ３１４とＡＰ１６３がＴ細胞を活性化することによる細胞因子放出の量を計算する。その結果、標的細胞が存在しない場合、ＡＢ３１４は、初代Ｔ細胞を２４ｈ活性化した後、細胞因子ＩＬ－４、ＩＬ－５及びＴＮＦ－αの放出を引き起こし、ＡＰ１６３は、初代Ｔ細胞を活性化し、２４ｈ、４８ｈにはいずれも著しい細胞因子の放出がない。
ヒトＴ細胞を培養し、細胞を遠心分離して收集して１０％のＦＢＳの１６４０完全培地で再懸濁し、細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調整して９６ウェルプレートに置き、５０μｌ／ウェルである。ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９の細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで加える。ＡＰ１６３を段階希釈した後、５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータでそれぞれ１、２、３、４、５、６、２４ｈ培養する。インキュベートが終了した後、ウェルあたり５０μｌの上清液を取り、８細胞因子検出キットを応用して上清における８細胞因子の放出量を検出する。実験結果は、ＡＰ１６３がＴ細胞を活性化してＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４を放出し、且つ時間依存性を呈することができることを表明し、具体的には表３に示される。
（８）異なるエフェクター対標的比で二重特異性抗体がＴ細胞を媒介してＢＣＭＡ陽性ヒト腫瘍細胞を殺傷させる
ヒトＴ細胞を培養し、細胞密度をそれぞれ２×１０７個／ｍｌ、１×１０７個／ｍｌ、１×１０６個／ｍｌ、１×１０５個／ｍｌ、１×１０４個／ｍｌ、１×１０３個／ｍｌに調整し、ウェルあたり５０μｌで、９６ウェルの細胞培養プレートに加える。ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を標的細胞として、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで加える。その後ウェルあたり５０μｌの段階希釈後のＡＰ１６３を加え、３７℃で、５％のＣＯ２インキュベータにおいて２４ｈインキュベートする。ウェルあたり４０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ試薬を加え、室温で３ｍｉｎ遮光して静置し、多機能マイクロプレートリーダを応用してＲＬＵ値を検出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、二重特異性抗体がＴ細胞を媒介してＨ９２９細胞を殺傷させるＥＣ５０値を計算する。
図９に示すように、エフェクター対標的比（Ｅ／Ｔ）が１／１よりも高い場合、ＡＰ１６３がＴ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させる効率は、１００％殺傷に達することができ、Ｅ／Ｔが１／１よりも低い場合、ＥＣ５０値は、Ｅ／Ｔの減少につれて徐々に増大する。
（９）デキサメタゾン及びインドメタシンが、ＡＰ１６３がＰＢＭＣを媒介して腫瘍細胞を殺傷させることに対する影響作用を評価する
健康な自発献血者１２名を募集し、末梢血を採取し且つＰＢＭＣを抽出し、１０％のＦＢＳを含む１６４０完全培地で細胞を再懸濁し、細胞密度を３×１０６個／ｍｌに調整し、ウェルあたり５０μｌて９６ウェル細胞培養プレートに加える。デキサメタゾンとインドメタシン希釈液を配合し、ウェルあたり５０μｌで９６ウェルプレートに加え、それぞれＰＢＭＣを１ｈと１４ｈインキュベートし、対照グループに等体積の緩衝液を加える。ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞の細胞密度１×１０５個／ｍｌに調整し、ウェルあたり５０μｌである。その後ウェルあたり５０μｌの段階希釈されるＡＰ１６３を加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータでそれぞれ４、８、１２、２４、４８ｈインキュベートし、ウェルあたり４０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ試薬を加え、室温で３ｍｉｎ遮光して静置し、多機能マイクロプレートリーダでＲＬＵ値を検出する。データを分析した結果、デキサメタゾン又はインドメタシンがＰＢＭＣインキュベートすることは、ＡＰ１６３がＰＢＭＣを媒介して腫瘍細胞を殺傷させることに対する影響が比較的に少ない。
（１）二重特異性抗体がＢＣＭＡ陽性細胞とＴ細胞との結合活性
ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞、ヒトＪｕｒｋａｔ－ＬＵＣ細胞、ヒトＴリンパ球性白血病ＨＵＴ－７８細胞、ヒト骨髄腫ＭＭ．１Ｓ細胞、ヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞、ヒトＴ細胞及びカニクイザルＴ細胞を培養し、細胞を遠心分離して収集して１％のＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝液）で再懸濁し、それぞれ細胞密度を２×１０６個／ｍｌに調整し、９６ウェルプレートに置き、ウェルあたり１００μｌである。測定対象の二重特異性抗体ＡＰ１６３に対して段階希釈を行い、ウェルあたり１００μｌであり、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで１ｈインキュベートする。遠心分離し、ウェルあたり２００μｌの１％のＤＰＢＳを加えて２回洗浄した後に遠心分離して上清を除去し、ウェルあたり１００μｌの蛍光二抗（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体）を加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで１ｈインキュベートする。遠心分離して上清を除去し、１％のＤＰＢＳでプレートを二回洗浄し、ウェルあたり１００μｌの１％のＤＰＢＳを加えて再懸濁し、フローサイトメトリで信号強度を検出する。さらに、平均蛍光強度をＹ軸として、抗体濃度をＸ軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、ＡＰ１６３とＢＣＭＡ＋細胞及びＣＤ３＋細胞との結合活性を計算する。
図３、図４に示すように、細胞レベルで、ＡＰ１６３は、ＢＣＭＡ陽性の細胞と特異的に高度に結合し、且つ用量効果関係を有するとともに、ＡＰ１６３は、ヒトＴ細胞とカニクイザルＴ細胞といずれも特異的に高度に結合することができ、且つ用量効果関係を有する。
（２）二重特異性抗体とヒトサル種属ＣＤ３とＢＣＭＡタンパクとの結合能力及び交差反応性の測定
抗原を被覆するヒトとサルのＣＤ３、ＢＣＭＡをＰＢＳでそれぞれ０．１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートに加え、１００μｌ／ウェルであり、２－８℃で一晩被覆する。プレートにおける液体を捨て、脱脂粉乳を含むＰＢＳＴを加えて室温で２ｈ閉鎖した後、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄する。測定対象の二重特異性抗体を４倍希釈して合計で１２個の勾配があり、濃度ごとに２個の重複ウェルであり、１００μｌ／ウェルを９６ウェルプレートに加え、室温で２ｈインキュベートする。結合していない二重特異性抗体をＰＢＳＴで洗浄除去し、ビオチン化したヒトＢＣＭＡタンパク又はヒトＣＤ３タンパクを０．１μｇ／ｍｌに希釈し、ＨＲＰ標識のストレプトアビジン（ＢＤ、商品番号５５４０６６）を１：１０００で混合して９６ウェルプレートに加え、１００μｌ／ウェルであり、室温で１ｈインキュベートする。その後、９６ウェルプレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢを加え、１００μｌ／ウェルであり、室温で２－３ｍｉｎ遮光して発色させ、続いて１Ｍ のＨＣＬを加えて発色反応を終止する。マイクロプレートリーダでＯＤ４５０ｎｍの吸光値を検出する。サンプル濃度対数値を横座標として、吸光度値を縦座標として、四パラメータ非線形回帰、可変スロープ方程を行う。二重特異性抗体が抗原と結合するＥＣ５０値を計算する。実験結果は、表１に示すように、二重特異性抗体がヒト源ＣＤ３とＢＣＭＡタンパク、カニクイザル源ＣＤ３とＢＣＭＡタンパクと結合するＥＣ５０値の差異が非常に小さく、二重特異性抗体は、異なる種属抗原との結合能力が基本的に同じである。
正常に培養されるヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞は、標的細胞として、ＰＫＨ２６染色試薬で染色標識し、１６４０完全培地で細胞を再懸濁し、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに加える。二重特異性抗体を培地で段階希釈し、５０μｌ／ウェルで加える。標的細胞数の５倍のエフェクター細胞（増幅培養するＴ細胞）を５０μｌ／ウェルで加える。３７℃で、５％のＣＯ２インキュベータで１ｈインキュベートし、測定対象のサンプルと細胞を十分に混合し、且つ架橋反応を発生させる。ＤＰＢＳで９６ウェルプレートを洗浄し、フローサイトメトリーで機器を扱って検出し、Ｔ細胞を捕捉すると、ＰＫＨ２６信号付きのＴ細胞は、ブリッジが発生する細胞であり、データを統計してブリッジ比率を計算する。図５から見られるように、ＡＰ１６３は、腫瘍細胞と標的細胞に特異的にブリッジ反応を発生させることができ、且つ用量効果関係を有する。
（４）二重特異性抗体の媒介によるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞のアクティブ化
健康な自発献血者３名を募集し、末梢血を採取し且つＰＢＭＣを抽出し、ＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット及びＣＤ８＋Ｔ細胞分離キットを利用し、ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を選別して濃縮し、１０％のＦＢＳを含む１６４０完全培地で細胞を再懸濁し、細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに加える。ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を培養し、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、ウェルあたり５０μｌを加える。二重特異性抗体に対して段階希釈を行い、５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで２４ｈインキュベートする。遠心分離して上清液を取り、ＥＬＩＳＡ法顆粒酵素検出キットを採用して上清における顆粒酵素放出量を検出する。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、二重特異性抗体がＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞を媒介してアクティブ化させるＥＣ５０を計算する。
図６と表２に示すように、ＡＰ１６３は、３名の健康なボランティアのＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させる時に顆粒酵素を放出し、且つ用量効果関係を呈することができる。
ＮＦＡＴ ＲＥ報告遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入される）は、二重特異性抗体とＢＣＭＡ陽性細胞が同時に存在する場合、ルシフェラーゼ酵素を過発現することができ、ルシフェラーゼ酵素の活性を検出することによってＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の活性化程度を定量する。具体的には、Ｈ９２９細胞を遠心分離して再懸濁し、細胞密度を２×１０５個／ｍｌに調整し、４０μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに加える。ＮＦＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞密度を２×１０６個／ｍｌに調整、ウェルあたり４０μｌを加える。二重特異性抗体ＡＰ１６３を培地で５０μｇ／ｍＬに希釈し、１０倍希釈した後、ウェルあたり２０μｌを加え、３７℃で、５％ＣＯ２のインキュベータで４８ｈインキュベートする。プレートを洗浄した後、それぞれ１００μｌ／ウェルのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ(R)Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを加え、５ｍｉｎ反応した後、マイクロプレートリーダで冷発光値を検出する。二重特異性抗体の濃度をＸ軸として、フルオレセイン強度をＹ軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、二重特異性抗体がＴ細胞を活性化するＥＣ５０を計算する。
図７に示すように、ＡＰ１６３は、ＮＦＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を特異的に活性化することができ、ＥＣ５０値は、３．１６１ｎｇ／ｍｌであり、且つその濃度は、信号強度に比例する。
（６）二重特異性抗体がＴ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させる能力
ヒト、カニクイザルのＴ細胞を培養し、細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルでそれぞれ９６ウェル細胞培養プレートに加える。正常に培養されるヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を標的細胞として、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで加える。その後ウェルあたり５０μｌの段階希釈後の二重特異性抗体ＡＰ１６３を加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで２４ｈインキュベートする。ウェルあたり４０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ試薬を加え、室温で３ｍｉｎ遮光して静置し、多機能マイクロプレートリーダを応用してＲＬＵ値を検出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、二重特異性抗体がＴ細胞を媒介してＨ９２９細胞を殺傷させるＥＣ５０値を計算する。
図８に示すように、ＡＰ１６３は、ヒトＴ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させるＥＣ５０値は、０．２３９ｐＭであり、カニクイザルＴ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させるＥＣ５０値は、０．２７８ｐＭである。ＡＰ１６３は、ヒトとカニクイザルのＴ細胞を特異的に媒介して腫瘍細胞を殺傷させることができ、ＢＣＭＡ高発現のＨ９２９細胞は、著しい殺傷作用を示し、且つ用量効果関係を呈する。
（７）二重特異性抗体による細胞因子放出の評価
二重特異性抗体が単独してまたは標的細胞に依存してＴ細胞を活性化して細胞因子の放出を引き起こす能力を評価する。
初代Ｔ細胞を培養し、細胞を遠心分離して収集して１％のＰＢＳＢで再懸濁し、それぞれ細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調整して９６ウェルプレートに置き、９０μｌ／ウェルである。ＣＤ３を認識する母本マブＡＢ３１４（具体的にはＷＯ２００７０４２２６１特許文献を参照する）と二重特異性抗体ＡＰ１６３をそれぞれ培地で１００００ｎｇ／ｍＬに希釈し、１０倍段階希釈した後、１０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータで培養する。それぞれ２４ｈと４８ｈインキュベートする時に培養上清液を取り、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭヒトＴｈ１／Ｔｈ２キットで検出分析し、フローサイトメトリで信号強度を検出する。細胞因子濃度をＹ軸として、抗体濃度をＸ軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、ＡＢ３１４とＡＰ１６３がＴ細胞を活性化することによる細胞因子放出の量を計算する。その結果、標的細胞が存在しない場合、ＡＢ３１４は、初代Ｔ細胞を２４ｈ活性化した後、細胞因子ＩＬ－４、ＩＬ－５及びＴＮＦ－αの放出を引き起こし、ＡＰ１６３は、初代Ｔ細胞を活性化し、２４ｈ、４８ｈにはいずれも著しい細胞因子の放出がない。
ヒトＴ細胞を培養し、細胞を遠心分離して收集して１０％のＦＢＳの１６４０完全培地で再懸濁し、細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調整して９６ウェルプレートに置き、５０μｌ／ウェルである。ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９の細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで加える。ＡＰ１６３を段階希釈した後、５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータでそれぞれ１、２、３、４、５、６、２４ｈ培養する。インキュベートが終了した後、ウェルあたり５０μｌの上清液を取り、８細胞因子検出キットを応用して上清における８細胞因子の放出量を検出する。実験結果は、ＡＰ１６３がＴ細胞を活性化してＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４を放出し、且つ時間依存性を呈することができることを表明し、具体的には表３に示される。
ヒトＴ細胞を培養し、細胞密度をそれぞれ２×１０７個／ｍｌ、１×１０７個／ｍｌ、１×１０６個／ｍｌ、１×１０５個／ｍｌ、１×１０４個／ｍｌ、１×１０３個／ｍｌに調整し、ウェルあたり５０μｌで、９６ウェルの細胞培養プレートに加える。ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を標的細胞として、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで加える。その後ウェルあたり５０μｌの段階希釈後のＡＰ１６３を加え、３７℃で、５％のＣＯ２インキュベータにおいて２４ｈインキュベートする。ウェルあたり４０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ試薬を加え、室温で３ｍｉｎ遮光して静置し、多機能マイクロプレートリーダを応用してＲＬＵ値を検出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって分析を行い、二重特異性抗体がＴ細胞を媒介してＨ９２９細胞を殺傷させるＥＣ５０値を計算する。
図９に示すように、エフェクター対標的比（Ｅ／Ｔ）が１／１よりも高い場合、ＡＰ１６３がＴ細胞を媒介して腫瘍細胞を殺傷させる効率は、１００％殺傷に達することができ、Ｅ／Ｔが１／１よりも低い場合、ＥＣ５０値は、Ｅ／Ｔの減少につれて徐々に増大する。
（９）デキサメタゾン及びインドメタシンが、ＡＰ１６３がＰＢＭＣを媒介して腫瘍細胞を殺傷させることに対する影響作用を評価する
健康な自発献血者１２名を募集し、末梢血を採取し且つＰＢＭＣを抽出し、１０％のＦＢＳを含む１６４０完全培地で細胞を再懸濁し、細胞密度を３×１０６個／ｍｌに調整し、ウェルあたり５０μｌて９６ウェル細胞培養プレートに加える。デキサメタゾンとインドメタシン希釈液を配合し、ウェルあたり５０μｌで９６ウェルプレートに加え、それぞれＰＢＭＣを１ｈと１４ｈインキュベートし、対照グループに等体積の緩衝液を加える。ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞の細胞密度１×１０５個／ｍｌに調整し、ウェルあたり５０μｌである。その後ウェルあたり５０μｌの段階希釈されるＡＰ１６３を加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベータでそれぞれ４、８、１２、２４、４８ｈインキュベートし、ウェルあたり４０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ試薬を加え、室温で３ｍｉｎ遮光して静置し、多機能マイクロプレートリーダでＲＬＵ値を検出する。データを分析した結果、デキサメタゾン又はインドメタシンがＰＢＭＣインキュベートすることは、ＡＰ１６３がＰＢＭＣを媒介して腫瘍細胞を殺傷させることに対する影響が比較的に少ない。
【0112】
実施例５、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のマウス移植瘤モデルにおける薬効学研究
（１）ＮＰＧマウスの皮下でヒトＣＩＫ細胞とヒト骨髄腫細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９移植腫瘍を共同接種するモデル
ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞とＣＩＫ細胞（ヒトＰＢＭＣによって１０日目までアクティブ化誘導増幅する）を異なる比率で雌ＮＰＧマウスの右側の前脇肋部の皮下に共同接種する。接種してから１小時後、マウスの体重に基づいてランダムにグループ分けし、４匹ずつで、計４グループである。グループ分けする当日に投薬を開始し、すべてのグループの投薬経路は、いずれも腹腔注射であり、対照グループに同じ体積のＰＢＳ溶液を投与し、ＡＰ１６３の投薬剤量は、０．２ｍｇ／ｋｇである。週に２回投薬し、４週間連続投薬する。腫瘍体積及び体重を３日間ごとに１回測定し、マウスの体重と腫瘍体積を記録する。実験が終了した時、動物は、安楽死し、腫瘍を剥取して計量し、写真を撮り、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を計算する。
表４に示すように、実験が終了した時、エフェクター対標的比が１／１である対照グループの平均腫瘍体積は、１５０１±３５１ｍｍ３であり、エフェクター対標的比が１／２である対照グループの平均腫瘍体積は、１５５５±２４４ｍｍ３であり、エフェクター対標的比が１／１であるＡＰ１６３試験グループの平均腫瘍体積は、９９±３８ｍｍ３であり、ＴＧＩ％は、９３％であり、エフェクター対標的比が１／１であるＡＰ１６３試験群の平均腫瘍体積は、４８１±２１５ｍｍ３であり、ＴＧＩ％は、７０．２％である。上記結果は、ＡＰ１６３が明らかな腫瘍阻害作用を有するとともに、ＡＰ１６３が比較的に良い安全性を示し、実験動物に対して明らかな毒性作用を生じないことを表明する。
（２）ＮＰＧマウスの皮下でヒトＣＩＫ細胞とヒトＢｕｒｋｋｉｔ’ｓリンパ腫Ｒａｊｉ細胞移植腫瘍を共同接種するモデル
ヒトＢｕｒｋｋｉｔ’ｓリンパ腫Ｒａｊｉ細胞と培養増幅した後のＣＩＫ（Ｒａｊｉ細胞とＣＩＫ細胞の比率が１：１である）、及びＭａｔｒｉｇｅｌを体積比１：１の比率で混合し、雌ＮＰＧマウスの右側の背部の皮下に共同接種する。接種してから１小時後、マウスの体重に基づいてランダムにグループ分けし、４匹ずつで、計４グループである。グループ分けする当日に投薬を開始し、対照グループに同じ体積のＰＢＳ溶液を投与し、ＡＰ１６３の投薬剤量は、１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇと０．０１ｍｇ／ｋｇである。すべてのグループの投薬経路は、腹腔注射であり、週に２回投薬し、計３週間投薬する。腫瘍体積及び体重を３日間ごとに１回測定し、マウスの体重と腫瘍体積を記録する。実験が終了した時、動物は、安楽死し、腫瘍を剥取して計量し、写真を撮り、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を計算する。
結果は、表５に示され、実験が終了した時、対照グループの平均腫瘍体積は、１７５０±６５３ｍｍ３であり、ＡＰ１６３が１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇである試験グループの平均腫瘍体積は、いずれも０．００±０．００ｍｍ３であり、いずれも溶媒対照グループの腫瘍体積と有意差があり（Ｐ＜０．０５）、３グループのＴＧＩは、いずれも１００％であり、供試二重特異性抗体ＡＰ１６３が極めて著しい腫瘍阻害作用を有することを表明する。
（３）ＮＰＧマウスの皮下でヒトＣＩＫ細胞とヒト骨髄腫細胞ＲＰＭＩ－８２２６移植腫瘍を共同接種するモデル
ヒト骨髄腫細胞ＲＰＭＩ－８２２６とＣＩＫを雌ＮＰＧマウスの右側の背部の皮下に接種し、接種してから１時間後、マウスの体重に基づいてランダムにグループ分けし、当日に投薬を開始する。第１組は、７匹であり、残りの２組は、８匹ずつであり、計３組である。グループ分けする当日に投薬を開始し、対照グループに同じ体積のＰＢＳ溶液を投与し、ＡＰ１６３の投薬剤量は、１ｍｇ／ｋｇと０．１ｍｇ／ｋｇである。すべてのグループの投薬経路は、いずれも腹腔注射であり、二日間ごとに１回投薬し、８回連続投薬し、最後に投薬してから１８日間後に実験が終了する。腫瘍体積及び体重を週に２回測定し、マウスの体重と腫瘍体積を記録する。実験が終了した時、動物は、安楽死し、腫瘍を剥取して計量し、写真を撮り、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を計算する。
（１）ＮＰＧマウスの皮下でヒトＣＩＫ細胞とヒト骨髄腫細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９移植腫瘍を共同接種するモデル
ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞とＣＩＫ細胞（ヒトＰＢＭＣによって１０日目までアクティブ化誘導増幅する）を異なる比率で雌ＮＰＧマウスの右側の前脇肋部の皮下に共同接種する。接種してから１小時後、マウスの体重に基づいてランダムにグループ分けし、４匹ずつで、計４グループである。グループ分けする当日に投薬を開始し、すべてのグループの投薬経路は、いずれも腹腔注射であり、対照グループに同じ体積のＰＢＳ溶液を投与し、ＡＰ１６３の投薬剤量は、０．２ｍｇ／ｋｇである。週に２回投薬し、４週間連続投薬する。腫瘍体積及び体重を３日間ごとに１回測定し、マウスの体重と腫瘍体積を記録する。実験が終了した時、動物は、安楽死し、腫瘍を剥取して計量し、写真を撮り、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を計算する。
表４に示すように、実験が終了した時、エフェクター対標的比が１／１である対照グループの平均腫瘍体積は、１５０１±３５１ｍｍ３であり、エフェクター対標的比が１／２である対照グループの平均腫瘍体積は、１５５５±２４４ｍｍ３であり、エフェクター対標的比が１／１であるＡＰ１６３試験グループの平均腫瘍体積は、９９±３８ｍｍ３であり、ＴＧＩ％は、９３％であり、エフェクター対標的比が１／１であるＡＰ１６３試験群の平均腫瘍体積は、４８１±２１５ｍｍ３であり、ＴＧＩ％は、７０．２％である。上記結果は、ＡＰ１６３が明らかな腫瘍阻害作用を有するとともに、ＡＰ１６３が比較的に良い安全性を示し、実験動物に対して明らかな毒性作用を生じないことを表明する。
ヒトＢｕｒｋｋｉｔ’ｓリンパ腫Ｒａｊｉ細胞と培養増幅した後のＣＩＫ（Ｒａｊｉ細胞とＣＩＫ細胞の比率が１：１である）、及びＭａｔｒｉｇｅｌを体積比１：１の比率で混合し、雌ＮＰＧマウスの右側の背部の皮下に共同接種する。接種してから１小時後、マウスの体重に基づいてランダムにグループ分けし、４匹ずつで、計４グループである。グループ分けする当日に投薬を開始し、対照グループに同じ体積のＰＢＳ溶液を投与し、ＡＰ１６３の投薬剤量は、１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇと０．０１ｍｇ／ｋｇである。すべてのグループの投薬経路は、腹腔注射であり、週に２回投薬し、計３週間投薬する。腫瘍体積及び体重を３日間ごとに１回測定し、マウスの体重と腫瘍体積を記録する。実験が終了した時、動物は、安楽死し、腫瘍を剥取して計量し、写真を撮り、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を計算する。
結果は、表５に示され、実験が終了した時、対照グループの平均腫瘍体積は、１７５０±６５３ｍｍ３であり、ＡＰ１６３が１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇである試験グループの平均腫瘍体積は、いずれも０．００±０．００ｍｍ３であり、いずれも溶媒対照グループの腫瘍体積と有意差があり（Ｐ＜０．０５）、３グループのＴＧＩは、いずれも１００％であり、供試二重特異性抗体ＡＰ１６３が極めて著しい腫瘍阻害作用を有することを表明する。
ヒト骨髄腫細胞ＲＰＭＩ－８２２６とＣＩＫを雌ＮＰＧマウスの右側の背部の皮下に接種し、接種してから１時間後、マウスの体重に基づいてランダムにグループ分けし、当日に投薬を開始する。第１組は、７匹であり、残りの２組は、８匹ずつであり、計３組である。グループ分けする当日に投薬を開始し、対照グループに同じ体積のＰＢＳ溶液を投与し、ＡＰ１６３の投薬剤量は、１ｍｇ／ｋｇと０．１ｍｇ／ｋｇである。すべてのグループの投薬経路は、いずれも腹腔注射であり、二日間ごとに１回投薬し、８回連続投薬し、最後に投薬してから１８日間後に実験が終了する。腫瘍体積及び体重を週に２回測定し、マウスの体重と腫瘍体積を記録する。実験が終了した時、動物は、安楽死し、腫瘍を剥取して計量し、写真を撮り、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を計算する。
【0113】
図１０に示すように、実験が終了した時（初回投薬してから３２日間後）、各グループの動物の体重は、いずれも増加が現れ、異なるグループ別の動物の体重を比較すれば、有意差がない（Ｐ＞０．０５）。対照グループの平均腫瘍体積は、１６４７．７９±２４７．９０ｍｍ３であり、ＡＰ１６３が１ｍｇ／ｋｇである試験グループの平均腫瘍体積は、０．００±０．００ｍｍ３であり、ＴＧＩ％は、１００％であり、ＡＰ１６３が０．１ｍｇ／ｋｇである試験グループの平均腫瘍体積は、８．００±５．２４ｍｍ３であり、ＴＧＩ％は、９９．５１％である。実験結果は、抗体ＡＰ１６３が極めて著しい腫瘍阻害作用を有することを表明する。本実験条件で、ＡＰ１６３は、各投薬濃度でいずれも腫瘍の生長を著しく阻害するとともに、ＡＰ１６３は、比較的に良い安全性を示し、実験動物に対して明らかな毒性作用を生じない。
（４）ＮＰＧマウスの皮下でヒトＣＩＫ細胞とヒトＢｕｒｋｋｉｔ’ｓリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞移植腫瘍を共同接種するモデル
ヒトＢｕｒｋｋｉｔ’ｓリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞と培養増殖した後のＣＩＫ（Ｄａｕｄｉ細胞の密度が５×１０６個／ｍｌであり、ＣＩＫ細胞の密度が１×１０６個／ｍｌであり）、及びＭａｔｒｉｇｅｌを体積比１：１の比率で混合し、雌ＮＰＧマウスの右側の背部の皮下に共同接種する。接種して１ｈ小時後、マウスの体重に基づいてランダムにグループ分けし、６匹ずつで、計４グループである。グループ分けする当日に投薬を開始し、対照グループに同じ体積のＰＢＳ溶液を投与し、ＡＰ１６３の投薬剤量は、１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇと０．０４ｍｇ／ｋｇである。すべてのグループの投薬経路は、いずれも腹腔注射であり、二日間ごとに１回投薬し、計８回投薬し、最後に投薬してから１０日間後に実験が終了する。腫瘍体積及び体重を週に２回測定し、マウスの体重と腫瘍体積を記録する。実験が終了した時、動物は、安楽死し、腫瘍を剥取して計量し、写真を撮り、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を計算する。
図１１に示され、実験が終了した時（初回投薬してから２５日間後）、各グループの動物の体重は、いずれも増加が現れ、異なるグループ別の動物の体重を比較すれば、有意差がない（Ｐ＞０．０５）。実験が終了した時、対照グループの平均腫瘍体積は、９７０．８３±１６５．４０ｍｍ３であり、ＡＰ１６３が１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．０４ｍｇ／ｋｇである試験グループの平均腫瘍体積は、それぞれ１７１．９９±３２．６０ｍｍ３、１９０．８２±５３．６０ｍｍ３及び２２８．６８±４４．９６ｍｍ３であり、対応するＴＧＩ％は、それぞれ８２．２８％、８０．３４％及び７６．４４％であり、且つ対照グループと比べて、腫瘍阻害作用は、いずれも有意差があり（Ｐ＜０．０５）、ＡＰ１６３が各投薬濃度でいずれも腫瘍の生長を著しく阻害し、且つ比較的に良い安全性を示し、実験動物に対して明らかな毒性作用を生じないことを表明する。
（４）ＮＰＧマウスの皮下でヒトＣＩＫ細胞とヒトＢｕｒｋｋｉｔ’ｓリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞移植腫瘍を共同接種するモデル
ヒトＢｕｒｋｋｉｔ’ｓリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞と培養増殖した後のＣＩＫ（Ｄａｕｄｉ細胞の密度が５×１０６個／ｍｌであり、ＣＩＫ細胞の密度が１×１０６個／ｍｌであり）、及びＭａｔｒｉｇｅｌを体積比１：１の比率で混合し、雌ＮＰＧマウスの右側の背部の皮下に共同接種する。接種して１ｈ小時後、マウスの体重に基づいてランダムにグループ分けし、６匹ずつで、計４グループである。グループ分けする当日に投薬を開始し、対照グループに同じ体積のＰＢＳ溶液を投与し、ＡＰ１６３の投薬剤量は、１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇと０．０４ｍｇ／ｋｇである。すべてのグループの投薬経路は、いずれも腹腔注射であり、二日間ごとに１回投薬し、計８回投薬し、最後に投薬してから１０日間後に実験が終了する。腫瘍体積及び体重を週に２回測定し、マウスの体重と腫瘍体積を記録する。実験が終了した時、動物は、安楽死し、腫瘍を剥取して計量し、写真を撮り、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を計算する。
図１１に示され、実験が終了した時（初回投薬してから２５日間後）、各グループの動物の体重は、いずれも増加が現れ、異なるグループ別の動物の体重を比較すれば、有意差がない（Ｐ＞０．０５）。実験が終了した時、対照グループの平均腫瘍体積は、９７０．８３±１６５．４０ｍｍ３であり、ＡＰ１６３が１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．０４ｍｇ／ｋｇである試験グループの平均腫瘍体積は、それぞれ１７１．９９±３２．６０ｍｍ３、１９０．８２±５３．６０ｍｍ３及び２２８．６８±４４．９６ｍｍ３であり、対応するＴＧＩ％は、それぞれ８２．２８％、８０．３４％及び７６．４４％であり、且つ対照グループと比べて、腫瘍阻害作用は、いずれも有意差があり（Ｐ＜０．０５）、ＡＰ１６３が各投薬濃度でいずれも腫瘍の生長を著しく阻害し、且つ比較的に良い安全性を示し、実験動物に対して明らかな毒性作用を生じないことを表明する。
【0114】
実施例６、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の安全性評価試験
ＡＰ１６３を週に２回投薬し、静脈注入を繰り返してカニクイザルに２週間投与した後の毒性反応状況を評価し、後続の毒性試験のために適切な剤量範囲及び観察指標を決定する。６匹のカニクイザルで、３匹／性別で、３グループに分け、１匹／性別／グループで、それぞれ０．１、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１６３を投与する（１、２又は３グループ）。注入速度は、３０ｍＬ／ｋｇ／ｈであり、投薬容量は、１０ｍＬ／ｋｇである。すべての動物は、１４日間（Ｄ１４）の投薬期間が終了してからＤ１５に安楽死を実施する。
試験期間に、動物の臨床症状、体重、食事量、体温、心電図、血圧、臨床病理指標（血球計数、凝固機能指標と血液生化学）、リンパ球亜群、細胞因子、薬物血漿濃度測定と毒物分析を周期的にモニタリングする。すべての動物に対して、いずれも肉眼解剖を行う。肉眼解剖では明らかな異常が見られず、組織病理学検査が行われない。その結果、本試験条件で、０．１、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１６３を週に２回投薬し、静脈注入を繰り返してカニクイザルに２週間投与し、各動物では死亡や瀕死が見られず、各投薬グループの動物では１回目の投薬後にいずれも一過性のＮｅｕｔ、ＣＤ３－ＣＤ２０＋、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２とＩＬ－６上昇及びＬｙｍｐｈ、ＣＤ３＋、ＣＤ３－ＣＤ１６＋／ＣＤ５６＋低減が見られ、最大耐性用量（ＭＴＤ）≧２．５ｍｇ／ｋｇである。
ＡＰ１６３を週に２回投薬し、静脈注入を繰り返してカニクイザルに２週間投与した後の毒性反応状況を評価し、後続の毒性試験のために適切な剤量範囲及び観察指標を決定する。６匹のカニクイザルで、３匹／性別で、３グループに分け、１匹／性別／グループで、それぞれ０．１、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１６３を投与する（１、２又は３グループ）。注入速度は、３０ｍＬ／ｋｇ／ｈであり、投薬容量は、１０ｍＬ／ｋｇである。すべての動物は、１４日間（Ｄ１４）の投薬期間が終了してからＤ１５に安楽死を実施する。
試験期間に、動物の臨床症状、体重、食事量、体温、心電図、血圧、臨床病理指標（血球計数、凝固機能指標と血液生化学）、リンパ球亜群、細胞因子、薬物血漿濃度測定と毒物分析を周期的にモニタリングする。すべての動物に対して、いずれも肉眼解剖を行う。肉眼解剖では明らかな異常が見られず、組織病理学検査が行われない。その結果、本試験条件で、０．１、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１６３を週に２回投薬し、静脈注入を繰り返してカニクイザルに２週間投与し、各動物では死亡や瀕死が見られず、各投薬グループの動物では１回目の投薬後にいずれも一過性のＮｅｕｔ、ＣＤ３－ＣＤ２０＋、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２とＩＬ－６上昇及びＬｙｍｐｈ、ＣＤ３＋、ＣＤ３－ＣＤ１６＋／ＣＤ５６＋低減が見られ、最大耐性用量（ＭＴＤ）≧２．５ｍｇ／ｋｇである。
【0115】
実施例７、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の薬物動態学試験
試験は、計６匹のカニクイザル（３匹／性別）を用い、３グループに分け、１匹／性別／グループで、それぞれ０．１、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１６３を投与する。動物の後肢の皮下静脈の非投薬部位から毒物血液サンプル（約１ｍＬ）を抗凝固剤のないチューブまで採取し、１～３グループ目の採血時点は、各グループの動物の最初と最後の投薬前、投薬終了直後（±１ｍｉｎ）、投薬開始後１ｈ、３ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈである。
遠心分離チューブ（抗凝固しない）を使用する前に氷水浴で保存し、血液サンプルを採取した後に上記遠心分離チューブに移送し、２～８℃で、３０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離する。血清サンプルを分離した後に２部に個装し、－７０℃以下に置いて保存する。血液サンプル採取から遠心分離完了まで２時間以内に完了する必要がある。
ＥＬＩＳＡ法を採用して血清におけるＡＰ１６３濃度に対して検出分析を行い、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ８．０ソフトウェアの非房室モデル法（ＮＣＡ）を採用して投薬グループの動態学パラメータに対して計算を行い、各グループの薬物動態学パラメータの結果を表６に示す。結果は、０．１、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇの剤量グループのＡＰ１６３のインビボ半減期がそれぞれ７．０８、８．９５及び１１．４２時間であることを表明する。
試験は、計６匹のカニクイザル（３匹／性別）を用い、３グループに分け、１匹／性別／グループで、それぞれ０．１、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１６３を投与する。動物の後肢の皮下静脈の非投薬部位から毒物血液サンプル（約１ｍＬ）を抗凝固剤のないチューブまで採取し、１～３グループ目の採血時点は、各グループの動物の最初と最後の投薬前、投薬終了直後（±１ｍｉｎ）、投薬開始後１ｈ、３ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈである。
遠心分離チューブ（抗凝固しない）を使用する前に氷水浴で保存し、血液サンプルを採取した後に上記遠心分離チューブに移送し、２～８℃で、３０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離する。血清サンプルを分離した後に２部に個装し、－７０℃以下に置いて保存する。血液サンプル採取から遠心分離完了まで２時間以内に完了する必要がある。
ＥＬＩＳＡ法を採用して血清におけるＡＰ１６３濃度に対して検出分析を行い、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ８．０ソフトウェアの非房室モデル法（ＮＣＡ）を採用して投薬グループの動態学パラメータに対して計算を行い、各グループの薬物動態学パラメータの結果を表６に示す。結果は、０．１、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇの剤量グループのＡＰ１６３のインビボ半減期がそれぞれ７．０８、８．９５及び１１．４２時間であることを表明する。
【0116】
本発明の好ましい例を説明し且つ記述するが、理解すべきことは、当業者は、本明細書の教示に従って、本発明の範囲に反しない様々な変更を行うことができる。
【0117】
本発明で言及されているすべての文献は、いずれも本出願において参照として引用され、各文献が参照として単独して引用されるようである。なお、理解できることは、本発明の上記講義内容を読んだ後、当業者は、本発明に対して様々な修正または変更を行うことができ、これらの等価形式は、同様に本出願に添付された特許請求の範囲によって限定される範囲よりも後になる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】