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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-27
(45)【発行日】2024-01-11
(54)【発明の名称】ビールテイストアルコール飲料
(51)【国際特許分類】
C12G 3/04 20190101AFI20231228BHJP
C12G 3/021 20190101ALI20231228BHJP
【ＦＩ】
C12G3/04
C12G3/021
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2020114419
(22)【出願日】2020-07-01
(65)【公開番号】P2022012538
(43)【公開日】2022-01-17
【審査請求日】2022-09-07
(73)【特許権者】
【識別番号】309007911
【氏名又は名称】サントリーホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】高木 理沙
(72)【発明者】
【氏名】首藤 菜子
(72)【発明者】
【氏名】岩佐 恵子
(72)【発明者】
【氏名】小沢 正晃
(72)【発明者】
【氏名】神田 直人
(72)【発明者】
【氏名】松尾 嘉英
【審査官】戸来 幸男
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１６８７１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１１５４３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１８－１９６３３６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／２０００００（ＷＯ，Ａ１）
【文献】J. Agric. Food Chem.，1997年，vol.45，pp.3183-3189
【文献】Food Biosci.，2018年，vol.25，pp.21-27
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｇ ３／００－３／０８
Ｃ１２Ｃ １／００－１３／１０
Ｇｏｏｇｌｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料であって、シクロロイシルプロリン、シクロバリルプロリン及びシクロイソロイシルプロリンからなる群から選択される少なくとも１種のジケトピペラジンを含み、前記ジケトピペラジンのうち最も多く含まれるジケトピペラジンの濃度が３．５ｐｐｍ以上であり、
さらに、分子量３５～５０ｋＤａのタンパク質を含み、
前記タンパク質の濃度が１ｐｐｍ以上であるビールテイストアルコール飲料。
【請求項2】
前記ジケトピペラジンのうち最も多く含まれるジケトピペラジンの濃度が１０ｐｐｍ以下である請求項１に記載のビールテイストアルコール飲料。
【請求項3】
前記タンパク質の濃度が３０ｐｐｍ以下である請求項１又は２に記載のビールテイストアルコール飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ビールテイストアルコール飲料に関する。
【背景技術】
【0002】
近年の消費者の嗜好の多様化にともなって、様々な香味特徴をもつビールテイストアルコール飲料の開発が望まれている。
【0003】
特許文献１には、ビールテイストアルコール飲料の香味を改善するために、特定の分子量のペプチドを含有させることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０１６－１４９９７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
特許文献１では、飲料の評価指標として、ビールらしい味わい、スムーズな味の流れ、口内に残るざらつき、といった指標を用いており、１０－２０ｋＤａのペプチドを所定濃度含有することにより、これらの指標に基づく官能評価スコアが高い飲料が得られることが記載されている。
【0006】
ここで、ビールテイスト飲料を飲んだ直後から感じられる味覚として、５基本味、すなわち、甘味、塩味、酸味、苦味及びうま味では表せない味覚で、味の強さ、広がり、厚み、味が持続する又は味の強さのバランスがとれているという特徴が好まれることがある。このような特徴を本明細書中では「ふくらみ」という 。
特許文献１に記載された飲料は、ふくらみの観点からはさらに改良の余地がある飲料であるといえ、ふくらみを増強する方法が望まれていた。
特許文献１に記載された飲料は、ふくらみの観点からはさらに改良の余地がある飲料であるといえ、ふくらみを増強する方法が望まれていた。
【0007】
本発明は、ふくらみが増強された飲料を提供することを目的とする。特に原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料において、ふくらみが増強された飲料を提供することを目的とする。原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料は、味が薄く、ふくらみが乏しい傾向があるために、ふくらみを増強することが特に望まれる飲料である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
すなわち、本発明は、以下のビールテイストアルコール飲料に関する。
〔１〕原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料であって、シクロロイシルプロリン、シクロバリルプロリン及びシクロイソロイシルプロリンからなる群から選択される少なくとも１種のジケトピペラジンを含み、上記ジケトピペラジンのうち最も多く含まれるジケトピペラジンの濃度が３．５ｐｐｍ以上であるビールテイストアルコール飲料。
〔２〕上記ジケトピペラジンのうち最も多く含まれるジケトピペラジンの濃度が１０ｐｐｍ以下である上記〔１〕に記載のビールテイストアルコール飲料。
〔３〕さらに、分子量３５～５０ｋＤａのタンパク質を含み、上記タンパク質の濃度が１ｐｐｍ以上である上記〔１〕又は〔２〕に記載のビールテイストアルコール飲料。
〔４〕上記タンパク質の濃度が３０ｐｐｍ以下である上記〔３〕に記載のビールテイストアルコール飲料。
〔１〕原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料であって、シクロロイシルプロリン、シクロバリルプロリン及びシクロイソロイシルプロリンからなる群から選択される少なくとも１種のジケトピペラジンを含み、上記ジケトピペラジンのうち最も多く含まれるジケトピペラジンの濃度が３．５ｐｐｍ以上であるビールテイストアルコール飲料。
〔２〕上記ジケトピペラジンのうち最も多く含まれるジケトピペラジンの濃度が１０ｐｐｍ以下である上記〔１〕に記載のビールテイストアルコール飲料。
〔３〕さらに、分子量３５～５０ｋＤａのタンパク質を含み、上記タンパク質の濃度が１ｐｐｍ以上である上記〔１〕又は〔２〕に記載のビールテイストアルコール飲料。
〔４〕上記タンパク質の濃度が３０ｐｐｍ以下である上記〔３〕に記載のビールテイストアルコール飲料。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料において、ふくらみが増強された飲料を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明のビールテイストアルコール飲料は、原料に麦芽を含まない。
ここで「原料に麦芽を含まない」とは、麦芽、米、トウモロコシ、コウリャン、バレイショ、デンプン、マメ類などの植物タンパク質、麦芽以外の麦、及び糖類など、水とホップ以外の原料中に占める麦芽の重量の比率が０であることをいう。
原料としては大豆タンパク分解物を主に含むことが好ましい。
ただし、酸味料、甘味料、苦味料、調味料、香料など、微量に添加され得る成分中に麦芽が含まれていてもよい。また、後述する分子量３５～５０ｋＤａのタンパク質が麦芽由来のタンパク質であっても、これを使用することは許容される。
ここで「原料に麦芽を含まない」とは、麦芽、米、トウモロコシ、コウリャン、バレイショ、デンプン、マメ類などの植物タンパク質、麦芽以外の麦、及び糖類など、水とホップ以外の原料中に占める麦芽の重量の比率が０であることをいう。
原料としては大豆タンパク分解物を主に含むことが好ましい。
ただし、酸味料、甘味料、苦味料、調味料、香料など、微量に添加され得る成分中に麦芽が含まれていてもよい。また、後述する分子量３５～５０ｋＤａのタンパク質が麦芽由来のタンパク質であっても、これを使用することは許容される。
【0011】
本発明のビールテイストアルコール飲料は、シクロロイシルプロリン、シクロバリルプロリン及びシクロイソロイシルプロリンからなる群から選択される少なくとも１種のジケトピペラジンを含む。
ジケトピペラジンは、アミノ酸が二つ結合した環状のジペプチドである。
シクロロイシルプロリンはロイシンとプロリンが結合したものであり、本明細書中でＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）と表記することがある。
シクロバリルプロリンはバリンとプロリンが結合したものであり、本明細書中でＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）と表記することがある。
シクロイソロイシルプロリンはイソロイシンとプロリンが結合したものであり、本明細書中でＣｙｃｌｏ（Ｉｌｅ－Ｐｒｏ）と表記することがある。
ジケトピペラジンは、アミノ酸が二つ結合した環状のジペプチドである。
シクロロイシルプロリンはロイシンとプロリンが結合したものであり、本明細書中でＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）と表記することがある。
シクロバリルプロリンはバリンとプロリンが結合したものであり、本明細書中でＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）と表記することがある。
シクロイソロイシルプロリンはイソロイシンとプロリンが結合したものであり、本明細書中でＣｙｃｌｏ（Ｉｌｅ－Ｐｒｏ）と表記することがある。
【0012】
本発明のビールテイストアルコール飲料では、上記ジケトピペラジンのうち最も多く含まれるジケトピペラジンの濃度が３．５ｐｐｍ以上である。
これらのジケトピペラジンの濃度が３．５ｐｐｍ以上であると、ビールテイストアルコール飲料におけるふくらみを増強することができる。特定のジケトピペラジンを所定濃度以上含有することとビールテイストアルコール飲料におけるふくらみが関連することは、これまで知られておらず、本発明者らが見出した知見である。
これらのジケトピペラジンの濃度が３．５ｐｐｍ以上であると、ビールテイストアルコール飲料におけるふくらみを増強することができる。特定のジケトピペラジンを所定濃度以上含有することとビールテイストアルコール飲料におけるふくらみが関連することは、これまで知られておらず、本発明者らが見出した知見である。
【0013】
本発明のビールテイストアルコール飲料では、ジケトピペラジンのうち最も多く含まれるジケトピペラジンの濃度が１０ｐｐｍ以下であることが好ましい。
ジケトピペラジンの濃度が高くなりすぎると、苦み、渋みといった味わいが強くなるためである。
ジケトピペラジンの濃度が高くなりすぎると、苦み、渋みといった味わいが強くなるためである。
【0014】
また、本発明のビールテイストアルコール飲料では、さらに、分子量３５～５０ｋＤａのタンパク質を含み、上記タンパク質の濃度が１ｐｐｍ以上であることが好ましい。
【0015】
分子量３５～５０ｋＤａのタンパク質は、ビールテイストアルコール飲料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動に供した場合に分子量が３５～５０ｋＤａの領域にみられるタンパク質である。ビールテイストアルコール飲料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動に供する前に、例えば、前処理としてビールテイストアルコール飲料に対して３０ｋＤａのカットオフ膜を用いて限外濾過を行ってもよい。
上記タンパク質は、好ましくは分子量が３５～４５ｋＤａのタンパク質であり、より好ましくは約４０ｋＤａのタンパク質である。本明細書では分子量３５～５０ｋＤａのタンパク質を４０ｋＤａタンパク質ともいう。
上記タンパク質は、好ましくは分子量が３５～４５ｋＤａのタンパク質であり、より好ましくは約４０ｋＤａのタンパク質である。本明細書では分子量３５～５０ｋＤａのタンパク質を４０ｋＤａタンパク質ともいう。
【0016】
４０ｋＤａタンパク質は、穀類由来タンパク質であることが好ましい。
上記穀類は、大麦、小麦、トウモロコシ、イネ、大豆からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
また、穀類が麦である場合、ビールテイストアルコール飲料の製造に使用される公知の麦に由来するタンパク質を含有することができる。このような麦としては、大麦、小麦、ライ麦、カラス麦、オート麦、エン麦などが挙げられ、好ましくは大麦である。また、発芽した麦、未発芽の麦のいずれでもよいが、好ましくは発芽した麦の麦芽である。これらは、単独で含有していてもよく、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
上記穀類は、大麦、小麦、トウモロコシ、イネ、大豆からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
また、穀類が麦である場合、ビールテイストアルコール飲料の製造に使用される公知の麦に由来するタンパク質を含有することができる。このような麦としては、大麦、小麦、ライ麦、カラス麦、オート麦、エン麦などが挙げられ、好ましくは大麦である。また、発芽した麦、未発芽の麦のいずれでもよいが、好ましくは発芽した麦の麦芽である。これらは、単独で含有していてもよく、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
【0017】
また、４０ｋＤａタンパク質としては、大麦（学名：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）由来のＳｅｒｐｉｎ Ｚ４（別名：ＢＳＺ４、ＨｏｒｖｕＺ４、Ｍａｊｏｒ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ａｌｂｕｍｉｎ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｚ）、大麦由来のＳｅｒｐｉｎ Ｚ７（別名：ＢＳＺ７又はＨｏｒｖｕＺ７）が好ましい。また、上記タンパク質において、そのアミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【0018】
ジケトピペラジンに加えて４０ｋＤａタンパク質をさらに含有させることによって、ビールテイストアルコール飲料におけるふくらみをさらに増強させることができる。
また、４０ｋＤａタンパク質の濃度は３０ｐｐｍ以下であることが好ましい。
また、４０ｋＤａタンパク質の濃度は３０ｐｐｍ以下であることが好ましい。
【0019】
また、ジケトピペラジンと４０ｋＤａタンパク質をともに含有する場合には、ジケトピペラジンと４０ｋＤａタンパク質の相乗効果によりビールテイストアルコール飲料のふくらみを増強させることができる。
【0020】
本発明のビールテイストアルコール飲料は、アルコールを含有するビールテイスト飲料であり、アルコール濃度は１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）が好ましいが、特に限定されるものではない。さらに、該ビールテイストアルコール飲料に含まれるアルコール分の由来としては、醗酵、非醗酵に限定されるものではない。なお、ここでのアルコールはエタノールを指し、後記の脂肪族アルコールは含まれない。ビールテイスト飲料とは、ビール様の風味をもつ炭酸飲料をいう。
【0021】
以下に、原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料の製造工程の例を示す。
炭素源を含有する液糖、麦又は麦芽以外のアミノ酸含有材料としての窒素源、ホップ、色素等を、温水と共に混合し、液糖溶液とする。該液糖溶液は、煮沸する。原料としてホップを用いる場合、ホップは煮沸開始前ではなく、煮沸中に、該液糖溶液に混合してもよい。この糖化液の代替として、麦芽以外の原料を用いたエキスに温水を加えたものにホップを加えて煮沸してもよい。ホップは煮沸開始から煮沸終了前のどの段階で混合してもよい。醗酵・貯酒工程などにおける条件は、知られている条件を用いればよい。得られた醗酵液を濾過し、得られた濾過液に炭酸ガスを加える。その後、容器に充填し殺菌工程を経て目的のビールテイストアルコール飲料を得る。
炭素源を含有する液糖、麦又は麦芽以外のアミノ酸含有材料としての窒素源、ホップ、色素等を、温水と共に混合し、液糖溶液とする。該液糖溶液は、煮沸する。原料としてホップを用いる場合、ホップは煮沸開始前ではなく、煮沸中に、該液糖溶液に混合してもよい。この糖化液の代替として、麦芽以外の原料を用いたエキスに温水を加えたものにホップを加えて煮沸してもよい。ホップは煮沸開始から煮沸終了前のどの段階で混合してもよい。醗酵・貯酒工程などにおける条件は、知られている条件を用いればよい。得られた醗酵液を濾過し、得られた濾過液に炭酸ガスを加える。その後、容器に充填し殺菌工程を経て目的のビールテイストアルコール飲料を得る。
【0022】
非醗酵かつアルコールを含有するビールテイストアルコール飲料は、原料用アルコールなどを加えることにより最終製品のアルコール分を調整したものでもよい。原料用アルコールの添加は、糖化工程から充填工程までのどの工程で行ってもよい。
【0023】
本発明に係るビールテイストアルコール飲料のアルコール度数は、飲料中のアルコール分の含有量（ｖ／ｖ％）を意味し、公知のいずれの方法によっても測定することができるが、例えば、振動式密度計によって測定することができる。具体的には、飲料から濾過又は超音波によって炭酸ガスを抜いた試料を調製し、そして、その試料を直火蒸留し、得られた留液の１５℃における密度を測定し、国税庁所定分析法（平１９国税庁訓令第６号、平成１９年６月２２日改訂）の付表である「第２表アルコール分と密度（１５℃）及び比重（１５/１５℃）換算表」を用いて換算して求めることができる。アルコール度が１．０％未満の低濃度の場合は、市販のアルコール測定装置や、ガスクロマトグラフィーを用いても良い。
【0024】
本発明に係るビールテイストアルコール飲料に、酒感を付与する観点から、脂肪族アルコールを添加してもよい。脂肪族アルコールとしては、公知のものであれば特に制限されないが、炭素数４～５の脂肪族アルコールが好ましい。本発明において、好ましい脂肪族アルコールとしては、炭素数４のものとして、２－メチル－１－プロパノール、１－ブタノール等が、炭素数５のものとして、３－メチル－１－ブタノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール等が挙げられる。これらは１種又は２種以上の組み合せで用いることができる。
炭素数４～５の脂肪族アルコールの含有量は好ましくは０．０００２～０．０００７質量％であり、より好ましくは０．０００３～０．０００６質量％である。本明細書において、脂肪族アルコールの含有量は、ヘッドスペースガスクロマトグラフ法を用いて測定することができる。
炭素数４～５の脂肪族アルコールの含有量は好ましくは０．０００２～０．０００７質量％であり、より好ましくは０．０００３～０．０００６質量％である。本明細書において、脂肪族アルコールの含有量は、ヘッドスペースガスクロマトグラフ法を用いて測定することができる。
【0025】
本発明に係るビールテイストアルコール飲料に含まれる糖質とは、食品の栄養表示基準（平成１５年厚生労働省告示第１７６号）に基づく糖質をいう。具体的には、糖質は、食品から、タンパク質、脂質、食物繊維、灰分、アルコール分及び水分を除いたものをいう。また、食品中の糖質の量は、当該食品の重量から、タンパク質、脂質、食物繊維、灰分及び水分の量を控除することにより算定される。この場合に、タンパク質、脂質、食物繊維、灰分及び水分の量は、栄養表示基準に掲げる方法により測定する。具体的には、タンパク質の量は窒素定量換算法で測定し、脂質の量はエーテル抽出法、クロロホルム・メタノール混液抽出法、ゲルベル法、酸分解法またはレーゼゴットリーブ法で測定し、食物繊維の量は高速液体クロマトグラフ法またはプロスキー法で測定し、灰分の量は酢酸マグネシウム添加灰化法、直接灰化法または硫酸添加灰化法で測定し、水分の量はカールフィッシャー法、乾燥助剤法、減圧過熱乾燥法、常圧加熱乾燥法またはプラスチックフィルム法で測定する。
【0026】
本発明に係るビールテイストアルコール飲料は、近年の低糖質嗜好に合わせて、低糖質であってもよい。従って、本発明に係るビールテイストアルコール飲料の糖質の含有量は、２．５ｇ／１００ｍＬ未満であってもよく、０．５ｇ／１００ｍＬ未満であってもよい。また、下限は特に設定されないが、通常、０．１ｇ／１００ｍＬ程度であり、例えば、０．１５ｇ／１００ｍＬ以上であっても、０．２ｇ／１００ｍＬ以上であってもよい。
【0027】
本発明に係るビールテイストアルコール飲料においては、原料の一部にホップを用いることができる。
ホップを使用する際には、ビール等の製造に使用される通常のペレットホップ、粉末ホップ、ホップエキスを、所望の香味に応じて適宜選択して使用することができる。また、イソ化ホップ、還元ホップなどのホップ加工品を用いてもよい。本発明に係るビールテイストアルコール飲料に使用されるホップには、これらのものが包含される。また、ホップの添加量は特に限定されないが、典型的には、飲料全量に対して０．０００１～１重量％程度である。
ホップを使用する際には、ビール等の製造に使用される通常のペレットホップ、粉末ホップ、ホップエキスを、所望の香味に応じて適宜選択して使用することができる。また、イソ化ホップ、還元ホップなどのホップ加工品を用いてもよい。本発明に係るビールテイストアルコール飲料に使用されるホップには、これらのものが包含される。また、ホップの添加量は特に限定されないが、典型的には、飲料全量に対して０．０００１～１重量％程度である。
【0028】
本発明に係るビールテイストアルコール飲料は、本発明の効果を妨げない範囲で、必要に応じて、その他の原料を用いてもよい。例えば、甘味料（高甘味度甘味料を含む）、苦味料、香料、酵母エキス、カラメル色素などの着色料、大豆サポニンやキラヤサポニン等の植物抽出サポニン系物質、コーンや大豆などの植物タンパク質およびペプチド含有物、ウシ血清アルブミン等のタンパク質系物質、食物繊維やアミノ酸などの調味料、アスコルビン酸等の酸化防止剤を、本発明の効果を妨げない範囲で必要に応じて用いることができる。
【0029】
本発明に係るビールテイストアルコール飲料は、容器詰めとすることができる。容器の形態は何ら制限されず、ビン、缶、樽、またはペットボトル等の密封容器に充填して、容器入り飲料とすることができる。
【0030】
本発明のビールテイストアルコール飲料の製造方法は、特に限定されるものではないが、原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料に対して、ジケトピペラジンを所定量添加する方法が例示される。
また、原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料に対して、４０ｋＤａタンパク質を添加することが好ましい。
添加するジケトピペラジン及び４０ｋＤａタンパク質の調製は例えば後述する実施例に記載の手順で行うことができる。
また、ジケトピペラジン及び４０ｋＤａタンパク質については、ビールテイストアルコール飲料の製造過程における諸条件を調整することによって、これらの含有量が増えるようにしてもよい。
また、原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料に対して、４０ｋＤａタンパク質を添加することが好ましい。
添加するジケトピペラジン及び４０ｋＤａタンパク質の調製は例えば後述する実施例に記載の手順で行うことができる。
また、ジケトピペラジン及び４０ｋＤａタンパク質については、ビールテイストアルコール飲料の製造過程における諸条件を調整することによって、これらの含有量が増えるようにしてもよい。
【実施例】
【0031】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
【0032】
（ジケトピペラジンの精製）
下記に従いジケトピペラジンの精製を行った。
（１）ビールのＨＰ２０による分画
６０Ｌのビールを、１０Ｌのダイヤイオン(登録商標)ＨＰ２０（三菱ケミカル株式会社製）を用いて分画した。ＨＰ２０は使用前に、エタノールにより３回洗浄し、次いで５０％エタノールにより３回洗浄した。洗浄したＨＰ２０を大量分画用カラムへ充填し、水により置換した。脱気させた６０Ｌのビールへ同量の蒸留水を混合し、中圧ポンプを用いてＨＰ２０カラムへ流した。ＨＰ２０カラムを素通りした溶液を素通り画分として得た。中圧ポンプを用いて４０Ｌの蒸留水を流し、溶出液を水溶出画分として得た。同様に、含水エタノール（１０％エタノール、３０％エタノール、および７０％エタノール）を４０Ｌずつ流し、溶出液をそれぞれ１０％エタノール溶出画分、３０％エタノール溶出画分、および７０％エタノール溶出画分として得た。それぞれの溶出画分は、エバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて、乾燥体として冷蔵保存した。
下記に従いジケトピペラジンの精製を行った。
（１）ビールのＨＰ２０による分画
６０Ｌのビールを、１０Ｌのダイヤイオン(登録商標)ＨＰ２０（三菱ケミカル株式会社製）を用いて分画した。ＨＰ２０は使用前に、エタノールにより３回洗浄し、次いで５０％エタノールにより３回洗浄した。洗浄したＨＰ２０を大量分画用カラムへ充填し、水により置換した。脱気させた６０Ｌのビールへ同量の蒸留水を混合し、中圧ポンプを用いてＨＰ２０カラムへ流した。ＨＰ２０カラムを素通りした溶液を素通り画分として得た。中圧ポンプを用いて４０Ｌの蒸留水を流し、溶出液を水溶出画分として得た。同様に、含水エタノール（１０％エタノール、３０％エタノール、および７０％エタノール）を４０Ｌずつ流し、溶出液をそれぞれ１０％エタノール溶出画分、３０％エタノール溶出画分、および７０％エタノール溶出画分として得た。それぞれの溶出画分は、エバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて、乾燥体として冷蔵保存した。
【0033】
（２）３０％エタノール溶出画分のＬＨ－２０分画
ＨＰ２０分画物のうち、３０％エタノール溶出画分について、１．２ｋｇのＳｅｐｈａｄｅｘ(登録商標)ＬＨ－２０を用いて分画した。エタノールにより洗浄したＬＨ－２０を大量分画用カラムへ充填し、水により置換した。ＨＰ２０分画により得られた３０％エタノール溶出画分（８７．９ｇ）のうち、１７．６ｇを蒸留水に溶解させ、ＬＨ－２０カラムへアプライした。中圧ポンプを用いて１３．５Ｌの蒸留水を流し、水溶出画分－１～６を得た。次いで、含水エタノール（３５％エタノール、７０％エタノール、および１００％エタノール）を７Ｌずつ流し、溶出液をそれぞれ３５％エタノール溶出画分、７０％エタノール溶出画分、および１００％エタノール溶出画分として得た。それぞれの溶出画分は、エバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて、乾燥体として冷蔵保存した。
ＨＰ２０分画物のうち、３０％エタノール溶出画分について、１．２ｋｇのＳｅｐｈａｄｅｘ(登録商標)ＬＨ－２０を用いて分画した。エタノールにより洗浄したＬＨ－２０を大量分画用カラムへ充填し、水により置換した。ＨＰ２０分画により得られた３０％エタノール溶出画分（８７．９ｇ）のうち、１７．６ｇを蒸留水に溶解させ、ＬＨ－２０カラムへアプライした。中圧ポンプを用いて１３．５Ｌの蒸留水を流し、水溶出画分－１～６を得た。次いで、含水エタノール（３５％エタノール、７０％エタノール、および１００％エタノール）を７Ｌずつ流し、溶出液をそれぞれ３５％エタノール溶出画分、７０％エタノール溶出画分、および１００％エタノール溶出画分として得た。それぞれの溶出画分は、エバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて、乾燥体として冷蔵保存した。
【0034】
（３）ジケトピペラジンの分離
ＬＨ－２０分画により得られた水溶出画分－３（１．０４ｇ）のうち８６．７ｍｇについて、ＨＰＬＣ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＰＡＱ，２０×２５０ｍｍ）を用いて、１０％エタノールにより溶出させた。次いで、１５ｍｉｎから２０ｍｉｎの溶出液を濃縮し、ＨＰＬＣ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＰＡＱ，２０×２５０ｍｍ）を用いて、エタノール－水（５：９５→２０：８０）の濃度勾配の混液により溶出させ、化合物１（６．７ｍｇ，ｔＲ＝２５ｍｉｎ）を得た。同様に、２７．５ｍｉｎから４０ｍｉｎの溶出液を濃縮し、ＨＰＬＣ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＰＡＱ，２０×２５０ｍｍ）を用いて、エタノール－水（５：９５→２０：８０）の濃度勾配の混液により溶出させ、化合物２（２．２ｍｇ，ｔＲ＝４３ｍｉｎ）および化合物３（２．６ｍｇ，ｔＲ＝４６ｍｉｎ）を得た。
化合物１は、ＭＳ、ＮＭＲの物理学的データの解析および文献値によりＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｖａｌ）であると同定した。化合物２は、ＭＳ、ＮＭＲの物理学的データの解析および文献値によりＣｙｃｌｏ（Ｉｌｅ－Ｐｒｏ）であると同定した。化合物３は、ＭＳ、ＮＭＲの物理学的データの解析および文献値によりＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）であると同定した。
参照した参考文献は、Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ２００７，５５，７５－７９．である。
使用した分析機器は以下の通りである。
ＬＣ－ＭＳ；Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
ＮＭＲ；ＡＶＡＮＣＥ４００，Ｂｒｕｋｅｒ社製
ＬＨ－２０分画により得られた水溶出画分－３（１．０４ｇ）のうち８６．７ｍｇについて、ＨＰＬＣ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＰＡＱ，２０×２５０ｍｍ）を用いて、１０％エタノールにより溶出させた。次いで、１５ｍｉｎから２０ｍｉｎの溶出液を濃縮し、ＨＰＬＣ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＰＡＱ，２０×２５０ｍｍ）を用いて、エタノール－水（５：９５→２０：８０）の濃度勾配の混液により溶出させ、化合物１（６．７ｍｇ，ｔＲ＝２５ｍｉｎ）を得た。同様に、２７．５ｍｉｎから４０ｍｉｎの溶出液を濃縮し、ＨＰＬＣ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＰＡＱ，２０×２５０ｍｍ）を用いて、エタノール－水（５：９５→２０：８０）の濃度勾配の混液により溶出させ、化合物２（２．２ｍｇ，ｔＲ＝４３ｍｉｎ）および化合物３（２．６ｍｇ，ｔＲ＝４６ｍｉｎ）を得た。
化合物１は、ＭＳ、ＮＭＲの物理学的データの解析および文献値によりＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｖａｌ）であると同定した。化合物２は、ＭＳ、ＮＭＲの物理学的データの解析および文献値によりＣｙｃｌｏ（Ｉｌｅ－Ｐｒｏ）であると同定した。化合物３は、ＭＳ、ＮＭＲの物理学的データの解析および文献値によりＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）であると同定した。
参照した参考文献は、Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ２００７，５５，７５－７９．である。
使用した分析機器は以下の通りである。
ＬＣ－ＭＳ；Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
ＮＭＲ；ＡＶＡＮＣＥ４００，Ｂｒｕｋｅｒ社製
【0035】
（４０ｋＤａタンパク質の精製）
市販のビール１Ｌから下記に従い４０ｋＤａタンパク質の精製を行った。
市販のビール１Ｌから下記に従い４０ｋＤａタンパク質の精製を行った。
【0036】
（１）陽イオン交換樹脂による分画
陽イオン交換樹脂ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ５０ｍＬを空きカラムに入れた。ビールを樹脂に吸着させた。その後、樹脂をカラムに移し替え、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄した。次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）＋０．５Ｍ－ＮａＣｌで溶出し画分を集めた。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価し、４０ｋＤａのタンパク質が含まれる画分を集め陽イオン交換樹脂結合画分とした。
陽イオン交換樹脂ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ５０ｍＬを空きカラムに入れた。ビールを樹脂に吸着させた。その後、樹脂をカラムに移し替え、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄した。次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）＋０．５Ｍ－ＮａＣｌで溶出し画分を集めた。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価し、４０ｋＤａのタンパク質が含まれる画分を集め陽イオン交換樹脂結合画分とした。
【0037】
（２）限外濾過（バッファー交換）
水洗浄した限外ろ過ユニット（Ｍｅｒｃｋ製 Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ ３０Ｋ）に（１）で得た陽イオン交換樹脂結合画分を１０ｍＬずつ添加し、３５００ｒｐｍで遠心し限外ろ過し濃縮液を得た。
水洗浄した限外ろ過ユニット（Ｍｅｒｃｋ製 Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ ３０Ｋ）に（１）で得た陽イオン交換樹脂結合画分を１０ｍＬずつ添加し、３５００ｒｐｍで遠心し限外ろ過し濃縮液を得た。
【0038】
（３）硫安分画
２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）＋２Ｍ硫酸アンモニウムをビーカーに入れ、（２）で得た濃縮液を滴下、撹拌した。次に懸濁液を遠心（２３３０ｇ、１０分間、室温）した。上清を別容器に集めた。集めた溶液は限外ろ過ユニットを用いて濃縮した。濃縮液を２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に加え遠心（２３３０ｇ、１０分間、室温）し、濃縮を行い、４０ｋＤａタンパク質精製品（Ｂｒａｄｆｏｒｄ定量（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）換算）、２０．４ｍｇ／ｍＬ、２．２１ｍＬ）を得た。得られた４０ｋＤａタンパク質の純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）＋２Ｍ硫酸アンモニウムをビーカーに入れ、（２）で得た濃縮液を滴下、撹拌した。次に懸濁液を遠心（２３３０ｇ、１０分間、室温）した。上清を別容器に集めた。集めた溶液は限外ろ過ユニットを用いて濃縮した。濃縮液を２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に加え遠心（２３３０ｇ、１０分間、室温）し、濃縮を行い、４０ｋＤａタンパク質精製品（Ｂｒａｄｆｏｒｄ定量（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）換算）、２０．４ｍｇ／ｍＬ、２．２１ｍＬ）を得た。得られた４０ｋＤａタンパク質の純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
【0039】
４０ｋＤａタンパク質を酵素で消化後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することにより、タンパク質の同定を試みた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した４０ｋＤａ付近のバンドを切り出し、ジチオスレイトールによる還元（５６℃、１時間）、ヨードアセトアミドによるカルバミドメチル化（遮光下，室温，４５分間）を行った。次いで０．０１％ＰｒｏｔｅａｓｅＭａｘ含有１０ｎｇ／μＬキモトリプシン溶液（５ｍＭ塩化カルシウム，５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液）１５μＬ、５ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液１５μＬを添加し一晩インキュベートした後、酵素消化液を回収した。回収した溶液を減圧乾固し、０．１％ギ酸溶液に再溶解した。
これをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した４０ｋＤａ付近のバンドを切り出し、ジチオスレイトールによる還元（５６℃、１時間）、ヨードアセトアミドによるカルバミドメチル化（遮光下，室温，４５分間）を行った。次いで０．０１％ＰｒｏｔｅａｓｅＭａｘ含有１０ｎｇ／μＬキモトリプシン溶液（５ｍＭ塩化カルシウム，５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液）１５μＬ、５ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液１５μＬを添加し一晩インキュベートした後、酵素消化液を回収した。回収した溶液を減圧乾固し、０．１％ギ酸溶液に再溶解した。
これをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。
【0040】
（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定）
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定は下記の条件で行った。
使用装置：ダイレクトフローｎａｎｏＬＣシステムＥａｓｙ－ｎＬＣ １０００ＴＭ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
分析カラム：ＮＡＮＯ ＨＰＬＣ ＣＡＰＩＬＬＡＲＹ ＣＯＬＵＭＮ（日京テクノス（株））
液体クロマトグラフ質量分析計 Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
移動相：Ａ液：０．１％ギ酸／水、Ｂ液：０．１％ギ酸／アセトニトリル
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
グラジエント：０－４０％Ｂ／０－３０ｍｉｎ、４０－６０％Ｂ／３０－３５ｍｉｎ、６０－９０％Ｂ／３５－３７ｍｉｎ、９０％Ｂ／３７－４５ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
イオン化モード：ＥＳＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：ＭＳ１（ｍ／ｚ ３５０－１７５０）
Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎモード
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定は下記の条件で行った。
使用装置：ダイレクトフローｎａｎｏＬＣシステムＥａｓｙ－ｎＬＣ １０００ＴＭ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
分析カラム：ＮＡＮＯ ＨＰＬＣ ＣＡＰＩＬＬＡＲＹ ＣＯＬＵＭＮ（日京テクノス（株））
液体クロマトグラフ質量分析計 Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
移動相：Ａ液：０．１％ギ酸／水、Ｂ液：０．１％ギ酸／アセトニトリル
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
グラジエント：０－４０％Ｂ／０－３０ｍｉｎ、４０－６０％Ｂ／３０－３５ｍｉｎ、６０－９０％Ｂ／３５－３７ｍｉｎ、９０％Ｂ／３７－４５ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
イオン化モード：ＥＳＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：ＭＳ１（ｍ／ｚ ３５０－１７５０）
Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎモード
【0041】
（４）タンパク質の解析
タンパク質同定は下記の条件で行った。
検索ソフト：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．２．０．３８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
生物種：大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
検索条件：消化酵素：Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ
プリカーサーイオン質量誤差範囲：Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ、±１０ｐｐｍ
プロダクトイオン質量誤差範囲：±０．０２Ｄａ
最大ミスクリベージ数：５
コンフィデンスレベル（Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ）：Ｈｉｇｈ（確からしさ３段階のうち最も確率が高いレベル）
データベース：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ
タンパク質同定は下記の条件で行った。
検索ソフト：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．２．０．３８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
生物種：大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
検索条件：消化酵素：Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ
プリカーサーイオン質量誤差範囲：Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ、±１０ｐｐｍ
プロダクトイオン質量誤差範囲：±０．０２Ｄａ
最大ミスクリベージ数：５
コンフィデンスレベル（Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ）：Ｈｉｇｈ（確からしさ３段階のうち最も確率が高いレベル）
データベース：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ
【0042】
その結果、４０ｋＤａタンパク質は大麦由来のＳｅｒｐｉｎ Ｚ４（配列カバー率：７７．２％）及び大麦由来のＳｅｒｐｉｎ Ｚ７（配列カバー率：７２．８％）であることがわかった。
【0043】
（市販のビールテイストアルコール飲料にジケトピペラジンを添加した場合の官能評価）
市販のビールテイストアルコール飲料に、ジケトピペラジンを添加し、ふくらみの官能評価を行った。
当該ビールテイストアルコール飲料は、原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料である。
当該ビールテイストアルコール飲料の原材料はホップ、糖類、大豆たんぱく、酵母エキスであり、栄養成分として１００ｍｌあたりアルコール分５％、タンパク質０．２ｇ、糖質２．７ｇ、プリン体約２．４ｍｇを含む。
市販のビールテイストアルコール飲料に、ジケトピペラジンを添加し、ふくらみの官能評価を行った。
当該ビールテイストアルコール飲料は、原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料である。
当該ビールテイストアルコール飲料の原材料はホップ、糖類、大豆たんぱく、酵母エキスであり、栄養成分として１００ｍｌあたりアルコール分５％、タンパク質０．２ｇ、糖質２．７ｇ、プリン体約２．４ｍｇを含む。
【0044】
官能評価の基準点は以下の通りである。
専門パネル５名により０．０５点刻みで下記の基準によりスコア化、そのスコア値を平均化した。
ふくらみ強度は以下の基準である。
０点：全く感じられない
１点：やや感じられる
２点：明確に感じる
３点：非常に感じる
基準点として、評価対象とする上記市販のビールテイストアルコール飲料とは異なる市販のビールテイストアルコール飲料を基準のビールテイストアルコール飲料（Ｉ）としてふくらみを０．７点とした。また、他の市販のビールテイストアルコール飲料を基準のビールテイストアルコール飲料（ＩＩ）としてそのふくらみを基準点の１．５点とした。
当該基準のビールテイストアルコール飲料（Ｉ）は原料中の麦芽の比率が０重量％を超え、５０重量％未満であるビールテイストアルコール飲料である。
原材料は発泡酒、麦芽、ホップ、糖類、食物繊維、スピリッツ（小麦）であり、栄養成分として１００ｍｌあたりアルコール分４％、タンパク質０～０．２ｇ、糖質０．５～０．８ｇ、プリン体約２．０ｍｇを含む。
当該基準のビールテイストアルコール飲料（ＩＩ）は原料中の麦芽の比率が５０重量％以上であるビールテイストアルコール飲料である。
原材料は麦芽、ホップであり、栄養成分として１００ｍｌあたりアルコール分５．５％、タンパク質０．４～０．６ｇ、糖質３．６ｇ、プリン体約１２．５ｍｇを含む。
専門パネル５名により０．０５点刻みで下記の基準によりスコア化、そのスコア値を平均化した。
ふくらみ強度は以下の基準である。
０点：全く感じられない
１点：やや感じられる
２点：明確に感じる
３点：非常に感じる
基準点として、評価対象とする上記市販のビールテイストアルコール飲料とは異なる市販のビールテイストアルコール飲料を基準のビールテイストアルコール飲料（Ｉ）としてふくらみを０．７点とした。また、他の市販のビールテイストアルコール飲料を基準のビールテイストアルコール飲料（ＩＩ）としてそのふくらみを基準点の１．５点とした。
当該基準のビールテイストアルコール飲料（Ｉ）は原料中の麦芽の比率が０重量％を超え、５０重量％未満であるビールテイストアルコール飲料である。
原材料は発泡酒、麦芽、ホップ、糖類、食物繊維、スピリッツ（小麦）であり、栄養成分として１００ｍｌあたりアルコール分４％、タンパク質０～０．２ｇ、糖質０．５～０．８ｇ、プリン体約２．０ｍｇを含む。
当該基準のビールテイストアルコール飲料（ＩＩ）は原料中の麦芽の比率が５０重量％以上であるビールテイストアルコール飲料である。
原材料は麦芽、ホップであり、栄養成分として１００ｍｌあたりアルコール分５．５％、タンパク質０．４～０．６ｇ、糖質３．６ｇ、プリン体約１２．５ｍｇを含む。
【0045】
官能評価の手順は以下の通りである。
（１）ビールテイストアルコール飲料を最終容量の１／１０容量（ｖ／ｖ）バイアル瓶に分注する
（２）ジケトピペラジンを任意の重量で秤量して加える
（３）３０秒ソニケーションする
（４）３０分室温で静置する
（５）ビールテイストアルコール飲料を最終容量にフィルアップする
（６）分注して飲み込み評価する
（１）ビールテイストアルコール飲料を最終容量の１／１０容量（ｖ／ｖ）バイアル瓶に分注する
（２）ジケトピペラジンを任意の重量で秤量して加える
（３）３０秒ソニケーションする
（４）３０分室温で静置する
（５）ビールテイストアルコール飲料を最終容量にフィルアップする
（６）分注して飲み込み評価する
【0046】
（市販のビールテイストアルコール飲料の分析）
官能評価に使用した市販のビールテイストアルコール飲料に含まれるジケトピペラジンの濃度を以下の手順によりＬＣ－ＭＳで定量した。
（１）標品の調製及び検量線の作製
ジケトピペラジンについて、それぞれ下記の濃度となるように希釈し、０．２２μｍのフィルターに通してから測定に供した。
最終濃度：０．００１ｐｐｍ，０．０２５ｐｐｍ，０．０５０ｐｐｍ，０．１００ｐｐｍ，０．２００ｐｐｍ，０．３００ｐｐｍ，０．５００ｐｐｍ，０．７５０ｐｐｍ，１．０００ｐｐｍ
（１ｐｐｍ＝１μｇ／ｍＬである）
希釈液には、５％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液を用いた。
なお、標品の分析結果において、検量線の直線性が保たれる範囲（Ｒ２＞０．９９）に測定値が入るような希釈倍率の測定値を採用した。
官能評価に使用した市販のビールテイストアルコール飲料に含まれるジケトピペラジンの濃度を以下の手順によりＬＣ－ＭＳで定量した。
（１）標品の調製及び検量線の作製
ジケトピペラジンについて、それぞれ下記の濃度となるように希釈し、０．２２μｍのフィルターに通してから測定に供した。
最終濃度：０．００１ｐｐｍ，０．０２５ｐｐｍ，０．０５０ｐｐｍ，０．１００ｐｐｍ，０．２００ｐｐｍ，０．３００ｐｐｍ，０．５００ｐｐｍ，０．７５０ｐｐｍ，１．０００ｐｐｍ
（１ｐｐｍ＝１μｇ／ｍＬである）
希釈液には、５％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液を用いた。
なお、標品の分析結果において、検量線の直線性が保たれる範囲（Ｒ２＞０．９９）に測定値が入るような希釈倍率の測定値を採用した。
【0047】
ＬＣ－ＭＳの測定条件は以下の通りである 。
ＬＣ－ＭＳ：エービー・サイエックス社製Ｘ５００Ｒ
分離カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製 ＨＳＳＴ３ １．８μｍ，２．１ｘ１５０ｍｍ
溶離液：
Ａ液：０．１％ギ酸／水、Ｂ液：０．１％ギ酸／アセトニトリル
グラジエント：Ａ液：Ｂ液＝９８：２→２：９８（２７ｍｉｎ）
注入量：５μＬ
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラムオーブン：４０℃
（ＭＳ）
イオン化モード：ＥＳＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：ＭＳ１（ｍ／ｚ １００－１０００）
Ｄａｔａ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎモード
イオン源温度：３５０℃
ＬＣ－ＭＳ：エービー・サイエックス社製Ｘ５００Ｒ
分離カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製 ＨＳＳＴ３ １．８μｍ，２．１ｘ１５０ｍｍ
溶離液：
Ａ液：０．１％ギ酸／水、Ｂ液：０．１％ギ酸／アセトニトリル
グラジエント：Ａ液：Ｂ液＝９８：２→２：９８（２７ｍｉｎ）
注入量：５μＬ
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラムオーブン：４０℃
（ＭＳ）
イオン化モード：ＥＳＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：ＭＳ１（ｍ／ｚ １００－１０００）
Ｄａｔａ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎモード
イオン源温度：３５０℃
【0048】
（２）市販のビールテイストアルコール飲料からの測定用試料の調製
市販のビールテイストアルコール飲料をソニケーションにより脱気し、気泡が落ち着いてから適宜希釈し、０．２２μｍのフィルターに通してから測定に供した。
希釈液には、５％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液を用いた。
市販のビールテイストアルコール飲料に含まれる各ジケトピペラジンの濃度をコントロールとした。
市販のビールテイストアルコール飲料をソニケーションにより脱気し、気泡が落ち着いてから適宜希釈し、０．２２μｍのフィルターに通してから測定に供した。
希釈液には、５％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液を用いた。
市販のビールテイストアルコール飲料に含まれる各ジケトピペラジンの濃度をコントロールとした。
【0049】
（実施例１：Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）添加による評価）
市販のビールテイストアルコール飲料に含まれるＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）の濃度は３．１２６ｐｐｍであった。
これに対してＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）濃度が３．５ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍにそれぞれなるようにＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）を加えて官能評価を行った。
官能評価の結果を表１に示した。
市販のビールテイストアルコール飲料に含まれるＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）の濃度は３．１２６ｐｐｍであった。
これに対してＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）濃度が３．５ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍにそれぞれなるようにＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）を加えて官能評価を行った。
官能評価の結果を表１に示した。
【0050】
【表1】
【0051】
表１に示す結果から、原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料につき、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）濃度が３．５ｐｐｍ以上であるとふくらみが増強されることが分かる。
【0052】
（実施例２：Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）と４０ｋＤａタンパク質の相乗効果の評価）
市販のビールテイストアルコール飲料に、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）を加えてＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）の濃度を５ｐｐｍとした飲料を基準として、さらに４０ｋＤａタンパク質を加えることによりＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）と４０ｋＤａタンパク質の相乗効果を評価した。４０ｋＤａタンパク質の濃度は１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍとした。４０ｋＤａタンパク質には、上記で精製したものを使用した。
また、対比のために市販のビールテイストアルコール飲料に４０ｋＤａタンパク質だけを添加しての評価も行った。
官能評価の結果を表２に示した。
市販のビールテイストアルコール飲料に、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）を加えてＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）の濃度を５ｐｐｍとした飲料を基準として、さらに４０ｋＤａタンパク質を加えることによりＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）と４０ｋＤａタンパク質の相乗効果を評価した。４０ｋＤａタンパク質の濃度は１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍとした。４０ｋＤａタンパク質には、上記で精製したものを使用した。
また、対比のために市販のビールテイストアルコール飲料に４０ｋＤａタンパク質だけを添加しての評価も行った。
官能評価の結果を表２に示した。
【0053】
【表2】
【0054】
表２に示す結果から、市販のビールテイストアルコール飲料に、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ）を加えてさらに４０ｋＤａタンパク質を加えることにより、ふくらみをより増強できることが分かる。
対比試料の結果から、４０ｋＤａタンパク質を添加するだけでもふくらみを増強することができることがわかる。しかしながら、上記試料２における官能評価のコントロールからの増加値（０．１２）と対比試料における官能評価のコントロールからの増加値（０．０７）の和で求められる、ジケトピペラジンと４０ｋＤａタンパク質を併用したときの相加効果（０．１９）よりも、試料５における官能評価のコントロールからの増加値（０．２４）が大きいことから、ジケトピペラジンと４０ｋＤａタンパク質を併用することにより、予想できない相乗効果が発揮されているといえる。
対比試料の結果から、４０ｋＤａタンパク質を添加するだけでもふくらみを増強することができることがわかる。しかしながら、上記試料２における官能評価のコントロールからの増加値（０．１２）と対比試料における官能評価のコントロールからの増加値（０．０７）の和で求められる、ジケトピペラジンと４０ｋＤａタンパク質を併用したときの相加効果（０．１９）よりも、試料５における官能評価のコントロールからの増加値（０．２４）が大きいことから、ジケトピペラジンと４０ｋＤａタンパク質を併用することにより、予想できない相乗効果が発揮されているといえる。
【産業上の利用可能性】
【0055】
本発明によれば、原料に麦芽を含まないビールテイストアルコール飲料において、ふくらみが増強された飲料を提供することができる。