特許 7411674 組換えｅｒＩＬ－１５ ＮＫ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-27

(45)【発行日】2024-01-11

(54)【発明の名称】組換えｅｒＩＬ－１５ ＮＫ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20231228BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231228BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231228BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

C12N5/10

C12N15/24

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/63 Z

A61K35/17

A61P35/00

【請求項の数】 25

(21)【出願番号】P 2021555571

(86)(22)【出願日】2020-02-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-19

(86)【国際出願番号】 US2020019991

(87)【国際公開番号】W WO2020205100

(87)【国際公開日】2020-10-08

【審査請求日】2021-09-14

(31)【優先権主張番号】62/819,256

(32)【優先日】2019-03-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】518203696

【氏名又は名称】ナントセル，インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】515258402

【氏名又は名称】ナントバイオ，インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】520393015

【氏名又は名称】イミュニティーバイオ、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】パトリック、スン－シオン

(72)【発明者】

【氏名】シャールーズ、ラビザド

(72)【発明者】

【氏名】カイバン、ニアジ

(72)【発明者】

【氏名】ハンス、クリンゲマン

【審査官】小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１３－５０１８１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１６５２９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】羽室 淳爾，ＩＬ－１５，Biotherapy，2002年，Vol. 16(4)，pp. 329-348

【文献】Sahm C. et al.，Expression of IL-15 in NK cells results in rapid enrichment and selective cytotoxicity of gene-modified effectors that carry a tumor-specific antigen receptor，Cancer Immunol Immunother，2012年，Vol. 61(9)，pp. 1451-1461

【文献】Bergamaschi C. et al.，Secretion and biological activity of short signal peptide IL-15 is chaperoned by IL-15 receptor alpha in vivo，J Immunol，2009年，Vol. 183(5)，pp. 3064-3072

【文献】Fujii R. et al.，A potential therapy for chordoma via antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity employing NK or high-affinity NK cells in combination with cetuximab，J Neurosurg，2018年，Vol. 128(5)，pp. 1419-1427

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５で表される配列を含むｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５をコードする第１のセグメントを含む組換え核酸を含む、遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項2】

前記ＮＫ細胞がＮＫ－９２細胞である、請求項１に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項3】

前記組換え核酸がＤＮＡである、請求項１又は２に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項4】

前記組換え核酸が線状プラスミドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項5】

前記組換え核酸が、ＣＤ１６又は高親和性ＣＤ１６をコードする第２のセグメントをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項6】

前記組換え核酸が、キメラ抗原受容体をコードする第３のセグメントをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項7】

前記組換え核酸が、免疫刺激をもたらす、チェックポイント阻害を妨げるタンパク質、免疫抑制に関与するサイトカインに結合する／サイトカインを阻害するタンパク質、及び／又はＩＬ－１５受容体アルファ鎖をコードする第４のセグメントをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項8】

前記組換え核酸が、（ａ）前記遺伝子改変されたＮＫ細胞を外来性サイトカインから独立させるのに、及び（ｂ）前記遺伝子改変されたＮＫ細胞の近くの他の免疫コンピテント細胞の刺激／活性化を可能にするのに十分な量で、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５の発現を引き起こすのに十分な強度を有するプロモーターを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項9】

前記ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５におけるＩＬ－１５部分が、コドン最適化ヒトＩＬ－１５配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項10】

ＣＤ１６を介して前記遺伝子改変されたＮＫ細胞につながれた抗体をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項11】

インビトロでＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法であって、前記方法は、
前記細胞に組換え核酸を導入することを含み、前記組換え核酸は、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５をコードする第１のセグメントを含み、前記第１のセグメントが配列番号４で表される配列を含む、方法。

【請求項12】

前記ＮＫ細胞がＮＫ－９２細胞である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記組換え核酸がＤＮＡである、請求項１１又は１２に記載の方法。

【請求項14】

前記組換え核酸が線状プラスミドである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記組換え核酸が、ＣＤ１６又は高親和性ＣＤ１６をコードする第２のセグメントをさらに含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記組換え核酸が、キメラ抗原受容体をコードする第３のセグメントをさらに含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記組換え核酸が、免疫刺激をもたらす、チェックポイント阻害を妨げるタンパク質、免疫抑制に関与するサイトカインに結合する／サイトカインを阻害するタンパク質、及び／又はＩＬ－１５受容体アルファ鎖をコードする第４のセグメントをさらに含む、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記組換え核酸が、（ａ）遺伝子改変されたＮＫ細胞を外来性サイトカインから独立させるのに、及び（ｂ）遺伝子改変されたＮＫ細胞の近くの他の免疫コンピテント細胞の刺激／活性化を可能にするのに十分な量で、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５の発現を引き起こすのに十分な強度を有するプロモーターを含む、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５におけるＩＬ－１５部分が、コドン最適化ヒトＩＬ－１５配列を含む、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

ＣＤ１６を介して前記遺伝子改変されたＮＫ細胞につながれた抗体をさらに含む、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞と組み合わせた薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。

【請求項22】

患者への注入のために製剤化された、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

投与単位当たり少なくとも１×１０^９細胞を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項24】

癌の治療のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたＮＫ細胞を含んでなる医薬組成物。

【請求項25】

前記治療が、ＴＭＥに侵入する薬物の投与、免疫抑制を低下させる薬物の投与、免疫コンピテント細胞を刺激する薬物の投与、癌ワクチン組成物の投与、及び／又は免疫応答の維持を助け且つ記憶細胞の発達を促進する薬物の投与をさらに含む、請求項２４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の参照】

【0001】

本出願は、２０１９年３月１５日に提出された発明者らの米国仮特許出願第６２／８１９，２５６号明細書に対する優先権の利益を主張し、この内容は、その全体が参照によって本明細書において援用される。

【0002】

配列表
サイズが８ｋｂで、２０２０年２月１９日に作成され、本出願と共にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子出願されたＳｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、その全体が参照によって援用される。

【技術分野】

【0003】

本開示は、ＩＬ－１５を発現する遺伝子改変された免疫細胞に関し、特に、本開示は、改変されたＩＬ－１５を発現し、細胞内に保持する並びにＣＤ１６の高親和性バリアント及びＣＡＲ（キメラ抗原受容体）の少なくとも１つをさらに発現するＮＫ細胞に関する。

【背景技術】

【0004】

背景に関する説明は、本開示を理解する上で有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるか若しくはここで特許請求される本発明と関連していること、又は具体的若しくは暗示的に参照されるあらゆる刊行物が先行技術であることを認めるものではない。

【0005】

本明細書のすべての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願がそれぞれあたかも具体的且つ個々に参照により組み込まれることを指示されているのと同程度に参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義又は使用が矛盾しているか、又は本明細書に提供されているその用語の定義に一致しないか若しくはそれに反する場合、本明細書に提供される用語の定義が適用され、参考文献における用語の定義は適用されない。

【0006】

ＮＫ－９２細胞は、レシピエントにおける同種異系細胞に対して明らかな毒性はなく、様々な腫瘍細胞に向けて比較的広範囲の細胞障害活性を有するので、細胞ベースの療法の種々の側面において望ましい。さらに、ＮＫ－９２細胞は、比較的単純な方法で培養することができ、よって、養子癌免疫療法に魅力的な選択肢を提示することができる。あいにく、ＮＫ－９２細胞の増殖及び機能は、ＩＬ－２に極めて依存しており、これは、ＮＫ－９２細胞が大規模なスケールで必要とされる場合、費用を増加させる。このようなサイトカインの必要と関連する問題を回避するために、ＮＫ－９２細胞は、ＩＬ－２を発現し、細胞内に保持するように形質転換された（たとえばＥｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３３：１５９－１６４を参照されたい）。このような改変された細胞は、実際に、外来性サイトカインから独立するようになったが、種々の不利益が残った。とりわけ、このような改変された細胞から放出されるＩＬ－２は、このような細胞が哺乳動物において使用される場合、インビボにおいてＩＬ－２媒介性の影響を増加させることがあり、これは、ＩＬ－２が腫瘍微小環境において免疫抑制を刺激する場合（典型的に、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の成長及び増殖を介して）、特に害となる。

【0007】

別の例では、ＮＫ－９２細胞は、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターの中にクローニングされたｃＤＮＡからＩＬ－１５を発現するようにトランスフェクトされ（たとえばＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００４；８９：３３８－３４７を参照されたい）、そのようにトランスフェクトされた細胞は、培養上清中に高レベルのＩＬ－１５を継続的に産生し、これにより、有意に、より急速に、低用量のＩＬ－２又はＩＬ－１５による刺激に応答して、細胞を増殖させると考えられた。さらに、長期培養中の細胞の累積数もまた、非トランスフェクト細胞よりもかなり大きかった。しかしながら、このような細胞がインビボにおいて使用される場合、高レベルの分泌されたＩＬ－１５は、臨床上問題になり得る。

【0008】

同様に、ＮＫ－９２細胞は、ＩＬ－１５の組換えネイティブ形態を発現するように、ウイルストランスフェクション系を使用して形質転換された（たとえばＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２０１２）６１：１４５１－１４６１を参照されたい）。このような組換え細胞は、外来性サイトカインの非存在下において成長することができ、組換えＣＡＲを発現したが、トランスフェクション効率は、比較的低く、細胞内に産生されるＩＬ－１５の量は、比較的低く、培養培地の中に分泌されるＩＬ－１５の量は、低かった。さらに、組換え細胞の細胞毒性は、親ＮＫ－９２細胞株と比較して、低下した。とりわけ、同様のＩＬ－１５がプラスミドから発現される場合、そのように生成されたＮＫ－９２細胞は、外来性成長因子から完全には独立しておらず、したがって、このような組換え細胞のインビボにおける使用を制限した。

【0009】

したがって、たとえ種々の改変された免疫細胞、特に、改変されたＮＫ細胞が、当技術分野において知られていても、それらはすべて又はほぼすべて、種々の不利益を被っている。その結果、目標とされる細胞毒性を維持しながら、望ましい成長特性を呈する、改善された、改変されたＮＫ細胞を提供する必要がある。

【発明の概要】

【0010】

ＮＫ細胞が、ＩＬ－１５又はそのバリアントを細胞内に発現して、分泌するか又は提示するように遺伝子改変され、改変されたＮＫ細胞を外来性サイトカインから独立させる、及び改変されたＮＫ細胞の近くの他の免疫コンピテント細胞の刺激／活性化を可能にする、種々の組換え細胞、組成物、及び方法が、本明細書において開示される。

【0011】

本発明の主題の一態様において、発明者らは、遺伝子改変されたＮＫ細胞及びこのような細胞を作製するための方法を企図し、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５をコードする第１のセグメントを含む組換え核酸を含む。最も典型的には、ＮＫ細胞は、ＮＫ－９２細胞であり、組換え核酸は、ＤＮＡ（たとえば線状プラスミド）である。好ましくは、必ずしもではないが、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５中のＩＬ－１５部分は、コドン最適化ヒトＩＬ－１５配列を含む。

【0012】

さらなる実施形態において、組換え核酸は、ＣＤ１６若しくは高親和性ＣＤ１６をコードする第２のセグメントをさらに含む並びに／又はキメラ抗原受容体をコードする第３のセグメントをさらに含んでいてもよい並びに／又は免疫刺激をもたらす、チェックポイント阻害を妨げるタンパク質、免疫抑制に関与するサイトカインに結合する／サイトカインを阻害するタンパク質、及び／若しくはＩＬ－１５受容体アルファ鎖をコードする第４のセグメントをさらに含んでいてもよい。組換え核酸が、（ａ）改変されたＮＫ細胞を外来性サイトカインから独立させるのに及び（ｂ）改変されたＮＫ細胞の近くの他の免疫コンピテント細胞の刺激／活性化を可能にするのに十分な量で、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５の発現を引き起こすのに十分な強度を有するプロモーターを含むこともまた、企図される。任意選択で、改変されたＮＫ細胞は、ＣＤ１６を介して細胞につながれた抗体を含んでいてもよい。

【0013】

本発明の主題のさらなる態様において、発明者らはまた、本明細書において記載される遺伝子改変されたＮＫ細胞と組み合わせて薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物をも企図する。最も典型的には、このような組成物は、患者への注入のために製剤化され、及び、投与単位当たり少なくとも１×１０^９細胞を含んでいてもよい。

【0014】

したがって、発明者らはまた、癌の治療における、本明細書において記載される遺伝子改変されたＮＫ細胞の使用をも企図する。このような使用は、スタンドアローンの治療としての細胞の注入であってもよいが、他の企図される使用はまた、ＴＭＥに侵入する薬物の投与、免疫抑制を低下させる薬物の投与、免疫コンピテント細胞を刺激する薬物の投与、癌ワクチン組成物の投与、及び／又は免疫応答の維持を助け且つ記憶細胞の発達を促進する薬物の投与をも含む。

【0015】

様々な目的、特徴、態様及び利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明と共に、同様の数字が同様の構成要素を表す添付の図面からより一層明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、示される種々のＮＫ細胞の成長速度を示す例示的なグラフを示す図である。

【図2】図２は、示されるＮＫ細胞の免疫表現型検査からの例示的な結果を示す図である。

【図3】図３～５は、示される種々のＮＫ細胞の細胞毒性についての例示的な結果を示す図である。

【図4】図３～５は、示される種々のＮＫ細胞の細胞毒性についての例示的な結果を示す図である。

【図5】図３～５は、示される種々のＮＫ細胞の細胞毒性についての例示的な結果を示す図である。

【図6】図６～８は、示される種々のＮＫ細胞の細胞毒性についてのさらなる例示的な結果を示す図である。

【図7】図６～８は、示される種々のＮＫ細胞の細胞毒性についてのさらなる例示的な結果を示す図である。

【図8】図６～８は、示される種々のＮＫ細胞の細胞毒性についてのさらなる例示的な結果を示す図である。

【図9】図９は、本明細書において使用される例示的な組換え核酸の概略的な配置を示す図である。

【発明の具体的説明】

【0017】

発明者らは、これまでに、組換えＣＤ１６及び／又はＣＡＲの細胞毒性及び機能的発現を維持しながら、ＩＬ－２／ＩＬ－１５から独立した成長及び刺激をもたらすのに十分な組換えＩＬ－１５の量を産生する改変されたＮＫ細胞を、生成することができることを発見した。さらに、少なくともいくつかの実施形態において、企図される改変されたＮＫ細胞は、サイトカインの非存在下において成長及び増殖を可能にするのに十分な細胞内ＩＬ－１５（特にｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５）を産生するだけでなく、このような細胞がＴＭＥ中に存在する場合に腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において免疫刺激（又は免疫抑制の転換）を支援する量でＩＬ－１５の分泌をも可能にする。したがって、本発明の主題によるＮＫ細胞は、ＣＤ１６及び／又はＣＡＲを介しての組換え標的細胞毒性のための手段を提供しながら、培養及び増殖の簡略化を有利に可能にする。

【0018】

内質保持配列と共にＩＬ－２を発現した、以前に調製されたＮＫ－９２誘導体は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び調節性Ｔ細胞（Ｔ－ｒｅｇ）などのような免疫抑制細胞の成長及び増殖を支持するように思われた。これらの負の調節因子は、免疫細胞、特にａＮＫ、ｈａＮＫ、及びｔ－ｈａＮＫ並びにドナーＮＫ細胞のいかなる抗腫瘍効果をも弱め得る。他方、組換えＩＬ－１５は、免疫活性細胞の機能のみを支持し、ｅｒＩＬ－２の負の影響がない。

【0019】

しかしながら、ＩＬ－１５及びそのバリアントの発現は、ＮＫ細胞、特にＮＫ－９２細胞の成長及び／又は機能に悪影響を与えかねないことを理解されたい。特に、ＣＤ１６及び／又はＣＡＲなどのような標的ＮＫ細胞にさらに所望される組換えタンパク質を有害に妨げることなく、細胞増殖及び活性を支持する量で、ＩＬ－１５及びそのバリアントの生物学的活性形態を発現することも、期待することができない。さらに、免疫刺激レベルを超えるＩＬ－１５及びそのバリアントの過剰発現及び分泌は、このような細胞のレシピエントにおいて全身性副作用をもたらし得る。様々な観点から見て、好ましい改変されたＮＫ細胞は、全身性副作用を回避するが、ＴＭＥ内で、改変された細胞及び免疫細胞について所望される有益な効果、成長、及び刺激特性を維持するのに十分に低いＩＬ－１５を産生し、分泌するであろう。とりわけ、発明者らは、これまでに、自己分泌方式で（すなわち、外来性サイトカインを必要とすることなく）成長及び増殖を刺激するために細胞内に形成され、保持されたＩＬ－１５とＴＭＥ内の他の免疫コンピテント細胞に対して免疫刺激効果をもたらす分泌されたＩＬ－１５との間に、望ましいバランスを有するＮＫ細胞を、調製することができることを発見した。

【0020】

適したＮＫ細胞に関して、ＮＫ細胞は、遺伝子改変されたＮＫ細胞を受けるであろう対象由来の自家ＮＫ細胞であってもよいことが、一般に企図される。このような自家ＮＫ細胞は、全血から単離されてもよい又は当技術分野においてよく知られている方法を使用して前駆細胞若しくは幹細胞から培養されてもよい。しかしながら、ＮＫ細胞が、自家である必要はなく、同種異系若しくは異種ＮＫ細胞であってもよいこともまた、理解されたい。本発明の主題の特に好ましい態様において、遺伝子操作を受けるＮＫ細胞は、ＮＫ－９２細胞又はその誘導体である。たとえば、本発明の主題の特に好ましい一態様において、遺伝子操作を受けたＮＫ細胞は、少なくとも１つのキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現の低下又は消滅を有するように改変されたＮＫ－９２誘導体であり、これは、典型的に、このような細胞を恒常的に活性化させる（阻害の欠如又は低下を介して）。

【0021】

ＮＫ－９２細胞は、珍しい受容体発現プロファイルを呈し、比較的多数の活性化（たとえばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、２Ｂ４、ＮＫＧＤ、Ｅ、ＣＤ２８）受容体を発現する。逆に、ＮＫ－９２細胞はさらに、阻害受容体をほとんど発現せず（たとえばＮＫＧＡ／Ｂ、低レベルのＫＩＲ２ＤＬ４、ＩＬＴ－２）、通常のＮＫ細胞上にクローン発現される大部分のキラー細胞抑制受容体（ＫＩＲ）を欠く。加えて、ＮＫ－９２は、パーフォリン－グランザイム細胞溶解経路に関与する比較的高レベルの分子及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－スーパーファミリーメンバーＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＮＦ－アルファを含む追加の細胞毒性エフェクター分子を発現し、代替機構を介して死滅させることができる能力を示す。さらに、ＮＫ－９２細胞はまた、免疫エフェクター細胞調節に関係する他の分子をも発現する（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＮＣＥ）が、ＮＫ死滅における関連性は、はっきりしない。しかしながら、とりわけ、これらの特に望ましい形質は、本明細書において記載される改変によって悪影響を与えられないであろう。実際に、少なくともいくつかの実施形態において、１つ又はそれ以上の上記のアクチベータータンパク質及び／又はエフェクタータンパク質は、下記により詳細に述べられるように、ＩＬ－１５の細胞内発現に応答して過剰発現されてもよい。

【0022】

さらに、適したＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を低下させる又は消滅させるなどのために突然変異させた１つ又はそれ以上の改変されたＫＩＲを有していてもよい。当然、１つ若しくはそれ以上のＫＩＲをさらに欠失させてもよい又は発現が抑制されてもよい（たとえばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を介して）ことに留意されたい。最も典型的には、１つを超えるＫＩＲを、突然変異させる、欠失させる、又は発現停止させるであろう、また、特に企図されるＫＩＲは、２つ又は３つのドメインを有し、短い又は長い細胞質側末端を有するものを含む。様々な観点から見て、改変された、発現停止させた、又は欠失させたＫＩＲは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、及びＫＩＲ３ＤＳ１を含むであろう。このような改変された細胞は、当技術分野においてよく知られているプロトコールを使用して調製されてもよい。その代わりに、このような細胞はまた、ＮａｎｔＫｗｅｓｔ（ＵＲＬ ｗｗｗ．ｎａｎｔｋｗｅｓｔ．ｃｏｍを参照されたい）から、ａＮＫ細胞（活性化ナチュラルキラー細胞）として市販で得られてもよい。このような細胞は、次いで、下記にさらに論じられるように、ＩＬ－１５又はそのバリアントを発現するように、追加で遺伝子改変されてもよい。

【0023】

本発明の主題の別の好ましい態様において、遺伝子操作を受けたＮＫ細胞はまた、高親和性Ｆｃγ受容体（ＣＤ１６）を発現するように改変されるＮＫ－９２誘導体であってもよい。Ｆｃγ受容体の高親和性バリアントの配列は、当技術分野においてよく知られており（たとえばＢｌｏｏｄ ２００９ １１３：３７１６－３７２５を参照されたい）、生成及び発現の方法はすべて、本明細書における使用に適していると考えられる。このような受容体の発現は、患者の腫瘍細胞（たとえばネオエピトープ）、特定の腫瘍型（たとえばｈｅｒ２ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ等）に対して特異的である又は癌（たとえばＣＥＡ－ＣＡＭ）と関連する抗体を使用する腫瘍細胞の特異的な標的化を可能にすると考えられる。好都合なことに、このような抗体は、市販で入手可能であり、細胞（たとえば、Ｆｃγ受容体に結合した）と併せて使用することができる。その代わりに、このような細胞はまた、ＮａｎｔＫｗｅｓｔから、ｈａＮＫ細胞（「高親和性ナチュラルキラー細胞）として、商業的に得られてもよい。このような細胞は、次いで、下記にさらに論じられるように、ＩＬ－１５又はそのバリアントを発現するように、さらに遺伝子改変されてもよい。

【0024】

その代わりに又は追加で、遺伝子操作を受けたＮＫ細胞はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作を受けてもよい。特に好ましい態様において、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、及び癌ネオエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖ部分又は他の外部ドメインを有する。したがって、容易に理解されるように、適したＣＡＲは、第１、第２、及び第３世代のＣＡＲを含む（たとえばＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１５）７（５）：４８７－４９７を参照されたい）。前に述べたように、このようなキメラＴ細胞受容体を発現するようにＮＫ細胞に遺伝子操作を受けさせるための数多くの方法があり、方法はすべて、本明細書における使用に適していると考えられる。その代わりに、このような細胞はまた、ＮａｎｔＫｗｅｓｔから、ｔａＮＫ細胞（「標的活性化ナチュラルキラー細胞」）として市販で得られてもよい。このような細胞は、次いで、下記にさらに論じられるように、ＩＬ－１５又はそのバリアントを発現するように、さらに遺伝子改変されてもよい。

【0025】

細胞が、癌関連抗原又は癌関連抗原に向けて特異性を有する抗体に向けて親和性を有するように操作を受ける場合、知られている癌関連抗原はすべて、使用に適切であると見なされることが企図される。たとえば、癌関連抗原は、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１、ＣＹＰＢ１等を含む。同様に、細胞が、癌特異抗原又は癌特異抗原に向けて特異性を有する抗体に向けて親和性を有するように操作を受ける場合、知られている癌特異抗原はすべて、使用に適切であると見なされることが企図される。たとえば、癌特異抗原は、ＰＳＡ、Ｈｅｒ－２、ＰＳＡ、ブラキウリ等を含む。細胞が、癌ネオエピトープ又は癌ネオエピトープに向けて特異性を有する抗体に向けて親和性を有するように操作を受ける場合、ネオエピトープを同定するための知られている方法はすべて、適した標的を導くことが企図される。たとえば、ネオエピトープは、第１のステップにおいて、腫瘍生検材料（又はリンパ生検材料又は転移部位の生検材料）及び適合する正常組織（すなわち、同じ患者由来の非罹患組織）の全ゲノム解析によって、そのように得られたオミックス情報の同期比較を介して、患者腫瘍から同定されてもよい。そのように同定されたネオエピトープは、次いで、ネオエピトープの抗原提示の可能性を増加させるために、患者のＨＬＡ型への適合について、さらにフィルタ処理にかけることができる。最も好ましくは、このような適合は、インシリコで（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）行うことができる。

【0026】

発現に適したＩＬ－１５配列に関して、ＩＬ－１５は、哺乳動物ＩＬ－１５配列、最も好ましくはヒトＩＬ－１５配列であることが一般に好ましい（たとえばＵｎｉＰｒｏｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ Ｐ４０９３３を参照されたい）。さらに、適したＩＬ－１５配列は、種々のバリアントを含むこと並びに特に企図されるバリアントは、長いシグナルペプチド（ＬＳＰ）及び短いシグナルペプチド（ＳＳＰ）を有するものを含むことに留意されたい。ＬＳＰバリアントは、典型的に、４８アミノ酸のシグナルペプチドを有し、転写物は、典型的に、３１６塩基の５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）、４８６塩基のコード化配列、及び長さが約４００塩基であるＣ末端３’－ＵＴＲ領域を含む。ＳＳＰバリアントは、典型的に、代替スプライシングに基づく２１アミノ酸の短いシグナルペプチドを有する（エキソン４Ａ及び５によってコードされる）。とりわけ、両方のアイソフォームは、同じ成熟タンパク質を産生するが、細胞輸送は別個である。より詳細には、ＩＬ－１５ ＬＳＰアイソフォームは、ゴルジ装置、初期エンドソーム、及び小胞体中に検出され、分泌され、膜に結合した形態で存在することができる。他方、ＩＬ－１５ ＳＳＰアイソフォームは、分泌されず、細胞質及び核に制限されているように見え、ここで、そのアイソフォームは、細胞周期の調節に関与していると思われる。さらに企図されるＩＬ－１５バリアントは、スーパーアゴニストバリアント、特にＩＬ－１５ Ｎ７２Ｄ突然変異体を含み、これらは、下記に論じられるように、追加のシグナルペプチド及び／又は輸送シグナルを含んでいても、含んでいなくてもよい。

【0027】

明らかなシグナル伝達の差に基づいて、発明者らは、したがって、適切な発現レベル及び細胞内の分布及び分泌される量をそのように達成するために、組換えＩＬ－１５に対する種々の改変の使用を企図する。その目的で、発明者らは、組換えＩＬ－１５に融合することができる種々のシグナル伝達部分の使用を企図する。たとえば、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントが、エンドソーム及びリソソーム区画に搬出されるべきである場合、ＣＤ１ｂリーダーペプチドなどのようなリーダーペプチドは、細胞質から（新生）タンパク質を隔離するために使用されてもよい。さらに又は代替的に、標的化プレ配列及び／又は標的化ペプチドを使用することができる。標的化ペプチドのプレ配列をＮ末端及び／又はＣ末端に付加して、典型的には、６～１３６個の塩基性及び疎水性アミノ酸を構成することができる。ペルオキシソーム標的化の場合、標的化配列は、Ｃ末端にあり得る。他のシグナル（例えば、シグナルパッチ）を使用し得、これらには、ペプチド配列において切り離されており、適切なペプチドフォールディング時に機能するようになる配列エレメントが挙げられる。加えて、グリコシル化のようなタンパク質修飾は、標的化を誘導することができる。本発明者らは、他の好適な標的化シグナルの中でも、ペルオキシソーム標的化シグナル１（ＰＴＳ１）、Ｃ末端トリペプチド及びＮ末端の近くに位置するノナペプチドであるペルオキシソーム標的化シグナル２（ＰＴＳ２）を企図している。

【0028】

加えて、エンドソーム及びリソソームへのタンパク質のソーティングは、タンパク質の細胞質ゾルドメイン内のシグナルによっても媒介され得、典型的には短い線状配列を含む。いくつかのシグナルは、チロシンベースのソーティングシグナルと呼ばれ、ＮＰＸＹ又はＹＸＸφコンセンサスモチーフに適合する。ジロイシンベースのシグナルとして知られる他のシグナルは、［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］又はＤＸＸＬＬコンセンサスモチーフに適合する。これらのシグナルは、すべて膜の細胞質面と周辺に関連するタンパク質コートの成分によって認識される。ＹＸＸφ及び［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］シグナルは、アダプタータンパク質（ＡＰ）複合体ＡＰ－１、ＡＰ－２、ＡＰ－３及びＡＰ－４によって特徴的な微細特異性で認識されるが、ＤＸＸＬＬシグナルは、ＧＧＡとして知られているアダプターの別のファミリーによって認識される。また、空胞タンパク質のソーティング及びエンドソーム機能に関連するＦＹＶＥドメインを加えることができる。さらなる態様において、エンドソーム区画は、ヒトＣＤ１テール配列を用いて標的化することもできる（たとえば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２２，５２２－５３１を参照されたい）。たとえば、リソソームの標的化は、ＬＡＭＰ１－ＴＭ（膜貫通）配列を使用して達成され得るが、リサイクリングエンドソームは、ＣＤ１ａテール標的配列を介して標的化され得、ソーティングエンドソームは、ＣＤ１ｃテール標的配列を介して標的化され得る。

【0029】

細胞質ゾル区画への輸送又は細胞質ゾル区画内での保持は、必ずしも１つ以上の特定の配列エレメントを必要とするものではない。しかしながら、少なくともいくつかの態様では、膜固着タンパク質又は膜固着タンパク質の膜固着ドメインなどのＮ－又はＣ－末端細胞質保持シグナルを加えて、タンパク質が細胞質ゾルに面している細胞内に保持されるようにし得る。たとえば、膜固着タンパク質としては、ＳＮＡＰ－２５、シンタキシン、シナプトプレビン（ｓｙｎａｐｔｏｐｒｅｖｉｎ）、シナプトタグミン、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）、シナプス小胞糖タンパク質（ＳＶ２）、高親和性コリン輸送体、ニューレキシン、電位依存性カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼ及びＮＯＴＣＨが挙げられる。

【0030】

本発明の主題のさらなる企図された態様では、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントは、処理後にネオエピトープを細胞膜の外側に向け、免疫コンピテント細胞にとって認識できるようにする１つ以上の膜貫通セグメントを含むこともできる。当技術分野で公知の多数の膜貫通ドメインが存在し、それらのすべては、単一のアルファヘリックス、複数のアルファヘリックス、アルファ／ベータバレルなどを有するものを含む本明細書での使用に適していると考えられる。たとえば、企図される膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（たとえば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ又はＰＡＧ／Ｃｂｐのアルファ、ベータ又はゼータ鎖の膜貫通領域を含み得る。

【0031】

加えて、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントが、ＩＬ－１５受容体アルファサブユニットと同時発現されてもよいこともまた、企図される。このような同時発現は、受容体アルファ鎖とＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントの結合又は他の関連を可能にし、ＩＬ－１５若しくはＩＬ－１５バリアントを安定化する及び／又は改変されたＮＫ細胞の表面上でのＩＬ－１５若しくはＩＬ－１５バリアントの分泌若しくは輸送／提示を支援すると考えられる。同様に、種々の他のタンパク質（ＣＤ１６及び／又はＣＡＲ以外が、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントと同時発現されてもよく、適した同時発現されたタンパク質は、種々の免疫調節化合物、特に、チェックポイント阻害を妨げる化合物（たとえば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４等に対するｓｃＦｖ）、免疫刺激物質（たとえばＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１等）、及び／又は免疫抑制に関与するサイトカイン（たとえばＴＧＦ－β、ＩＬ－８等）に結合する／を阻害する化合物を含む。

【0032】

容易に理解されるように、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアント及び他の同時発現されるタンパク質は、組換え核酸上にコードされ、これは、１つ又はそれ以上の組換えＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子であってもよい。しかしながら、最も典型的には、組換え核酸は、多シストロン性ＤＮＡ構築物、好ましくはプラスミドである。しかしながら、種々の他の構築物もまた、本明細書における使用に適していると考えられ、ウイルスベクター（ウイルスとして又は他の方法を介してトランスフェクトされてもよい）、線状ＤＮＡ、キャリアに結合したＤＮＡ（たとえば、弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）トランスフェクションのための）等を含む。

【0033】

核酸の特定の形状及びタイプとは無関係に、改変されたＮＫ－９２細胞は、（ａ）そのようにトランスフェクトされた細胞を外来性サイトカインから独立させる及び（ｂ）トランスフェクトされた細胞の近くの（典型的にＴＭＥ内の）他の免疫コンピテント細胞の刺激／活性化を可能にするのに十分な量のＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントを発現することが、一般に好ましい。たとえば、分泌された又は細胞外の（若しくは細胞外に提示された）組換えＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントは、細胞中に産生された全ＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントの５～１０％の間又は１０～２０％の間又は２０～３０％の間又は３０～５０％の間を占めるであろうということが企図される。したがって、また、様々な観点から見て、分泌された又は細胞外の（若しくは細胞外に提示された）組換えＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントは、約２０～６０ｐｇ／ｍｌの間又は約６０～８０ｐｇ／ｍｌの間又は約８０～１００ｐｇ／ｍｌの間又は約１００～１５０ｐｇ／ｍｌの間又は約１５０～２００ｐｇ／ｍｌの間又はそれ以上の量で存在してもよい。他方、細胞内に保持されたＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントは、約１００～１５０ｐｇ／ｍｌの間又は約１５０～２５０ｐｇ／ｍｌの間又は約２５０～５００ｐｇ／ｍｌの間又は約５００～７５０ｐｇ／ｍｌの間又はそれ以上量で存在するであろうということが企図される。したがって、特に好ましい改変されたＮＫ－９２細胞は、自律的な成長を支持し、ＴＭＥにおける免疫コンピテント細胞を刺激するのに並びにＣＤ８＋Ｔ細胞記憶の確立及び維持を刺激するのに十分な量で、組換えＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントを産生するであろうが、このような量は、このような細胞を受けている患者において全身性の有害事象を引き起こすには不十分であることに留意されたい。

【0034】

したがって、機能的観点から、組換えＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントは、他のＮＫ細胞（たとえばＴＭＥ中の自家ＮＫ細胞）、種々のＴ細胞等のエフェクター機能及び／又は増殖を刺激する又は増強する並びにＴＭＥ中の細胞におけるＪａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達を増強する又は引き起こすために存在するであろう。さらに、細胞内に保持されたＩＬ－１５又はＩＬ－１５バリアントの分画のおかげで、このような細胞はまた、下記にさらに詳細に記載されるように、外来性ＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５が全く存在しない状況でも増殖することができるであろう。さらに企図される態様において、このような改変されたＮＫ－９２細胞はまた、改変されていないＮＫ－９２細胞と比較して、ＩＬ－１２シグナル伝達に対する感受性が増加しており、これは、ＩＦＮ－γのＩＬ－４媒介性の抑制を低下させてもよく、これは、次に、ＴＭＥ中のＴｈ１ Ｔ細胞の抑制を低下させてもよい。

【0035】

企図される改変されたＮＫ細胞の使用は、好ましくは、ＮＫ細胞の投与に応答する疾患の治療における、特に、種々の癌の治療におけるものである。容易に理解されるように、改変されたＮＫ細胞は、単独の治療剤として又はより複雑なレジメンにおける薬剤として投与されてもよい。たとえば、改変されたＮＫ細胞は、免疫療法戦略の一部であってもよく、その中で、腫瘍は、最初に、ＴＭＥに侵入する薬物（たとえばアブラキサン）により、免疫抑制を低下させる薬物（たとえばシトキサン）により、種々の免疫コンピテント細胞を刺激する薬物（たとえばＡＬＴ－８０３）により、癌ワクチン組成物（たとえば、腫瘍新生抗原をコードする組換えＡｄＶ）により、及び／又は免疫応答を維持し且つ記憶細胞の発達を促進するのを助ける薬物（たとえば腫瘍標的ＩＬ－１２）により治療されてもよい。例示的な適した治療レジメンは、本明細書において参照によって援用される国際公開第２０１８／００５９７３号パンフレットにおいて論じられる。

【0036】

適した投与量及び投与様式に関して、細胞の量及び注入のスケジュールは、ＮＫ細胞注入について知られている確立されたプロトコールに典型的に従うことが一般に好ましい。したがって、改変されたＮＫ－９２細胞の典型的な量は、５×１０^７細胞／用量ＩＶ～５×１０^８細胞／用量ＩＶの間又は５×１０^８細胞／用量ＩＶ～５×１０^９細胞／用量ＩＶの間又は５×１０^９細胞／用量ＩＶ～５×１０^１０細胞／用量ＩＶの間、及び最も典型的には７×１０^８細胞／用量ＩＶ～７×１０^９細胞／用量ＩＶの間（たとえば２×１０^９細胞／用量ＩＶ）であろう。当然、改変されたＮＫ細胞がＣＤ１６又はＣＤ１６の高親和性バリアント（たとえば１５８Ｖ）を発現する場合、細胞は、改変されたＮＫ細胞に有利に結合するであろう１つ又はそれ以上の抗体と同時投与されてもよい（インビトロにおいて注入の前に又は順次、たとえば、細胞注入の前に抗体を投与する）ことを理解されたい。

【実施例】

【0037】

以下の実施例は、代表的な手引きのみを提供し、本発明の主題を限定するものと理解されるべきではない。特に断りのない限り、すべての組換え発現構築物は、配列番号１として示されるＩＬ－１５のコドン最適化バージョンを使用し、これは、少なくともいくつかの実施形態において、高収率の組換えタンパク質をもたらした（データは示さず）。

【0038】

実験の第１のセットにおいて、ＩＬ－１５の３つのバリアントは、配列番号１を使用して作り出した：野生型ＩＬ－１５に対応する長いシグナルペプチドのバリアント（ＬＳＰ－ＩＬ－１５）、ＥＲ－保持シグナルを有する長いシグナルペプチドのバリアント（ｅｒＬＳＰ－ＩＬ１５）、及び代替のスプライスバリアントである短いシグナルペプチドのバリアント（ＳＳＰ－ＩＬ－１５）。より詳細には、一実施形態において、ＩＬ－１５ ＬＳＰは、配列番号２において示されるヌクレオチド配列を有した；ＩＬ－１５ ＬＳＰは、配列番号３のペプチド配列を有した；ｅｒＩＬ－１５ ＬＳＰは、配列番号４のヌクレオチド配列を有した；ｅｒＩＬ－１５ ＬＳＰは、配列番号５のペプチド配列を有した；ＩＬ－１５ ＳＳＰは、配列番号６のヌクレオチド配列を有した；ＩＬ－１５は、配列番号７のペプチド配列を有した。

【0039】

プラスミドの設計及びトランスフェクション：
ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ制限酵素部位が側面に位置する３つのｇＢｌｏｃｋを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで合成し、同様に消化したｐＮＥＵｋｖ１－ＣＤ１６－ｅｒＩＬ２プラスミド骨格の中に、それぞれの配列をサブクローニングするために使用し、以下のプラスミドを作り出した。
ｐＮＥＵｋｖ１－ＣＤ１６（１５８Ｖ）－ＩＲＥＳ－（ＫｐｎＩ）－［ＩＬ－１５ ＬＳＰ］－（ＮｏｔＩ）
ｐＮＥＵｋｖ１－ＣＤ１６（１５８Ｖ）－ＩＲＥＳ－－（ＫｐｎＩ）－［ｅｒＩＬ－１５ ＬＳＰ］－（ＮｏｔＩ）
ｐＮＥＵｋｖ１－ＣＤ１６（１５８Ｖ）－ＩＲＥＳ－－（ＫｐｎＩ）－［ＩＬ－１５ ＳＳＰ］－（ＮｏｔＩ）

【0040】

プラスミドはすべて、サンガーシークエンシングによって確認し、ＳａｌＩ制限酵素消化によって線状にし、カラム精製によって単離した。細胞株は、ＭａｘＣｙｔｅ ＧＴエレクトロポレーターを使用して、１μｇの線状ＤＮＡ／１０^６細胞をエレクトロポレーション処理することによって作り出した（プログラムＮＫ－９２－２－ＯＣ）。ｐＮＥＵｋｖ１－ＣＤ１６－ＩＲＥＳ－［ｅｒＩＬ－２］は、ポジティブコントロールとして同様に調製し、エレクトロポレーション処理した。この実験は、結果を確認するために、２回繰り返した。ＣＤ１６及びｅｒＩＬ－１５を同時発現するＮＫ－９２細胞株は、ａＮＫ（ＮＫ－９２「野生型」）への以下の線状プラスミドのエレクトロポレーションによって作り出した：ｐＮＥＵｋｖ１－ＣＤ１６（１５８Ｖ）－ＩＲＥＳ－［ＬＳＰ ＩＬ－１５］；ｐＮＥＵｋｖ１－ＣＤ１６（１５８Ｖ）－ＩＲＥＳ－［ｅｒＩＬ－１５］；及びｐＮＥＵｋｖ１－ＣＤ１６（１５８Ｖ）－ＩＲＥＳ－［ＳＳＰ ＩＬ－１５］。ポジティブコントロールは、ｐＮｅｕｋｖ１－ＣＤ１６－ＩＲＥＳ－［ｅｒＩＬ－２］によりトランスフェクトした。サンプルはすべて、いかなるサイトカインも存在しない状況で２週間、Ｘ－ｖｉｖｏ－１０／５％ＨＳ中でインキュベートした。

【0041】

プラスミドのトランスフェクションが成功したことを決定するために、エレクトロポレーション処理された細胞を、いかなるサイトカインも存在しない状況で、２週間、５％ＨＳを有するＸ－ｖｉｖｏ－１０中で成長させた。とりわけ、３つの試験したＩＬ－１５クローンのうちの１つだけが、再生に成功した：ＥＲ－保留シグナルを有する長いシグナルペプチド（ｅｒＩＬ－１５）。さらに、下記にさらに詳細に示されるように、ｅｒＩＬ－１５を発現するＮＫ－９２細胞（ｅｒＬＳＰ－ＩＬ１５）は、すべての関連するＮＫ表面マーカー及び細胞毒性を維持した。さらに、これらの細胞はまた、望ましい量の細胞外ｅｒＬＳＰ－ＩＬ１５をもたらし、これは、おそらく、成熟ＩＬ－１５からのｅｒ／ＬＳＰセグメントの除去の後に、免疫刺激についてのその生物学的機能を保持した。

【0042】

図１からわかるように、ｅｒＩＬ－１５の発現は、ａＮＫ又はｈａＮＫ（ＣＤ１６＋、ｅｒＩＬ－２）細胞と比較して、外来性サイトカインの非存在下において、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５発現細胞の成長速度を変化させることはなかった。したがって、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５の組換え発現は、十分な自己分泌シグナル伝達を有利にもたらし、細胞増殖を支持する。ＥＲ保持配列は、おそらく、細胞内では除去されないが、適切な機能をなお維持したので、このような結果は、予想外である。さらに、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５の組換え発現はまた、改変されたＮ－９２細胞の数多くの表現型マーカーにも悪影響を与えなかった。新たに生成された細胞株の免疫表現型検査からの例示的な結果を、図２に示す。ここで、試験したフローサイトメトリー表面受容体プロファイルは、ｈａＮＫ細胞、ｅｒＩＬ２を同時発現するＣＤ１６発現ＮＫ－９２細胞株と同一であった。

【0043】

これに関連して、新たに作り出された細胞株が機能的に重要な表面タンパク質：ＣＤ１６（Ｆｃ受容体）及び活性化受容体ＮＫＧ２Ｄの完全な発現を維持したことを理解されたい。ｅｒＩＬ－１５発現細胞株の機能性を試験するために、また、ｅｒＩＬ－２発現細胞株（ｈａＮＫ）との比較のために、細胞毒性アッセイを、様々な標的細胞株：Ｋ５６２、Ｒａｊｉ、及びＨＬ－６０を使用して実行した。図３～５に示す結果は、ｅｒＩＬ－１５の導入が、ｈａＮＫ細胞と比較して、自発的な細胞毒性の特性を変化させなかったことを明らかに立証するものである。これは、新規な／異なる遺伝子の統合がＮＫ－９２細胞の細胞毒性機能に影響を与え得るので、予想外の発見である。とりわけ、図３～５からもわかるように、ｅｒＩＬ－１５発現細胞は、同じエフェクター細胞対標的細胞比で、ｅｒＩＬ－２発現細胞より優れていた。

【0044】

新たなｅｒＩＬ－１５ベースのプラスミドを、ＣＡＲの活性に影響を与えることなく、トリシストロン性（ｔｒｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ＣＡＲ発現プラスミドの中に組み込むことができるかどうかをさらに試験するために、ＮＫ－９２細胞株を、ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２０ＣＡＲ、又はＣＤ３３ＣＡＲをコード化するトリシストロン性ＣＡＲ＿ＣＤ１６＿ｅｒＩＬ－１５プラスミドによるエレクトロポレーションによって生成した。ｅｒＩＬ－１５発現株の細胞毒性機能について、試験し、いくつかの標的細胞株：Ｋ５６２（ＣＤ１９ｎｅｇ、ＣＤ２０ｎｅｇ、ＣＤ３３＋）、ＳＵＰＢ１５^ＣＤ２０（ＣＤ２０＋）、及びＴＨＰ－１（ＣＤ３３＋）に対する、対応するｔ－ｈａＮＫ細胞（ｅｒＩＬ－２）の細胞毒性機能と比較した。図６～８は、例示的な結果を示す。ここで、上のパネルについて、Ｋ５６２に対する、トランスフェクトされた（トリシストロン性）細胞株の死滅は、試験したエフェクター：標的比のすべてで、優れた死滅を示す。新たな構築物が標準Ｋ５６２株（上のグラフ）の死滅に影響を与えないので、この結果は重要である。重要なことに、新たに作り出されたＣＡＲは、そうでなければ野生型ＮＫ－９２による死滅に対して抵抗性であるＣＤ２０及びＣＤ３３発現標的細胞株を死滅させる。

【0045】

さらなる実験において、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５細胞の回復力及び機能について評価する。たとえば、あらかじめ凍結させたｅｒＩＬ－２ ＣＤ１９ ｔ－ｈａＮＫ及びｅｒＩＬ－１５ ＣＤ１９ ｔ－ｈａＮＫを、解凍し、次いで、サイトカインなしのＸ－Ｖｉｖｏ１０ ５％中で成長させる。両方の細胞株は、外因的に追加されるサイトカインの非存在下において、同等の生存率及び増殖特性を有することが期待される。

【0046】

さらなる実験において、ＩＬ－１５及びＩＬ－２の分泌を、測定する。ここで、ＩＬ－１５の分泌は、ＩＬ－２の分泌に等しいか、又は特に、細胞が、ＩＬ－１５受容体アルファ鎖をも同時発現する場合、少なくとも５％若しくは少なくとも１０％若しくは少なくとも２０％若しくは少なくとも４０％若しくはそれ以上、ＩＬ－２の分泌より優れていることが企図される。量的には、改変されたＮＫ＝９２細胞は、少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ又は少なくとも１５０ｐｇ／ｍｌ又は少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ又はそれ以上のＩＬ－１５を分泌するということ、及び細胞内の量（溶解物によって決定）は、少なくとも１５０ｐｇ／ｍｌ又は少なくとも２５０ｐｇ／ｍｌ又は少なくとも５００ｐｇ／ｍｌ又は少なくとも７５０ｐｇ／ｍｌ又はそれ以上であることが期待される。

【0047】

さらに、本明細書において記載される改変されたＮＫ－９２細胞が、増殖及び培養の間に、集塊又は他の凝集を呈しないことが期待される。同様に、本明細書において提示される細胞（特に、細胞がＣＤ１６（好ましくは高親和性バリアント）及び／又はＣＡＲを発現する場合）は、標準的な成長アッセイを使用すると、ａＮＫ細胞又はｈａＮＫ細胞の倍加時間と比較して、実質的に同一の倍加時間を有するであろう（すなわち、１５％以下又は１０％以下又は５％以下の偏差）。同様に、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５を発現する細胞は、ｈａＮＫ細胞及びｔ－ｈａＮＫ細胞と比較して、実質的に同様の量で（すなわち、１５％以下又は１０％以下又は５％以下の偏差）、機能的に活性な組換えＣＡＲ及び／又はＣＤ１６を典型的に発現するであろう。

【0048】

同様に、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５並びに組換えＣＡＲ及び／又はＣＤ１６を発現する細胞のＫ５６２に対する非特異的細胞毒性が、ａＮＫ細胞及びｈａＮＫ細胞と実質的に同じであることが期待される。上記にすでに示されるように、ｅｒＬＳＰ－ＩＬ－１５及び組換えＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞によるＳＵＰ－Ｂ１５のＣＡＲ媒介性の細胞死滅は、ＳＵＰＢ１５ ＣＤ２０＋のＡＤＣＣ媒介性の細胞死滅であることが期待される。

【0049】

機能的観点から、本明細書において提示される、企図される改変されたＮＫ－９２細胞は、標的刺激あり及びなしで同等の又は増強されたＩＦＮγ分泌（又はサイトカインパネルＩＦＮγ／ＩＬ－８／ＩＬ－１０／ケモカイン）を有するであろう。さらに、本明細書において提示される、企図される改変されたＮＫ－９２細胞は、フローマーカー（ｆｌｏｗ ｍａｒｋｅｒ）（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、Ｔ－ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、グランザイムＢ、パーフォリン）の同等の又は増強された発現を有するであろうということ期待される。

【0050】

さらなる企図される方法において、ＲＮＡ ｓｅｑ解析は、発現パターンを同定するために実行し、これは、他の免疫コンピテント細胞の存在及び／又は活性の中での、腫瘍内の改変されたＮＫ－９２細胞の活性及び／又は存在を調査するために使用することができる。ＲＮＡ ｓｅｑ解析は、活性化ＮＫ細胞を実質的に代表するＲＮＡの発現パターンを提供することが期待される。

【0051】

本明細書で使用される場合、医薬組成物又は薬物の「投与」という用語は、医薬組成物又は薬物の直接投与及び間接投与の両方を指し、医薬組成物又は薬物の直接投与は、典型的には医療従事者（例えば、医師、看護師など）によって行われ、間接投与は、直接投与（たとえば、注射、注入、経口送達、局所送達などによる）のために医療従事者に医薬組成物又は薬物を提供するか又は使用できるようにする工程を含む。最も好ましくは、細胞又はエキソソームは、皮下注射又は真皮下注射によって投与される。しかしながら、他の企図されている態様では、投与は、静脈内注射であり得る。代替的に又は追加的に、抗原提示細胞を患者の細胞から単離又は増殖させ、インビトロで感染させ、次いで患者に注入し得る。したがって、企図された系及び方法は、高度個別化癌治療のための完全な薬物送達系（たとえば、薬物送達、治療プロトコール、バリデーションなど）と考え得ることを理解されたい。また理解されるように、企図された治療は、特に新しいネオエピトープが開発された場合（例えば、クローン増殖の結果として）、経時的に繰り返され得る。

【0052】

本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に入る個々の値ごとに個々に言及する簡略な方法として役立つことを意図するに過ぎない。本明細書中で他に示されない限り、個々の各値は、本明細書中に個別に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書中で他に指示されない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意の及びすべての実施例又は例示的言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示の全範囲をよりよく説明することを意図するものであり、他に特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言語も、特許請求される本発明の実施に不可欠な任意の特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

【0053】

本開示の概念の全範囲から逸脱することなく、すでに記述した以外の多くのさらなる変更形態が可能であることは、当業者に明らかであるはずである。したがって、開示された主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるものではない。さらに、明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈するにあたり、すべての用語は、文脈と一致する最も広い可能な様式で解釈されるべきである。特に、用語「含む」及び「含んでいる」は、要素、構成成分又は工程を非排他的な様式で参照するものと解釈され、参照された要素、構成成分又は工程が存在するか、利用されているか、又は明示的に参照されていない他の要素、構成成分又は工程と組み合わせたものであり得ることを示す。明細書の請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．及びＮからなる群から選択されたものの少なくとも１つを指す場合、Ａ＋Ｎ、Ｂ＋Ｎなどではなく、その群の要素を１つのみ必要としていると解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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