特許7412546抗老化遺伝子ＫＬＯＴＨＯの発現を誘導する化合物およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-28
(45)【発行日】2024-01-12
(54)【発明の名称】抗老化遺伝子ＫＬＯＴＨＯの発現を誘導する化合物およびその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/423 20060101AFI20240104BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240104BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240104BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240104BHJP
A61K 8/49 20060101ALI20240104BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240104BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240104BHJP
C12Q 1/6897 20180101ALI20240104BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240104BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20240104BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20240104BHJP
C07D 263/58 20060101ALN20240104BHJP
【ＦＩ】
A61K31/423
A61P13/12 ZNA
A61P17/00
A61P9/00
A61K8/49
A61Q19/08
A23L33/10
C12Q1/6897 Z
C12N15/12
C12Q1/686 Z
C12Q1/6851 Z
C07D263/58
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2022520415
(86)(22)【出願日】2020-10-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-27
(86)【国際出願番号】 KR2020013480
(87)【国際公開番号】W WO2021066608
(87)【国際公開日】2021-04-08
【審査請求日】2022-05-02
(31)【優先権主張番号】10-2019-0122305
(32)【優先日】2019-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】522129786
【氏名又は名称】克洛索科学公司
【氏名又は名称原語表記】ＫＬＯＴＨＯ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】３ｒｄ Ｆｌｏｏｒ，１７２，Ｄｏｌｍａ－ｒｏ，Ｂｕｎｄａｎｇ－ｇｕ，Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ，１３６０５ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100125450
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 広明
(72)【発明者】
【氏名】チョン、ドンジュ
【審査官】土橋 敬介
(56)【参考文献】
【文献】韓国登録特許第１０－１４４６３０１（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】特開２００１－１３９５５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５１０１４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００１／０８３４２７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５０３１０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５３８１２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１７－００２４５２２（ＫＲ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／００９０４８０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００８／０３５９５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００４／０１９８７６８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００７／００６６５７７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許第０４０８８７７０（ＵＳ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００３／０１０９７１４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／００９６１３６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００５－５２９０８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５０２８６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－００７９４７８（ＫＲ，Ａ）
【文献】特開２０１２－２０８１７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０５６３７７２４（ＵＳ，Ａ）
【文献】国際公開第２００９／０２９６１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Jung, Se-Lin et al，An efficient solid-phase parallel synthesis of 2-amino and 2-amidobenzo[d]oxazole derivatives via cyclization reactions of 2-hydroxyphenylthiourea resin，Bulletin of the Korean Chemical Society ，2012年，33(12)，4109-4116
【文献】Kim, Beom Joon et al，Synthesis of benzoxazole amides as novel antifungal agents against Malassezia furfur，Bulletin of the Korean Chemical Society ，2010年，31(5),，1270-1274
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｑ
Ａ２３Ｌ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、
細胞老化抑制用組成物
［化学式１］
【化1】
【化2】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－１０の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－８のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－８のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ、－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－１０の直鎖または側鎖アルキルである）。
【請求項2】
前記細胞は、腎近位尿細管上皮細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記組成物は、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子の発現量を向上させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
下記の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、
皮膚老化の予防または改善用化粧料組成物
［化学式１］
【化3】
【化4】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－１０の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－８のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－８のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ、－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－１０の直鎖または側鎖アルキルである）。
【請求項5】
下記の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または治療用薬学的組成物［化学式１］
【化5】
【化6】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－１０の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－８のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－８のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ、－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－１０の直鎖または側鎖アルキルである）。
【請求項6】
下記の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩、およびアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤（angiotensin II receptor blocker）を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または治療用薬学的組成物［化学式１］
【化7】
【化8】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－１０の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－８のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－８のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ、－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－１０の直鎖または側鎖アルキルである）。
【請求項7】
前記血管老化によって誘発される疾患は、高血圧、狭心症、心筋梗塞症、動脈硬化、前立腺肥大症、血管けいれん収縮、血栓症、脳梗塞および脳出血からなる群から選択されることを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗老化遺伝子ｋｌｏｔｈｏの発現を誘導する化合物およびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
動物の老化を調節できる遺伝子が存在できるという事実は、１９８１年に報告されたＳＡＭ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｍｉｃｅ）から知られることになった。ＡＫＲ／Ｊ系マウスを交配する途中に偶然に作られたこのマウスは、同系マウスより非常に老化が速かったが、このマウスは、色々な遺伝子に変異を有していることが確認された。以後、単一グループの老化関連遺伝子の発見は、１９９０年代に報告された。報告された遺伝子は、ＲｅｃＱ ｆａｍｉｌｙであり、ＤＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅという酵素を発現させる遺伝子であった。この遺伝子に変異が発生すると、早期老化が発生したり、がんが生成される結果が報告されたが、これは、ＤＮＡの修復に影響を及ぼして発生すると知られた。単一遺伝子として老化に関連したものは、１９９７年に報告されたｋｌｏｔｈｏ遺伝子である。Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子は、高血圧マウスの形質変更動物モデルを作成している中、偶然に発見されたが、この遺伝子を発現しなくなったマウスでは、早期老化現象が発生し、生命が短くなった。さらに興味深い事実は、以後にこの遺伝子の発現を増加させたマウスは、雄性の場合、寿命が２０．０～３０．８％が増加し、雌性では、１８．８～１９．０％増加した。これは、単一遺伝子の発現によってマウスの寿命が増えることも、減ることもできるという事実を初めて世間に知らせることになった契機になった。そして、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子の塩基配列は、動物間に非常に類似していて、マウスとヒトの場合は、９８％程度一致することが報告された。これは、ヒトにおいてもｋｌｏｔｈｏ遺伝子の発現によって寿命が調節されうることを示す。
【0003】
ヒトにおいてｋｌｏｔｈｏ遺伝子は、１３番目の染色体に位置し、β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅと塩基配列が類似した膜タンパク質を生産する。Ｋｌｏｔｈｏタンパク質は、腎臓の尿細管上皮細胞と脳の脈絡叢（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ）で主に発現し、一部が副甲状腺で発現することが報告された。Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子は、多様な老化の表現型に関連した遺伝子であり、ｋｌｏｔｈｏ遺伝子が欠乏したマウスでは、寿命減少、活動性低下、成長遅延、粥状硬化症、動脈の石灰化、骨粗しょう症、生殖器未熟、不妊、皮膚萎縮、肺気腫などの老化過程と類似の症候群が発生する。Ｋｌｏｔｈｏ変異マウスでは、ヒトにおいて老化によって発生するＭｏｎｃｋｅｂｅｒｇ ｔｙｐｅの動脈硬化症と類似した様相の動脈硬化症が大動脈から小動脈まですべての動脈で観察され、ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓとｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓに障害が発生する。
【0004】
Ｋｌｏｔｈｏ ｍＲＮＡは、腎臓組織において他の組織より発現が顕著に高いが、高血圧、２型糖尿病、糖尿病性腎症 、慢性腎不全の疾患モデルマウスの腎臓では、ｋｌｏｔｈｏ ｍＲＮＡの発現が減少する。Ｋｌｏｔｈｏ発現低下マウスでは、血管内皮由来弛緩因子であるＮＯ（Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ）の生産が減少し、多くの心血管系疾患の危険因子を同時に有するＯｔｓｕｋａ Ｌｏｎｇ－Ｅｖａｎｓ Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ ｆａｔｔｙ ｒａｔ（ＯＬＥＴＦ）マウスにｋｌｏｔｈｏ遺伝子をウイルス遺伝子伝達体を利用して注入すると、血管内膜の機能異常が好転し、ＮＯの生産を増加させ、血管肥厚と線維化を抑制して血圧を降下させる。また、ｋｌｏｔｈｏ遺伝子は、マウスにおいて糖とインスリン代謝にも影響を及ぼし、代表的な高コレステロール血症治療剤であるスタチンは、腎近位尿細管細胞でｋｌｏｔｈｏ ｍＲＮＡの発現を増加させる。Ｋｌｏｔｈｏ発現低下マウスでは、骨芽細胞および破骨細胞両方の分化障害による低い骨交替状態の骨減少症が発生し、これは、ヒトにおいて年齢の増加による骨量の減少および老人性骨粗しょう症の特徴と類似している。また、Ｋｌｏｔｈｏ変異マウスでは、骨端部位の骨梁の異常な伸長と微細電算化断層撮影で異常な骨梁組織の所見が観察され、これは、骨吸収過程の障害に起因する。ヒトにおいて観察されるＫｌｏｔｈｏ遺伝子突然変異による臨床的表現型の変化は、多様である。Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子ｅｘｏｎ２の３つの部位の突然変異を有するＫＬ－ＶＳ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｋｌｏｔｈｏ）変形は、脂質代謝、血圧、寿命、認知機能、冠状動脈疾患および脳血管疾患に関連していて、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子のｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ多形成と単一塩基遺伝子多形成が骨密度に関連していて、健康な成人女性においてＫｌｏｔｈｏ遺伝子の単一塩基遺伝子多形成が心血管系疾患の危険因子および骨密度と関連していることも発表されたことがある。最近では、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子とアルツハイマーとの関連性も色々な論文を通じて報告された。アルツハイマー認知症マウスモデルにおいてｋｌｏｔｈｏを過発現させる場合、マウスの寿命が３０％増加し、認知機能低下が抑制されることが報告された。また、ｋｌｏｔｈｏ発現によって脳内でアミロイドベータタンパク質の生成が５０％減少することが観察された。ヒトにおいても、ｋｌｏｔｈｏの発現量は、アルツハイマー疾患の進行程度と反比例し、ｋｌｏｔｈｏタンパク質がアルツハイマー疾患者の血液で炎症性サイトキンの量を減少させるという報告が提出された。
【0005】
このように明確な老化阻害効果を有しているｋｌｏｔｈｏ遺伝子の発現を誘導できる物質の開発に対する努力が続いてきた。知られた物質のうちｋｌｏｔｈｏの発現を誘導できると報告されたものには、ｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ、ｓｔａｔｉｎなどがある。２０１２年にボストン大学校の研究チームは、合計１５万個に達する化合物ライブラリーを利用してｋｌｏｔｈｏ遺伝子発現を誘導できる化合物をスクリーニングして、３個の化合物を報告した。本発明者は、これらの化合物のうち、医薬品として開発可能性が大きい構造を有するｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｈという化合物を選定して、実際実験を通じてこの化合物が細胞でｋｌｏｔｈｏ遺伝子を発現させることができることを確認し、その作用メカニズムに対する研究結果を論文に発表した。以後、ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｈ（比較例１）の構造を分析する実験を進めてｋｌｏｔｈｏ発現を誘導できる化合物の構造的特性を把握し、これをベースにして１０倍以上活性が増加した新しい化合物を作成することになった。
【0006】
老化は、ほぼすべての組織と器官の機能障害と破壊を起こす不可避かつ漸進的な生物学的過程であり、究極的に死を招く。人体の老化は、例えば、細胞機能の低下と関連していて、多様な疾患の発達につながる。老化は、遺伝的および後天的要因間の相互作用によるものと考えられ、老化の増加、幹細胞の定量的および定性的減少、および組織レベルで異常な構造によって一般的に特性化される。
【0007】
これより、本発明者らは、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子の発現を向上させる化合物を合成し、従来に知られた化合物に比べてＫｌｏｔｈｏ遺伝子の発現をさらに向上させることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供することにある。
【0009】
本発明の他の目的は、前記化学式１で表される化合物の製造方法を提供することにある。
【0010】
本発明のさらに他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む細胞老化阻害用組成物を提供することにある。
【0011】
本発明の他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用化粧料組成物を提供することである。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用健康機能食品組成物を提供することにある。
【0013】
本発明の他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用健康食品組成物を提供することにある。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【0015】
本発明の他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供することにある。
【0016】
本発明のさらに他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または改善用健康食品組成物を提供することにある。
【0017】
本発明の他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
【0018】
本発明のさらに他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供することにある。
【0019】
本発明の他の目的は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または改善用健康食品組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0020】
前記目的を達成するために、
本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【0021】
［化学式１］
【化1】
【0022】
（前記化学式１において、Ｌ１は、単一結合または
であり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－１０の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－８のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－８のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ、－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－１０の直鎖または側鎖アルキルである）。
【化2】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－１０の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－８のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－８のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ、－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－１０の直鎖または側鎖アルキルである）。
【0023】
また、本発明は、下記反応式１に示されたように、
化合物２を有機溶媒に溶かした後、化合物３を添加し、１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物４を得る段階（段階１）；および
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物４が溶解した有機溶媒を滴加した後、１５～３０℃で１０～１６時間反応させて化合物１Ａを得る段階（段階２）；
を含む化学式１Ａで表される化合物の製造方法を提供する：
化合物２を有機溶媒に溶かした後、化合物３を添加し、１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物４を得る段階（段階１）；および
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物４が溶解した有機溶媒を滴加した後、１５～３０℃で１０～１６時間反応させて化合物１Ａを得る段階（段階２）；
を含む化学式１Ａで表される化合物の製造方法を提供する：
【0024】
［反応式１］
【化3】
【0025】
（前記反応式１において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ａは、請求項１の化学式１に含まれる）。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ａは、請求項１の化学式１に含まれる）。
【0026】
また、本発明は、下記反応式２に示されたように、
化合物５を有機溶媒に溶かした後、化合物３を添加し、１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物６を得る段階（段階１）；
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物６が溶解した有機溶媒を滴加した後、１２～２４時間反応させて化合物７を得る段階（段階２）；および
化合物７を有機溶媒に溶かし、三臭化ホウ素（ＢＢｒ３）を添加した後、常温で２０～２８時間反応させて化合物１Ｂを得る段階（段階３）；
を含む化学式１Ｂで表される化合物の製造方法を提供する：
化合物５を有機溶媒に溶かした後、化合物３を添加し、１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物６を得る段階（段階１）；
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物６が溶解した有機溶媒を滴加した後、１２～２４時間反応させて化合物７を得る段階（段階２）；および
化合物７を有機溶媒に溶かし、三臭化ホウ素（ＢＢｒ３）を添加した後、常温で２０～２８時間反応させて化合物１Ｂを得る段階（段階３）；
を含む化学式１Ｂで表される化合物の製造方法を提供する：
【0027】
［反応式２］
【化4】
【0028】
（前記反応式２において、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ｂは、請求項１の化学式１に含まれる）。
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ｂは、請求項１の化学式１に含まれる）。
【0029】
また、本発明は、下記反応式３に示されたように、
化合物８、二硫化炭素（Ｃａｒｂｏｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ヨードメタン（Ｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ）、および水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で２～８時間反応させて化合物９を得る段階（段階１）；および
化合物９および化合物２を有機溶媒に溶かした後、２～８時間反応させて化合物１Ｃを得る段階（段階２）；
を含む化学式１Ｃで表される化合物の製造方法を提供する：
化合物８、二硫化炭素（Ｃａｒｂｏｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ヨードメタン（Ｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ）、および水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で２～８時間反応させて化合物９を得る段階（段階１）；および
化合物９および化合物２を有機溶媒に溶かした後、２～８時間反応させて化合物１Ｃを得る段階（段階２）；
を含む化学式１Ｃで表される化合物の製造方法を提供する：
【0030】
［反応式３］
【化5】
【0031】
（前記反応式３において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ｃは、請求項１の化学式１に含まれる）。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ｃは、請求項１の化学式１に含まれる）。
【0032】
また、本発明は、下記反応式４に示されたように、
化合物１０および化合物３を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で２０～２８時間反応させて化合物１１を得る段階（段階１）；
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物１１が溶解した有機溶媒を滴加した後、１０～５０℃で１２～２４時間反応させて化合物１２を得る段階（段階２）；
化合物１２を触媒とともに有機溶媒に添加した後、水素ガスを注入して１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物１３を得る段階（段階３）；および
化合物１３および化合物１４を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で１２～２４時間反応させて化合物１Ｄを得る段階（段階４）；
を含む化合物１Ｄで表される化合物の製造方法を提供する：
化合物１０および化合物３を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で２０～２８時間反応させて化合物１１を得る段階（段階１）；
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物１１が溶解した有機溶媒を滴加した後、１０～５０℃で１２～２４時間反応させて化合物１２を得る段階（段階２）；
化合物１２を触媒とともに有機溶媒に添加した後、水素ガスを注入して１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物１３を得る段階（段階３）；および
化合物１３および化合物１４を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で１２～２４時間反応させて化合物１Ｄを得る段階（段階４）；
を含む化合物１Ｄで表される化合物の製造方法を提供する：
【0033】
［反応式４］
【化6】
【0034】
（前記反応式４において、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し；
Ｒ８は、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上であり；
前記化合物１Ｄは、請求項１の化学式１に含まれる）。
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し；
Ｒ８は、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上であり；
前記化合物１Ｄは、請求項１の化学式１に含まれる）。
【0035】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む細胞老化抑制用組成物を提供する。
【0036】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【0037】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0038】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用健康食品組成物を提供する。
【0039】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0040】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩、およびアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋｅｒ）を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0041】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0042】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または改善用健康食品組成物を提供する。
【0043】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0044】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0045】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または改善用健康食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【0046】
本発明による化学式１で表される化合物は、老化に関連した遺伝子であるＫｌｏｔｈｏ遺伝子の発現量を向上させる効果に優れ、これによって、皮膚老化の防止、細胞老化の抑制または血管老化によって誘発される疾患、または腎臓疾患の予防、改善または治療用薬学組成物、化粧料組成物または食品組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0047】
図１ａは、比較例１～４のヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の開始部位から１．７ｋｂｐの前までのプロモーターを含むレポータ遺伝子を利用してルシフェラーゼ発現実験の結果を示す図である。
図１ｂは、比較例１～４のヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の開始部位から２４０ｂｐの前までのプロモーターを含むレポータ遺伝子を利用してルシフェラーゼ発現実験の結果を示す図である。
図２は、実施例１～実施例６のヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の－２．１ｋｂアップストリームまで含まれたプロモーターを含むレポータ遺伝子を利用してルシフェラーゼ発現実験の結果を示す図である。
図３は、実施例１～３のヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の－２．１ｋｂアップストリームまで含まれたプロモーターを含むレポータ遺伝子を利用してルシフェラーゼ発現実験の結果を示す図である。
図４は、実施例１および実施例２によるｋｌｏｔｈｏ（ＫＬ）遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＲＴ－ＰＣＲで確認した結果である。
図５は、実施例１～２および実施例７～１０の化合物で処理したＲＰＴＥＣ細胞においてｋｌｏｔｈｏ遺伝子の発現を確認した結果である。
図６は、実施例１、実施例９および実施例１０の化合物で処理したＨＫ２細胞において細胞毒性を確認した結果である。
図７ａは、ＨＫ－２細胞（ヒト腎細胞）にシスプラチンを処理して疾患モデルを作成するプロトコルを概略的に示す図である。
図７ｂは、図７ａのプロトコルによって収得したＨＫ－２細胞でのＫｌｏｔｈｏタンパク質発現程度を分析した結果である。
図８ａは、片側尿管閉塞動物モデルにＫＳ１化合物を注入して実験サンプルを収得するプロトコルを概略的に示す図である。
図８ｂは、図８ａのプロトコルによって収得された実験サンプルを利用して腎肥大化程度を分析した結果である。
図９は、Ｈ＆Ｅ染色を通じて片側尿管閉塞モデルにおける核と細胞質に対する変化を確認した結果である。
図１０は、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色を通じて片側尿管閉塞モデルにおける線維化進行程度を確認した結果である。
図１１は、ＴＵＮＥＬ染色を通じて片側尿管閉塞モデルにおける細胞死滅程度を確認した結果である。
図１２は、片側尿管閉塞モデルにおけるＫｌｏｔｈｏタンパク質発現変化を分析した結果である。
図１３は、片側尿管閉塞モデルにおけるＭＭＰ－９タンパク質発現変化を分析した結果である。
図１４は、ＫＳ１化合物の高血圧減少効果を分析した結果である。
図１５は、ＫＳ１化合物の細胞老化抑制効果を分析した結果である。
図１ｂは、比較例１～４のヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の開始部位から２４０ｂｐの前までのプロモーターを含むレポータ遺伝子を利用してルシフェラーゼ発現実験の結果を示す図である。
図２は、実施例１～実施例６のヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の－２．１ｋｂアップストリームまで含まれたプロモーターを含むレポータ遺伝子を利用してルシフェラーゼ発現実験の結果を示す図である。
図３は、実施例１～３のヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の－２．１ｋｂアップストリームまで含まれたプロモーターを含むレポータ遺伝子を利用してルシフェラーゼ発現実験の結果を示す図である。
図４は、実施例１および実施例２によるｋｌｏｔｈｏ（ＫＬ）遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＲＴ－ＰＣＲで確認した結果である。
図５は、実施例１～２および実施例７～１０の化合物で処理したＲＰＴＥＣ細胞においてｋｌｏｔｈｏ遺伝子の発現を確認した結果である。
図６は、実施例１、実施例９および実施例１０の化合物で処理したＨＫ２細胞において細胞毒性を確認した結果である。
図７ａは、ＨＫ－２細胞（ヒト腎細胞）にシスプラチンを処理して疾患モデルを作成するプロトコルを概略的に示す図である。
図７ｂは、図７ａのプロトコルによって収得したＨＫ－２細胞でのＫｌｏｔｈｏタンパク質発現程度を分析した結果である。
図８ａは、片側尿管閉塞動物モデルにＫＳ１化合物を注入して実験サンプルを収得するプロトコルを概略的に示す図である。
図８ｂは、図８ａのプロトコルによって収得された実験サンプルを利用して腎肥大化程度を分析した結果である。
図９は、Ｈ＆Ｅ染色を通じて片側尿管閉塞モデルにおける核と細胞質に対する変化を確認した結果である。
図１０は、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色を通じて片側尿管閉塞モデルにおける線維化進行程度を確認した結果である。
図１１は、ＴＵＮＥＬ染色を通じて片側尿管閉塞モデルにおける細胞死滅程度を確認した結果である。
図１２は、片側尿管閉塞モデルにおけるＫｌｏｔｈｏタンパク質発現変化を分析した結果である。
図１３は、片側尿管閉塞モデルにおけるＭＭＰ－９タンパク質発現変化を分析した結果である。
図１４は、ＫＳ１化合物の高血圧減少効果を分析した結果である。
図１５は、ＫＳ１化合物の細胞老化抑制効果を分析した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0048】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0049】
化合物またはその薬学的に許容可能な塩
本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【0050】
［化学式１］
【化7】
【0051】
前記化学式１において、Ｌ１は、単一結合または
であり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－１０の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－８のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－８のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－１０の直鎖または側鎖アルキルでありうる。
【化8】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－１０の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－８のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－８のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－１０の直鎖または側鎖アルキルでありうる。
【0052】
本発明による一実施例において、前記Ｌ１は、単一結合または
であり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－５の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－７のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－５の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－７のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－５の直鎖または側鎖アルキルでありうる。
【化9】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ－Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１－５の直鎖または側鎖アルキル、またはＣ６－７のアリールアミドであり、ここで、前記アリールアミドのアリールには、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－５の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにＣ６－７のアリールを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ－Ｈ、ハロゲン、－ＮＯ２またはＣ１－５の直鎖または側鎖アルキルでありうる。
【0053】
本発明による一実施例において、前記Ｌ１は、単一結合または
であり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ－Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ３、またはフェニルアミドであり、ここで、前記フェニルアミドのフェニルには、－Ｃｌ、－ＮＯ２および－ＣＨ２Ｃｌのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにフェニルを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－ＮＯ２または－ＣＨ２ＣＨ３でありうる。
【化10】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ－Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ３、またはフェニルアミドであり、ここで、前記フェニルアミドのフェニルには、－Ｃｌ、－ＮＯ２および－ＣＨ２Ｃｌのうち１種以上が置換されることができ；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにフェニルを形成することができ；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－ＮＯ２または－ＣＨ２ＣＨ３でありうる。
【0054】
本発明による一実施例において、前記Ｌ１は、単一結合または
であり；
Ｒ１は、－Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ３、
、
、または
であり；
Ｒ２は、－Ｈであり；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにフェニルを形成することができ；
Ｒ３は、－Ｈまたは、－Ｃｌであり；
Ｒ４は、－Ｈ、－Ｆまたは、－Ｃｌであり；
Ｒ５は、－Ｆ、－Ｃｌ、－ＮＯ２、または－ＣＨ２ＣＨ３であり；
Ｒ６は、－Ｈであり；
Ｒ７は、－Ｈであるものでありうる。
【化11】
Ｒ１は、－Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ３、
【化12】
【化13】
【化14】
Ｒ２は、－Ｈであり；
前記Ｒ１およびＲ２は、これらが連結された炭素原子とともにフェニルを形成することができ；
Ｒ３は、－Ｈまたは、－Ｃｌであり；
Ｒ４は、－Ｈ、－Ｆまたは、－Ｃｌであり；
Ｒ５は、－Ｆ、－Ｃｌ、－ＮＯ２、または－ＣＨ２ＣＨ３であり；
Ｒ６は、－Ｈであり；
Ｒ７は、－Ｈであるものでありうる。
【0055】
本発明による化学式１で表される化合物の好ましい例としては、下記の化合物群が挙げられる。
１）Ｎ－（ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－イル）－２－クロロ－４－ニトロベンズアミド；
２）８－メチル－２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール；
３）２－（（３，４－ジクロロフェニル）アミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－オル；
４）Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－２－クロロ－５－ニトロベンズアミド；
５）Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－３，４－ジクロロベンズアミド；
６）Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－３－（クロロメチル）ベンズアミド；
７）２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール；
８）Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）ナフト［２，３－ｄ］オキサゾール－２－アミン；
９）Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）－５－メチルベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン；および
１０）Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン。
１）Ｎ－（ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－イル）－２－クロロ－４－ニトロベンズアミド；
２）８－メチル－２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール；
３）２－（（３，４－ジクロロフェニル）アミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－オル；
４）Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－２－クロロ－５－ニトロベンズアミド；
５）Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－３，４－ジクロロベンズアミド；
６）Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－３－（クロロメチル）ベンズアミド；
７）２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール；
８）Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）ナフト［２，３－ｄ］オキサゾール－２－アミン；
９）Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）－５－メチルベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン；および
１０）Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン。
【0056】
本発明の前記化学式１で表される化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で使用でき、塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）により形成された酸付加塩が有用である。薬学的に許容可能な塩という表現は、患者に比較的非毒性であり、無害な有効作用を有する濃度であり、この塩に起因した副作用が化学式１の塩基化合物の有利な効能を落とさない化学式１の塩基化合物のいずれの有機または無機付加塩を意味する。これら塩は、遊離酸としては、無機酸と有機酸が使用でき、無機酸としては、塩酸、臭素酸、硝酸、硫酸、過塩素酸、リン酸などが使用でき、有機酸としては、クエン酸、酢酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グルコン酸、コハク酸、タルタル酸、ガラクツロン酸、エンボン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、シュウ酸、（Ｄ）または（Ｌ）リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、サリチル酸、クエン酸、安息香酸またはマロン酸などが使用できる。また、これらの塩は、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）およびアルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）などを含む。例えば、酸付加塩としては、アセテート、アスパルテート、ベンゾアート、ベシレート、バイカーボネート／カーボネート、バイサルフェート／サルフェート、ボラート、カムシレート、シトレート、エジシレート、エシレート、ホルメート、フマラート、グルセプテート、グルコネート、グルクロナート、ヘキサフルオルホスフェート、ハイベンゼート、ハイドロクロリド／クロリド、ハイドロブロミド／ブロミド、ハイドロヨージド／ヨージド、イセチオナート、ラクテート、マレート、マレアート、マロネート、メシレート、メチルサルフェート、ナフチレート、２－ナフシレート、ニコチネート、ナイトレート、ヨロテート、オキサレート、パルミテート、パモエート、ホスフェート／水素ホスフェート／二水素ホスフェート、サッカレート、ステアレート、スクシネート、タルトレート、トシレート、トリフルオルアセテート、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リシン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、亜鉛塩などが含まれ得、これらのうち、ハイドロクロリドまたはトリフルオルアセテートが好ましい。
【0057】
また、本発明の前記化学式１で表される化合物は、薬学的に許容される塩だけでなく、通常の方法によって製造できるすべての塩、異性体、水和物および溶媒和物を全部含む。
【0058】
本発明による付加塩は、通常の方法で製造することができ、例えば、化学式１の化合物を水混和性有機溶媒、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、またはアセトニトリルなどに溶かし、過量の有機酸を加えたり、無機酸の酸水溶液を加えた後、沈殿させたり、結晶化させて製造することができる。次に、この混合物から溶媒や過量の酸を蒸発させた後、乾燥させて、付加塩を得たり、または析出された塩を吸引ろ過させて製造することができる。
【0059】
製造方法１
本発明は、下記反応式１に示されたように、
化合物２を有機溶媒に溶かした後、化合物３を添加し、１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物４を得る段階（段階１）；および
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物４が溶解した有機溶媒を滴加した後、１５～３０℃で１０～１６時間反応させて化合物１Ａを得る段階（段階２）；
を含む化学式１Ａで表される化合物の製造方法を提供する。
本発明は、下記反応式１に示されたように、
化合物２を有機溶媒に溶かした後、化合物３を添加し、１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物４を得る段階（段階１）；および
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物４が溶解した有機溶媒を滴加した後、１５～３０℃で１０～１６時間反応させて化合物１Ａを得る段階（段階２）；
を含む化学式１Ａで表される化合物の製造方法を提供する。
【0060】
［反応式１］
【化15】
【0061】
前記反応式１において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ａは、請求項１の化学式１に含まれる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ａは、請求項１の化学式１に含まれる。
【0062】
本発明の製造方法において、前記有機溶媒の例としては、メタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１，２－ジメトキシエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジオキサンを単独でまたは混合して使用できる。
【0063】
本発明の製造方法において、前記製造方法によって製造できる化合物の例としては、８－メチル－２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール、２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール、Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）ナフト［２，３－ｄ］オキサゾール－２－アミン、Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）－５－メチルベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミンまたはＮ－（３，４－ジフルオロフェニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミンでありうる。
【0064】
製造方法２
本発明は、下記反応式２に示されたように、
化合物５を有機溶媒に溶かした後、化合物３を添加し、１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物６を得る段階（段階１）；
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物６が溶解した有機溶媒を滴加した後、１２～２４時間反応させて化合物７を得る段階（段階２）；および
化合物７を有機溶媒に溶かし、三臭化ホウ素（ＢＢｒ３）を添加した後、常温で２０～２８時間反応させて化合物１Ｂを得る段階（段階３）；
を含む化学式１Ｂで表される化合物の製造方法を提供する。
本発明は、下記反応式２に示されたように、
化合物５を有機溶媒に溶かした後、化合物３を添加し、１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物６を得る段階（段階１）；
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物６が溶解した有機溶媒を滴加した後、１２～２４時間反応させて化合物７を得る段階（段階２）；および
化合物７を有機溶媒に溶かし、三臭化ホウ素（ＢＢｒ３）を添加した後、常温で２０～２８時間反応させて化合物１Ｂを得る段階（段階３）；
を含む化学式１Ｂで表される化合物の製造方法を提供する。
【0065】
［反応式２］
【化16】
【0066】
前記反応式２において、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ｂは、請求項１の化学式１に含まれる。
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ｂは、請求項１の化学式１に含まれる。
【0067】
本発明の製造方法において、前記有機溶媒の例としては、メタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１，２－ジメトキシエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジオキサンを単独でまたは混合して使用できる。
【0068】
本発明の製造方法において、前記製造方法によって製造できる化合物の例としては、２－（（３，４－ジクロロフェニル）アミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－オルでありうる。
【0069】
製造方法３
本発明は、下記反応式３に示されたように、
化合物８、二硫化炭素（Ｃａｒｂｏｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ヨードメタン（Ｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ）、および水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で２～８時間反応させて化合物９を得る段階（段階１）；および
化合物９および化合物２を有機溶媒に溶かした後、２～８時間反応させて化合物１Ｃを得る段階（段階２）；
を含む化学式１Ｃで表される化合物の製造方法を提供する。
本発明は、下記反応式３に示されたように、
化合物８、二硫化炭素（Ｃａｒｂｏｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ヨードメタン（Ｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ）、および水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で２～８時間反応させて化合物９を得る段階（段階１）；および
化合物９および化合物２を有機溶媒に溶かした後、２～８時間反応させて化合物１Ｃを得る段階（段階２）；
を含む化学式１Ｃで表される化合物の製造方法を提供する。
【0070】
［反応式３］
【化17】
【0071】
前記反応式３において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ｃは、請求項１の化学式１に含まれる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し、
前記化合物１Ｃは、請求項１の化学式１に含まれる。
【0072】
本発明の製造方法において、前記有機溶媒の例としては、メタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１，２－ジメトキシエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジオキサンを単独でまたは混合して使用できる。
【0073】
本発明の製造方法において、前記製造方法によって製造できる化合物の例としては、Ｎ－（ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－イル）－２－クロロ－４－ニトロベンズアミドでありうる。
【0074】
製造方法４
本発明は、下記反応式４に示されたように、
化合物１０および化合物３を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で２０～２８時間反応させて化合物１１を得る段階（段階１）；
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物１１が溶解した有機溶媒を滴加した後、１０～５０℃で１２～２４時間反応させて化合物１２を得る段階（段階２）；
化合物１２を触媒とともに有機溶媒に添加した後、水素ガスを注入して１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物１３を得る段階（段階３）；および
化合物１３および化合物１４を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で１２～２４時間反応させて化合物１Ｄを得る段階（段階４）；
を含む化合物１Ｄで表される化合物の製造方法を提供する。
本発明は、下記反応式４に示されたように、
化合物１０および化合物３を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で２０～２８時間反応させて化合物１１を得る段階（段階１）；
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が溶解した有機溶媒に、前記段階１で得られた化合物１１が溶解した有機溶媒を滴加した後、１０～５０℃で１２～２４時間反応させて化合物１２を得る段階（段階２）；
化合物１２を触媒とともに有機溶媒に添加した後、水素ガスを注入して１０～５０℃で１２～２０時間反応させて化合物１３を得る段階（段階３）；および
化合物１３および化合物１４を有機溶媒に溶かした後、１０～５０℃で１２～２４時間反応させて化合物１Ｄを得る段階（段階４）；
を含む化合物１Ｄで表される化合物の製造方法を提供する。
【0075】
［反応式４］
【化18】
【0076】
前記反応式４において、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し；
Ｒ８は、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上であり；
前記化合物１Ｄは、請求項１の化学式１に含まれる。
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項１の化学式１で定義したものと同一のものを表し；
Ｒ８は、ハロゲン、－ＮＯ２およびＣ１－１０の直鎖または側鎖ハロゲン化アルキルのうち１種以上であり；
前記化合物１Ｄは、請求項１の化学式１に含まれる。
【0077】
本発明の製造方法において、前記有機溶媒の例としては、メタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１，２－ジメトキシエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジオキサンを単独でまたは混合して使用できる。
【0078】
本発明の製造方法において、前記製造方法によって製造できる化合物の例としては、Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－２－クロロ－５－ニトロベンズアミド、Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－３，４－ジクロロベンズアミドまたはＮ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－３－（クロロメチル）ベンズアミドでありうる。
【0079】
細胞老化抑制用組成物
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む細胞老化抑制用組成物を提供する。
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む細胞老化抑制用組成物を提供する。
【0080】
本発明の組成物において、前記細胞は、腎近位尿細管上皮細胞であってもよく、これに限定されない。
【0081】
本発明の組成物において、前記組成物は、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子の発現量を向上させることができる。
【0082】
皮膚老化の予防または改善用化粧料組成物
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【0083】
本発明の組成物において、前記組成物は、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子の発現量を向上させることができる。
【0084】
本発明の化粧料組成物は、上述した本発明の有効物質の化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）および化粧品学的に許容される担体を含んで製造することができる。
【0085】
本発明の一実施例による前記化粧料組成物は、その剤形において特に限定されるものではなく、スキン、スキンソフトナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、アイクリーム、モイスチャクリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレジングフォーム、クレンジングウォーター、クレジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンジャー、ソープまたはパウダーなどの化粧品に剤形化することができる。
【0086】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられ得る。
【0087】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられ得、特にスプレーである場合には、さらに、ハイドロクロロフルオロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。
【0088】
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶媒和剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾアート、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコールオイル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタン脂肪酸エステルがある。
【0089】
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガカントなどが用いられ得る。
【0090】
本発明の剤形が界面－活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオナート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシ化グリセリン脂肪酸エステルなどが用いられ得る。
【0091】
皮膚老化の予防または改善用健康機能食品または健康食品組成物
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用健康機能食品または健康食品組成物を提供する。
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚老化の予防または改善用健康機能食品または健康食品組成物を提供する。
【0092】
本発明の組成物において、前記組成物は、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子の発現量を向上させることができる。
【0093】
食品の種類には、特別な限定はない。本発明の有効物質を添加できる食品の例としては、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、ビスケット、モチ、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、アルコール飲料およびビタミン複合剤、乳製品および乳加工製品などがあり、通常の意味における健康食品および健康機能性食品を全部含む。
【0094】
本発明による有効物質を含有する健康食品および健康機能性食品組成物は、食品にそのまま添加したり、他の食品または食品成分と共に使用でき、通常の方法によって適切に使用できる。有効物質の混合量は、その使用目的（予防または改善用）によって適宜決定できる。一般的に、健康食品および健康機能性食品中の前記組成物の量は、全体食品重量の０．１～９０重量部で加えることができる。しかしながら、健康維持を目的としたり、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下であってもよく、安全性の面から何の問題もないので、有効物質は、前記範囲以上の量でも使用できる。
【0095】
本発明の健康食品および健康機能性食品組成物は、指示された比率で必須成分として本発明の有効物質を含有する以外には、他の成分には特別な限定がなく、通常の飲料とともに様々な香味剤または天然炭水化物などをさらなる成分として含有してもよい。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなど；およびポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えばレバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用できる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の健康機能性食品組成物１００ｇ当たり一般的に約１～２０ｇ、好ましくは、約５～１２ｇである。
【0096】
前記の他に本発明の有効物質を含有する健康食品および健康機能性食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有してもよい。その他、本発明の健康食品および健康機能性食品組成物は、天然果物ジュースおよび果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。
【0097】
このような成分は、独立して、または組み合わせて使用できる。このような添加剤の比率は、あまり重要なことではないが、本発明の有効物質を含有する健康食品および健康機能性食品組成物１００重量部当たり０．１～約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【0098】
血管老化によって誘発される疾患の予防または治療用薬学的組成物
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0099】
本発明の組成物において、前記組成物は、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子の発現量を向上させることができる。
【0100】
また、本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩、およびアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋｅｒ）を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。具体的に、前記アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤は、ロサルタン（ｌｏｓａｒｔａｎ）、バルサルタン（ｖａｌｓａｒｔａｎ）、テルミサルタン（ｔｅｌｍｉｓａｒｔａｎ）イルベサルタン（ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ）、アジルサルタン（ａｚｉｌｓａｒｔａｎ）およびオルメサルタン（ｏｌｍｅｓａｒｔａｎ）からなる群から選択される一つ以上を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【0101】
化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩と共に従来高血圧治療剤に使用されているアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋｅｒ）薬物を併用投与する場合、各薬物を独立して投与した場合より、さらに血圧減少効果を示すことができる。
【0102】
本発明の組成物において、前記血管老化によって誘発される疾患は、高血圧、狭心症、心筋梗塞症、動脈硬化、前立腺肥大症、血管けいれん収縮、血栓症、脳梗塞または脳出血でありうる。
【0103】
本発明の化合物は、臨床投与時に経口および非経口の様々な剤形で投与でき、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して製造される。
【0104】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の本発明の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）またはゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤の他にマグネシウム、ステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤などが該当するが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。
【0105】
非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用できる。
【0106】
また、本発明の化合物の人体に対する効果的な投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患程度によって異なり、一般的に、約０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは、０．０１～３５ｍｇ／ｋｇ／日である。体重が７０ｋｇの成人患者を基準とするとき、一般的に０．０７～７０００ｍｇ／日であり、好ましくは、０．７～２５００ｍｇ／日であり、医師または薬剤師の判断によって一定の時間間隔で１日に１回～数回に分割投与することもできる。
【0107】
血管老化によって誘発される疾患の予防または改善用健康機能食品または健康食品組成物
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または改善用健康機能食品または健康食品組成物を提供する。
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む血管老化によって誘発される疾患の予防または改善用健康機能食品または健康食品組成物を提供する。
【0108】
本発明の組成物において、前記組成物は、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子の発現量を向上させることができる。
【0109】
本発明の組成物において、前記血管老化によって誘発される疾患は、高血圧、狭心症、心筋梗塞症、動脈硬化、前立腺肥大症、血管けいれん収縮、血栓症、脳梗塞または脳出血でありうる。
【0110】
腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0111】
本発明の組成物において、前記組成物は、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子の発現量を向上させることができる。
【0112】
本発明の組成物において、前記腎臓疾患は、腎炎、腎盂炎、腎症候群、急性腎盂炎、慢性腎盂炎、尿路感染症、糖尿病腎症、慢性糸球体腎炎、急性進行性腎炎、ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症、膜性腎症または膜性増殖性糸球体腎炎でありうる。
【0113】
腎臓疾患の予防または改善用健康機能食品または健康食品組成物
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または改善用健康機能食品または健康食品組成物を提供する。
本発明は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む腎臓疾患の予防または改善用健康機能食品または健康食品組成物を提供する。
【0114】
本発明の組成物において、前記組成物は、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子の発現量を向上させることができる。
【0115】
本発明の組成物において、前記腎臓疾患は、腎炎、腎盂炎、腎症候群、急性腎盂炎、慢性腎盂炎、尿路感染症、糖尿病腎症、慢性糸球体腎炎、急性進行性腎炎、ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症、膜性腎症または膜性増殖性糸球体腎炎でありうる。
【0116】
以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【0117】
＜実施例１＞Ｎ－（ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－イル）－２－クロロ－４－ニトロベンズアミド（Ｎ－（Ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，ＦＣＣＳ－１７０６４）の製造
【化19】
【0118】
段階１：ジメチル（２－クロロ－４－ニトロベンゾイル）カルボニミドジチオエート（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ（２－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌ）ｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ、１７０６４－２－１）の製造
２－クロロ－４－ニトロベンズアミド（２－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）（５００ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）、二硫化炭素（Ｃａｒｂｏｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＣＳ２）（７５９ｍｇ、９．９７ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（Ｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ）（１．１３ｇ、７．９７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（７ｍＬ）に溶かした後、６０％水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）（２００ｍｇ、４．９８ｍｍｏｌ）を入れ、室温で５時間撹拌した。
２－クロロ－４－ニトロベンズアミド（２－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）（５００ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）、二硫化炭素（Ｃａｒｂｏｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＣＳ２）（７５９ｍｇ、９．９７ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（Ｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ）（１．１３ｇ、７．９７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（７ｍＬ）に溶かした後、６０％水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）（２００ｍｇ、４．９８ｍｍｏｌ）を入れ、室温で５時間撹拌した。
【0119】
反応混合物に氷水（ｉｃｅ－ｃｏｌｄ ｗａｔｅｒ）をゆっくり加え、エチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で抽出した。有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をシリカ－ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（１０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、ジメチル（２－クロロ－４－ニトロベンゾイル）カルボニミドジチオエート（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ（２－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌ）ｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ、１７０６４－２－１）を淡黄色の固体（１６０ｍｇ、２１％）として得た。
【0120】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）；δ８．３４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、８．２９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４、８．８Ｈｚ）、８．２０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、２．６５（ｓ、６Ｈ）。
【0121】
段階２：Ｎ－（ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－イル）－２－クロロ－４－ニトロベンズアミド（Ｎ－（Ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，ＦＣＣＳ－１７０６４）の製造
【0122】
前記段階１で得られたジメチル（２－クロロ－４－ニトロベンゾイル）カルボニミドジチオエート（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ（２－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌ）ｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ、１７０６４－２－１）（１５０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（１５ｍＬ）に溶かした後、２－アミノフェノール（２－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ）（５３ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を入れた。
【0123】
反応混合物を６時間還流した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物にジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）を入れ、沈殿した固体をフィルターして得られた固体をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（４０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物Ｎ－（ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－イル）－２－クロロ－４－ニトロベンズアミド（Ｎ－（Ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，ＦＣＣＳ－１７０６４）を茶色の固体（７０ｍｇ、３０％）として得た。
【0124】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）；δ８．３６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、８．３３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０、８．４Ｈｚ）、８．０９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．６２－７．５６（ｍ、２Ｈ）、７．４０－７．３３（ｍ、２Ｈ）。
【0125】
＜実施例２＞８－メチル－２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール（８－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）］ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５）の製造
【化20】
【0126】
段階１：１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）チオウレア（１－（３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、１７０６５－２－１）の製造
２－アミノ－ｐ－クレゾール（２－Ａｍｉｎｏ－ｐ－ｃｒｅｓｏｌ）（３００ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）をメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（１２ｍＬ）に溶かした後、３，４－ジクロロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｃｈｌｏｌｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（４９７ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認した後、冷蔵庫（０～４℃）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）した。沈殿した固体をフィルターして、白色固体（３４６ｍｇ）として１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）チオウレア（１－（３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、１７０６５－２－１）を得、さらなる精製することなく、次のステップに使用した。
２－アミノ－ｐ－クレゾール（２－Ａｍｉｎｏ－ｐ－ｃｒｅｓｏｌ）（３００ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）をメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（１２ｍＬ）に溶かした後、３，４－ジクロロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｃｈｌｏｌｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（４９７ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認した後、冷蔵庫（０～４℃）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）した。沈殿した固体をフィルターして、白色固体（３４６ｍｇ）として１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）チオウレア（１－（３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、１７０６５－２－１）を得、さらなる精製することなく、次のステップに使用した。
【0127】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）；δ７．９８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝０．４，２．０Ｈｚ）、７．５５－７．５０（ｍ、２Ｈ）、７．４３（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、６．９４－６．９０（ｍ、１Ｈ）、６．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）２．２４（ｓ、３Ｈ）。
【0128】
段階２：８－メチル－２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール（８－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）］ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５）の製造
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（３７５ｍｇ、５．２９ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（１５ｍＬ）の溶液に前記段階１で得られた１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）チオウレア（１－（３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、１７０６５－２－１）（３４６ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（２５ｍＬ）に溶かした溶液をゆっくり加えた後、室温で１８時間撹拌した。
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（３７５ｍｇ、５．２９ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（１５ｍＬ）の溶液に前記段階１で得られた１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）チオウレア（１－（３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、１７０６５－２－１）（３４６ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（２５ｍＬ）に溶かした溶液をゆっくり加えた後、室温で１８時間撹拌した。
【0129】
反応混合物にジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）と水を入れて抽出した。有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（１０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物８－メチル－２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール（８－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）］ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５）を白色の固体（１７０ｍｇ、２４％、２ ｓｔｅｐｓ）として得た。
【0130】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）；δ８．２９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、７．７３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８、８．８Ｈｚ）、７．７６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．３２－７．２０（ｍ、１Ｈ）、７．２８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．００－６．９７０（ｍ、１Ｈ）、２．４１（ｓ、３Ｈ）。
【0131】
＜実施例３＞２－（（３，４－ジクロロフェニル）アミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－オル（２－（（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｏｌ、ＦＣＣＳ－１７０６６）の製造
【化21】
【0132】
段階１：１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メトキシフェニル）チオウレア（１－（３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、１７０６６－３－１）の製造
２－アミノ－４－メトキシフェノール（２－Ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌ）（１．１３ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（４０ｍＬ）に溶かした後、３，４－ジクロロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｃｈｌｏｌｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（１．９９ｇ、９．７４ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認した後、冷蔵庫（０～４℃）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）した。沈殿した固体をフィルターして、茶色固体（２ｇ）として１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メトキシフェニル）チオウレア（１－（３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、１７０６６－３－１）を得、さらなる精製することなく、次のステップに使用した。
２－アミノ－４－メトキシフェノール（２－Ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌ）（１．１３ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（４０ｍＬ）に溶かした後、３，４－ジクロロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｃｈｌｏｌｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（１．９９ｇ、９．７４ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認した後、冷蔵庫（０～４℃）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）した。沈殿した固体をフィルターして、茶色固体（２ｇ）として１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メトキシフェニル）チオウレア（１－（３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、１７０６６－３－１）を得、さらなる精製することなく、次のステップに使用した。
【0133】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）；δ７．８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４Ｈｚ）、７．４８－７．４４（ｍ、２Ｈ）、７．３９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．４、８．８Ｈｚ）、６．８１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、６．６６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．６、８．８Ｈｚ）、３．７３（ｓ、３Ｈ）。
【0134】
段階２：Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）－５－メトキシベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、１７０６６－３－２）の製造
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（５４０ｍｇ、７．６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（２０ｍＬ）の溶液に前記段階１で得られた１７０６６－３－１（５２５ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（３０ｍＬ）に溶かした溶液をゆっくり加えた後、室温で１８時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）と水を入れ、抽出した。有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）－５－メトキシベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、１７０６６－３－２）を茶色の固体（２３０ｍｇ、３５％）として得た。
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（５４０ｍｇ、７．６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（２０ｍＬ）の溶液に前記段階１で得られた１７０６６－３－１（５２５ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（３０ｍＬ）に溶かした溶液をゆっくり加えた後、室温で１８時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）と水を入れ、抽出した。有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）－５－メトキシベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、１７０６６－３－２）を茶色の固体（２３０ｍｇ、３５％）として得た。
【0135】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）；δ８．２９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４Ｈｚ）、７．７０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４、８．８Ｈｚ）、７．５５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．３０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．０８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、７．７４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４、８．８Ｈｚ）、３．８４（ｓ、３Ｈ）。
【0136】
段階３：２－（（３，４－ジクロロフェニル）アミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－オル（２－（（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｏｌ、ＦＣＣＳ－１７０６６）の製造
Ａｒガス雰囲気下で前記段階２で得られた１７０６６－３－２（２００ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）（１５ｍＬ、ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）に溶かした後、氷浴（ｉｃｅ－ｂａｔｈ）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）した。三臭化ホウ素（ＢＢｒ３）（３．２３ｍＬ、１．０Ｍ ｉｎ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）をゆっくり入れ、室温まで温度を上げた後、２４時間撹拌した。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液（８ｍＬ、１．０Ｍ ｉｎ ｗａｔｅｒ）をゆっくり入れ、反応を終結し、分液漏斗（ｓｅｐａｒａｔｏｒｙ ｆｕｎｎｅｌ）に移して、有機層と水層を分離した。水層をエチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で抽出した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（４０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物２－（（３，４－ジクロロフェニル）アミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－オル（２－（（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｏｌ、ＦＣＣＳ－１７０６６）を茶色の固体（９７ｍｇ、５０％）として得た。
Ａｒガス雰囲気下で前記段階２で得られた１７０６６－３－２（２００ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）（１５ｍＬ、ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）に溶かした後、氷浴（ｉｃｅ－ｂａｔｈ）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）した。三臭化ホウ素（ＢＢｒ３）（３．２３ｍＬ、１．０Ｍ ｉｎ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）をゆっくり入れ、室温まで温度を上げた後、２４時間撹拌した。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液（８ｍＬ、１．０Ｍ ｉｎ ｗａｔｅｒ）をゆっくり入れ、反応を終結し、分液漏斗（ｓｅｐａｒａｔｏｒｙ ｆｕｎｎｅｌ）に移して、有機層と水層を分離した。水層をエチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で抽出した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（４０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物２－（（３，４－ジクロロフェニル）アミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－オル（２－（（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｏｌ、ＦＣＣＳ－１７０６６）を茶色の固体（９７ｍｇ、５０％）として得た。
【0137】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）；δ８．２９（ｂｒ ｓ、－ＯＨ）、８．２６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４Ｈｚ）、７．７２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４、８．８Ｈｚ）、７．５６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．２１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０、７．２Ｈｚ）、６．９５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．６６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４、８．８Ｈｚ）。
【0138】
＜実施例４＞Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－２－クロロ－５－ニトロベンズアミド（Ｎ－（２－（４－Ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｃｈｌｏｒｏ－５－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、ＦＣＣＳ－１７０６７）の製造
【化22】
【0139】
段階１：１－（４－エチルフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－ニトロフェニル）チオウレア（１－（４－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、Ｉｎｔｅｒｍ－３－１）の製造
【0140】
２－アミノ－４－ニトロフェノール（２－Ａｍｉｎｏ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）（１．８８ｇ、１２．２５ｍｍｏｌ）と４－エチルフェニルイソチオシアネート（４－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｔｅ）（２ｇ、１２．２５ｍｍｏｌ）をメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（８０ｍＬ）に溶かした後、室温で一日間撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、クロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、１－（４－エチルフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－ニトロフェニル）チオウレア（１－（４－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、Ｉｎｔｅｒｍ－３－１）を茶色の固体（２．９ｇ、６５％）として得た。
【0141】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）；δ９．２４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、７．８８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０、９．２Ｈｚ）、７．３６（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．２５（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、６．９４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、２．６６（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、１．２４（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）。
【0142】
段階２：Ｎ－（４－エチルフェニル）－５－ニトロベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（４－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－５－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、Ｉｎｔｅｒｍ－３－２）の製造
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（２．８ｇ、３９．３８ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（１３０ｍＬ）の溶液を氷浴（ｉｃｅ－ｂａｔｈ）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）した後、前記段階１で得られたＩｎｔｅｒｍ－３－１（２．５ｇ、７．８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（１７０ｍＬ）に溶かした溶液をゆっくり加えた後、室温で１８時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）と水を入れ、抽出した。有機層を塩水で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（１０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、化合物Ｉｎｔｅｒｍ－３－２を茶色の固体（１．７８ｇ、８０％）として得た。
過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（２．８ｇ、３９．３８ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（１３０ｍＬ）の溶液を氷浴（ｉｃｅ－ｂａｔｈ）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）した後、前記段階１で得られたＩｎｔｅｒｍ－３－１（２．５ｇ、７．８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（１７０ｍＬ）に溶かした溶液をゆっくり加えた後、室温で１８時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）と水を入れ、抽出した。有機層を塩水で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（１０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、化合物Ｉｎｔｅｒｍ－３－２を茶色の固体（１．７８ｇ、８０％）として得た。
【0143】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）；δ８．２０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．０Ｈｚ）、８．０８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝０．８、９．６Ｈｚ）、７．５９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．５１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．２２（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、２．６４（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、１．２４（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）。
【0144】
段階３：Ｎ－（４－エチルフェニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２，５－ジアミン（Ｎ－（４－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌｅ－２，５－ｄｉａｍｉｎｅ、Ｉｎｔｅｒｍ－３－３）の製造
Ｐｄ／Ｃ（Ｐａｌｌａｄｉｕｍ ｏｎ ｃａｒｂｏｎ）（１．７０ｇ、０．８０ｍｍｏｌ、１０ｗｔ．％、ｗｅｔ ｓｕｐｐｏｒｔ）を丸いフラスコ（ｒｏｕｎｄ－ｆｌａｓｋ）に称量して入れた後、Ａｒガスでパージング（ｐｕｒｇｉｎｇ）した。そこへ前記段階２で得られたＩｎｔｅｒｍ－３－２（１．５８ｇ、５．３０ｍｍｏｌ）をメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（８０ｍＬ）に溶かした溶液をゆっくり入れた後、Ｈ２（ｇ）で置換した。Ｈ２（ｇ）をｂｕｂｂｌｉｎｇしながら、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認後、Ｃｅｌｉｔｅ ｐａｄでフィルターした後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（４０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、化合物Ｉｎｔｅｒｍ－３－３を淡茶色の固体（１．２１ｇ、９０％）として得た。
Ｐｄ／Ｃ（Ｐａｌｌａｄｉｕｍ ｏｎ ｃａｒｂｏｎ）（１．７０ｇ、０．８０ｍｍｏｌ、１０ｗｔ．％、ｗｅｔ ｓｕｐｐｏｒｔ）を丸いフラスコ（ｒｏｕｎｄ－ｆｌａｓｋ）に称量して入れた後、Ａｒガスでパージング（ｐｕｒｇｉｎｇ）した。そこへ前記段階２で得られたＩｎｔｅｒｍ－３－２（１．５８ｇ、５．３０ｍｍｏｌ）をメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（８０ｍＬ）に溶かした溶液をゆっくり入れた後、Ｈ２（ｇ）で置換した。Ｈ２（ｇ）をｂｕｂｂｌｉｎｇしながら、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認後、Ｃｅｌｉｔｅ ｐａｄでフィルターした後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（４０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、化合物Ｉｎｔｅｒｍ－３－３を淡茶色の固体（１．２１ｇ、９０％）として得た。
【0145】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）；δ７．７１（ｍ、２Ｈ）、７．１９（ｍ、２Ｈ）、７．０３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝０．８、８．４Ｈｚ）、６．７５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝０．８、２．０Ｈｚ）、６．４４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０、８．４Ｈｚ）、２．６０（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、１．１９（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）。
【0146】
段階４：Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－２－クロロ－５－ニトロベンズアミド（Ｎ－（２－（４－Ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｃｈｌｏｒｏ－５－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、ＦＣＣＳ－１７０６７）の製造
前記段階３で得られたＩｎｔｅｒｍ－３－３（２５３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、２－クロロ－５－ニトロベンゾイルクロリド（２－ｃｈｌｏｒｏ－５－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（２２０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）（４ｍＬ）に溶かした後、ジイソメチルプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ，ＤＩＰＥＡ）（１２９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１８時間撹拌した。１８時間後、２－クロロ－５－ニトロベンゾイルクロリド（２－ｃｈｌｏｒｏ－５－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）とジイソメチルプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ，ＤＩＰＥＡ）各０．５当量を追加し、８時間さらに撹拌した。反応混合物に１０％ ＨＣｌ（ａｑ．）を入れ、エチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で抽出した後、有機層を飽和されたＮａＨＣＯ３水溶液と塩水で順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（４０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－２－クロロ－５－ニトロベンズアミド（Ｎ－（２－（４－Ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｃｈｌｏｒｏ－５－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、ＦＣＣＳ－１７０６７）を淡黄色の固体（１２０ｍｇ、２７％）として得た。
前記段階３で得られたＩｎｔｅｒｍ－３－３（２５３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、２－クロロ－５－ニトロベンゾイルクロリド（２－ｃｈｌｏｒｏ－５－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（２２０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）（４ｍＬ）に溶かした後、ジイソメチルプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ，ＤＩＰＥＡ）（１２９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１８時間撹拌した。１８時間後、２－クロロ－５－ニトロベンゾイルクロリド（２－ｃｈｌｏｒｏ－５－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）とジイソメチルプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ，ＤＩＰＥＡ）各０．５当量を追加し、８時間さらに撹拌した。反応混合物に１０％ ＨＣｌ（ａｑ．）を入れ、エチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で抽出した後、有機層を飽和されたＮａＨＣＯ３水溶液と塩水で順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（４０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－２－クロロ－５－ニトロベンズアミド（Ｎ－（２－（４－Ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｃｈｌｏｒｏ－５－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、ＦＣＣＳ－１７０６７）を淡黄色の固体（１２０ｍｇ、２７％）として得た。
【0147】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）；δ１０．７１（ｓ、１Ｈ）、１０．５３（ｓ、１Ｈ）、８．４８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、８．３４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４、８．８Ｈｚ）、７．９０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．６４（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．４６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．４０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０、８．４Ｈｚ）、７．２１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、２．５８（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、１．１８（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）。
【0148】
＜実施例５＞Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－３，４－ジクロロベンズアミド（Ｎ－（２－（４－Ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｙｌ）－３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、ＦＣＣＳ－１７０６８）の製造
【化23】
【0149】
前記実施例４の段階３で得られたＩｎｔｅｒｍ－３－３（２５３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、３，４－ジクロロベンゾイルクロリド（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（２０９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）（４ｍＬ）に溶かした後、ジイソメチルプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ，ＤＩＰＥＡ）（１２９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１８時間撹拌した。反応混合物に１０％ ＨＣｌ（ａｑ．）を入れ、エチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で抽出した後、有機層を飽和されたＮａＨＣＯ３水溶液と塩水で順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（４０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物ＦＣＣＳ－１７０６８を淡白色の固体（２７０ｍｇ、６４％）として得た。
【0150】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）；δ８．１８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４Ｈｚ）、７．９９（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝２．４Ｈｚ）、７．９７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．８０－７．２０（ｍ、３Ｈ）、７．７０－７．５０（ｍ、１Ｈ）、７．３５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．２４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、２．６３（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、１．２２（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）。
【0151】
＜実施例６＞Ｎ－（２－（４－エチルフェニルアミノ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－３－（クロロメチル）ベンズアミド（Ｎ－（２－（４－Ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－５－ｙｌ）－３－（ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ、ＦＣＣＳ－１７０６９）の製造
【化24】
【0152】
前記実施例４の段階３で得られたＩｎｔｅｒｍ－３－３（２５３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、３－（クロロメチル）ベンゾイルクロリド（３－（ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１８９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）（４ｍＬ）に溶かした後、ジイソメチルプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ，ＤＩＰＥＡ）（１２９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１８時間撹拌した。反応混合物に１０％ ＨＣｌ（ａｑ．）を入れ、エチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で抽出した後、有機層を飽和されたＮａＨＣＯ３水溶液と塩水で順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（３０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物ＦＣＣＳ－１７０６９を淡白色の固体（１７０ｍｇ、４０％）として得た。
【0153】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）；δ８．０８（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１．２Ｈｚ）、８．０３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．９８（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ＝１．２、７．６Ｈｚ）、７．８０－７．７５（ｍ、２Ｈ）、７．６９－７．６５（ｍ、１Ｈ）、７．５７－７．５２（ｍ、３Ｈ）、７．３４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．２６－７．２２（ｍ、２Ｈ）、２．６２（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、１．２２（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）。
【0154】
＜実施例７＞２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール（２－［Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）］ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ａ）の製造
【化25】
【0155】
段階１：１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシフェニル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ａ－２－１）の製造
Ａｒガス雰囲気下で２－アミノフェノール（２－Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ）（３００ｍｇ、２．７４９ｍｍｏｌ）にメタノール（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＭｅＯＨ）（８ｍＬ）を加えて溶かした後、３，４－ジクロロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（０．４７ｍＬ、３．２９９ｍｍｏｌ）をゆっくり滴加し、１４時間常温で撹拌させる。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認し、減圧して、溶媒を除去後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（３０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．４）を行うことによって、１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシフェニル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ａ－２－１）、７９３ｍｇ（ｌｉｇｈｔ ｂｒｏｗｎ ｆｏａｍｙ ｓｏｌｉｄ、９２％）を得た。
Ａｒガス雰囲気下で２－アミノフェノール（２－Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ）（３００ｍｇ、２．７４９ｍｍｏｌ）にメタノール（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＭｅＯＨ）（８ｍＬ）を加えて溶かした後、３，４－ジクロロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（０．４７ｍＬ、３．２９９ｍｍｏｌ）をゆっくり滴加し、１４時間常温で撹拌させる。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認し、減圧して、溶媒を除去後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（３０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．４）を行うことによって、１－（３，４－ジクロロフェニル）－３－（２－ヒドロキシフェニル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ａ－２－１）、７９３ｍｇ（ｌｉｇｈｔ ｂｒｏｗｎ ｆｏａｍｙ ｓｏｌｉｄ、９２％）を得た。
【0156】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）；δ７．８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、７．６３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．４５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．３９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．６、２．２Ｈｚ）、７．１１－７．０６（ｍ、１Ｈ）、６．９０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０、１．２Ｈｚ）、６．８５（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６、１．２Ｈｚ）
【0157】
段階２：２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール（２－［Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）］ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ａ）の製造
Ａｒガス雰囲気下で前記段階１で得られたＦＣＣＳ－１７０６５－Ａ－２－１（４００ｍｇ、１．２７７ｍｍｏｌ）と過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（４５４ｍｇ、６．３８６ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（４８ｍＬ）を加えて常温で１４時間撹拌する。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、減圧する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．４）を行うことによって、目的化合物２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール（２－［Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）］ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ａ）、２３１ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、６５％）を得た。
Ａｒガス雰囲気下で前記段階１で得られたＦＣＣＳ－１７０６５－Ａ－２－１（４００ｍｇ、１．２７７ｍｍｏｌ）と過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（４５４ｍｇ、６．３８６ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（４８ｍＬ）を加えて常温で１４時間撹拌する。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、減圧する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．４）を行うことによって、目的化合物２－［Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）］アミノベンゾオキサゾール（２－［Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）］ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ａ）、２３１ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、６５％）を得た。
【0158】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）；δ８．０６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、７．５５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．６，２，６Ｈｚ）、７．４８－７．４５（ｍ、２Ｈ）、７．３９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．２４（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６、１．２Ｈｚ）、７．１６（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．８、１．２Ｈｚ）
【0159】
＜実施例８＞Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）ナフト［２，３－ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｎａｐｈｔｈｏ［２，３－ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｂ）の製造
【化26】
【0160】
段階１：１－（４，５－ジクロロフェニル）－３－（３－ヒドロキシナフタレン－２－イル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（３－ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ，ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｂ－２－１）の製造
【0161】
Ａｒガス雰囲気下で３－アミノ－２－ナフトール（３－Ａｍｉｎｏ－２－ｎａｐｈｔｈｏｌ）（３５０ｍｇ、２．１１９ｍｍｏｌ）にメタノール（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＭｅＯＨ）（７ｍＬ）とクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，ＣＨＣｌ３）（２ｍＬ）を加えて５分間常温で撹拌後、３，４－ジクロロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（０．３８ｍＬ、２．６３８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴加し、１３時間常温で撹拌させる。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認し、減圧して、溶媒を除去後、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）（８ｍＬ）を加えて、５分間撹拌後、溶けない固体をフィルターして、１－（４，５－ジクロロフェニル）－３－（３－ヒドロキシナフタレン－２－イル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（３－ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ，ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｂ－２－１）、７９２ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、９９％）を得た。
【0162】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）；δ１０．４８（ｓ、１Ｈ）、１０．３４（ｓ、１Ｈ）、９．５７（ｓ、１Ｈ）、８．５９（ｓ、１Ｈ）、８．０５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．７３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．６７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．６０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．５２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．６、２．２Ｈｚ）、７．３５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．２７（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．２４（ｓ、１Ｈ）
【0163】
段階２：Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）ナフト［２，３－ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｎａｐｈｔｈｏ［２，３－ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｂ）の製造
Ａｒガス雰囲気下で前記段階１で得られたＦＣＣＳ－１７０６５－Ｂ－２－１（４００ｍｇ、１．１０１ｍｍｏｌ）と過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（３９１ｍｇ、５．５０５ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（４２ｍＬ）を加えて常温で１４時間撹拌する。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、減圧する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．５）を行うことによって、目的化合物Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）ナフト［２，３－ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｎａｐｈｔｈｏ［２，３－ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｂ）、２３６ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、６５％）を得た。
Ａｒガス雰囲気下で前記段階１で得られたＦＣＣＳ－１７０６５－Ｂ－２－１（４００ｍｇ、１．１０１ｍｍｏｌ）と過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（３９１ｍｇ、５．５０５ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（４２ｍＬ）を加えて常温で１４時間撹拌する。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、減圧する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．５）を行うことによって、目的化合物Ｎ－（３，４－ジクロロフェニル）ナフト［２，３－ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｎａｐｈｔｈｏ［２，３－ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｂ）、２３６ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、６５％）を得た。
【0164】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）；δ１１．２２（ｓ、１Ｈ）、８．２０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．９８－７．９５（ｍ、４ Ｈ）、７．７２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ）、７．６６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．４７－７．４１（ｍ、２Ｈ）
【0165】
＜実施例９＞Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）－５－メチルベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｃ）の製造
【化27】
【0166】
段階１：１－（３，４－ジフルオロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｃ－２－１）の製造
Ａｒガス雰囲気下で２－アミノ－ｐ－クレゾール（２－Ａｍｉｎｏ－ｐ－ｃｒｅｓｏｌ）（３００ｍｇ、２．４３６ｍｍｏｌ）にメタノール（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＭｅＯＨ）（８ｍＬ）を加えて溶かした後、３，４－ジフルオロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（０．３７ｍＬ、２．９２３ｍｍｏｌ）をゆっくり滴加し、１３時間常温で撹拌させる。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認し、減圧して溶媒を除去後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（３０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．４）を行うことによって、１－（３，４－ジフルオロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｃ－２－１）、７１０ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｆｏａｍｙ ｓｏｌｉｄ、９９％）を得た。
Ａｒガス雰囲気下で２－アミノ－ｐ－クレゾール（２－Ａｍｉｎｏ－ｐ－ｃｒｅｓｏｌ）（３００ｍｇ、２．４３６ｍｍｏｌ）にメタノール（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＭｅＯＨ）（８ｍＬ）を加えて溶かした後、３，４－ジフルオロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（０．３７ｍＬ、２．９２３ｍｍｏｌ）をゆっくり滴加し、１３時間常温で撹拌させる。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認し、減圧して溶媒を除去後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（３０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．４）を行うことによって、１－（３，４－ジフルオロフェニル）－３－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｃ－２－１）、７１０ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｆｏａｍｙ ｓｏｌｉｄ、９９％）を得た。
【0167】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）；δ７．５７－７．５２（ｍ、１Ｈ）、７．４０（ｓ、１Ｈ）、７．２５－７．１３（ｍ、２Ｈ）、６．９１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０、１．６Ｈｚ）、６．７９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、２．２５（ｓ、３Ｈ）
【0168】
段階２：Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）－５－メチルベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｃ）の製造
Ａｒガス雰囲気下で前記段階１で得られたＦＣＣＳ－１７０６５－Ｃ－２－１（４００ｍｇ、１．３５９ｍｍｏｌ）と過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（４８３ｍｇ、６．７９５ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）、ＭｅＣＮ）（５２ｍＬ）を加えて、常温で１４時間撹拌する。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、減圧する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．４５）を行うことによって、目的化合物Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）－５－メチルベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｃ）、２２４ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、６３％）を得た。
Ａｒガス雰囲気下で前記段階１で得られたＦＣＣＳ－１７０６５－Ｃ－２－１（４００ｍｇ、１．３５９ｍｍｏｌ）と過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（４８３ｍｇ、６．７９５ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）、ＭｅＣＮ）（５２ｍＬ）を加えて、常温で１４時間撹拌する。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で確認して、出発物質が全部消えることを確認後、ｃｒｕｄｅにｓｉｌｉｃａを入れて吸着させ、減圧する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ、Ｒｆ＝０．４５）を行うことによって、目的化合物Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）－５－メチルベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１７０６５－Ｃ）、２２４ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、６３％）を得た。
【0169】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）；δ＝７．８３－７．７８（ｍ、１Ｈ）、７．３３－７．２９（ｍ、１Ｈ）、７．２７－７．２０（ｍ、３Ｈ）、６．９７－６．９５（ｍ、１Ｈ）、２．４１（ｓ、３Ｈ）
【0170】
＜実施例１０＞Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１９０２５）の合成
【化28】
【0171】
段階１：１－（３，４－ジフルオロフェニル）－３－（２－ヒドロキシフェニル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＦＣＣＳ－１９０２５－２－１）の製造
Ａｒガス雰囲気下で２－アミノフェノール（２－Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ）（１５０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）をメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（８ｍＬ）に溶かした後、３，４－ジフルオロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（２２４μｌ、１．６５ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた後、室温で１３時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認した後、減圧下でメタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ Ａｃｅｔｏｎｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、１－（３，４－ジフルオロフェニル）－３－（２－ヒドロキシフェニル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＦＣＣＳ－１９０２５－２－１）を淡黄色の固体（３５４ｍｇ、９２％）として得た。
Ａｒガス雰囲気下で２－アミノフェノール（２－Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ）（１５０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）をメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（８ｍＬ）に溶かした後、３，４－ジフルオロフェニルイソチオシアネート（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（２２４μｌ、１．６５ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた後、室温で１３時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認した後、減圧下でメタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（２０％ Ａｃｅｔｏｎｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、１－（３，４－ジフルオロフェニル）－３－（２－ヒドロキシフェニル）チオウレア（１－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＦＣＣＳ－１９０２５－２－１）を淡黄色の固体（３５４ｍｇ、９２％）として得た。
【0172】
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ－ｄ４）δ７．６２（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．５５（ｄｄｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．２５－７．１３（ｍ、２Ｈ）、７．１１－７．０５（ｍ、１Ｈ）、６．９２－６．８２（ｍ、２Ｈ）；ＥＳＩ－（＋）２８１．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0173】
段階２：Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１９０２５）の製造
Ａｒガス雰囲気下で前記段階１で得られたＦＣＣＳ－１９０２５－２－１（２２４ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）、過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（２８４ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（２５ｍＬ）に溶かした後、常温で１４時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認した後、減圧下でアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（１０～２０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１９０２５）を白色の固体（１６０ｍｇ、８２％）として得た。
Ａｒガス雰囲気下で前記段階１で得られたＦＣＣＳ－１９０２５－２－１（２２４ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）、過酸化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＫＯ２）（２８４ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）（２５ｍＬ）に溶かした後、常温で１４時間撹拌した。ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で反応終結を確認した後、減圧下でアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）を除去した。反応混合物をクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）（１０～２０％ Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）で精製して、目的化合物Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－アミン（Ｎ－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ、ＦＣＣＳ－１９０２５）を白色の固体（１６０ｍｇ、８２％）として得た。
【0174】
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ－ｄ４）δ７．８２（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．４２（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３６（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．３４－７．２９（ｍ、１Ｈ）、７．２８－７．１８（ｍ、２Ｈ）、７．１６－７．１０（ｍ、１Ｈ）；ＥＳＩ－（＋）２４７．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0175】
下記表１に実施例１～実施例１０の化学構造式を示した。
【0176】
【表1】
【0177】
＜比較例１＞
Ｎ－（２－クロロフェニル）－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド（Ｎ－（２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）を比較例１として使用した。
Ｎ－（２－クロロフェニル）－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド（Ｎ－（２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）を比較例１として使用した。
【化29】
【0178】
＜比較例２＞
２’－クロロアセトアニリド（２’－Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｎｉｌｉｄｅ，Ｃ０６２１）を購入して、比較例２として使用した。
２’－クロロアセトアニリド（２’－Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｎｉｌｉｄｅ，Ｃ０６２１）を購入して、比較例２として使用した。
【化30】
【0179】
＜比較例３＞
Ｎ－メチル－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ，ＦＣＣＳ－１６０３０）を購入して、比較例３として使用した。
Ｎ－メチル－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ，ＦＣＣＳ－１６０３０）を購入して、比較例３として使用した。
【化31】
【0180】
＜比較例４＞Ｎ－（２－（（クロロフェニル）アミノ）－２－オキソエチル）－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド（Ｎ－（２－（（２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ，ＦＣＣＳ－１６０３１）の製造
【化32】
【0181】
段階１：メチル２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）アセテート（ｍｅｔｈｙｌ ２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ，ＣＣＳ－１６０３１－３－１）の製造
Ａｒガス雰囲気下でインドール－３－カルボン酸（Ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（６００ｍｇ、３．７２ｍｍｏｌ）とグリシンメチルエステル（ｇｌｙｃｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）（４６７ｍｇ、３．７２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）（１１ｍＬ）に溶かし、氷浴（ｉｃｅ－ｂａｔｈ）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）する。トリエチルアミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（１．０４ｍＬ、７．４４６ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）をさらに入れた後、０℃で１４時間撹拌する。１０％ ＮａＨＣＯ３水溶液で洗った後、５％ＨＣｌ水溶液で洗って、無水Ｎａ２ＳＯ４ Ｐａｄに通過させて、残った水分を除去した後、減圧下で溶媒を除去する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（７０％ ｅｔｈｙｌ ａｃｅａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）を行うことによって、メチル２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）アセテート（ｍｅｔｈｙｌ ２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ，ＣＣＳ－１６０３１－３－１）４３０ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、５０％）をｍｉｘｔｕｒｅ状態で得た。さらなる精製することなく、次のステップに進めた。ＥＳＩ－ＭＳ：２３１．２［Ｍ－Ｈ］－
Ａｒガス雰囲気下でインドール－３－カルボン酸（Ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（６００ｍｇ、３．７２ｍｍｏｌ）とグリシンメチルエステル（ｇｌｙｃｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）（４６７ｍｇ、３．７２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）（１１ｍＬ）に溶かし、氷浴（ｉｃｅ－ｂａｔｈ）で冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）する。トリエチルアミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（１．０４ｍＬ、７．４４６ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）をさらに入れた後、０℃で１４時間撹拌する。１０％ ＮａＨＣＯ３水溶液で洗った後、５％ＨＣｌ水溶液で洗って、無水Ｎａ２ＳＯ４ Ｐａｄに通過させて、残った水分を除去した後、減圧下で溶媒を除去する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（７０％ ｅｔｈｙｌ ａｃｅａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）を行うことによって、メチル２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）アセテート（ｍｅｔｈｙｌ ２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ，ＣＣＳ－１６０３１－３－１）４３０ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、５０％）をｍｉｘｔｕｒｅ状態で得た。さらなる精製することなく、次のステップに進めた。ＥＳＩ－ＭＳ：２３１．２［Ｍ－Ｈ］－
【0182】
段階２：２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）酢酸（２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＦＣＣＳ－１６０３１－３－２）の製造
前記段階１で得られた２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）アセテート（ｍｅｔｈｙｌ ２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ，ＣＣＳ－１６０３１－３－１）（２２０ｍｇ、０．９４７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）（６ｍＬ）に溶かし、そこへ水酸化リチウム水和物（ＬｉＯＨ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）（１３１ｍｇ、３．１２６ｍｍｏｌ）を水（２ｍＬ）に溶かした溶液を入れ、常温で１時間撹拌する。１．０Ｎ ＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ２に調整後、エチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で抽出した。無水Ｎａ２ＳＯ４ Ｐａｄに通過させて、残った水分を除去した後、減圧下で溶媒を除去する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（１０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ／ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｈｔａｎｅ）を行うことによって、２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）酢酸（２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＦＣＣＳ－１６０３１－３－２）１４７ｍｇ（ｙｅｌｌｏｗ ｆｏａｍｙ ｓｏｌｉｄ、７１％）を得た。
前記段階１で得られた２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）アセテート（ｍｅｔｈｙｌ ２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ，ＣＣＳ－１６０３１－３－１）（２２０ｍｇ、０．９４７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）（６ｍＬ）に溶かし、そこへ水酸化リチウム水和物（ＬｉＯＨ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）（１３１ｍｇ、３．１２６ｍｍｏｌ）を水（２ｍＬ）に溶かした溶液を入れ、常温で１時間撹拌する。１．０Ｎ ＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ２に調整後、エチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で抽出した。無水Ｎａ２ＳＯ４ Ｐａｄに通過させて、残った水分を除去した後、減圧下で溶媒を除去する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（１０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ／ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｈｔａｎｅ）を行うことによって、２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）酢酸（２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＦＣＣＳ－１６０３１－３－２）１４７ｍｇ（ｙｅｌｌｏｗ ｆｏａｍｙ ｓｏｌｉｄ、７１％）を得た。
【0183】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）；δ８．１０－８．０８（ｍ、１Ｈ）、７．９２（ｓ、１Ｈ）、７．４３（ｄｔ、Ｊ＝８．０、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．１７（ｑｕｉｎｔ ｄ、Ｊ＝７．２、１．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．１２（ｓ、２Ｈ）
【0184】
段階３：Ｎ－（２－（（２－クロロフェニル）アミノ）－２－オキソエチル）－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド（Ｎ－（２－（（２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ，ＦＣＣＳ－１６０３１）の製造
Ａｒガス雰囲気下で前記段階２で得られた２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）酢酸（２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＦＣＣＳ－１６０３１－３－２）（２００ｍｇ、０．９１７ｍｍｏｌ）とＴＳＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ）（２９０ｍｇ、０．９６２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（４ｍＬ、ａｎｈｙｄｏｒｕｓ）に溶かし、Ｎ，Ｎ－ジイソメチルプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．４ｍＬ、２．２９３ｍｍｏｌ）を加えた後、常温で３時間撹拌する。２－クロロアニリン（２－ｃｈｌｏｒｏａｎｉｌｉｎｅ）（０．２９ｍＬ、２．７５１ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソメチルプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．６４ｍＬ、３．６６８ｍｍｏｌ）を入れ、６０℃で４時間加熱する。減圧下で溶媒を除去後、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）とＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液を加えて抽出をして、有機層を得、無水Ｎａ２ＳＯ４ Ｐａｄに通過させて、残った水分を除去した後、減圧下で溶媒を除去する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（７０％ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）を行うことによって、目的化合物Ｎ－（２－（（２－クロロフェニル）アミノ）－２－オキソエチル）－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド（Ｎ－（２－（（２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ、ＦＣＣＳ－１６０３１）２０ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、６．６％）を得た。
Ａｒガス雰囲気下で前記段階２で得られた２－（１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド）酢酸（２－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＦＣＣＳ－１６０３１－３－２）（２００ｍｇ、０．９１７ｍｍｏｌ）とＴＳＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ）（２９０ｍｇ、０．９６２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（４ｍＬ、ａｎｈｙｄｏｒｕｓ）に溶かし、Ｎ，Ｎ－ジイソメチルプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．４ｍＬ、２．２９３ｍｍｏｌ）を加えた後、常温で３時間撹拌する。２－クロロアニリン（２－ｃｈｌｏｒｏａｎｉｌｉｎｅ）（０．２９ｍＬ、２．７５１ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソメチルプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．６４ｍＬ、３．６６８ｍｍｏｌ）を入れ、６０℃で４時間加熱する。減圧下で溶媒を除去後、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）とＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液を加えて抽出をして、有機層を得、無水Ｎａ２ＳＯ４ Ｐａｄに通過させて、残った水分を除去した後、減圧下で溶媒を除去する。シリカ－ゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ－ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（７０％ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／ｎ－ｈｅｘａｎｅ）を行うことによって、目的化合物Ｎ－（２－（（２－クロロフェニル）アミノ）－２－オキソエチル）－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド（Ｎ－（２－（（２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ、ＦＣＣＳ－１６０３１）２０ｍｇ（ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ、６．６％）を得た。
【0185】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）；δ８．１５－８．１２（ｍ、１Ｈ）、８．０４（ｄｄ，Ｊ＝８．０、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．９７（ｓ、１Ｈ）、７．４６－７．４１（ｍ、２Ｈ）、７．３３－７．２８（ｍ、１Ｈ）、７．２３－７．１２（ｍ、３Ｈ）、４．２６（ｓ、２Ｈ）
【0186】
＜実験例１－１＞ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）発現実験（比較例１～４）
ルシフェラーゼ活性評価を通したｋｌｏｔｈｏ遺伝子の発現有無を評価するために、ヒト腎臓の近位尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ）の上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）細胞であるＲＰＴＥＣ（ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－４０３１）細胞を米国のＬｏｎｚａ社から購入して使用した。
ルシフェラーゼ活性評価を通したｋｌｏｔｈｏ遺伝子の発現有無を評価するために、ヒト腎臓の近位尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ）の上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）細胞であるＲＰＴＥＣ（ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－４０３１）細胞を米国のＬｏｎｚａ社から購入して使用した。
【0187】
培養のためには、同じＬｏｎｚａ社製のＲｅｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＥＧＭＴＭ）Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔを使用し、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。ルシフェラーゼ発現のためのプラスミドは、ヒトのＫＬ（ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子のプロモーター部位が蛍ルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子発現を調節するように配置されたものを使用した。
【0188】
プラスミドは、Ｒｏｃｈｅ社のＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを使用して細胞内に取り入れた。細胞で発現したルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＤｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍを利用して測定した。各化合物を表示された濃度ずつ培養された細胞に２４時間処理した後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼの活性が高い場合は、ｋｌｏｔｈｏ遺伝子の発現が増加できることを間接的に示す。
【0189】
比較例１～比較例４をＲＰＴＥＣ細胞に５μＭの濃度で処理し、ヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の開始部位から１．７ｋｂｐの前までのプロモーターを含むレポータ遺伝子またはヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の開始部位から２４０ｂｐの前までのプロモーターを含むレポータ遺伝子を利用してレポータ遺伝子の発現を確認した。
【0190】
その結果、図１に示されたように、比較例１の化合物のルシフェラーゼ活性が最も高いことを確認した。
【0191】
＜実験例１－２＞ルシフェラーゼ発現実験（実施例１～６）
前記実験例１－１の結果を基盤として、比較例１と類似した化学構造を有する実施例１～６を合成し、本実験例１－２を実施した。
前記実験例１－１の結果を基盤として、比較例１と類似した化学構造を有する実施例１～６を合成し、本実験例１－２を実施した。
【0192】
ヒト腎臓の近位尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ）の上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）細胞であるＲＰＴＥＣに実施例１～６をそれぞれ０．５，１および５μＭの濃度で処理し、比較例１は、５μＭの濃度で処理して、ヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の－２．１ｋｂアップストリームまで含まれたプロモーターを含むレポータ遺伝子（ｐＨＫＰ－ｌｕｃ）を利用してレポータ遺伝子の発現を確認した結果を図２および図３に示した。
【0193】
図２に示されたように、実施例１、実施例２の化合物のレポータ遺伝子の発現が比較例１と類似したレベルであることを確認した。
【0194】
図３に示されたように、比較例１および実施例１～３をＲＰＴＥＣ細胞に５μＭの濃度で処理し、ヒトのｋｌｏｔｈｏ遺伝子の－２．１ｋｂアップストリームまで含まれたプロモーターを含むレポータ遺伝子（ｐＨＫＰ－ｌｕｃ）を利用してレポータ遺伝子の発現を確認した結果、実施例２の化合物が比較例１と類似したレベルであることを確認した。
【0195】
＜実験例２＞Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ実験を利用したｋｌｏｔｈｏ（ＫＬ）遺伝子発現量の定量評価
比較例１および実施例１～２の化合物を６時間処理したヒト腎臓の近位尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ）の上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）細胞であるＲＰＴＥＣ細胞からＲＮＡ抽出のために、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ ｋｉｔを利用した。抽出されたＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｋｉｔを利用してｃＤＮＡを製造し、ＫＬ（ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子特異的キットは、Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓを利用して実施した結果を図４に示した。
比較例１および実施例１～２の化合物を６時間処理したヒト腎臓の近位尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ）の上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）細胞であるＲＰＴＥＣ細胞からＲＮＡ抽出のために、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ ｋｉｔを利用した。抽出されたＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｋｉｔを利用してｃＤＮＡを製造し、ＫＬ（ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子特異的キットは、Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓを利用して実施した結果を図４に示した。
【0196】
図４に示されたように、実施例２の化合物が比較例１と類似したレベルであることを確認した。
【0197】
本実験例２の結果をベースとして、実施例２化合物と化学構造が類似した実施例７～１０化合物を合成して、次の実験例３に使用した。
【0198】
＜実験例３＞一般ＰＣＲ実験を利用したｋｌｏｔｈｏ（ＫＬ）遺伝子発現量の定量評価
実施例７～１０を２．５μＭずつ６時間ヒト腎臓の近位尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ）の上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）細胞であるＲＰＴＥＣ細胞に処理後、細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｋｉｔを利用してｃＤＮＡを製造した後、一般ＰＣＲを実施した。
実施例７～１０を２．５μＭずつ６時間ヒト腎臓の近位尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ）の上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）細胞であるＲＰＴＥＣ細胞に処理後、細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｋｉｔを利用してｃＤＮＡを製造した後、一般ＰＣＲを実施した。
【0199】
実験に使用されたプライマーの情報は、下記の通りである。
【0200】
ＫＬ－Ｆ ＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＣ（配列番号１）
ＫＬ－Ｒ ＧＧＴＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＧ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ－Ｆ ＴＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＧ（配列番号３）
ＧＡＰＤＨ－Ｒ ＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣ（配列番号４）
ＫＬ－Ｒ ＧＧＴＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＧ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ－Ｆ ＴＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＧ（配列番号３）
ＧＡＰＤＨ－Ｒ ＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣ（配列番号４）
【0201】
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡは、アガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）染色を通じて確認し、バンド内のＤＮＡ量は、ＳｐｅｅｄｙＱｕａｎｔプログラムを利用して定量比較して、図５に示した。
【0202】
図５に示されたように、比較例１より実施例８～１０のｋｌｏｔｈｏ（ＫＬ）遺伝子発現量がさらに高いことが確認され、特に実施例１０は、比較例１と比べて約１０倍向上することが示された。
【0203】
＜実験例４＞毒性テスト
培養されたＨＫ２（Ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ－２）細胞に比較例１、実施例２および実施例９～実施例１０を２５μＭまたは１２．５μＭの濃度で処理し、２４時間後にＥＺ－Ｃｙｔｏｘ ｋｉｔを利用して細胞毒性を測定した。ＥＺ－Ｃｙｔｏｘは、生きた細胞のミトコンドリア酵素によって４５０ｎｍで吸光度を有するホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を生成するので、生きた細胞は、４５０ｎｍでさらに高い吸光度を示す。処理した化合物の量と同じ体積のＤＭＳＯを処理した細胞の毒性を１と見なすとき、化合物サンプル処理によってどれくらい細胞が毒性に減少したかを確認し、その結果を図６に示した。
培養されたＨＫ２（Ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ－２）細胞に比較例１、実施例２および実施例９～実施例１０を２５μＭまたは１２．５μＭの濃度で処理し、２４時間後にＥＺ－Ｃｙｔｏｘ ｋｉｔを利用して細胞毒性を測定した。ＥＺ－Ｃｙｔｏｘは、生きた細胞のミトコンドリア酵素によって４５０ｎｍで吸光度を有するホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を生成するので、生きた細胞は、４５０ｎｍでさらに高い吸光度を示す。処理した化合物の量と同じ体積のＤＭＳＯを処理した細胞の毒性を１と見なすとき、化合物サンプル処理によってどれくらい細胞が毒性に減少したかを確認し、その結果を図６に示した。
【0204】
図６に示されたように、１２．５μＭまたは２５μＭの濃度で処理した場合、全部実施例１０の化合物が最も少ない毒性を示し、比較例１と比べて毒性が２０％以上改善されたことを確認した。
【0205】
＜実験例５＞ＨＫ－２細胞におけるＫｌｏｔｈｏタンパク質発現量分析
図７ａのプロトコルのように、ＨＫ－２細胞（ヒト腎細胞）にシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ２０μＭ）を処理して、疾患モデルを作成した後、ＫＳ１化合物（実施例１０）（３μＭ）を処理した。２４時間後に細胞を収得して、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質発現程度を確認した。図７ｂに示されるように、ＨＫ－２細胞においてＫｌｏｔｈｏタンパク質発現は、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）を処理した群では減少し、ＫＳ１化合物（実施例１０）を処理した群では増加することが確認された。
図７ａのプロトコルのように、ＨＫ－２細胞（ヒト腎細胞）にシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ２０μＭ）を処理して、疾患モデルを作成した後、ＫＳ１化合物（実施例１０）（３μＭ）を処理した。２４時間後に細胞を収得して、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質発現程度を確認した。図７ｂに示されるように、ＨＫ－２細胞においてＫｌｏｔｈｏタンパク質発現は、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）を処理した群では減少し、ＫＳ１化合物（実施例１０）を処理した群では増加することが確認された。
【0206】
＜実験例６＞片側尿管閉塞（Ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ Ｕｒｅｔｅｒ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ＵＵＯ）モデルにおけるＫＳ１化合物（実施例１０）の効果分析
片側尿管閉塞モデルは、５週齢の雄Ｃ５６ＢＬ／６マウスを利用した。片側尿管閉塞モデルを作成するために、右側尿管を糸で縛った後、２４時間後から毎日ＫＳ１化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を腹腔に注入させた。以後、７日目および１４日目に犠牲させて、サンプルを集めて、実験を進めた（図８ａ）。
片側尿管閉塞モデルは、５週齢の雄Ｃ５６ＢＬ／６マウスを利用した。片側尿管閉塞モデルを作成するために、右側尿管を糸で縛った後、２４時間後から毎日ＫＳ１化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を腹腔に注入させた。以後、７日目および１４日目に犠牲させて、サンプルを集めて、実験を進めた（図８ａ）。
【0207】
腎肥大化の有無の確認
実験結果、片側尿管閉塞モデルでは、腎臓が肥大している結果を示し、ＫＳ１化合物を処理した腎臓では、サイズの差異がない結果を示した（図８ｂ）。
実験結果、片側尿管閉塞モデルでは、腎臓が肥大している結果を示し、ＫＳ１化合物を処理した腎臓では、サイズの差異がない結果を示した（図８ｂ）。
【0208】
核と細胞質変化の確認
片側尿管閉塞モデルにおける核と細胞質に対する変化を調べてみるために、Ｈ＆Ｅ染色を進め、その結果を図９に示した。ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルの１週サンプルでは、核の数が多く増加したことが分かり、２週サンプルでは、細胞質が破壊されている結果を示したが、ＫＳ１処理したサンプルでは、組織の破壊が多く減少している結果を示した（図９）。
片側尿管閉塞モデルにおける核と細胞質に対する変化を調べてみるために、Ｈ＆Ｅ染色を進め、その結果を図９に示した。ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルの１週サンプルでは、核の数が多く増加したことが分かり、２週サンプルでは、細胞質が破壊されている結果を示したが、ＫＳ１処理したサンプルでは、組織の破壊が多く減少している結果を示した（図９）。
【0209】
線維化進行の有無の確認
また、片側尿管閉塞モデルにおける線維化進行による変化を調べてみるために、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色を進めた。ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルの組織１週サンプルでは、赤色に線維化が進行され始めることを見ることができ、２週サンプルでは、線維化が１週サンプルよりさらに進行されている結果を示した。しかしながら、ＫＳ１処理群では、ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルより線維化が少なく起こる結果を示した（図１０）。
また、片側尿管閉塞モデルにおける線維化進行による変化を調べてみるために、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色を進めた。ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルの組織１週サンプルでは、赤色に線維化が進行され始めることを見ることができ、２週サンプルでは、線維化が１週サンプルよりさらに進行されている結果を示した。しかしながら、ＫＳ１処理群では、ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルより線維化が少なく起こる結果を示した（図１０）。
【0210】
細胞死滅の有無の確認
片側尿管閉塞モデルにおける細胞死滅程度を調べてみるために、ＴＵＮＥＬ染色を進めた。ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルの組織１週サンプルでは、細胞死滅が起こり、２週サンプルでは、細胞死滅が１週サンプルより増加している結果を示した。しかしながら、ＫＳ１処理群では、ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルより細胞死滅が顕著に減少する結果を示した（図１１）。
片側尿管閉塞モデルにおける細胞死滅程度を調べてみるために、ＴＵＮＥＬ染色を進めた。ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルの組織１週サンプルでは、細胞死滅が起こり、２週サンプルでは、細胞死滅が１週サンプルより増加している結果を示した。しかしながら、ＫＳ１処理群では、ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルより細胞死滅が顕著に減少する結果を示した（図１１）。
【0211】
Ｋｌｏｔｈｏタンパク質発現量の確認
片側尿管閉塞モデルの１週サンプルでＫｌｏｔｈｏタンパク質発現変化を確認した結果、ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルサンプルでは、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質が減少したが、ＫＳ１化合物を処理した場合、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質発現が増加する結果を示した（図１２）。
片側尿管閉塞モデルの１週サンプルでＫｌｏｔｈｏタンパク質発現変化を確認した結果、ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルサンプルでは、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質が減少したが、ＫＳ１化合物を処理した場合、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質発現が増加する結果を示した（図１２）。
【0212】
ＭＭＰ－９タンパク質発現量分析
片側尿管閉塞モデルで炎症標識マーカーであるＭＭＰ－９タンパク質の変化を確認した結果、ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルの１週と２週サンプルでＭＭＰ－９が増加したが、ＫＳ１を処理した場合、ＭＭＰ－９発現量が顕著に減少する結果を示した（図１３）。
片側尿管閉塞モデルで炎症標識マーカーであるＭＭＰ－９タンパク質の変化を確認した結果、ＫＳ１非処理の片側尿管閉塞モデルの１週と２週サンプルでＭＭＰ－９が増加したが、ＫＳ１を処理した場合、ＭＭＰ－９発現量が顕著に減少する結果を示した（図１３）。
【0213】
＜実験例７＞ＫＳ１化合物（実施例１０）の高血圧減少効果の分析
１．実験用ラット（ｒａｔ）
正常対照群として６週齢ラット（ｒａｔ）雄ＷＫＹ／ｌｚｍを使用し、高血圧を発生させる実験群としては、６週齢ラット（ｒａｔ）雄ＳＨＲ／ｌｚｍを使用した。すべての動物は、中央実験動物から購入し、オソン先端医療産業振興財団の実験動物センター内の再搬入区域飼育施設で実験を進めた。実験用ラットは、入手後７日間検疫および純化期間を有し、この期間中に動物の健康を観察した。
１．実験用ラット（ｒａｔ）
正常対照群として６週齢ラット（ｒａｔ）雄ＷＫＹ／ｌｚｍを使用し、高血圧を発生させる実験群としては、６週齢ラット（ｒａｔ）雄ＳＨＲ／ｌｚｍを使用した。すべての動物は、中央実験動物から購入し、オソン先端医療産業振興財団の実験動物センター内の再搬入区域飼育施設で実験を進めた。実験用ラットは、入手後７日間検疫および純化期間を有し、この期間中に動物の健康を観察した。
【0214】
２．ラット（ｒａｔ）飼育環境
（１）環境条件
本実験は、温度２２±２℃、相対湿度５０±１０％、喚起回数１０～１５回／ｈｒ、照明時間１２時間（午前８時点灯～午後８時消灯）および照度５００Ｌｕｘ以上に設定されたオソン先端医療産業振興財団の実験動物センター内の再搬入区域飼育施設で行った。実験者全部は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、２０分）した作業服と保護装具を着用し、作業を実施した。
（１）環境条件
本実験は、温度２２±２℃、相対湿度５０±１０％、喚起回数１０～１５回／ｈｒ、照明時間１２時間（午前８時点灯～午後８時消灯）および照度５００Ｌｕｘ以上に設定されたオソン先端医療産業振興財団の実験動物センター内の再搬入区域飼育施設で行った。実験者全部は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、２０分）した作業服と保護装具を着用し、作業を実施した。
【0215】
（２）ケージ（ｃａｇｅ）および飼育密度
試験棟物の飼育は、個別喚起ケージ（ＩＶＣｓ）システムでＡＡＡＬＡＣガイドライン基準のケージ（Ｗ２００×Ｄ３１０×Ｈ１５０）で純化期間および実験機間に２匹／ケージ（ｃａｇｅ）で飼育した。
試験棟物の飼育は、個別喚起ケージ（ＩＶＣｓ）システムでＡＡＡＬＡＣガイドライン基準のケージ（Ｗ２００×Ｄ３１０×Ｈ１５０）で純化期間および実験機間に２匹／ケージ（ｃａｇｅ）で飼育した。
【0216】
（３）飼料および水の給餌方法
試験に供給された飼料は、放射線照射で滅菌された試験棟水用固形飼料（＋４０ＲＭＭ－１０，ＳＡＦＥ）を給餌し、飼料の成分分析成績書を検討した結果、飼料組成および汚染物質検査で試験に影響を与えるほどの要因はなかった。水は、ＲＯ水（逆浸透蒸留水）製造および供給装置で生産された超純水を次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）およびＵＶ装置を経て殺菌した後、水筒を通じて自由に摂取するようにし、公認機関（忠北保健環境研究院、忠北清原郡オソン邑オソン生命路１路１８４）に依頼して、定期的な水質検査を実施した結果、「飲水水質基準適合」判定を受けた。
試験に供給された飼料は、放射線照射で滅菌された試験棟水用固形飼料（＋４０ＲＭＭ－１０，ＳＡＦＥ）を給餌し、飼料の成分分析成績書を検討した結果、飼料組成および汚染物質検査で試験に影響を与えるほどの要因はなかった。水は、ＲＯ水（逆浸透蒸留水）製造および供給装置で生産された超純水を次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）およびＵＶ装置を経て殺菌した後、水筒を通じて自由に摂取するようにし、公認機関（忠北保健環境研究院、忠北清原郡オソン邑オソン生命路１路１８４）に依頼して、定期的な水質検査を実施した結果、「飲水水質基準適合」判定を受けた。
【0217】
（５）検疫純化
搬入時に動物の外観検査を実施した。純化期間中に毎日１回一般症状を観察し、一般症状観察記録紙に記録した。純化期間の終了日に一般症状を確認して、動物の健康状態を評価した。
搬入時に動物の外観検査を実施した。純化期間中に毎日１回一般症状を観察し、一般症状観察記録紙に記録した。純化期間の終了日に一般症状を確認して、動物の健康状態を評価した。
【0218】
（６）個体および飼育箱子識別
純化期間中には、入手時に動物の尾に赤色油性ペンを利用して個体表示をし、飼育箱子には、検疫純化期間中に個体識別カードを付着した。観察期間中には、群分離時に動物の尾に青色油性ペンを利用して個体表示をし、飼育箱子には、個体識別カードを付着した。
純化期間中には、入手時に動物の尾に赤色油性ペンを利用して個体表示をし、飼育箱子には、検疫純化期間中に個体識別カードを付着した。観察期間中には、群分離時に動物の尾に青色油性ペンを利用して個体表示をし、飼育箱子には、個体識別カードを付着した。
【0219】
（７）群分離
群分離は、一般症状異常がない動物のうち、機器純化終了日（群分離日）に実施した。群分離日に動物を各群平均血圧が均等となるように無作為で各５群、群当たり５匹に群分離した。残余動物は、ＣＯ２を利用して安楽死させた。
群分離は、一般症状異常がない動物のうち、機器純化終了日（群分離日）に実施した。群分離日に動物を各群平均血圧が均等となるように無作為で各５群、群当たり５匹に群分離した。残余動物は、ＣＯ２を利用して安楽死させた。
【0220】
３．実験群の構成
血圧が上昇するかを判別するために、ＷＫＹを正常対照群として使用した。ＳＨＲラットは、陰性対照群、試験物質投与群、陽性物質投与群、試験物質＋陽性物質投与群に分けて進めた。
血圧が上昇するかを判別するために、ＷＫＹを正常対照群として使用した。ＳＨＲラットは、陰性対照群、試験物質投与群、陽性物質投与群、試験物質＋陽性物質投与群に分けて進めた。
【0221】
４．試験物質の調製および投与
（１）試験物質および陽性対照物質を該当濃度に合わせて２０ｍＬ／ｋｇの液量で賦形剤に溶解した。
（１）試験物質および陽性対照物質を該当濃度に合わせて２０ｍＬ／ｋｇの液量で賦形剤に溶解した。
【0222】
（２）検疫および純化後、動物の血圧および体重に基づいて群分離後、賦形剤、試験物質および陽性対照物質を投与した。
【0223】
（３）すべての投与群は、週１回測定した体重を基準として２０ｍＬ／ｋｇの液量で３ｍＬ注射器を利用して７回／１週、８週間経口投与する。物質の濃度は、２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙに該当する。
【0224】
５．血圧測定
薬物投与後３６日と６４日に動物を血圧測定用補正装置に入れ、尾を出るようにして血圧を測定した。血圧測定は、Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＭＯＤＡ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｙｓｔｅｍを利用して記録した。
薬物投与後３６日と６４日に動物を血圧測定用補正装置に入れ、尾を出るようにして血圧を測定した。血圧測定は、Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＭＯＤＡ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｙｓｔｅｍを利用して記録した。
【0225】
６．実験結果
ラット（ｒａｔ）で測定された薬物処理群の収縮期血圧（ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を図１４に示した。実験結果、高血圧動物モデルである自発性高血圧ラット（ＳＨＲ）にＫＳ１化合物を処理する場合、収縮期血圧が顕著に減少する結果を示したところ、ＫＳ１化合物が、高血圧予防、治療に効果的に用いられ得ることが分かる。また、従来高血圧治療剤として使用されているアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋｅｒ）薬物の一つであるロサルタン（ｌｏｓａｒｔａｎ）との併用投与時に、各薬物を独立して投与したときより、良好な血圧減少効果を示したので、高血圧治療のための併用投与にもＫＳ１が用いられ得ることが分かる。
ラット（ｒａｔ）で測定された薬物処理群の収縮期血圧（ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を図１４に示した。実験結果、高血圧動物モデルである自発性高血圧ラット（ＳＨＲ）にＫＳ１化合物を処理する場合、収縮期血圧が顕著に減少する結果を示したところ、ＫＳ１化合物が、高血圧予防、治療に効果的に用いられ得ることが分かる。また、従来高血圧治療剤として使用されているアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋｅｒ）薬物の一つであるロサルタン（ｌｏｓａｒｔａｎ）との併用投与時に、各薬物を独立して投与したときより、良好な血圧減少効果を示したので、高血圧治療のための併用投与にもＫＳ１が用いられ得ることが分かる。
【0226】
＜実験例５＞ＫＳ１化合物（実施例１０）の細胞老化抑制効果分析
１．細胞培養と化合物処理
腎尿細管上皮細胞であるＲＰＴＥＣ（ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）は、Ｌｏｎｚａ社から購入し、培養用培地も、同じ会社で供給するＲＥＧＭ ｋｉｔを利用した。細胞培養は、３７℃培養器で５％ＣＯ２条件で培養した。細胞は、８０％飽和になると、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）処理して、新しい培養皿に移して継代培養した。化合物は、最終濃度が２．５μＭとなるように培地に添付し、継代培養時ごとに化合物を入れ、一定の濃度が維持されるようにした。陰性対照のために、溶媒であるＤＭＳＯのみを入れた細胞を使用し、老化が進行されない対照群として９回継代培養した細胞（＃９）を使用した。老化を誘導した細胞は、全部１７回継代培養した細胞（＃１７）を使用した。
１．細胞培養と化合物処理
腎尿細管上皮細胞であるＲＰＴＥＣ（ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）は、Ｌｏｎｚａ社から購入し、培養用培地も、同じ会社で供給するＲＥＧＭ ｋｉｔを利用した。細胞培養は、３７℃培養器で５％ＣＯ２条件で培養した。細胞は、８０％飽和になると、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）処理して、新しい培養皿に移して継代培養した。化合物は、最終濃度が２．５μＭとなるように培地に添付し、継代培養時ごとに化合物を入れ、一定の濃度が維持されるようにした。陰性対照のために、溶媒であるＤＭＳＯのみを入れた細胞を使用し、老化が進行されない対照群として９回継代培養した細胞（＃９）を使用した。老化を誘導した細胞は、全部１７回継代培養した細胞（＃１７）を使用した。
【0227】
２．老化程度の確認
細胞の老化程度を確認するために、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の「Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ」を使用した。実験当日に細胞に染色液を入れ、８時間後に染色された細胞を確認した。２００倍顕微鏡下で観察される全体細胞数のうち、染色された細胞の数を確認して、比率で示し、一つのサンプル当たり互いに異なる三カ所で染色された細胞の数を数えて平均を求めた。細胞の老化が進行されるほどβ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）酵素の発現が増加するので、染色された細胞は、染色されない細胞より老化がさらに多く進行された細胞と判断することができる。
細胞の老化程度を確認するために、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の「Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ」を使用した。実験当日に細胞に染色液を入れ、８時間後に染色された細胞を確認した。２００倍顕微鏡下で観察される全体細胞数のうち、染色された細胞の数を確認して、比率で示し、一つのサンプル当たり互いに異なる三カ所で染色された細胞の数を数えて平均を求めた。細胞の老化が進行されるほどβ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）酵素の発現が増加するので、染色された細胞は、染色されない細胞より老化がさらに多く進行された細胞と判断することができる。
【0228】
３．実験結果
実験結果、１７回継代培養した細胞は、９回継代培養した細胞に比べて老化の程度がかなり増加したことが分かった。顕微鏡下で２００倍で観察したとき、１７回継代培養した細胞は、細胞の９０％程度が全部染色されたが、９回継代培養した細胞は、５０％の細胞だけが染色された（図１５）。同一に１７回継代培養した細胞では、ＫＳ１化合物（実施例１０）を培地に入れて培養した細胞群において染色の程度が減少して、細胞のうち７０％程度が染色された（図１５）。すなわち、ＫＳ１化合物（実施例１０）が存在する状態で培養された細胞は、１７回の継代培養期間中にＤＭＳＯを入れた培地で成長した細胞より老化の程度が２０％程度減少したことが示された。
実験結果、１７回継代培養した細胞は、９回継代培養した細胞に比べて老化の程度がかなり増加したことが分かった。顕微鏡下で２００倍で観察したとき、１７回継代培養した細胞は、細胞の９０％程度が全部染色されたが、９回継代培養した細胞は、５０％の細胞だけが染色された（図１５）。同一に１７回継代培養した細胞では、ＫＳ１化合物（実施例１０）を培地に入れて培養した細胞群において染色の程度が減少して、細胞のうち７０％程度が染色された（図１５）。すなわち、ＫＳ１化合物（実施例１０）が存在する状態で培養された細胞は、１７回の継代培養期間中にＤＭＳＯを入れた培地で成長した細胞より老化の程度が２０％程度減少したことが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【配列表】