特許 7412700 多孔質複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-04

(45)【発行日】2024-01-15

(54)【発明の名称】多孔質複合体

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/12 20060101AFI20240105BHJP

   A61L 27/24 20060101ALI20240105BHJP

   A61L 27/56 20060101ALI20240105BHJP

   A61L 27/40 20060101ALI20240105BHJP

   C01B 25/32 20060101ALI20240105BHJP

   C08J 9/28 20060101ALI20240105BHJP

   A61F 2/28 20060101ALI20240105BHJP

【ＦＩ】

A61L27/12

A61L27/24

A61L27/56

A61L27/40

C01B25/32 B

C08J9/28

A61F2/28

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020009277

(22)【出願日】2020-01-23

(65)【公開番号】P2021115165

(43)【公開日】2021-08-10

【審査請求日】2022-10-06

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （１）発行日 ２０１９年９月２０日 刊行物 日本口腔外科学会雑誌 第６５巻 総会特別号 （２）ウェブサイトの掲載日 ２０１９年１０月１６日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃ－ｌｉｎｋａｇｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｏｍｓ２０１９／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃ－ｌｉｎｋａｇｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｏｍｓ２０１９／ａｂｓｔｒａｃｔ－ａｐｐｌｉ．ｈｔｍｌ （３） 開催日 ２０１９年１０月２５日から２０１９年１０月２７日 集会名、開催場所 第６４回公益社団法人日本口腔外科学会総会・学術大会 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市白石区東札幌６条１丁目１－１） （４）ウェブサイトの掲載日 ２０１９年１１月１５日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐ：／／ｊｓｂｍ２０１９．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ ｈｔｔｐ：／／ｊｓｂｍ２０１９．ｏｒｇ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｊｐ／ｌｏｇｉｎ．ｐｈｐ （５）開催日 ２０１９年１１月２４日から２０１９年１１月２６日 集会名、開催場所 第４１回日本バイオマテリアル学会大会 つくば国際会議場（茨城県つくば市竹園２－２０－３）

(73)【特許権者】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】鎌倉 慎治

(72)【発明者】

【氏名】柳沢 俊樹

(72)【発明者】

【氏名】中山 翔平

(72)【発明者】

【氏名】岩井 敦史

【審査官】伊藤 幸司

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０８４４１３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０４３４９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１６３３９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００６－１６７４４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０－０３５８３４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｌ

Ｃ０１Ｂ

Ｃ０８Ｊ

Ａ６１Ｆ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第８リン酸カルシウム及びコラーゲンを含み、気孔率が９２％以下であり、ヤング率比が０．０６～０．１である、多孔質複合体（ここで、ヤング率比とは、湿潤条件での多孔質複合体のヤング率を乾燥条件での多孔質複合体のヤング率で除した値であり、湿潤条件とは生理食塩水０．５ｍｌを滴下した状態である）。

【請求項2】

ヤング率比が０．０６～０．０８である、請求項１に記載の多孔質複合体。

【請求項3】

気孔率が８７％以上である、請求項１又は２に記載の多孔質複合体。

【請求項4】

第８リン酸カルシウム及びコラーゲンを含む懸濁液（コラーゲン濃度４％以上）を－１９６℃以下で予備凍結し、更に凍結乾燥することを含む、請求項１～３に記載の多孔質複合体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

多孔質複合体に関する技術が開示される。

【背景技術】

【0002】

ヒドロキシアパタイト、β－第３リン酸カルシウム（β－ＴＣＰ）、及び第８リン酸カルシウム（Ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、以下、「ＯＣＰ」という）等のリン酸カルシウムが骨再生材料として使用されている（例えば、特許文献１～５）。また、ＯＣＰに保形性を付与するために、コラーゲンでできた多孔質体にＯＣＰを含有させることが提案されている（特許文献５）。 特許文献６には、リン酸カルシウムを含む多孔質複合体とＰＴＨを併用する、で骨再生又は骨増生の手段が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特開２０１０－２７３８４７号公報

【文献】特開２００３－２６０１２４号公報

【文献】特開２００９－１３２６０１号公報

【文献】特開２００５－２７９０７８号公報

【文献】特開２００６－１６７４４５号公報

【文献】ＷＯ２０１７／１７５５０９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

より改善された骨再生又は骨造成の手段を提供することが１つの課題である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

斯かる課題の解決手段として下記に代表される発明が提供される。
項１．
第８リン酸カルシウム及びコラーゲンを含み、気孔率が９２％以下であり、ヤング率比が０．０６～０．１である、多孔質複合体。
項２．
ヤング率比が０．０６～０．０８である、項１に記載の多孔質複合体。
項３．
気孔率が８７％以上である、項１又は２に記載の多孔質複合体。
項４．
第８リン酸カルシウム及びコラーゲンを含む懸濁液を－４０℃以下で予備凍結し、更に凍結乾燥することを含む、項１～３に記載の多孔質複合体の製造方法。
項５．
懸濁液中のコラーゲン濃度が４％以上である、項４に記載の方法。

【発明の効果】

【0006】

効果的に骨再生又は骨造成することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】実施例で撮影した術後４週および12週後のラットのＣＴ画像を示す。

【図2】実施例における組織学的解析のためにＨＥ染色した組織を示す。

【図3】実施例において多核巨細胞の存在を組織学的に解析するために使用した画像を示す。

【図4】実施例において既存骨吸収を組織学的に解析するために使用した画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0008】

多孔質複合体は、第８リン酸カルシウム（「ＯＣＰ」とも称する。）及びコラーゲンを含み、気孔率が９２％以下であり、ヤング率比が０．０６～０．１であることが好ましい。

【0009】

ＯＣＰは、種々公知の方法によって調製することができる。例えば、滴下法（ＬｅＧｅｒｏｓ ＲＺ，Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ ３７：１９４－１９７，１９８５）、又は特許文献６に開示される合成装置（三流管）を使用した方法などによって調製することができる。また、リン酸二水素ナトリウム水溶液と酢酸カルシウム水溶液を適切な条件下で混合し、生成した沈殿物を回収することによる混合法によって調製することもできる。沈殿物から得られたＯＣＰは、乾燥させ、電動ミル等を用い粉砕し、粒子状の粉体にして用いることが好ましい。

【0010】

ＯＣＰの粒径は１０～１０００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１００～５００μｍに調製することが好ましく、さらに好ましくは３００～５００μｍに調製することが好ましい。粒径は、ふるい分け法によりふるいの目開きのサイズによって分級することができる。

【0011】

多孔質複合体を構成するコラーゲンは、骨再生又は骨造成用の材料として適している限り、由来及び性状などは特に限定されず、任意のコラーゲンを使用することができる。一実施形態において、コラーゲンは、蛋白分解酵素（例えばペプシン、又はプロナーゼ等）で可溶化し、テロペプチドが除去された酵素可溶化コラーゲンであることが好ましい。このようなコラーゲンはアレルゲン性が低い。また、コラーゲンは、繊維性コラーゲンであるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型又はＩＶ型のコラーゲンであることが好ましい。一実施形態において、コラーゲンは、生体内に大量に含まれるＩ型コラーゲン、又はＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの混合物であることが好ましい。コラーゲンの原料は、例えば、豚又は牛などの皮膚、骨、若しくは腱等、並びに魚のうろこなどを用いることができる。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高い。上記のコラーゲンとしては、市販の製品を使用してもよい。

【0012】

ＯＣＰとコラーゲンの配合比は、所望する保形性、操作性、及び生体親和性等を考慮して適宜調整することができる。例えば、コラーゲン１重量部に対するＯＣＰの配合比は、０．５～３５重量部、好ましくは１～２０重量部、より好ましくは２～１０重量部である。コラーゲン１重量部に対してＯＣＰが０．５重量部未満であると、得られた複合体の骨再生機能が劣るおそれがあり、３５重量部を超えると保形性が低下するおそれがある。

【0013】

多孔質複合体の気孔率は９２％以下であることが好ましい。一実施形態において、多孔質複合体の気孔率は９１％以下、９０％以下、又は８９％以下であることが好ましい。多孔質複合体の気孔率の下限は特に制限されないが、例えば、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、又は８８％以上であり得る。

【0014】

多孔質複合体の気孔率は、多孔質複合体の理論密度及び実測密度から次の式から求められる物性値である。

【数1】

式中、Pは気孔率を示し、P₀は複合体の理論密度を示し、ｍ_０は複合体の実測密度を示す。また、ＯＣＰの理論密度は２．６１(ｇ／ｃｍ^３)である。

【0015】

多孔質複合体の気孔率を上記の範囲に調整する手段は任意である。例えば、凍結乾燥法により多孔質複合体を作製する場合、一般的に凍結乾燥前の水分率が気孔率に影響する。そこで、多孔質複合体を調製する際に使用するコラーゲン溶液におけるコラーゲン濃度を調整することにより水分率を調整し、気孔率を制御することができる。コラーゲン濃度を高めることにより、気孔率は低下する傾向にある。

【0016】

多孔質複合体の気孔率を上述の範囲に調整するという観点で、多孔質複合体を調製する際に使用するコラーゲン溶液中のコラーゲン濃度は、３重量％よりも高いことが好ましく、３．５重量％以上、４重量％以上、４．５重量％以上、５重量％以上、又は５．５重量％であることが好ましい。

【0017】

多孔質複合体は、ヤング率比が０．０６～０．１であることが好ましい。一実施形態において、ヤング率比は、０．０５５よりも大きいことが好ましく、０．０６以上、０．０６１以上、０．０６２以上、０．０６３以上、０．０６４以上、又は０．０６５以上であることが好ましい。一実施形態において、ヤング率比は、０．１４以下、０．１３以下、０．１２以下、０．１１以下、０．１以下、０．０９以下、又は０．０８以下であることが好ましい。

【0018】

多孔質複合体のヤング率比とは、多孔質複合体の湿潤条件でのヤング率を乾燥条件でのヤング率で除して求められる物性である。ヤング率は、多孔質複合体について測定された応力－ひずみ曲線から算出される物性である。乾燥条件でのヤング率は、圧縮試験機（EZ-L 5kN、島津製作所）を使用し、カタログ値としての乾燥条件で、クロスヘッド速度０．５ｍｍ／分、サンプル時間５０ｍ秒、最大荷重４５００Ｎで得られる荷重－変異曲線から算出されるヤング率である。湿潤条件でのヤング率は、生理食塩水０．５ｍｌを試料に滴下し、クロスヘッド速度、サンプル時間、最大荷重は乾燥条件と同じで測定し、得られる荷重－変異曲線から算出されるヤング率である。

【0019】

多孔質複合体のヤング率比を上述の範囲に制御するという観点でも、多孔質複合体を調製する際にするコラーゲン溶液中のコラーゲン濃度を３重量％よりも高くすることがこのましい。コラーゲン濃度は、３．５重量％以上、４重量％以上、４．５重量％以上、５重量％以上、又は５．５重量％であることが好ましい。

【0020】

一実施形態において、多孔質複合体は３～９０μｍの細孔径を有することが好ましい。細孔径が９０μｍを超える場合、多孔質複合体の強度が低下する傾向がある。一方、細孔径が３μｍ未満である場合、骨芽細胞等の骨代謝系細胞の侵入が起こり難くなり、骨再生の促進作用が低下する恐れがある。多孔質複合体の細孔径は、より好ましくは５～４０μｍである。

【0021】

多孔質複合体の細孔径は水銀ポロシメーター（Ｍｅｒｃｕｒｙ ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｅｒ）による細孔分布測定を用いて測定される。具体的には以下の方法により測定される。（細孔径測定）
前処理として、サンプル（多孔質複合体）を１２０℃で４時間恒温乾燥する。前処理後の各サンプルについて、下記の測定装置を用いた水銀圧入法により、下記の条件で細孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）０．００１８～２００μｍの細孔分布を求める。
測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
測定条件：サンプルと水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
水銀の表面張力：０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０^－５Ｎで換算）

【0022】

上記水銀圧入法で得られた細孔分布曲線において、最も大きな面積を有するピークの極大値を示す細孔径（直径）の値が本書における細孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）の値である。

【0023】

多孔質複合体の形状は、それを充填する患部の形状及び大きさ等を考慮して任意に設定することができる。例えば、多孔質複合体は、直方体（ブロック体）、立方体、円筒体、タブレット状、又は顆粒であることが好ましい。一実施形態において、直方体である多孔質複合体の大きさは５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ以上であることが好ましく、一般に上限は１００ｍｍ×１００ｍｍ×１００ｍｍであることが好ましい。円筒状である場合の大きさは、直径が５～５０ｍｍであることが好ましく、高さは１～５０ｍｍの範囲であることが好ましい。顆粒状である場合、形状は球体に限られず不定形でもよいが、直径が０．１～１０ｍｍであることが好ましい。顆粒状の多孔質複合体の直径は、ふるい分け試験法により求められる。

【0024】

多孔質複合体を移植する方法（ｍａｎｎｅｒ）は、任意であり特に制限されない。例えば、多孔質複合体の移植は、適当なサイズの多孔質複合体を骨再生又は骨造成（好ましくは、骨造成）が必要な部位に補填することより行われ得る。骨再生又は骨造成が必要な部位（例えば、骨欠損部）に十分な血液もしくは体液が存在する場合には、多孔質複合体をそのまま、もしくは適当な形状に切断し補填することができる。当該部位に十分な血液等が認められない、又は多孔質複合体を元の形状で補填できない場合は、多孔質複合体を血液もしくは生理食塩水等に浸漬し、多孔質複合体がスポンジ状の弾力性を示すことを確認した上で骨欠損部に補填することができる。

【0025】

骨再生が必要な部位は、例えば、骨欠損部位を含む。骨欠損は種々に要因により生じ得る。要因としては、例えば、骨欠損は、骨折、外傷後の骨欠損（ｐｏｓｔ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ）、骨の外科的手術、先天性骨欠損、感染後の骨欠損（ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ）、骨の化学療法処置（ｂｏｎｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、同種移植片の埋め込み（ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、骨の放射線療法処置（ｂｏｎｅ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に関連する骨欠損疾患（ｂｏｎｅ ｄｅｆｉｃｉｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、及び歯周病等を挙げることができる。骨の外科的手術としては、例えば、脊椎固定術、四肢の関節固定術などを含む関節固定、および外傷後の骨の手術（ｐｏｓｔ－ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｏｎｅ ｓｕｒｇｅｒｙ）、補綴後の関節の手術（ｐｏｓｔ－ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｊｏｉｎｔ ｓｕｒｇｅｒｙ）、整形後の骨の手術（ｐｏｓｔ－ｐｌａｓｔｉｃ ｂｏｎｅ ｓｕｒｇｅｒｙ）、及び歯科手術（ｄｅｎｔａｌ ｓｕｒｇｅｒｙ）等を挙げることができる。一実施形態における骨欠損部位としては、例えば、嚢胞腔、萎縮歯槽堤、顎裂部、及び抜歯窩等を挙げることができる。

【0026】

骨造成が必要な部位は、特に制限されず、例えば、ｓｉｎｕｓ ｌｉｆｔ， ｂｏｎｅ ｇｒａｆｔ， 及びｒｉｄｇｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎから成る群より選択される一種以上の処置を必要とする部位である。一実施形態において、骨造成が必要な部位は、骨粗鬆症、変形性脊椎症、慢性関節リウマチ、悪性腫瘍、外傷等に伴う骨塩量の減少病態を示す部位であり得る。他の実施形態において、骨造成が必要な部位は、構音障害咀嚼傷害、及び／又は審美障害を伴う口腔外科的病態が挙げられる。

【0027】

被検体は、特に制限されないが、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、サル、及びラット等の動物を挙げることができる。一実施形態において、好ましい被検体はヒトである。

【0028】

多孔質複合体は、任意の方法で製造することができる。例えば、多孔質複合体は、下記の（ａ）又は（ｂ）の方法で製造できる。

【0029】

（ａ）ＯＣＰとコラーゲンとを混合して複合化する方法
濃度及びｐＨ等がゲル化し得る範囲に調整されたコラーゲン溶液にＯＣＰを添加し、十分に混練してＯＣＰとコラーゲンの混合物を作製することができる。次いで、この混合物を適当な型に加えて成型し、凍結し、凍結乾燥することにより複合体を得る。得られた複合体は、熱脱水架橋処理を施し、慣用の滅菌法（例えば、γ線照射、電子線照射、エチレンオキサイドガス等）により滅菌することが好ましい。

【0030】

（ｂ）ＯＣＰ懸濁液を混合して複合化する方法
適当な濃度のコラーゲン酸性溶液を、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）で無菌的にｐＨ５．５～７．５に調整する。そこにコラーゲンがゲル化する前にＯＣＰを添加して、コラーゲンとＯＣＰの懸濁液を調製する。その後、ｐＨを中性から弱アルカリ性に保持した状態で型に流し込み、形状を付与した後、適当な温度（例えば３７℃）でゲル化させ、水洗浄を繰り返して緩衝液の塩などを除去して複合体を得ることができる。その後、上記（ａ）と同様に凍結乾燥および滅菌処理を施すことが好ましい。

【0031】

一実施形態において、多孔質複合体を得る方法は、ＯＣＰとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し凍結（予備凍結）した後、凍結乾燥する工程を含むことが好ましい。「ゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し凍結し」とは、例えば、ゲル、ゾルまたは液体が収容された容器を密閉した後に該容器を液体冷媒に浸漬して、ゲル、ゾルまたは液体を凍結させる態様も含む。

【0032】

液体冷媒は、ＯＣＰとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体の凍結温度より低い温度の液体であり、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、及び液体窒素等が挙げられる。該液体冷媒の温度は、例えば、－２０℃以下、好ましくは－４０℃以下、－６０℃以下、－８０℃以下、－１００℃以下、－１２０℃以下、－１４０℃以下、－１６０℃以下、又は－１８０℃以下である。ＯＣＰとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬することによって急速に凍結させることにより、得られる多孔質複合体の細孔径を小さくすることができると考えられる。

【0033】

一実施形態において、多孔質複合体は、熱処理が施されていることが好ましい。熱処理により、ＯＣＰ分子構造の一部が崩れて骨形成系細胞の侵入が起こり易くなり、骨再生が促進されると共に、コラーゲンが架橋して形状保持力が向上する。

【0034】

熱処理の温度は、好ましくは５０～２００℃、より好ましくは６０～１８０℃である。また、熱処理は、減圧条件下で行うことが好ましい。圧力は、好ましくは０～３０００Ｐａ、より好ましくは０～３００Ｐａである。熱処理の処理時間は、好ましくは０．１～１０日、より好ましくは０．５～５日である。

【0035】

多孔質複合体は、上述する各成分以外の任意の成分を含み得る。そのような配合成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ポリエチレングリコール共重合体等）を挙げることができる。また、多孔質複合体は、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ）といった成分を含んでいてもよい。

【0036】

多孔質複合体は、骨再生／骨造成材料として用いることができる。骨再生材料は歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復、並びに、開頭、及び開胸術後の骨欠損修復などに有用である。

【実施例】

【0037】

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。

【0038】

１．ＯＣＰの調製
ＯＣＰ調製用の１液および２液を次の通り調製した。リン酸二水素ナトリウム二水和物３１．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、１液を調製した。酢酸カルシウム一水和物３５．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、２液を調製した。１液をセパラブルフラスコに入れ、マントルヒーターにて７０℃に昇温した。撹拌機（東京理化器械社製、ＭＡＺＥＬＡ Ｚ）に撹拌翼（羽径１２ｃｍ）を取り付け、１液を２５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら、２液を約２８ｍＬ／ｍｉｎの速度で滴下した。滴下終了後、１液と２液の混合液を７０℃、２５０ｒｐｍでさらに２時間撹拌した。

【0039】

上記の混合液中に生成した沈殿物をメンブレンフィルター（孔径３μｍ、アドバンテック東洋社製、Ａ３００Ａ２９３Ｃ）を用いてろ過し、回収した。それを蒸留水１５００ｍＬに分散させ、１５分間撹拌し洗浄した。このろ過及び洗浄の工程をさらに３回繰り返した。洗浄した沈殿物を、恒温乾燥機を用いて３０℃で２４時間乾燥した。乾燥後の沈殿物を電動ミルにて粉砕した後、ふるいを用いて粒径を３００～５００μｍに分級し、粉体を得た。最後に、得られた粉体に対して１２０℃で２時間の乾熱滅菌を行い、ＯＣＰを得た。

【0040】

２．ＣＯＰ／Ｃｏｌの調製
Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約７．４に調整しコラーゲン懸濁液を得た。コラーゲン懸濁液に製造例１で得たＯＣＰ（粒径３００～５００μｍ）をＯＣＰとコラーゲンが重量比で７７：２３となるように加え、室温で撹拌してＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を得た。

【0041】

ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ－２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが３重量％となるように上清を廃棄した後、内容物を薬さじで約２分間混合し、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを得た。併せて、ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが３重量％である懸濁液に、更に、７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心し、上清を廃棄する作業を繰り返し、それぞれコラーゲンの濃度が４重量％、５重量％又は６重量％であるＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを得た。これらを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径９．０ｍｍ、容積約３．０ｃｍ^３）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。

【0042】

これらの複合ゲルを２群に分け、一方の群は、密閉した状態のプラスチック容器を－８０℃に設定した冷凍庫に入れ、ＣＯＰ／コラーゲン複合ゲルを凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（－１０℃、４８時間）させ成形した。これを気相OCP/Col「OCP/Col(G群)」とし、ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲン濃度が３重量％、４重量％、５重量％、６重量％であった各試料を、それぞれ「G 1.0，G 1.3，G 1.7，G 2.0」とした。

【0043】

もう一方の群は、密閉した状態のプラスチック容器をその容積に対して大過剰の－１９６℃の液体窒素に浸漬して急速に凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（－１０℃、４８時間）させ成形した。これを液相OCP/Col「OCP/Col(L群)」とし、ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲン濃度が３重量％、４重量％、５重量％、６重量％であった各試料を、それぞれ「L 1.0，L 1.3，L 1.7，L 2.0」とした。

【0044】

各試料は凍結乾燥後、減圧下、150℃で24時間加熱し、熱脱水架橋を行い、電子線照射で滅菌を行なった。圧縮試験等には10mm×10mm×10mmの試料を用た。一方、動物埋植用にはOCP/Col G群およびOCP/Col L群の直径9mm×厚さ2mmのディスクを用いた。

【0045】

３．気孔率
得られた試料について、かさ密度と理論密度から気孔率を求めた。なお、用いた理論密度(g/cm³)はOCP: 2.61、Col: 1.41である。測定された各試料の気孔率(％；N=3、mean ± S.D.)は以下の通りである。

【表1】

【0046】

上記のとおり、OCP/Col (G群)、OCP/Col (L群)ともにＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲンの濃縮比率を高めることで気孔率は減少した。また、同一濃縮比率のOCP/Col (G群)とOCP/Col (L群)との比較では、同程度の気孔率を示していた。

【0047】

４．ヤング率
通常の乾燥条件での測定に加え、実際の臨床現場では試料が血液等の組織液にさらされることを考慮し、湿潤条件で測定を行なった。乾燥条件、湿潤条件ともに、圧縮試験機（EZ-L 5kN、島津製作所）を使用した。クロスヘッド速度0.5mm/min、サンプル時間50msec、最大荷重4500Nと設定した。なお、湿潤条件では生理食塩水0.5mlを試料へ滴下後5分以内に測定を開始した。それぞれ得られた荷重―変位曲線から応力―ひずみ曲線を求め、算出した各試料のヤング率を下記の表に示す。

【0048】

【表2】

【0049】

OCP/Col (G群)、OCP/Col (L群)ともに濃縮比率を高めることでヤング率は上昇した。

【0050】

５．埋入試験
雄性Wistar系ラット(12週齢)を無作為に８群（G 1.0，G 1.3，G 1.7，G 2.0，L 1.0，L 1.3，L 1.7，L 2.0）に分け、各群５匹、計40匹を用いた。腹腔内麻酔後、ラット頭蓋冠部に皮膚切開、骨膜切開を加え、頭蓋冠上に骨膜下ポケットを作製し、同部に試料（直径9mm×厚さ2mmのディスク）を埋入した。試料埋入後、骨膜および皮膚縫合を行い手術を終了した。

【0051】

６．Ｘ線学的解析
術後４週および12週後に実験動物用X線CT装置（Latheta LCT-200；日立アロカメディカル社製）を低Ｘ線管電圧で用い、生存状態で断層撮影を行い、試料埋入部における新生骨形成状況を精査した。同様に術後12週後あるいは24週後のCT撮影後、ペントバルビタール過量麻酔にて屠殺し頭蓋冠および周囲組織を採取し、0.1Mリン酸緩衝4%パラホルムアルデヒド(pH 7.4)に浸漬固定した。

【0052】

ＣＴ画像を図１に示す。術後12週において、OCP/Col（L群）（とりわけL 1.3，L 1.7，L 2.0）では、埋入試料の高さが保持されていたのに対し、OCP/Col (G群)では埋入試料が潰れ、高さが保持できないことが確認された。特にL 2.0では埋入試料の高さの保持のみならず、試料のエッジの変形量が他群と比較して小さく、形状が最も保持されていた。

【0053】

７．組織学的解析
摘出標本は10% EDTAで脱灰しパラフィン標本作成後、前頭断で6 μm厚の組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色で組織学的に検索を行った。

【0054】

結果を図２に示す。術後12週のOCP/Col (G群)では、埋入試料や既存骨の吸収が観察され、既存骨側からの少量の新生骨の形成を認めるが、明確な骨造成は認められなかった。一方、OCP/Col（L群）（とりわけL 1.3，L 1.7，L 2.0）では、埋入試料の高さの保持が認められた。また、既存骨側から皮膚側に向かう骨の新生が目立ち、それらは試料辺縁部で顕著であった。新生骨量についてはL 2.0がL 1.7，L 1.3に比べ多いように見られた。

【0055】

８．組織学的解析（多核巨細胞）
HE染色された各標本の試料埋入中央相当部（複数個）の組織切片を用いて、多核巨細胞を確認した。結果の一部を図３に示す。OCP/Col（G群）（図３はG 2.0）の中央上部（Upper Central area: UC）では多数の多核巨細胞が確認され、OCP/Colの吸収が示唆されたが、OCP/Col（L群）（図３はL 2.0）のUCでは、多核巨細胞は目立たず、残存しているOCP/Col内への細胞の侵入は目立たない。これらは、液体窒素処理したL群はG群に比べて、生体の異物反応が少ないことを示唆している。

【0056】

９．組織学的解析（既存骨吸収）
HE染色された各標本の試料埋入中央相当部（複数個）の組織切片を用いて、既存骨吸収を確認した。結果の一部を図４に示す。OCP/Col（G群）（図４はG 2.0）の中央下部（Lpper Central area: LC）では既存骨が薄くなっているが、それら表面には骨吸収系の細胞の存在は顕著ではない。一方、OCP/Col（L群）（図４はL 2.0）のLCでは新生骨が既存骨側から形成されている。OCP/Col（G群）のLC はCT写真では不透過像も混在していることから、OCP/Col（G群）ではアパタイトに転換し、（石のように）硬くなったOCP/Colが既存骨を圧迫することで、それらが吸収したと考えられた。

【0057】

１０．組織定量学的解析（新生骨比率（n-Bone％））
HE染色された各標本の試料埋入中央相当部（複数個）の組織切片を用いて、試料埋入部位における新生骨の割合 (n-Bone%)を組織定量学的に検討した。

【0058】

各群の新生骨比率（n-Bone％）の結果を下記表３に示す。OCP/Col（L群）（L 1.3，L 1.7，L 2.0）では、埋入試料の高さは保持されていたが、それら内部に占める新生骨比率はL 2.0がL 1.7，L 1.3に比べ有意に高く、L 1.7もL 1.3に比べ有意に高かった。

【0059】

【表3】

【0060】

１１．エックス線学的解析（形状解析）
埋入12週後の試料の変形量解析のため，CT 画像を用いて試料の高さと左右両端の角度を計測し形状解析を行なった。高さの解析では，既存骨底面から試料上面までの高さを測定した。埋入試料上縁の変形量の解析では，左右の上端に２つの点を取り，各点から試料の稜線に沿って既存骨に対して水平方向及び鉛直方向に２点を取り（端近傍），左右上端の各１点とその近傍２点とを直線で結び，直線間の角度をそれぞれ測定した（１つの試料について左右上端２つの角度を計測）。

【0061】

高さ解析の結果を下記表４に示す。OCP/Col(G群)（G 1.0，G 1.3，G 1.7，G 2.0）では、術後４週において埋入試料の高さが減じており、それらはG 1.0で特に著しい。術後12週では術後４週に比べて全てのOCP/Col（G群）で、さらに高さが減少している。特にG 1.3では減少傾向が顕著で、最終的にはG 1.0と同程度の高さを示した。一方、OCP/Col（L群）（L 1.0，L 1.3，L 1.7，L 2.0）では、術後４週において埋入試料の高さを維持する傾向があった。術後12週ではL 1.3，L 1.7，L 2.0は引き続き埋入試料の高さを維持する傾向が見られた。

【0062】

【表4】

【0063】

埋入試料上部の変形量の解析結果を下記表５に示す。変形がないと仮定すれば角度は90度を示すと考えられる。OCP/Col（G群）（G 1.0，G 1.3，G 1.7，G 2.0）については試料の変形が著しく埋入試料上縁の点が特定できないことから、表４に数値を示していないが、概略的にはG群全てにおいて180度に近い値を示すと考えられる。これに対してOCP/Col（L群）（L 1.0，L 1.3，L 1.7，L 2.0）では、術後４週及び１２週のいずれにおいてもG群と比較して低い角度を示し、変形が少ないことが確認された。

【0064】

【表5】

【0065】

尚、ヤング率、高さの解析、埋入試料上縁の変形量およびn-Bone%の解析については、平均値及び標準偏差を用いて分散分析等を行い、有意差検定を行った。有意水準は5 %に設定した。

【0066】

これらの結果は、本発明が「骨造成タイプ」における骨再生を実現できることを示す。具体的な適応疾患としては、従来の手法では困難であった「骨造成タイプ」（顔面陥没変形、歯槽堤増大、重度の歯周病など）の修復が期待でき、顔面変形の回復や咀嚼機能の改善等により国民の健康増進の向上に寄与できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】