特許7412832組換え発生が最小限に抑えられた遺伝子治療用ベクター、ベクターを含む組換えレトロウイルス、及び組換えレトロウイルスを含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-04
(45)【発行日】2024-01-15
(54)【発明の名称】組換え発生が最小限に抑えられた遺伝子治療用ベクター、ベクターを含む組換えレトロウイルス、及び組換えレトロウイルスを含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/867 20060101AFI20240105BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/68 20060101ALI20240105BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240105BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240105BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240105BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240105BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240105BHJP
【ＦＩ】
C12N15/867 Z ZNA
C12N5/10
C12N15/12
C12N15/52 Z
C12N15/68 Z
A61P35/00
A61K35/76
A61K35/12
A61P35/02
A61K48/00
【請求項の数】
32
(21)【出願番号】P 2023518119
(86)(22)【出願日】2021-09-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-07
(86)【国際出願番号】 KR2021012776
(87)【国際公開番号】W WO2022060155
(87)【国際公開日】2022-03-24
【審査請求日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】10-2020-0120797
(32)【優先日】2020-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0118834
(32)【優先日】2021-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】523098120
【氏名又は名称】アーティキュア インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム ヨン－ス
(72)【発明者】
【氏名】カン ムンギョン
(72)【発明者】
【氏名】キム スジン
【審査官】馬場 亮人
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－００６０５２０（ＫＲ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／８６７
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ１２Ｎ １５／５２
Ｃ１２Ｎ １５／６８
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｋ ３５／７６
Ａ６１Ｋ ３５／１２
Ａ６１Ｐ ３５／０２
Ａ６１Ｋ ４８／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｇａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１α（短鎖伸長因子１α）プロモータ又はＭＣＭＶ（マウスサイトメガロウイルス）プロモータ及び第１の治療用遺伝子を含有する第１の組換え発現ベクターと、ウイルスのＥｎｖ遺伝子、ＭＣＭＶプロモータ及び第２の治療用遺伝子を含有する第２の組換え発現ベクターと、を含む、組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターであって、前記ＭＣＭＶプロモータが、それぞれ、配列番号４、５、６、及び７のいずれかで表される塩基配列からなる切断型ＭＣＭＶプロモータであり、
前記ｓＥＦ１αプロモータが、配列番号１８で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項2】
前記Ｇａｇ－Ｐｏｌ遺伝子が、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）又は両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）のＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子である、請求項１に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項3】
前記ウイルスＥｎｖ遺伝子が、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、異種マウス白血病ウイルス（異種ＭｕＬＶ）、ネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及び麻疹ウイルス（ＭＶ）Ｅｎｖ遺伝子からなる群に由来するいずれかである、請求項１に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項4】
前記ＧａＬＶ Ｅｎｖ遺伝子が、配列番号１９で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項３に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項5】
前記ＭｕＬＶ Ｅｎｖ遺伝子が、配列番号２０で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項３に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項6】
前記第１の治療用遺伝子又は前記第２の治療用遺伝子が、自殺遺伝子、サイトカイン遺伝子、及び癌抗原遺伝子からなる群から選択されるいずれかである、請求項１に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項7】
前記自殺遺伝子がチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子又は酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子である、請求項６に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項8】
前記チミジンキナーゼ遺伝子が、配列番号２１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項７に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項9】
前記酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子が、配列番号２２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項７に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項10】
前記サイトカイン遺伝子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である、請求項６に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項11】
前記顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）がヒトコドンで最適化されている、請求項１０に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項12】
前記顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が、配列番号６５で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項１１に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項13】
前記癌抗原遺伝子が、ヒトＣＤ１９（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １９：分化抗原群１９）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ：癌胎児抗原）、又はＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２：ヒト上皮増殖因子受容体２）である、請求項６に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項14】
前記ヒトＣＤ１９遺伝子が、配列番号４３で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項１３に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項15】
前記ヒトＣＤ１９遺伝子が、細胞質ドメインのアミノ酸が除去された短縮型ヒトＣＤ１９（ｈＣＤ１９）遺伝子である、請求項１３に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項16】
前記短縮型ヒトＣＤ１９遺伝子が、配列番号５３で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項１３に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項17】
前記チミジンキナーゼ又は酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子が前駆体薬物を活性化する、請求項８又は９に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項18】
前記前駆体薬物が、ガンシクロビル（ＧＣＶ）及び５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１７に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター。
【請求項19】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のベクターを含む組換えレトロウイルス。
【請求項20】
請求項１９に記載の組換えレトロウイルスでトランスフェクト又は形質導入された細胞。
【請求項21】
前記細胞が、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、ヒト２９３Ｔ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣａｐＴ細胞（ヒト羊水由来細胞）、ＣＯＳ細胞、イヌＤ１７細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、レトロウイルスパッケージング細胞、ヒト間葉系幹細胞、及びネコＰＧ４細胞からなる群から選択される、請求項２０に記載の組換えレトロウイルスでトランスフェクト又は形質導入された細胞。
【請求項22】
請求項１９に記載の組換えレトロウイルスを有効成分として含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項23】
請求項２０に記載の組換えレトロウイルスでトランスフェクト又は形質導入された前記細胞を含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項24】
前記癌が、粘液細胞癌腫、円形細胞癌腫、局所進行腫瘍、転移性癌、ユーイング肉腫、癌転移、リンパ転移、扁平上皮癌腫、食道扁平上皮癌腫、口腔癌腫、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、流出リンパ腫（セリアックリンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌、小細胞肺癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ産生腫瘍、非小細胞肺癌、乳癌、小細胞癌腫、乳管癌腫、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸新生物に関連するポリープ、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌、原発性表在膀胱腫瘍、膀胱の浸潤性転移性細胞膀胱癌腫、筋肉浸潤性膀胱癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、食道癌、卵巣癌腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、原発性腹膜上皮新生物、子宮頸癌腫、膣癌、外陰癌、子宮癌、濾胞性固形腫瘍、精巣癌、陰茎癌、腎細胞癌腫、脳癌、頭頸部癌、神経芽細胞腫、脳幹神経膠腫、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞浸潤、骨腫、骨肉腫、悪性黒色腫、ヒト皮膚角化細胞の腫瘍進行、扁平上皮癌腫、甲状腺癌、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆のう癌、絨毛性腫瘍、血管周皮腫、及びカポジ肉腫からなる群から選択される、請求項２２又は２３に記載の癌を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項25】
請求項１９に記載の組換えレトロウイルスを含む、癌を治療するための遺伝子送達組成物。
【請求項26】
以下の工程を含む、組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを調製するための方法：
１）ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）のＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ又はＭＣＭＶプロモータ、及び第１の治療用遺伝子を含む第１の組換え発現ベクターを調製する工程と、
２）ウイルスのＥｎｖ遺伝子、ＭＣＭＶプロモータ、及び第２の治療用遺伝子を含む第２の組換え発現ベクターを調製する工程；
前記ＭＣＭＶプロモータは、配列番号４、５、６及び７のいずれかで表される塩基配列からなる切断型ＭＣＭＶプロモータであり、
前記ｓＥＦ１αプロモータは、配列番号１８で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【請求項27】
前記ウイルスのＥｎｖ遺伝子が、配列番号１９又は２０で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項２６に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを調製するための方法。
【請求項28】
前記第１の治療用遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子、及びヒトＣＤ１９遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２６に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを調製するための方法。
【請求項29】
前記第２の治療用遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子、及びヒトＣＤ１９遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２６に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを調製するための方法。
【請求項30】
前記チミジンキナーゼ遺伝子が、配列番号２１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項２８又は２９に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを調製するための方法。
【請求項31】
前記酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子が、配列番号２２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項２８又は２９に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを調製するための方法。
【請求項32】
前記ヒトＣＤ１９遺伝子が、配列番号４３で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項２８又は２９に記載の組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、効率的な癌治療のための治療用遺伝子としてチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）、ヒトＣＤ１９遺伝子又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含み、治療用遺伝子の高い発現率を維持しながら組換えを最小限に抑える最小限のＭＣＭＶプロモータを含む、組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療は、患者の細胞又は組織において疾患を引き起こす異常遺伝子を置換することによって、又は疾患の治療に有用な遺伝子を挿入することによって、疾患を治療するための技術を指す。遺伝子治療の開発の初期において、遺伝子治療の主な概念は、外来ＤＮＡを標的細胞の染色体に挿入して特定の遺伝子を発現させることであった。しかしながら、近年では、アンチセンスオリゴジオキシヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等を用いて特定の疾患に関連する遺伝子の発現を抑制するアンチセンス療法もその範疇に含まれる。
【0003】
このような遺伝子治療は、これまでの治療法とは全く異なる概念のアプローチであり、分子レベルで同定することによって疾患の根本的原因を治療することができる。更に、遺伝子治療は塩基配列特異的な作用であるため、主要な疾患に関連する遺伝子を除去することにより、他の治療法で問題となる不要な副作用を最小限に抑えることができる。遺伝子を標的化するそのような方法は、発現レベルを制御するための遺伝子の塩基配列のみが知られている場合、治療剤の製造においていかなる最適化も必要とせず、そのため、製造プロセスは抗体又は化合物治療剤と比較して非常に単純である。更に、疾患の原因となる遺伝子が既知であれば、他の治療薬が標的とし難い標的を標的とすることができ、したがって、次世代の治療薬として十分な可能性を有する。この点、既存の医療技術では治療が困難な不治疾患、癌、ＡＩＤＳ、遺伝病、神経系疾患に遺伝子治療を適用することで治療可能性を高めた研究結果がいくつかあり、実際の臨床試験も行われている（ＹＯＵＮＧ ｅｔ ａｌ，２００６）。
【0004】
遺伝子治療は、遺伝子キャリア及び治療用遺伝子からなる。生体内に遺伝子を送達するためのツールである遺伝子キャリアは、ウイルスキャリアと非ウイルスキャリアとに大きく分けることができる。ウイルスキャリアは、ウイルスが自身を複製できないようにウイルスの大部分のウイルス遺伝子又はいくつかの必須遺伝子を排除し、代わりに治療用遺伝子をその中に挿入することによって製造される（Ｌｏｔｚｅ ＭＴ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：６９２－６９９，２００２）。ウイルスキャリアは遺伝子を高効率で送達することができるが、ウイルスの種類によっては、大量製造の困難さ、免疫応答の誘導、毒性、又は複製可能なウイルスの出現等の問題がある。遺伝子治療の開発において現在使用されている主なウイルスキャリアには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス、及びポックスウイルスが含まれる。一方、非ウイルス性担体は、免疫反応を誘導せず、毒性が低く、大量製造が容易であるが、遺伝子送達効率及び一過性発現が低い。
【0005】
臨床現場で最も広く使用されているウイルスキャリアの一つであるレトロウイルスベクターは、１９９０年に米国国立衛生研究所によって行われた遺伝子治療の最初の臨床試験で使用され、治療用遺伝子を安定に挿入するための最も有用なベクターと考えられている。
【0006】
自己複製が制限された複製不可能なレトロウイルスベクターに比較的大きな遺伝子を挿入することができ、ベクターの力価は約１０６～１０７ｐｆｕ／ｍｌであるため、標的細胞への感染に大きな問題はない。更に、パッケージング細胞株が開発されているため、レトロウイルスベクターの製造方法が容易である。更に、レトロウイルスベクターは、治療用遺伝子をレトロウイルスプラスミドに挿入し、パッケージング細胞をレトロウイルスプラスミドで感染させて組換えウイルスを産生させ、標的細胞を組換えウイルスで感染させることによってスケールアップすることができる。しかしながら、染色体への挿入プロセスにおいて、遺伝子挿入に起因して変異が生じ得る。
【0007】
複製可能なレトロウイルスベクターはゲノム安定性の点で非常に議論の余地があり、遺伝子治療用の自己複製ウイルスベクターとして開発された場合、導入できる遺伝子のサイズが約１．３ｋｂに制限されているため、様々な治療用遺伝子を導入することは困難である（Ｊ．ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５，６９８９－６９９８，２００１）。
【0008】
抗癌遺伝子治療に用いられる治療用遺伝子としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ等のプロドラッグ投与により癌細胞の自殺を誘導する遺伝子、インターロイキン１２、ＧＭ－ＣＳＦ等の免疫応答を促進し得るサイトカイン遺伝子、ＣＥＡ又はＨｅｒ－２等の腫瘍特異的抗原遺伝子が広く用いられている（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＭＭ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１０：５０１－５０８，２００３）。自殺遺伝子は、癌細胞に送達された後に癌を死滅させ、サイトカイン遺伝子又は腫瘍特異的抗原遺伝子は、癌に対する免疫応答を活性化することによって癌細胞を攻撃する。
【0009】
近年、悪性腫瘍に対して選択的に抗腫瘍効果を示す酵素／プロドラッグの合成技術に関する研究が盛んに行われている。実際、自殺遺伝子を癌組織で発現させ、その前駆体を生体に全身投与すると、正常細胞には毒性が現れず、治療用遺伝子が発現している腫瘍細胞でのみ前駆体が毒性物質に変換され、腫瘍細胞を破壊する。
【0010】
最も広く使用されている自殺遺伝子の１つは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）である。それは、細胞に無害なガンシクロビル（ＧＣＶ）と呼ばれるプロドラッグを酵素反応によって細胞傷害性物質に変換することによって、自殺遺伝子を有する細胞並びにギャップ結合を介して隣接細胞のアポトーシスを誘導するバイスタンダー効果を有する。自殺遺伝子についての第３相までの臨床試験を実施して、有効性及び安定性を証明した（ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，４：７２５－７３１，１９９３；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ，１：１９５－２０３，２０００）。
【0011】
別の自殺遺伝子は、酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）であり、これは５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を強力な抗癌剤である５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に脱アミノ化する。５－ＦＵは、５－フルオロウリジン三リン酸（５－ＦＵＴＰ）及び５－フルオロデオキシウリジン一リン酸（５－ＦｄＵＭＰ）に代謝される。リボ核酸と融合した５－ＦＵＴＰは、リボソームリボ核酸及び担体リボ核酸の合成を妨害し、５－ＦｄＵＭＰは、チミジンシンターゼを不可逆的に阻害することによってＤＮＡ合成を阻害する。更に、ｙＣＤは、ｙＣＤが送達されていない周囲の細胞を死滅させるバイスタンダー効果を有する。したがって、ＴＫ又はｙＣＤを発現する腫瘍細胞では、それらはＧＣＶ及び５－ＦＣ等のプロドラッグを毒性代謝産物に変換することによって癌細胞を選択的に死滅させる。
【0012】
近年、癌治療のための免疫療法剤が多く研究されており、ＣＡＲ－Ｔ等の癌細胞に特異的に発現する抗原を標的とする受容体をウイルスベクターにロードし、送達する免疫療法の方法が開発され、臨床応用されている。この免疫療法の方法は、体内の免疫細胞の特性を使用して副作用を可能な限り軽減することができ、患者の身体が癌細胞と戦うように免疫応答を強化することができる。癌細胞に特異的に発現する抗原遺伝子の例としては、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、又はＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）が挙げられる。癌抗原遺伝子であるＣＤ１９は、主に血液悪性腫瘍において特異的に発現し、合計５５６のアミノ酸から構成される９５ｋＤａサイズの膜貫通糖タンパク質である。それは、細胞質Ｃ末端、細胞外Ｎ末端、及び膜貫通ドメインからなる。このうち、細胞外Ｎ末端は、シグナル伝達ペプチドとしてのＣＡＲとの結合に役割を果たす。細胞質Ｃ末端のＹ３９１、Ｙ４８２、及びＹ５１３チロシン残基は、それぞれＶａｖＰＬＣ（ホスホリパーゼＣ）及びＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３－キナーゼ）／Ｌｙｎ等の細胞内シグナル伝達機構に関与し、大きな影響を及ぼす。
【0013】
ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）は、顆粒球の増殖及び産生とともに白血球増殖因子として機能するサイトカインであり、感染と戦うマクロファージ数を急速に増加させることにより免疫応答を増加させる。
【0014】
２種類以上の治療用遺伝子を同時に遺伝子治療に適用する技術は、治療効率の点で優れており、特定の遺伝子治療に抵抗性を示す場合に特に有用である。ここで、近年、ＴＫ及びＣＤの投与による治療に抵抗性を示す癌が報告されているため、癌組織においてＴＫ及びＣＤを同時に発現させることができる遺伝子治療用ベクター系は大きな利点を有する。しかし、ＨＳＶ－ＴＫ及びＣＤの両方をＲＲＶ（複製型レトロウイルスベクター）に導入すると、ゲノムサイズは約１０ｋｂ以上になり、単一のレトロウイルスベクターに挿入することは事実上不可能になる。更に、遺伝子治療用の複製型レトロウイルスベクターには、元のレトロウイルスのゲノムＲＮＡに加えて外来遺伝子が導入されるため、ゲノムＲＮＡのサイズが大きくなり、非相同配列が付加され、遺伝子組換えにより治療用遺伝子が失われやすく、ベクターの構築が困難となる。
【0015】
この問題を解決するために、本発明者らは、複製中のレトロウイルスに含まれるｇａｇ－ｐｏｌ－ｅｎｖゲノムのサイズを小さくし、ウイルスの安定性を維持した。また、ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を、１つのゲノムからなるｇａｇ－ｐｏｌ－ｅｎｖベクターとは別のベクターに含めることにより、二重複製型レトロウイルスベクターを構築して、他の治療用遺伝子の導入を可能にした。
【0016】
マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）ＩＥ遺伝子のプロモータは、特定の細胞においてＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子のプロモータよりも数倍から数十倍高い発現を誘導し（Ｌａｆｅｍｉｎａ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，６９，３５５－３７４（１９８８）、様々な細胞において均一に安定した発現を誘導することが知られている（Ａｉｂａ－Ｍａｓａｇｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５４，７３５－７４３（１９９９））。特に、ＭＣＭＶ主要前初期プロモータ（ＭＩＥＰ）領域から上流領域を除去すると、霊長類及びマウス細胞で非常に強い発現が誘導されることが報告されている（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｒｉｓｓｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，２３９－２４８（１９９３）；ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０３，１１５２－１１５９（１９９４））。また、韓国特許第１０－０４２３０２２号明細書は、プロモータは、ヒト及びマウスの真核細胞における遺伝子発現を強く安定的に誘導するため、ＭＣＭＶプロモータを動物の発現ベクターとして用いることができることを開示している。
【0017】
しかし、ＭＣＭＶプロモータ中の反復塩基配列に起因して、ＭＣＭＶ塩基配列の一部がウイルス複製中に失われるか、又はＭＣＭＶプロモータから始まる他の位置のウイルスベクター塩基配列が一緒に失われ、組換えウイルスが生じ、これは治療用遺伝子を連続的に発現するレトロウイルスベクターの産生及び感染において大きな問題である。
【0018】
したがって、本発明者らは、組換えを生じない遺伝子治療用ウイルスベクターを開発する一方で、ＭＣＭＶプロモータの反復塩基配列に基づいてプロモータを短縮することにより、ＨＳＶ－ＴＫ、ｈｏｐｔ－ｙＣＤ、ｈＣＤ１９又はＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を含む４つのバリアントを治療用遺伝子として構築し、切断型ＭＣＭＶプロモータを導入し、ウイルス感染中に組換えが生じないため治療用遺伝子の欠損がない複製型レトロウイルスベクターを開発した。本発明者らは、ベクターにおいてウイルスの組換えが起こらず、ベクターが優れた治療用遺伝子発現及び薬物感受性を有することを確認することにより、本発明を完成させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0019】
本発明の目的は、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ヒトＣＤ１９遺伝子又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を治療用遺伝子として含む、組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター、及び癌を治療するためのＭＣＭＶプロモータを提供することである。
【0020】
本発明の別の目的は、レトロウイルスベクターを含む組換えレトロウイルス、及び組換えレトロウイルスに感染した宿主細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0021】
上記目的を達成するために、本発明は、ＭｕＬＶのＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ又はＭＣＭＶプロモータ、及び第１の治療用遺伝子を含有する第１の組換え発現ベクターと、ウイルスのＥｎｖ遺伝子、ＭＣＭＶプロモータ及び第２の治療用遺伝子を含有する第２の組換え発現ベクターと、を含む、組換え発生が最小限に抑えられた複製型組換えレトロウイルスベクターを提供する。
【0022】
本発明はまた、ベクターを含む組換えレトロウイルスを提供する。
【0023】
本発明はまた、組換えレトロウイルスでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【0024】
本発明はまた、組換えレトロウイルスを有効成分として含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【0025】
本発明はまた、組換えレトロウイルスを含む、癌を治療するための遺伝子送達組成物を提供する。
【0026】
更に、本発明は、組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを調製するための方法であって、以下の工程
１）ＭｕＬＶのＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ又はＭＣＭＶプロモータ、及び第１の治療用遺伝子を含む第１の組換え発現ベクターを調製する工程と、
２）ウイルスのＥｎｖ遺伝子、ＭＣＭＶプロモータ、第２の治療用遺伝子を含む第２の組換え発現ベクターを調製する工程と、
を含む。
１）ＭｕＬＶのＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ又はＭＣＭＶプロモータ、及び第１の治療用遺伝子を含む第１の組換え発現ベクターを調製する工程と、
２）ウイルスのＥｎｖ遺伝子、ＭＣＭＶプロモータ、第２の治療用遺伝子を含む第２の組換え発現ベクターを調製する工程と、
を含む。
【発明の効果】
【0027】
本発明は、組換え発生が最小限に抑えられた遺伝子治療用ベクターに関する。本発明では、ウイルス複製中に治療用遺伝子を連続的に発現するレトロウイルスベクターウイルスの産生及び感染において大きな問題となる組換えの発生を最小限に抑えるために、ＭＣＭＶプロモータをリピート配列に基づいて切断することによって切断型ＭＣＭＶプロモータを作製し、切断型ＭＣＭＶプロモータを導入してベクターを作製した。切断型ＭＣＭＶプロモータが組み込まれたベクターは、複数回インキュベートしても組換えを起こさず、治療用タンパク質の連続発現を示し、ベクターを含むウイルスをトランスフェクトした細胞では、プロドラッグを投与すると効果的に細胞死が起こることが確認された。したがって、本発明の組換え発生が最小限に抑えられたベクターは、癌の治療に有利に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】複製型レトロウイルスベクターの感染性及び組換え型を確認するために設計されたＧａＬＶ ｅｎｖ－ｐＭＣＭＶ－ｙＣＤ／ｇａｇ－ｐｏｌ－ｐＭＣＭＶ－ＨＳＶ１－ＴＫベクターの概略図である。
【図2】ＧａＬＶ ｅｎｖ－ｐＭＣＭＶ－ｙＣＤ／ｇａｇ－ｐｏｌ－ｐＭＣＭＶ－ＨＳＶ１－ＴＫベクターの感染性及び組換え型を確認するための実験手順を示す概略図である。
【図3】ＧａＬＶ ｅｎｖ－ｐＭＣＭＶ－ｙＣＤ／ｇａｇ－ｐｏｌ－ｐＭＣＭＶ－ＨＳＶ１－ＴＫベクターの組換え型を確認するために行われるポリメラーゼ連鎖反応で使用されるプライマーの位置を示す概略図である。
【図4】ｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤ：ｅｎｖベクターにおいて組換えが起こったかどうかを確認するために行われたポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す図であり、ウイルス増殖及び感染が進行したが、ウイルス感染後の増幅プロセス中に組換えが起こったことを確認する。
【図5】ＧａＬＶ ｅｎｖ、ＭＣＭＶプロモータ、ｙＣＤ、及び３’塩基配列において生じた組換えのタイプを確認する図である。
【図6】ＭＣＭＶプロモータ塩基配列内の４つの反復塩基配列（１．ＡＡＣＡＧＧＡＡＡ、２．ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡ、３．ＴＧＧＧＴＴＴＴＴＣＣ、４．ＧＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡ）を示す図である。
【図7】切断型ＭＣＭＶプロモータがＧａＬＶ Ｅｎｖに導入されるｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの構造を示す図である。
【図8】切断型ＭＣＭＶプロモータがＭｕＬＶ Ｅｎｖに導入されるｓＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの構造を示す図である。
【図9】ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ、ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターにおける組換えを確認するためのプライマーの位置、及び組換えの有無を示す図である。
【図10】チミジンキナーゼ（ＴＫ）タンパク質が、ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターにおいて連続的に発現されることを確認する図である。
【図11】ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの組換えがｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターにおいて起こらず、酵母シトシンデアミナーゼタンパク質がその中で連続的に発現されることを確認する図である。
【図12】ベクターをプロドラッグＧＣＶ及び５－ＦＣで処理した場合に、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ、ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターで発現されるチミジンキナーゼ及び酵母シトシンデアミナーゼによって細胞死が誘導されることを確認する図である。
【図13】ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ、ｓＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターにおける組換えを確認するためのプライマーの位置、及び組換えの有無を示す図である。
【図14】ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターにおける組換えを確認するためのプライマーの位置及び組換えの有無を示す図である。
【図15】チミジンキナーゼ（ＴＫ）タンパク質がｓＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターで連続的に発現されることを確認する図である。
【図16】ベクターをプロドラッグＧＣＶで処理した場合に、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ、ｓＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターで発現されるチミジンキナーゼによって細胞死が誘導されることを確認する図である。
【図17】ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターを含むウイルスでトランスフェクトした細胞における細胞死に従って定量的に細胞生存率を示す図である。
【図18】組換えがｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターにおいて起こるかどうかを確認するためのプライマーの増幅位置を示す図である。
【図19】継代３からのｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターにおいて組換えが生じたことをＰＣＲによって確認する図である。
【図20】ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターにおいて組換えが起こるかどうかを確認するためのプライマーの増幅位置を示す図である。
【図21】ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターにおいて組換えが起こらなかったことをＰＣＲによって確認する図である。
【図22】ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ及びｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの概略図である。
【図23】ＴＫを導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターとｈＣＤ１９ｔを導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターで組換えが生じなかったことをＰＣＲによって確認する図である。
【図24】ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの概略図である。
【図25】ｈｏｐｔ－ｙＣＤを導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクター及びｈＣＤ１９ｔを導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターで組換えが生じなかったことをＰＣＲで確認した図である。
【図26】ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの概略図である。
【図27】ｍＧＭ－ＣＳＦが導入されたｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクター及びｈＣＤ１９ｔが導入されたｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターにおいて組換えが生じなかったことをＰＣＲによって確認する図である。
【図28】ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターの概略図である。
【図29】ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＧＭ－ＣＳＦベクターの複製が構造不安定性のために完全には起こらなかったことをＰＣＲによって確認する図である。
【図30】ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターの概略図である。
【図31】ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの概略図である。
【図32】ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦが導入されたｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクター及びウイルス複製中にｈＣＤ１９が導入されたｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターにおいて組換えが起こらなかったことをＰＣＲによって確認する図である。
【図33】ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦが導入されたｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクター及びウイルス複製中にｈＣＤ１９ｔが導入されたｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターにおいて組換えが起こらなかったことをＰＣＲによって確認する図である。
【発明の詳細な説明】
【0029】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0030】
本発明は、ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）のＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ又はＭＣＭＶプロモータ、及び第１の治療用遺伝子を含む第１の組換え発現ベクターと、ウイルスのＥｎｖ遺伝子、ＭＣＭＶプロモータ及び第２の治療用遺伝子を含有する第２の組換え発現ベクターと、を含む、組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを提供する。
【0031】
ＭＣＭＶプロモータは、配列番号３で表される塩基配列を有する６４６ｂｐのポリヌクレオチドである。
【0032】
ＭＣＭＶプロモータは、マウスサイトメガロウイルスのプロモータであり、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ＩＥ遺伝子のプロモータよりも特定の細胞で数倍から数十倍高い発現を誘導し（Ｌａｆｅｍｉｎａ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，６９，３５５－３７４（１９８８））、様々な細胞で均一に安定した発現を誘導することが知られている（Ａｉｂａ－Ｍａｓａｇｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５４，７３５－７４３（１９９９））。特に、主要前初期プロモータ（ＭＩＥＰ）部位の上流領域が除去されたＭＣＭＶプロモータは、霊長類及びマウス細胞において非常に強い発現を誘導することが報告されている（Ｋｉｍ及びＲｉｓｓｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，２３９－２４８（１９９３）；並びにＫｉｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０３，１１５２－１１５９（１９９４）。
【0033】
しかしながら、４つの位置のＭＣＭＶプロモータ中の反復塩基配列のために、ＭＣＭＶプロモータから始まる他の部位のウイルスベクター塩基配列が失われるか、又は塩基配列の一部がプロモータ内で失われ、組換えが生じ、治療用遺伝子が失われ、治療用遺伝子を連続的に発現するレトロウイルスベクターウイルスの産生及び感染において大きな問題を引き起こす。
【0034】
したがって、組換えの発生を最小限に抑えるために、ＭＣＭＶプロモータは、切断型ＭＣＭＶプロモータであることを特徴とする。
【0035】
切断型ＭＣＭＶプロモータは、配列番号４、５、６及び７で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる群から選択される任意の１つであり得、好ましくは配列番号５、６及び７で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる群から選択される任意の１つであり得、より好ましくは配列番号６又は７で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドであり得、最も好ましくは配列番号７で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドであり得る。
【0036】
本発明の特定の実施形態では、ＭＣＭＶプロモータ全長配列、ＧａＬＶ ｅｎｖ及び酵母シトシンデアミナーゼタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター（ｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤ）、並びにＭＣＭＶプロモータ全長配列、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子及びチミジンキナーゼ（ＴＫ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター（ｓＲＲＶｇｐ－ＴＫ）において、ＭＣＭＶプロモータ中の反復塩基配列に起因して遺伝子組換えが起こることが確認された（図１～６）。
【0037】
ｓＥＦ１α（短鎖伸長因子１α）プロモータは、配列番号１８で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【0038】
ウイルスＥｎｖ遺伝子は、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、両種指向性ＭｕＬＶ、異種ＭｕＬＶ、ネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及び麻疹ウイルス（ＭＶ）Ｅｎｖ遺伝子からなる群に由来するいずれか１つである。ポリヌクレオチドは、上記の特徴を有するバリアントを含み得る。
【0039】
ＧａＬＶ Ｅｎｖ遺伝子は、配列番号１９で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【0040】
ＭｕＬＶ Ｅｎｖ遺伝子は、配列番号２０で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【0041】
第１の治療用遺伝子又は第２の治療用遺伝子は、プロドラッグの投与により癌細胞の自殺を誘発する自殺遺伝子、免疫応答を促進するインターロイキン－１２又はＧＭ－ＣＳＦ等のサイトカイン遺伝子、ＣＤ１９、ＣＥＡ、ＨＥＲ２等の腫瘍特異的癌抗原遺伝子からなる群から選択されるいずれか１つであり得る。
【0042】
自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子又は酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子であり得る。
【0043】
第１治療用遺伝子及び第２治療用遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子及びヒトＣＤ１９遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである。
【0044】
チミジンキナーゼ遺伝子は、配列番号２１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、チミジンキナーゼタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリ塩基配列だけでなく、ポリヌクレオチドと実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチド及びその断片を含むことができる。実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドと８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上の相同性を有することができる。上述の通り、本発明のポリヌクレオチドは、それと同等の活性を有するタンパク質をコードする限り、１つ以上の塩基配列が置換、欠失、又は挿入されたバリアントを含むことができる。
【0045】
酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子は、配列番号２２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【0046】
シトシンデアミナーゼ遺伝子は、ヒトコドンで最適化された遺伝子であり得る。
【0047】
本明細書で使用される「ヒトコドンで最適化」という用語は、ＤＮＡが宿主細胞内で転写され、タンパク質に翻訳される場合、アミノ酸を指定するコドンの間に宿主に応じて好ましいコドンがあり、それらがヒトコドンで置換されて、核酸によってコードされるアミノ酸又はタンパク質の発現効率を高めることを意味する。
【0048】
チミジンキナーゼ遺伝子又は酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子は、前駆体薬物を活性化する。前駆体薬物は、ガンシクロビル（ＧＣＶ）及び５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）からなる群から選択される少なくとも１つである。本発明の一実施形態では、チミジンキナーゼ遺伝子はガンシクロビルを活性化することができ、酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子は５－フルオロシトシンを活性化することができる。
【0049】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）は、ヒトコドンで最適化されたものであり得る。
【0050】
本明細書で使用される「ヒトコドンで最適化」という用語は、ＤＮＡが宿主細胞内で転写され、タンパク質に翻訳される場合、アミノ酸を指定するコドンの間に宿主に応じて好ましいコドンがあり、それらがヒトコドンで置換されて、核酸によってコードされるアミノ酸又はタンパク質の発現効率を高めることを意味する。
【0051】
ヒトＣＤ１９（分化抗原群１９）遺伝子は、細胞質ドメインのアミノ酸が除去される短縮型ヒトＣＤ１９遺伝子であり得、細胞質ドメインの２３３個のアミノ酸が除去され得る。
【0052】
ヒトＣＤ１９遺伝子は、配列番号４３又は５３で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【0053】
ｇａｇ遺伝子は、レトロウイルスコアを構成する４種類のタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。一方、ｐｏｌ遺伝子はレトロウイルス逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドであり、ｅｎｖ遺伝子はレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【0054】
ＭｕＬＶ－Ｇａｇ遺伝子は、マウス白血病ウイルスのＧａｇ遺伝子であり、配列番号２３で表される塩基配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。ＭｕＬＶ－Ｐｏｌ遺伝子は、マウス白血病ウイルスのＰｏｌ遺伝子であり、配列番号２４で表される塩基配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。ＭｕＬＶ Ｇａｇ－Ｐｏｌ遺伝子は、配列番号２３及び２４で表される塩基配列が融合した塩基配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。
【0055】
本明細書で使用される「複製可能」という用語は、特定の遺伝子を含むウイルスゲノムが動物細胞又は特定の遺伝子を含むウイルスベクターで形質導入又は感染された細胞において、ウイルスベクターがそれ自体を複製することができることを意味する。
【0056】
本明細書で使用される場合、「複製型レトロウイルスベクター」とは、非溶菌性ウイルスを産生するベクターであり、核膜の亀裂を通って核内に入るため、分裂中の細胞、すなわち癌細胞に特異的に感染することができ、したがって挿入された遺伝子が他の正常細胞で発現することを防ぐことができる。したがって、ベクターは、癌細胞に遺伝子を安全に送達することができ、ウイルスを複製することができるため、遺伝子送達効率を高めることができる。
【0057】
本発明の具体的な実施形態において、４７０ｂｐ、３３７ｂｐ、２３７ｂｐ、及び１６０ｂｐのサイズをそれぞれ有する４つの切断型ＭＣＭＶプロモータを、組換えを最小限に抑えるためにＭＣＭＶプロモータ中の反復塩基配列を除去することによって調製した（表２）。更に、切断型ＭＣＭＶプロモータを導入した、ＧａＬＶ ｅｎｖ系ベクター（ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）及びＭｕＬＶ系ベクター（ｓＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）を構築し、チミジンキナーゼタンパク質を発現するベクターとともに導入したベクターとしてｇａｇ－ｐｏｌ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ発現酵母シトシンデアミナーゼタンパク質から構成されるｓＲＲＶｅ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターを構築し（図７、８）、続いて組換えの発生を確認した。その結果、ｓＲＲＶｅ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターでは組換えが起こらず（図９参照）、ＭＣＭＶプロモータ内の反復配列の大部分が除去されたｓｐＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターでは組換えがほとんど起こらないことが確認された（図１０、図１１及び図１３）。更に、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤと、ｓＲＲＶｅ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターのｓＥＦ１αをＭＣＭＶのＦ４短縮型プロモータで置換したベクターとの組み合わせであっても組換えが生じないことが確認された（図１４参照）。また、ヒトＣＤ１９遺伝子を治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターにおいて組換えが生じないことが確認された（図２０及び図２１参照）。また、ヒトＣＤ１９遺伝子の細胞質ドメインの短縮型アミノ酸を有するｈＣＤ１９ｔを治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターにおいても組換えが生じないことが確認された（図２３及び図２５参照）。また、マウスＧＭ－ＣＳＦを治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクターでも組換えが生じないことが確認された（図２７参照）。また、コドン最適化ヒトＧＭ－ＣＳＦを治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクターでは組換えが生じないことが確認された（図３２及び図３３参照）。
【0058】
したがって、本発明のベクターにおける組換えの発生が最小限に抑えられるため、治療用遺伝子を欠損なく安定に発現させるために有用に用いることができる。
【0059】
本発明はまた、ベクターを含む組換えレトロウイルスを提供する。一方、ＭｕＬＶのＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ又はＭＣＭＶプロモータ、及び第１治療用遺伝子を含む第１組換え発現ベクターと、ウイルスのＥｎｖ遺伝子、ＭＣＭＶプロモータ及び第２の治療用遺伝子を含有する第２の組換え発現ベクターと、は、それぞれ又は一緒に組換えレトロウイルスに含まれ得る。
【0060】
本発明の具体的な実施形態において、４７０ｂｐ、３３７ｂｐ、２３７ｂｐ、及び１６０ｂｐのサイズをそれぞれ有する４つの切断型ＭＣＭＶプロモータを、組換えを最小限に抑えるためにＭＣＭＶプロモータ中の反復塩基配列を除去することによって調製した（表２）。更に、切断型ＭＣＭＶプロモータを導入した、ＧａＬＶ ｅｎｖ系ベクター（ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）及びＭｕＬＶ系ベクター（ｓＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）を構築し、チミジンキナーゼタンパク質を発現するベクターとともに導入したベクターとしてｇａｇ－ｐｏｌ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ発現酵母シトシンデアミナーゼタンパク質から構成されるｓＲＲＶｅ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターを構築し（図７、８）、続いて組換えの発生を確認した。その結果、ｓＲＲＶｅ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターでは組換えが起こらず（図９参照）、ＭＣＭＶプロモータ内の反復配列の大部分が除去されたｓｐＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターでは組換えがほとんど起こらないことが確認された（図１０、図１１及び図１３）。更に、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤと、ｓＲＲＶｅ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターのｓＥＦ１αをＭＣＭＶのＦ４短縮型プロモータで置換したベクターとの組み合わせであっても組換えが生じないことが確認された（図１４参照）。また、ヒトＣＤ１９遺伝子を治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターにおいて組換えが生じないことが確認された（図２０及び図２１参照）。また、ヒトＣＤ１９遺伝子の細胞質ドメインの短縮型アミノ酸を有するｈＣＤ１９ｔを治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターにおいても組換えが生じないことが確認された（図２３及び図２５参照）。また、マウスＧＭ－ＣＳＦを治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクターでも組換えが生じないことが確認された（図２７参照）。また、コドン最適化ヒトＧＭ－ＣＳＦを治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクターでは組換えが生じないことが確認された（図３２及び図３３参照）。
【0061】
したがって、本発明のベクターにおける組換えの発生が最小限に抑えられるため、治療用遺伝子を欠損なく安定に発現させるために有用に用いることができる。
【0062】
本発明はまた、組換えレトロウイルスでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【0063】
宿主細胞は、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、ヒト２９３Ｔ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣａｐＴ細胞（ヒト羊水由来細胞）、ＣＯＳ細胞、イヌＤ１７細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、レトロウイルスパッケージング細胞、ヒト間葉系幹細胞、又はネコＰＧ４細胞であり得る。
【0064】
トランスフェクションは、組換えレトロウイルスベクタープラスミドで形質導入された細胞で産生された組換えウイルスを上記細胞に感染させることによって行われる。
【0065】
トランスフェクションは、当該分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、リポフェクタミン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム媒介性トランスフェクション法、ＤＥＡＥ－デキストラン処理法及び遺伝子ボンバードメント法からなる群より選択される１つ又は複数の方法により行うことができる。本発明の一態様において、トランスフェクションはリポフェクタミン法により行うことができる。
【0066】
トランスフェクト細胞は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を用いて培養することができる。例えば、培地は、イーグルＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、イスコフＭＥＭ、培地１９９、ＣＭＲＬ１０６６、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ１２、Ｆ１０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ及びＦ１２の混合培地、Ｗａｙ－ｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ及びＭＣＤＢシリーズ培地からなる群から選択される少なくとも１つであり得る。本発明の一実施形態では、培地はＤＭＥＭであり得る。
【0067】
本発明はまた、組換えレトロウイルスを有効成分として含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【0068】
一方、ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）のＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ及び酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子を含む第１の組換え発現ベクター；及びウイルスのＥｎｖ遺伝子、ＭＣＭＶプロモータ及びチミジンキナーゼ遺伝子を含む第２の組換え発現ベクターは、それぞれ又は一緒に組換えレトロウイルスに含まれ得る。
【0069】
レトロウイルスは、任意の分裂細胞を標的とすることができ、具体的には、細胞は癌細胞であり得る。癌細胞は、粘液細胞癌腫、円形細胞癌腫、局所進行腫瘍、転移性癌、ユーイング肉腫、癌転移、リンパ転移、扁平上皮癌腫、食道扁平上皮癌腫、口腔癌腫、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、流出リンパ腫（セリアックリンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌、小細胞肺癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ産生腫瘍、非小細胞肺癌、乳癌、小細胞癌腫、乳管癌腫、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸新生物に関連するポリープ、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌、原発性表在膀胱腫瘍、膀胱の浸潤性転移性細胞膀胱癌腫、筋肉浸潤性膀胱癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、食道癌、卵巣癌腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、原発性腹膜上皮新生物、子宮頸癌腫、膣癌、外陰癌、子宮癌、濾胞性固形腫瘍、精巣癌、陰茎癌、腎細胞癌腫、脳癌、頭頸部癌、神経芽細胞腫、脳幹神経膠腫、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞浸潤、骨腫、骨肉腫、悪性黒色腫、ヒト皮膚角化細胞の腫瘍進行、扁平上皮癌腫、甲状腺癌、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆のう癌、絨毛性腫瘍、血管周皮腫、又はカポジ肉腫等の癌に由来する細胞を含み得る。
【0070】
本発明の具体的な実施形態では、ＧａＬＶ ｅｎｖ系ベクター（ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ、及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）及びＭｕＬＶ系ベクター（ｓＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ、及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）において、治療用遺伝子として使用されるチミジンキナーゼ及び酵母シトシンデアミナーゼが安定に発現し、治療用遺伝子がプロドラッグＧＣＶ及び５－ＦＣに作用することによって、細胞を死滅させることが確認された。
【0071】
したがって、本発明のベクターを含む組換えレトロウイルスは、癌の予防又は治療に有効に利用することができる。
【0072】
本発明の医薬組成物は、非経口製剤として製剤化することができる。非経口投与用の製剤は、滅菌水溶液、水不溶性賦形剤、懸濁液及びエマルジョン等の注射剤を含み得る。
【0073】
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能なエステルは、水不溶性賦形剤及び懸濁液として使用することができる。
【0074】
非経口投与は、皮膚外用、腹腔内注射、直腸注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、及び胸部内注射からなる群から選択される方法によって行うことができる。
【0075】
本発明の組成物は、薬学的有効量で投与することができる。有効量は、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する患者の感受性、投与時間、投与経路、治療期間、同時に使用されている薬物等に応じて決定され得る。本発明の組成物は、単独で、又は他の治療剤と組み合わせて投与することができる。併用投与では、投与は連続的又は同時であり得る。
【0076】
組成物の有効用量は、組換えウイルスの場合では、体重１ｋｇ当たり１０１１～１０１３個のウイルス粒子（１０８～１０１０ＩＵ）／ｋｇ、細胞の場合では、１０３～１０６細胞／ｋｇであり、単回投与として実行される。
【0077】
本発明の医薬組成物は、組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを、組成物の総重量に対して、有効成分として、１０重量％～９５重量％含有することができる。更に、本発明の医薬組成物は、上記の有効成分に加えて、同一又は同様の機能を発揮する少なくとも１種の有効成分を更に含むことができる。
【0078】
本発明はまた、組換えレトロウイルスを含む、癌を治療するための遺伝子送達組成物を提供する。
【0079】
一方、ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）のＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ又はＭＣＭＶプロモータ、及び第１治療用遺伝子を含む第１組換え発現ベクターと、ウイルスのＥｎｖ遺伝子、ＭＣＭＶプロモータ及び第２の治療用遺伝子を含有する第２の組換え発現ベクターと、は、それぞれ又は一緒に組換えレトロウイルスに含まれ得る。
【0080】
癌には、上記のように癌が含まれ得る。
【0081】
本明細書で使用される「遺伝子送達組成物」という用語は、遺伝子を標的細胞に移入することができる組成物を指す。
【0082】
本発明の具体的な実施形態では、ＧａＬＶ ｅｎｖ系ベクター（ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ、及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）及びＭｕＬＶ系ベクター（ｓＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ、及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）において、治療用遺伝子として使用されるチミジンキナーゼ及び酵母シトシンデアミナーゼが安定に発現し、治療用遺伝子がプロドラッグＧＣＶ及び５－ＦＣに作用することによって、細胞を死滅させることが確認された。
【0083】
したがって、本発明によるベクターを含む組換えレトロウイルスは、癌治療のための遺伝子の送達に有効に利用することができる。
【0084】
更に、本発明は、組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを調製するための方法であって、以下の工程
１）ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）のＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ又はＭＣＭＶプロモータ、及び第１の治療用遺伝子を含む第１の組換え発現ベクターを調製する工程と、
２）ウイルスのＥｎｖ遺伝子と、ＭＣＭＶプロモータと、第２の治療用遺伝子とを含む第２の組換え発現ベクターを調製する工程と、
を含む。
１）ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）のＧａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、ｓＥＦ１αプロモータ又はＭＣＭＶプロモータ、及び第１の治療用遺伝子を含む第１の組換え発現ベクターを調製する工程と、
２）ウイルスのＥｎｖ遺伝子と、ＭＣＭＶプロモータと、第２の治療用遺伝子とを含む第２の組換え発現ベクターを調製する工程と、
を含む。
【0085】
ベクターは、上述した特徴を有する。例えば、ＭＣＭＶプロモータは、配列番号３、４、５、６及び７で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる群から選択され、ｓＥＦ１αプロモータは、配列番号１８で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、ウイルスのＥｎｖ遺伝子は、配列番号１９又は２０で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【0086】
更に、第１治療用遺伝子及び第２治療用遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子及びヒトＣＤ１９遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである。
【0087】
チミジンキナーゼ遺伝子は配列番号２１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）遺伝子は配列番号２２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、ヒトＣＤ１９遺伝子は配列番号４３で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【0088】
チミジンキナーゼ遺伝子は前駆体薬物ガンシクロビルを活性化することができ、シトシンデアミナーゼ遺伝子は前駆体薬物５－フルオロシトシンを活性化することができる。
【0089】
本発明の具体的な実施形態において、４７０ｂｐ、３３７ｂｐ、２３７ｂｐ、及び１６０ｂｐのサイズをそれぞれ有する４つの切断型ＭＣＭＶプロモータを、組換えを最小限に抑えるためにＭＣＭＶプロモータ中の反復塩基配列を除去することによって調製した（表２）。更に、切断型ＭＣＭＶプロモータを導入した、ＧａＬＶ ｅｎｖ系ベクター（ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）及びＭｕＬＶ系ベクター（ｓＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）を構築し、チミジンキナーゼタンパク質を発現するベクターとともに導入したベクターとしてｇａｇ－ｐｏｌ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ発現酵母シトシンデアミナーゼタンパク質から構成されるｓＲＲＶｅ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターを構築し（図７、８）、続いて組換えの発生を確認した。その結果、ｓＲＲＶｅ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターでは組換えが起こらず（図９参照）、ＭＣＭＶプロモータ内の反復配列の大部分が除去されたｓｐＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターでは組換えがほとんど起こらないことが確認された（図１０、図１１及び図１３）。ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤと、ｓＲＲＶｅ－ｓＥＦ１α－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターのｓＥＦ１αをＭＣＭＶのＦ４短縮型プロモータで置換したベクターとの組み合わせであっても組換えが生じないことも確認された（図１４参照）。また、ヒトＣＤ１９遺伝子を治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターにおいて組換えが生じないことが確認された（図２０及び図２１参照）。また、ヒトＣＤ１９遺伝子の細胞質ドメインの短縮型アミノ酸を有するｈＣＤ１９ｔを治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターにおいても組換えが生じないことが確認された（図２３及び図２５参照）。また、マウスＧＭ－ＣＳＦを治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクターでも組換えが生じないことが確認された（図２７参照）。また、コドン最適化ヒトＧＭ－ＣＳＦを治療用遺伝子として導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクターでは組換えが生じないことが確認された（図３２及び図３３参照）。
【0090】
したがって、本発明の製造方法により調製されたベクターにおける組換えの発生が最小限に抑えられるため、治療用遺伝子を欠損なく安定に発現させるために有用に使用され得る。
【実施例】
【0091】
以下、本発明を実施例に従って詳細に説明する。
【0092】
しかし、以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の内容がこれらに限定されるものではない。
【0093】
＜実施例１＞複製型レトロウイルスベクターの構築
＜１－１＞ウイルスベクターの作製
ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が単一のゲノムに合成される従来のＲＲＶベクターに１．３ｋｂより大きい外来遺伝子を挿入すると、ゲノムサイズが大きくなり、ベクター構造が不安定になるため、インタクトな形態のウイルスベクターを増殖させることができない。したがって、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子がそれぞれ独立したベクターで発現されるように２つのベクターを構築した。このとき、ｅｎｖを、哺乳動物の感染に対して優しいＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）のｅｎｖ遺伝子、又は霊長類の感染に対して優しいＧａＬＶ（テナガザル白血病ウイルス）のｅｎｖ遺伝子で置換した。治療用遺伝子として、ｇａｇ－ｐｏｌベクターにＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）遺伝子を、ＧａＬＶ－ｅｎｖベクターにｙＣＤ（酵母シトシンデアミナーゼ）遺伝子をそれぞれクローニングし、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモータを遺伝子発現制御用プロモータとしてベクターを構築した。
＜１－１＞ウイルスベクターの作製
ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が単一のゲノムに合成される従来のＲＲＶベクターに１．３ｋｂより大きい外来遺伝子を挿入すると、ゲノムサイズが大きくなり、ベクター構造が不安定になるため、インタクトな形態のウイルスベクターを増殖させることができない。したがって、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子がそれぞれ独立したベクターで発現されるように２つのベクターを構築した。このとき、ｅｎｖを、哺乳動物の感染に対して優しいＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）のｅｎｖ遺伝子、又は霊長類の感染に対して優しいＧａＬＶ（テナガザル白血病ウイルス）のｅｎｖ遺伝子で置換した。治療用遺伝子として、ｇａｇ－ｐｏｌベクターにＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）遺伝子を、ＧａＬＶ－ｅｎｖベクターにｙＣＤ（酵母シトシンデアミナーゼ）遺伝子をそれぞれクローニングし、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモータを遺伝子発現制御用プロモータとしてベクターを構築した。
【0094】
具体的には、以下のようにしてウイルスベクターを構築した。
【0095】
１．ｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤ ｅｎｖベクター（配列番号２５）：（図１）
予め構築したｓｐＲＲＶｅＭＣＭＶ－ＭＣＳ（ＧａＬＶＥｎｖ－ＭＣＭＶ－ＭＣＳ－３’－ＬＴＲ）ベクターのＭＣＳ（マルチクローニングサイト）に存在するＰｍｅＩを切断し、ＣＩＡＰで処理して、短縮型ベクターの両端を平滑末端の形態で調製した。ｙＣＤを挿入したｐｃＤＮＡ－ｙＣＤベクターをＸｈｏＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化してｙＣＤ遺伝子を回収した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理してベクターの両端を平滑末端に形態に調製した。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｓｐＲＲＶｅＭＣＭＶ（ＰｍｅＩ、ＣＩＡＰ）ベクターとｙＣＤ（ＸｈｏＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ）とを連結して、ｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤを作製した。
予め構築したｓｐＲＲＶｅＭＣＭＶ－ＭＣＳ（ＧａＬＶＥｎｖ－ＭＣＭＶ－ＭＣＳ－３’－ＬＴＲ）ベクターのＭＣＳ（マルチクローニングサイト）に存在するＰｍｅＩを切断し、ＣＩＡＰで処理して、短縮型ベクターの両端を平滑末端の形態で調製した。ｙＣＤを挿入したｐｃＤＮＡ－ｙＣＤベクターをＸｈｏＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化してｙＣＤ遺伝子を回収した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理してベクターの両端を平滑末端に形態に調製した。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｓｐＲＲＶｅＭＣＭＶ（ＰｍｅＩ、ＣＩＡＰ）ベクターとｙＣＤ（ＸｈｏＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ）とを連結して、ｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤを作製した。
【0096】
２．ｓＲＲＶｇｐ－ＴＫ：ｇａｇ－ｐｏｌベクター（配列番号２６）：（図１）
プロモータ及び導入遺伝子を含まないｓＲＲＶｇｐ（レトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌを含むベクター）ベクターを構築した。次いで、ｇａｇ－ｐｏｌと３’－ＬＴＲとの間のＥｃｏＲＩ部位にＭＣＭＶ－ＴＫを導入した。ｓＲＲＶｇｐ－ＴＫは、１つのクローニングプロセスで完了することができなかったので、最初にＭＣＭＶをクローニングし、次いで、ＴＫをＭＣＭＶ下で導入して、最終生成物であるｓＲＲＶｇｐ－ＴＫを完成させた。方法は以下の通りである。
プロモータ及び導入遺伝子を含まないｓＲＲＶｇｐ（レトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌを含むベクター）ベクターを構築した。次いで、ｇａｇ－ｐｏｌと３’－ＬＴＲとの間のＥｃｏＲＩ部位にＭＣＭＶ－ＴＫを導入した。ｓＲＲＶｇｐ－ＴＫは、１つのクローニングプロセスで完了することができなかったので、最初にＭＣＭＶをクローニングし、次いで、ＴＫをＭＣＭＶ下で導入して、最終生成物であるｓＲＲＶｇｐ－ＴＫを完成させた。方法は以下の通りである。
【0097】
ｓＲＲＶｇｐのｇａｇ－ｐｏｌ及び３’－ＬＴＲ間のＥｃｏＲＩ部位にＭＣＭＶをクローニングするために、ＭＣＭＶプロモータをＰＣＲによって増幅した。
ＭＣＭＶ－Ｆ－ＥｃｏＲＩ：５’－ｃｇＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＧＧＡ－３’（配列番号４７）
ＭＣＭＶ－Ｒ－ＰｍｅＩ－ＥｃｏＲＩ：５’－ｃｇＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＧＣＧＴＴＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡ－３’（配列番号４８）増幅したＭＣＭＶプロモータ産物をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ及びＣＩＡＰで処理することによってｓＲＲＶｇｐベクターを回収した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結してｓＲＲＶｇｐＭＣＭＶを完成させた。次いで、ｓＲＲＶｇｐＭＣＭＶベクターのＰｍｅＩサイトにＴＫ遺伝子をクローニングするために、ＰＣＲでＴＫ遺伝子を増幅してＰｍｅＩを含めた。
ＴＫ－Ｆ－ＰｍｅＩ：５’－ｃｇＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＣＧＴＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＣ－３’（配列番号４９）
ＴＫ－Ｒ－ＰｍｅＩ：５’－ＣＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣ－３’（配列番号５０）ＰｍｅＩ及びＣＩＡＰで処理することにより、ｓＲＲＶｇｐＭＣＭＶを回収し、ＴＫ遺伝子をＰｍｅＩで消化し回収した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと連結して最終産物ｓＲＲＶｇｐ－ＴＫを構築した。
ＭＣＭＶ－Ｆ－ＥｃｏＲＩ：５’－ｃｇＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＧＧＡ－３’（配列番号４７）
ＭＣＭＶ－Ｒ－ＰｍｅＩ－ＥｃｏＲＩ：５’－ｃｇＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＧＣＧＴＴＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡ－３’（配列番号４８）増幅したＭＣＭＶプロモータ産物をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ及びＣＩＡＰで処理することによってｓＲＲＶｇｐベクターを回収した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結してｓＲＲＶｇｐＭＣＭＶを完成させた。次いで、ｓＲＲＶｇｐＭＣＭＶベクターのＰｍｅＩサイトにＴＫ遺伝子をクローニングするために、ＰＣＲでＴＫ遺伝子を増幅してＰｍｅＩを含めた。
ＴＫ－Ｆ－ＰｍｅＩ：５’－ｃｇＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＣＧＴＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＣ－３’（配列番号４９）
ＴＫ－Ｒ－ＰｍｅＩ：５’－ＣＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣ－３’（配列番号５０）ＰｍｅＩ及びＣＩＡＰで処理することにより、ｓＲＲＶｇｐＭＣＭＶを回収し、ＴＫ遺伝子をＰｍｅＩで消化し回収した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと連結して最終産物ｓＲＲＶｇｐ－ＴＫを構築した。
【0098】
＜１－２＞ウイルス産生
ＭＣＭＶプロモータの制御下で治療用遺伝子が発現する複製型レトロウイルスベクターの感染性及び組換え型を確認するため、実施例＜１－１＞で構築したベクターを用いて、図２の模式図に示す手順でウイルスを作製した。
ＭＣＭＶプロモータの制御下で治療用遺伝子が発現する複製型レトロウイルスベクターの感染性及び組換え型を確認するため、実施例＜１－１＞で構築したベクターを用いて、図２の模式図に示す手順でウイルスを作製した。
【0099】
具体的には、実施例＜１－１＞で作製したベクターを２９３Ｔ細胞に一過性に形質導入することによりウイルスを作製し、脳腫瘍細胞株Ｕ８７ＭＧに２Ｅ７ｇｃ（ゲノムコピー）のウイルスで感染させた。最初の感染の３日後、培養上清を採取し、新しいＵ８７ＭＧに再感染させ、感染したＵ８７ＭＧ細胞株を回収し、ゲノムＤＮＡを単離した。
【0100】
＜１－３＞ｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤ：ｅｎｖベクターの組換えの確認
遺伝子治療用複製型レトロウイルスベクターは、導入された外来遺伝子によりゲノムＲＮＡのサイズが大きくなり、非相同配列が付加されるため、組換えを起こす可能性が高い。したがって、遺伝子治療のための効率的かつ安定な複製型レトロウイルスベクターを構築するためには、発生段階における組換えの存在及び程度を確認することが非常に重要である。実施例＜１－２＞で作製したウイルスから抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ウイルスの増殖及び感染が進んでいるか、及びウイルス感染後の増幅プロセスで組換えが起こったかを確認するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
遺伝子治療用複製型レトロウイルスベクターは、導入された外来遺伝子によりゲノムＲＮＡのサイズが大きくなり、非相同配列が付加されるため、組換えを起こす可能性が高い。したがって、遺伝子治療のための効率的かつ安定な複製型レトロウイルスベクターを構築するためには、発生段階における組換えの存在及び程度を確認することが非常に重要である。実施例＜１－２＞で作製したウイルスから抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ウイルスの増殖及び感染が進んでいるか、及びウイルス感染後の増幅プロセスで組換えが起こったかを確認するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【0101】
具体的には、ｅｎｖベクターを特異的に増幅可能な下記表１に記載のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。図３に示すように、ｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤ：ｅｎｖベクターについて、ＧａＬＶ ｅｎｖ及び３’末端を増幅するプライマーを標的部位として使用してゲノムＤＮＡ ＰＣＲを実施して、遺伝子が予想されるサイズに増幅されたかどうかを確認した。ＰＣＲ反応管に１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１Ｘ反応バッファー、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、０．２ｐｍｏｌフォワードプライマー、０．２ｐｍｏｌリバースプライマー、及び０．２単位のＴａｑポリメラーゼを加え、滅菌蒸留水を加えて最終容量を２０μｌとした。次いで、下記表１に示す条件でＰＣＲを行った後、増幅したＤＮＡを１％アガロースゲルにロードしてＰＣＲ増幅産物を確認し、それによって、ウイルスの感染性及び組換えの有無を確認した。
【表1】
【0102】
その結果、図４に示すように、ｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤ：ｅｎｖベクターのポリメラーゼ連鎖反応を行った結果、初感染３日目及び１～３継代目にＰＣＲ産物が検出され、ウイルスの増殖及び感染が進行していることが確認された。しかし、第２継代から予想される２，３３７ｂｐの増幅産物よりも少ないＰＣＲ産物が多数検出されたことから、ウイルス感染後の増幅過程で組換えが起こったことが確認された。具体的には、第１継代までは単一のＰＣＲバンドしか観察できなかったが、第２継代及び第３継代では、いくつかのＰＣＲバンドが増幅されていることが確認された。
【0103】
＜１－４＞ｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤ：ｅｎｖベクターの組換え型の分析
レトロウイルスは逆転写のプロセスを介して合成されるので、このプロセス中のゲノム配列の不安定性は、様々なタイプの組換えを生じ得る。したがって、実施例＜１－３＞のｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤ：ｅｎｖベクターのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応後に、ｐ２及びｐ３ステージの組換えバンド（図４の赤色のボックスで示されるバンド）のＰＣＲ産物を回収し、遺伝子解析用ｐＧＥＭ－Ｔベクターにクローニングし、クローンを精製し、遺伝子の塩基配列を解析して組換え型を解析した。
レトロウイルスは逆転写のプロセスを介して合成されるので、このプロセス中のゲノム配列の不安定性は、様々なタイプの組換えを生じ得る。したがって、実施例＜１－３＞のｓｐＲＲＶｅ－ｙＣＤ：ｅｎｖベクターのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応後に、ｐ２及びｐ３ステージの組換えバンド（図４の赤色のボックスで示されるバンド）のＰＣＲ産物を回収し、遺伝子解析用ｐＧＥＭ－Ｔベクターにクローニングし、クローンを精製し、遺伝子の塩基配列を解析して組換え型を解析した。
【0104】
結果として、図５に示されるように、ＧａＬＶ ｅｎｖ、ＭＣＭＶプロモータ、ｙＣＤ及び３’－ＬＴＲ配列内で組換えが起こったクローンが、回収されたＰＣＲ産物において確認された。特に、図６に示すＭＣＭＶプロモータ内の４つの反復塩基配列（１．ＡＡＣＡＧＧＡＡＡ、２．ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡ、３．ＴＧＧＧＴＴＴＴＴＣＣ、４．ＧＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡ）によって引き起こされる、ＭＣＭＶプロモータ又はプロモータ内の塩基配列の一部から始まる他の部位でのウイルスベクター塩基配列の喪失に起因して組換えが起こったことが確認された。したがって、ＭＣＭＶプロモータ配列を切除してＭＣＭＶの反復配列を最小化して、組換えを防止し、治療用遺伝子の発現を促進することによって、サイズの異なる４種類のプロモータを設計した。
【0105】
＜実施例２＞組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターの構築
＜２－１＞組換え発生が最小限に抑えられたベクター構築のための短縮型ＭＣＭＶプロモータの調製
ＭＣＭＶプロモータ内の反復配列によって引き起こされる複製型レトロウイルスベクターの組換えを克服するために、切断型ＭＣＭＶプロモータを、ＭＣＭＶプロモータ内の反復配列を除去することによって構築した。
＜２－１＞組換え発生が最小限に抑えられたベクター構築のための短縮型ＭＣＭＶプロモータの調製
ＭＣＭＶプロモータ内の反復配列によって引き起こされる複製型レトロウイルスベクターの組換えを克服するために、切断型ＭＣＭＶプロモータを、ＭＣＭＶプロモータ内の反復配列を除去することによって構築した。
【0106】
具体的には、最初に使用したＭＣＭＶプロモータを反復配列に基づいて約６４６ｂｐ切断することによって、４種類の切断型ＭＣＭＶプロモータを調製した（表２）。次いで、ＭＣＭＶ Ｆ１（４７０ｂｐ）、Ｆ２（３３７ｂｐ）、Ｆ３（２３７ｂｐ）、及びＦ４（１６０ｂｐ）を、この実験室で予め構築されたｓＲＲＶｅ－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－ＴＫの６４６ｂｐ ＭＣＭＶプロモータ部位に導入した。切断型ＭＣＭＶプロモータは、以下の表３に記載の制限酵素部位を含む増幅プライマーを用いたＰＣＲによって得た。
【表2】
【表3】
【0107】
＜２－２＞組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター（ｓｐＲＲＶｅ（ＧａＬＶ）－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ）の構築
ＰｍｅＩ－ＢａｍＨＩで消化した切断型ＭＣＭＶプロモータをｓｐＲＲＶｅ（ＧａＬＶ）－ＴＫのプロモータ部位にクローニングして、ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ（配列番号２７）、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ（配列番号２８）、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ（配列番号２９）、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ（配列番号３０）、及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ（配列番号３１）ベクターを完成させた（図７）。次いで、構築したスプリットデュアルＲＲＶベクターの有効性及び組換えの発生の有無を確認するために、ｓＥＦ１ａプロモータによって調節されるｈｏｐｔ－ｙＣＤを発現するｇａｇ－ｐｏｌベクター（ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ、配列番号３２）の組み合わせでウイルスを合成し、次いでＵ８７ＭＧ細胞に感染させて組換えが発生したかどうかを判定した。
ＰｍｅＩ－ＢａｍＨＩで消化した切断型ＭＣＭＶプロモータをｓｐＲＲＶｅ（ＧａＬＶ）－ＴＫのプロモータ部位にクローニングして、ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ（配列番号２７）、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ（配列番号２８）、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ（配列番号２９）、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ（配列番号３０）、及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ（配列番号３１）ベクターを完成させた（図７）。次いで、構築したスプリットデュアルＲＲＶベクターの有効性及び組換えの発生の有無を確認するために、ｓＥＦ１ａプロモータによって調節されるｈｏｐｔ－ｙＣＤを発現するｇａｇ－ｐｏｌベクター（ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ、配列番号３２）の組み合わせでウイルスを合成し、次いでＵ８７ＭＧ細胞に感染させて組換えが発生したかどうかを判定した。
【0108】
＜２－３＞組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクター（ｓＲＲＶｅ（ＭｕＬＶ）－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ）の構築
ＰｍｅＩ－ＮｏｔＩで消化した切断型ＭＣＭＶプロモータをｓＲＲＶｅ（ＭｕＬＶ）－ＴＫのプロモータ部位にクローニングして、ｓＲＲＶｅ－ＴＫ（配列番号３３）、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ（配列番号３４）、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ（配列番号３５）、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ（配列番号３６）、及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ（配列番号３７）ベクターを完成させた（図８）。次いで、構築したスプリットデュアルＲＲＶベクターの有効性及び組換えの発生の有無を確認するために、ｓＥＦ１ａプロモータによって調節されるｈｏｐｔ－ｙＣＤを発現するｇａｇ－ｐｏｌベクター（ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ）の組み合わせでウイルスを合成し、次いでＵ８７ＭＧ細胞に感染させて組換えが発生したかどうかを判定した。
ＰｍｅＩ－ＮｏｔＩで消化した切断型ＭＣＭＶプロモータをｓＲＲＶｅ（ＭｕＬＶ）－ＴＫのプロモータ部位にクローニングして、ｓＲＲＶｅ－ＴＫ（配列番号３３）、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ（配列番号３４）、ｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ（配列番号３５）、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ（配列番号３６）、及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ（配列番号３７）ベクターを完成させた（図８）。次いで、構築したスプリットデュアルＲＲＶベクターの有効性及び組換えの発生の有無を確認するために、ｓＥＦ１ａプロモータによって調節されるｈｏｐｔ－ｙＣＤを発現するｇａｇ－ｐｏｌベクター（ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ）の組み合わせでウイルスを合成し、次いでＵ８７ＭＧ細胞に感染させて組換えが発生したかどうかを判定した。
【0109】
＜実施例３＞組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターの組換え型（ｓｐＲＲＶｅ（ＧａＬＶ）－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ）の確認
実施例＜２－２＞で構築したベクターの組換え型を、実施例＜１－３＞と同様の様式で確認した。
実施例＜２－２＞で構築したベクターの組換え型を、実施例＜１－３＞と同様の様式で確認した。
【0110】
具体的には、構築したＧａＬＶ ｅｎｖ系ベクター（ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫ、及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ）をｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターと組み合わせて２９３Ｔ細胞にウイルスを合成し、実施例＜１－３＞と同様にして組換え型を解析した。表４に示すＧａＬＶ１９３２Ｆ及びＭＦＧＳａｃＩＲプライマーをｅｎｖベクター特異的増幅に使用し、ｐｏｌ７１３０Ｆ及びＭＦＧＳａｃＩＲプライマーをｇａｇ－ｐｏｌベクター特異的増幅に使用した。
【0111】
その結果、図９に示すように、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲ解析の結果、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクター５セット全てで組換えは生じなかった。一方、ｓｐＲＲＶｅ－ＴＫではｐ１から、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫではｐ４から、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫではｐ５から組換えが起こり始め、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫではｐ１０まで組換えは生じなかった。しかしながら、ｐ６～ｐ１０のＰＣＲ産物中の増幅バンドに加えて、遺伝子配列決定によって下の小さなバンドが確認され、これは、ｇａｇ－ｐｏｌベクターの完全なｈｏｐｔ－ｙＣＤが相互に組み換えられ、ｅｎｖベクターのＴＫ部位に挿入されたことを示す。
【表4】
【0112】
＜実施例４＞組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを含むウイルスでトランスフェクトした細胞におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）及び酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）タンパク質の発現レベル（ｓｐＲＲＶｅ（ＧａＬＶ）－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ）
その後、組換え試験工程で得られたＵ８７ＭＧ細胞におけるチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）及び酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）のタンパク質発現レベルを、ウエスタンブロッティングによって確認した。
その後、組換え試験工程で得られたＵ８７ＭＧ細胞におけるチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）及び酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）のタンパク質発現レベルを、ウエスタンブロッティングによって確認した。
【0113】
具体的には、図２に示されるように、ヒト脳腫瘍細胞株Ｕ８７ＭＧを０．１ＭＯＩのレトロウイルスベクターの組み合わせに感染させ、３日後にウイルス含有細胞培養上清を採取し、新しい脳腫瘍細胞株Ｕ８７ＭＧに順次感染させた。最初の感染の３日後、ｐ１（継代１）～ｐ１０細胞を採取し、１００μｌのＴ－ＰＥＲ組織抽出剤（ＰＩＥＲＣＥ、７８５１０）＋１ｘプロテイナーゼ阻害剤に再懸濁した。その後、３回の凍結融解によって細胞を破壊し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞質上清を回収した。ＢＣＡを用いてタンパク質量を定量した後、２０μｇの細胞溶解物を採取し、ＳＤＳ試料ローディング色素と１％まで混合した。１００℃のヒートブロック中で５分間反応させた後、反応混合物を氷に移し、２分間反応させた。次いで、反応物を１０％（ＴＫ）又は１３．５％（ｙＣＤ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードし、続いて電気泳動した。電気泳動終了後、タンパク質をＮＣ（ニトロセルロース）膜に９０Ｖで２時間転写した後、ブロッキング溶液（１ＸＴＢＳ－Ｔ中５％スキムミルク）に入れ、続いて室温で１時間反応させた。次いで、一次抗体（抗ウサギＴＫ：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚｅ ｓｃ－２８０３８、１：５００希釈、抗ヒツジｙＣＤ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＰＡ１－８５３６５、１：５００、抗マウスｂ－アクチン：ＳｉｇｍａＡ２２２８、１：１０００）を含む１％スキムミルク／１ＸＴＢＳ－Ｔに膜を加え、続いて４℃の冷蔵庫で一晩反応させた。その後、室温で１０分間、１ｘＴＢＳ－Ｔで４回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体と室温で１時間反応させた。次いで、膜を１ｘＴＢＳ－Ｔで室温にて１０分間４回洗浄し、ＥＣＬ（増強された化学発光、Ｂｉｏ－ｒａｄカタログ番号１７０－５０６２）溶液中で反応させた後、化学発光イメージングシステム（ＣｈｅｍｉＤｏｃ，Ｂｉｏｒａｄ ＣＡ）で分析した。
【0114】
その結果、図１０及び図１１に示されるように、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲの結果と一致して、プロモータサイズの縮小に伴ってチミジンキナーゼ（ＴＫ）タンパク質の発現が安定的に継続し、ｇａｇ－ｐｏｌベクター（ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ）中の酵母シトシンジアミナーゼ（ｙＣＤ）タンパク質も連続的に発現していることが確認された。
【0115】
＜実施例５＞チミジンキナーゼ及び酵母シトシンデアミナーゼのプロドラッグ投与による細胞死の確認
実施例＜２－２＞で作製したｓｐＲＲＶｅ（ＧａＬＶ）－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤウイルスのガンシクロビル（ＧＣＶ）及び５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する薬剤感受性を確認した。
実施例＜２－２＞で作製したｓｐＲＲＶｅ（ＧａＬＶ）－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤウイルスのガンシクロビル（ＧＣＶ）及び５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する薬剤感受性を確認した。
【0116】
具体的には、ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２９３Ｔ細胞株にｓｐＲＲＶｅ－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤウイルスを同時トランスフェクトした。２日後、ウイルスの上清を回収し、前日に１．５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに継代したＵ－８７ＭＧ細胞に８μｇ／ｍｌの濃度のウイルス及びポリブランを８時間感染させた。感染の５日後（感染後５ｄ）、細胞上清を採取し、前日（ｐ１）に１．５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートで継代したＵ－８７ＭＧ細胞に再感染させ、次いで同様にしてｐ４まで連続感染させた。感染の各段階の細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで処理して単一細胞とし、１２ウェルプレートで１．５×１０５細胞／ウェルの密度で継代し、継代翌日からそれぞれ３０μｇ／ｍｌのＧＣＶ及び１ｍＭの５－ＦＣを５日間又は８日間処理して細胞死を確認した。
【0117】
その結果、図１２に示すように、プロドラッグである、３０μｇ／ｍｌのガンシクロビル（ＧＣＶ）及び１ｍＭの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）でウイルス感染細胞を処理すると、細胞が死滅することが確認された。
【0118】
＜実施例６＞切断型ＭＣＭＶプロモータを含むＭｕＬＶ ｅｎｖ系ベクターの組換え型の確認
ｓｐＲＶｅ－ｓＥＦ１ａ－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤの組み合わせの組換え発生の解析試験では、ｇａｇ－ｐｏｌベクターにおいて組換えが良好に起こらないことが確認されたが、ｇａｇ－ｐｏｌベクターの完全なｈｏｐｔ－ｙＣＤが相互に組み換えられ、ｅｎｖベクターのＴＫ部位に挿入されていることが確認された。これは、ｇａｇ－ｐｏｌベクターに用いられるプロモータ及びｅｎｖベクターに用いられるプロモータが同じであれば、プロモータ間の相同組換えによって引き起こされる現象であり、治療用遺伝子の発現には影響しない。一方、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫの組み合わせの場合、プロモータ間で非相同組換えが起こり、有効な治療用遺伝子の発現に影響を及ぼす。このような組換えの発生を最小限にするため、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤのｓＥＦ１ａ部位にＦ４プロモータを導入することによってｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤを構築し、実施例＜１－３＞と同様にしてｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶ３ ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの組換え型を確認した。
ｓｐＲＶｅ－ｓＥＦ１ａ－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤの組み合わせの組換え発生の解析試験では、ｇａｇ－ｐｏｌベクターにおいて組換えが良好に起こらないことが確認されたが、ｇａｇ－ｐｏｌベクターの完全なｈｏｐｔ－ｙＣＤが相互に組み換えられ、ｅｎｖベクターのＴＫ部位に挿入されていることが確認された。これは、ｇａｇ－ｐｏｌベクターに用いられるプロモータ及びｅｎｖベクターに用いられるプロモータが同じであれば、プロモータ間の相同組換えによって引き起こされる現象であり、治療用遺伝子の発現には影響しない。一方、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫの組み合わせの場合、プロモータ間で非相同組換えが起こり、有効な治療用遺伝子の発現に影響を及ぼす。このような組換えの発生を最小限にするため、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤのｓＥＦ１ａ部位にＦ４プロモータを導入することによってｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤを構築し、実施例＜１－３＞と同様にしてｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶ３ ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの組換え型を確認した。
【0119】
具体的には、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ＴＫベクターをＥｃｏＲＩで処理してｓＥＦ１ａ－ＴＫを作製し、他の治療用遺伝子をクローニングするための制限酵素認識配列を含む下記の表５に示すＭＣＭＶ（Ｆ４）－ＥｃｏＲＩ－Ｆ及びＭＣＭＶ－ＮｏｔＩ－ＭｌｕＩ－ＥｃｏＲＩ－Ｒプライマーを用いて、ｓｐＲＶｅ－ＴＫを鋳型としてＰＣＲを行ってＭＣＭＶＦ４をクローニングした。その後、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ＴＫ及びＭＣＭＶ Ｆ４ ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、クローニングしてｓＲＲＶｇｐ－ＭＣＭＶ Ｆ４ベクターを構築した。次いで、ｈｏｐｅｔ－ｙＣＤを用いて、表５に示すｈｏｐｅｔ－ｙＣＤ－ＮｏｔＩ－Ｆ及びｈｏｐｅｔ－ｙＣＤ－ＮｏｔＩ－Ｒプライマーを構築し、ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターを鋳型としてＰＣＲを行った。
【表5】
【0120】
その後、ＮｏｔＩ－ＭｌｕＩで処理してｓＲＲＶｇｐ－ＭＣＭＶ Ｆ４ベクター及びｈｏｐｔ－ｙＣＤ ＰＣＲ産物を回収し、クローニングしてｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターを完成させた。構築したＭｕＬＶ ｅｎｖ系ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターをｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターと組み合わせて用いて２９３Ｔ細胞にウイルスを合成し、実施例＜１－３＞と同様に組換え型解析試験を行った。表４に示すＡｍ１８０１Ｆ及びＭＦＧＳａｃＩＲプライマーをｅｎｖベクター特異的増幅に使用し、ｐｏｌ７１３０Ｆ及びＭＦＧＳａｃＩＲプライマーをｇａｇ－ｐｏｌベクター特異的増幅に使用した。
【0121】
その結果、図１３に示すように、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲ解析の結果、ｇａｇ－ｐｏｌベクター５セット全てにおいて組換えは生じなかった。一方、ｓＲＲＶｅ－ＴＫベクターでは、ｐ２から小さいサイズが失われた組換えが起こり始めることが確認された。また、ｓＲＲＶｅ－Ｆ１－ＴＫ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ２－ＴＫではｐ７から、ｓＲＲＶｅ－Ｆ３－ＴＫではｐ８から組換えが起こり始めたことが確認された。一方、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターの組み合わせでは、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫではｐ１０まで組換えは起こらず、ｐ１５まで連続感染しても組換えは起こらなかった（図１４）。
【0122】
すなわち、ＭｕＬＶ ｅｎｖ系ＲＲＶベクターでは、ＭＣＭＶプロモータのサイズが小さくなるにつれて組換え頻度が低下し、ＭＣＭＶプロモータの反復配列の大部分が除去されたｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターでは組換えは生じなかった。したがって、切断型ＭＣＭＶプロモータを含む複製型レトロウイルスベクターは組換えを受けず、したがって治療用遺伝子を標的細胞に損失なく送達できることが確認された。
【0123】
＜実施例７＞組換え発生が最小限に抑えられた複製型レトロウイルスベクターを含むウイルスでトランスフェクトした細胞におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現レベル（ｓＲＲＶｅ（ＭｕＬＶ）－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－ｓＥＦ１ａ－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ）
次いで、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ後の組換え試験工程で得られたＵ８７ＭＧ細胞におけるＴＫタンパク質の発現レベルを、上記実施例４に記載したのと同様の方法及び条件でウエスタンブロッティングにより確認した。ｇａｇ－ｐｏｌベクターにおいて組換えが起こらず、ＴＫタンパク質の発現レベルのみが確認されたことから、ｙＣＤタンパク質が安定に発現していることが確認された。
次いで、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ後の組換え試験工程で得られたＵ８７ＭＧ細胞におけるＴＫタンパク質の発現レベルを、上記実施例４に記載したのと同様の方法及び条件でウエスタンブロッティングにより確認した。ｇａｇ－ｐｏｌベクターにおいて組換えが起こらず、ＴＫタンパク質の発現レベルのみが確認されたことから、ｙＣＤタンパク質が安定に発現していることが確認された。
【0124】
その結果、図１５に示されるように、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲの結果と一致して、プロモータサイズの縮小に伴ってチミジンキナーゼ（ＴＫ）タンパク質の発現が安定的に継続することが確認された。
【0125】
＜実施例８＞チミジンキナーゼ（ＴＫ）及び酵母シトシンデアミナーゼのプロドラッグ投与による細胞死の確認
実施例６で作製したｓＲＲＶｅ（ＭｕＬＶ）－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターを含むウイルスのガンシクロビル（ＧＣＶ）及び５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する薬剤感受性を確認した。
実施例６で作製したｓＲＲＶｅ（ＭｕＬＶ）－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターを含むウイルスのガンシクロビル（ＧＣＶ）及び５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する薬剤感受性を確認した。
【0126】
具体的には、ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶｇｐ－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ１－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ２－ＴＫ、ｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ３－ＴＫ及びｓｐＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ＴＫを含むウイルスを２９３Ｔ細胞株に同時トランスフェクトした。２日後、ウイルスの上清を回収し、前日に１．５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに継代したＵ－８７ＭＧ細胞に８μｇ／ｍｌの濃度のウイルス及びポリブランを８時間感染させた。感染の５日後（感染後５ｄ）、細胞上清を採取し、前日（ｐ１）に１．５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートで継代したＵ－８７ＭＧ細胞に再感染させ、次いで同様にしてｐ４まで連続感染させた。感染の各段階の細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで処理して単一細胞とし、１２ウェルプレートで１．５×１０５細胞／ウェルの密度で継代し、継代翌日からそれぞれ３０μｇ／ｍｌのＧＣＶ及び１ｍＭの５－ＦＣを５日間又は８日間処理して細胞死を確認した。
【0127】
その結果、図１６に示すように、プロドラッグである３０μｇ／ｍｌの（ＧＣＶ）及び１ｍＭの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）でウイルス感染細胞を光学顕微鏡下で処理すると、細胞が死滅したことが確認された。Ｕ８７ＭＧにｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ／ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤウイルスの２Ｅ７ゲノムコピーを７日間感染させた後、３０μｇ／ｍｌのＧＣＶ及び１ｍＭの５－ＦＣを処理して細胞死を定量的に評価した。結果として、ＧＣＶを処理した場合、細胞生存率は感染後４日までに約８０％低下し、感染後１０日間生存した細胞は約１０％しかなく、ＧＣＶが９０％を超える細胞を死滅させたことを示唆した。５－ＦＣを処理した場合、細胞生存率は感染の２日後に約４０％低下し、感染の８日後に生存した細胞は約４０％しかなく、５－ＦＣが細胞の６０％超を死滅させたことを示唆した（図１７）。
【0128】
＜実施例９＞癌抗原遺伝子であるヒトＣＤ１９を導入した、組換え発生が最小限に抑えられた自己複製型レトロウイルスベクターの構築
＜９－１＞ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９／ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの構築及び組換え発生の確認
近年、癌を治療するための免疫療法薬が多く研究されており、実際には、ＣＡＲ－Ｔ等の癌細胞に特異的に発現する抗原を標的とする受容体をウイルスベクターにロードし、送達する免疫療法の方法が開発され、臨床現場で応用されている。これらの免疫療法の方法は、体内の免疫細胞の特性を使用して副作用を可能な限り軽減することができ、患者の身体が癌細胞と戦うように免疫応答を強化することができる。中でも、能動免疫療法は、癌細胞が有する腫瘍特異的抗原を癌患者に投与することにより、免疫系を能動的に活性化させて癌細胞を攻撃するものである。したがって、自己複製するレトロウイルスベクターにヒトＣＤ１９遺伝子を導入し、組換えを最小限にした癌の遺伝子治療用ベクターとして用いた。
＜９－１＞ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９／ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの構築及び組換え発生の確認
近年、癌を治療するための免疫療法薬が多く研究されており、実際には、ＣＡＲ－Ｔ等の癌細胞に特異的に発現する抗原を標的とする受容体をウイルスベクターにロードし、送達する免疫療法の方法が開発され、臨床現場で応用されている。これらの免疫療法の方法は、体内の免疫細胞の特性を使用して副作用を可能な限り軽減することができ、患者の身体が癌細胞と戦うように免疫応答を強化することができる。中でも、能動免疫療法は、癌細胞が有する腫瘍特異的抗原を癌患者に投与することにより、免疫系を能動的に活性化させて癌細胞を攻撃するものである。したがって、自己複製するレトロウイルスベクターにヒトＣＤ１９遺伝子を導入し、組換えを最小限にした癌の遺伝子治療用ベクターとして用いた。
【0129】
具体的には、ｈＣＤ１９バリアント２をｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤのｈｏｐｔ－ｙＣＤ部位にクローニングするために、制限酵素部位を含むＮｏｔＩ－ｈＣＤ１９－ＭｌｕＩ遺伝子を合成した。その後、ｈＣＤ１９及びｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤをそれぞれＮｏｔＩ及びＭｌｕＩで消化し、回収した後、クローニングしてｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクター（配列番号４４）を構築した。図１８に示すように、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ（配列番号３７）及びｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９の組み合わせでウイルスを合成し、ウイルスベクターの力価を定量した。脳腫瘍細胞株Ｕ８７－ＭＧに０．１ＭＯＩのウイルスを感染させた後、細胞を１３回継代し、各継代工程で感染細胞株からゲノムＤＮＡを精製した。その後、表６に示すプライマーを用いてゲノムＤＮＡでＰＣＲを行って、組換えの種類を解析した。
【0130】
【0131】
＜９－２＞ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ／ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターの構築及び組換え発生の確認
実施例＜９－１＞に示すように、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９／ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの組み合わせでは、ウイルス複製中にｈＣＤ１９が挿入されたｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターにおいて組換えが起こることが確認された。その後、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ ｇａｇ－ｐｏｌベクターにより、選択されたウイルス複製中に組換えが起こらないことを確認し、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターのＴＫ遺伝子をｈＣＤ１９で置換したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターを構築した。
実施例＜９－１＞に示すように、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９／ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの組み合わせでは、ウイルス複製中にｈＣＤ１９が挿入されたｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターにおいて組換えが起こることが確認された。その後、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ ｇａｇ－ｐｏｌベクターにより、選択されたウイルス複製中に組換えが起こらないことを確認し、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターのＴＫ遺伝子をｈＣＤ１９で置換したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターを構築した。
【0132】
具体的には、ｈＣＤ１９バリアント２を用いてｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫのＴＫ部位にｈＣＤ１９をクローニングするために、制限酵素部位を含むＮｏｔＩ－ｈＣＤ１９－ＭｌｕＩ遺伝子を合成した。その後、ｈＣＤ１９及びｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ＴＫをＮｏｔＩ及びＭｌｕＩで消化し、回収した後、クローニングしてｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクター（配列番号４５）を構築した。図２０に示すように、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９（配列番号４５）及びｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ（配列番号４６）の組み合わせでウイルスを合成し、ウイルスベクターの力価を定量した。表６に示すプライマーを用いて、ウイルスを０．１ＭＯＩ採取して組換え型解析実験を行った。
【0133】
図２１に示されるように、ＰＣＲを、ｅｎｖベクターの複製及びゲノム安定性を確認することができるプライマーを使用して行った。その結果、ＡｍＥｎｖ９６１Ｆ／ＭＦＧＳａｃＩＲ増幅産物のサイズは３，４６０ｂｐであり、ＡｍＥｎｖ１８０１Ｆ／ＭＦＧＳａｃＩＲ増幅産物のサイズは３，０３０ｂｐであった。更に、ｇａｇ－ｐｏｌベクターの複製及びゲノム安定性を確認できるｐｏｌ７１３０Ｒ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーを用いた増幅産物のサイズは２，０９２ｂｐであった。したがって、ｈＣＤ１９を導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクター及びｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターの組み合わせでは、ウイルス複製中に組換えが起こらないことが確認された。
【0134】
＜実施例１０＞癌抗原遺伝子であるヒトＣＤ１９ｔ（短縮型ヒトＣＤ１９、ｈＣＤ１９ｔ）を導入した、組換え発生が最小限に抑えられた自己複製型レトロウイルスベクターの構築
＜１０－１＞ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの構築及び組換え発生の確認
ＣＤ１９のＮ末端／ＣＡＲ－Ｔ機構に加えて、ＣＤ１９のＣ末端によって起こり得る細胞内シグナル伝達を抑制するために、細胞質ドメインの２３３アミノ酸を除去し、３２３アミノ酸からなる短縮型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）を、自己複製するレトロウイルスベクターに導入して、組換えを最小限に抑えた癌遺伝子治療用ベクターとして使用した。ＣＤ１９ｔは、１９アミノ酸のみを有する細胞外Ｎ末端、膜貫通ドメイン、及び細胞質Ｃ末端からなる。
＜１０－１＞ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの構築及び組換え発生の確認
ＣＤ１９のＮ末端／ＣＡＲ－Ｔ機構に加えて、ＣＤ１９のＣ末端によって起こり得る細胞内シグナル伝達を抑制するために、細胞質ドメインの２３３アミノ酸を除去し、３２３アミノ酸からなる短縮型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）を、自己複製するレトロウイルスベクターに導入して、組換えを最小限に抑えた癌遺伝子治療用ベクターとして使用した。ＣＤ１９ｔは、１９アミノ酸のみを有する細胞外Ｎ末端、膜貫通ドメイン、及び細胞質Ｃ末端からなる。
【0135】
ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターを以下のように構築した。ｈＣＤ１９ｔを確保するために、以下の表７に示すプライマーを用いて、ｈＣＤ１９バリアント２を鋳型として使用してｈＣＤ１９ｔを増幅した。
【表7】
【0136】
クローニングを容易にするために、ＮｏｔＩを５’側に、ＭｌｕＩを３’側に挿入することによってプライマーを調製した。次いで、ｈＣＤ１９ｔをｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターのｈｏｐｔ－ｙＣＤ部位にクローニングするために、ベクターをＮｏｔＩ－ＭｌｕＩで消化し、増幅したｈＣＤ１９ｔをＮｏｔＩ－ＭｌｕＩで消化し、回収し、ベクターに導入して、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクター（配列番号５４）を構築した（図２２）。その後、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫ（配列番号３７）及びｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔの組み合わせでウイルスを合成し、ウイルスベクターの力価を定量した。表６に示すプライマーを用いて、ウイルスを０．１ＭＯＩ採取して組換え型解析実験を行った。その結果、図２３に示すように、ＡｍＥｎｖ９６１Ｆ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクターの増幅産物２，９４６ｂｐ、及びｐｏｌ７１３０Ｒ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの増幅産物２，５９１ｂｐは、ウイルス複製及び再感染中の１２継代まで連続的に増幅されることが確認された。これらの結果は、ウイルス複製及び再感染が１２継代まで継続したことを示している。以上の結果は、ＴＫを導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ＴＫベクター及びｈＣＤ１９ｔを導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの両方が、ウイルス複製中に優れたゲノム安定性を示したことが示唆する。
【0137】
＜１０－２＞ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの構築及び組換え発生の確認
ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターを以下のように構築した。ｈＣＤ１９ｔを確保するために、以下の表８に示すプライマーを用いて、ｈＣＤ１９バリアント２を鋳型として使用してｈＣＤ１９ｔを増幅した。
ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターを以下のように構築した。ｈＣＤ１９ｔを確保するために、以下の表８に示すプライマーを用いて、ｈＣＤ１９バリアント２を鋳型として使用してｈＣＤ１９ｔを増幅した。
【表8】
【0138】
クローニングを容易にするために、ＮｏｔＩを５’側に、ＳａｌＩを３’側に挿入することによってプライマーを調製した。次いで、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターのｈＣＤ１９部位にｈＣＤ１９ｔをクローニングするために、ベクターをＮｏｔＩ－ＳａｌＩで消化し、増幅したｈＣＤ１９ｔをＮｏｔＩ－ＳａｌＩで消化し、回収し、ベクターに導入して、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクター（配列番号５６）を構築した（図２４）。その後、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤ（配列番号４６）及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔの組み合わせでウイルスを合成し、ウイルスベクターの力価を定量した。表６に示すプライマーを用いて、ウイルスを０．１ＭＯＩ採取して組換え型解析実験を行った。その結果、図２５に示すように、ＡｍＥｎｖ９６１Ｆ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの増幅産物２，７６０ｂｐ、及びｐｏｌ７１３０Ｒ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターの増幅産物２，０８９ｂｐが、１２継代まで連続的に増幅されたことが確認された。これらの結果は、ウイルス複製及び再感染が１２継代まで継続したことを示している。以上の結果は、ｈｏｐｔ－ｙＣＤを導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクター及びｈＣＤ１９ｔを導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの両方が、ウイルス複製中に優れたゲノム安定性を示したことが示唆する。
【0139】
＜実施例１１＞顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を導入した組換え発生が最小限に抑えられた自己複製型レトロウイルスベクターの構築
＜１１－１＞ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクターの構築及び組換え発生の確認
マウスＧＭ－ＣＳＦ及びヒトＧＭ－ＣＳＦを以下のように自己複製型レトロウイルスベクターに導入して、治療用遺伝子及び短縮型ｈＣＤ１９をロードした自己複製型レトロウイルスベクターを癌患者に適用した場合の患者の免疫増強を促進した。
＜１１－１＞ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクターの構築及び組換え発生の確認
マウスＧＭ－ＣＳＦ及びヒトＧＭ－ＣＳＦを以下のように自己複製型レトロウイルスベクターに導入して、治療用遺伝子及び短縮型ｈＣＤ１９をロードした自己複製型レトロウイルスベクターを癌患者に適用した場合の患者の免疫増強を促進した。
【0140】
まず、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクターを構築した。マウスＧＭ－ＣＳＦ（ｍＧＭ－ＣＳＦ）を確保するために、構築したｓｐＲＲＶｅ－ｍＧＭ－ＣＳＦ（配列番号５７）を鋳型として使用して、以下の表９に示すプライマーを用いてｍＧＭ－ＣＳＦを増幅した。
【表9】
【0141】
この時に、クローニングを容易にするために、ＮｏｔＩを５’側に、ＭｌｕＩを３’側に挿入することによってプライマーを調製した。次いで、ｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターのｈｏｐｔ－ｙＣＤ部位にｍＧＭ－ＣＳＦをクローニングするために、ベクターをＮｏｔＩ－ＭｌｕＩで消化し、増幅したｍＧＭ－ＣＳＦをＮｏｔＩ－ＭｌｕＩで消化し、回収し、ベクターに導入してｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクター（配列番号６０）を構築した（図２６）。その後、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔの組み合わせ（配列番号５６）でウイルスを合成し、ウイルスベクターの力価を定量した。表６に示すプライマーを用いて、ウイルスを０．１ＭＯＩ採取して組換え型解析実験を行った。その結果、図２７に示すように、ＡｍＥｎｖ９６１Ｆ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの増幅産物２，７６０ｂｐ、及びｐｏｌ７１３０Ｒ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクターの増幅産物２，０４１ｂｐが、ウイルス複製及び再感染中に１２継代まで連続的に増幅されることが確認された。上記の結果は、ｈＣＤ１９ｔを導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクター、及びｍＧＭ－ＣＳＦを導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｍＧＭ－ＣＳＦベクターの両方は、ウイルス複製中に優れたゲノム安定性を示したことを示唆する。
【0142】
＜１１－２＞ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＧＭ－ＣＳＦベクターの構築及び組換え発生の確認
ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＧＭ－ＣＳＦベクターを以下のように構築した。ｈＧＭ－ＣＳＦを確保するために、構築したｓｐＲＲＶｅ－ｈＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６１）を鋳型として、以下の表１０に示すプライマーを用いてｈＧＭ－ＣＳＦを増幅した。
ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＧＭ－ＣＳＦベクターを以下のように構築した。ｈＧＭ－ＣＳＦを確保するために、構築したｓｐＲＲＶｅ－ｈＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６１）を鋳型として、以下の表１０に示すプライマーを用いてｈＧＭ－ＣＳＦを増幅した。
【表10】
【0143】
クローニングを容易にするために、ＮｏｔＩを５’側に、ＭｌｕＩを３’側に挿入することによってプライマーを調製した。次いで、ｈＧＭ－ＣＳＦをｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターのｈｏｐｔ－ｙＣＤ部位にクローニングするために、ベクターをＮｏｔＩ－ＭｌｕＩで消化し、増幅したｈＧＭ－ＣＳＦをＮｏｔＩ－ＭｌｕＩで消化し、回収し、クローニングしてｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＧＭ－ＣＳＦベクター（配列番号６４）を構築した（図２８）。その後、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔの組み合わせ（配列番号５６）でウイルスを合成し、ウイルスベクターの力価を定量した。表６に示すプライマーを用いて、ウイルスを０．１ＭＯＩ採取して組換え型解析実験を行った。その結果、図２９に示すように、ＡｍＥｎｖ９６１Ｆ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターの３，４６０ｂｐの増幅産物は継代６まで増幅を続けたが、ｐｏｌ７１３０Ｒ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈＧＭ－ＣＳＦの増幅産物は初感染から継代６までの２種類の増幅産物として観察された。したがって、初期感染からのゲノム構造の不安定性により、完全に複製が起こらなかったことが確認された。
【0144】
＜１１－３＞ｈＧＭ－ＣＳＦのヒトコドン最適化塩基配列の確保
実施例＜１１－２＞における組換え変異により、完全に複製が起こらないという問題を解決するために、ｈＧＭ－ＣＳＦ塩基配列をヒトコドン最適化塩基配列に変換した。
実施例＜１１－２＞における組換え変異により、完全に複製が起こらないという問題を解決するために、ｈＧＭ－ＣＳＦ塩基配列をヒトコドン最適化塩基配列に変換した。
【0145】
ヒトコドン塩基配列の確保及び合成は、Ｃｏｓｍｏｇｅｎｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａに依頼して行った。この際、自己複製するレトロウイルスベクターへのクローニングを容易にするため、５’側にＮｏｔＩ、３’側にＭｌｕＩを挿入して配列を合成した（配列番号６５）。
【0146】
＜１１－４＞ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクターの構築及び組換え発生の確認
実施例＜１１－３＞で合成したｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦを、ＮｏｔＩ及びＭｌｕＩで消化したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターのｈｏｐｔ－ｙＣＤ部位にクローニングすることにより、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクター（配列番号６６）を構築した（図３０）。その後、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９（配列番号４５）の組み合わせ（図３０）、又はｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔ（配列番号５６）の組み合わせ（図３１）でウイルスを合成し、ウイルスベクターの力価を定量した。表６に示すプライマーを用いて、ウイルスを０．１ＭＯＩ採取して組換え型解析実験を行った。
実施例＜１１－３＞で合成したｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦを、ＮｏｔＩ及びＭｌｕＩで消化したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ｙＣＤベクターのｈｏｐｔ－ｙＣＤ部位にクローニングすることにより、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクター（配列番号６６）を構築した（図３０）。その後、ｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９（配列番号４５）の組み合わせ（図３０）、又はｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦ及びｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔ（配列番号５６）の組み合わせ（図３１）でウイルスを合成し、ウイルスベクターの力価を定量した。表６に示すプライマーを用いて、ウイルスを０．１ＭＯＩ採取して組換え型解析実験を行った。
【0147】
その結果、図３２に示すように、ＡｍＥｎｖ９６１Ｆ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクターの増幅産物３，４６０ｂｐ、及びｐｏｌ７１３０Ｒ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクターの増幅産物２，０４７ｂｐが、ウイルス複製及び再感染中に１２継代まで連続的に増幅されることが確認された。上記の結果は、ｈＣＤ１９を導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ベクター、及びｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦを導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクターの両方は、ウイルス複製中に優れたゲノム安定性を示したことを示唆する。
【0148】
更に、図３３に示すように、ＡｍＥｎｖ９６１Ｆ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクターの増幅産物２，７６０ｂｐ、及びｐｏｌ７１３０Ｒ／ＭＦＧＳａｃＩＲプライマーによるｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクターの増幅産物２，０４７ｂｐが、ウイルス複製及び再感染中に１２継代まで連続的に増幅されることが確認された。上記の結果は、ｈＣＤ１９ｔを導入したｓＲＲＶｅ－Ｆ４－ｈＣＤ１９ｔベクター、及びｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦを導入したｓＲＲＶｇｐ－Ｆ４－ｈｏｐｔ－ＧＭ－ＣＳＦベクターの両方は、ウイルス複製中に優れたゲノム安定性を示したことを示唆する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【配列表】