特許 7413256 神経変性疾患の遺伝子治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-04

(45)【発行日】2024-01-15

(54)【発明の名称】神経変性疾患の遺伝子治療

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240105BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240105BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240105BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20240105BHJP

   C12N 15/866 20060101ALI20240105BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240105BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240105BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240105BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240105BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20240105BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240105BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240105BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240105BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240105BHJP

   C12N 15/35 20060101ALN20240105BHJP

   A61K 31/713 20060101ALN20240105BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALN20240105BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/85 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/56

C12N15/866 Z

C12N7/01

C12N5/10

A61P25/28

A61P21/00

A61P25/02

A61P43/00 111

A61P25/16

A61K48/00

A61K35/76

C12N15/35

A61K31/713

A61K31/7105

【請求項の数】 31

(21)【出願番号】P 2020523011

(86)(22)【出願日】2018-10-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-01-07

(86)【国際出願番号】 US2018057187

(87)【国際公開番号】W WO2019084068

(87)【国際公開日】2019-05-02

【審査請求日】2021-10-18

(31)【優先権主張番号】62/742,723

(32)【優先日】2018-10-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/575,795

(32)【優先日】2017-10-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520118865

【氏名又は名称】プリベイル セラピューティクス，インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＥＶＡＩＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ ９４０，４３０ Ｅａｓｔ ２９ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １００１６，Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】アベリオビッチ，アサ

(72)【発明者】

【氏名】ヘックマン，ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】リーン，エルベ

【審査官】馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５０８２２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５２５４１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５１４４１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１０２９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５０３４０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】Molecular Therapy，24(Suppl.1)，2016年，S291，738

【文献】Mol. Neurobiol.，2017年，54(6)，pp.4466-4476，Epub 2016 Jun 28

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ｃ１２Ｎ １５／８５

Ｃ１２Ｎ １５／８６４

Ｃ１２Ｎ １５／５６

Ｃ１２Ｎ １５／８６６

Ｃ１２Ｎ ７／０１

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ａ６１Ｐ ２５／２８

Ａ６１Ｐ ２１／００

Ａ６１Ｐ ２５／０２

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｐ ２５／１６

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ｃ１２Ｎ １５／３５

Ａ６１Ｋ ３１／７１３

Ａ６１Ｋ ３１／７１０５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）（ａ）配列番号５１に記載の配列によりコードされるＣ９ｏｒｆ７２タンパク質；および
（ｂ）配列番号３９に記載の配列を含む、阻害性核酸
をコードする導入遺伝子を含む発現構築物、ならびに
（ｉｉ）発現構築物に隣接している２つのアデノ随伴ウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列
を含む、単離された核酸。

【請求項2】

導入遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の単離された核酸。

【請求項3】

プロモーターが、ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項２に記載の単離された核酸。

【請求項4】

ＣＭＶエンハンサーをさらに含む、請求項３に記載の単離された核酸。

【請求項5】

ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項6】

ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項7】

各ＩＴＲ配列が、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項8】

（ｉ）配列番号５１に記載の配列によりコードされる、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質；および
（ｉｉ）配列番号３９に記載の配列を含む、阻害性核酸
をコードする導入遺伝子を含む発現構築物を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって；
発現構築物は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接している、
前記組換えＡＡＶベクター。

【請求項9】

導入遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項８に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項10】

プロモーターが、ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項９に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項11】

ＣＭＶエンハンサーをさらに含む、請求項１０に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項12】

ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項13】

ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールをさらに含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項14】

各ＩＴＲ配列が、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、請求項８～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項15】

５’から３’へ順番に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）；
（ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー；
（ｃ）ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター；
（ｄ）導入遺伝子であって、
配列番号５１に記載の核酸配列によりコードされる、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質、ならびに、
配列番号３９に記載の配列を含む、阻害性核酸
をコードする、前記導入遺伝子；
（ｅ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；
（ｆ）ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルテール；および
（ｇ）３’ＡＡＶ（ＩＴＲ）
を含む核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。

【請求項16】

（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質；および
（ｉｉ）請求項８～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項17】

ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項１６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項18】

請求項８～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターを含む、プラスミド。

【請求項19】

請求項８～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターを含む、バキュロウイルスベクター。

【請求項20】

（ｉ）１種以上のアデノ随伴ウイルスｒｅｐタンパク質および／または１種以上のアデノ随伴ウイルスｃａｐタンパク質をコードする、第１のベクター；ならびに
（ｉｉ）請求項８～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターを含む、第２のベクター
を含む、細胞。

【請求項21】

第１のベクターがプラスミドであり、および第２のベクターがプラスミドである、請求項２０に記載の細胞。

【請求項22】

細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２０または２１に記載の細胞。

【請求項23】

哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項２２に記載の細胞。

【請求項24】

第１のベクターがバキュロウイルスベクターであり、および第２のベクターがバキュロウイルスベクターである、請求項２０に記載の細胞。

【請求項25】

細胞が、昆虫細胞である、請求項２４に記載の細胞。

【請求項26】

請求項１６または１７に記載のｒＡＡＶを生成する方法であって、
（ｉ）１種以上のアデノ随伴ウイルスｒｅｐタンパク質および／または１種以上のアデノ随伴ウイルスｃａｐタンパク質をコードする、第１のベクター、ならびに請求項８～１５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを、細胞に送達すること；
（ｉｉ）ｒＡＡＶのパッケージングが可能になる条件下で、細胞を培養すること；および
（ｉｉｉ）ｒＡＡＶの回収のために、培養した宿主細胞または培養培地をハーベストすること
を含む、前記方法。

【請求項27】

対象において筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するための医薬組成物であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項８～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、あるいは請求項１６または１７に記載のｒＡＡＶを含む、前記医薬組成物。

【請求項28】

ＣＮＳへの直接注射により対象へ投与される、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項29】

直接注射が、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

直接注射が、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）への直接注射である、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項31】

ＣＳＦへの直接注射が、槽内注射、脳室内注射、腰椎内注射、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項３０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、35 U.S.C. 119(e)の下で、２０１８年１０月８日に提出された米国仮出願第62/742,723号、表題「神経変性疾患の遺伝子治療」、および２０１７年１０月２３日に提出された第62/575,795号、表題「神経変性疾患の遺伝子治療」の利益を主張する；これら各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

背景
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、ヒトのＣ９ｏｒｆ７２遺伝子におけるヘキサヌクレオチドリピート領域の伸長に関連する神経変性疾患である。一般に、Ｃ９ｏｒｆ７２リピート領域の伸長に関連する病理は、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質の発現低下および有毒なＲＮＡ病巣の蓄積による機能獲得に起因する。現在、ＡＬＳ／ＦＴＤの処置の選択肢は限られている。

【発明の概要】

【0003】

本開示の側面は、神経変性疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および／または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病、ゴーシェ病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、またはライソゾーム病などの処置に有用な、組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法および組成物は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のジペプチドリピート領域の伸長を特徴とするＡＬＳ／ＦＴＤを有する対象を処置するために有用である。

【0004】

いくつかの側面において、本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２および／またはアタキシン２（ＡＴＸＮ２）および／またはリボソームタンパク質２５（ＲＰＳ２５）の発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする発現カセットを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、ＡＴＸＮを標的とする阻害性核酸は、配列番号１０～２５のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、Ｃ９ｏｒｆ７２を標的とする阻害性核酸は、配列番号３７～５０のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなる。

【0005】

いくつかの側面において、本開示は、コドン最適化Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質（またはその一部）をコードする発現カセットを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、コドン最適化Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、コドン最適化Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質は、配列番号５１に示される配列を有する核酸によってコードされる。

【0006】

いくつかの側面において、本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２および／またはＡＴＸＮ２および／またはＲＰＳ２５の発現または活性を阻害する阻害性核酸、ならびに野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質（例えば、病原性ジペプチドリピート伸長を欠くＣ９ｏｒｆ７２タンパク質）をコードする発現カセットを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質は、配列番号３またはその一部によってコードされる。いくつかの態様において、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質は、配列番号４に示される配列またはその一部を含むか、またはそれからなる。

【0007】

いくつかの側面において、本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現または活性を阻害する第１の阻害性核酸、およびアタキシン２（ＡＴＸＮ２）の発現または活性を阻害する第２の阻害性核酸をコードする発現カセットを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの側面において、本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現または活性を阻害する第１の阻害性核酸、および膜貫通タンパク質１０６Ｂ（ＴＭＥＭ１０６Ｂ）の発現または活性を阻害する第２の阻害性核酸をコードする発現カセットを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの側面において、本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現または活性を阻害する第１の阻害性核酸、およびＲＰＳ２５の発現または活性を阻害する第２の阻害性核酸をコードする発現カセットを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸はさらに、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質（例えば、配列番号３に示されるような）をコードする核酸配列を含む。

【0008】

いくつかの側面において、本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現または活性を阻害する阻害性核酸およびβ－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）タンパク質をコードする発現カセットを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、ＧＢＡタンパク質は、ＧＢＡ１タンパク質（例えば、ＧＢＡ１遺伝子またはその一部によってコードされるタンパク質）である。いくつかの側面において、本開示は、ＡＴＸＮ２の発現または活性を阻害する阻害性核酸およびβ－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）タンパク質をコードする発現カセットを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、ＧＢＡタンパク質は、ＧＢＡ１タンパク質（例えば、ＧＢＡ１遺伝子またはその一部によってコードされるタンパク質）である。いくつかの側面において、本開示は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現または活性を阻害する阻害性核酸およびβ－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）タンパク質をコードする発現カセットを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、ＧＢＡタンパク質は、ＧＢＡ１タンパク質（例えば、ＧＢＡ１遺伝子またはその一部によってコードされるタンパク質）である。

【0009】

いくつかの態様において、阻害性核酸（例えば、第１の阻害性核酸、第２の阻害性核酸、第３の阻害性核酸など）は、Ｃ９ｏｒｆ７２のジペプチドリピート領域（例えば、ジペプチドリピート領域を含むＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡ転写物）をコードする核酸に結合する。いくつかの態様において、ジペプチドリピート領域は、１つ以上のＧＧＧＧＣＣリピート、または１つ以上のＣＣＣＣＧＧリピート（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２のジペプチドリピート領域）を含む。いくつかの態様において、ジペプチドリピート領域は、２３以上（例えば、２３～１０，０００の間の任意の整数、例えば、２４、２５、３０、５０、１００、１０００、５０００、または１０，０００）のＧＧＧＧＣＣリピート（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２のセンス鎖ジペプチドリピート領域）、または２３以上（例えば、２３と１０，０００の間の任意の整数、例えば、２４、２５、３０、５０、１００、１０００、５０００、または１０，０００）のＣＣＣＣＧＧリピート（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２のアンチセンス鎖ジペプチドリピート領域）を含む。

【0010】

いくつかの態様において、阻害性核酸は、ジペプチドリピート領域ではないＣ９ｏｒｆ７２の領域をコードする核酸（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピート領域の外側にある核酸の一部）に結合する。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ジペプチドリピート領域の１つの核酸（例えば、ジペプチドリピート領域に隣接するもの）と約５００個の核酸との間にある単離された核酸配列に結合する。いくつかの態様において、阻害性核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードする遺伝子のイントロン領域を標的とする。

【0011】

いくつかの態様において、阻害性核酸（例えば、第１の阻害性核酸、第２の阻害性核酸、第３の阻害性核酸など）は、ＡＴＸＮ２（例えば、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写物）をコードする核酸配列、例えば、配列番号９に示されるようなものに結合する。いくつかの態様において、ＡＴＸＮ２を標的とする阻害性核酸は、ＡＴＸＮ２をコードする核酸配列の非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）に結合する。
いくつかの態様において、阻害性核酸（例えば、第１の阻害性核酸、第２の阻害性核酸、第３の阻害性核酸など）は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡ転写物）をコードする核酸配列に、例えば、配列番号７に示されるようなものに結合する。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする阻害性核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂをコードする核酸配列の非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）に結合する。

【0012】

いくつかの態様において、阻害性核酸（例えば、第１の阻害性核酸、第２の阻害性核酸、第３の阻害性核酸など）は、ＲＰＳ２５をコードする核酸配列（例えば、ＲＰＳ２５ ｍＲＮＡ転写物）に、例えば、配列番号６０に示されるようなものに結合する。いくつかの態様において、ＲＰＳ２５を標的とする阻害性核酸は、ＲＰＳ２５をコードする核酸配列の非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）に結合する。
いくつかの態様において、阻害性核酸（例えば、第１の阻害性核酸および／または第２の阻害性核酸）は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｄｓＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ足場配列、例えば、ｍｉＲ－１５５足場配列が隣接する阻害性核酸配列を含む、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。

【0013】

いくつかの態様において、阻害性核酸（例えば、第１の阻害性核酸および／または第２の阻害性核酸）は、発現構築物の非翻訳領域に位置する。いくつかの態様において、非翻訳領域は、イントロン、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）である。
いくつかの態様において、単離された核酸は、１つ以上のプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６またはＨ１）、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである。
いくつかの態様において、発現構築物は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接している。いくつかの態様において、発現構築物に隣接するＩＴＲ配列の１つは、機能的な末端分解部位を欠く。

【0014】

本開示は、いくつかの側面において、修飾された「Ｄ」領域（例えば、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ、配列番号３２と比べて修飾されたＤ配列）を有するＩＴＲを含む、ｒＡＡＶベクターに関する。いくつかの態様において、修飾Ｄ領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの５’ＩＴＲである。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域は、例えば配列番号２９に示されるような「Ｓ」配列を含む。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの３’ＩＴＲである。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域は３’ＩＴＲを含み、ここで「Ｄ」領域は、ＩＴＲの３’末端（例えば、ベクターの導入遺伝子インサートに対してＩＴＲの外側または末端）に位置する。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域は、配列番号２９または３０に示されるような配列を含む。
いくつかの態様において、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、ＴＲＹ領域を含む。いくつかの態様において、ＴＲＹ領域は、配列番号３１に示される配列を含む。

【0015】

いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号１～６２のいずれか１つに示される配列またはその一部を含む（またはそれに示されるアミノ酸配列をコードする）。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接した、１つ以上の阻害性核酸をコードする単離された核酸配列および／または１つ以上のタンパク質、例えば野生型Ｃ９ｏｒｆ７２および／またはＧＢＡ１をコードする単離された核酸を含む、導入遺伝子）、またはバキュロウイルスベクターである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。

【0016】

いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸またはベクターを含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はさらに、薬学的に許容し得る担体を含む。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸またはベクターを含む、宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）または原核細胞（例えば、細菌細胞）である。
いくつかの側面において、本開示は、カプシドタンパク質および本開示に記載の単離された核酸またはベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、血液脳関門を通過することができる。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質、またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞および／または非神経細胞を形質導入する。

【0017】

いくつかの側面において、本開示は、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および／または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病、ゴーシェ病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、またはライソゾーム病）を有するかまたは有することが疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象に、本開示に記載の単離された核酸、ベクター、組成物、またはｒＡＡＶを投与することを含む。

【0018】

いくつかの態様において、投与は、対象のＣＮＳへの直接注射を含む。いくつかの態様において、ＣＮＳへの直接注射は、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）への直接注射、例えば、槽内注射、脳室内注射、腰椎内注射、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、直接注射は、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、直接注射は、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む。

【0019】

いくつかの態様において、対象は、哺乳動物、例えばヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、約３０～約５０００（例えば、３０から５０００までの任意の整数）のＧＧＧＧＣＣジペプチドリピートおよび／または約３０～５０００（例えば、３０から５０００までの任意の整数）のＣＣＣＣＧＧリピートを有することを特徴とする。いくつかの態様において、対象は、５０００を超えるＧＧＧＧＣＣジペプチドリピートおよび／またはＣＣＣＣＧＧリピートを有することを特徴とする。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、Ｃ９ｏｒｆ７２のリピート伸長を標的とする阻害性核酸、膜貫通タンパク質１０６Ｂ（ＴＭＥＭ１０６Ｂ）を標的とする阻害性核酸および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２コード配列をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。ｒＡＡＶベクターは、発現構築物に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復をさらに含む。

【図2】図２は、Ｃ９ｏｒｆ７２のリピート伸長を標的とする阻害性核酸およびβ-グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ１）コード配列をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。ｒＡＡＶベクターは、発現構築物に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復をさらに含む。

【0021】

【図3】図３は、Ｃ９ｏｒｆ７２のリピート伸長を標的とする阻害性核酸および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２コード配列をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。ｒＡＡＶベクターは、発現構築物に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復をさらに含む。

【図4】図４は、ｐｏｌ ＩＩＩ（Ｈ１）プロモーターに作動可能に連結されたＡＴＸＮ２（例えば、ＡＴＮＸ２をコードする遺伝子）を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。ｒＡＡＶベクターは、発現構築物に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復をさらに含む。３’ＵＴＲの「Ｄ」配列は、「外側」の位置にある。

【0022】

【図5】図５は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＴＸＮ２（例えば、ＡＴＮＸ２をコードする遺伝子）を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。ｒＡＡＶベクターは、発現構築物に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復をさらに含む。３’ＵＴＲの「Ｄ」配列は、「外側」の位置にある。

【図6】図６は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＴＸＮ２（例えば、ＡＴＮＸ２をコードする遺伝子）を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【0023】

【図7】図７は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結された、それぞれがＡＴＸＮ２（例えば、ＡＴＮＸ２をコードする遺伝子）を標的とする２つの阻害性核酸をコードする発現構築物を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【図8】図８は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＴＸＮ２（例えば、ＡＴＮＸ２をコードする遺伝子）を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【0024】

【図9】図９は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＴＸＮ２（例えば、ＡＴＮＸ２をコードする遺伝子）を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターおよび野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。ｒＡＡＶベクターは、発現構築物に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復をさらに含む。３’ＵＴＲの「Ｄ」配列は、「外側」の位置にある。

【図10】図１０は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＣ９ｏｒｆ７２を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【0025】

【図11】図１１は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＣ９ｏｒｆ７２を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【図12】図１２は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＣ９ｏｒｆ７２を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【0026】

【図13】図１３は、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ（例えば、Ｈ１）プロモーターに作動可能に連結されたＣ９ｏｒｆ７２を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【図14】図１４は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＣ９ｏｒｆ７２を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【図15】図１５は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＣ９ｏｒｆ７２を標的とする２つの阻害性核酸をコードする発現構築物および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【0027】

【図16】図１６は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＣ９ｏｒｆ７２を標的とする２つの阻害性核酸をコードする発現構築物および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【図17】図１７は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＣ９ｏｒｆ７２を標的とする２つの阻害性核酸をコードする発現構築物および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【0028】

【図18】図１８は、ＩＴＲの「外側」（例えば、導入遺伝子インサートまたは発現構築物に対してＩＴＲの末端の近位）に位置する「Ｄ」領域を含むｒＡＡＶベクター（上）、およびＩＴＲをベクターの「内側」（例えば、ベクターの導入遺伝子インサートの近位）に有する野生型ｒＡＡＶベクターを示す概略図である。

【図19A】図１９Ａ～１９Ｂは、in vitroのＣ９ｏｒｆ７２発現およびノックダウンアッセイの代表的なデータを示す。図１９Ａは、ｒＡＡＶベクターによる内因性Ｃ９ｏｒｆ７２の統計的に有意なサイレンシングを示す代表的なデータを示す。

【図19B】図１９Ａ～１９Ｂは、in vitroのＣ９ｏｒｆ７２発現およびノックダウンアッセイの代表的なデータを示す。図１９Ｂは、ｒＡＡＶベクターでのトランスフェクション後の、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２発現の統計的に有意な増加を示す代表的なデータを示す。

【0029】

【図20】図２０は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＲＰＳ２５を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【図21】図２１は、ｐｏｌ ＩＩ（ＣＢＡ）プロモーターに作動可能に連結されたＲＰＳ２５を標的とする阻害性核酸をコードする発現構築物および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。

【0030】

詳細な説明
本開示の側面は、神経変性疾患、例えばＡＬＳ／ＦＴＤ、パーキンソン病、アルツハイマー病、ライソゾーム病、およびレビー小体型認知症などを処置するための、組成物および方法に関する。本開示は部分的に、対象における、ＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子産物（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＡＴＸＮ２、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、前述の遺伝子を標的とする阻害性核酸など）およびそれらの組み合わせをコードする発現構築物に基づく。遺伝子産物は、タンパク質、タンパク質の断片（例えば、一部）、ＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸などであり得る。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子によりコードされる、タンパク質またはタンパク質断片である。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）である。

【0031】

ＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子とは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、またはＡＬＳおよびＦＴＤ（ＡＬＳ／ＦＴＤ）と遺伝的、生化学的または機能的に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子に２３を超えるＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有する個人は、リピート領域伸長を有しない個人と比較して、ＡＬＳ／ＦＴＤを発症するリスクが高いことが観察されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の発現カセットは、野生型または非変異型のＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子（またはそのコード配列）をコードする。一般に、遺伝子の「野生型」または「非変異」形態とは、正常なまたは非病原性の活性に関連するタンパク質（例えば、神経変性疾患の発症または進行をもたらすリピート領域伸長等の変異または変化のないタンパク質）をコードする核酸を指す。例えば、いくつかの態様において、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質は、配列番号４に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0032】

単離された核酸およびベクター
単離された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの側面において、本開示は、１つ以上のＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子、例えばＣ９ｏｒｆ７２（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２のジペプチドリピート領域）、ＡＴＸＮ２、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、ＲＰＳ２５などを標的とする１つ以上の阻害性核酸をコードする、単離された核酸（例えばｒＡＡＶベクター）を提供する。阻害性核酸は、遺伝子のセンス鎖（例えば、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、遺伝子のアンチセンス鎖（例えば、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方（例えば、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）を標的とし得る。

【0033】

一般に、本明細書に記載の単離された核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の阻害性核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードし得る。いくつかの態様において、単離された核酸は、１０を超える阻害性核酸をコードする。いくつかの態様において、１つ以上の阻害性核酸のそれぞれは、異なる遺伝子または遺伝子の一部を標的とする（例えば、第１のｍｉＲＮＡは遺伝子の第１の標的配列を標的とし、第２のｍｉＲＮＡは、第１の標的配列とは異なる、遺伝子の第２の標的配列を標的とする）。いくつかの態様において、１つ以上の阻害性核酸のそれぞれは、同じ遺伝子の同じ標的配列を標的とする（例えば、単離された核酸は、同じｍｉＲＮＡの複数のコピーをコードする）。

【0034】

本開示の側面は、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡ転写産物のジペプチドリピート領域）を標的とする１つ以上の干渉核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。いくつかの態様において、ジペプチドリピート領域は、ヘキサヌクレオチドリピート配列ＧＧＧＧＣＣの５つ以上のポリマー単位（例えば、ＧＧＧＧＣＣリピート配列の５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれ以上の反復を含む領域）によってコードされる。

【0035】

一般に、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質は、Ｒａｂなどの小さなＧＴＰａｓｅの交換因子として関与すると考えられている、ニューロンの細胞質およびシナプス前終末に見られるタンパク質を指す。ヒトにおいて、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子は９番染色体上に位置する。いくつかの態様において、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_060795.1によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子は、配列番号３に示される配列を含むか、または配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする。

【0036】

Ｃ９ｏｒｆ７２を標的とする阻害性核酸は、長さが６～５０ヌクレオチドの相補性の領域（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２などの標的遺伝子にハイブリダイズする阻害性核酸の領域、または標的遺伝子の一部、例えばＣ９ｏｒｆ７２のジペプチドリピート領域またはジペプチドリピート領域の外側の領域）を含み得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、長さが約６～３０、約８～２０、または約１０～１９ヌクレオチドの、Ｃ９ｏｒｆ７２と相補的な領域を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、阻害性核酸によって標的化される（例えば、結合される）Ｃ９ｏｒｆ７２配列は、Ｃ９ｏｒｆ７２のジペプチドリピート領域から、１ヌクレオチドから５００ヌクレオチド（例えば、１から５００ヌクレオチドまでの任意の整数）、離れている（５’または３’いずれかに対して）。いくつかの態様において、阻害性核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードする遺伝子のイントロン領域（例えば、非タンパク質コード領域）を標的とする。

【0037】

本開示の側面は、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の遺伝子産物）を標的とする１つ以上の干渉核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質は、樹状突起の形態形成およびリソソーム輸送の調節に関与するタンパク質である、膜貫通タンパク質１０６Ｂを指す。ヒトにおいて、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は７番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_060844.2で表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は、配列番号７に示される配列を含むか、または配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする。

【0038】

ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする阻害性核酸は、長さが６～５０ヌクレオチドの相補性の領域（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂなどの標的遺伝子にハイブリダイズする阻害性核酸の領域）を含み得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、長さが約６～３０、約８～２０、または約１０～１９ヌクレオチドの、ＴＭＥＭ１０６Ｂと相補的な領域を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドと相補的である。

【0039】

本開示の側面は、ＡＴＸＮ２タンパク質（例えば、ＳＣＡ２遺伝子とも呼ばれる、ＡＴＸＮ２遺伝子の遺伝子産物）を標的とする１つ以上の干渉核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＡＴＸＮ２タンパク質は、ポリ（Ａ）結合タンパク質との相互作用を介してｍＲＮＡの翻訳を調節することに関与するタンパク質である、アタキシン２を指す。ヒトにおいて、ＡＴＸＮ２遺伝子は１２番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＡＴＸＮ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_002964.3で表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、ＡＴＸＮ２遺伝子は、配列番号９に示される配列を含むか、または配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードする。

【0040】

ＡＴＸＮ２を標的とする阻害性核酸は、長さが６～５０ヌクレオチドの相補性の領域（例えば、ＡＴＸＮ２などの標的遺伝子にハイブリダイズする阻害性核酸の領域）を含み得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、長さが約６～３０、約８～２０、または約１０～１９ヌクレオチドの、ＡＴＸＮ２と相補的な領域を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＡＴＸＮ２配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドと相補的である。

【0041】

本開示の側面は、リボソームタンパク質ｓ２５（ＲＰＳ２５）（例えば、ＲＰＳ２５の遺伝子産物）を標的とする１つ以上の干渉核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＲＰＳ２５タンパク質は、タンパク質合成に関与するタンパク質複合体である、ｓ４０リボソームのサブユニットであるリボソームタンパク質を指す。ヒトにおいて、ＲＰＳ２５遺伝子は１１番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＲＰＳ２５遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_001019.1によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、ＲＰＳ２５遺伝子は、配列番号６０に示される配列を含む。

【0042】

ＲＰＳ２５を標的とする阻害性核酸は、長さが６～５０ヌクレオチドである相補性の領域（例えば、ＲＰＳ２５などの標的遺伝子にハイブリダイズする阻害性核酸の領域）を含み得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、長さが約６～３０、約８～２０、または約１０～１９ヌクレオチドの、ＲＰＳ２５と相補的な領域を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＲＰＳ２５配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドと相補的である。

【0043】

本開示の側面は、１つ以上の阻害性核酸（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２のジペプチドリピート領域を標的とする阻害性核酸、Ｃ９ｏｒｆ７２の非ジペプチドリピート領域を標的とする阻害性核酸、および／またはＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする阻害性核酸、および／またはＡＴＸＮ２を標的とする阻害性核酸、および／またはＲＰＳ２５を標的とする阻害性核酸、等）をコードする第１の遺伝子産物、および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質またはＧＢＡタンパク質などのタンパク質をコードする第２の遺伝子産物を含む、発現構築物に関する。

【0044】

いくつかの態様において、単離された核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現または活性を阻害する第１の阻害性核酸、およびＴＭＥＭ１０６Ｂの発現または活性を阻害する第２の阻害性核酸をコードする、発現カセットを含む。
いくつかの態様において、単離された核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現または活性を阻害する第１の阻害性核酸、およびＡＴＸＮ２の発現または活性を阻害する第２の阻害性核酸をコードする、発現カセットを含む。

【0045】

いくつかの態様において、単離された核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現または活性を阻害する第１の阻害性核酸、およびＲＰＳ２５の発現または活性を阻害する第２の阻害性核酸をコードする、発現カセットを含む。
いくつかの態様において、単離された核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびβ－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）タンパク質の発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする、発現カセットを含む。いくつかの態様において、ＧＢＡタンパク質は、ＧＢＡ１タンパク質（例えば、ＧＢＡ１遺伝子またはその一部によってコードされるタンパク質）である。

【0046】

いくつかの態様において、単離された核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質（例えば、病原性ジペプチドリピート伸長を欠くＣ９ｏｒｆ７２タンパク質）の発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする、発現カセットを含む。いくつかの態様において、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードする核酸配列またはその一部は、コドン最適化された核酸配列である。いくつかの態様において、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質は、配列番号３に示される核酸配列またはその一部によってコードされる。いくつかの態様において、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質は、配列番号４に示される配列またはその一部を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様において、コドン最適化Ｃ９ｏｒｆ７２をコードする単離された核酸は、配列番号５１に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0047】

当業者は、第１の遺伝子産物（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質またはＧＢＡタンパク質をコードする核酸配列）および第２の遺伝子産物（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＡＴＸＮ２、ＴＭＥＭ１０６Ｂなどを標的とする阻害性ＲＮＡ）の発現の順序は、一般的に逆転され得ることを認識する（例えば、阻害性ＲＮＡは第１の遺伝子産物であり、タンパク質コード配列は２番目の遺伝子産物である）。いくつかの態様において、遺伝子産物は、遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、ＡＴＸＮ２、ＧＢＡ１など）の断片（例えば、一部）である。タンパク質断片は、タンパク質（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質、ＧＢＡタンパク質など）の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％を含み得る。いくつかの態様において、タンパク質断片は、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質またはＧＢＡタンパク質の、５０％～９９．９％（例えば、５０％～９９．９％の間の任意の値）を含む。いくつかの態様において、遺伝子産物（例えば、阻害性ＲＮＡ）は、標的遺伝子の一部にハイブリダイズする（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＡＴＸＮ２、またはＴＭＥＭ１０６Ｂなどの標的遺伝子の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上の連続したヌクレオチドに相補的である）。

【0048】

いくつかの態様において、発現構築物はモノシストロニックである（例えば、発現構築物は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物を含む単一の融合タンパク質をコードする）。いくつかの態様において、発現構築物はポリシストロニックである（例えば、発現構築物は、２つの異なる遺伝子産物、例えば２つの異なるタンパク質またはタンパク質断片をコードする）。

【0049】

ポリシストロニックな発現ベクターは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）のプロモーターを含み得る。任意の適切なプロモーター、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、内因性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、ＣＮＳ特異的プロモーター）などを使用することができる。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）、ＣＡＧプロモーター（例えば、Alexopoulou et al. (2008) BMC Cell Biol. 9:2; doi: 10.1186/1471-2121-9-2に記載のもの）、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーター（例えばTornoe et al. (2002) Gene 297(1-2):21-32、またはKarumuthil-Melethil et al. (2016) Human Gene Therapy 27(7):509-521に記載のもの）である。いくつかの態様において、プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６、Ｈ１など）である。いくつかの態様において、プロモーターは、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、または第１の遺伝子産物と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列に、作動可能に連結されている。いくつかの態様において、発現カセットは１つ以上の追加の調節配列を含み、これには、限定することなく、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）付加部位、エンハンサー配列、リプレッサー結合部位、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0050】

いくつかの態様において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列によって分離されている。ＩＲＥＳ部位の例は、例えば、Mokrejs et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(Database issue):D125-30に記載されている。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、自己切断型ペプチドをコードする核酸配列によって分離されている。自己切断型ペプチドの例には、限定はされないが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ ２Ａ、およびＢｍＩＦＶ ２Ａ、およびLiu et al. (2017) Sci Rep. 7: 2193に記載されたものが含まれる。いくつかの態様において、自己切断型ペプチドはＴ２Ａペプチドである。

【0051】

病理学的にはＡＬＳやＦＴＤなどの疾患は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子に由来するリピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳タンパク質で主に構成されるタンパク質凝集体の蓄積に関連する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質（例えば、病原性ジペプチドリピート伸長を有する遺伝子によってコードされるＣ９ｏｒｆ７２タンパク質）の発現を低減または防止する阻害性核酸を含む。阻害性核酸をコードする配列は、発現構築物の非翻訳領域（例えば、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）に配置され得る。

【0052】

いくつかの態様において、阻害性核酸は、発現構築物のイントロン、例えば、第１の遺伝子産物をコードする配列の上流のイントロンに配置される。阻害性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）、またはＲＮＡアプタマーであることができる。一般に阻害性核酸は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の約６～約３０（例えば、６から３０までの任意の整数）個の連続したヌクレオチドに結合する（例えば、ハイブリダイズする）。いくつかの態様において、阻害性核酸分子は、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ、例えば、例えばＣ９ｏｒｆ７２（病原性Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードする遺伝子）を標的とするｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイズするＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡの領域とのいかなるミスマッチも含まない（例えば、ｍｉＲＮＡは「完全」である）。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイズするＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡの領域と、２～２０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）のミスマッチ、例えば「バルジ」など、を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイズするＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡの領域と２０を超えるミスマッチを含む。

【0053】

いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｓｈＲＮＡ（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２を標的とするｓｈＲＮＡ）である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｍｉＲＮＡ（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２を標的とするｍｉＲＮＡ）である。いくつかの態様において、発現構築物の１つ以上の阻害性ＲＮＡの発現は、１つ以上のＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばＨ１プロモーターまたはＵ６プロモーターによって駆動される。各阻害性ＲＮＡは、異なるプロモーターまたは同じプロモーターによって駆動され得る。

【0054】

いくつかの態様において、阻害性核酸は、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は典型的には、植物および動物に見られる小さな非コードＲＮＡを指し、遺伝子発現の転写および翻訳後調節に機能する。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて、プリｍｉＲＮＡと呼ばれるヘアピンループ構造を形成する；これは、その後酵素（Drosha、Pasha、スプライセオソームなど）によって処理されてプレｍｉＲＮＡヘアピン構造を形成し、これは次にダイサーにより処理されて、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖（^＊はｍｉＲＮＡ二重鎖のパッセンジャー鎖を示す）を形成し、その一方の鎖は次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。いくつかの態様において、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡは、Ｃ９ｏｒｆ７２（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２のジペプチドリピート領域またはＣ９ｏｒｆ７２の非ジペプチドリピート領域）、ＡＴＸＮ２、またはＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするｍｉＲＮＡである。

【0055】

いくつかの態様において、Ｃ９ｏｒｆ７２を標的とする阻害性核酸は、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖は、配列番号２４または２５、３７または３８、４０または４１のいずれか１つに示される配列もしくはその一部を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のｍｉＲＮＡ^＊鎖は、配列番号２４または２５、３７または３８、４０または４１に示される配列もしくはその一部を含むか、またはそれからなる。

【0056】

いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする阻害性核酸は、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖は、配列番号１または７に示される配列もしくはその一部を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のｍｉＲＮＡ^＊鎖は、配列番号１または７に示される配列もしくはその一部を含むか、またはそれからなる。
いくつかの態様において、ＡＴＸＮ２を標的とする阻害性核酸は、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖は、配列番号１０～２３のいずれか１つに示される配列もしくはその一部を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のｍｉＲＮＡ^＊鎖は、配列番号１０～２３のいずれか１つに示される配列もしくはその一部を含むか、またはそれからなる。

【0057】

人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は、天然のｍｉＲＮＡを修飾して、プレｍＲＮＡの天然の標的化領域を目的の標的化領域で置き換えることにより誘導される。例えば、天然に発現するｍｉＲＮＡを足場または骨格（例えば、プリｍｉＲＮＡ足場）として使用でき、ステム配列を、目的遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡのそれに置き換える。人工前駆体マイクロＲＮＡ（プレａｍｉＲＮＡ）は、通常、単一の安定した低分子ＲＮＡが優先的に生成されるように処理される。いくつかの態様において、本明細書に記載のｓｃＡＡＶベクターおよびｓｃＡＡＶは、ａｍｉＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、ａｍｉＲＮＡのプリｍｉＲＮＡ足場は、プリＭＩＲ－２１、プリＭＩＲ－２２、プリＭＩＲ－２６ａ、プリＭＩＲ－３０ａ、プリＭＩＲ－３３、プリＭＩＲ－１２２、プリＭＩＲ－３７５、プリＭＩＲ－１９９、プリＭＩＲ－９９、プリＭＩＲ－１９４、プリＭＩＲ－１５５、およびプリＭＩＲ－４５１からなる群から選択されるプリｍｉＲＮＡに由来する。いくつかの態様において、ａｍｉＲＮＡは、例えばFowler et al. Nucleic Acids Res. 2016 Mar 18; 44(5): e48に記載されているように、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＡＴＮＸ２、またはＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする核酸配列、およびｅＳＩＢＲ ａｍｉＲＮＡ足場を含む。

【0058】

いくつかの側面において、本開示は、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ／ＦＴＤ）の処置のための阻害性ＲＮＡの組み合わせを含む、発現構築物に関する。例えば、いくつかの態様において、本開示に記載の発現構築物は、Ｃ９ｏｒｆ７２を標的とする阻害性ＲＮＡおよび膜貫通タンパク質１０６Ｂ（ＴＭＥＭ１０６Ｂ）を標的とする阻害性ＲＮＡを含む。単離された核酸が阻害性核酸の配列をコードする順序は、変化し得る。例えば単離された核酸は、５’末端から３’末端まで、Ｃ９ｏｒｆ７２とＴＭＥＭ１０６Ｂを、またはＴＭＥＭ１０６ＢとＣ９ｏｒｆ７２を標的とするｓｈＲＮＡのいずれかをコードする。

【0059】

本明細書に記載の単離された核酸は、それ自体で、またはベクターの一部として存在し得る。一般にベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなど）である。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミド（例えば、本明細書に記載の単離された核酸を含むプラスミド）である。いくつかの態様において、ベクターは、組換えＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接した導入遺伝子をコードする発現構築物）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖である（例えば、一本鎖ＤＮＡ）。いくつかの態様において、ベクターは、バキュロウイルスベクター（例えば、Autographa californica核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクター）である。

【0060】

典型的には、ｒＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した導入遺伝子を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子は、本開示に記載の単離された核酸を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターの２つのＩＴＲ配列のそれぞれは、完全長ＩＴＲ（例えば、長さが約１４５ｂｐであり、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を含む）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターのＩＴＲの１つは、切断されている（例えば、短縮されているかまたは完全長ではない）。いくつかの態様において、切断型ＩＴＲは、機能的末端分解部位（ｔｒｓ）を欠き、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶベクター）の生成のために使用される。いくつかの態様において、切断型ＩＴＲは、例えば、McCarty et al. (2003) Gene Ther. 10(26):2112-8に記載のΔＩＴＲである。

【0061】

本開示の側面は、野生型ＡＡＶ ＩＴＲと比べて、例えば野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（例えば、配列番号３２）と比べて、１つ以上の修飾（例えば、核酸の追加、欠失、置換など）を有するＩＴＲを含む、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）に関する。野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの構造を、図１８に示す。一般に野生型ＩＴＲは、自己アニーリングして回文構造の二本鎖Ｔ型ヘアピン構造（これは、２つのクロスアーム（それぞれＢ／Ｂ’およびＣ／Ｃ’と呼ばれる配列によって形成される）、より長いステム領域（配列Ａ／Ａ’によって形成される）、および「Ｄ」領域と呼ばれる一本鎖末端領域からなる）を形成する、１２５ヌクレオチドの領域を含む（図１８）。一般に、ＩＴＲの「Ｄ」領域は、Ａ／Ａ’配列によって形成されるステム領域と、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子を含むインサートの間に配置される（例えば、ＩＴＲの末端に対してＩＴＲの「内側」に配置されるか、またはｒＡＡＶベクターの導入遺伝子インサートもしくは発現構築物の近位に配置される）。いくつかの態様において、「Ｄ」領域は、配列番号３０に示される配列を含む。「Ｄ」領域は、例えば、Ling et al. (2015) J Mol Genet Med 9(3)に開示されるように、カプシドタンパク質によるｒＡＡＶベクターのカプシド形成において、重要な役割を果たすことが観察されている。

【0062】

本開示は、部分的に、ＩＴＲの「外側」に位置する「Ｄ」領域（例えば、導入遺伝子インサートまたは発現構築物に対してＩＴＲの末端に近い）を含むｒＡＡＶベクターが、修飾されていない（例えば、野生型の）ＩＴＲを有するｒＡＡＶベクターよりも、ＡＡＶカプシドタンパク質によって効率的にカプシド化されるという、驚くべき発見に基づいている。いくつかの態様において、修飾された「Ｄ」領域を有するｒＡＡＶベクターは、野生型ＩＴＲ配列を有するｒＡＡＶベクターと比べて毒性が減少している。

【0063】

いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号３０）と比べて、少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む。修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号３０）と比べて、少なくも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド置換を有し得る。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号３０）と比べて、少なくも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９のヌクレオチド置換を含む。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号３０）と、約１０％～約９９％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）同一である。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、Wang et al. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80に記載のように、「Ｓ」配列とも呼ばれる配列番号２９に示される配列を含む。

【0064】

本開示に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶベクターはさらに、例えば、配列番号３１に示されるような、またはFrancois, et al. 2005. The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent Replication of a Minimal Adeno-Associated Virus Type 2 p5 Element. J Virolに記載のような「ＴＲＹ」配列を含み得る。いくつかの態様において、ＴＲＹ配列は、単離された核酸またはｒＡＡＶベクターのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）と発現構築物（例えば、導入遺伝子をコードするインサート）との間に配置される。

【0065】

いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶベクターを含む、バキュロウイルスベクターに関する。いくつかの態様において、バキュロウイルスベクターは、例えばUrabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43およびSmith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896に記載されるような、Autographa californica核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクターである。

【0066】

いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはベクターを含む、宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例えば宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などであり得る。いくつかの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は細菌細胞、例えば大腸菌細胞である。

【0067】

ｒＡＡＶ
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の核酸をコードする導入遺伝子を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に関する（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター）。「ｒＡＡＶ」という用語は一般に、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化されたｒＡＡＶベクターを含む、ウイルス粒子を指す。本開示に記載のｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０から選択される血清型を有するカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、非ヒト宿主由来のカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９などのアカゲザルＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、野生型カプシドタンパク質のバリアントであるカプシドタンパク質を含み、これは例えば、それが由来する野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多く（例えば、１５、２０、２５、５０、１００など）のアミノ酸置換（例えば、変異）を含む、カプシドタンパク質バリアントである。

【0068】

いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、特にＣＳＦ空間にまたは直接脳実質に導入された場合に、ＣＮＳを通して容易に広がる。したがって、いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができるカプシドタンパク質を含む。例えば、いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ．１０血清型を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、血液脳関門を通過するＡＡＶ９バリアント、例えばDeverman et al. (2016) Nature Biotechnology 34:204-209に記載のようなＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ血清型を含む。一般にｒＡＡＶの生成は、例えば、Samulski et al. (1989) J Virol. 63(9):3822-8およびWright (2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698-706に記載されている。

【0069】

いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化されてｒＡＡＶカプシド粒子を形成する、組換えｒＡＡＶゲノムを含むもの）は、バキュロウイルスベクター発現系（ＢＥＶＳ）で生成される。ＢＥＶＳを使用したｒＡＡＶの生成は、例えば以下に記載されている：Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43、Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896、米国特許第8,945,918号、米国特許第9,879,282号、および国際ＰＣＴ公開WO 2017/184879。しかしながらｒＡＡＶは、任意の適切な方法を使用して（例えば、組換えｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を使用して）生成され得る。

【0070】

医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る」という用語は、化合物の生物活性または特性を無効にせず、また比較的非毒性である、担体または希釈剤などの材料を指し、例えば材料は、望ましくない生物学的影響を引き起こしたり、またはそれが含まれている組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用したりすることなく、個体に投与し得る。

【0071】

本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容し得る担体」とは、薬学的に許容し得る材料、組成物または担体、例えば、液体または固体の充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒または封入材料などであって、本発明内で有用な化合物をそれが意図する機能を果たすことができるように患者内にまたは患者に運ぶかまたは輸送することに関連するものを、意味する。本発明の実施において使用される医薬組成物に含まれ得るさらなる成分は、当該分野で知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)に記載されている；これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0072】

本明細書で提供される組成物（例えば、医薬組成物）は、以下を含む任意の経路で投与することができる：経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、大槽内、皮下、脳室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、クリーム、および／または滴剤による）、粘膜、鼻腔、頬側、舌下；気管内注入、気管支注入、および／または吸入；および／または経口スプレー、鼻スプレー、および／またはエアロゾルとして。具体的に企図される経路は、経口投与、静脈内投与（例えば、全身静脈内注射）、血液および／またはリンパ供給による局所投与、および／または罹患部位への直接投与である。一般に、最も適切な投与経路は、様々な因子、例えば薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境におけるその安定性）、および／または対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）などに依存するであろう。

【0073】

方法
本開示は部分的に、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ／ＦＴＤなど）を処置するために一緒に（例えば、相乗的に）作用する、対象における１つ以上のＡＬＳ－ＦＴＤ関連遺伝子産物（またはそれらの組み合わせ）の発現のための組成物に基づく。本明細書で使用される「処置する」または「処置すること」とは、（ａ）神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ／ＦＴＤ、アルツハイマー病、ゴーシェ病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ライソゾーム病など）の発症を予防または遅延させること；（ｂ）神経変性疾患の重症度を軽減すること；（ｃ）神経変性疾患に特徴的な症状の発症を軽減または防止すること；（ｄ）および／または、神経変性疾患に特徴的な症状の悪化を防止すること、を指す。例えば、ＡＬＳ／ＦＴＤの症状には、例えば、運動機能障害（例えば、麻痺、震え、硬直、動きの鈍さ、歩行困難）、認知機能障害（例えば、認知症、うつ病、不安症）、感情的および行動的機能障害が含まれる。

【0074】

したがって、いくつかの側面において、本開示は、神経変性疾患を有するかまたは有することが疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象に、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を投与することを含む。いくつかの態様において、神経変性疾患は、ＡＬＳ／ＦＴＤ、アルツハイマー病、ゴーシェ病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、またはライソゾーム病である。

【0075】

いくつかの態様において、組成物は、対象のＣＮＳに直接的に、例えば対象の脳および／または脊髄への直接注射によって、投与される。ＣＮＳ直接投与法の例には、限定はされないが、脳内注射、脳室内注射、槽内注射、実質内注射、髄腔内注射、および前述の任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対象の中脳、線条体および／または大脳皮質における、導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。

【0076】

いくつかの態様において、本開示に記載の組成物は、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接投与される。いくつかの態様において、ＣＳＦへの直接注入は、対象の脊髄および／またはＣＳＦにおける導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。対象のＣＳＦへの直接投与の例には、限定はされないが、槽内注射、脳室内注射、腰椎内注射、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0077】

いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む。対流強化送達は、脳の外科的露出および小径カテーテルを脳の標的領域に直接配置し、続いて治療剤（例えば、本明細書に記載の組成物またはｒＡＡＶ）を対象の脳に直接注入することを含む、治療戦略である。ＣＥＤは、例えば、Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27に記載されている。
いくつかの態様において、組成物は、例えば末梢注射により、対象の末梢に投与される。末梢注射の例には、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、末梢注射は、動脈内注射、例えば対象の頸動脈への注射である。

【0078】

いくつかの態様において、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象の末梢および直接的にＣＮＳの両方で投与される。例えば、いくつかの態様において、対象は、動脈内注射（例えば、頸動脈への注射）および実質内注射（例えば、ＣＥＤによる実質内注射）によって、組成物を投与される。いくつかの態様において、ＣＮＳへの直接注射および末梢注射は同時である（例えば、同時に起こる）。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の前（例えば、１分から１週間の間、またはそれより前）に行われる。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の後（例えば、１分から１週間の間、またはその後）に行われる。

【0079】

対象に投与される本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）の量は、投与方法に応じて変化するであろう。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、対象に、約１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇと約１０^１４ＧＣ／ｋｇの間（例えば、約１０^９ＧＣ／ｋｇ、約１０^１０ＧＣ／ｋｇ、約１０^１１ＧＣ／ｋｇ、約１０^１２ＧＣ／ｋｇ、約１０^１２ＧＣ／ｋｇ、または約１０^１４ＧＣ／ｋｇ）の力価で投与される。いくつかの態様において、対象は、高力価（例えば、＞１０^１２ゲノムコピーＧＣ／ｋｇのｒＡＡＶ）を、ＣＳＦ空間への注射により、または実質内注射により投与される。

【0080】

本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象に１回または複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、またはそれ以上）投与され得る。いくつかの態様において、組成物は対象に継続的に（例えば、慢性的に）、例えば注入ポンプを介して、投与される。

【実施例】

【0081】

例１：ｒＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、トリプルプラスミドトランスフェクション用のＨＥＫ２９３細胞などの細胞を使用して生成される。ＩＴＲ配列は、目的の各導入遺伝子のプロモーター／エンハンサー要素、３’ポリＡシグナル、およびＷＰＲＥ要素等の翻訳後シグナルを含む発現構築物に隣接している。複数の遺伝子産物、例えばＣ９ｏｒｆ７２タンパク質またはＧＢＡ１タンパク質、および１つ以上の阻害性核酸（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２および／またはＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする阻害性核酸）などを、例えば単一の発現カセットまたは別々の発現カセットでの発現により、同時に発現させることができる。発現された遺伝子の上流で効率的にスプライシングされる短いイントロン配列の存在は、発現レベルを改善することができる。阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）および他の調節ＲＮＡは、これらの配列内に含まれる可能性がある。本開示に記載の発現構築物の例を、図１～１７および２０～２１、および以下の表１に示す。

【0082】

【表1-1】

【表1-2】

【0083】

例２：ＡＬＳ／ＦＴＤ細胞へのウイルス導入の細胞ベースのアッセイ
Ｃ９ｏｒｆ７２のリピート伸長を特徴とする細胞は、例えば、ＡＬＳ／ＦＴＤ患者からの線維芽細胞、単球、またはｈＥＳ細胞、または患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として得られる。これらの細胞は、ＲＮＡ病巣およびＲＡＮ翻訳タンパク質を蓄積する。
かかる細胞モデルを使用して、細胞の病理を、ＲＡＮタンパク質などのタンパク質凝集体の蓄積に関して抗ＲＡＮタンパク質抗体を用いて定量化し、その後、蛍光顕微鏡を使用して画像化する。ウエスタンブロッティングおよび／またはＥＬＩＳＡを使用して、ＲＡＮタンパク質の異常な蓄積を定量化する。
治療のエンドポイント（ＡＬＳ／ＦＴＤ関連の病状の軽減など）は、ＡＡＶベクターの形質導入の発現の状況で測定し、活動と機能を確認および定量化する。内因性（例えば、病原性リピート伸長を含有する）Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡレベルの減少は、例えば、定量的ＲＴ－ＰＣＴ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用して定量化することができる。

【0084】

例３：in vitro研究
この例は、本開示に記載のＣ９ｏｒｆ７２ ｒＡＡＶベクターのin vitro試験を説明する。Ｃ９ｏｒｆ７２ノックダウンおよび過剰発現の影響を、哺乳類細胞で調べた。試験した構築物の例を表２に示す。

【表2】

【0085】

遺伝子ノックダウンおよび過剰発現は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡによって分析した。図１９Ａは、ｒＡＡＶベクターによるＣ９ｏｒｆ７２の統計的に有意なサイレンシングを示す、代表的なデータを示す。図１９Ｂは、ｒＡＡＶベクターでのトランスフェクション後の野生型Ｃ９ｏｒｆ７２発現の統計的に有意な増加を示す、代表的なデータを示す。

【0086】

配列
いくつかの態様において、１つ以上の遺伝子産物（例えば、第１、第２および／または第３の遺伝子産物）をコードする発現カセットは、配列番号１～６２のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなる（またはそれをコードする）。いくつかの態様において、遺伝子産物は、配列番号１～６２のいずれか１つの一部（例えば、断片）を含むか、またはそれからなる（またはそれによってコードされる）。いくつかの態様において、以下の配列中の「Ｔ」ヌクレオチドは、例えばＲＮＡ分子の文脈において、「Ｕ」ヌクレオチドによって置き換えられる。
当業者は、前述の配列の「一部」が、プラスミド骨格（例えば、複製配列の起点、選択マーカー配列など）を欠く発現カセット（例えば、ＩＴＲをコードする配列、干渉ＲＮＡ、コード配列、調節配列など）の配列であり得ることを理解するであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【配列表】

0007413256000001.app