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特許7413410エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する際に、レーザ光による蛍光色素の退色を低減するための装置及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-04
(45)【発行日】2024-01-15
(54)【発明の名称】エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する際に、レーザ光による蛍光色素の退色を低減するための装置及び方法
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20240105BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 Z
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2021571297
(86)(22)【出願日】2020-07-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-14
(86)【国際出願番号】 DE2020000149
(87)【国際公開番号】W WO2021004563
(87)【国際公開日】2021-01-14
【審査請求日】2021-12-07
(31)【優先権主張番号】102019004870.9
(32)【優先日】2019-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】516313966
【氏名又は名称】パーティクル メトリックス ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100084375
【弁理士】
【氏名又は名称】板谷 康夫
(72)【発明者】
【氏名】ヴァヘルニッヒ，ハンノ
(72)【発明者】
【氏名】ヘルムブレヒト，クレメンス
(72)【発明者】
【氏名】シフマン，イェンス
【審査官】嶋田 行志
(56)【参考文献】
【文献】独国実用新案第２０２０１８００５２８７（ＤＥ，Ｕ１）
【文献】欧州特許出願公開第０２５９４９８１（ＥＰ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／００－Ｇ０１Ｎ ２１／８３
Ｇ０１Ｎ １５／００－Ｇ０１Ｎ １５／１４
Ｇ０１Ｎ ３３／００－Ｇ０１Ｎ ３３／９８
Ｇ０１Ｎ ３５／００－Ｇ０１Ｎ ３５／１０
Ｇ０１Ｎ ３７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＡＣＳ ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＳ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する際に、レーザ光による蛍光色素の品質低下を低減するための装置であって、ｄ）測定セル（１７）の所定の測定位置において、異なる色のレーザによる種々の測定点（２６）を保存する手段を備え、サンプル（１８）と相互作用した個々のレーザビーム（２４）のフォーカシングが、ビデオカメラ（１３）に収束ビーム束の中心として記録され、
ｅ）マルチノッチフィルタから成るノッチフィルタ（６）と、前記ノッチフィルタ（６）と同じ光路長を模倣して前記測定セル（１７）における測定点（２６）を調節する際に液体レンズ（１５）と前記測定セル（１７）の測定位置（２６）との間で収束ビームパスにおける蛍光とレーザ散乱光との光路長を同じに設定及び固定するための石英ガラス（１６）と、のための交換装置（７）を備え、
２秒以下の時間で、個々のレーザが測定セルの各測定点にガイドされ、イメージがビデオカメラ（１３）により記録され、対応するデータがパターン認識及び粒子トラッキング解析に送られた後、レーザがスイッチオフされることを特徴とする装置。
【請求項2】
前記ビデオカメラ（１３）は、ｓＣＭＯＳ又はｅＣＣＤであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項3】
エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する際に、レーザ光による蛍光色素の強度低下を低減するための方法であって、請求項１に記載の装置において、
ｄ）測定セル（１７）が、用いるレーザの位置検知、フォーカシング及び保存のためのテスト液で満たされ、
ｅ）検定液が調査するエクソソームを含むサンプル液で置き換えられ、測定セル（１７）が泡を含んでいないかチェックされ、全てのレーザが位置１に戻され、
ｆ）レーザが各々の保存されたフォーカス地点に連続的に移動されて分析開始時にスイッチオンされ、イメージが光センサ（１２）により記録され、対応するデータがパターン認識に送信されることを特徴とする方法。
【請求項4】
プログラムがコンピュータで実行される場合に、請求項３に記載された方法ステップを実行するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラム。
【請求項5】
プログラムがコンピュータで実行される場合に、請求項３に記載された方法を実行する ためのコンピュータプログラムのプログラムコードを有する機械可読キャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する際に、レーザ光による蛍光色素の強度低下を低減するための装置に関する。
【背景技術】
【0002】
エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する装置は、ＤＥ ２０ ２０１８ ００５ ２８７ Ｕ１で知られている。
【0003】
生物学における小胞とは、一重又は二重の膜若しくはタンパク質から成る網状の膜により包まれ、細胞内在性で非常に小さい円形から楕円形の泡である。小胞は、異なる細胞プロセスが進行する別個の細胞コンパートメントを形成する。小胞の大きさは、約１マイクロメートルである。小胞は、細胞内で多くの物質の輸送を担う。
【0004】
細胞外小胞が生じる機構については、現時点においても完全には説明されていない。３タイプの細胞外小胞が、それらの起源又は大きさに基づいて分類されている。
【0005】
ここで、エクソソームは、約５０から１５０ｎｍの大きさを持つ小さな小胞である。
【0006】
上記文献の請求項１は、以下の特徴を持つ装置に関する。
ａ）複数の異なるレーザ（１，２，３，４）のビームが、粒子含有サンプル（９）を含む測定セル（２２）で１つのビームパス（２１）となるようにそれぞれ別個の集光プリズム（１４）により配光され、サンプル（９）と相互作用したレーザビーム（２１）の集束は、蛍光プレイン（５）及び散乱光プレイン（８）からの光より成る収束ビーム束の中心を形成し、光学ユニットコントローラ（１８）を有する液体レンズを通過した後、ビデオカメラ（１５）に記録され、
ｂ）収束ビームパスは、交換ホイール（１７）及びコントローラ（２６）により移動されるカラーフィルタ（１６）を通過し、
ｃ）タッチスクリーン（１９）を有するディスプレイ（９）及び粒子トラッキングプログラムを有する全体コントローラ（２０）が、ビデオカメラ（１５）を操作するのに用いられる。
ａ）複数の異なるレーザ（１，２，３，４）のビームが、粒子含有サンプル（９）を含む測定セル（２２）で１つのビームパス（２１）となるようにそれぞれ別個の集光プリズム（１４）により配光され、サンプル（９）と相互作用したレーザビーム（２１）の集束は、蛍光プレイン（５）及び散乱光プレイン（８）からの光より成る収束ビーム束の中心を形成し、光学ユニットコントローラ（１８）を有する液体レンズを通過した後、ビデオカメラ（１５）に記録され、
ｂ）収束ビームパスは、交換ホイール（１７）及びコントローラ（２６）により移動されるカラーフィルタ（１６）を通過し、
ｃ）タッチスクリーン（１９）を有するディスプレイ（９）及び粒子トラッキングプログラムを有する全体コントローラ（２０）が、ビデオカメラ（１５）を操作するのに用いられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
統計的に良質な結果を得るための同じサンプルによる連続的な複数回の測定は、用いた蛍光色素が長いレーザ作用時間により急激に退色し、測定後に測定セルでのサンプルの置換を必要とするため、上述のＤＥ ２０ ２０１８ ００５ ２８７ Ｕ１に記載された従来技術では実行することができない。
【0008】
レーザ色素（蛍光色素）へのレーザ作用時間が短くなれば、退色は低減し、同じサンプルを用いた複数回の測定が可能となる。
【0009】
そこで、本願は、蛍光色素（蛍光染料）へのレーザ光の作用時間を減らすという目的に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【0010】
この目的は、請求項１でクレームされた以下の装置、
エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する際に、レーザ光による蛍光色素の品質低下を低減するための装置であって、
ａ）測定セル（１７）の所定の測定位置において、異なる色のレーザによる種々の測定点（２６）を保存する手段を備え、サンプル（１８）と相互作用した個々のレーザビーム（２４）のフォーカシングが、ビデオカメラ（１３）に収束ビーム束の中心として記録され、
ｅ）マルチノッチフィルタから成るノッチフィルタ（６）と、前記ノッチフィルタ（６）と同じ光路長を模倣して前記測定セル（１７）における測定点（２６）を調節する際に液体レンズ（１５）と前記測定セル（１７）の測定位置（２６）との間で収束ビームパスにおける蛍光とレーザ散乱光との光路長を同じに設定及び固定するための石英ガラス（１６）と、のための交換装置（７）を備え、
２秒以下の時間で、個々のレーザが測定セルの各測定点にガイドされ、イメージがビデオカメラ（１３）により記録され、対応するデータがパターン認識及び粒子トラッキング解析に送られた後、レーザがスイッチオフされ、前記ビデオカメラ（１３）は、ｓＣＭＯＳ又はｅＣＣＤであることを特徴とする装置、
及び請求項３でクレームされた以下の方法、
エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する際に、レーザ光による蛍光色素の強度低下を低減するための方法であって、請求項１に記載の装置において、
ａ）測定セル（１７）が、用いるレーザの位置検知、フォーカシング及び保存のためのテスト液で満たされ、
ｂ）検定液が調査するエクソソームを含むサンプル液で置き換えられ、測定セル（１７）が泡を含んでいないかチェックされ、全てのレーザが位置１に戻され、
ｃ）レーザが各々の保存されたフォーカス地点に連続的に移動されて分析開始時にスイッチオンされ、イメージが光センサ（１２）により記録され、対応するデータがパターン認識に送信されることを特徴とする方法、
プログラムがコンピュータで実行される場合に、請求項３でクレームされた方法ステップを実行するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラム、
プログラムがコンピュータで実行される場合に、請求項３でクレームされた方法を実行するためのコンピュータプログラムのプログラムコードを有する機械可読キャリア、
により達成される。
エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する際に、レーザ光による蛍光色素の品質低下を低減するための装置であって、
ａ）測定セル（１７）の所定の測定位置において、異なる色のレーザによる種々の測定点（２６）を保存する手段を備え、サンプル（１８）と相互作用した個々のレーザビーム（２４）のフォーカシングが、ビデオカメラ（１３）に収束ビーム束の中心として記録され、
ｅ）マルチノッチフィルタから成るノッチフィルタ（６）と、前記ノッチフィルタ（６）と同じ光路長を模倣して前記測定セル（１７）における測定点（２６）を調節する際に液体レンズ（１５）と前記測定セル（１７）の測定位置（２６）との間で収束ビームパスにおける蛍光とレーザ散乱光との光路長を同じに設定及び固定するための石英ガラス（１６）と、のための交換装置（７）を備え、
２秒以下の時間で、個々のレーザが測定セルの各測定点にガイドされ、イメージがビデオカメラ（１３）により記録され、対応するデータがパターン認識及び粒子トラッキング解析に送られた後、レーザがスイッチオフされ、前記ビデオカメラ（１３）は、ｓＣＭＯＳ又はｅＣＣＤであることを特徴とする装置、
及び請求項３でクレームされた以下の方法、
エクソソーム上の蛍光及び抗体数を決定する際に、レーザ光による蛍光色素の強度低下を低減するための方法であって、請求項１に記載の装置において、
ａ）測定セル（１７）が、用いるレーザの位置検知、フォーカシング及び保存のためのテスト液で満たされ、
ｂ）検定液が調査するエクソソームを含むサンプル液で置き換えられ、測定セル（１７）が泡を含んでいないかチェックされ、全てのレーザが位置１に戻され、
ｃ）レーザが各々の保存されたフォーカス地点に連続的に移動されて分析開始時にスイッチオンされ、イメージが光センサ（１２）により記録され、対応するデータがパターン認識に送信されることを特徴とする方法、
プログラムがコンピュータで実行される場合に、請求項３でクレームされた方法ステップを実行するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラム、
プログラムがコンピュータで実行される場合に、請求項３でクレームされた方法を実行するためのコンピュータプログラムのプログラムコードを有する機械可読キャリア、
により達成される。
【0011】
本出願の図面は、以下のような内容となっている。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】特別なＮＴＡナノ粒子トラッキング方法を示す図。
【図2】測定セルを示す図。
【図3】秒単位でのレーザ作用による色素の強度低下を示す図。
【図4】測定セルにおける測定位置及びレーザの焦点（測定点）を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0013】
【0014】
レーザの数は、従来技術の４つに対して５つになっている。従来技術における液体フィルタ６は、ノッチフィルタ６と石英ガラス１６とを交換するための交換装置を有するノッチフィルタ６に置き換えられている。石英ガラス１６は、測定セル１７における測定点２６（図４参照）を調節する際に、対象物を通って光センサ１２までの収束ビームパスで蛍光とレーザ散乱光とを同じ光路長に設定及び固定するのに用いられる。石英ガラス１６は、ノッチフィルタ６と同じ光路長を模倣している。
【0015】
従来技術でのビデオカメラ１５は、ここでは符号１３で示され、コントローラ１１により制御されてグラフェンをベースとした光センサ１２を有し、光学ユニットコントローラ８を介してカメラ光学ユニット１４を用いることにより、液体レンズ１５を制御するものであり、液体レンズ１５には、レーザ１～５の一つ及び集光プリズム２１の一つのビームパス２４上にある測定セル１７のサンプル１８における蛍光プレイン２０に対して、ノッチフィルタ６及び測定セル１７の光学通路窓１９を介して投影される。
【0016】
全体コントローラ１０は、従来技術の全体コントローラ２０に対応し、ディスプレイ９は、従来技術のディスプレイ１９に対応する。
【0017】
図２の測定セル１７は鉛直上方から見たものであり、図１でも示したレーザのビームパス２４はレーザ通路窓２３を通過し、蛍光プレイン２０のフォーカスは、液体レンズ１５及びカメラ光学ユニット１４から石英ガラス１６を通る点へと側方にテーパ状となっている。
【0018】
測定セル１７の注入口２５は、前方に見られる。
【0019】
秒単位でのレーザ作用後の色素強度低下は、図３に示したパーセンテージからよく読み取ることができる。レーザ光が、測定位置２６において蛍光色素にせいぜい２秒作用しただけで、蛍光色素の強度は、かなり弱くなって利用可能な測定結果を与えることができなくなる。
【0020】
測定セル１７における測定位置と、レーザのビームパス２４に対する光学ユニットの焦点（レーザ散乱光プレイン及び蛍光プレイン）での測定位置２６とが、図４に示す種々の測定位置１－４で示されている。ここでは、カメラ光学ユニット１４も示されている。
【0021】
【0022】
測定セル１７は、エクソソームサンプルの代わりに、ポリスチレン粒子又は認証されたエクソソームスタンダードを含むテスト液で満たされる。
【0023】
個々のレーザが、測定セル１７の各測定点２６（図４参照）にガイド及び保存される。
【0024】
すなわち、すべての５レーザが、それぞれ測定位置１にガイドされ、光路長が確認及びフォーカスされた後に保存される。その後、すべての５レーザが、次の測定位置にガイドされ、フォーカス及び保存される。
【0025】
すべての５レーザについて、位置３及び位置４についても同じことが実行される。
【0026】
その後、レーザはスイッチオフされる。
【0027】
次のステップとして、測定セルの検定液が、エクソソームを含むサンプル液で置き換えられる。
【0028】
そして、ノッチフィルタ６が、液体レンズ１５と測定セル１７との間に押し出され、収束ビームパスに移動される。一方、石英ガラス１６は、装置７に接続されて固定される。
【0029】
実際の測定は測定位置１で始まり、５つのレーザが保存されたフォーカス点に次々とスイッチされ、イメージが光センサにより記録され、データがパターン認識に送られる。この目的に必要とされる時間は、２秒以下である。その後、レーザはスイッチオフされる。
【0030】
レーザは、測定位置２へと更に移動される。測定は、上記ステップのように行われる。レーザは、その後スイッチオフされる。
【0031】
レーザは、測定位置３へと更に移動される。測定は、再び上記ステップのように行われる。レーザは、その後スイッチオフされる。
【0032】
レーザは、測定位置４へと移動される。データが評価される。
【0033】
粒子は、例えば、充填により、測定セル内の様々な点において異なるレベルの高又は低濃度粒子を形成し得る。そのため、良質で高い統計的確実性を持つ測定結果を得るために、複数の測定位置が測定セル内で必要となる。
【0034】
測定セル内で新たに処理される測定位置では、抗体上の蛍光はまだ新しく未使用である。
【0035】
蛍光は、次の測定位置に移動する際にレーザがスイッチオフされ、レーザによる退色が起こらないことによっても保存される。これは、個々の測定位置及びフォーカス点の前もっての保存、そして、それら位置への再度の高精度高速移動（オブジェクティブのレーザ及び液体レンズにおける遊びの無い高速ステッピングモータ及び精密移動キャリッジ）により初めて可能となる。
【0036】
マルチバンドパスフィルタ６（マルチノッチフィルタ）は、各レーザの高速スイッチングを可能とする。フィルタ交換が不要となるので、時間が短縮されて蛍光の保存となる。
【0037】
上で例示したような念入りな測定方法によれば、１つのエクソソームサンプルについて５つのレーザを用い、４つどころか１００又はそれ以上の測定位置２６を持つ測定位置にアプローチして測定することができる。これにより、非常に高品質な測定が保証される。
【0038】
マルチバンドパスフィルタ６（ノッチフィルタ）が光強度を低下させるので、カメラには高感度ｓＣＭＯＳ、ｅＣＣＤ又はグラフェン光センサを使用する必要がある。
【0039】
本方法は、特別な制御及び解析プログラムによる上記方法及び動作シークエンスの実行に複雑な制御を必要とする。
【符号の説明】
【0040】
１ レーザ３７５ｎｍ
２ レーザ（紫＝４０５ｎｍ）
３ レーザ（青＝４８８ｎｍ）
４ レーザ（緑＝５２０ｎｍ）
５ レーザ（赤＝６４０ｎｍ）
６ ノッチフィルタ（マルチバンドパスフィルタ）
７ ノッチフィルタ及び石英ガラスのための交換装置
８ 光学ユニットコントローラ
９ タッチスクリーンを有するディスプレイ
１０ 粒子トラッキングプログラムを有する全体コントローラ
１１ 光センサ１２のコントローラ
１２ グラフェンをベースとした光センサ
１３ 検出器又はビデオカメラｅＣＣＤ、ｓＣＭＯＳ
１４ カメラ光学ユニット
１５ 調整可能なフォーカスを有する液体レンズ
１６ 石英ガラス
１７ 測定セル
１８ サンプル
１９ 測定セル１７の光学ユニット通路窓
２０ 蛍光プレイン
２１ 集光プリズム（すべてのレーザを１つのビームパスにガイドする）
２２ 散乱光プレイン
２３ 測定セル１７のレーザ通路窓
２４ ビームパスレーザ
２５ 測定セル１７の注入口
２６ 測定位置（レーザ散乱光と蛍光とのフォーカスプレインを持つ測定点）
２ レーザ（紫＝４０５ｎｍ）
３ レーザ（青＝４８８ｎｍ）
４ レーザ（緑＝５２０ｎｍ）
５ レーザ（赤＝６４０ｎｍ）
６ ノッチフィルタ（マルチバンドパスフィルタ）
７ ノッチフィルタ及び石英ガラスのための交換装置
８ 光学ユニットコントローラ
９ タッチスクリーンを有するディスプレイ
１０ 粒子トラッキングプログラムを有する全体コントローラ
１１ 光センサ１２のコントローラ
１２ グラフェンをベースとした光センサ
１３ 検出器又はビデオカメラｅＣＣＤ、ｓＣＭＯＳ
１４ カメラ光学ユニット
１５ 調整可能なフォーカスを有する液体レンズ
１６ 石英ガラス
１７ 測定セル
１８ サンプル
１９ 測定セル１７の光学ユニット通路窓
２０ 蛍光プレイン
２１ 集光プリズム（すべてのレーザを１つのビームパスにガイドする）
２２ 散乱光プレイン
２３ 測定セル１７のレーザ通路窓
２４ ビームパスレーザ
２５ 測定セル１７の注入口
２６ 測定位置（レーザ散乱光と蛍光とのフォーカスプレインを持つ測定点）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
