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特許7413629ＩＧＦ－１異型体を発現させるＤＮＡコンストラクトを用いた神経病症の治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-05
(45)【発行日】2024-01-16
(54)【発明の名称】ＩＧＦ－１異型体を発現させるＤＮＡコンストラクトを用いた神経病症の治療
(51)【国際特許分類】
C12N 15/16 20060101AFI20240109BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240109BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240109BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240109BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20240109BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240109BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240109BHJP
C07K 14/65 20060101ALN20240109BHJP
A61K 38/30 20060101ALN20240109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/16 ZNA
C12N15/86 Z
C12N15/85 Z
A61K48/00
A61P25/02
A61P25/00
A61P43/00 111
C07K14/65
A61K38/30
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021502750
(86)(22)【出願日】2019-07-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-31
(86)【国際出願番号】 IB2019000843
(87)【国際公開番号】W WO2020016655
(87)【国際公開日】2020-01-23
【審査請求日】2021-07-05
(31)【優先権主張番号】62/699,662
(32)【優先日】2018-07-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【微生物の受託番号】KCTC KCTC 13540BP
【微生物の受託番号】KCTC KCTC 13539BP
【微生物の受託番号】KCCM KCCM-10476
【微生物の受託番号】KCCM KCCM-10179
(73)【特許権者】
【識別番号】518069438
【氏名又は名称】ヘリックスミス カンパニー， リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(72)【発明者】
【氏名】イ、チュンフン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ネヨン
(72)【発明者】
【氏名】コ、キョン リャン
【審査官】大久保 元浩
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５３２０６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５２９２２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００３－５２０７８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Molecular Medicine，2014年，Vol.20，p.202-214
【文献】Arch Otolaryngol Head Neck Surg.，1999年，Vol.125，p.274-279
【文献】SCIENTIFIC REPORTS，Vol.8 5408，2018年04月，p.1-11
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン（ｅｘｏｎ）１、３及び４と同じ配列を有する配列番号１の第１ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；配列番号６又は配列番号７の第２ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１と同じ配列を有する配列番号３の第３ポリヌクレオチド；
配列番号８の第４ポリヌクレオチド；及び
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２と同じ配列を有する配列番号５の第５ポリヌクレオチド；
を含む、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトであって、
前記第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結され、
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質の両方、をコードする、
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
【請求項2】
配列番号９又は配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む、ウイルスベクター。
【請求項4】
請求項１又は２に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む、プラスミドベクター。
【請求項5】
配列番号９のヌクレオチド配列からなるＩＧＦ－１Ｘ６又は配列番号１０のヌクレオチド配列からなるＩＧＦ－１Ｘ１０を含む、請求項４に記載のプラスミドベクター。
【請求項6】
請求項１又は２に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト、請求項３に記載のウイルスベクター、又は請求項４又は５に記載のプラスミドベクターを含む、神経病症を治療するための薬剤学的組成物。
【請求項7】
前記神経病症は、糖尿病性神経病症である、請求項６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項8】
筋肉内注射用に製剤化されている、請求項６に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願に対する相互参照（ＣＲＯＳＳ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ ＴＯ ＲＥＬＡＴＥＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）］
本出願は、２０１８年７月１７日に出願された米国仮出願番号６２／６９９，６６２に優先権を主張し、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年７月１７日に出願された米国仮出願番号６２／６９９，６６２に優先権を主張し、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0002】
［配列目録（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ）］
当該出願はＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて提出された配列目録を含み、これによって、その全体が参照によって組み込まれる。２０１９年７月２日に生成された前記ＡＳＣＩＩコピー（ｃｏｐｙ）は、３８９１７ＵＳ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名され、４７，２６５バイトのサイズである。
当該出願はＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて提出された配列目録を含み、これによって、その全体が参照によって組み込まれる。２０１９年７月２日に生成された前記ＡＳＣＩＩコピー（ｃｏｐｙ）は、３８９１７ＵＳ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名され、４７，２６５バイトのサイズである。
【0003】
本発明は、ＩＧＦ－１異型体を発現させるＤＮＡコンストラクトを用いた神経病症の治療に関する。
【背景技術】
【0004】
神経病症は、神経の損傷に起因する慢性の病的状態である。神経病症は糖尿病の通常の結果であり、糖尿病患者の神経病症は、特に、糖尿病性（ｄｉａｂｅｔｉｃ）神経病症と呼ばれる。神経病症はまた、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（例えば、帯状疱疹後神経痛（ｐｏｓｔ－ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｎｅｕｒａｌｇｉａ）として知られた感染後に発生するものと関連した神経病症に伴う、ヘルペス（ｈｅｒｐｅｓ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）／エイズ（ＡＩＤＳ）；ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）：ハンセン病（ｌｅｐｒｏｓｙ）；梅毒（ｓｙｐｈｉｌｉｓ）；及び帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ））；自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）（例えば、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性ループス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ）、及びギラン－バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ））；遺伝的（ｇｅｎｅｔｉｃ）又は遺伝される（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ）疾患（例えば、 フリードライヒ運動失調（Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ ａｔａｘｉａ）とシャルコ－マリー－トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ））；アミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）；尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）；毒素（ｔｏｘｉｎ）、毒（ｐｏｉｓｏｎ）又は薬物への曝露；外傷（ｔｒａｕｍａ）；又は負傷（ｉｎｊｕｒｙ）による神経の損傷が原因で発生することもある。いくつかの場合において原因が不明であり、この場合の神経病症は特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）神経病症と呼ばれる。
【0005】
原因にかかわらず、神経病症は、疼痛（神経病性疼痛）、及びその他の感覚的な欠陥（例えば、部分的又は完全な感覚喪失を含む、麻酔（ａｎｅｓｔｈｅｓｉａｓ）；及び無感覚（ｎｕｍｂｎｅｓｓ）、しびれ（ｔｉｎｇｌｉｎｇ）を含む、感覚異常（ｐａｒｅｓｔｈｅｓｉａｓ）など）、運動障害（例えば、弱さ（ｗｅａｋｎｅｓｓ）、反射作用（ｒｅｆｌｅｘｅｓ）喪失、筋肉量（ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ）の喪失、痙攣（ｃｒａｍｐｉｎｇ）、敏捷性（ｄｅｘｔｅｒｉｔｙ）喪失など）、及び自律神経病症（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）（例えば、吐き気（ｎａｕｓｅａ）、嘔吐（ｖｏｍｉｔｉｎｇ）、勃起不全（ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ）、めまい（ｄｉｚｚｉｎｅｓｓ）、便秘（ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ）、下痢（ｄｉａｒｒｈｅａ）など）のような神経の損傷（例えば、末梢（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）神経病症、頭蓋（ｃｒａｎｉａｌ）神経病症、自律（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ）神経病症、局所（ｆｏｃａｌ）神経病症）の解剖学的部位に部分的に依存する特徴的な症状と関連がある。
【0006】
神経病症は、関連する症状を管理する措置によって日常的に治療され、病因が知られている場合には、神経病症の根本となる原因を治療することによって日常的に治療される。例えば、鎮痛剤、又は糖尿病、自己免疫疾患、感染症又はビタミン欠乏の医学的な治療が用いられる。しかし、これらの方法は、神経の損傷それ自体は治療しない。
【0007】
したがって、神経病症に関連する神経の損傷を予防し、治療できる効果的な治療方法が必要である。
【0008】
様々な成長因子は、神経病症の治療のために可能な製剤として提案されており、Ｋｅｓｓｌｅｒらは、近年、糖尿病性末梢神経病症において非ウイルス性肝細胞成長因子（ＨＧＦ）遺伝子治療の成功的な二重盲検（ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ）、プラセボ対照（ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）、ヒト２相臨床試験を報告した。Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ２（５）：４６５－４７８（２０１５）。また、米国特許番号９，９６３，４９３を参照し、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
【0009】
神経病症を誘発する広範な病因と広範な神経病症の臨床発表を考慮すると、ＨＧＦ発現核酸コンストラクトで糖尿病性末梢神経病症を治療する臨床的成功にもかかわらず、ＨＧＦ以外の成長因子の投与に基づく治療を含む追加の治療の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、ヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトが神経病症に関連した症状を治療するのに効果的であるという新しい発見に基づく。ＩＧＦ－１のクラスＩ，Ｅｃ又はクラスＩ，Ｅａ異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトが、クラスＩＩ，Ｅａ又はクラスＩ，Ｅｂ異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトに比べてより効果的であるということがさらに証明された。それぞれ、ＩＧＦ－１のクラスＩ，Ｅｃ又はクラスＩ，Ｅａ異型体をエンコードする２つの類型のＤＮＡコンストラクトが共に投与されるとき、治療的な効果はより強くなる。したがって、本発明の一部の具現例は、神経病症のある対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に、ＩＧＦ－１のクラスＩ，Ｅｃ又はクラスＩ，Ｅａ異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトを個別に又は組み合わせて投与することによって神経病症を治療する方法を対象とする。
【0011】
本発明は、特異的に設計された新しいＤＮＡコンストラクトをさらに提供して、１個のベクター内に２個のＩＧＦ－１異型体（すなわち、クラスＩ，Ｅｃ及びクラスＩ，Ｅａ）をエンコードする。ＤＮＡコンストラクトは、クラスＩ，Ｅｃ及びクラスＩ，Ｅａ異型体両方の高いレベルの発現を誘導し、生体内で神経病症に関連した症状を効果的に治療するそれらの能力に基づいて選別され選択された。それらの治療効果は、クラスＩ，Ｅｃ又はクラスＩ，Ｅａの２つの異型体のうち一方だけをエンコードするＤＮＡコンストラクトの効果よりも大きく、それぞれ、クラスＩ，Ｅｃ又はクラスＩ，Ｅａをエンコードするコンストラクトの２つの類型の同時投与によって証明された効果と類似であった。
【0012】
したがって、本発明は、神経病症の治療のための治療法に基づく新しいＩＧＦ－１を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0013】
具体的に、一側面において、本発明は、次を含む、ヒトＩＧＦ－１をエンコードするＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを提供する：ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３及び４（配列番号１）と同じ配列を有する第１ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４（配列番号２）と同じ配列を有する第２ポリヌクレオチド又はその切片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）と同じ配列を有する第３ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）と同じ配列を有する第４ポリヌクレオチド又はその切片；及びヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）と同じ配列を有する第５ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート。ここで、第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
【0014】
一部の具現例において、第２ポリヌクレオチドは配列番号６のポリヌクレオチドである。一部の具現例において、第２ポリヌクレオチドは配列番号７のポリヌクレオチドである。
【0015】
一部の具現例において、第４ポリヌクレオチドは配列番号８のポリヌクレオチドである。
【0016】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクターをさらに含む。
【0017】
一部の具現例において、プラスミドベクターはｐＣＫである。一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０である。
【0018】
一部の具現例において、プラスミドベクターはｐＴｘである。一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０である。
【0019】
他の側面において、本発明は、本願に提供されるＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む薬剤学的組成物を提供する。
【0020】
他の側面において、本発明は、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む薬剤学的組成物を提供し、ここで、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質をエンコードする。
【0021】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質の両方をエンコードする。
【0022】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質の両方を全てエンコードしないわけではない。
【0023】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質も配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質もエンコードしない。
【0024】
一部の具現例において、薬剤学的組成物は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクト、及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクトを含む。
【0025】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０である。一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０である。
【0026】
本発明の一部の側面は、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトの有効量を、神経病症を有する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む神経病症治療方法を提供し、ここで、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、少なくとも１個のヒトＩＧＦ－１異型体を発現させることができる。
【0027】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現させることができる。
【0028】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質を発現させることができない。
【0029】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、方法は、次の段階をさらに含む：第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階であって、ここで、第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。
【0030】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、方法は、次の段階をさらに含む：第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階であって、ここで、第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む。
【0031】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、同時に行われる。
【0032】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、順次に行われる。
【0033】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、１個を超えるヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする。一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質をエンコードする。
【0034】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、次を含む：ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３及び４（配列番号１）と同じ配列を有する第１ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４（配列番号２）と同じ配列を有する第２ポリヌクレオチド又はその切片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）と同じ配列を有する第３ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）と同じ配列を有する第４ポリヌクレオチド又はその切片；及びヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）と同じ配列を有する第５ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート。ここで、第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
【0035】
一部の具現例において、第２ポリヌクレオチドは配列番号６のポリヌクレオチドである。一部の具現例において、第２ポリヌクレオチドは配列番号７のポリヌクレオチドである。
【0036】
一部の具現例において、第４ポリヌクレオチドは配列番号８のポリヌクレオチドである。
【0037】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクターをさらに含む。一部の具現例において、プラスミドベクターはｐＣＫである。一部の具現例において、プラスミドベクターはｐＴｘである。
【0038】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号９のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号２７のポリヌクレオチドを含む。
【0039】
一部の具現例において、有効量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の疼痛を減少させるのに十分な量である。
【0040】
一部の具現例において、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、神経病性疼痛を有する。一部の具現例において、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、糖尿病性神経病症を有する。
【0041】
一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト又は第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、筋肉内注射を含む。
【0042】
さらに他の側面において、本開示内容は、神経病症を治療する医学的方法に用いるためのＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを提供し、前記方法は、神経病症を有する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトの有効量を投与する段階を含み、ここで、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、少なくとも１個のヒトＩＧＦ－１異型体を発現させることができる。
【0043】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現させることができる。一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパクの両方を全て発現させることができるわけではない。
【0044】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、医学的な方法は、次の段階をさらに含む：第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階であって、ここで、第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。
【0045】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、医学的な方法は、次の段階をさらに含む：第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階であって、ここで、第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む。
【0046】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、同時に行われる。一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、順次に行われる。
【0047】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、１個以上のヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする。一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質をエンコードする。
【0048】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、次を含む：ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３及び４（配列番号１）と同じ配列を有する第１ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４（配列番号２）と同じ配列を有する第２ポリヌクレオチド又はその切片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）と同じ配列を有する第３ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）と同じ配列を有する第４ポリヌクレオチド又はその切片；及びヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）と同じ配列を有する第５ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート、ここで、第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
【0049】
一部の具現例において、第２ポリヌクレオチドは配列番号６のポリヌクレオチドである。一部の具現例において、第２ポリヌクレオチドは配列番号７のポリヌクレオチドである。一部の具現例において、第４ポリヌクレオチドは配列番号８のポリヌクレオチドである。
【0050】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクターを含む。一部の具現例において、プラスミドベクターはｐＣＫである。一部の具現例において、プラスミドベクターはｐＴｘである。
【0051】
一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号９のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号２７のポリヌクレオチドを含む。
【0052】
一部の具現例において、有効量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の疼痛を減少させるのに十分な量である。一部の具現例において、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、神経病性疼痛を有する。一部の具現例において、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、糖尿病性神経病症を有する。一部の具現例において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト又は第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、筋肉内注射を含む。
【図面の簡単な説明】
【0053】
【図1】選択的転写開始部位及び選択的スプライシング部位を含むヒトＩＧＦ－１遺伝子の概略図である。ＩＧＦ－１遺伝子から自然的に生成されるＩＧＦ－１異型体は、クラスＩ Ｅｃ（異型体＃１）；クラスＩＩ Ｅａ（異型体＃２）；クラスＩ Ｅｂ（異型体＃３）；及びクラスＩ Ｅａ（異型体＃４）を含む。
【図2A】慢性収縮損傷（ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ，ＣＣＩ）モデルにおいてＩＧＦ－１異型体をエンコードする様々なＤＮＡコンストラクトの治療的な効能をテストするための実験プロトコルを概略的に説明する。
【図2B】図２Ａに概略的に説明された実験においてシャム（Ｓｈａｍ）マウス又はＣＣＩマウスから測定された足引っ込み（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）頻度を示すヒストグラムである。ＣＣＩマウスには、ＤＮＡコンストラクト－（ｉ）ｐＣＫベクター、（ｉｉ）ｐＣＫ－ＩＧＦ－１ ＃１（クラスＩ Ｅｃ異型体を発現させるコンストラクト）、（ｉｉｉ）ｐＣＫ－ＩＧＦ－１ ＃４（クラスＩ Ｅａ異型体を発現させるコンストラクト）、又は（ｉｖ）ｐＣＫ－ＩＧＦ－１ ＃１及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１ ＃４の両方、が投与される。
【図3A】様々なＤＮＡコンストラクトから生成されるＩＧＦ－１異型体の生体内発現を評価するために実施例２において用いられる実験プロトコルを概略的に説明する。
【図3B】ＩＧＦをエンコードしないＤＮＡコンストラクト（“ｐＣＫ”ベクターのみ）；異型体＃１をエンコードするＤＮＡコンストラクト（クラスＩ Ｅｃ異型体）；異型体＃４をエンコードするＤＮＡコンストラクト（クラスＩ Ｅａ異型体）；異型体＃１（クラスＩ Ｅｃ異型体）又は＃４（クラスＩ Ｅａ異型体）をそれぞれエンコードする、２個のコンストラクト；及び二重発現コンストラクトｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の投与後に発現される全てのヒトＩＧＦ－１の異型体の量を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図3C】ＩＧＦ－１異型体＃１（クラスＩ Ｅｃ異型体）及び＃４（クラスＩ Ｅａ異型体）の発現を区別するためのＲＴ－ＰＣＲに用いられる順方向／左側（Ｌ）及び逆方向／右側（Ｒ）プライマーの位置を示す。
【図3D】二重発現コンストラクトｐＣＫ ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ ＩＧＦ－１Ｘ１０から生成される異型体＃１及び＃４の発現を示すＲＴ－ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動を示す。ｐＣＫ ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の両方とも、全ての異形体の高いレベルの発現を誘導した。
【図4A】試験管内の２９３Ｔ細胞においてＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトから発現するタンパク質を評価するために実施例２において用いられるプロトコルを概略的に説明する。
【図4B】（ｉ）異型体＃１をエンコードするコンストラクト、（ｉｉ）異型体＃４をエンコードするコンストラクト、（ｉｉｉ）異型体＃１又は＃４をそれぞれエンコードする、２個のコンストラクト、（ｉｖ）二重発現ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６、又は（ｖ）二重発現ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の試験管内形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後にＩＧＦ－１異型体＃１及び／又は＃４の発現を証明するウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）結果を示す。
【図5A】ＣＣＩ動物モデルにおいて機械的異質痛（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｌｌｏｄｙｎｉａ）を減少させる上で様々なＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトの効能をテストするための実施例３において用いられる実験プロトコルを概略的に説明する。
【図5B】図５Ａに概略的に説明された実験において、シャムマウス又はＣＣＩマウスから測定された足引っ込みの頻度を示すヒストグラムである。ＣＣＩマウスには、ＤＮＡコンストラクト－（ｉ）ｐＣＫベクター、（ｉｉ）ｐＣＫ－ＩＧＦ－１ ＃１（クラスＩ Ｅｃ異型体を発現させるコンストラクト）、（ｉｉｉ）ｐＣＫ－ＩＧＦ－１ ＃４（クラスＩ Ｅａ異型体を発現させるコンストラクト）、又は（ｉｖ）ｐＣＫ－ＩＧＦ－１ ＃１及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１ ＃４の両方、（ｖ）二重発現ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６、又は（ｖｉ）二重発現ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０、が投与される。
【図6A】シャム又は神経損傷動物モデルから得た右同側坐骨神経（ｒｉｇｈｔ ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ）の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージを提供する。神経損傷動物モデルには、ｐＣＫベクター又は二重発現ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０が投与される。
【図6B】ｐＣＫ（“Ｃｒｕｓｈ－ｐＣＫ”）が処理された神経損傷動物及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（“Ｃｒｕｓｈ－ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０”）が処理された神経損傷動物のニューロン径の分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0054】
図面は、単に実例の目的で本発明の様々な具現例を描画する。当業者は、本願に例示されたコンストラクト及び方法の代案的な具現例が、本願に説明された発明の原理から逸脱しない範囲で使用可能であることが、次の議論から容易に認識できよう。
【0055】
１．定義
特に断らない限り、本願において使われる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解される意味を有する。本願において使われる通りに、次の用語は下記のそれらに与えられる意味を有する。
特に断らない限り、本願において使われる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解される意味を有する。本願において使われる通りに、次の用語は下記のそれらに与えられる意味を有する。
【0056】
用語“ＩＧＦ－１の異型体（ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ ＩＧＦ－１）”、“ヒトＩＧＦ－１異型体（ｈｕｍａｎ ＩＧＦ－１ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“ＩＧＦ－１異型体（ＩＧＦ－１ｉｓｏｆｏｒｍ）”は、本願において同じ意味で使われ、自然的に発生するヒトのｐｒｅ－ｐｒｏ－ＩＧＦ－１ポリペプチド、又はそれらの対立遺伝子変異体、スプライス変異体、又は欠失変異体のうち一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％同じアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを指す。自然的に発生するｐｒｅ－ｐｒｏ－ＩＧＦ－１ポリペプチドは、クラスＩ，Ｅｃ（配列番号１６）；クラスＩＩ，Ｅａ（配列番号１８）；クラスＩ，Ｅｂ（配列番号２０）；及びクラスＩ，Ｅａ異型体（配列番号１４）を含む。
【0057】
用語“異形体＃１（Ｉｓｏｆｏｒｍ ＃１）”、“クラスＩ，Ｅｃ異形体（Ｃｌａｓｓ Ｉ，Ｅｃ ｉｓｏｆｏｒｍ）”、“クラスＩ、ＩＧＦ－１Ｅｃ異形体（Ｃｌａｓｓ Ｉ，ＩＧＦ－１Ｅｃ ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“クラスＩ、ＩＧＦ－１Ｅｃ（Ｃｌａｓｓ Ｉ，ＩＧＦ－１Ｅｃ）”は、本願において同じ意味で使われ、配列番号１６のポリペプチドのことを指す。
【0058】
用語“異型体＃２（Ｉｓｏｆｏｒｍ ＃２）”、“クラスＩＩ，Ｅａ異型体（Ｃｌａｓｓ ＩＩ，Ｅａ ｉｓｏｆｏｒｍ）”、“クラスＩＩ、ＩＧＦ－１Ｅａ異型体（Ｃｌａｓｓ ＩＩ，ＩＧＦ－１Ｅａ ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“クラスＩＩ、ＩＧＦ－１Ｅａ（Ｃｌａｓｓ ＩＩ，ＩＧＦ－１Ｅａ）”は、本願において同じ意味で使われ、配列番号１８のポリペプチドのことを指す。
【0059】
用語“異型体＃３（Ｉｓｏｆｏｒｍ ＃３）”、“クラスＩ，Ｅｂ異型体（Ｃｌａｓｓ Ｉ，Ｅｂ ｉｓｏｆｏｒｍ）”、“クラスＩ、ＩＧＦ－１Ｅｂ異型体（Ｃｌａｓｓ Ｉ，ＩＧＦ－１Ｅｂ ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“クラスＩ、ＩＧＦ－１Ｅｂ（Ｃｌａｓｓ Ｉ，ＩＧＦ－１Ｅｂ）”は、本願において同じ意味で使われ、配列番号２０のポリペプチドのことを指す。
【0060】
用語“異型体＃４（Ｉｓｏｆｏｒｍ ＃４）”、“クラスＩ，Ｅａ異型体（Ｃｌａｓｓ Ｉ，Ｅａ ｉｓｏｆｏｒｍ）”、“クラスＩ、ＩＧＦ－１Ｅａ異型体（Ｃｌａｓｓ Ｉ，ＩＧＦ－１Ｅａ ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“クラスＩ、ＩＧＦ－１Ｅａ（Ｃｌａｓｓ Ｉ，ＩＧＦ－１Ｅａ）”は、本願において同じ意味で使われ、配列番号１４のポリペプチドのことを指す。
【0061】
本願に使われた用語“治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）”は、（ａ）神経病症の症状抑制；（ｂ）神経病症の症状緩和；及び（ｃ）神経病症の症状除去といった全ての活動のことを指す。一部の具現例において、本発明の組成物は、神経細胞の成長又は神経細胞死滅の抑制によって神経病症を治療できる。
【0062】
本願に使われた用語“治療的に有効な容量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）”又は“有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）”は、それが投与されて好ましい効果を生成する容量（ｄｏｓｅ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）のことを指す。本方法の脈絡において、治療的に有効な量は、神経病症の症状を治療するための効果的な量である。
【0063】
本願に使われた用語“十分な量（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｏｕｎｔ）”は、好ましい効果を生成するための十分な量のことを指す。
【0064】
本願に使われた用語“デジェネレート配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”又は“デジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）”は、翻訳可能な核酸配列のことを指し、参照核酸配列から翻訳されたのと同じアミノ酸配列を提供する。
【0065】
２． その他解釈規約（Ｏｔｈｅｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎｓ）
本願に言及された範囲は、言及された終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を包括する範囲内の全ての値に対する縮約型（ｓｈｏｒｔｈａｎｄ）と理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０からなる群から選ばれる任意の数字、数字の組合せ、又は下位範囲を含むものと理解される。
本願に言及された範囲は、言及された終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を包括する範囲内の全ての値に対する縮約型（ｓｈｏｒｔｈａｎｄ）と理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０からなる群から選ばれる任意の数字、数字の組合せ、又は下位範囲を含むものと理解される。
【0066】
３． ＩＧＦ－１異型体を発現させるＤＮＡコンストラクト
【0067】
第１の側面において、ヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトが提供される。
【0068】
３．１． ＩＧＦ－１異型体
図１に例示するように、ヒトＩＧＦ－１遺伝子は、ほぼ９０ｋｂのゲノムＤＮＡに亘っている６個のエクソン（エクソン１、２、３、４、５、及び６（６－１及び６－２））を含む。エクソン１及び２は、相互排他的なリーダーエクソン（ｍｕｔｕａｌｌｙ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｌｅａｄｅｒ ｅｘｏｎｓ）であり、それぞれ様々に用いられる複数のプロモーター部位を有する。さらに、ＩＧＦ－１遺伝子は、複数の転写体変異体を生成するために異なるようにスプライシングできる。それぞれの転写体変異体は、可変的な信号伝達ペプチドリーダー配列を有する異なるｐｒｅ－ｐｒｏ－ＩＧＦ－１タンパク質（“ＩＧＦ－１異型体”）をエンコードする。しかし、全ての転写体異型体は、プロセシング後に同じ受容体を使用する同じ成熟した（ｍａｔｕｒｅ）７０個のアミノ酸であるＩＧＦ－１ペプチドを生成する。
図１に例示するように、ヒトＩＧＦ－１遺伝子は、ほぼ９０ｋｂのゲノムＤＮＡに亘っている６個のエクソン（エクソン１、２、３、４、５、及び６（６－１及び６－２））を含む。エクソン１及び２は、相互排他的なリーダーエクソン（ｍｕｔｕａｌｌｙ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｌｅａｄｅｒ ｅｘｏｎｓ）であり、それぞれ様々に用いられる複数のプロモーター部位を有する。さらに、ＩＧＦ－１遺伝子は、複数の転写体変異体を生成するために異なるようにスプライシングできる。それぞれの転写体変異体は、可変的な信号伝達ペプチドリーダー配列を有する異なるｐｒｅ－ｐｒｏ－ＩＧＦ－１タンパク質（“ＩＧＦ－１異型体”）をエンコードする。しかし、全ての転写体異型体は、プロセシング後に同じ受容体を使用する同じ成熟した（ｍａｔｕｒｅ）７０個のアミノ酸であるＩＧＦ－１ペプチドを生成する。
【0069】
Ｐｒｅ－ｐｒｏ－ＩＧＦ－１ペプチドは、それらのリーダー、又は信号、配列及びそれらのカルボキシ（ｃａｒｂｏｘｙ）（Ｃ）末端が異なる。エクソン１又はエクソン２の統合は相互排他的であり、それらのうち一つは、ｐｒｅ－ｐｒｏ－ＩＧＦ－１ペプチドのリーダー配列の役割を担う；他のリーダーエクソンは、５’－ＵＴＲを生成する。Ｐｒｅ－ｐｒｏ－ＩＧＦ－１ポリペプチドは、リーダー及びＥ－ペプチドカルボキシ末端を除去して、成熟した７０個のアミノ酸であるＩＧＦ－１を生成する転写後タンパク質分解的切断を経る。
【0070】
エクソン１を含む転写体は、クラス１転写体（例えば、図１のクラスＩ，Ｅｃ；クラスＩ，Ｅｂ；及びクラスＩ，Ｅａ）と呼ばれるが、エクソン２を含むそれらは、クラス２転写体（例えば、図１のクラスＩＩ，Ｅａ）と呼ばれる。ほぼ全てのｐｒｅ－ｐｒｏペプチドは、エクソン３から得た信号伝達ペプチドにおける２７個のアミノ酸を、エクソン１又は２の包含（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）から得た残りの信号配列と共に含む。少数の転写体は、２２個アミノ酸のより短い信号伝達ペプチドを生成するエクソン３内の他の転写開始部位を用いる。エクソン３及び４は変わらず、成熟したＩＧＦ－１ペプチドのＢ、Ｃ、Ａ、及びＤドメインをエンコードする；エクソン４は、成熟したＩＧＦ－１ペプチドの３分の２をエンコードする。ヒトＥｂペプチドは、エクソン４及び５だけで構成されるのに対し、Ｅｃはエクソン４、５、及び６を含む。
【0071】
選択的スプライシング及び転写の相互排他的な開始は、異なるｐｒｅ－ｐｒｏ－ＩＧＦ－１ポリペプチド（すなわち、ＩＧＦ－１異型体）の生成結果である図１に説明される。具体的に、少なくともエクソン１、３／４、５及び６の切片を含む、クラスＩ，Ｅｃ ＩＧＦ－１異型体（配列番号１６）は、配列番号１７の配列を含む転写体から生成される。少なくともエクソン２、３／４及び６の切片を含む、クラスＩＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体（配列番号１８）は、配列番号１９の配列を含む転写体から生成される。少なくともエクソン１、３／４及び５の切片を含む、クラスＩ，Ｅｂ ＩＧＦ－１異型体（配列番号２０）は、配列番号２１の配列を含む転写体から生成される。少なくともエクソン１、３／４及び６の切片を含む、クラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体（配列番号１４）は、配列番号１５の配列を含む転写体から生成される。
【0072】
たとえ様々な転写体から得られた成熟したＩＧＦ－１タンパク質は異ならないが、様々な転写体異型体は異なる調節的な役割を有することが提示されてきた。変異体形態は、異型体に対する中枢的調節役割を示す異なる安定性、結合パートナー、及び活性を有している。異型体の生物学的重要性はたとえ不明に残っているが、エクソン１を有するクラスＩ異型体は、自己分泌／側分泌の形態であり、エクソン２を有するクラスＩＩ異型体は、内分泌の形態で分泌されるという仮設が立てられた。これはクラスＩＩ転写体が効率的な分泌に関連した典型的な信号ペプチドモチーフを含むのに対し、クラスＩ転写体は分泌を妨害し得るより長い信号ペプチドを有しているという発見に基づく。
【0073】
大部分の組織はクラスＩ転写体を使用すると考えられるが、肝は２つの形態を全て使用し、肝のクラスＩＩ転写体は発達中に優先して強化される。発達中にＩＧＦ－１転写体の産物量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）に多くの変化がある。クラス１，Ｅａは、活性成長期間において最も豊富な形態であり、クラス１，Ｅｂは、初期成長期間において成長板全体にわたって低いレベルであるにも拘わらず、均一に発現することが明らかになった。
【0074】
３．２． ＩＧＦ－１異型体を発現させるＤＮＡコンストラクト
一側面において、本発明は、少なくとも１個のヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能なＤＮＡコンストラクトを提供する。一部の具現例において、それぞれ異なるＩＧＦ－１異型体をエンコードする１個以上のＤＮＡコンストラクトが用いられる。例えば、クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）をエンコードする第１コンストラクト、及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）をエンコードする第２コンストラクトが共に用いられる。一部の具現例において、２個以上の異型体（すなわち、“二重発現コンストラクト”）を発現させるＤＮＡコンストラクトが用いられる。例えば、クラスＩ，Ｅｃ異型体及びクラスＩ，Ｅａ異型体を両方ともエンコードする単一ＤＮＡコンストラクトが用いられてよい。
一側面において、本発明は、少なくとも１個のヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能なＤＮＡコンストラクトを提供する。一部の具現例において、それぞれ異なるＩＧＦ－１異型体をエンコードする１個以上のＤＮＡコンストラクトが用いられる。例えば、クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）をエンコードする第１コンストラクト、及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）をエンコードする第２コンストラクトが共に用いられる。一部の具現例において、２個以上の異型体（すなわち、“二重発現コンストラクト”）を発現させるＤＮＡコンストラクトが用いられる。例えば、クラスＩ，Ｅｃ異型体及びクラスＩ，Ｅａ異型体を両方ともエンコードする単一ＤＮＡコンストラクトが用いられてよい。
【0075】
３．２．１． ＩＧＦ－１エンコーディング配列
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１異型体のうち１個のコーディング配列を含む。例えば、ＤＮＡコンストラクトは、クラスＩ，Ｅａ（配列番号１５）；クラスＩ，Ｅｂ（配列番号２１）；クラスＩ，Ｅｃ（配列番号１７）；又はクラスＩＩ，Ｅａ（配列番号１９）をエンコードする配列を含むことができる。
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１異型体のうち１個のコーディング配列を含む。例えば、ＤＮＡコンストラクトは、クラスＩ，Ｅａ（配列番号１５）；クラスＩ，Ｅｂ（配列番号２１）；クラスＩ，Ｅｃ（配列番号１７）；又はクラスＩＩ，Ｅａ（配列番号１９）をエンコードする配列を含むことができる。
【0076】
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、それぞれの異型体コーディング配列（ＣＤＳ）に対する発現調節配列を含むことによって、１個以上のＩＧＦ－１異型体を発現できるＤＮＡコンストラクトである二重発現コンストラクトである。一部の具現例において、コンストラクトは、２個のコーディング配列間の内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を（例えば、（１）発現調節配列－（２）第１異型体のコーディング配列－（３）ＩＲＥＳ－（４）第２異型体のコーディング配列－（５）転写終結配列の順に）含む。ＩＲＥＳは、翻訳がＩＲＥＳ配列から始まるように許容し、それによって単一コンストラクトから２個のタンパク質生成物の発現を許容する。追加の具現例において、それぞれのＩＧＦ－１単一異型体をエンコードする複数のコンストラクトは、投与される対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において併せて使用され、１個を超えるＩＧＦ－１異型体の発現を誘導する。
【0077】
好ましい具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、選択的スプライシング部位を含むことによって同時に２個以上のＩＧＦ－１異型体を発現させることができる。－例えば、（ｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）；（ｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；（ｉｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）；（ｉｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；（ｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）；（ｖｉ）クラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）
【0078】
例えば、ＤＮＡコンストラクトは、（ｉ）ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３及び４（配列番号１）を含む第１の配列又は第１の配列のデジェネレート配列；（ｉｉ）ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４（配列番号２）を含む第２配列又は第２配列の切片；（ｉｉｉ）ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）を含む第３配列又は第３配列のデジェネレート配列；（ｉｖ）ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）を含む第４配列又は第２配列の切片；及び（ｖ）ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）を含む第５配列又は第５配列のデジェネレート配列；を含むことができる。イントロン１及び２は選択的にスプライシングでき、その結果、２個のＩＧＦ－１異型体が生成される（例えば、クラスＩ，Ｅｃ及びクラスＩ，Ｅａ）。
【0079】
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、１個以上のＩＧＦ－１異型体を発現できるそれの能力と関連した試験管内及び／又は生体内でテストされる。好ましい具現例において、クラスＩ，Ｅｃ及びクラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体の両方を発現できるＤＮＡコンストラクトが選択される。
【0080】
一部の具現例において、コンストラクトは、イントロン４（配列番号２）の全配列又はその切片を含む。好ましい具現例において、コンストラクトは、配列番号６又は配列番号７の配列を有するイントロン４の切片を含む。
【0081】
一部の具現例において、コンストラクトは、イントロン５（配列番号４）の全配列、又はその切片を含む。好ましい具現例において、コンストラクトは、配列番号８の配列を有するイントロン５の切片を含む。
【0082】
（ｉ）ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１～６及び（ｉｉ）ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン１及び２又はイントロン１及び２の様々な切片に該当するｃＤＮＡを含む様々なＤＮＡコンストラクトは、“ＩＧＦ－１Ｘ”と命名され、固有番号が付く。出願人によってテストされたＩＧＦ－１Ｘコンストラクトは、ＩＧＦ－１Ｘ１、ＩＧＦ－１Ｘ２、ＩＧＦ－１Ｘ３、ＩＧＦ－１Ｘ４、ＩＧＦ－１Ｘ５、ＩＧＦ－１Ｘ６、ＩＧＦ－１Ｘ７、ＩＧＦ－１Ｘ８、ＩＧＦ－１Ｘ９及びＩＧＦ－１Ｘ１０を含むが、これに限定されない。テストされたコンストラクトのうち、ＩＧＦ－１Ｘ６及びＩＧＦ－１Ｘ１０は、クラスＩ，Ｅｃ及びクラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体の両方を発現することが明らかにされた。
【0083】
好ましい具現例において、ＩＧＦ－１Ｘ６（配列番号９）又はＩＧＦ－１Ｘ１０（配列番号１０）が用いられる。ｐＣＫベクターにクローニングされたＩＧＦ－１Ｘ６（配列番号９）及びＩＧＦ－１Ｘ１０（配列番号１０）はそれぞれ、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０と命名される。ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６（“ＤＨ５α＿ｐＣＫ－ＩＧＦ１Ｘ６”）で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、２０１８年５月３０日にブダペスト条約の条件によって韓国生物資源センター（ＫＣＴＣ、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）、大韓民国、５６２１２、チョルラプク－ト、チョンウブ－シ、イブシンギル１８１）に受託番号ＫＣＴＣ１３５３９ＢＰとして寄託された。ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（“ＤＨ５α＿ｐＣＫ－ＩＧＦ１Ｘ１０”）で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、２０１８年５月３０日にブダペスト条約の条件によって韓国生物資源センター（ＫＣＴＣ、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）、大韓民国、５６２１２、チョルラプク－ト、チョンウブ－シ、イブシンギル１８１）に受託番号ＫＣＴＣ１３５４０ＢＰとして寄託された。
【0084】
他の好ましい具現例において、ＩＧＦ－１Ｘ６（配列番号９）及びＩＧＦ－１Ｘ１０（配列番号１０）は、ｐＴｘベクターにクローニングされる。ＩＧＦコンストラクトは、それぞれｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０と命名される。
【0085】
本願に記述されたＩＧＦ－１異型体又はＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトは、野生型ヒトＩＧＦ－１異型体からの変形を含むことができる。変形された配列は、最大の方式で変形された配列が野生型ヒトＩＧＦ－１異型体配列と整列されるとき、少なくとも８０％同一性、より好ましくは少なくとも９０％同一性、及び最も好ましくは少なくとも９５％同一性を有する配列を含むことができる。比較のための配列の整列方法は、本技術分野によく公知されている。具体的に、国立生物情報センター（ＮＢＣｌ、ベセスダ、メリーランド州）ウェブサイトのＮＣＢＩ基本ローカル整列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）に開示され、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと併せて用いられる整列アルゴリズムは、同一性百分率を決定するために用いられてよい。
【0086】
３．２．２． ベクター
本発明のＩＧＦ－１異型体を発現させるＤＮＡコンストラクトは、発現する配列と作動可能に連結された１個以上の調節配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）があるベクターを典型的に含む。調節配列は、ＩＧＦ－１異型体の発現を調節する。
本発明のＩＧＦ－１異型体を発現させるＤＮＡコンストラクトは、発現する配列と作動可能に連結された１個以上の調節配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）があるベクターを典型的に含む。調節配列は、ＩＧＦ－１異型体の発現を調節する。
【0087】
ＩＧＦ－１異型体の１個以上の異型体をエンコードするポリヌクレオチドは、発現コンストラクトにおいてプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。用語“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”とは、核酸発現調節配列（プロモーター、信号配列、又は転写因子結合部位の配列のような）と第２核酸配列との間の機能的な連結を指し、ここで、発現調節配列は、第２配列に相応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。
【0088】
典型的な具現例において、ポリヌクレオチドに連結されたプロモーターは、哺乳類細胞のゲノム又は哺乳類ウイルスから得たプロモーター（例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）ウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦｌアルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーター、ベータアクチンプロモーター、ヒトＩＬ－２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ－４遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）遺伝子プロモーター及びヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子プロモーター。ただし、これらに限定されない。）を含み、これらのプロモーターは、ポリヌクレオチドの転写を調節し、好ましくは動物、より好ましくは哺乳類細胞において作動可能である。より好ましくは、本発明において有用なプロモーターは、ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ Ｅａｒｌｙ）遺伝子から得られたプロモーター又はＥＦ１アルファプロモーター、最も好ましくは、ｈＣＭＶ ＩＥ遺伝子由来のプロモーター／エンハンサー及びＡＴＧ開始コドン直前の配列に亘っているエクソン１及びエクソン２配列の全配列を含む５’－ＵＴＲ（非番駅領域）である。
【0089】
本発明において用いられる発現カセットは、例えば、ウシ成長ホルモン終結子（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：６９８３－６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来のポリアデニレーション配列（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：５３８６－５３９３（１９９２））、ＨＩＶ－１ ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１８７０－１８７６（１９９８））、ベータ－グロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ４９：３９９－４０６（１９８７））、ＨＳＶ ＴＫ ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５Ｂｉｏｌ．５：２１０４－２１１３（１９８５））又はポリオマ（ｐｏｌｙｏｍａ）ウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂａｎｄ Ｇ．Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３－４７９０（１９９５））を含むが、これに限定されない、ポリアデニレーション（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列を含むことができる。
【0090】
３．２．３． 非ウイルスベクター
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、１個以上のＩＧＦ－１異型体を発現できる非ウイルスベクターである。
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、１個以上のＩＧＦ－１異型体を発現できる非ウイルスベクターである。
【0091】
典型的な具現例において、非ウイルスベクターは、プラスミドである。現在の好ましい具現例において、プラスミドは、ｐＣＫ、ｐＣＰ、ｐＶＡＸｌ、ｐＴｘ又はｐＣＹである。特に好ましい具現例において、プラスミドはｐＣＫであり、細部事項は、ＷＯ２０００／０４０７３７及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７２：２３０－２３５（２０００）から分かり、それらはいずれも、その全体が本願に参照によって組み込まれる。ｐＣＫ（Ｔｏｐ１０－ｐＣＫ）で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、２００３年３月２１日にブダペスト条約の条件によって韓国微生物文化院（ＫＣＣＭ）に寄託された（受託番号：ＫＣＣＭ－１０４７６）。ｐＣＫ－ＶＥＧＦ１６５（すなわち、ＶＥＧＦコーディング配列があるｐＣＫベクター－Ｔｏｐ１０－ｐＣＫ／ＶＥＧＦ１６５’）で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、１９９９年１２月２７日にブダペスト条約の条件によって韓国微生物文化院（ＫＣＣＭ）に寄託された（受託番号：ＫＣＣＭ－１０１７９）。
【0092】
ｐＣＫベクターは、遺伝子（例えば、ＩＧＦ－１遺伝子）の発現がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のエンハンサー／プロモーター下で調節されるように構成され、細部事項は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７２：２３０（２０００）；ＷＯ２０００／０４０７３７に開示され、それらはいずれも、その全体が本願に参照によって組み込まれる。ｐＣＫベクターは、人体において臨床試験のために用いられており、それの安全性と有効性が確認された（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７８８（２０１１））。
【0093】
好ましい具現例において、ｐＣＫプラスミドは、クラスＩ，Ｅｃ ＩＧＦ－１異型体及び／又はクラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体に対するコーディング配列を含む。特に好ましい具現例において、ｐＣＫプラスミドは、ＩＧＦ－１Ｘ６（すなわち、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６）又はＩＧＦ－１Ｘ１０（すなわち、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０）を含む。
【0094】
他の好ましい具現例において、プラスミドは、ｐＣＫから由来したプラスミドベクターである、ｐＴｘ（配列番号２６）である。ｐＴｘは、ｐＣＫの２回の順次的な突然変異誘発によって生成された。第１の欠失突然変異誘発キャンペンが行われ、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子及びｐＣＫのＣｏｌＥ１との間の不要な配列が除去された。具体的に、欠失突然変異誘発ＰＣＲは、第１のプライマー対（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２及び２３）を用いて行われた。カナマイシン抵抗及びＣｏｌＥ１との間の２２８ベースペア欠失は、プラスミドをシーケンシングすることから確認された。第２欠失突然変異誘発キャンペンは、その後にＨＣＭＶイントロン配列のサイズを最適化するために、第２プライマー対（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４及び２５）を用いて行われた。ＩＥ１エクソン１及びエクソン２間のＨＣＭＶイントロン配列（４２１ベースペア）は削除され、欠失はシーケンシングを行うことによって確認された。
【0095】
特定の具現例において、ｐＴｘプラスミドは、ＩＧＦ－１Ｘ６（すなわち、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６）又はＩＧＦ－１Ｘ１０（すなわち、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０）を含む。例えば、ｐＴｘ－１Ｘ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）は、５’でＣｌａＩ酵素及び３’でＳａｌ１酵素で切れたｐＴｘにＩＧＦ－１Ｘ１０をライゲーションすることによって生成される。
【0096】
３．２．４． ウイルスベクター
他の具現例において、技術分野に公知された様々なウイルスベクターは、本発明の１個以上のＩＧＦ－１異型体を伝達し発現させるように用いられてよい。例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、又はアデノ付属ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ）を用いて開発されたベクターは、本発明の一部の具現例に用いられてよい。
他の具現例において、技術分野に公知された様々なウイルスベクターは、本発明の１個以上のＩＧＦ－１異型体を伝達し発現させるように用いられてよい。例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、又はアデノ付属ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ）を用いて開発されたベクターは、本発明の一部の具現例に用いられてよい。
【0097】
（ａ）レトロウイルス
比較的大きい外因性遺伝子を運搬できるレトロウイルスは、それらのゲノムを宿主ゲノムに統合し、広い宿主スペクトラムを有するという点から、ウイルス遺伝子伝達ベクターとして用いられてきた。
比較的大きい外因性遺伝子を運搬できるレトロウイルスは、それらのゲノムを宿主ゲノムに統合し、広い宿主スペクトラムを有するという点から、ウイルス遺伝子伝達ベクターとして用いられてきた。
【0098】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、１個以上のＩＧＦ－１異型体のコーディング配列）は、複製欠陥ウイルスを生成するために、あるウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入され、レトロウイルスベクターが構築された。ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ（長い末端反復）及びＷ成分は含まないパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）細胞株が構築され、ビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）が生成される（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３－１５９（１９８３））。本発明のポリヌクレオチド、ＬＴＲ及びＷを含む組換えプラスミドが細胞株に導入されるとき、Ｗ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写体がウイルス粒子にパッケージングされた後、培養培地に分泌されるようにする（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ “Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，” Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ｅｄｓ．）、Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４９４－５１３（１９８８））。組換えレトロウイルスを含む培地は、その次に収集され、選択的に濃縮されて遺伝子伝達のために用いられる。
【0099】
２世代ウイルスベクターを用いる成功的な遺伝子伝達が報告されてきている。Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１３７３－１３７６（１９９４））は、ＥＰＯ（赤血球生成因子）配列が外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）部位の代わりに挿入され、順次に新しい結合特性を有するキメラタンパク質を生成する、モロニー（ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウイルスの変異体を作製した。同様に、本遺伝子伝達システムは、２世代レトロウイルスベクターに対する構築戦略によって構築されてよい。
【0100】
（ｂ）レンチウイルス
レンチウイルスはまた、本発明の一部の具現例において用いられてよい。レンチウイルスは、レトロウイルスの下位クラスである。しかし、レンチウイルスは、非分裂する細胞のゲノムに統合され得るが、レトロウイルスは、分裂する細胞にのみ感染され得る。
レンチウイルスはまた、本発明の一部の具現例において用いられてよい。レンチウイルスは、レトロウイルスの下位クラスである。しかし、レンチウイルスは、非分裂する細胞のゲノムに統合され得るが、レトロウイルスは、分裂する細胞にのみ感染され得る。
【0101】
レンチウイルスベクターは、通常、いくつかのプラスミドで形質転換されたパッケージング細胞株、一般にＨＥＫ２９３から生産される。プラスミドは、（１）カプシド（ｃａｐｓｉｄ）及び逆転写酵素のようなビリオンタンパク質をエンコードするパッケージングプラスミド、（２）外因性遺伝子を含むプラスミド（例えば、１個以上のＩＧＦ－１異型体のコーディング配列）を含んでターゲットに伝達される。
【0102】
ウイルスが細胞に投入されると、ＲＮＡ形態のウイルスゲノムは逆転写されてＤＮＡを生成し、その後、ウイルス統合酵素（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）によってゲノム中に挿入される。したがって、レンチウイルスベクターと共に伝達される外因性要素は、ゲノム中に残ることができ、細胞の分裂の際に細胞の後代に伝達される。
【0103】
（ｃ）アデノウイルス
アデノウイルスは、それの中間サイズゲノム、操作の容易性、高い力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染性の点から、遺伝子伝達システムに一般的に用いられてきた。ウイルスゲノムの両末端は、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングをするために必要なｃｉｓ要素である１００～２００ｂｐのＩＴＲ（逆末端反復）を含む。Ｅｌ部位（ＥｌＡ及びＥｌＢ）は、ウイルスゲノム及びいくつかの細胞遺伝子の転写調節を担当するタンパク質をエンコードする。Ｅ２部位（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を招く。
アデノウイルスは、それの中間サイズゲノム、操作の容易性、高い力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染性の点から、遺伝子伝達システムに一般的に用いられてきた。ウイルスゲノムの両末端は、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングをするために必要なｃｉｓ要素である１００～２００ｂｐのＩＴＲ（逆末端反復）を含む。Ｅｌ部位（ＥｌＡ及びＥｌＢ）は、ウイルスゲノム及びいくつかの細胞遺伝子の転写調節を担当するタンパク質をエンコードする。Ｅ２部位（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を招く。
【0104】
いままで開発されたアデノウイルスベクターのうち、Ｅ１部位が欠失した複製不能であるアデノウイルスが一般に用いられる。アデノウイルスベクターの欠失したＥ３部位は、形質転換遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）のための挿入部位を提供できる（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３－５５１（１９８２）；及びＲｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０６６－１０７３（１９８９））。したがって、デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）エンコーディングヌクレオチド配列は、欠失したＥ１領域（ＥｌＡ領域及び／又はＥｌＢ５領域、好ましくは、ＥｌＢ領域）又は欠失したＥ３領域に挿入されることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、欠失したＥ４領域に挿入されてよい。用語“欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）”は、ウイルスゲノム配列を参照して全体欠失及び部分欠失を含む。自然において、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングし、約２ｋｂの追加ＤＮＡ容量を提供することができる（Ｇｈｏｓｈ－Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６：１７３３－１７３９（１９８７））。これと関連して、アデノウイルスに挿入される上述した外部配列は、アデノウイルス野生型ゲノムにさらに挿入されてよい。
【0105】
アデノウイルスは、公知の血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）又は下位グループＡ～Ｆのうち任意のものでよい。下位グループＣのアデノウイルス類型５は、本発明においてアデノウイルス遺伝子伝達システムを構築するための最も好ましい開始物質である。アデノウイルス類型５に関する多くの生化学的及び遺伝的情報が公知されている。アデノウイルス遺伝子伝達システムによって伝達される外来遺伝子は、宿主細胞に対するエピソーム（ｅｐｉｓｏｍａｌ）、及び遺伝毒性である。したがって、アデノウイルス遺伝子伝達システムを用いた遺伝子治療は実質的に安全であり得る。
【0106】
（ｄ）アデノ付属ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ付属ウイルスは、非分裂細胞及び様々な類型の細胞を感染させることができるので、本発明の遺伝子伝達システムを構築するのに有用にする。アデノ付属ウイルスベクターの用途及び準備に対する詳細な記述は、米国特許番号第１０，３０８，９５８号；第１０，３０１，６５０号；第１０，３０１，６４８号；第１０，２６６，８４６号；第１０，２６５，４１７号；第１０，２０８，１０７号；第１０，１６７，４５４号；第１０，１５５，９３１号；第１０，１４９，８７３号；第１０，１４４，７７０号；第１０，１３８，２９５号；第１０，１３７，１７６号；第１０，１１３，１８２号；第１０，０４１，０９０号；第９，８９０，３６５号；第９，７９０，４７２号；第９，７７０，０１１号；第９，７３８，６８８号；第９，７３７，６１８号；第９，７１９，１０６号；第９，６７７，０８９号；第９，６１７，５６１号；第９，５９７，３６３号；第９，５９３，３４６号；第９，５８７，２５０号；第９，５６７，６０７号；第９，４９３，７８８号；第９，３８２，５５１号；第９，３５９，６１８号；第９，２１７，１５９号；第９，２０６，２３８号；第９，１６３，２６０号；第９，１３３，４８３号；第８，９６２，３３２から見出すことができ、その開示内容は、その全体が本願に参照によって含まれ、第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号、その開示内容は、その全体が本願に参照によって組み込まれる。
アデノ付属ウイルスは、非分裂細胞及び様々な類型の細胞を感染させることができるので、本発明の遺伝子伝達システムを構築するのに有用にする。アデノ付属ウイルスベクターの用途及び準備に対する詳細な記述は、米国特許番号第１０，３０８，９５８号；第１０，３０１，６５０号；第１０，３０１，６４８号；第１０，２６６，８４６号；第１０，２６５，４１７号；第１０，２０８，１０７号；第１０，１６７，４５４号；第１０，１５５，９３１号；第１０，１４９，８７３号；第１０，１４４，７７０号；第１０，１３８，２９５号；第１０，１３７，１７６号；第１０，１１３，１８２号；第１０，０４１，０９０号；第９，８９０，３６５号；第９，７９０，４７２号；第９，７７０，０１１号；第９，７３８，６８８号；第９，７３７，６１８号；第９，７１９，１０６号；第９，６７７，０８９号；第９，６１７，５６１号；第９，５９７，３６３号；第９，５９３，３４６号；第９，５８７，２５０号；第９，５６７，６０７号；第９，４９３，７８８号；第９，３８２，５５１号；第９，３５９，６１８号；第９，２１７，１５９号；第９，２０６，２３８号；第９，１６３，２６０号；第９，１３３，４８３号；第８，９６２，３３２から見出すことができ、その開示内容は、その全体が本願に参照によって含まれ、第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号、その開示内容は、その全体が本願に参照によって組み込まれる。
【0107】
遺伝子伝達システムとしてＡＡＶに対する研究結果は、ＬａＦａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｏｌｏｇｙ，１６２：４８３４８６（１９８８）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（ＮＹ）、２１：９２８－９３３（１９９３），Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４：１４４０－１４４８（１９９４）及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：２９－３７（１９９５）に開示されている。典型的に、組換えＡＡＶウイルスは、２個のＡＡＶ末端反復が側面にある（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）関心遺伝子（すなわち、伝達される関心ヌクレオチド配列、例えば、ＩＧＦ－１異型体のコーディング配列）を含むプラスミド、及び末端反復のない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミドを同時形質感染することによって製造される（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．，６５：２９３６－２９４５（１９９１））。
【0108】
（ｅ）その他ウイルスベクター
その他ウイルスベクターは、本発明において遺伝子伝達システムとして用いられてよい。ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１０：６４９－６５７（１９９９）；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、“哺乳類発現ベクター、”Ｉｎ：ベクター：分子クローニングベクター及びその用途に関する調査。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４６７－４９２（１９８８）；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、“動物ＤＮＡウイルスから得た遺伝子伝達のためのベクター：伝達された遺伝子の一時的又は安定的発現、”Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ，ｅｄ．遺伝子伝達。Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１１７－１４８（１９８６）及びＣｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６８：１－１０（１９８８））、レンチウイルス（Ｗａｎｇ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：ＲＳ５－６２（１９９９））及び単純疱疹ウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．１０１５Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１４１１－１４１５（１９９５））のようなウイルスから得たベクターは、本発明のポリヌクレオチドを細胞に伝達するための本伝達システムにおいて用いられてよい。
その他ウイルスベクターは、本発明において遺伝子伝達システムとして用いられてよい。ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１０：６４９－６５７（１９９９）；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、“哺乳類発現ベクター、”Ｉｎ：ベクター：分子クローニングベクター及びその用途に関する調査。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４６７－４９２（１９８８）；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、“動物ＤＮＡウイルスから得た遺伝子伝達のためのベクター：伝達された遺伝子の一時的又は安定的発現、”Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ，ｅｄ．遺伝子伝達。Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１１７－１４８（１９８６）及びＣｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６８：１－１０（１９８８））、レンチウイルス（Ｗａｎｇ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：ＲＳ５－６２（１９９９））及び単純疱疹ウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．１０１５Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１４１１－１４１５（１９９５））のようなウイルスから得たベクターは、本発明のポリヌクレオチドを細胞に伝達するための本伝達システムにおいて用いられてよい。
【0109】
４． ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む薬剤学的組成物
さらに他の側面において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む薬剤学的組成物が提供される。
さらに他の側面において、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む薬剤学的組成物が提供される。
【0110】
４．１． 投与に適した薬剤学的組成物及び単位投与剤形
静脈内、筋肉内、皮膚内、又は皮下投与のために、ＤＮＡコンストラクトは、発熱源がなく、適度なｐＨ、等張性（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ）及び安定性を有する非経口的に許容される水溶性溶液の剤形とすることができる。本技術分野における関連者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸化リンゲル注射のような等張性運搬体、必要によって、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又はその他添加剤を用いて適切な溶液を製造することができる。
静脈内、筋肉内、皮膚内、又は皮下投与のために、ＤＮＡコンストラクトは、発熱源がなく、適度なｐＨ、等張性（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ）及び安定性を有する非経口的に許容される水溶性溶液の剤形とすることができる。本技術分野における関連者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸化リンゲル注射のような等張性運搬体、必要によって、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又はその他添加剤を用いて適切な溶液を製造することができる。
【0111】
一部の具現例において、薬剤学的組成物は、１個のＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトを含む。例えば、ＤＮＡコンストラクトは、クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）；クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）；クラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；又はクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を発現させることができる。
【0112】
一部の具現例において、薬剤学的組成物は、１個を超えるＤＮＡコンストラクトを含み、それぞれは、１個のＩＧＦ－１異型体をエンコードする。例えば、薬剤学的組成物は、（ｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクト及びクラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクト；（ｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクト及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクト；（ｉｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクト及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクト；（ｉｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクト及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクト；（ｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクト及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクト；（ｖｉ）クラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクト及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクトを含むことができる。
【0113】
一部の具現例において、薬剤学的組成物は、１個を超えるＩＧＦ－１異型体を発現できるＤＮＡコンストラクトである二重発現コンストラクトを含む。例えば、薬剤学的組成物は、（ｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）；（ｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；（ｉｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）；（ｉｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；（ｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）；（ｖｉ）クラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を発現できる二重発現コンストラクトを含むことができる。
【0114】
一部の具現例において、薬剤学的組成物は、二重発現コンストラクトの、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を含む。一部の具現例において、薬剤学的組成物は、二重発現コンストラクトの、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を含む。一部の具現例において、薬剤学的組成物は、例えば、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の両方を含む２個の二重発現コンストラクトを含む。一部の具現例において、薬剤学的組成物は、例えば、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の両方を含む２個の二重発現コンストラクトを含む。
【0115】
一部の具現例において、薬剤学的組成物は、他の治療製剤をさらに含む。例えば、薬剤学的組成物は、神経病症を治療するのに効果的な他の治療製剤をさらに含むことができる。
【0116】
様々な具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度である液体組成物中に存在する。一部の具現例において、単位投与剤形は、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度である薬剤学的組成物の２ｍｌを含むバイアルである。一部の具現例において、単位投与剤形は、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度である薬剤学的組成物の１ｍｌを含むバイアルである。一部の具現例において、単位投与剤形は、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度である薬剤学的組成物の１ｍｌ未満を含むバイアルである。
【0117】
一部の具現例において、単位投与剤形は、バイアル（ｖｉａｌ）、アンプル（ａｍｐｕｌｅ）、瓶（ｂｏｔｔｌｅ）、又はあらかじめ充填された注射器（ｐｒｅ－ｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）である。一部の具現例において、単位投与剤形は、本発明のＤＮＡコンストラクトの０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、１６ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、又は２００ｍｇを含む。
【0118】
一部の具現例において、単位投与剤形における薬剤学的組成物は、液体の剤形である。様々な具現例において、単位投与剤形は、薬剤学的組成物の０．１ｍｌ～５０ｍｌを含む。一部の具現例において、単位投与剤形は、薬剤学的組成物の０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２．５ｍｌ、５ｍｌ、７．５ｍｌ、１０ｍｌ、２５ｍｌ、又は５０ｍｌを含む。
【0119】
特定具現例において、単位投与剤形は、あらかじめ充填された注射器、自動注射器、及び自動注射ペンを含む皮下、皮膚内、又は筋肉内投与に適した単位投与剤形具現例における薬剤学的組成物の０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌ又は２ｍｌを含むバイアルであり、それぞれは、本願に記載された上記の薬剤学的組成物のあらかじめ決定された量を含む。
【0120】
様々な具現例において、単位投与剤形は、注射器及びあらかじめ決定された量の薬剤学的組成物を含むあらかじめ充填された注射器である。特定のあらかじめ充填された注射器の具現例において、注射器は、皮下投与に適している。特定の具現例において、注射器は、自己投与に適している。特定の具現例において、あらかじめ充填された注射器は、使い捨て注射器である。
【0121】
様々な具現例において、あらかじめ充填された注射器は、約０．１ｍＬ～約０．５ｍＬの薬剤学的組成物を含む。特定の具現例において、注射器は、約０．５ｍＬの薬剤学的組成物を含む。特定の具現例において、注射器は、約１．０ｍＬの薬剤学的組成物を含む。特定の具現例において、注射器は、約２．０ｍＬの薬剤学的組成物を含む。
【0122】
特定の具現例において、単位投与剤形は、自動注射ペンである。自動注射ペンは、本願に記載された通り、薬剤学的組成物を含む自動注射ペンを含む。一部の具現例において、自動注射ペンは、あらかじめ決定された容量の薬剤学的組成物を伝達する。他の具現例において、自動注射ペンは、ユーザによって設定された体積の薬剤学的組成物を伝達するように構成される。
【0123】
様々な具現例において、自動注射ペンは、約０．１ｍＬ～約０．５ｍＬの薬剤学的組成物を含む。特定の具現例において、自動注射ペンは、約０．５ｍＬの薬剤学的組成物を含む。特定の具現例において、自動注射ペンは、約０．１ｍＬの薬剤学的組成物を含む。他の具現例において、自動注射ペンは、約５．０ｍＬの薬剤学的組成物を含む。
【0124】
４．２． 凍結乾燥したＤＮＡ剤形
一部の具現例において、本発明のＤＮＡコンストラクトは、凍結乾燥した組成物として剤形化される。特定の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、米国特許番号第８，３８９，４９２号に開始されているように凍結乾燥し、その全体が本願に参照によって組み込まれる。
一部の具現例において、本発明のＤＮＡコンストラクトは、凍結乾燥した組成物として剤形化される。特定の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、米国特許番号第８，３８９，４９２号に開始されているように凍結乾燥し、その全体が本願に参照によって組み込まれる。
【0125】
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、凍結乾燥前に特定賦形剤、例えば、炭水化物及び塩と共に剤形化される。診断又は治療製剤として用いられるＤＮＡコンストラクトの安定性は、安定した量の炭水化物を含む水溶性溶液と共に凍結乾燥する前にＤＮＡコンストラクトを剤形化することによって増大できる。
【0126】
一部の具現例において、他の炭水化物が組成物に用いられる。炭水化物は、蔗糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、乳糖（ｌａｃｔｏｓｅ）、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、五炭糖（ｐｅｎｔｏｓｅ）、リボース（ｒｉｂｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、六炭糖（ｈｅｘｏｓｅ）、イドース（ｉｄｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、タロース（ｔａｌｏｓｅ）、七炭糖（ｈｅｐｔｏｓｅ）、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、グルコン酸（ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、メチルａ－グルコピラノシド（ｍｅｔｈｙｌ ａ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、イソアスコルビン酸（ｉｓｏａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、ラクトン（ｌａｃｔｏｎｅ）、ソルボース（Ｓｏｒｂｏｓｅ）、グルカル酸（ｇｌｕｃａｒｉｃ ａｃｉｄ）、エリトロース（ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ）、トレオース（ｔｈｒｅｏｓｅ）、アロース（ａｌｌｏｓｅ）、アルトロース（ａｌｔｒｏｓｅ）、グロース（ｇｕｌｏｓｅ）、エリトルロース（ｅｒｙｔｈｒｕｌｏｓｅ）、リブロース（ｒｉｂｕｌｏｓｅ）、キシルロース（ｘｙｌｕｌｏｓｅ）、プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、マンヌロン酸（ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、グルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトサミン（ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アラビナン（ａｒａｂｉｎａｎｓ）、フルクタン（ｆｒｕｃｔａｎｓ）、フカン（ｆｕｃａｎｓ）、ガラクタン（ｇａｌａｃｔａｎｓ）、ガラクツロナン（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎｓ）、グルカン（ｇｌｕｃａｎｓ）、マンナン（ｍａｎｎａｎｓ）、キシラン（ｘｙｌａｎｓ）、レバン（ｌｅｖａｎ）、フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、ガラクトカロロース（ｇａｌａｃｔｏｃａｒｏｌｏｓｅ）、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎｓ）、ペクチン酸（ｐｅｃｔｉｃ ａｃｉｄｓ）、アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ）、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）、グリコーゲン（ｇｌｙｃｏｇｅｎ）、アミロペクチン（ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、プスツラン（ｐｕｓｔｕｌａｎ）、キチン（ｃｈｉｔｉｎ）、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、ケラチン（ｋｅｒａｔｉｎ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、デルマタン（ｄｅｒｍａｔａｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、キサンタンガム（ｘａｎｔｈａｍ ｇｕｍ）、又は澱粉（ｓｔａｒｃｈ）のような、単糖類、オリゴ糖、又は多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）でよい。
【0127】
一連の具現例において、炭水化物はマンニトール又は蔗糖である。
【0128】
凍結乾燥前の炭水化物溶液は、水中の炭水化物に該当したり、又は緩衝液が含まれてよい。このような緩衝液の例示は、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）、トリス（ＴＲＩＳ）又はトリス／イーディーティエ－（ＴＲＩＳ／ＥＤＴＡ）を含む。典型的に、炭水化物溶液は、約０．０５％～約３０％蔗糖、典型的に０．１％～約１５％蔗糖、０．２％～約５％のように、１０％又は１５％蔗糖、好ましくは、約０．５％～１０％蔗糖、１％～５％蔗糖、１％～３％蔗糖、及び最も好ましくは約１．１％蔗糖の最終濃度でＤＮＡコンストラクトと結合する。
【0129】
本発明のＤＮＡ剤形はまた、塩、例えば、塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含むことができる。一部の具現例において、塩は、塩化ナトリウムである。一部の具現例において、ＤＮＡ剤形の塩は、約０．００１％～約１０％、約０．１％～５％、約０．１％～４％、約０．５％～２％、約０．８％～１．５％、約０．８％～１．２％ ｗ／ｖからなる群から選ばれる量で存在する。特定の具現例において、ＤＮＡ剤形の塩は、約０．９％ ｗ／ｖの量で存在する。
【0130】
凍結乾燥した剤形から再溶解された液体組成物中のＤＮＡコンストラクトの最終濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬでよい。例えば、最終濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約３．５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約４．５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約５．５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約３０ｍｇ／ｍＬでよい。本発明の特定の具現例において、ＤＮＡコンストラクトの最終濃度は、約１００μｇ／ｍＬ～約２．５ｍｇ／ｍＬである。本発明の特定の具現例において、ＤＮＡコンストラクトの最終濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬである。
【0131】
本発明のＤＮＡ剤形は、本技術分野に公知の標準条件下で凍結乾燥する。本発明のＤＮＡ剤形の凍結乾燥のための方法は、（ａ）プラスミドＤＮＡがＩＧＦ－１遺伝子又はその変異体を含むＤＮＡ剤形（例えば、プラスミドＤＮＡを含むＤＮＡ剤形）、塩及び炭水化物が入っている容器（例えば、バイアル）を凍結乾燥器に積載し、凍結乾燥器は約５℃～約－５０℃の開始温度を有する段階；（ｂ）ＤＮＡ剤形を零下の温度（例えば、－１０℃～－５０℃）に冷却させる段階；及び（ｃ）ＤＮＡ剤形を実質的に乾燥させる段階を含むことができる。本発明のＤＮＡ剤形の凍結乾燥のための条件（例えば、温度及び期間）は、凍結乾燥媒介変数（例えば、凍結乾燥機械の類型、使用されるＤＮＡの量、及び使用される容器のサイズ）に影響を及ぼす要因を考慮して、本技術分野における通常の当業者によって調整されてよい。
【0132】
凍結乾燥したＤＮＡ剤形を入れた容器は、その後にシールされ、様々な温度で延長された期間だけ保存可能である（例えば、室温～約－１８０℃、好ましくは約２～８℃～約－８０℃、より好ましくは約－２０℃～約－８０℃、及び最も好ましくは約－２０℃）。特定の側面において、凍結乾燥したＤＮＡ剤形は、約２～８℃～約－８０℃の範囲で実質的な活性を失うことなく少なくとも６ヶ月の期間に好適に安定である。プラスミドＤＮＡ剤形の安定的な保存はまた、研究又はプラスミドベース治療のように、使用前に長期間に安定した形態でプラスミドＤＮＡを保存することに該当し得る。保存期間は、数ヶ月、１年、５年、１０年、１５年、又は最大では２０年と長い。好ましく準備されたものは、最小で約３年の期間において安定である。
【0133】
５．神経病症治療方法
さらに他の側面において、ヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトを投与することによって神経病症を治療する方法が提示される。
さらに他の側面において、ヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトを投与することによって神経病症を治療する方法が提示される。
【0134】
６．５．１． 異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトの投与
方法は、治療的に効果的な量のヒトＩＧＦ－１異型体を発現させるＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む。対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、神経病症のおる人又は動物でよい。
方法は、治療的に効果的な量のヒトＩＧＦ－１異型体を発現させるＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む。対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、神経病症のおる人又は動物でよい。
【0135】
一部の具現例において、方法は、１個のヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトの投与を含む。一部の具現例において、方法は、ヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクトの投与又はヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクトの投与を含む。一部の具現例において、方法は、第１のヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクトの投与及び第２ヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクトの投与を含む。一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１異型体はクラスＩ，Ｅｃ（異型体＃１）であり、第２のＩＧＦ－１異型体はクラスＩ，Ｅａ（異型体＃４）である。一部の具現例において、第１のＩＧＦ－１異型体はクラスＩ，Ｅａ（異型体＃４）であり、第２のＩＧＦ－１異型体はクラスＩ，Ｅｃ（異型体＃１）である。第１及び第２ＤＮＡコンストラクトは、同時に又は順次に投与されてよい。
【0136】
一部の具現例において、方法は、二重発現コンストラクトである、１個を超えるヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトの投与を含む。一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、クラスＩ，Ｅｃ（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）の両方を発現させることができる。一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、さらに、クラスＩ，Ｅｂ又はクラスＩＩ，Ｅａを発現させる。一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、クラスＩ，Ｅｂ又はクラスＩＩ，Ｅａを発現させることができない。一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、クラスＩ，Ｅｃ（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を発現させることができるが、任意の他のＩＧＦ－１異型体は発現させることができない。
【0137】
一部の具現例において、方法は、次を含む、ヒトＩＧＦ－１をエンコードするＤＮＡコンストラクトの投与を含む：ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３及び４（配列番号１）のような配列を有する第１ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４（配列番号２）のような配列を有する第２ポリヌクレオチド又はその切片；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）のような配列を有する第３ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート；ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）のような配列を有する第４ポリヌクレオチド又はその切片；及びヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）のような配列を有する第５ポリヌクレオチド又はそのデジェネレート。ここで、第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
【0138】
一部の具現例において、方法は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の投与を含む。一部の具現例において、方法は、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の投与を含む。
【0139】
一部の具現例において、方法は、本願に提供される、１個を超えるＤＮＡコンストラクトの投与を含む。
【0140】
５．１．１． 伝達方法
様々な伝達方法は、ＩＧＦ－１の１個以上の異型体を発現させるＤＮＡコンストラクトを投与するために用いられてよい。
様々な伝達方法は、ＩＧＦ－１の１個以上の異型体を発現させるＤＮＡコンストラクトを投与するために用いられてよい。
【0141】
５．１．１．１． 注射（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、液体薬剤学的組成物の注射によって投与される。
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、液体薬剤学的組成物の注射によって投与される。
【0142】
現在、好ましい具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、筋肉内注射によって投与される。一般に、ＤＮＡコンストラクトは、神経損傷部位、疼痛部位又は患者の認知する疼痛部位、又は神経病性疾病の他の症状の部位の近くに筋肉内注射で投与される。一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の手、足、脚、又は腕の筋肉に投与される。
【0143】
一部の具現例において、コンストラクトは、皮下又は皮膚内に注射される。
【0144】
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、静脈内伝達で投与される。特定の具現例において、コンストラクトは、逆行性（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ）静脈内注射で注射される。
【0145】
５．１．１．２． 電気穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）
プラスミドＤＮＡの生体内細胞への形質転換効率は、一部の場合、注射後電気穿孔を行うことによって改善され得る。したがって、一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、注射後電気穿孔で投与される。特定の具現例において、電気穿孔は、ＴｒｉＧｒｉｄ（登録商標）伝達システム（Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、米国）を用いて投与される。
プラスミドＤＮＡの生体内細胞への形質転換効率は、一部の場合、注射後電気穿孔を行うことによって改善され得る。したがって、一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、注射後電気穿孔で投与される。特定の具現例において、電気穿孔は、ＴｒｉＧｒｉｄ（登録商標）伝達システム（Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、米国）を用いて投与される。
【0146】
５．１．１．３． ソノポレーション（Ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）
一部の具現例において、ソノポレーションが用いられ、本発明のＤＮＡコンストラクトの形質転換効率を強化させる。ソノポレーションは、超音波を用いて一時的に細胞膜を透過化し、ＤＮＡの細胞吸収を許容する。ＤＮＡコンストラクトは、微細気泡内に統合されて全身循環で投与された後、超音波を外部適用できる。超音波は、ターゲット組織内で微細気泡の空洞現象（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）を誘導し、コンストラクトの放出及び形質感染を招く。
一部の具現例において、ソノポレーションが用いられ、本発明のＤＮＡコンストラクトの形質転換効率を強化させる。ソノポレーションは、超音波を用いて一時的に細胞膜を透過化し、ＤＮＡの細胞吸収を許容する。ＤＮＡコンストラクトは、微細気泡内に統合されて全身循環で投与された後、超音波を外部適用できる。超音波は、ターゲット組織内で微細気泡の空洞現象（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）を誘導し、コンストラクトの放出及び形質感染を招く。
【0147】
５．１．１．４． マグネトフェクション（Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）
一部の具現例において、マグネトフェクションが用いられ、本発明のＤＮＡコンストラクトの形質感染効率を強化させる。コンストラクトは、磁性を持つナノ粒子に結合した後に投与される。高勾配（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｉｅｎｔ）外部磁石の適用は、複合物がターゲットに捕らえられて固定されるようにする。ＤＮＡコンストラクトは、架橋（ｃｒｏｓｓ ｌｉｎｋｉｎｇ）分子の酵素的切断、電荷相互作用又は基質の分解によって放出されてよい。
一部の具現例において、マグネトフェクションが用いられ、本発明のＤＮＡコンストラクトの形質感染効率を強化させる。コンストラクトは、磁性を持つナノ粒子に結合した後に投与される。高勾配（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｉｅｎｔ）外部磁石の適用は、複合物がターゲットに捕らえられて固定されるようにする。ＤＮＡコンストラクトは、架橋（ｃｒｏｓｓ ｌｉｎｋｉｎｇ）分子の酵素的切断、電荷相互作用又は基質の分解によって放出されてよい。
【0148】
５．１．１．５． リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）
一部の具現例において、本発明のＤＮＡコンストラクトは、リポソームによって伝達されてよい。リポソームは、リン脂質が過量の水溶性媒質に懸濁される時に自発的に形成される。リポソーム媒介ＤＮＡ伝達は、Ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．５６６：７１７－７３０（２０１９）；Ｒａｓｏｕｌｉａｎｂｏｒｏｕｊｅｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｅｎｇ Ｃ Ｍａｔｅｒ Ｂｉｏｌ Ａｐｐｌ．７５：１９１－１９７（２０１７）；Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ６６（３）：１５８－１６４（２０１１）；Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５－１９０（１９８２）及びＮｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７－１７６（１９８７）に記述されているように成功的に進行されてきた。リポソームを用いて動物細胞を形質感染させるための商業的に接近可能な製剤の例には、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））が含まれる。本発明のＤＮＡコンストラクトを捕獲するリポソームは、細胞内移入（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、吸着（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）及び融合（ｆｕｓｉｏｎ）のようなメカニズムによって細胞と相互作用した後、配列を細胞に伝達する。
一部の具現例において、本発明のＤＮＡコンストラクトは、リポソームによって伝達されてよい。リポソームは、リン脂質が過量の水溶性媒質に懸濁される時に自発的に形成される。リポソーム媒介ＤＮＡ伝達は、Ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．５６６：７１７－７３０（２０１９）；Ｒａｓｏｕｌｉａｎｂｏｒｏｕｊｅｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｅｎｇ Ｃ Ｍａｔｅｒ Ｂｉｏｌ Ａｐｐｌ．７５：１９１－１９７（２０１７）；Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ６６（３）：１５８－１６４（２０１１）；Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５－１９０（１９８２）及びＮｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７－１７６（１９８７）に記述されているように成功的に進行されてきた。リポソームを用いて動物細胞を形質感染させるための商業的に接近可能な製剤の例には、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））が含まれる。本発明のＤＮＡコンストラクトを捕獲するリポソームは、細胞内移入（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、吸着（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）及び融合（ｆｕｓｉｏｎ）のようなメカニズムによって細胞と相互作用した後、配列を細胞に伝達する。
【0149】
５．１．１．６． 形質感染（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ウイルスベクターがＩＧＦ－１をエンコードするＤＮＡコンストラクトを伝達するために用いられるとき、コンストラクトは、本技術分野に公知の様々なウイルス感染方法によって細胞内に伝達されてよい。ウイルスベクターを用いる宿主細胞の感染は、上述の引用された文献に記述されている。
ウイルスベクターがＩＧＦ－１をエンコードするＤＮＡコンストラクトを伝達するために用いられるとき、コンストラクトは、本技術分野に公知の様々なウイルス感染方法によって細胞内に伝達されてよい。ウイルスベクターを用いる宿主細胞の感染は、上述の引用された文献に記述されている。
【0150】
好ましくは、本発明の薬剤学的組成物は、非経口的に投与されてよい。非経口投与の場合、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は局所注射などが用いられてよい。例えば、薬剤学的組成物は、逆行性静脈内注射で注射できる。
【0151】
好ましくは、本発明の薬剤学的組成物は、筋肉内に投与されてよい。一部の具現例において、投与は、神経病症によって影響を受ける筋肉をターゲットする（例えば、神経病性疼痛又は他の症状）。
【0152】
５．１．２． 容量（Ｄｏｓｅ）
ＤＮＡコンストラクトは、治療的に効果的な容量で投与されてよい。本願に記述の方法において、治療的に効果的な容量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の神経病症を治療するのに効果的な容量である。
ＤＮＡコンストラクトは、治療的に効果的な容量で投与されてよい。本願に記述の方法において、治療的に効果的な容量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の神経病症を治療するのに効果的な容量である。
【0153】
本願に記述の方法の一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、１μｇ～２００ｍｇ、１ｍｇ～２００ｍｇ、１ｍｇ～１００ｍｇ、１ｍｇ～５０ｍｇ、１ｍｇ～２０ｍｇ、５ｍｇ～１０ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ、又は４ｍｇの総容量で投与される。
【0154】
典型的な具現例において、総容量は、複数の個別の注射容量に分割される。一部の具現例において、総容量は、複数の同じ注射容量に分割される。一部の具現例において、総容量は、同一でない注射容量に分割される。
【0155】
様々な分割された容量の具現例において、総容量は、４、８、１６、２４、３２又は６４の異なる注射部位に投与される。
【0156】
一部の具現例において、注射当たり容量は、０．１～２０ｍｇ、１～１０ｍｇ、２～８ｍｇ、又は３～８ｍｇである。特定の具現例において、注射当たり容量は、０．１ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、８ｍｇ、１６ｍｇ、又は３２ｍｇである。
【0157】
総容量は、１回の訪問の問又は２回以上の訪問の問に投与されてよい。
【0158】
典型的な分割された容量の具現例において、全ての複数の注射容量は、相互に１時間以内に投与される。一部の具現例において、全ての複数の注射容量は、相互に１．５、２、２．５又は３時間以内に投与される。
【0159】
方法の様々な具現例において、単一単位の容量で投与されたり、複数の注射容量に分割されたＤＮＡコンストラクトの総容量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に１回のみ投与される。
【0160】
一部の具現例において、１回、２回、３回又は４回の訪問にわたって、総容量のＤＮＡコンストラクトを、複数の注射部位に投与することは、単一周期を含むことができる。特に、６４ｍｇ、３２ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ、又は４ｍｇのＤＮＡコンストラクトを２回の訪問にわたって複数の注射部位に投与することは、単一周期を含むことができる。２回の訪問は、３、５、７、１４、２１又は２８日の間隔でよい。
【0161】
一部の具現例において、周期は反復されてよい。周期は、２回、３回、４回、５回、６回、又はそれ以上反復されてよい。
【0162】
一部の具現例において、周期は、以前の周期後に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上反復されてよい。
【0163】
一部の具現例において、次の周期に投与される総容量は、前の周期に投与された総容量と同一である。一部の具現例において、次の周期に投与される総容量は、前の周期に投与された総容量と異なる。
【0164】
現在の好ましい具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、影響を受けた四肢当たり８ｍｇの容量で投与され、複数の筋肉内注射及び多数の訪問で均等に分割され、ここで、任意の単一訪問におけるそれぞれの複数の注射は、分離された注射部位で行われる。特定の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、影響を受けた四肢当たり８ｍｇの容量で投与され、０日に四肢当たり４ｍｇの第１容量及び１４日に四肢当たり４ｍｇの第２容量に均等に分割され、ここで、第１及び第２容量のそれぞれは、複数の注射容量に均等に分割される。一部の具現例において、影響を受けた四肢当たり８ｍｇ容量のＤＮＡコンストラクトの投与は、１回周期を構成する。周期は、１回、２回、３回又はそれ以上で反復されてよい。
【0165】
投与される実際の量、及び投与速度及び時間過程は、治療される神経病症の特性及び重症度によって変わるであろう。典型的な具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、神経病症の症状、例えば、神経病性疼痛を減少させるのに効率的な量で投与される。一部の具現例において、前記量は、投与１週以内に神経病症の症状を減少させるのに効率的である。一部の具現例において、上記の量は、投与して２週、３週、又は４週以内に神経病症の症状を減少させるのに効率的である。
【0166】
一部の具現例において、コンストラクトの２つの異なる類型は共に投与されて、ＩＧＦ－１の２個の異型体の発現を誘導する。例えば、クラスＩ，Ｅｃ異型体をエンコードする第１コンストラクト及びクラスＩ，Ｅａ異型体をエンコードする第２コンストラクトであり、一部の具現例において、クラスＩ，Ｅｃ異型体及びクラスＩ，Ｅａ異型体を両方ともエンコードする二重発現コンストラクトは、伝達されて２異型体両方の発現を誘導する。
【0167】
当業者に公知の従来の技術によれば、薬剤学的組成物は、上述したように、薬剤学的に許容される担体及び／又は運搬体と共に剤形化でき、最終的に、種々の単位投与剤形及び多重投与剤形を提供する。剤形の非制限的に例は、油又は水溶性媒質中の懸濁液又はエマルジョン、抽出物、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、粉末、顆粒、錠剤及びカプセルを含むが、これに限定されず、分散製剤又は安定剤をさらに含むことができる。
【0168】
５．１．３． 変形（Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）
最適の投与範囲を確認するのに役立つように生体内及び／又は試験管内試験法が選択的に用いられてよい。剤形に用いられる正確な容量は、投与経路及び状態の深刻性によって異なってよく、専門家の判断及び各対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の状況に応じて決定されるべきである。効果的な容量は、試験管内又は動物モデル試験システムで得た容量反応曲線から外挿法（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）によって推定されてよい。
最適の投与範囲を確認するのに役立つように生体内及び／又は試験管内試験法が選択的に用いられてよい。剤形に用いられる正確な容量は、投与経路及び状態の深刻性によって異なってよく、専門家の判断及び各対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の状況に応じて決定されるべきである。効果的な容量は、試験管内又は動物モデル試験システムで得た容量反応曲線から外挿法（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）によって推定されてよい。
【0169】
ＤＮＡコンストラクトは、単独で又は他の治療との組合せで、同時に又は順次に投与されてよい。
【0170】
５．２． 神経病症患者
本願に記述の方法において、治療のために選択される患者は、神経病症を有する。患者は、末梢神経病症、頭蓋骨神経病症、自律神経病症又は局所神経病症を有し得る。神経病症は、疾病、負傷、感染又はビタミン欠乏状態によって発生することがある。例えば、神経病症は、糖尿病、ビタミン欠乏、自己免疫疾患、遺伝的又は遺伝される障害、アミロイド症、尿毒症、毒素又は毒、外傷又は負傷、腫瘍によって誘発されてもよく、又は特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）であってもよい。一部の具現例において、患者は、糖尿病性末梢神経病症を有する。
本願に記述の方法において、治療のために選択される患者は、神経病症を有する。患者は、末梢神経病症、頭蓋骨神経病症、自律神経病症又は局所神経病症を有し得る。神経病症は、疾病、負傷、感染又はビタミン欠乏状態によって発生することがある。例えば、神経病症は、糖尿病、ビタミン欠乏、自己免疫疾患、遺伝的又は遺伝される障害、アミロイド症、尿毒症、毒素又は毒、外傷又は負傷、腫瘍によって誘発されてもよく、又は特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）であってもよい。一部の具現例において、患者は、糖尿病性末梢神経病症を有する。
【0171】
患者は、疼痛（神経病性疼痛）、その他感覚的な欠陥（例えば、感覚喪失、無感覚、しびれなど）、運動欠陥（例えば、弱さ、反射作用喪失、筋肉量喪失、痙攣、敏捷性喪失など）、及び自律神経障害（例えば、吐き気、嘔吐、勃起不全、めまい、便泌、下痢など）のような神経病症に関連した１個以上の症状を有し得る。
【0172】
患者は、本願に提供された治療方法に加えて、本技術分野に公知の１個以上の治療方法によって治療されてもよい。
【0173】
本発明の治療方法は、ヒト患者又は神経病症の動物を治療するのに用いられてよい。
【実施例】
【0174】
次の実施例が提示され、これは、本発明を作製し使用する方法に関する完全な開示及び説明を当業者に提供するもので、本発明者らがそれらの発明と見なすものの範囲を制限するために、又は下記に行われた実験が全部又は唯一の実験であることを表すために意図されるものではない。用いられた数字（例えば、量、温度など）と関連して正確性を保障するための努力がなされてきたが、一部の実験的な誤り及び偏差を考慮すべであろう。別に断らない限り、部分は重量部（ｐａｒｔｓ ｂｙ ｗｅｉｇｈｔ）で、分子量は重量平均分子量で、温度は摂氏温度であり、圧力は、大気圧又はその近傍である。標準略語は、例えば、ｂｐ、ベースペア；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓ又はｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈ又はｈｒ、時；ａａ、アミノ酸；ｎｔ、ヌクレオチド；などが用いられてよい。
【0175】
本発明の実行は、別に断らない限り、当業界における技術内でタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の通常の方法を用いるであろう。
【0176】
実施例１：ＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトによる、ネズミＣＣＩ神経病症モデルにおける機械的異質痛の低減
個別のヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトは、標準分子クローニング技術を用いて発現プラスミドｐＣＫに構築された。
個別のヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードするＤＮＡコンストラクトは、標準分子クローニング技術を用いて発現プラスミドｐＣＫに構築された。
【0177】
具体的に、バイオニア（韓国）から提供するカスタマイズＤＮＡ合成工程によって、４個のポリヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１７、１９及び２１）を得た。このようなポリヌクレオチドは、５’リンカー、Ｃｌａ Ｉ及び３’リンカー、Ｓａｌ Ｉで合成された。ｐＣＫベクター及びポリヌクレオチドは、Ｃｌａ Ｉ及びＳａｌ Ｉで制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）された。クラスＩ，Ｅｃ（異型体＃１）をエンコードするプラスミド＃１は、配列番号１７のポリヌクレオチドを挿入することによって生成され、それは、クラスＩ，Ｅｃ異型体のコーディング配列であり、ｐＣＫベクターのクローニング部位にＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３／４、５及び６の少なくとも一部を含む。クラスＩＩ，Ｅａ（異型体＃２）をエンコードするプラスミド＃２は、配列番号１９のポリヌクレオチドを挿入することによって生成され、それは、クラスＩＩ，Ｅａ異型体のコーディング配列であり、ｐＣＫベクターのクローニング部位にＩＧＦ－１遺伝子のエクソン２、３／４、及び６の少なくとも一部を含む。クラスＩ，Ｅｂ（異型体＃３）をエンコードするプラスミド＃３は、配列番号２１のポリヌクレオチドを挿入することによって生成され、それは、クラスＩ，Ｅｂ異型体のコーディング配列であり、ｐＣＫベクターのクローニング部位にＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３／４及び５の少なくとも一部を含む。クラスＩ，Ｅａ（異型体＃４）をエンコードするプラスミド＃４は、配列番号１５のポリヌクレオチドを挿入することによって生成され、ｐＣＫベクターのクローニング部位にエクソン１、３／４及び６の少なくとも一部を含む。
【0178】
それぞれのプラスミドから各ＩＧＦ－１異型体の発現は、試験管内及び生体内の両方でテストされ確認された。
【0179】
ＤＮＡコンストラクトの治療的な効果は、後でＣＣＩマウスにおいてテストにされたが、そのモデルは、神経病症の研究に広く受容されるモデルである。坐骨神経の慢性収縮損傷（ＣＣＩ）によって生成されたＣＣＩマウスモデルは、末梢に慢性神経損傷を招く様々な過程を開始するものと知られている。ＣＣＩマウスはまた、神経病性疼痛を有するものと知られている。ＣＣＩ手術は、成体雄ＩＣＲマウス（２４～２６ｇの体重）を対象に、ソウル大学校（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）動物管理及び使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けた手術及び実験手順に従って行われた。
【0180】
特に、約１ｃｍ長の鈍い（ｂｌｕｎｔ）切開は、麻酔下に実施され、一般に、殿筋（ｇｌｕｔｅｕｓ）及び大腿二頭筋（ｂｉｃｅｐｓ ｆｅｍｏｒｉｓ）の間にある右坐骨神経が露出された。３分岐（ｔｒｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ）部位に隣接した坐骨神経が露出されると、それは、６－０シルク（Ｅｔｈｉｃｏｎ）縫合糸（ｓｕｔｕｒｅ）を用いて０．５ｍｍ間隔で３回の緩い結紮（ｌｉｇａｔｕｒｅ）が加えられた。結紮は、右側後足が目に付くほど痙攣するまで若干引き締めた。偽手術された（ｓｈａｍ－ｏｐｅｒａｔｅｄ）マウスは、右大腿で同じ切開が加えられたが、坐骨神経には結紮がされなかった。
【0181】
図２Ａに図式化したように、総２００μｇのプラスミドＤＮＡは、ＣＣＩ手術当日に筋肉内に注射される。注射されたプラスミドＤＮＡは、ｐＣＫ（挿入のないベクター；“ｐＣＫ”）２００ｕｇ又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１２００ｕｇである。－（ｉ）プラスミド＃１（クラスＩ，Ｅｃ ＩＧＦ－１をエンコードする“ＩＧＦ－１ ＃１”）２００μｇ；（ｉｉ）プラスミド＃４（クラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１をエンコードする“ＩＧＦ－１ ＃４”）２００μｇ、又は（ｉｉｉ）プラスミド＃１（クラスＩ，Ｅｃ ＩＧＦ－１をエンコードする“ＩＧＦ－１ ＃１”）１００μｇ及びプラスミド＃４（“クラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１をエンコードする“ＩＧＦ－１ ＃４”）１００μｇ。
【0182】
ＣＣＩ手術１週後に、機械的異質痛の発生がフォンフレイ（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ）フィラメントテストを用いて評価された。簡単にいうと、動物は、適応のために金属メッシュ床の上にあるシリンダーに個別に配置された。マウスの機械的敏感性は、フィラメント（０．１６ｇ）の一定の厚さを用いて後足を刺激することによって評価された。テストは、その後、毎週反復された。結果は、ＩＧＦ １クラスＩ Ｅｃを発現させるＩＧＦ－１ ＃１の注射が、ベクター単独と比較して、足引っ込み頻度において測定可能な減少を提供することを立証している。
【0183】
図２Ｂは、図２Ａに記述されたＣＣＩ実験において測定された足引っ込みの頻度（％）を要約したヒストグラムである。結果は、（ｉ）ＩＧＦ １ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｅｃを発現させるＩＧＦ－１ ＃１の注射が、ベクター単独（ｐＣＫ）と比較して、足引っ込み頻度において測定可能な減少を提供したこと；（ｉｉ）ＩＧＦ １ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｅａを発現させるＩＧＦ－１ ＃４の注射も、足引っ込み頻度において測定可能な減少を提供したこと；及び（ｉｉｉ）ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ（ＩＧＦ－１ ＃１）及びクラスＩ Ｅａ（ＩＧＦ－１ ＃４）を共に発現させるＤＮＡコンストラクトの注射は、ベクター単独（ｐＣＫ）と比較して、より大きく、統計的に有意な足引っ込み頻度の減少を提供したこと、を証明している。
【0184】
全ての値は、３回の独立した実験から、平均±標準誤差平均（ＳＥＭ）で表示される。値間の差は、１元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの事後検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）又はボンフェローニ多重比較テスト（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ）で決定された。
【0185】
実施例２：ＤＮＡコンストラクトによる、ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ及びクラスＩ Ｅａ異型体両方の発現
ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ（ＩＧＦ－１ ＃１）を発現させるＤＮＡコンストラクト及びクラスＩ Ｅａ（ＩＧＦ－１ ＃４）を共に発現する他のＤＮＡコンストラクトは、上述した行動実験において、機械的異質痛においてより大きくて統計的により重要な影響を及ぼす点で、我々はＲＮＡ転写体の選択的スプライシングを通じてＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ（ＩＧＦ－１ ＃１）及びクラスＩ Ｅａ（ＩＧＦ－１ ＃４）の両方を同時に発現するように設計された様々なプラスミドを構築した。特に、ＤＮＡコンストラクトは、エクソン１、３／４、５及び６及びＩＧＦ－１遺伝子のイントロン又はそれらの断片に対する配列を含むように生成された。他の変異体を含む様々なＤＮＡコンストラクトが生成され、それらの能力に対するテストを行った結果、ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ異型体及びクラスＩ Ｅａ異型体の両方が発現した。
ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ（ＩＧＦ－１ ＃１）を発現させるＤＮＡコンストラクト及びクラスＩ Ｅａ（ＩＧＦ－１ ＃４）を共に発現する他のＤＮＡコンストラクトは、上述した行動実験において、機械的異質痛においてより大きくて統計的により重要な影響を及ぼす点で、我々はＲＮＡ転写体の選択的スプライシングを通じてＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ（ＩＧＦ－１ ＃１）及びクラスＩ Ｅａ（ＩＧＦ－１ ＃４）の両方を同時に発現するように設計された様々なプラスミドを構築した。特に、ＤＮＡコンストラクトは、エクソン１、３／４、５及び６及びＩＧＦ－１遺伝子のイントロン又はそれらの断片に対する配列を含むように生成された。他の変異体を含む様々なＤＮＡコンストラクトが生成され、それらの能力に対するテストを行った結果、ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ異型体及びクラスＩ Ｅａ異型体の両方が発現した。
【0186】
それぞれのプラスミドは、ｐＣＫ発現調節配列に作動可能に連結された挿入体を含むように、プラスミドバックボーンとしてｐＣＫを用いて構築された。挿入体は、次を連結させることによって生成された。（１）ヒトＩＧＦ－１エクソン１、３、及び４（配列番号１）をエンコードする第１ポリヌクレオチド；（２）第２ポリヌクレオチド、ＩＧＦ－１イントロン４（配列番号２）又はその切片の一つ；（３）エクソン５及び６－１（配列番号３）をエンコードする第３ポリヌクレオチド；（４）第４ポリヌクレオチド、イントロン５（配列番号４）又はその切片の一つ；及び（５）エクソン６－２（配列番号５）をエンコードする第５ポリヌクレオチド。ここで、第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。プラスミドは、イントロン４及び／又はイントロン５の切片のサイズにおいて異なっている。具体的に、配列番号６は、ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６において用いられるイントロン４切片のヌクレオチド配列を提供し、配列番号７は、ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１－Ｘ１０において用いられるイントロン４切片のヌクレオチド配列を提供する。配列番号８は、ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０において用いられるイントロン５切片のヌクレオチド配列を提供する。
【0187】
生体内で様々なコンストラクトから異型体１（クラスＩ，Ｅｃ）及び異型体４（クラスＩ，Ｅａ）の発現をテストするために、９週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスのＴ．Ａ．（前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓ ａｎｔｅｒｉｏｒ））に５０μｇプラスミドが注射された。それらの前脛骨筋は、注射５日後に採取された。前記骨格筋は、その後に、ポリプロピレン乳棒（Ｂｅｌ－Ａｒｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ）を用いて、タンパク質分解酵素抑制剤、脱リン酸化酵素抑制剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌｔｄ．）、及びＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）を含む溶解バッファにおいて均質化された。サンプルは、４゜Ｃで１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離され、総タンパク質を含む上澄液は、メーカーのプロトコルに明示された通り、ヒトＩＧＦ－１ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に用いられた。検出されたＩＧＦ－１のレベルは、ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州、米国）で測定され、組織由来のタンパク質抽出物の総量が一般化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）された。実験的な手順は、図３Ａに要約されている。
【0188】
図３Ｂに示すように、マウスＴ．Ａ筋肉においてヒトＩＧＦ－１タンパク質の総発現レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。マウスが単一異型体（“１”（クラスＩ，Ｅｃ）又は“４”（クラスＩ，Ｅａ））を発現させるコンストラクトの５０ｕｇ、異型体＃１（クラスＩ，Ｅｃ）を発現させる第１コンストラクトの２５ｕｇ＋異型体＃４（クラスＩ，Ｅａ）を発現させる第２コンストラクトの２５ｕｇ（“１＋４”）、又は２異型体を発現させるコンストラクトｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６（“Ｘ６”）又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（“Ｘ１０”）５０μｇを受けたか否かにかかわらず、ヒトＩＧＦ－１タンパク質の総発現レベルは類似であった。
【0189】
我々は、ＲＴ－ＰＣＲを用いてコンストラクトが異型体＃１及び異型体＃４の両方に対する成熟した（ｍａｔｕｒｅ）転写体を同時に発現させるかどうか確認した。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、エクソン３／４に付く順方向／左側プライマー（Ｌ）及びエクソン６に付く逆方向／右側プライマー（Ｒ）で行われた。図３Ｃにさらに説明されているように、異型体＃１（クラスＩ，Ｅｃ）に対する転写体のＲＴ－ＰＣＲは、２つのアンプリコン、すなわち、１７８ｂｐアンプリコン及び２５９ｂｐアンプリコンを生成するのに対し、異型体＃４（クラスＩ，Ｅａ）に対する転写体のＲＴ－ＰＣＲは、１２９ｂｐの単一アンプリコンを生成する。
【0190】
ＲＴ－ＰＣＲを行うために、骨格筋が収集され、ポリプロピレン乳棒（Ｂｅｌ－Ａｒｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ）を用いて機械的に均質化され、ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（タカラ（Ｔａｋａｒａ））を用いて抽出された。ＲＮＡ定量は、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）機器を用いて行われた。同一量のＲＮＡを用いてＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（タカラ）でｃＤＮＡが合成され、ＰＣＲは、図３Ｃに提示された順方向（ＴＧＡ ＴＣＴ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＧＡ（配列番号２８））及び逆方向（ＣＴＡ ＣＴＴ ＧＣＧ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＧ（配列番号２９））プライマーを用いて行われた。
【0191】
図３Ｄに示すように、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０は、異型体＃１（１７８ｂｐ及び２５９ｂｐバンド）及び異型体＃４（１２９ｂｐバンド）の両方に対する成熟した転写体を発現した。異型体＃１及び異型体＃４両方に対する成熟した転写体の発現は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０以外のコンストラクトでは検出されず、それに対するデータは本願に提供されない。
【0192】
２個の異型体転写体が両方とも効果的にタンパク質に翻訳されたことを確認するために、図４Ａに示すように、我々は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１－Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１－Ｘ１０で２９３Ｔ細胞を形質感染させた。免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）のために、細胞は、プラスミドＤＮＡの形質感染２日（４８時間）後に準備され、続いて、タンパク質分解酵素及び脱リン酸化酵素抑制剤カクテル（ロシュ診断（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌｔｄ．））が含まれているＲＩＰＡバッファを用いて溶解された。同一量のタンパク質が１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから分離され、ウェスタンメンブレイン（ＰＶＤＦ）に移された。メンブレインは、１％ ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ）の入っているＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、ｐＨ ７．４、０．９％塩化ナトリウム、及び０．１％ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ２０））で１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）され、一晩４゜Ｃでブロッキング溶液に希釈された１次抗体で探針（ｐｒｏｂｅ）された。ＩＧＦ－１異型体１及び異型体４のレベルを試験するために用いられた１次抗体は、アブクロン（Ａｂｃｌｏｎ）（韓国）から提供され、ＩＧＦ－１及びベータアクチン（β－ａｃｔｉｎ）に対する１次抗体は、アブカム（Ａｂｃａｍ）（イギリス）及びシグマ－アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（米国）から購買した。ＴＢＳＴで洗浄した後、メンブレインは室温で１時間、ＨＲＰ接合ヤギ抗マウス又はウサギＩｇＧ ２次抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と共にインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）された。その後、ブロット（ｂｌｏｔ）は、ＴＢＳＴで３回洗浄され、タンパク質バンドは、強化された化学発光システム（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で視覚化した。ベータアクチンはローディング対照群として用いられた。
【0193】
図４Ｂに提示されたウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）データは、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の両方がタンパク質レベルのＩＧＦ－１の異型体を発現させることを裏付けた。
【0194】
実施例３：ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ異型体及びクラスＩ Ｅａ異型体を同時に発現するＤＮＡコンストラクトによる、ネズミＣＣＩ神経病症モデルにおける機械的異質痛の低減
実施例１に記述されており、図５Ａに図式化しているプロトコルを用いて、ネズミＣＣＩ神経病症モデルにおいて機械的異質痛を低減させるＤＮＡコンストラクトの能力をテストした。
実施例１に記述されており、図５Ａに図式化しているプロトコルを用いて、ネズミＣＣＩ神経病症モデルにおいて機械的異質痛を低減させるＤＮＡコンストラクトの能力をテストした。
【0195】
図５Ｂは、足引っ込み頻度を示し、ＩＧＦ－１異型体（ＩＧＦ－１ ＃１、ＩＧＦ－１ ＃４、ＩＧＦ－１ ＃１＋＃４、ＩＧＦ－１Ｘ６、及びＩＧＦ－１Ｘ１０）をエンコードするコンストラクトの同時の筋肉内注射後に機械的な異質痛において統計的に有意な減少を証明するヒストグラムである。特に、機械的異質痛における効果は、マウスにＩＧＦ－１異型体＃１及び＃４をエンコードするコンストラクトを単独で投与したり、或いは二重発現コンストラクトｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を注射したときに、遥かに良好であった。
【0196】
実施例４：ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ異型体及びクラスＩ Ｅａ異型体を同時に発現するＤＮＡコンストラクトによる、ネズミ神経損傷モデルにおける軸索（ａｘｏｎ）成長誘導
ＤＮＡコンストラクトの治療的な効果が、神経損傷モデルにおいてさらにテストされた。神経損傷モデルは、ソウル大学校（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）動物管理及び使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認された外科及び実験的手順にしたがって、成体雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２４～２６ｇの体重）で生成された。坐骨神経損傷を誘導するために、各ネズミの右坐骨神経は切開によって露出され、前記神経は微細止血鉗子（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｆｏｒｃｅｐｓ）で１５秒間損傷された。その後、５－０検定シルク縫合糸を用いて切開を縫合した。プラスミドＤＮＡ２００ｕｇ（ｐＣＫ ２００ｕｇ、又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０ ２００ｕｇ）の総量は、坐骨神経近傍の筋肉において神経損傷当日に筋肉内投与された。
ＤＮＡコンストラクトの治療的な効果が、神経損傷モデルにおいてさらにテストされた。神経損傷モデルは、ソウル大学校（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）動物管理及び使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認された外科及び実験的手順にしたがって、成体雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２４～２６ｇの体重）で生成された。坐骨神経損傷を誘導するために、各ネズミの右坐骨神経は切開によって露出され、前記神経は微細止血鉗子（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｆｏｒｃｅｐｓ）で１５秒間損傷された。その後、５－０検定シルク縫合糸を用いて切開を縫合した。プラスミドＤＮＡ２００ｕｇ（ｐＣＫ ２００ｕｇ、又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０ ２００ｕｇ）の総量は、坐骨神経近傍の筋肉において神経損傷当日に筋肉内投与された。
【0197】
神経損傷及びプラスミドＤＮＡ注射後４週（２８日）に、ネズミは０．１Ｍリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に２％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）＋２％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で潅流固定した。右同側坐骨神経がその後に準備され、固定溶液と共に４時間さらにインキュベーションされた。固定した組織は、０．１Ｍリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に１％四酸化オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ）が処理され、次いで、一晩、２％水溶性酢酸ウラニール（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を用いてｅｎ ｂｌｏｃ染色をした。翌日、組織は、３０％～１００％エタノールで１０分間連続して継代によって脱水され、脱水された組織は、その後にレジン化合物（ｒｅｓｉｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）に包埋（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）された。包埋過程後に、サンプルは、スパーレジン（Ｓｐｕｒｒ Resin）で重合され、乾燥オーブンでインキュベーションされた。サンプルは、その後、断面化され、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で視覚化された。
【0198】
シャム動物、ｐＣＫが処理された動物、及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０が処理された動物から得られたサンプルのＴＥＭイメージは、図６Ａに提供される。イメージは、神経損傷動物がシャム動物に比較して、実質的な神経損傷を、実質的により小さい軸索直径と共に有するということを明らかにしている。軸索直径の減少は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の投与によって阻害されるが、ｐＣＫの投与によっては阻害されなかった。
【0199】
軸索成長においてのｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の効果は、ニューロン径を測定することによって定量化された。ｐＣＫ（“Ｃｒｕｓｈ－ｐＣＫ”）が処理された神経損傷動物及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（“Ｃｒｕｓｈ－Ｘ１０”）が処理された神経損傷動物におけるニューロン径の分布は、図６Ｂに提供される。グラフから、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０が処理された動物が、より大きい直径を持つニューロンを有していることが明らかである。これは、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０が軸索成長を誘導することによって神経損傷を治療できることをさらに裏付ける。
【0200】
［参照による援用（ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＢＹ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ）］
本出願に援用された全ての刊行物、特許、特許出願及びその他文書は、それぞれの個別的な刊行物、特許、特許出願又はその他文書が全ての目的のために個別的に参照によって組み込まれると表示されたように、同一の程度に全ての目的のためにその全体が本願に参照によって組み込まれる。
本出願に援用された全ての刊行物、特許、特許出願及びその他文書は、それぞれの個別的な刊行物、特許、特許出願又はその他文書が全ての目的のために個別的に参照によって組み込まれると表示されたように、同一の程度に全ての目的のためにその全体が本願に参照によって組み込まれる。
【0201】
［均等特許（ＥＱＵＩＶＡＬＥＮＴＳ）］
様々な特定の具現例が説明され記述されてきたが、前記明細書は制限的ではない。本発明の思想及び範囲を逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解されよう。様々な変形が本明細書を検討する上で当業者にとって明らかになるであろう。
本発明の態様は以下を含む。
［付記１］
次を含むＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト：
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン（ｅｘｏｎ）１、３及び４（配列番号１）と同じ配列又はそのデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）を有する第１ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）４（配列番号２）と同じ配列又はその切片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を有する第２ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第３ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）と同じ配列又はその切片を有する第４ポリヌクレオチド；及び
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第５ポリヌクレオチド；
前記第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
［付記２］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記１に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記３］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記１に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４］
前記第４ポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記１に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクターをさらに含む、付記１～４のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６］
前記プラスミドベクターはｐＣＫである、付記５に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記７］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０からなる群から選ばれる、付記６に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記８］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記５に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記９］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０からなる群から選ばれる、付記８に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記１０］
付記１～９のいずれか一項の前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む薬剤学的組成物。
［付記１１］
ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む薬剤学的組成物であって、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａ又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃをエンコードする、薬剤学的組成物。
［付記１２］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質の両方をエンコードする、付記１１に記載の薬剤学的組成物。
［付記１３］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質を全て発現不可能なわけではない、付記１１又は１２に記載の薬剤学的組成物。
［付記１４］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質も配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質も発現不可能である、付記１１又は１２に記載の薬剤学的組成物。
［付記１５］
次を含む、付記１１に記載の薬剤学的組成物：
配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクト、及び
配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクト。
［付記１６］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０である、付記１２に記載の薬剤学的組成物。
［付記１７］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０である、付記１２に記載の薬剤学的組成物。
［付記１８］
次の段階を含む、神経病症を治療する方法：
神経病症を持つ対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトの有効量を投与する段階であって、前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、少なくとも１個のヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能である、方法。
［付記１９］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現可能である、付記１８に記載の方法。
［付記２０］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質の両方を全て発現不可能なわけではない、付記１８又は１９に記載の方法。
［付記２１］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記１８～２０のいずれかに記載の方法。
［付記２２］
次の段階をさらに含む、付記２１に記載の方法：
第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階であって、
前記第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、方法。
［付記２３］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記１８～２０のいずれかに記載の方法。
［付記２４］
次の段階をさらに含む、付記２３に記載の方法：
第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階であって、
前記第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、方法。
［付記２５］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、同時に行われる、付記２２又は２４に記載の方法。
［付記２６］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、順次に行われる、付記２２又は２４に記載の方法。
［付記２７］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、１個を超えるヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする、付記１８に記載の方法。
［付記２８］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃをエンコードする、付記２７に記載の方法。
［付記２９］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトが次を含む、付記２７又は２８に記載の方法：
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３及び４（配列番号１）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第１ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４（配列番号２）と同じ配列又はその切片を有する第２ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第３ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）と同じ配列又はその切片を有する第４ポリヌクレオチド；及び
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第５ポリヌクレオチド；
前記第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
［付記３０］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記２９に記載の方法。
［付記３１］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記２９に記載の方法。
［付記３２］
前記第４ポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記２９に記載の方法。
［付記３３］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクターを含む、付記１８～３２のいずれかに記載の方法。
［付記３４］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである、付記３３に記載の方法。
［付記３５］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記３３に記載の方法。
［付記３６］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、付記２９～３４のいずれかに記載の方法。
［付記３７］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号９のポリヌクレオチドを含む、付記２９～３４のいずれかに記載の方法。
［付記３８］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号２７のポリヌクレオチドを含む、付記２９～３４のいずれかに記載の方法。
［付記３９］
有効量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において疼痛を減少させるのに十分な量である、付記１８～３７のいずれかに記載の方法。
［付記４０］
対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、神経病性疼痛を有する、付記１８～３９のいずれかに記載の方法。
［付記４１］
対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、糖尿病性神経病症を有する、付記１８～４０のいずれかに記載の方法。
［付記４２］
第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト又は第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、筋肉内注射を含む、付記１８～４１のいずれかに記載の方法。
［付記４３］
神経病症治療の医学的方法に用いるためのＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトであって、
前記医学的方法は、神経病症を有する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に対して有効量のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階を含み；前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、少なくとも一つのヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能である、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４４］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現可能である、付記４３に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４５］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質の両方を全て発現不可能なわけではない、付記４３又は４４に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４６］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記４３～４５のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４７］
前記医学的方法は、第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階をさらに含み；前記第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記４６に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４８］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記４３～４５のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４９］
前記医学的方法は、第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階をさらに含み；前記第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記４８に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５０］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、同時に行われる、付記４７又は４９に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５１］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、順次に行われる、付記４７又は４９に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５２］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、１個を超えるヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする、付記４３に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５３］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質をエンコードする、付記５２に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５４］
次を含む、付記５２又は５３に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト：
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３及び４（配列番号１）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第１ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４（配列番号２）と同じ配列又はその切片を有する第２ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第３ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）と同じ配列又はその切片を有する第４ポリヌクレオチド；及び
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第５ポリヌクレオチド；
前記第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
［付記５５］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記５４に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５６］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記５４に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５７］
前記第４ポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記５４に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５８］
ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクターを含む、付記４３～５７のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５９］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである、付記５８に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６０］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記５８に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６１］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、付記４３～６０のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６２］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号９のポリヌクレオチドを含む、付記４３～６０のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６３］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号２７のポリヌクレオチドを含む、付記４３～６０のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６４］
有効量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において疼痛を減少させるのに十分な量である、付記４３～６３のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６５］
対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、神経病性疼痛を有する、付記４３～６４のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６６］
対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、糖尿病性神経病症を有する、付記４３～６５のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６７］
ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階又は第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、筋肉内注射を含む、付記４３～６６に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
様々な特定の具現例が説明され記述されてきたが、前記明細書は制限的ではない。本発明の思想及び範囲を逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解されよう。様々な変形が本明細書を検討する上で当業者にとって明らかになるであろう。
本発明の態様は以下を含む。
［付記１］
次を含むＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト：
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン（ｅｘｏｎ）１、３及び４（配列番号１）と同じ配列又はそのデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）を有する第１ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）４（配列番号２）と同じ配列又はその切片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を有する第２ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第３ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）と同じ配列又はその切片を有する第４ポリヌクレオチド；及び
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第５ポリヌクレオチド；
前記第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
［付記２］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記１に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記３］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記１に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４］
前記第４ポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記１に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクターをさらに含む、付記１～４のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６］
前記プラスミドベクターはｐＣＫである、付記５に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記７］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０からなる群から選ばれる、付記６に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記８］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記５に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記９］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０からなる群から選ばれる、付記８に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記１０］
付記１～９のいずれか一項の前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む薬剤学的組成物。
［付記１１］
ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを含む薬剤学的組成物であって、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａ又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃをエンコードする、薬剤学的組成物。
［付記１２］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質の両方をエンコードする、付記１１に記載の薬剤学的組成物。
［付記１３］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質を全て発現不可能なわけではない、付記１１又は１２に記載の薬剤学的組成物。
［付記１４］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質も配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質も発現不可能である、付記１１又は１２に記載の薬剤学的組成物。
［付記１５］
次を含む、付記１１に記載の薬剤学的組成物：
配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質をエンコードする第１ＤＮＡコンストラクト、及び
配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質をエンコードする第２ＤＮＡコンストラクト。
［付記１６］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０である、付記１２に記載の薬剤学的組成物。
［付記１７］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０である、付記１２に記載の薬剤学的組成物。
［付記１８］
次の段階を含む、神経病症を治療する方法：
神経病症を持つ対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトの有効量を投与する段階であって、前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、少なくとも１個のヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能である、方法。
［付記１９］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現可能である、付記１８に記載の方法。
［付記２０］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質の両方を全て発現不可能なわけではない、付記１８又は１９に記載の方法。
［付記２１］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記１８～２０のいずれかに記載の方法。
［付記２２］
次の段階をさらに含む、付記２１に記載の方法：
第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階であって、
前記第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、方法。
［付記２３］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記１８～２０のいずれかに記載の方法。
［付記２４］
次の段階をさらに含む、付記２３に記載の方法：
第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階であって、
前記第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、方法。
［付記２５］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、同時に行われる、付記２２又は２４に記載の方法。
［付記２６］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、順次に行われる、付記２２又は２４に記載の方法。
［付記２７］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、１個を超えるヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする、付記１８に記載の方法。
［付記２８］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃをエンコードする、付記２７に記載の方法。
［付記２９］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトが次を含む、付記２７又は２８に記載の方法：
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３及び４（配列番号１）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第１ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４（配列番号２）と同じ配列又はその切片を有する第２ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第３ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）と同じ配列又はその切片を有する第４ポリヌクレオチド；及び
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第５ポリヌクレオチド；
前記第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
［付記３０］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記２９に記載の方法。
［付記３１］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記２９に記載の方法。
［付記３２］
前記第４ポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記２９に記載の方法。
［付記３３］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクターを含む、付記１８～３２のいずれかに記載の方法。
［付記３４］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである、付記３３に記載の方法。
［付記３５］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記３３に記載の方法。
［付記３６］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、付記２９～３４のいずれかに記載の方法。
［付記３７］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号９のポリヌクレオチドを含む、付記２９～３４のいずれかに記載の方法。
［付記３８］
前記第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号２７のポリヌクレオチドを含む、付記２９～３４のいずれかに記載の方法。
［付記３９］
有効量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において疼痛を減少させるのに十分な量である、付記１８～３７のいずれかに記載の方法。
［付記４０］
対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、神経病性疼痛を有する、付記１８～３９のいずれかに記載の方法。
［付記４１］
対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、糖尿病性神経病症を有する、付記１８～４０のいずれかに記載の方法。
［付記４２］
第１のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト又は第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、筋肉内注射を含む、付記１８～４１のいずれかに記載の方法。
［付記４３］
神経病症治療の医学的方法に用いるためのＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトであって、
前記医学的方法は、神経病症を有する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に対して有効量のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階を含み；前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、少なくとも一つのヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能である、ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４４］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現可能である、付記４３に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４５］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質の両方を全て発現不可能なわけではない、付記４３又は４４に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４６］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記４３～４５のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４７］
前記医学的方法は、第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階をさらに含み；前記第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記４６に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４８］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記４３～４５のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記４９］
前記医学的方法は、第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階をさらに含み；前記第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記４８に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５０］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、同時に行われる、付記４７又は４９に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５１］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階及び第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階は、順次に行われる、付記４７又は４９に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５２］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、１個を超えるヒトＩＧＦ－１異型体をエンコードする、付記４３に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５３］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質をエンコードする、付記５２に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５４］
次を含む、付記５２又は５３に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト：
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３及び４（配列番号１）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第１ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４（配列番号２）と同じ配列又はその切片を有する第２ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１（配列番号３）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第３ポリヌクレオチド；
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン５（配列番号４）と同じ配列又はその切片を有する第４ポリヌクレオチド；及び
ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２（配列番号５）と同じ配列又はそのデジェネレートを有する第５ポリヌクレオチド；
前記第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に順次連結される。
［付記５５］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記５４に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５６］
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記５４に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５７］
前記第４ポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記５４に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５８］
ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクターを含む、付記４３～５７のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記５９］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである、付記５８に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６０］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記５８に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６１］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、付記４３～６０のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６２］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号９のポリヌクレオチドを含む、付記４３～６０のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６３］
前記ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、配列番号２７のポリヌクレオチドを含む、付記４３～６０のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６４］
有効量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において疼痛を減少させるのに十分な量である、付記４３～６３のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６５］
対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、神経病性疼痛を有する、付記４３～６４のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６６］
対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、糖尿病性神経病症を有する、付記４３～６５のいずれかに記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
［付記６７］
ＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトを投与する段階又は第２のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクトは、筋肉内注射を含む、付記４３～６６に記載のＩＧＦ－１エンコーディングＤＮＡコンストラクト。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【配列表】