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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-05
(45)【発行日】2024-01-16
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240109BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240109BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240109BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20240109BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240109BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240109BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240109BHJP
G01N 33/563 20060101ALI20240109BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20240109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
A61K39/395 S
A61P31/14
C07K16/10
C07K16/46
C12N15/62 Z
G01N33/531 A
G01N33/563
G01N33/569 L
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021162820
(22)【出願日】2021-10-01
(65)【公開番号】P2022060186
(43)【公開日】2022-04-14
【審査請求日】2022-08-31
(31)【優先権主張番号】P 2020168078
(32)【優先日】2020-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2020185268
(32)【優先日】2020-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2020201212
(32)【優先日】2020-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2021085698
(32)【優先日】2021-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2021134372
(32)【優先日】2021-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2021150604
(32)【優先日】2021-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】516255448
【氏名又は名称】株式会社Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
(73)【特許権者】
【識別番号】598041566
【氏名又は名称】学校法人北里研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】正木 秀和
(72)【発明者】
【氏名】熊地 重文
(72)【発明者】
【氏名】米原 涼
(72)【発明者】
【氏名】松村 佑太
(72)【発明者】
【氏名】河野 響
(72)【発明者】
【氏名】東條 卓人
(72)【発明者】
【氏名】森本 拓也
(72)【発明者】
【氏名】片山 和彦
(72)【発明者】
【氏名】芳賀 慧
(72)【発明者】
【氏名】戸高 玲子
(72)【発明者】
【氏名】澤田 成史
(72)【発明者】
【氏名】高野 友美
【審査官】馬場 亮人
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１１３０３２７９（ＣＮ，Ａ）
【文献】WU et al.，BioRxiv，2020年03月31日，DOI: 10.1101/2020.03.30.015990
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ１／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記１）～９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド。１）ＣＤＲ１：配列番号１０で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ２：配列番号１９で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ３：配列番号１で示されるアミノ酸配列
２）ＣＤＲ１：配列番号１１で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ２：配列番号２０で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ３：配列番号２で示されるアミノ酸配列
３）ＣＤＲ１：配列番号１２で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ２：配列番号２１で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ３：配列番号３で示されるアミノ酸配列
４）ＣＤＲ１：配列番号１３で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ２：配列番号２２で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ３：配列番号４で示されるアミノ酸配列
５）ＣＤＲ１：配列番号１４で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ２：配列番号２３で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ３：配列番号５で示されるアミノ酸配列
６）ＣＤＲ１：配列番号１５で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ２：配列番号２４で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ３：配列番号６で示されるアミノ酸配列
７）ＣＤＲ１：配列番号１６で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ２：配列番号２５で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ３：配列番号７で示されるアミノ酸配列
８）ＣＤＲ１：配列番号１７で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ２：配列番号２６で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ３：配列番号８で示されるアミノ酸配列
９）ＣＤＲ１：配列番号１８で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ２：配列番号２７で示されるアミノ酸配列
ＣＤＲ３：配列番号９で示されるアミノ酸配列
【請求項2】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドが、ＶＨＨ抗体、及び重鎖抗体及びＶＨＨ抗体多量体からなる群から選ばれるいずれかである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項4】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドを被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドを含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドを含有する医薬。
【請求項8】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための請求項７に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２，；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）やＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同様ベータコロナウイルス属に属し、急性呼吸器疾患の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認された急性呼吸器疾患を惹起するウイルスは、その後、新型のコロナウイルスであると同定され、ＣＯＶＩＤ－１９と命名されたが、多様に変異しつつ世界的流行（パンデミック）を引き起こしている。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、一般的なコロナウイルスと同様に、４つの構造タンパク質、１６の非構造タンパク質（ｎｓｐ１－１６）、及びいくつかの付属タンパク質をコードする大きなポジティブセンスＲＮＡゲノムを有している。構造タンパク質は、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシド、膜タンパク質、エンベロープタンパク質から成り、スパイクタンパク質は、受容体結合を担うＮ末端のＳ１サブユニットと膜融合を担うＣ末端のＳ２サブユニットから構成される。Ｓ１サブユニットはさらに、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、サブドメイン１（ＳＤ１）、サブドメイン２（ＳＤ２）に分割されている。Ｓ２サブユニットは、さらに、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタドリピート１（ＨＲ１）及びヘプタドリピート２（ＨＲ２）に分割されていることが知られている（非特許文献１参照）。
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのスパイクタンパク質を介して宿主細胞受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と結合して細胞内に侵入する。受容体との結合は、スパイク蛋白質の構造変化を引き金とし、活性化状態へと変化させる。活性化されたスパイクは、Ｓ１／Ｓ２部位でプロテアーゼ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ではＴＭＰＲＳＳ２）によって切断され、Ｓ１サブユニットが放出され、Ｓ２サブユニット上のＦＰが露出する。ＦＰは標的細胞膜に挿入され、ＨＲ１とＨＲ２とがリフォールドして融合後のコンフォメーションを形成し、標的細胞とのウイルス膜融合を促進することが知られている（非特許文献２参照）。
【0005】
最近、低温電子顕微鏡や結晶解析によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２三量体スパイクのプレフュージョンコンフォメーションやＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤと完全長ヒトＡＣＥ２の構造解析が進んでおり、ＡＣＥ２への結合様式の解明やヒトＡＣＥ２とのより強い接触を形成するＲＢＤ上の重要な変異点の知見、更には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤを標的とする交差反応性抗体の同定に向けたエピトープの洞察が提供されている。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質の糖鎖解析から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ同様に多くのグリコシル化部位を有しており、その中でもＳＡＲＳ－ＣｏＶには無い、ユニークなグリコシル化部位も報告されており、この様な特異な糖鎖がエピトープのマスキングを介した免疫回避を促進する可能性があることも報告されている（非特許文献３参照）。
【0006】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、宿主細胞にウイルスが侵入する際に不可欠な役割を果たしており、中和抗体の主要な標的となる。コロナウイルスＳ１サブユニットの機能性と高い免疫原性のため、これまでにコロナウイルスに対して特徴づけられたほとんどの中和抗体は、Ｓ１、特にＳ１－ＲＢＤを標的としていることが報告されている。また、以前のＳＡＲＳ及びＭＥＲＳの感染の流行中にもいくつかの中和抗体が開発され、コロナウイルス感染症の治療での使用の可能性が証明されている。
しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤに特異的な多くの既知の中和抗体（Ｓ２３０、ｍ３９６、８０Ｒなど）は、１μＭまでの濃度でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合せず、一方で、単一のＢ細胞の選別によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者から単離されたモノクローナル抗体はいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＲＢＤと交差反応を示さないことが報告されている。この様に、多くの既存の中和抗体は交差反応性に乏しいが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の両方に中和活性を示す４７Ｄ１１やＳ３０９といったＩｇＧ抗体やシングルドメイン抗体としてＶＨＨ－７２－Ｆｃ等が存在することも報告されている（非特許文献３参照）。
しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤに特異的な多くの既知の中和抗体（Ｓ２３０、ｍ３９６、８０Ｒなど）は、１μＭまでの濃度でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合せず、一方で、単一のＢ細胞の選別によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者から単離されたモノクローナル抗体はいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＲＢＤと交差反応を示さないことが報告されている。この様に、多くの既存の中和抗体は交差反応性に乏しいが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の両方に中和活性を示す４７Ｄ１１やＳ３０９といったＩｇＧ抗体やシングルドメイン抗体としてＶＨＨ－７２－Ｆｃ等が存在することも報告されている（非特許文献３参照）。
【0007】
ＣＯＶＩＤ－１９のウイルス学的診断は、主として遺伝子増幅法（ＰＣＲ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子検出（ＰＣＲ検査）によって行われている（以下、「従来技術１」という。）。
一方で、ウイルスの検出にはＰＣＲとは異なる検査方法があることも知られている。その１つは、ウイルスの遺伝物質を検出するのではなく、ウイルス表面のタンパク質の断片を検出する抗原検査である（以下、「従来技術２」という。）。抗原が検出できれば、高価な機械、検査を行う者に要求される技術に習熟するための訓練、検査に要する多大な労力等がなくても、感染しているかどうかが数分で診断できる。
その他の検査方法として、血清中のウイルス特異的抗体を検出するイムノクロマト法、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）を利用した血清学的診断法（以下、「従来技術３」という。）等が知られている。
一方で、ウイルスの検出にはＰＣＲとは異なる検査方法があることも知られている。その１つは、ウイルスの遺伝物質を検出するのではなく、ウイルス表面のタンパク質の断片を検出する抗原検査である（以下、「従来技術２」という。）。抗原が検出できれば、高価な機械、検査を行う者に要求される技術に習熟するための訓練、検査に要する多大な労力等がなくても、感染しているかどうかが数分で診断できる。
その他の検査方法として、血清中のウイルス特異的抗体を検出するイムノクロマト法、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）を利用した血清学的診断法（以下、「従来技術３」という。）等が知られている。
【0008】
免疫応答における抗体は、生体が感染によって抗原と接触した後、比較的感染初期に患者の血中で増加するイムノグロブリンＭ（以下、「ＩｇＭ」と略すことがある）と、その後に増加するＩｇＧ等があることが知られている。
ここで、一般的なＩｇは軽鎖と重鎖とで構成されているが、ラクダ科の動物は、軽鎖を含まない重鎖抗体を産生することが知られている。また、重鎖抗体の可変領域を含む単一のドメインは、天然のシングルドメインであり、それ自身でも抗体として機能する。このため、「シングルドメイン抗体」（以下、「ＶＨＨ抗体」と略すことがある。）と呼ばれている。
ここで、一般的なＩｇは軽鎖と重鎖とで構成されているが、ラクダ科の動物は、軽鎖を含まない重鎖抗体を産生することが知られている。また、重鎖抗体の可変領域を含む単一のドメインは、天然のシングルドメインであり、それ自身でも抗体として機能する。このため、「シングルドメイン抗体」（以下、「ＶＨＨ抗体」と略すことがある。）と呼ばれている。
【0009】
ウイルスの立体構造エピトープが、例えば、酵素ポケットのような穴状の構造や、ドメイン間の割目の構造部分を含む場合、従来のＩｇＧではその大きさからこうしたエピトープに結合することができなかった。これに対し、上記のVHH抗体は、その分子量がＩｇＧ抗体の１０分の１と小さいため、上記のような構造のエピトープにも結合することができ、多くの糖鎖で修飾されたウイルス粒子の表面等にも結合できるため、標的分子になり得る分子の幅が広くなる。
【0010】
さらに、ＶＨＨは耐酸性や耐熱性にも優れており、ＩｇＧとは異なって培養細胞で産生させる必要がなく、大腸菌、酵母等で生産することができる。このため、量産しやすく、精製も容易であるという利点がある。さらに、ＶＨＨ抗体は１本鎖のペプチドで構成されているため、蛋白質工学の技術又は化学修飾等の技術を用いて機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製しやすいという特徴を有することが知られている（以下、「従来技術４」という。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【文献】Neutralizing nanobodies bind SARS-CoV-2 spike RBD and block interaction with ACE2. Nature Structural & Molecular Biology 2020
【文献】Development of multi-specific humanized llama antibodies blocking SARS-CoV-2/ACE2 interaction with high affinity and avidity. Emerging Microbes & Infections 2020; 9; 1034-1036
【文献】Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell 2020; 181: 1004-1015.
【文献】Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2. Cell Host & Microbe 2020; 27: 891-898
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
従来技術１は、ウイルスの遺伝物質を検出する方法で、現時点で使えるウイルス検査の中では最も正確といわれており、精度が高いという点では優れた技術である。しかし、検査を実施するには時間と手間とがかかり、ＰＣＲ検査の実施数を、本当に必要な数まで増加させるのが難しいという問題がある。
また、従来技術２は、高価な機械、検査を行う者に要求される技術に習熟するための訓練、検査に要する多大な労力等がなくても、感染しているかどうかが数分で診断できるという点では優れた技術である。したがって、信頼できる抗原検査法が確立されれば、検査数の拡大を容易に行うことができる。また、自宅や診療現場においてＣＯＶＩＤ－１９感染の診断ができるようになることから、一刻も早い臨床現場への導入が求められている。しかし、抗体の調製にコストがかかり、検査に必要とされる量を確保することが容易ではないという問題がある。
また、従来技術２は、高価な機械、検査を行う者に要求される技術に習熟するための訓練、検査に要する多大な労力等がなくても、感染しているかどうかが数分で診断できるという点では優れた技術である。したがって、信頼できる抗原検査法が確立されれば、検査数の拡大を容易に行うことができる。また、自宅や診療現場においてＣＯＶＩＤ－１９感染の診断ができるようになることから、一刻も早い臨床現場への導入が求められている。しかし、抗体の調製にコストがかかり、検査に必要とされる量を確保することが容易ではないという問題がある。
【0013】
従来技術３は、多くの症例において感染から発症までの潜伏期間が長いと考えられているとともに、発症から１週間程度経過した後に症状が急速に悪化して重症肺炎に至るなど、臨床経過が長い症例も報告されているＣＯＶＩＤ－１９の感染においては、経時的に状況を把握できるという点では優れた方法である。しかし、こうした血清学的方法においても、検査には抗体を使用するため、抗原検査と同じ問題を抱えている。
【0014】
血清学的診断に用いられる抗体の代表例はＩｇＧであるが、抗原を投与した動物の血清から精製するか、目的のＩｇＧのヌクレオチド配列をコードする遺伝子断片をプラスミド等組み込んで培養細胞に導入し、培養して得るのが一般的な製造法である。このため、精製に時間と手間がかからない、抗体として機能する分子に対する強い社会的要請があった。
【0015】
ＶＨＨは、上述したように種々の利点を有しているが、基質との親和性が高いＶＨＨを取得するのが難しい。このため、基質との親和性が高く、産生及び精製がし易く、かつ変異しやすい基質（ウイルスのヌクレオチド配列）に対応できるＶＨＨ、とりわけ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するＶＨＨを取得することについての強い社会的要請があった。
また、ＩｇＧ抗体は、静脈内投与や皮下投与による全身投与を前提とするため、局所投与に比較して十分な治療効果は望めないという問題がある。一方で、全身への暴露による抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）のリスクも懸念される。さらに、ＶＨＨ－７２－Ｆｃについては、ＶＨＨ単独では十分な中和活性を示さないことが報告されており、Ｆｃフュージョン化によりシングルドメイン抗体の物理的優位性が失われる他、Ｆｃを介した抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）のリスクも懸念される。
以上から、ＳＡＲＳ関連のコロナウイルスに対して優れた治療効果を示す薬剤を開発するために、多様なエピトープを認識するシングルドメイン抗体の開発についての強い社会的要請があった。
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチド及びその利用法を提供することに関する。
また、ＩｇＧ抗体は、静脈内投与や皮下投与による全身投与を前提とするため、局所投与に比較して十分な治療効果は望めないという問題がある。一方で、全身への暴露による抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）のリスクも懸念される。さらに、ＶＨＨ－７２－Ｆｃについては、ＶＨＨ単独では十分な中和活性を示さないことが報告されており、Ｆｃフュージョン化によりシングルドメイン抗体の物理的優位性が失われる他、Ｆｃを介した抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）のリスクも懸念される。
以上から、ＳＡＲＳ関連のコロナウイルスに対して優れた治療効果を示す薬剤を開発するために、多様なエピトープを認識するシングルドメイン抗体の開発についての強い社会的要請があった。
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチド及びその利用法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチドを得るべく検討した結果、特定のアミノ酸数を有するＣＤＲ１～３をコンストラクトに含むＶＨＨ抗体ライブラリーから、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローンを得ることに成功した。
【0017】
すなわち、本発明は、配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドに係るものである。
一態様として、前記ペプチドは、ＶＨＨ抗体、重鎖抗体及びＶＨＨ抗体多量体からなる群から選ばれるいずれかである。
また別の一態様として、前記ＶＨＨ抗体多量体は、前記構造ドメインを複数連結した多量体である。
一態様として、前記ペプチドは、ＶＨＨ抗体、重鎖抗体及びＶＨＨ抗体多量体からなる群から選ばれるいずれかである。
また別の一態様として、前記ＶＨＨ抗体多量体は、前記構造ドメインを複数連結した多量体である。
【0018】
また別の一態様として、前記配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して３．６ｘ１０－９Ｍ以下のＫＤを有するものである。
また別の一態様として、前記構造ドメインは、さらに配列番号１０～１８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号１９～２７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２を含むものである。
また、本発明の別の態様は、上述したペプチドをコードする核酸である。
また別の一態様として、前記構造ドメインは、さらに配列番号１０～１８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号１９～２７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２を含むものである。
また、本発明の別の態様は、上述したペプチドをコードする核酸である。
【0019】
また、本発明の別の態様は、上述したいずれかのペプチドを被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法である。
また、本発明の別の態様は、上述したいずれかのペプチドを含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キットである。
また、本発明の別の態様は、上述したいずれかのペプチドを含有する医薬である。
また、本発明の別の態様は、上述したいずれかのペプチドを含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キットである。
また、本発明の別の態様は、上述したいずれかのペプチドを含有する医薬である。
【発明の効果】
【0020】
本発明によれば、従来の抗体では得られない強力な中和能などを有する抗体医薬の創出に寄与し得る、反応性の高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドを提供することができる。当該ペプチドを用いることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出、すなわちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の迅速な検出が可能となる。
また、感染部位である上気道や肺に直接吸入器で局所投与できる、呼吸器感染症治療剤の創薬に寄与できるペプチドを提供することができる。
また、感染部位である上気道や肺に直接吸入器で局所投与できる、呼吸器感染症治療剤の創薬に寄与できるペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド（以下、「本発明のペプチド」と称する）は、配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチドである。
【0023】
ここで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急性呼吸器疾患の原因となる、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）であり、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。本発明のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチドであるが、詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のうちのＳ１サブユニットに結合するペプチドである。
【0024】
本発明のペプチドとしては、エピトープに潜在的に結合する能力を有するペプチドが挙げられ、代表的には抗体又は抗体フラグメントが該当する。「抗体」とは、液性免疫を担う抗体産生細胞から産生される、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの他、重鎖抗体、一本鎖抗体、ＳｃＦｖ、重鎖抗体のＣＤＲ３配列を含むシングルドメイン抗体（以下、「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨ抗体」ということがある。）、体内に侵入した病原体などの異物に結合し得るアプタマー、及びこれらの一部が修飾・改変されたものを含むものとする。
【0025】
本明細書において、「ＣＤＲ３クラスター」とは、相補性決定領域の一つであるＣＤＲ３のアミノ酸配列を対象として、ＣＤ－ＨＩＴ（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｔ Ｈｉｇｈ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）その他の配列クラスタリングプログラムを用いて、８０％ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ（クラスタリングの閾値）を一集団として定義したものとする。
【0026】
本発明のペプチドは、少なくとも３つの相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＣＤＲ」ということがある。）及び複数のフレームワーク領域を含む。ＣＤＲは超可変領域とも云われ、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含む領域をいう。そして、各ＣＤＲの位置関係は、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順番となっている。また、上記フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＦＲ」ということがある。）は、抗体分子の可変領域における相補性決定領域を除く領域、すなわち、保存性の高い領域をいい、上記フレーム指す上記のＣＤＲ１～ＣＤＲ３の５’側及び３’側の双方に位置していてもよい。
【0027】
本発明のペプチドは、上記ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のうち、ＣＤＲ３が、例えば、下記表１に示す配列のうちのいずれか、又はこれらのアミノ酸配列の少なくとも１つが他のアミノ酸に置換されているものである。ここで、置換されるアミノ酸の位置及び置換後のアミノ酸の種類は、これらのアミノ酸配列の抗原との解離定数が１００ｎＭ以上とならない限り、限定されないが好ましくは１個の置換である。
【0028】
【表1】
【0029】
斯かるＣＤＲ３を有するペプチドは、後述する実施例において、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローン、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（ＣｏＶＨＨ））である。
なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能は、当業者に公知の方法により評価することができる。具体的には、後述する実施例に示すように、バイオレイヤー干渉法により、解離定数ＫＤを求めることにより評価できる。また、例えば抗原を固定したＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、表面プラズモン共鳴測定法等を用いた方法によっても評価することができる。本発明における解離定数ＫＤは、バイオレイヤー干渉法によって求めたものとする。
なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能は、当業者に公知の方法により評価することができる。具体的には、後述する実施例に示すように、バイオレイヤー干渉法により、解離定数ＫＤを求めることにより評価できる。また、例えば抗原を固定したＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、表面プラズモン共鳴測定法等を用いた方法によっても評価することができる。本発明における解離定数ＫＤは、バイオレイヤー干渉法によって求めたものとする。
【0030】
上記ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～９のうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性の点から、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９が好ましい。
【0031】
本発明のペプチドの構造ドメインにおいて、例えば、ＣＤＲ１は、配列番号１０～１８のいずれかで示されるアミノ酸配列であってもよく、ＣＤＲ２は、配列番号１９～２７のいずれかで示されるアミノ酸配列であってもよい。これらのアミノ酸配列は、これらのアミノ酸配列を構成するアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。
例えば、上記ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～９の構造ドメインにおける３つの相補性決定領域のアミノ酸配列は以下のとおりである。
例えば、上記ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～９の構造ドメインにおける３つの相補性決定領域のアミノ酸配列は以下のとおりである。
【0032】
【表2】
【0033】
また、ＦＲ１は配列番号２８～３４に示すアミノ酸配列であってもよく、ＦＲ２は配列番号３５～４２に示すアミノ酸配列であってもよい。ＦＲ３は、配列番号４３～５０に示すアミノ酸配列であってもよく、ＦＲ４は配列番号５１～５３に示すヌクレオチド配列で規定されるアミノ酸配列であってもよい。
【0034】
また、ＦＲ１～ＦＲ４は、上記の配列番号２８～５３に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。ここで、配列番号２８～５３に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号２８～５３に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有する配列であることがより好ましく、さらに好ましくは９０％以上である。９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域であることが、さらに好ましい。
【0035】
ここで、アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを用いて解析を行なうことにより算出できる。
【0036】
本発明のＣＤＲ３の配列を含むペプチドとしては、例えば、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順に連結されたものを挙げることができる。これらの領域のアミノ酸配列は、上述したとおり、配列表の配列番号１～５３で示され、前述したＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の当該領域のアミノ酸配列は、配列番号６５（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１）、配列番６６（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２）、配列番号６７（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３）、配列番号６８（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４）、配列番号６９（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５）、配列番号７０（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６）、配列番号７１（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７）、配列番号７２（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８）、配列番号７３（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９）に示すものとなっている。
【0037】
本発明のペプチドは、上記の構造ドメインを少なくとも１つ有するものであればその形態は限定されず、ＶＨＨ抗体のような可変領域断片（ナノボディーとも呼ばれる）の他、一本鎖抗体、重鎖抗体、可変領域断片をペプチドリンカーなどで結合させた多量体、例えば二量体であってもよい。
【0038】
本発明のペプチドの作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、本発明のペプチドをコードする核酸を適当なベクター（例えば、プラスミド）に組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換えペプチドとして産生させる方法が好ましい。
【0039】
ここで、本発明のペプチドの発現用プラスミドとしては、各種の宿主細胞に適したプラスミドを用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３その他の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４その他の枯草菌由来のベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５その他の酵母由来ベクター；λファージその他のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスその他のウイルスベクターの他、これらを適宜改変したベクターを用いることができる。
【0040】
これらの発現プラスミドは、各々のプラスミドに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現プラスミドには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
【0041】
本発明のペプチド産生菌は、所望の方法、例えば、エレクトロポレーションによって、上記の発現プラスミドを所望の菌に導入することにより作製できる。組換えペプチドの産生に使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、コリネ菌、各種のカビ、動物細胞、植物細胞その他の細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞等を挙げることができる。これらのうちでも、コリネ菌と枯草菌が好適に使用でき、生産性が高い枯草菌がより好ましい。
【0042】
発現させた本発明のペプチドを培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的のペプチドを取得することができる。
【0043】
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【0044】
本発明のペプチドは、後述する実施例に示すように、ｃＤＮＡディスプレイ法を用いてＶＨＨ抗体候補配列を選抜することにより見い出されたものである。以下にこの方法を用いた場合の抗体の取得について、記載する。
【0045】
標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｈｉｓリコンビナントタンパク（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク」と略す、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をスクリーニング用の標的分子として用いた。ＲｅＰＨＡＧＥＮ社より提供されているアルパカ由来ナイーブＶＨＨライブラリー遺伝子を鋳型として、ＣＤＲ１－２領域またはＣＤＲ３領域の２つの遺伝子断片をＶＨＨ特異的プライマーにてＰＣＲで増幅し、オーバーラップＰＣＲ用プライマーを用いて伸長ＰＣＲを行って伸長させ、全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリーを作製する。
【0046】
ここで使用するＶＨＨ特異的プライマーとしては、例えば、配列表の配列番号５４及び５５を挙げることができる。また、オーバーラップＰＣＲ用プライマーしては、例えば、配列表の配列番号５６及び５７を挙げることができる。上記のライブラリーを構成するＤＮＡ断片は、Ｔ７プロモーター、オメガ（Ω）エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ＶＨＨ遺伝子、Ｈｉｓタグ、およびリンカーハイブリダイゼーション領域（Ｙタグ）を含むことが好ましい。
【0047】
以上のようにして得られたライブラリ（ＰＣＲ産物）を精製し、引き続き転写を行う。上記ライブラリーの精製には、市販のキット、例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）等を用いることができる。また、転写には、市販のキット、例えば、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等を使用することができる。その後、例えば、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）等を使用して、ＲＮＡを定量する。
【0048】
得られたｍＲＮＡをｃｎｖＫ又はその類縁体等の光架橋塩基を含むピューロマイシンリンカーと、所望の波長の光を所望の時間、例えば、３３０～３７０ｎｍの光を１～１０分間照射して連結させ、ｍＲＮＡ－リンカー連結体を得る。得られたｍＲＮＡ－リンカー連結体を用いて無細胞翻訳を行い、ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成する。この無細胞翻訳には、例えば、Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の市販品を使用することができる。
【0049】
次いで得られたｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を磁性ビーズに固定化する。こうしたビーズとしては、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などを使用することができる。上記磁性ビーズに固定されなかった上記ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を除き、逆転写反応を行うことによって、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成する。
次いで、磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を、例えば、ＲＮａｓｅ Ｔ１を含むＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加して溶出させ、Ｈｉｓ－ｔａｇ精製を行い、精製後したｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を得ることができる。
次いで、磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を、例えば、ＲＮａｓｅ Ｔ１を含むＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加して溶出させ、Ｈｉｓ－ｔａｇ精製を行い、精製後したｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を得ることができる。
【0050】
所望の標的分子、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパクを、例えば、上述した磁性体ビーズに固定化するために、常法に従って上記標的分子をビオチン化する。このようにビオチン化された標的タンパクは、上記のビーズに固定されたストレプトアビジンと結合するため、標的分子をビーズ上に固定することができる。固定化前後の溶液のタンパク濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のバンド強度比を比較することによって、上記の固定化反応の収率を確認することができる。
【0051】
次いで、上記のようにして得られたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体（ｃＤＮＡディスプレイ分子）と、標的分子、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク、を固定化したビーズとを用いて、試験管内淘汰セレクションを行う。このセレクションは複数回繰り返すことが得られるＶＨＨの配列が収束することから好ましく、３～６ラウンド繰り返すことがセレクションの効率を上げるために好ましい。
【0052】
このセレクションでは、ｃＤＮＡディスプレイ法を使用するが、各ラウンドで使用するｍＲＮＡ－リンカー連結体の量を調節するとともに、必要に応じて非特異的吸着物を除去するためプレセレクションを行うことが好ましい。また、各ラウンドでの溶出に使用する溶出液及び溶出回数は、適宜選択することができる。例えば、ラウンド１とそれ以降のラウンドの溶出回数を変えてもよく、また、各ラウンドで複数の溶出バッファーを用いてもよい。得られた溶出液は、例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製し、精製産物を得ることができる。
【0053】
次いで、セレクションで得られた精製産物をＰＣＲに供し、増幅させてＰＣＲ増幅産物を得ることができる。得られたＰＣＲ増幅産物を、例えば、上記の磁性ビーズに上記と同様にして固定化し、ＦＩＴＣで標識されたＦＡＣＳソーティング用ビーズを得ることができる。上記標的タンパク固定化ビーズの領域の同定を行う。最適な分取条件にてソーティングを行って、所望の粒子数、例えば、それぞれ５０万粒子を回収し、上記と同様に精製する。得られた粒子を、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅し、上記と同様に精製する。
【0054】
その後、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を利用したシーケンス解析を行い、試験管内淘汰サイクルによるＤＮＡライブラリーの収束度を詳細に確かめる。シーケンスサンプルの調製は、例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社が提供している２－ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎに準じて行うことができる。各セレクション後のＰＣＲ産物を鋳型として、所望のプライマーを、例えば、配列番号６０及び６１に示すプライマーを用いて、アンプリコンＰＣＲを行うことができる。
【0055】
以上のようにしてＡｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を上記と同様にして精製し、その後、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を上記と同様に精製した後、ゲル電気泳動によってＰＣＲ産物のサイズを確認する。この後、例えば、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＰＣＲ産物の定量を行い、例えば、下記の式（１）に従ってモル濃度を算出し、得られた値に基づいて、ＮＦＷで希釈して所望の濃度、例えば、４ｎＭに調製する。
（数１）
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０６＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］ （１）
（数１）
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０６＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］ （１）
【0056】
推奨プロトコルに従ってライブラリー濃度を調整し、変性・希釈済みのサンプルライブラリー及びコントロールの濃度を所望の最終濃度に調製する。その後、例えば、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２５００ ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行うことができる。
引き続き、得られたＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供し、ＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳する。これらの翻訳データから、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測し、その後、相補性決定領域の一つ、例えば、ＣＤＲ３の配列を対象とし、例えば、上記配列クラスタリングプログラムＣＤ－ＨＩＴ等を用いて、所望の類似度を８０％以上を同一クラスターとしてクローン数を計測し、各ラウンドのクラスター数を求めることができる。
引き続き、得られたＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供し、ＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳する。これらの翻訳データから、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測し、その後、相補性決定領域の一つ、例えば、ＣＤＲ３の配列を対象とし、例えば、上記配列クラスタリングプログラムＣＤ－ＨＩＴ等を用いて、所望の類似度を８０％以上を同一クラスターとしてクローン数を計測し、各ラウンドのクラスター数を求めることができる。
【0057】
ＦＡＣＳソーティングのデータ比較等から非特異的結合と考えられるクローンを除去した後、標的分子に結合するＶＨＨ抗体候補配列を選抜する。選抜されたＶＨＨ抗体候補配列を所望のプライマー、例えば、配列番号６３及び６４で表されるプライマーを用いてＰＣＲで増幅させ、得られたＰＣＲ増幅産物を精製して、ＶＨＨ抗体作成用の遺伝子を調製する。得られた遺伝子から無細胞翻訳系でポリクローナルＶＨＨ抗体を作製する。得られたポリクローナルＶＨＨ抗体の抗体価は、例えば、常法に従ってＥＬＩＳＡにより評価することができる。
【0058】
ＥＬＩＳＡ評価で結合が認められたＣＤＲ３配列を含むＶＨＨクローンをタンパク発現させるには、上述した試験管内スクリーニングのＲ５のＤＮＡライブラリーから各ＶＨＨの遺伝子を調製し、発現用プラスミドに導入する。目的断片のＤＮＡは制限酵素を用いて切り出し、発現プラスミドにライゲーションさせて組換えプラスミドを調製し、所望の菌、例えば、大腸菌を形質転換する。形質転換した大腸菌から上記組換えプラスミドを抽出して発現プラスミドを得ることができる。得られた発現プラスミドを所望の菌に導入し、得られた抗体産生菌を抗生物質を含む培地で前培養し、その後本培養して培養上清を回収する。ＶＨＨの産生はゲル電気泳動等で確認することができる。回収した培養上清をＨｉｓ－タグ精製し、ＶＨＨ抗体試料とすることができる。
【0059】
本発明のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合することから、これを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有するか、または含有する可能性のある被験試料と接触させることによって、当該試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
具体的には、本発明のペプチドを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明のペプチドと被検試料とを接触させ、本発明のペプチドと前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明のペプチドは、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認するペプチドとして使用することもできる。
具体的には、本発明のペプチドを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明のペプチドと被検試料とを接触させ、本発明のペプチドと前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明のペプチドは、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認するペプチドとして使用することもできる。
【0060】
被験試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液，咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、ウイルスが付着している可能性のある固体表面、例えばドアノブ、便器等から採取された試料が挙げられる。本発明のペプチドは固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明のペプチドとは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明のペプチドとは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
【0061】
また、本発明のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用キットの構成成分となり得る。当該キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の診断薬として、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬の開発用のツールとして使用可能である。
当該検出キットは、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドの他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明のペプチドは固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェルを有する基板（以下、「ウェル基板」という）が挙げられ、本発明のペプチドが直接的又は間接的に固定される。
当該検出キットは、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドの他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明のペプチドは固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェルを有する基板（以下、「ウェル基板」という）が挙げられ、本発明のペプチドが直接的又は間接的に固定される。
【0062】
本発明のペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１サブユニットに結合し、ウイルスの細胞への結合を阻害する場合には、本発明のペプチドは、哺乳動物に投与し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療するための医薬として利用することができる。上記哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等を挙げることができるが、ヒトであることが好ましい。
【0063】
本発明のペプチドを医薬として用いる場合には、その投与形態は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤等と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、静脈内、皮下、皮内、筋肉内等への投与、噴霧その他による粘膜への投与等を挙げることができる。
こうした投与は、医薬中に含まれる本発明のペプチドの含有量を適宜調整し、また、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で投与することとしてもよい。
こうした投与は、医薬中に含まれる本発明のペプチドの含有量を適宜調整し、また、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で投与することとしてもよい。
【実施例】
【0064】
（実施例１）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シングルドメイン抗体のスクリーニング
＜材料と方法＞
１．スクリーニングの標的分子
標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｈｉｓリコンビナントタンパク（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク」と略す、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いた。
＜材料と方法＞
１．スクリーニングの標的分子
標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｈｉｓリコンビナントタンパク（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク」と略す、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いた。
【0065】
２．ｃＤＮＡディスプレイの合成
（１）完全長アルパカ由来抗体の可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＶＨＨ）コード化ＤＮＡライブラリーの作製
ＲｅＰＨＡＧＥＮ社より提供されているアルパカ由来ナイーブＶＨＨライブラリー遺伝子を鋳型として、ＣＤＲ１－２領域またはＣＤＲ３領域の２つの遺伝子断片をＶＨＨ特異的プライマー（配列番号５４、５５）にてＰＣＲで増幅した後、Ｔ７プロモーター、オメガ（ω）エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ＶＨＨ遺伝子、Ｈｉｓタグ、およびリンカーハイブリダイゼーション領域（Ｙタグ）からなるＤＮＡ断片へと調整するため、オーバーラップＰＣＲ用プライマー（配列番号５６、５７）を用いて伸長ＰＣＲを行って伸長させ、全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリーを作製した。
（１）完全長アルパカ由来抗体の可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＶＨＨ）コード化ＤＮＡライブラリーの作製
ＲｅＰＨＡＧＥＮ社より提供されているアルパカ由来ナイーブＶＨＨライブラリー遺伝子を鋳型として、ＣＤＲ１－２領域またはＣＤＲ３領域の２つの遺伝子断片をＶＨＨ特異的プライマー（配列番号５４、５５）にてＰＣＲで増幅した後、Ｔ７プロモーター、オメガ（ω）エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ＶＨＨ遺伝子、Ｈｉｓタグ、およびリンカーハイブリダイゼーション領域（Ｙタグ）からなるＤＮＡ断片へと調整するため、オーバーラップＰＣＲ用プライマー（配列番号５６、５７）を用いて伸長ＰＣＲを行って伸長させ、全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリーを作製した。
【0066】
【表3】
【0067】
ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。１．４ｍＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った上清の除去後、磁気プレート上で３分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、１００μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で２分間静置した後、上清を回収した。
【0068】
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。２５μＬのＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ２ｘ Ｂｕｆｆｅｒ，２０ｐｍｏｌ ＰＣＲ産物、５μＬのＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、５μＬのＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡｓｅを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。転写産物の精製はＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。チューブに入れた転写産物μＬあたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングして混合し、その後５分間静置した。磁性プレート上で静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で１０分間静置してビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＲＮＡを定量した。
Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。２５μＬのＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ２ｘ Ｂｕｆｆｅｒ，２０ｐｍｏｌ ＰＣＲ産物、５μＬのＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、５μＬのＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡｓｅを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。転写産物の精製はＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。チューブに入れた転写産物μＬあたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングして混合し、その後５分間静置した。磁性プレート上で静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で１０分間静置してビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＲＮＡを定量した。
【0069】
（３）ｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーの連結
４μＬの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｐｍｏｌのｍＲＮＡ、２０ｐｍｏｌのｃｎｖＫ ｒｉｂｏ Ｇ ｌｉｎｋｅｒを混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで２０μＬになるように反応液を調製した。アニーリングは、ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９０℃で２分間、７０℃で１分間、２５℃で３０秒、４℃でインキュベートという条件下で行った。Ｒａｍｐ ｒａｔｅは０．１℃／秒に設定した。続いて、Ｈａｎｄｈｅｌｄ ＵＶ Ｌａｍｐ（６Ｗ、ＵＶＧＬ－５８、測定波長を２５４／３６５ｎｍ、１００Ｖ；Ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ、Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて３６５ｎｍの波長の光を５分間照射した。ｍＲＮＡ－リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
４μＬの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｐｍｏｌのｍＲＮＡ、２０ｐｍｏｌのｃｎｖＫ ｒｉｂｏ Ｇ ｌｉｎｋｅｒを混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで２０μＬになるように反応液を調製した。アニーリングは、ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９０℃で２分間、７０℃で１分間、２５℃で３０秒、４℃でインキュベートという条件下で行った。Ｒａｍｐ ｒａｔｅは０．１℃／秒に設定した。続いて、Ｈａｎｄｈｅｌｄ ＵＶ Ｌａｍｐ（６Ｗ、ＵＶＧＬ－５８、測定波長を２５４／３６５ｎｍ、１００Ｖ；Ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ、Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて３６５ｎｍの波長の光を５分間照射した。ｍＲＮＡ－リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
【0070】
（４）無細胞翻訳
ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体の合成にはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。１０．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ、１５μＬの２０ｘ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｍｉｘ，５２５μＬのＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ、１５μＬのＲＮａｓｉｎ（商標） Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、９μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、３６μＬのＩＶＶ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ ＫＣｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ２）混合液を加え、さらに３７℃で２０分間反応させることで、ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体の合成にはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。１０．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ、１５μＬの２０ｘ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｍｉｘ，５２５μＬのＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ、１５μＬのＲＮａｓｉｎ（商標） Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、９μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、３６μＬのＩＶＶ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ ＫＣｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ２）混合液を加え、さらに３７℃で２０分間反応させることで、ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
【0071】
（５）ストレプトアビジン磁性体ビーズへの固定化
６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０μＬの２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は２回行った。７５μＬのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体、７５μＬの２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁性プレート上で１分間静置した後、上清を除去した。２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は２回行った。
６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０μＬの２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は２回行った。７５μＬのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体、７５μＬの２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁性プレート上で１分間静置した後、上清を除去した。２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は２回行った。
【0072】
（６）逆転写反応
５５．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ、１．５μＬの５ｘ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１．５μＬのＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（１００Ｕ／μＬ）（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を混合した。上記の反応液にストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を添加し、４２℃、３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
５５．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ、１．５μＬの５ｘ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１．５μＬのＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（１００Ｕ／μＬ）（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を混合した。上記の反応液にストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を添加し、４２℃、３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
【0073】
（７）磁性体ビーズからの切り出し
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体に対して、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。続いて、３０μＬの１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた後、３７℃で１５分間静置することでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出させた。
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体に対して、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。続いて、３０μＬの１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた後、３７℃で１５分間静置することでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出させた。
【0074】
（８）Ｈｉｓタグ精製
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた後、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作は２回行った。ｃＤＮＡ－ペプチド連結体の溶出液とＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ懸濁液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。２００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作を２回行った。１０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出した。
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた後、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作は２回行った。ｃＤＮＡ－ペプチド連結体の溶出液とＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ懸濁液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。２００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作を２回行った。１０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出した。
【0075】
３．セレクション
（１）標的分子の磁性ビーズへの固定化
標的分子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパクを固定化するため、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１を使用し、以下の手順にて固定化した。まず、２５μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパクに１００μＬの１ｘ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを加えた後、本溶液に１ｍＭのＥＺ－ＬｉｎｋTM Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎ溶液を６．５μＬ加え、室温にて３０分間インキュベートした。反応溶液をＺｅｂａTM Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にて精製し、Ｂｉｏｔｉｎ化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク１１６μＬを回収した。
（１）標的分子の磁性ビーズへの固定化
標的分子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパクを固定化するため、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１を使用し、以下の手順にて固定化した。まず、２５μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパクに１００μＬの１ｘ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを加えた後、本溶液に１ｍＭのＥＺ－ＬｉｎｋTM Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎ溶液を６．５μＬ加え、室温にて３０分間インキュベートした。反応溶液をＺｅｂａTM Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にて精製し、Ｂｉｏｔｉｎ化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク１１６μＬを回収した。
【0076】
２０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１をエッペンドルフチューブにとり、磁気プレート上に１分間静置した後、上清を除去し、１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を１００μＬ加え、再懸濁した。ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。２５μＬのビオチン化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク溶液を加え、室温にて３０分間撹拌し、磁気プレート上に１分間静置した後、１００μＬの１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、１００μＬのＰＢＳＴで順次洗浄し、１００μＬのＰＢＳＴを加え、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク固定化ビーズ溶液を得た。固定化反応の収率は、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）を用いて固定化前後の溶液のタンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のバンド強度比を比較することにより推定した。
【0077】
（２）試験管内淘汰セレクション
上記２－（８）にて合成されるｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体（ｃＤＮＡディスプレイ分子）と上記３－（１）にて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク固定化ビーズを用いて、試験管内淘汰セレクションを下記表４に示す条件、以下の手順にてＲｏｕｎｄ １～５（Ｒ１～Ｒ５）まで繰り返し行った。ｃＤＮＡディスプレイ合成では、（Ｒ１）では１９２ｐｍｏｌ、Ｒ２では、１２ｐｍｏｌ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５では６ｐｍｏｌのｍＲＮＡ／Ｌｉｎｋｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔを用いた。（Ｒ２）～（Ｒ５）においては、非特異的吸着物を除去するためプレセレクションを実施した。すなわち、調製したｃＤＮＡディスプレイ分子をＰＢＳＴで１００μＬの希釈溶液とし、予め１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄したストレプトアビジン結合磁性体ビーズに結合させ、室温にて１～２時間撹拌した後、磁気スタンドに２分間静置し、上清を回収した。この操作を１～２回行った後、得られた上清をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパクの固定化量に対して、ＰＢＳＴで（Ｒ１）は１μＭ、（Ｒ２）～（Ｒ４）は１００ｎＭになるように希釈した後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１固定化ビーズに結合させ、室温にて１～２時間撹拌した。磁気スタンドに２分間静置した後、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳＴで磁気ビーズを洗浄した。
上記２－（８）にて合成されるｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体（ｃＤＮＡディスプレイ分子）と上記３－（１）にて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク固定化ビーズを用いて、試験管内淘汰セレクションを下記表４に示す条件、以下の手順にてＲｏｕｎｄ １～５（Ｒ１～Ｒ５）まで繰り返し行った。ｃＤＮＡディスプレイ合成では、（Ｒ１）では１９２ｐｍｏｌ、Ｒ２では、１２ｐｍｏｌ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５では６ｐｍｏｌのｍＲＮＡ／Ｌｉｎｋｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔを用いた。（Ｒ２）～（Ｒ５）においては、非特異的吸着物を除去するためプレセレクションを実施した。すなわち、調製したｃＤＮＡディスプレイ分子をＰＢＳＴで１００μＬの希釈溶液とし、予め１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄したストレプトアビジン結合磁性体ビーズに結合させ、室温にて１～２時間撹拌した後、磁気スタンドに２分間静置し、上清を回収した。この操作を１～２回行った後、得られた上清をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパクの固定化量に対して、ＰＢＳＴで（Ｒ１）は１μＭ、（Ｒ２）～（Ｒ４）は１００ｎＭになるように希釈した後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１固定化ビーズに結合させ、室温にて１～２時間撹拌した。磁気スタンドに２分間静置した後、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳＴで磁気ビーズを洗浄した。
【0078】
洗浄操作を１～３回繰り返した後、４０μＬの１０ｍＭ ＴＣＥＰバッファー（ｐＨ ７～８）、１０ｍＭ ＮａＯＨ溶液、１％ＳＤＳ含有ＰＢＳＴ溶液、もしくは、２０μＬの１μＭ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク溶液を溶出バッファーとして加え、室温で５～３０分間インキュベートし、溶出液を回収した。各ラウンドの溶出回数は、（Ｒ１）で４回、（Ｒ２）～（Ｒ５）で３回行った。尚、（Ｒ１）及び（Ｒ２）は、最初の２回はＴＣＥＰバッファーで溶出し、３回目にＮａＯＨ溶液、（Ｒ１）の４回目は、１％ＳＤＳ含有ＰＢＳＴで溶出した。（Ｒ３）～（Ｒ５）については、最初の２回は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク溶液で溶出し、３回目はＴＣＥＰバッファーで溶出した。得られた溶出液をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。
【0079】
【表4】
【0080】
（３）セレクションサンプルのＰＣＲ増幅
上記の淘汰セレクションで得られた溶出サンプルをＰＣＲに供した。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製）を用いて、下記表５に示す組成のＰＣＲ反応液を調製して、これを加え、ＰＣＲを行った。反応条件は、９８℃で２分間の後、９８℃で１０秒、６２℃で５秒、７２℃で３５秒を２５サイクル行い、７２℃で１分反応させた後に１０℃まで冷却した。Ｔ７ｏｍｅｇａ＿Ｎｅｗプライマーは、配列番号５８、ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙＡ ｃｎｖＫプライマーは配列番号５９の配列を有するものを使用した（表６参照）。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰを用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。
上記の淘汰セレクションで得られた溶出サンプルをＰＣＲに供した。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製）を用いて、下記表５に示す組成のＰＣＲ反応液を調製して、これを加え、ＰＣＲを行った。反応条件は、９８℃で２分間の後、９８℃で１０秒、６２℃で５秒、７２℃で３５秒を２５サイクル行い、７２℃で１分反応させた後に１０℃まで冷却した。Ｔ７ｏｍｅｇａ＿Ｎｅｗプライマーは、配列番号５８、ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙＡ ｃｎｖＫプライマーは配列番号５９の配列を有するものを使用した（表６参照）。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰを用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。
【0081】
【表5】
【0082】
【表6】
【0083】
（４）ＦＩＴＣビーズの作製
２０μＬのストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をエッペンドルフチューブにとり、磁気プレート上に１分間静置した後、上清を除去し、１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、再懸濁した。ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。１０μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ（５－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０μＬ加え、室温で１時間撹拌した後、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。ＰＢＳＴを１００μＬ加え、ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。この操作を２回繰り返した後、１．８μＬのＰＢＳＴを加え、ＦＩＴＣビーズ溶液を得た。
２０μＬのストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をエッペンドルフチューブにとり、磁気プレート上に１分間静置した後、上清を除去し、１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、再懸濁した。ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。１０μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ（５－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０μＬ加え、室温で１時間撹拌した後、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。ＰＢＳＴを１００μＬ加え、ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。この操作を２回繰り返した後、１．８μＬのＰＢＳＴを加え、ＦＩＴＣビーズ溶液を得た。
【0084】
（５）ＦＡＣＳによるソーティング
上記の手法で調整した８μＬのＦＩＴＣビーズと４μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク固定化ビーズを混合し、磁気プレート上に１分間静置した後、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳＴを加え、再懸濁した。ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去し、ＦＡＣＳソーティング用ビーズを調整した。得られたビーズに（Ｒ５）のＰＣＲ増幅産物から調整した５０μＬのｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液（６ｐｍｏｌ）を混合し、室温で３０分間撹拌した後、磁気スタンドに２分間静置し、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳＴを加えて、ピペッティングを１分間行った。その後、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。この操作を３回繰り返した後、１ｍＬのＰＢＳＴを加えてソーティング用溶液とした。
上記の手法で調整した８μＬのＦＩＴＣビーズと４μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク固定化ビーズを混合し、磁気プレート上に１分間静置した後、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳＴを加え、再懸濁した。ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去し、ＦＡＣＳソーティング用ビーズを調整した。得られたビーズに（Ｒ５）のＰＣＲ増幅産物から調整した５０μＬのｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液（６ｐｍｏｌ）を混合し、室温で３０分間撹拌した後、磁気スタンドに２分間静置し、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳＴを加えて、ピペッティングを１分間行った。その後、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。この操作を３回繰り返した後、１ｍＬのＰＢＳＴを加えてソーティング用溶液とした。
【0085】
得られたソーティング用溶液をＦＡＣＳ（Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ ＳＨ８００：ＳＯＮＹ）にセットし、サンプル流路、分取時のドロップレット形成条件のセットアップを行い、ソーティングを実施した。粒子径から磁性体ビーズの領域を同定し、４８８ｎｍのレーザー照射による蛍光強度からＦＩＴＣビーズとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク固定化ビーズの領域の同定を行い、最適な分取条件にてソーティングを行って、それぞれ５０万粒子をエッペンドルフにて回収した。その後、１３，０００ｘｇで１０分間、遠心分離を行った。遠心後、磁気プレート上に１０分間静置し、その後、上清を除去し、４０μＬの溶出バッファーを加えて１０分間振とうした。引き続き、磁気プレート上に２分間静置した後、溶出液を回収した。得られた溶出液をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰを用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。
【0086】
（６）ＦＡＣＳ分離サンプルのＰＣＲ増幅
上記と同様の手法により、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰを用いて、当該製品の使用説明書に従って、得られたＰＣＲ産物を精製した。
上記と同様の手法により、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰを用いて、当該製品の使用説明書に従って、得られたＰＣＲ産物を精製した。
【0087】
（７）アンプリコンシーケンスの実施
試験管内淘汰サイクルによるＤＮＡライブラリーの収束度を詳細に確かめるために、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を利用したシーケンス解析を行った。シーケンスサンプルの調製は、ｉｌｌｕｍｉｎａ社が提供している２－ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎの方法を参考に実施した。最初に、各セレクション後のＰＣＲ産物を鋳型として、下記表７に示す組成のＰＣＲ反応液を調製し、下記の配列番号６０及び６１に示すプライマー（表８参照）を用いて、Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、６２℃で５秒間、７２℃で３５秒を１５サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。
試験管内淘汰サイクルによるＤＮＡライブラリーの収束度を詳細に確かめるために、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を利用したシーケンス解析を行った。シーケンスサンプルの調製は、ｉｌｌｕｍｉｎａ社が提供している２－ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎの方法を参考に実施した。最初に、各セレクション後のＰＣＲ産物を鋳型として、下記表７に示す組成のＰＣＲ反応液を調製し、下記の配列番号６０及び６１に示すプライマー（表８参照）を用いて、Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、６２℃で５秒間、７２℃で３５秒を１５サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。
【0088】
【表7】
【0089】
【表8】
【0090】
得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰを用いて当該製品の使用説明書に従って精製した後、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を鋳型として、下記表９に示す組成のＰＣＲ反応液を調整して、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１７秒を１０サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。
【0091】
【表9】
【0092】
得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰを用いて当該製品の使用説明書に従って精製した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズを確認した。その後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＰＣＲ産物の定量を行い、以下の式（１）に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、ＮＦＷで希釈することで４ｎＭに調製した。
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０６＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］・・・（１）
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０６＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］・・・（１）
【0093】
４ｎＭライブラリーを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルライブラリーの最終濃度は７ｐＭになるように調製した。また，サンプルライブラリー中のＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌは５％になるように調製した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２５００ ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行った。
【0094】
（８）ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列の抽出とＣＤＲ３クラスター解析
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。得られた翻訳データから、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測後、ＣＤＲ３クラスター数を計測し、各ラウンドのクラスター数を求めた。結果、ラウンドを重ねる毎にクローン数が減少し、良好な淘汰セレクションが実行できていることが確認できた（図１）。
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。得られた翻訳データから、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測後、ＣＤＲ３クラスター数を計測し、各ラウンドのクラスター数を求めた。結果、ラウンドを重ねる毎にクローン数が減少し、良好な淘汰セレクションが実行できていることが確認できた（図１）。
【0095】
（９）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＶＨＨ抗体候補配列の選抜
ＦＡＣＳソーティングのデータ比較等から非特異的結合と考えられるクローンを除去した後、Ｒ５に出現したＣＤＲ３クラスターを対象として、ラウンド間での頻度上昇率（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を算出し、Ｒ４からＲ５にかけて出現頻度が１０倍以上上昇したＣＤＲ３クラスターを抽出した結果、下記表１０に示す９個のＣＤＲ３クラスターが該当した。
ＦＡＣＳソーティングのデータ比較等から非特異的結合と考えられるクローンを除去した後、Ｒ５に出現したＣＤＲ３クラスターを対象として、ラウンド間での頻度上昇率（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を算出し、Ｒ４からＲ５にかけて出現頻度が１０倍以上上昇したＣＤＲ３クラスターを抽出した結果、下記表１０に示す９個のＣＤＲ３クラスターが該当した。
【0096】
【表10】
【0097】
（実施例２）無細胞翻訳系によるポリクローナルＶＨＨ抗体の作製
（１）遺伝子の調製
試験管内スクリーニングのＲ５で得られたＰＣＲ産物を鋳型として、Ｎｅｗｌｅｆｔプライマー（配列番号６２）と上記で選択されたＣＤＲ３配列を含む特異的プライマー９種類を用いて、ＰＣＲを行った。その後、上記ＮｅｗｌｅｆｔプライマーとＣＤＲ３以降のＦＲ４配列とＨｉｓタグ配列を含むプライマーでＣ末端を延長し、最後にＰＵＲＥｆｌｅｘシステム合成用に設計したＰＵＲＥ＿Ｓｙｓｔｅｍ＿ＦＷプライマー（配列番号６３）、ＰＵＲＥ＿Ｓｙｓｔｅｍ＿Ｒｖプライマー（配列番号６４）を用いてＰＣＲを行った（下記表１１参照）。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰを用いて精製し、ポリクローナルＶＨＨ抗体作製用の遺伝子を９種類調製した。
（１）遺伝子の調製
試験管内スクリーニングのＲ５で得られたＰＣＲ産物を鋳型として、Ｎｅｗｌｅｆｔプライマー（配列番号６２）と上記で選択されたＣＤＲ３配列を含む特異的プライマー９種類を用いて、ＰＣＲを行った。その後、上記ＮｅｗｌｅｆｔプライマーとＣＤＲ３以降のＦＲ４配列とＨｉｓタグ配列を含むプライマーでＣ末端を延長し、最後にＰＵＲＥｆｌｅｘシステム合成用に設計したＰＵＲＥ＿Ｓｙｓｔｅｍ＿ＦＷプライマー（配列番号６３）、ＰＵＲＥ＿Ｓｙｓｔｅｍ＿Ｒｖプライマー（配列番号６４）を用いてＰＣＲを行った（下記表１１参照）。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰを用いて精製し、ポリクローナルＶＨＨ抗体作製用の遺伝子を９種類調製した。
【0098】
【表11】
【0099】
（２）無細胞翻訳合成
上記（１）で調製した遺伝子を鋳型ＤＮＡとし、ＰＵＲＥｆｌｅｘ１．０（Ｇｅｎｅｆｒｏｎｔｉｅｒ）のプロトコルに従って、下記表１２の組成にて反応溶液を調製し、３７℃で３～４時間インキュベートし、ポリクローナルＶＨＨ抗体を合成した。
上記（１）で調製した遺伝子を鋳型ＤＮＡとし、ＰＵＲＥｆｌｅｘ１．０（Ｇｅｎｅｆｒｏｎｔｉｅｒ）のプロトコルに従って、下記表１２の組成にて反応溶液を調製し、３７℃で３～４時間インキュベートし、ポリクローナルＶＨＨ抗体を合成した。
【0100】
【表12】
【0101】
（３）Ｈｉｓタグ精製
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。その後、２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作を２回行った。上記（１）で調製した無細胞翻訳液２０μＬをＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓを入れたチューブに加え、室温で３０分間インキュベートした。その後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。このチューブに２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングして懸濁させた。このチューブを磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作を２回行った。２０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）をこのチューブに添加し、室温で１５分間インキュベートした。磁気プレート上で１分間静置し、上清を回収した。この溶出操作を２回行った。１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液をチューブに加えて２００μＬとなるように希釈し、ポリクローナルＶＨＨ抗体試料溶液を得た。
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。その後、２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作を２回行った。上記（１）で調製した無細胞翻訳液２０μＬをＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓを入れたチューブに加え、室温で３０分間インキュベートした。その後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。このチューブに２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングして懸濁させた。このチューブを磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作を２回行った。２０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）をこのチューブに添加し、室温で１５分間インキュベートした。磁気プレート上で１分間静置し、上清を回収した。この溶出操作を２回行った。１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液をチューブに加えて２００μＬとなるように希釈し、ポリクローナルＶＨＨ抗体試料溶液を得た。
【0102】
（実施例３）ＥＬＩＳＡでの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ｓｕｂｕｎｉｔ－Ｆｃ溶液（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で２μｇ／ｍＬに希釈した。この溶液を、イムノモジュール（Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｌｅａｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｏｄｕｌｅｓ＿Ｃ８＿ＭａｘｉＳｏｒｐ（ｃａｔ＃４４５１０１， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の各ウェルに１００μＬ添加し、シーリング後、４℃で一晩静置して上記のＳ１タンパクを固相化した。このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、各ウェルに３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を３００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、その後、Ｓ１タンパク質を固相化した上記モジュールの各ウェルに対して上記実施例２（３）で調整したポリクローナルＶＨＨ抗体試料溶液を１００μＬ添加し、室温で振盪した。その後、このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ｓｕｂｕｎｉｔ－Ｆｃ溶液（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で２μｇ／ｍＬに希釈した。この溶液を、イムノモジュール（Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｌｅａｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｏｄｕｌｅｓ＿Ｃ８＿ＭａｘｉＳｏｒｐ（ｃａｔ＃４４５１０１， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の各ウェルに１００μＬ添加し、シーリング後、４℃で一晩静置して上記のＳ１タンパクを固相化した。このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、各ウェルに３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を３００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、その後、Ｓ１タンパク質を固相化した上記モジュールの各ウェルに対して上記実施例２（３）で調整したポリクローナルＶＨＨ抗体試料溶液を１００μＬ添加し、室温で振盪した。その後、このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【0103】
１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を用いてＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ｔａｇ ｍＡｂ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＨＲＰ（ｃａｔ＃ Ａ８５９２， Ｓｉｇｍａ）を１／１０，０００に希釈した。次いで、上記各ウェルに対して、この希釈液を１００μＬずつ添加し、ウェルプレートを遮光し、室温で１時間振盪した。このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。ＯＰＤタブレット（ｃａｔ＃ １５５－０２１６１， ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、１０ｍＬの０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４で溶解し、５μＬの３０％Ｈ２Ｏ２を加えてＯＰＤタブレット溶液を調製した。洗浄後、各ウェルに対してＯＰＤタブレット溶液を１００μＬずつ添加し、遮光下で５分間インキュベートした。１００μＬの１Ｍ 硫酸を添加し、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ Ｍ ＰＬＥＸ（ＴＥＣＡＮ）を用いて各ウェルの吸光度を４９０ｎｍで測定した（図２）。このＥＬＩＳＡ試験の結果、選択した９種類全てのポリクローナルＶＨＨ抗体が、良好な結合活性を有することが確認された。
【0104】
（実施例４）組換えコリネ菌によるモノクローナルＶＨＨ抗体の生産
（１）ＶＨＨ発現用プラスミドの構築
リンカーとＨｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を組換えコリネ菌にて生産した。具体的には、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５（配列番号６９）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９０）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６（配列番号７０）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９１（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７（配列番号７１）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９２）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８（配列番号７２）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９３）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号７３）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９４）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９」と表記）を作製した。ＥＬＩＳＡ評価で結合が認められたＣＤＲ３配列を含むＶＨＨクローンをタンパク発現させるため、試験管内スクリーニングのＲ５のＤＮＡライブラリーから各ＶＨＨの遺伝子を調製し、Ｈｉｓタグを含むような様式の発現用プラスミドに導入した。合成したＶＨＨクローンの遺伝子と空の発現用プラスミドを、２種類の制限酵素ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理し、アガロースゲル電気泳動により目的断片のＤＮＡをそれぞれ単離精製した。その後、制限酵素処理したＶＨＨクローン遺伝子と発現用プラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてライゲーションし、そのライゲーション産物を用いてクローニング用コンピテントセルＪＭ１０９に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミド抽出を行い、ＶＨＨクローンの発現用プラスミドを取得した。
（１）ＶＨＨ発現用プラスミドの構築
リンカーとＨｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を組換えコリネ菌にて生産した。具体的には、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５（配列番号６９）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９０）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６（配列番号７０）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９１（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７（配列番号７１）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９２）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８（配列番号７２）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９３）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号７３）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９４）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９」と表記）を作製した。ＥＬＩＳＡ評価で結合が認められたＣＤＲ３配列を含むＶＨＨクローンをタンパク発現させるため、試験管内スクリーニングのＲ５のＤＮＡライブラリーから各ＶＨＨの遺伝子を調製し、Ｈｉｓタグを含むような様式の発現用プラスミドに導入した。合成したＶＨＨクローンの遺伝子と空の発現用プラスミドを、２種類の制限酵素ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理し、アガロースゲル電気泳動により目的断片のＤＮＡをそれぞれ単離精製した。その後、制限酵素処理したＶＨＨクローン遺伝子と発現用プラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてライゲーションし、そのライゲーション産物を用いてクローニング用コンピテントセルＪＭ１０９に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミド抽出を行い、ＶＨＨクローンの発現用プラスミドを取得した。
【0105】
（２）組換えコリネバクテリウム グルタミカム株の作成
コリネバクテリウム グルタミカム株へのプラスミド導入は以下に示す電気穿孔法により実施した。ＣＭ２Ｇ液体培地にグリセロールストックしたコリネバクテリウム グルタミカム株を植菌し、３０℃、１６０ｒｐｍで数時間振とう培養した。この培養液をマイクロチューブに回収し、遠心機（ＴＡＩＴＥＣ）で１５，０００ｒｐｍ（２０，３８０ｘｇ）、１分間遠心し、上清を除去したペレットを滅菌水にて懸濁した。再度、上記と同様の操作により、滅菌水による菌体の洗浄を行ったのちに、１００μＬの滅菌水で得られたペレットを懸濁し、懸濁液とした。この懸濁液を各種ＶＨＨ発現用プラスミドと混合し、エレクトロポレーションを実施した。この液に１ｍＬのＣＭ２Ｇ培地を加え、３０℃、１８０ｒｐｍで１時間浸透した後、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ寒天培地プレートに適量塗布し、３０℃で１～２日間インキュベートした。
コリネバクテリウム グルタミカム株へのプラスミド導入は以下に示す電気穿孔法により実施した。ＣＭ２Ｇ液体培地にグリセロールストックしたコリネバクテリウム グルタミカム株を植菌し、３０℃、１６０ｒｐｍで数時間振とう培養した。この培養液をマイクロチューブに回収し、遠心機（ＴＡＩＴＥＣ）で１５，０００ｒｐｍ（２０，３８０ｘｇ）、１分間遠心し、上清を除去したペレットを滅菌水にて懸濁した。再度、上記と同様の操作により、滅菌水による菌体の洗浄を行ったのちに、１００μＬの滅菌水で得られたペレットを懸濁し、懸濁液とした。この懸濁液を各種ＶＨＨ発現用プラスミドと混合し、エレクトロポレーションを実施した。この液に１ｍＬのＣＭ２Ｇ培地を加え、３０℃、１８０ｒｐｍで１時間浸透した後、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ寒天培地プレートに適量塗布し、３０℃で１～２日間インキュベートした。
【0106】
（３）ＶＨＨ産生
上記（２）で作成した組換えコリネバクテリウム グルタミカム株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地に植菌し、３０℃で一晩振とうし、前培養液とした。前培養液の全量をＰＭ１Ｓ培地に５％接種し、２５℃で７２時間振とう培養した。培養終了後に、遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４，１００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心し、培養上清を回収した。各培養上清中におけるＶＨＨの産生を確認するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。各ウェルに４μＬ分のサンプルをアプライした後、１５０Ｖで１時間の条件で電気泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色し、培養上清中にＶＨＨが合成されていることを確認した。
上記（２）で作成した組換えコリネバクテリウム グルタミカム株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地に植菌し、３０℃で一晩振とうし、前培養液とした。前培養液の全量をＰＭ１Ｓ培地に５％接種し、２５℃で７２時間振とう培養した。培養終了後に、遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４，１００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心し、培養上清を回収した。各培養上清中におけるＶＨＨの産生を確認するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。各ウェルに４μＬ分のサンプルをアプライした後、１５０Ｖで１時間の条件で電気泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色し、培養上清中にＶＨＨが合成されていることを確認した。
【0107】
回収した培養上清に対してＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてろ過した後、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。４００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．５）を添加し、遠心機（ＴＯＭＹ）で５００×ｇ、３０秒間遠心した。溶出液を回収し、ＶＨＨ抗体サンプルとした。
【0108】
（実施例５）プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
（１）遺伝子配列の人工合成
Ｈｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ１、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４をプロテアーゼ欠損組換え枯草菌にて生産した。具体的には、Ｎ末端にＡｌａ残基を、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ１（配列番号９５（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２（配列番号９６）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３（配列番号９７）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４（配列番号９８）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４」と表記）の人工合成遺伝子を合成した。配列番号９５～９８をコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与し、さらにGCAGCTCTTGCAGCA（配列番号７５）が５’末端に、TCTATTAAACTAGTT（配列番号７６）が３’末端に付加された配列番号７７（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１発現用コンストラクト）、配列番号７８（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２発現用コンストラクト）、配列番号７９（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３発現用コンストラクト）、配列番号８０（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４発現用コンストラクト）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。
（１）遺伝子配列の人工合成
Ｈｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ１、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４をプロテアーゼ欠損組換え枯草菌にて生産した。具体的には、Ｎ末端にＡｌａ残基を、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ１（配列番号９５（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２（配列番号９６）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３（配列番号９７）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４（配列番号９８）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４」と表記）の人工合成遺伝子を合成した。配列番号９５～９８をコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与し、さらにGCAGCTCTTGCAGCA（配列番号７５）が５’末端に、TCTATTAAACTAGTT（配列番号７６）が３’末端に付加された配列番号７７（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１発現用コンストラクト）、配列番号７８（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２発現用コンストラクト）、配列番号７９（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３発現用コンストラクト）、配列番号８０（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４発現用コンストラクト）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。
【0109】
（２）Ｈｉｓタグ付きＶＨＨ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０参照）をテンプレートとし、プライマーとして５’-GATCCCCGGGAATTCCTGTTATAAAAAAAGG-３’（配列番号８１）と５’-ATGATGTTAAGAAAGAAAACAAAGCAG-３’（配列番号８２）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ＰＣＲを行い、上記発現用プラスミド構築用のプラスミド配列を増幅した。
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０参照）をテンプレートとし、プライマーとして５’-GATCCCCGGGAATTCCTGTTATAAAAAAAGG-３’（配列番号８１）と５’-ATGATGTTAAGAAAGAAAACAAAGCAG-３’（配列番号８２）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ＰＣＲを行い、上記発現用プラスミド構築用のプラスミド配列を増幅した。
【0110】
１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’-GAATTCCCGGGGATCTAAGAAAAGTGATTCTGGGAGAG-３’（配列番号８３）と５’-CTTTCTTAACATCATAGTAGTTCACCACCTTTTCCC-３’（配列番号８４）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、ｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。
得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
プライマーとして５’-TGCTGCAAGAGCTGCCGGAAATAAA-３’（配列番号８５）及び５’-TCTATTAAACTAGTTATAGGG-３’（配列番号８６）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ＰＣＲを行い、上記プラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ産物に、（１）で作製した人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてそれぞれ組み込み、各人工合成ＶＨＨ遺伝子を含むＨｉｓタグ付きのＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。構築したプラスミドを、下記（３）に示す手順に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株から、特開２００６－１７４７０７号に記載されている方法に従って、８種の細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ）を欠損させ、さらに特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させることにより得られた株（Ｄｐｒ８ΔｓｉｇＦ）に導入した。
得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
プライマーとして５’-TGCTGCAAGAGCTGCCGGAAATAAA-３’（配列番号８５）及び５’-TCTATTAAACTAGTTATAGGG-３’（配列番号８６）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ＰＣＲを行い、上記プラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ産物に、（１）で作製した人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてそれぞれ組み込み、各人工合成ＶＨＨ遺伝子を含むＨｉｓタグ付きのＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。構築したプラスミドを、下記（３）に示す手順に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株から、特開２００６－１７４７０７号に記載されている方法に従って、８種の細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ）を欠損させ、さらに特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させることにより得られた株（Ｄｐｒ８ΔｓｉｇＦ）に導入した。
【0111】
（３）組換え枯草菌の作製
枯草菌株への上記プラスミド導入は、以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地を入れたチューブ中に、グリセロールを含む溶液中でストックしておいた枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍにて一晩振とう培養した。翌日、このチューブ中の培養液１０μＬを新鮮な１ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。培養終了後、この培養液を１５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含む５００μＬのＳＭＭＰを加えて、得られたペレットを懸濁させ、このチューブを３７℃で１時間インキュベートした。
枯草菌株への上記プラスミド導入は、以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地を入れたチューブ中に、グリセロールを含む溶液中でストックしておいた枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍにて一晩振とう培養した。翌日、このチューブ中の培養液１０μＬを新鮮な１ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。培養終了後、この培養液を１５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含む５００μＬのＳＭＭＰを加えて、得られたペレットを懸濁させ、このチューブを３７℃で１時間インキュベートした。
【0112】
インキュベート終了後、このチューブを３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。４００μＬのＳＭＭＰをこのチューブに加え、得られたペレットを懸濁させて懸濁液とした。別のチューブに得られた懸濁液３３μＬを加え、そこに上記のようにして作製したに各プラスミドを加えて混合し、さらに１００μＬの４０％ＰＥＧを添加し、ボルテックスして混合液とした。この混合液に３５０μＬのＳＭＭＰを加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうして振盪培養物を得た。その後、あらかじめ準備しておいたＤＭ３寒天培地を含むプレートの寒天培地上に、振盪培養物を全量塗布し、３０℃にて２～３日間インキュベートし、組換え枯草菌を得た。
【0113】
（４）ＶＨＨの産生
（３）で作製した組換え枯草菌を、５０ｐｐｍのテトラサイクリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌し、３２℃で一晩往復振とうし、前培養液を得た。得られた前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養物をマイクロチューブに取り、４℃、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清中に含まれる各ＶＨＨについては、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットに添付されたプロトコルに従って精製した。精製時の溶出液としては、５０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳを用いた。
（３）で作製した組換え枯草菌を、５０ｐｐｍのテトラサイクリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌し、３２℃で一晩往復振とうし、前培養液を得た。得られた前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養物をマイクロチューブに取り、４℃、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清中に含まれる各ＶＨＨについては、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットに添付されたプロトコルに従って精製した。精製時の溶出液としては、５０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳを用いた。
【0114】
培養上清中に含まれる抗体の生産量を確認するために、以下の条件でウエスタンブロッティングを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、スーパーセップエース又は１５－２０％（トリシンゲル）（いずれも富士フィルム和光純薬）を用いた。各ウェルに０．５μＬの培養上清を含むサンプルをアプライし、その後１２０Ｖで３時間泳動した。分子量マーカーには、ｘＬ ｌａｄｄｅｒ（Ｂｒｏａｄ）（アプロサイエンス）を用いた。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いて、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜へ転写した。抗体として、６ｘ－Ｈｉｓ Ｔａｇモノクローナル抗体（３Ｄ５）、ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）またはＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２－ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンンジュゲート（シグマアルドリッチ）を用い、ｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抗体反応を行った。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて目的タンパク質を検出した。
【0115】
（実施例６）バイオレイヤー干渉法による結合活性測定
バイオレイヤー干渉法（以下、「ＢＬＩ」と略すことがある）を用いて、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４、コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク質に対する結合活性測定を行った。ＢＬＩは、Ｏｃｔｅｔ ３８４（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨクローンをＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに固相化し、４９５ｎＭから２倍連続希釈で調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃリコンビナントタンパク（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と結合させ、解離速度を測定した。測定準備として、センサーチップを水和するため、センサーチップの先端を２００μＬのキネティックスバッファーに１０分間浸漬させた。その後、５０μＬの各測定液を３８４ウェルブラックプレート（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に添加し、以下に示す１）～６）のステップで測定を実行した。
バイオレイヤー干渉法（以下、「ＢＬＩ」と略すことがある）を用いて、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４、コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク質に対する結合活性測定を行った。ＢＬＩは、Ｏｃｔｅｔ ３８４（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨクローンをＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに固相化し、４９５ｎＭから２倍連続希釈で調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃリコンビナントタンパク（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と結合させ、解離速度を測定した。測定準備として、センサーチップを水和するため、センサーチップの先端を２００μＬのキネティックスバッファーに１０分間浸漬させた。その後、５０μＬの各測定液を３８４ウェルブラックプレート（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に添加し、以下に示す１）～６）のステップで測定を実行した。
【0116】
１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒），
２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（２４０秒），
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（３０秒），
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク溶液中と会合（１８０秒），
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（２４０秒），
６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）中で５秒間測定、キネティックスバッファー中で５秒間の測定を３回繰り返す。
２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（２４０秒），
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（３０秒），
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク溶液中と会合（１８０秒），
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（２４０秒），
６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）中で５秒間測定、キネティックスバッファー中で５秒間の測定を３回繰り返す。
【0117】
上記測定が終了後、実測値からＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（キネティックスバッファーのみ）を差し引き、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを用いて、１：１の結合モデルを用いてＧｌｏｂａｌ Ｆｉｔｔｉｎｇを行い，結合活性を算出した（図３）。各ＶＨＨクローンのＳｐｉｋｅ Ｓ１タンパクに対する平衡解離定数（ＫＤ）を表１３に示す。
【0118】
【表13】
【0119】
（実施例７）バイオレイヤー干渉法による競合阻害活性測定
Ｏｃｔｅｔ ３８４を用いて、各ＶＨＨクローン間でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパクに対する競合阻害を解析した。競合阻害活性は、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４、コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のいずれかを第１抗体として固相化したセンサーチップに対して、一定の濃度に調製したＳｐｉｋｅ Ｓ１タンパクと、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４、コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のいずれかである第２抗体との混合液に一定時間浸漬させて得られる結合シグナルとＳｐｉｋｅ Ｓ１タンパクのみで結合させた際の結合シグナルを比較することで算出した。
Ｏｃｔｅｔ ３８４を用いて、各ＶＨＨクローン間でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパクに対する競合阻害を解析した。競合阻害活性は、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４、コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のいずれかを第１抗体として固相化したセンサーチップに対して、一定の濃度に調製したＳｐｉｋｅ Ｓ１タンパクと、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４、コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のいずれかである第２抗体との混合液に一定時間浸漬させて得られる結合シグナルとＳｐｉｋｅ Ｓ１タンパクのみで結合させた際の結合シグナルを比較することで算出した。
【0120】
まず、キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）で１００μｇ／ｍＬに調製した第一の競合ＶＨＨ抗体をＨＩＳ１Ｋセンサーチップに固相化した。次に、１００μｇ／ｍＬの第二の競合ＶＨＨクローンと２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５及び０μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃ リコンビナントタンパク（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をそれぞれ混合し、５分間反応させて結合溶液を調製した。ラン毎の測定順は以下の通りとした。
【0121】
１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒），
２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（６０秒），
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（３０秒），
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク溶液と競合ＶＨＨ抗体混合溶液中での会合（１２０秒），
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（３０秒），
６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）中で５秒間測定、キネティックスバッファー中で５秒間の測定を３回繰り返す。
２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（６０秒），
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（３０秒），
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｓｐｉｋｅ Ｓ１タンパク溶液と競合ＶＨＨ抗体混合溶液中での会合（１２０秒），
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（３０秒），
６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）中で５秒間測定、キネティックスバッファー中で５秒間の測定を３回繰り返す。
【0122】
競合阻害率は、第１抗体とＳｐｉｋｅ Ｓ１タンパクで得られる結合シグナルを１００％として、第２抗体存在下でのシグナル強度が最大結合能の２５％未満に減少させる場合には競合し、結合が７５％を超える場合には非競合と定義した。２５％～７５％のレベルは、中間競合とした。各クローンの結合競合シグナルの結果から、結合活性の高いＶＨＨクローンが得られ、今回活性が認められたＶＨＨクローンについては、少なくとも５つの競合グループに分割できるものと考えられた（下記表１４参照）。
【0123】
【表14】
【0124】
（実施例８）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性の測定
枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を測定した。抗体は２％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）と混合することで、１５μｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。さらに、１００μＬのＶＨＨクローン混合液と１００μＬの２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを混合することで３倍希釈液を調製し、抗体の３倍希釈系列溶液を調製した。
枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を測定した。抗体は２％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）と混合することで、１５μｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。さらに、１００μＬのＶＨＨクローン混合液と１００μＬの２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを混合することで３倍希釈液を調製し、抗体の３倍希釈系列溶液を調製した。
【0125】
９６ウェルプレートにＶＨＨクローンの３倍希釈系列溶液を１００μＬ添加し、さらに２．５×１０６ＲＮＡコピー／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２溶液（国立感染症研究所から入手）をそれぞれ１００μＬずつ添加した。その後、３７℃で２時間インキュベートした後、４℃で一晩インキュベートし、抗体とウイルスを接触させた。Ｖｅｒｏ－Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を播種したウェルに、抗体とウイルスを接触させた溶液２００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養した。培養開始３日後に培養上清を回収し、定量ＰＣＲにより、上清中のウイルスゲノムのコピー数を定量した。
【0126】
定量ＰＣＲ法により得られた結果をもとに、ＶＨＨクローンの各濃度におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染阻害率を算出した（図５）。その結果、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して、中和活性を示したため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の粒子に対しても結合可能であることがわかった。また、感染阻害率から求められたＩＣ５０は０．０５μｇ／ｍＬであり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して、高い中和活性を有していることがわかった。
【0127】
（実施例９）プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
Ｈｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９をプロテアーゼ欠損組換え枯草菌にて生産した。具体的には、Ｎ末端にＡｌａ残基、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ５（配列番号９９）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８（配列番号１００）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号１０１）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９」と表記）の人工合成遺伝子を合成した。配列番号９９～１０１をコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与し、さらにGCAGCTCTTGCAGCA（配列番号７５）が５’末端に、TCTATTAAACTAGTT（配列番号７６）が３’末端に付加された配列番号８７（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５発現用コンストラクト）、配列番号８８（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８発現用コンストラクト）、配列番号８９（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９発現用コンストラクト）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。以降のプロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産の操作は実施例５に従い行った。
Ｈｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９をプロテアーゼ欠損組換え枯草菌にて生産した。具体的には、Ｎ末端にＡｌａ残基、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ５（配列番号９９）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８（配列番号１００）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号１０１）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９」と表記）の人工合成遺伝子を合成した。配列番号９９～１０１をコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与し、さらにGCAGCTCTTGCAGCA（配列番号７５）が５’末端に、TCTATTAAACTAGTT（配列番号７６）が３’末端に付加された配列番号８７（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５発現用コンストラクト）、配列番号８８（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８発現用コンストラクト）、配列番号８９（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９発現用コンストラクト）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。以降のプロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産の操作は実施例５に従い行った。
【0128】
（実施例１０）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性の測定
上述した実施例８に記載の方法に従い、使用するＶＨＨクローンをＶＨＨ－ＣＯＶＥ２からそれぞれ枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９に変更し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を評価した。その結果、感染阻害率から求められたＩＣ５０は３．０４８μｇ／ｍＬ（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５）、１．７３３μｇ／ｍＬ未満（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８）、０．５８μｇ／ｍＬ未満（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９）となった。
上述した実施例８に記載の方法に従い、使用するＶＨＨクローンをＶＨＨ－ＣＯＶＥ２からそれぞれ枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９に変更し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を評価した。その結果、感染阻害率から求められたＩＣ５０は３．０４８μｇ／ｍＬ（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５）、１．７３３μｇ／ｍＬ未満（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８）、０．５８μｇ／ｍＬ未満（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９）となった。
【0129】
（実施例１１）プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
Ｈｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７をプロテアーゼ欠損組換え枯草菌にて生産した。具体的には、Ｎ末端にＡｌａ残基、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ６（配列番号１０２）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７（配列番号１０３）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７」と表記）の人工合成遺伝子を合成した。配列番号Ｑ、配列番号Ｒをコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与し、さらにGCAGCTCTTGCAGCA（配列番号７５）が５’末端に、TCTATTAAACTAGTT（配列番号７６）が３’末端に付加された配列番号１０４（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６発現用コンストラクト）、配列番号１０５（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７発現用コンストラクト）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。以降のプロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産の操作は実施例５に従い行った。
Ｈｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７をプロテアーゼ欠損組換え枯草菌にて生産した。具体的には、Ｎ末端にＡｌａ残基、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ６（配列番号１０２）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７（配列番号１０３）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７」と表記）の人工合成遺伝子を合成した。配列番号Ｑ、配列番号Ｒをコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与し、さらにGCAGCTCTTGCAGCA（配列番号７５）が５’末端に、TCTATTAAACTAGTT（配列番号７６）が３’末端に付加された配列番号１０４（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６発現用コンストラクト）、配列番号１０５（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７発現用コンストラクト）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。以降のプロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産の操作は実施例５に従い行った。
【0130】
（実施例１２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性の測定
枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の８種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお標的タンパク質として、Ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ａｎｔｉｇｅｎ， Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ（「武漢型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．１．７ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「イギリス型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．３５１ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「南アフリカ型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐ．１ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「ブラジル型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）をＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。イギリス型とは武漢型に対してＨ６９－Ｖ７０欠失，Ｙ１４４欠失，Ｎ５０１Ｙ，Ａ５７０Ｄ，Ｄ６１４Ｇ，Ｐ６８１Ｈ，Ｔ７１６Ｉ，Ｓ９８２Ａ，Ｄ１１１８Ｈの変異が生じたものである。南アフリカ型とは武漢型に対してＹ１４４欠失，Ｋ４１７Ｎ，Ｅ４８４Ｋ，Ｎ５０１Ｙ，Ａ５７０Ｄ，Ｄ６１４Ｇ，Ｐ６８１Ｈ，Ｔ７１６Ｉ，Ｓ９８２Ａ，Ｄ１１１８Ｈの変異が生じたものである。ブラジル型とは武漢型に対して、Ｌ１８Ｆ，Ｔ２０Ｎ，Ｐ２６Ｓ，Ｄ１３８Ｙ，Ｒ１９０Ｓ，Ｋ４１７Ｔ，Ｅ４８４Ｋ，Ｎ５０１Ｙ，Ｈ６５５Ｙ，Ｔ１０２７Ｉ，Ｖ１１７６Ｆの変異が生じたものである。
枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の８種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお標的タンパク質として、Ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ａｎｔｉｇｅｎ， Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ（「武漢型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．１．７ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「イギリス型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．３５１ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「南アフリカ型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐ．１ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「ブラジル型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）をＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。イギリス型とは武漢型に対してＨ６９－Ｖ７０欠失，Ｙ１４４欠失，Ｎ５０１Ｙ，Ａ５７０Ｄ，Ｄ６１４Ｇ，Ｐ６８１Ｈ，Ｔ７１６Ｉ，Ｓ９８２Ａ，Ｄ１１１８Ｈの変異が生じたものである。南アフリカ型とは武漢型に対してＹ１４４欠失，Ｋ４１７Ｎ，Ｅ４８４Ｋ，Ｎ５０１Ｙ，Ａ５７０Ｄ，Ｄ６１４Ｇ，Ｐ６８１Ｈ，Ｔ７１６Ｉ，Ｓ９８２Ａ，Ｄ１１１８Ｈの変異が生じたものである。ブラジル型とは武漢型に対して、Ｌ１８Ｆ，Ｔ２０Ｎ，Ｐ２６Ｓ，Ｄ１３８Ｙ，Ｒ１９０Ｓ，Ｋ４１７Ｔ，Ｅ４８４Ｋ，Ｎ５０１Ｙ，Ｈ６５５Ｙ，Ｔ１０２７Ｉ，Ｖ１１７６Ｆの変異が生じたものである。
【0131】
ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｎｉｃｋｌｅ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ、Ｃｌｅａｒ、９６－ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに、２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨ抗体を１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートし固相化を行った。その後、ピペットを用いて丁寧にＶＨＨ抗体を除去したのち、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットで丁寧に除去する操作（「洗浄」と表記）を３回繰り返した。次に、各ウェルに２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートしブロッキングを行った。その後、ピペットを用いて丁寧にスキムミルク／ＰＢＳＴを除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。続いて、各ウェルに適切な濃度に調製した１００μＬの標的タンパク質を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ピペットを用いて丁寧に標的タンパク質溶液を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。
一次抗体として、Ｍｓ ｍＡｂ ｔｏ Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ［１Ｄ４］（Ａｂｃａｍ）をＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に一次抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。二次抗体としてＧｏａｔ ｐＡｂ ｔｏ Ｍｓ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ）をＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。室温かつ遮光条件で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に二次抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。発光基質として、ＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。その後、室温かつ遮光条件で２０分間インキュベートし、吸光度（４５０ｎｍ）をＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。
一次抗体として、Ｍｓ ｍＡｂ ｔｏ Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ［１Ｄ４］（Ａｂｃａｍ）をＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に一次抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。二次抗体としてＧｏａｔ ｐＡｂ ｔｏ Ｍｓ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ）をＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。室温かつ遮光条件で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に二次抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。発光基質として、ＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。その後、室温かつ遮光条件で２０分間インキュベートし、吸光度（４５０ｎｍ）をＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。
【0132】
ＥＬＩＳＡ試験の結果を図６に示す。試験に供した全てのＶＨＨ抗体に関して、４種のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性が確認された。なおＥ１とＥ４以外のＶＨＨ抗体に関しては、いずれのＳｐｉｋｅタンパク質に対しても特に良好な結合活性（吸光度が０．９７以上）が確認された。
【0133】
（実施例１３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性の測定
上述した実施例１１の方法に倣い、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。実施例１１と同様に、標的タンパク質としてＴｒｉｍｅｒｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ａｎｔｉｇｅｎ， Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ（「武漢型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．１．７ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「イギリス型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．３５１ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「南アフリカ型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐ．１ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「ブラジル型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）のいずれかをＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。なお、各変異株における変異箇所は実施例１２において記載したものと同じである。図７にＥＬＩＳＡ試験の結果を示すが、いずれの変異株のｓｐｉｋｅタンパク質に対しても、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６の明瞭な結合活性が確認された。
上述した実施例１１の方法に倣い、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。実施例１１と同様に、標的タンパク質としてＴｒｉｍｅｒｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ａｎｔｉｇｅｎ， Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ（「武漢型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．１．７ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「イギリス型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．３５１ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「南アフリカ型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐ．１ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「ブラジル型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）のいずれかをＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。なお、各変異株における変異箇所は実施例１２において記載したものと同じである。図７にＥＬＩＳＡ試験の結果を示すが、いずれの変異株のｓｐｉｋｅタンパク質に対しても、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６の明瞭な結合活性が確認された。
【0134】
（実施例１４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性の測定
上述した実施例１１の方法に倣い、枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の９種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２イギリス／ナイジェリア変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお標的タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．５２５ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（以降「イギリス／ナイジェリア型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）をＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。イギリス／ナイジェリア変異株とは武漢型に対して、Ｈ６９－Ｖ７０欠失，Ｙ１４４欠失，Ｑ５２Ｒ，Ｅ４８４Ｋ，Ｑ６６７Ｈ，Ｆ８８８Ｌの変異が生じたものである。
上述した実施例１１の方法に倣い、枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の９種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２イギリス／ナイジェリア変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお標的タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．５２５ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（以降「イギリス／ナイジェリア型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）をＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。イギリス／ナイジェリア変異株とは武漢型に対して、Ｈ６９－Ｖ７０欠失，Ｙ１４４欠失，Ｑ５２Ｒ，Ｅ４８４Ｋ，Ｑ６６７Ｈ，Ｆ８８８Ｌの変異が生じたものである。
【0135】
ＥＬＩＳＡ試験の結果を図８に示す。試験に供した全てのＶＨＨ抗体に関して、イギリス／ナイジェリア型のｓｐｉｋｅタンパク質への結合活性が確認された。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９に関しては、非常に良好な結合活性（吸光度が１以上）が確認された。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７に関しても、良好な結合活性（吸光度が０．５以上）が確認された。
【0136】
（実施例１５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性の測定
上述した実施例１１の方法に倣い、枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の９種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カリフォルニア変異株およびインド変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお標的タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．４２９ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（以降「カリフォルニア型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．６１７ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（以降「インド型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）のそれぞれを、ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。カリフォルニア変異株とは武漢型に対してＳ１３ｌ，Ｗ１５２Ｃ，Ｌ４５２Ｒ，Ｄ１１８３Ｙの変異が生じたものである。インド変異株とは武漢型に対してＧ１４２Ｄ，Ｅ１５４Ｋ，Ｌ４５２Ｒ，Ｅ４８４Ｑ，Ｄ６１４Ｇ，Ｐ６８１Ｒ，Ｑ１０７１Ｈの変異が生じたものである。
上述した実施例１１の方法に倣い、枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の９種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カリフォルニア変異株およびインド変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお標的タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．４２９ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（以降「カリフォルニア型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ．１．６１７ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（以降「インド型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）のそれぞれを、ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。カリフォルニア変異株とは武漢型に対してＳ１３ｌ，Ｗ１５２Ｃ，Ｌ４５２Ｒ，Ｄ１１８３Ｙの変異が生じたものである。インド変異株とは武漢型に対してＧ１４２Ｄ，Ｅ１５４Ｋ，Ｌ４５２Ｒ，Ｅ４８４Ｑ，Ｄ６１４Ｇ，Ｐ６８１Ｒ，Ｑ１０７１Ｈの変異が生じたものである。
【0137】
ＥＬＩＳＡ試験の結果を図９に示す。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を除く全てのＶＨＨ抗体に関して、カリフォルニア型およびインド型のｓｐｉｋｅタンパク質への結合活性がいずれも確認されなかった。一方ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関しては、カリフォルニア型およびインド型のｓｐｉｋｅタンパク質に対する高い結合活性が確認された。実施例１１、実施例１３も踏まえると、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がＳｐｉｋｅタンパク質の変異による影響を受けにくいようなエピトープを認識しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株に対して幅広く結合活性を示すことが明らかになった。
【0138】
（実施例１６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤに対する結合活性測定
枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の９種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク質への結合活性を実施例７と同様の方法にて測定した。キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨクローンをＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに固相化し、１９９．２ ｎＭから２倍連続希釈で調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（４０５９２－ＶＮＡＨ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、武漢型）と結合させ、解離速度を測定した。測定準備として、センサーチップを水和するため、センサーチップの先端を２００μＬのキネティックスバッファーに１０分間浸漬させた。その後、５０μＬの各測定液を３８４ウェルブラックプレート（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に添加し、以下に示す１）～６）のステップで測定を実行した。
枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の９種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク質への結合活性を実施例７と同様の方法にて測定した。キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨクローンをＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに固相化し、１９９．２ ｎＭから２倍連続希釈で調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（４０５９２－ＶＮＡＨ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、武漢型）と結合させ、解離速度を測定した。測定準備として、センサーチップを水和するため、センサーチップの先端を２００μＬのキネティックスバッファーに１０分間浸漬させた。その後、５０μＬの各測定液を３８４ウェルブラックプレート（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に添加し、以下に示す１）～６）のステップで測定を実行した。
【0139】
１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（３０秒）
２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（１２０秒）
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒）
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＲＢＤタンパク溶液中と会合（１８０秒）
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（２４０秒）
６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ ２．２）中で５秒間測定、キネティックスバッファー中で５秒間の測定を３回繰り返す。
２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（１２０秒）
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒）
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＲＢＤタンパク溶液中と会合（１８０秒）
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（２４０秒）
６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ ２．２）中で５秒間測定、キネティックスバッファー中で５秒間の測定を３回繰り返す。
【0140】
上記測定が終了後、実測値からＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（キネティックスバッファーのみ）を差し引き、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを用いて、１：１の結合モデルを用いてＧｌｏｂａｌ Ｆｉｔｔｉｎｇを行い，結合活性を算出した。各ＶＨＨ抗体のＲＢＤタンパクに対する平衡解離定数（ＫＤ）を表１５に示す。
【0141】
【表15】
【0142】
ＲＢＤに対する平衡解離定数（ＫＤ）より、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１とＶＨＨ－ＣＯＶＥ４を除くその他のＶＨＨ抗体はＳ１タンパクと同様に強力な結合活性を示した。一方、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１とＶＨＨ－ＣＯＶＥ４については、明確な結合を示さなかった。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１とＶＨＨ－ＣＯＶＥ４は、Ｓ１タンパクに結合し、ＲＢＤに結合するＶＨＨ－ＣＯＶＥ２等と競合することが確認されていることから、ＲＢＤの近傍部位（ＮＴＤ）をエピトープとして認識しているものと推察された。
【0143】
（実施例１７）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤとＡＣＥ２の結合に対する競合阻害活性測定
実施例７と同様の方法にて、実施例１５にてＲＢＤへの結合が確認された枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の７種のＶＨＨ抗体に関して、Ｏｃｔｅｔ ３８４を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤとヒトＡＣＥ２の結合に対する競合阻害評価を実施した。キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨクローンをＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに１２０秒間インキュベートすることで固相化し、１ｓｔアナライトとして１９９．２ｎＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（２０μｇ／ｍＬ，４０５９２－ＶＮＡＨ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、武漢型）溶液に浸し、１８０秒間後の結合を確認した後、緩衝溶液に２４０秒間浸した。３０秒間のベースラインステップを挟んで、センサーチップを２０ｎｇ／ｍＬに調整したＡＣＥ２－Ｆｃのウェルに浸し、１８０秒間後の結合の有無を確認した。
実施例７と同様の方法にて、実施例１５にてＲＢＤへの結合が確認された枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の７種のＶＨＨ抗体に関して、Ｏｃｔｅｔ ３８４を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤとヒトＡＣＥ２の結合に対する競合阻害評価を実施した。キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨクローンをＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに１２０秒間インキュベートすることで固相化し、１ｓｔアナライトとして１９９．２ｎＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（２０μｇ／ｍＬ，４０５９２－ＶＮＡＨ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、武漢型）溶液に浸し、１８０秒間後の結合を確認した後、緩衝溶液に２４０秒間浸した。３０秒間のベースラインステップを挟んで、センサーチップを２０ｎｇ／ｍＬに調整したＡＣＥ２－Ｆｃのウェルに浸し、１８０秒間後の結合の有無を確認した。
【0144】
センサーチップに固定した各ＶＨＨ抗体と１ｓｔアナライトであるＲＢＤ間の結合レスポンスを確認した後、２ｎｄアナライトであるＡＣＥ２－Ｆｃを結合させたところ、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８は、ＡＣＥ２との結合を明確に阻害し、競合性を示した。この結果は、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への中和活性を示すことを示唆する。
一方、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、ＡＣＥ２と競合性を示さず、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２は、ＡＣＥ２と部分的に競合性を示した。ＡＣＥ２に対する各センサーグラムの変化を図１０に示す。本結果から、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、ＲＢＤ上におけるＡＣＥ２結合サイト以外をエピトープとしていることが示され、その中和活性はＡＣＥ２と直接競合して中和活性を示す一般的な抗体とは異なる作用であると考えられた。
一方、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、ＡＣＥ２と競合性を示さず、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２は、ＡＣＥ２と部分的に競合性を示した。ＡＣＥ２に対する各センサーグラムの変化を図１０に示す。本結果から、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、ＲＢＤ上におけるＡＣＥ２結合サイト以外をエピトープとしていることが示され、その中和活性はＡＣＥ２と直接競合して中和活性を示す一般的な抗体とは異なる作用であると考えられた。
【0145】
（実施例１８）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株に対する結合活性測定
実施例７と同様の方法にて、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の６種のＶＨＨ抗体の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株への結合活性を測定した。予め、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株（ＳＰＤ－Ｃ５２Ｈｎ，Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｎ５０１Ｙ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株（ＳＲＤ－Ｃ５２Ｈ３，Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｅ４８４Ｋ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株（ＳＲＤ－Ｃ５２Ｈ２，Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｎ４４０Ｋ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株（ＳＰＤ－Ｃ５２Ｈｐ，Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｋ４１７Ｎ， Ｅ４８４Ｋ， Ｎ５０１Ｙ）をＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ１２－ｂｉｏｔｉｎ化試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化し、キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した。ＲＢＤ変異株をＳＡセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に固相化し、６６６．７ｎＭから２倍連続希釈で調整した各ＶＨＨと結合させ、解離速度を測定した。測定準備として、センサーチップを水和するため、センサーチップの先端を２００μＬのキネティックスバッファーに１０分間浸漬させた。その後、５０μＬの各測定液を３８４ウェルブラックプレート（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に添加し、以下に示す１）～５）のステップで測定を実行した。
実施例７と同様の方法にて、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の６種のＶＨＨ抗体の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株への結合活性を測定した。予め、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株（ＳＰＤ－Ｃ５２Ｈｎ，Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｎ５０１Ｙ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株（ＳＲＤ－Ｃ５２Ｈ３，Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｅ４８４Ｋ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株（ＳＲＤ－Ｃ５２Ｈ２，Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｎ４４０Ｋ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株（ＳＰＤ－Ｃ５２Ｈｐ，Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｋ４１７Ｎ， Ｅ４８４Ｋ， Ｎ５０１Ｙ）をＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ１２－ｂｉｏｔｉｎ化試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化し、キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した。ＲＢＤ変異株をＳＡセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に固相化し、６６６．７ｎＭから２倍連続希釈で調整した各ＶＨＨと結合させ、解離速度を測定した。測定準備として、センサーチップを水和するため、センサーチップの先端を２００μＬのキネティックスバッファーに１０分間浸漬させた。その後、５０μＬの各測定液を３８４ウェルブラックプレート（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に添加し、以下に示す１）～５）のステップで測定を実行した。
【0146】
１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒）
２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（３００秒）
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒）
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤタンパク溶液中と会合（１２０秒）
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（２４０秒）
２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（３００秒）
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒）
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤタンパク溶液中と会合（１２０秒）
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（２４０秒）
【0147】
上記測定が終了後、実測値からＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（キネティックスバッファーのみ）を差し引き、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを用いて、１：１の結合モデルを用いてＧｌｏｂａｌ Ｆｉｔｔｉｎｇを行い，結合活性を算出した。各ＶＨＨクローンのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ変異株に対する平衡解離定数（ＫＤ）を表１６、表１７、表１８、及び表１９に示す。
【0148】
【表16】
【0149】
【表17】
【0150】
【表18】
【0151】
【表19】
【0152】
結合解析の結果、本試験に供した全てのＶＨＨ抗体が各ＲＢＤ変異株に対して結合した。しかし、ＡＣＥ２とエピトープの競合性が認められているＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８については、変異の位置によっては結合活性への影響が生じることが確認された。一方、ＡＣＥ２と異なるエピトープに結合するＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、これら変異に伴う結合活性の低下は認められなかった。このことから、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は上記変異株に対しても、中和活性を発揮する可能性が示唆された。
【0153】
（実施例１９）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ―２インド型変異株のＲＢＤに対する結合活性測定
実施例１５においてインド型変異株由来のｓｐｉｋｅタンパク質への結合活性が確認されたＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、インド型変異株由来のＲＢＤへの結合活性を評価した。まず、３０分以上常温に戻したＤｙｎａｂｅａｄｓTM ＭｙＯｎｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をよく撹拌し、２５０μＬを１．５ｍＬチューブに分取した。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。２５０μＬの１５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を加えたのち、１０秒間ボルテックスした。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。５０μＬの１５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）でビーズを懸濁し、１０ｍｇ／ｍＬに調製した１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を５０μＬ加えて混合したのち、常温で３０分撹拌した。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。次に、５０ｎｇのＶＨＨ―ＣＯＶＥ３を含む１５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を１２０μＬ調製し、その溶液でビーズを懸濁した。常温下で一晩の間撹拌した後、磁石ラックを用いて上清を除去した。５００μＬのＰＢＳＴでビーズを懸濁し、１０分間攪拌した。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。なお、この操作は２回繰り返した。３％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴ５００μＬで懸濁したのち、３０分撹拌した。その後ＰＢＳＴによる洗浄を３回行った。以上の操作により、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズを調製した。またコントロールとして、ＶＨＨ非固定化ビーズの調製も併せて行った。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ，Ｅ４８４Ｑ）Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（以降、「インド型ＲＢＤ」と表現）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を、ＰＢＳＴを用いて１２．５μｇ／ｍＬに調製した。１．５ｍＬチューブ内で、２００μＬのインド型ＲＢＤでＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズを懸濁したのち、ゆっくり撹拌させた。撹拌開始１０分後に３０μＬの反応液を分取して、溶液が透明になるまで磁石ラック上に静置したのち、その上清を分取してＳＤＳ―ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｂｏｌｔ（登録商標） Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェルに２０μＬの上清を含むサンプルをアプライし、その後２００Ｖで３５分間泳動した。分子量マーカーには。ＮｏｖｅｘTM Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。染色には、ＧｅｌＣｏｄｅTM Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。
実施例１５においてインド型変異株由来のｓｐｉｋｅタンパク質への結合活性が確認されたＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、インド型変異株由来のＲＢＤへの結合活性を評価した。まず、３０分以上常温に戻したＤｙｎａｂｅａｄｓTM ＭｙＯｎｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をよく撹拌し、２５０μＬを１．５ｍＬチューブに分取した。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。２５０μＬの１５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を加えたのち、１０秒間ボルテックスした。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。５０μＬの１５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）でビーズを懸濁し、１０ｍｇ／ｍＬに調製した１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を５０μＬ加えて混合したのち、常温で３０分撹拌した。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。次に、５０ｎｇのＶＨＨ―ＣＯＶＥ３を含む１５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を１２０μＬ調製し、その溶液でビーズを懸濁した。常温下で一晩の間撹拌した後、磁石ラックを用いて上清を除去した。５００μＬのＰＢＳＴでビーズを懸濁し、１０分間攪拌した。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。なお、この操作は２回繰り返した。３％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴ５００μＬで懸濁したのち、３０分撹拌した。その後ＰＢＳＴによる洗浄を３回行った。以上の操作により、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズを調製した。またコントロールとして、ＶＨＨ非固定化ビーズの調製も併せて行った。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ，Ｅ４８４Ｑ）Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（以降、「インド型ＲＢＤ」と表現）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を、ＰＢＳＴを用いて１２．５μｇ／ｍＬに調製した。１．５ｍＬチューブ内で、２００μＬのインド型ＲＢＤでＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズを懸濁したのち、ゆっくり撹拌させた。撹拌開始１０分後に３０μＬの反応液を分取して、溶液が透明になるまで磁石ラック上に静置したのち、その上清を分取してＳＤＳ―ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｂｏｌｔ（登録商標） Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェルに２０μＬの上清を含むサンプルをアプライし、その後２００Ｖで３５分間泳動した。分子量マーカーには。ＮｏｖｅｘTM Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。染色には、ＧｅｌＣｏｄｅTM Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。
【0154】
ＳＤＳ―ＰＡＧＥに供した結果を図１１に示す。初発のサンプルとして２５０ｎｇ相当のインド型ＲＢＤをＳＤＳ―ＰＡＧＥに供しており、このバンドとの比較により当該ＶＨＨの結合活性を評価した。コントロールとして、ＶＨＨ非固定化ビーズとインド型ＲＢＤを反応させた場合には、初発のサンプルと同様に位置にバンドが確認された（レーン１と２の比較）。つまり、ＶＨＨ非固定化ビーズとインド型ＲＢＤとの結合活性が無いことが確認された。一方、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズとインド型ＲＢＤを反応させると、インド型ＲＢＤ由来のバンドが消失した（レーン１と３の比較）。この結果は、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズがインド型ＲＢＤを吸着したことを意味する。以上を総合すると、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がインド型ＲＢＤとの明瞭な結合活性を有することが明らかになった。
【0155】
（実施例２０）組換えコリネ菌によるＶＨＨ－ＣＯＶＥ９変異体の生産
（１）ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９変異体発現用プラスミドの構築
試験管内淘汰セレクションのＲ５のＤＮＡライブラリー内の配列を考慮して、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号７３）のＣＤＲ３領域内にＲ１０８Ｋの変異が生じたＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｒ１０８Ｋ（配列番号１０６）、同じくＣＤＲ３領域内にＮ１０９Ｄの変異が生じたＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｎ１０９Ｄ（配列番号１０７）とＹ１１０Ｓの変異が生じたＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｙ１１０Ｓ（配列番号１０８）を選抜した。これらＶＨＨを組換えコリネ菌で作製するにあたって、Ｎ末端にＡｌａ残基を、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与した形でＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｒ１０８Ｋ（配列番号１０９）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｎ１０９Ｄ（配列番号１１０）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｙ１１０Ｓ（配列番号１１１）を発現させた。各ＶＨＨの遺伝子をユーロフィン社で合成し、発現用プラスミドに導入した。合成したＶＨＨクローンの遺伝子と空の発現用プラスミドを、２種類の制限酵素ＳｆｉＩ及びＡｐａＩ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理し、アガロースゲル電気泳動により目的断片のＤＮＡをそれぞれ単離精製した。その後、制限酵素処理したＶＨＨクローン遺伝子と発現用プラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてライゲーションし、そのライゲーション産物を用いてクローニング用コンピテントセルＪＭ１０９株に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミド抽出を行い、ＶＨＨクローンの発現用プラスミドを取得した。
（１）ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９変異体発現用プラスミドの構築
試験管内淘汰セレクションのＲ５のＤＮＡライブラリー内の配列を考慮して、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号７３）のＣＤＲ３領域内にＲ１０８Ｋの変異が生じたＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｒ１０８Ｋ（配列番号１０６）、同じくＣＤＲ３領域内にＮ１０９Ｄの変異が生じたＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｎ１０９Ｄ（配列番号１０７）とＹ１１０Ｓの変異が生じたＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｙ１１０Ｓ（配列番号１０８）を選抜した。これらＶＨＨを組換えコリネ菌で作製するにあたって、Ｎ末端にＡｌａ残基を、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与した形でＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｒ１０８Ｋ（配列番号１０９）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｎ１０９Ｄ（配列番号１１０）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｙ１１０Ｓ（配列番号１１１）を発現させた。各ＶＨＨの遺伝子をユーロフィン社で合成し、発現用プラスミドに導入した。合成したＶＨＨクローンの遺伝子と空の発現用プラスミドを、２種類の制限酵素ＳｆｉＩ及びＡｐａＩ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理し、アガロースゲル電気泳動により目的断片のＤＮＡをそれぞれ単離精製した。その後、制限酵素処理したＶＨＨクローン遺伝子と発現用プラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてライゲーションし、そのライゲーション産物を用いてクローニング用コンピテントセルＪＭ１０９株に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミド抽出を行い、ＶＨＨクローンの発現用プラスミドを取得した。
【0156】
（２）組換えコリネバクテリウム グルタミカム株の作製
コリネバクテリウム グルタミカム株へのプラスミド導入は、実施例４の条件と同様に実施した。
コリネバクテリウム グルタミカム株へのプラスミド導入は、実施例４の条件と同様に実施した。
【0157】
（３）ＶＨＨ産生
上記（２）で作製した組換えコリネバクテリウム グルタミカム株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地に植菌し、３０℃で一晩振とうし、前培養液とした。前培養液を９６ディープウェルプレートに入れた７００μＬのＰＭ１Ｓ培地に５％接種し、２５℃で７２時間振とう培養した。培養終了後に、遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４，０００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心し、培養上清をチューブに回収した。
上記（２）で作製した組換えコリネバクテリウム グルタミカム株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地に植菌し、３０℃で一晩振とうし、前培養液とした。前培養液を９６ディープウェルプレートに入れた７００μＬのＰＭ１Ｓ培地に５％接種し、２５℃で７２時間振とう培養した。培養終了後に、遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４，０００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心し、培養上清をチューブに回収した。
【0158】
回収した培養上清に対してＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてろ過した後、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。ＶＨＨの溶出には、７００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．５）を添加し、遠心機（ＴＯＭＹ）で５００×ｇ、３０秒間遠心した。溶出液を回収し、ＶＨＨ抗体サンプルとした。
【0159】
精製したＶＨＨの純度を確認するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。各ウェルに４μＬ分のサンプルをアプライした後、１５０Ｖで１時間の条件で電気泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。電気泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色し、培養上清中にＶＨＨが合成されていることを確認した。
【0160】
（実施例２１）バイオレイヤー干渉法による結合活性測定
実施例６と同様の方法にて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃリコンビナントタンパク（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対するＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｒ１０８Ｋ（配列番号１０６）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｎ１０９Ｄ（配列番号１０７）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｙ１１０Ｓ（配列番号１０８）の結合活性を測定した。各ＶＨＨクローンのＳｐｉｋｅ Ｓ１タンパクに対する平衡解離定数（ＫＤ）を表２０に示す。
実施例６と同様の方法にて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃリコンビナントタンパク（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対するＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｒ１０８Ｋ（配列番号１０６）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｎ１０９Ｄ（配列番号１０７）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｙ１１０Ｓ（配列番号１０８）の結合活性を測定した。各ＶＨＨクローンのＳｐｉｋｅ Ｓ１タンパクに対する平衡解離定数（ＫＤ）を表２０に示す。
【0161】
【表20】
【0162】
（実施例２２）ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性の測定
枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型およびデルタ型変異株に対する中和活性を測定した。抗体は２％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）と混合することで、１５０μｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。さらに、１００μＬのＶＨＨクローン混合液と１００μＬの２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを混合することで３倍希釈液を調製し、抗体の３倍希釈系列溶液を調製した。
枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型およびデルタ型変異株に対する中和活性を測定した。抗体は２％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）と混合することで、１５０μｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。さらに、１００μＬのＶＨＨクローン混合液と１００μＬの２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを混合することで３倍希釈液を調製し、抗体の３倍希釈系列溶液を調製した。
【0163】
９６ウェルプレートにＶＨＨクローンの３倍希釈系列溶液を１００μＬ添加し、さらに２．５×１０６ＲＮＡコピー／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型・デルタ型変異株の溶液（国立感染症研究所から入手）をそれぞれ１００μＬずつ添加した。その後、３７℃で２時間インキュベートした後、４℃で一晩インキュベートし、抗体とウイルスを接触させた。Ｖｅｒｏ－Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を播種したウェルに、抗体とウイルスを接触させた溶液１００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養した。培養開始１日後に培養上清を回収し、定量ＰＣＲにより、上清中のウイルスゲノムのコピー数を定量した。定量ＰＣＲにはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いた。培養上清３μＬを前処理液３μＬと混合し、そのうちの３μＬをＲＴ―ＰＣＲ反応液（反応液１５μＬ、酵素液２．５μＬ、プライマー・プローブ液２．５μＬ）に加えて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６にて定量ＰＣＲを行った。反応条件は、逆転写反応４２℃・５分、プレ変性９５℃・１０秒、サイクル反応［変性９５℃・１秒、会合５０℃・３秒、伸長５５℃・１０秒］４５サイクルで検出を行った。
【0164】
定量ＰＣＲ法により得られた細胞中のウイルス数の結果を図１２に示す。その結果、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型、デルタ型のいずれに対しても中和活性を示すこと、またそれらウイルスへの結合活性を示すことが明らかになった。
【0165】
（実施例２３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カッパ型変異株由来の（Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｂ．１．６１７．１株）とＡＣＥ２の結合に対する競合阻害活性測定
枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、Ｏｃｔｅｔ ３８４を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カッパ型変異株由来のＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ）とヒトＡＣＥ２の結合に対する競合阻害評価を実施した。キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）で２０μｇ／ｍＬに調製したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３をＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに１２０秒間インキュベートすることで固相化し、アナライトとして１０μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（５０μＬ）、２０μｇ／ｍＬＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（２５μＬ）と４０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（２５μＬ）の混合溶液、２０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（５０μＬ、リファレンスウェル）にそれぞれ浸し、１２０秒間後の結合を確認した後、緩衝溶液に１２０秒間浸した。
枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、Ｏｃｔｅｔ ３８４を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カッパ型変異株由来のＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ）とヒトＡＣＥ２の結合に対する競合阻害評価を実施した。キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）で２０μｇ／ｍＬに調製したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３をＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに１２０秒間インキュベートすることで固相化し、アナライトとして１０μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（５０μＬ）、２０μｇ／ｍＬＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（２５μＬ）と４０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（２５μＬ）の混合溶液、２０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（５０μＬ、リファレンスウェル）にそれぞれ浸し、１２０秒間後の結合を確認した後、緩衝溶液に１２０秒間浸した。
【0166】
ＡＣＥ２を固定したセンサーチップをリファレンスとしてデータ処理した結果を図１３に示す。結果、センサーチップに固定したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３とＲＢＤ間の結合レスポンスに対して、ＲＢＤとＡＣＥ２の混合液ではレスポンスが明確に消失した。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３は、ＡＣＥ２とカッパ型変異株由来のＲＢＤとの結合を明確に阻害したため、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３はカッパ型変異株に対しても中和活性を有することがわかった。
【0167】
（実施例２４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株由来のＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｂ．１．６１７．２株）とＡＣＥ２の結合に対する競合阻害活性測定
枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、Ｏｃｔｅｔ ３８４を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株由来のＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ変異株）とヒトＡＣＥ２の結合に対する競合阻害評価を実施した。キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）で２０μｇ／ｍＬに調製したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３をＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに１２０秒間インキュベートすることで固相化し、アナライトとして１０μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（５０μＬ）、２０μｇ／ｍＬＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（２５μＬ）と４０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（２５μＬ）の混合溶液、２０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（５０μＬ）にそれぞれ浸し、１２０秒間後の結合を確認した後、緩衝溶液に１２０秒間浸した。
枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、Ｏｃｔｅｔ ３８４を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株由来のＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ変異株）とヒトＡＣＥ２の結合に対する競合阻害評価を実施した。キネティックスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）で２０μｇ／ｍＬに調製したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３をＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに１２０秒間インキュベートすることで固相化し、アナライトとして１０μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（５０μＬ）、２０μｇ／ｍＬＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤリコンビナントタンパク（２５μＬ）と４０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（２５μＬ）の混合溶液、２０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（５０μＬ）にそれぞれ浸し、１２０秒間後の結合を確認した後、緩衝溶液に１２０秒間浸した。
【0168】
ＡＣＥ２を固定したセンサーチップをリファレンスとしてデータ処理した結果を図１４に示す。結果、センサーチップに固定したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３とＲＢＤ間の結合レスポンスに対して、ＲＢＤとＡＣＥ２の混合液ではレスポンスが明確に消失した。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３は、ＡＣＥ２とデルタ型変異株由来のＲＢＤとの結合を明確に阻害したため、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３はデルタ型変異株に対しても中和活性を有することがわかった。
【0169】
（実施例２５）ハムスター体内におけるＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株に対する中和活性の測定
６週齢、オスのシリアンハムスター（以下、ハムスター）１２匹に３種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２．０ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇの混合剤）を腹腔内投与して鎮静後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ アルファ型変異株（１０３．５ＴＣＩＤ５０／ｈｅａｄ）を経鼻投与した。経鼻投与後、アチパメゾールをハムスターに腹腔内投与して鎮静状態から回復させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２投与の１日後、再び３種混合麻酔薬を全てのハムスターに腹腔内投与して鎮静後、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を濃度別（２０ｍｇ／ｋｇ，４ｍｇ／ｋｇ，０．８ｍｇ／ｋｇ）に３匹ずつ経鼻投与した。コントロールとして、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の希釈に使用したアルブミン加ＰＢＳのみを３匹のハムスターに経鼻投与した。ウイルス投与直後からその４日後まで毎日ハムスターの体重を測定した。
６週齢、オスのシリアンハムスター（以下、ハムスター）１２匹に３種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２．０ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇの混合剤）を腹腔内投与して鎮静後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ アルファ型変異株（１０３．５ＴＣＩＤ５０／ｈｅａｄ）を経鼻投与した。経鼻投与後、アチパメゾールをハムスターに腹腔内投与して鎮静状態から回復させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２投与の１日後、再び３種混合麻酔薬を全てのハムスターに腹腔内投与して鎮静後、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を濃度別（２０ｍｇ／ｋｇ，４ｍｇ／ｋｇ，０．８ｍｇ／ｋｇ）に３匹ずつ経鼻投与した。コントロールとして、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の希釈に使用したアルブミン加ＰＢＳのみを３匹のハムスターに経鼻投与した。ウイルス投与直後からその４日後まで毎日ハムスターの体重を測定した。
【0170】
ハムスター体内でのＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の中和活性評価の結果を図１５に示す。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９未投与のコントロールでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に伴う明瞭な体重減少が確認された。０．８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を投与すると、体重減少の緩和が確認された。また、４ｍｇ／ｋｇ，２０ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を投与した際には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に伴う体重減少が明瞭に抑制された。つまり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株への中和活性（治療効果）を有することが明らかになった。
【0171】
（実施例２６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ―２ラムダ型変異株のＲＢＤに対する結合活性測定
ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、ラムダ型変異株由来のＲＢＤへの結合活性を評価した。実施例１９に倣ってＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズを調製した。またコントロール用として、ＶＨＨ非固定ビーズおよびＶＨＨ－ＣＯＶＥ９固定化ビーズの調製も併せて行った。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｑ，Ｆ４９０Ｓ）Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（以降、「ラムダ型ＲＢＤ」と表現）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を、ＰＢＳＴを用いて１２．５μｇ／ｍＬに調製した。１．５ｍＬチューブ内において、２００μＬのラムダ型ＲＢＤでＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズ、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９固定化ビーズ、ＶＨＨ非固定ビーズをそれぞれ懸濁したのち、ゆっくり撹拌させた。撹拌開始１０分後に１００μＬの反応液を分取して、溶液が透明になるまで磁石ラック上に静置したのち、その上清を除去した。次に、回収したビーズを４０μＬの蒸留水で懸濁したのち、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプルバッファーと混合したものを１００℃で5分間静置し、ビーズに吸着したラムダ型ＲＢＤをサンプルバッファーに溶出することで、溶出画分として調製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｂｏｌｔ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェルに４０μＬの溶出画分を含むサンプルをアプライし、その後２００Ｖで３５分間泳動した。分子量マーカーには。ＮｏｖｅｘTM Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。染色には、ＧｅｌＣｏｄｅTM Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。
ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、ラムダ型変異株由来のＲＢＤへの結合活性を評価した。実施例１９に倣ってＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズを調製した。またコントロール用として、ＶＨＨ非固定ビーズおよびＶＨＨ－ＣＯＶＥ９固定化ビーズの調製も併せて行った。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｑ，Ｆ４９０Ｓ）Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（以降、「ラムダ型ＲＢＤ」と表現）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を、ＰＢＳＴを用いて１２．５μｇ／ｍＬに調製した。１．５ｍＬチューブ内において、２００μＬのラムダ型ＲＢＤでＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズ、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９固定化ビーズ、ＶＨＨ非固定ビーズをそれぞれ懸濁したのち、ゆっくり撹拌させた。撹拌開始１０分後に１００μＬの反応液を分取して、溶液が透明になるまで磁石ラック上に静置したのち、その上清を除去した。次に、回収したビーズを４０μＬの蒸留水で懸濁したのち、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプルバッファーと混合したものを１００℃で5分間静置し、ビーズに吸着したラムダ型ＲＢＤをサンプルバッファーに溶出することで、溶出画分として調製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｂｏｌｔ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェルに４０μＬの溶出画分を含むサンプルをアプライし、その後２００Ｖで３５分間泳動した。分子量マーカーには。ＮｏｖｅｘTM Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。染色には、ＧｅｌＣｏｄｅTM Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。
【0172】
ＳＤＳ―ＰＡＧＥに供した結果を図１６に示す。初発のサンプルとして２５０ｎｇ相当のラムダ型ＲＢＤをＳＤＳ―ＰＡＧＥに供した（レーン１）。コントロールであるＶＨＨ非固定ビーズ、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９固定化ビーズの溶出画分には、ラムダ型ＲＢＤ由来のバンドは確認されなかった（レーン２，４）。一方、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズの溶出画分にはラムダ型ＲＢＤ由来のバンドが確認された（レーン３）。以上の結果はＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズがラムダ型ＲＢＤを吸着したことを示す。つまり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がラムダ型ＲＢＤとの結合活性を有することが明らかになった。
【0173】
（実施例２７）ハムスター体内におけるＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株に対する中和活性の測定
６週齢、オスのシリアンハムスター（以下、ハムスター）６匹に３種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２．０ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇの混合剤）を腹腔内投与して鎮静後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ アルファ型変異株（１０３．５ＴＣＩＤ５０／ｈｅａｄ）を経鼻投与した。経鼻投与後、アチパメゾールをハムスターに腹腔内投与して鎮静状態から回復させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２投与の１日後、再び３種混合麻酔薬を全てのハムスターに腹腔内投与して鎮静後、８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を３匹に経鼻投与した。コントロールとして、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の希釈に使用したアルブミン加ＰＢＳのみを３匹のハムスターに経鼻投与した。ウイルス投与直後からその４日後まで毎日ハムスターの体重を測定した。
６週齢、オスのシリアンハムスター（以下、ハムスター）６匹に３種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２．０ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇの混合剤）を腹腔内投与して鎮静後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ アルファ型変異株（１０３．５ＴＣＩＤ５０／ｈｅａｄ）を経鼻投与した。経鼻投与後、アチパメゾールをハムスターに腹腔内投与して鎮静状態から回復させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２投与の１日後、再び３種混合麻酔薬を全てのハムスターに腹腔内投与して鎮静後、８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を３匹に経鼻投与した。コントロールとして、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の希釈に使用したアルブミン加ＰＢＳのみを３匹のハムスターに経鼻投与した。ウイルス投与直後からその４日後まで毎日ハムスターの体重を測定した。
【0174】
ハムスター体内でのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の中和活性評価の結果を図１７に示す。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３未投与のコントロールでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に伴う明瞭な体重減少が確認された。８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を投与すると、体重減少が抑制された。つまり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株への中和活性（治療効果）を有することが明らかになった。
【0175】
（実施例２８）ハムスター体内におけるＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株に対する中和活性の測定
６週齢、オスのシリアンハムスター（以下、ハムスター）６匹に３種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２．０ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇの混合剤）を腹腔内投与して鎮静後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ デルタ型変異株（１０３．５ＴＣＩＤ５０／ｈｅａｄ）を経鼻投与した。経鼻投与後、アチパメゾールをハムスターに腹腔内投与して鎮静状態から回復させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２投与の１日後、再び３種混合麻酔薬を全てのハムスターに腹腔内投与して鎮静後、８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を３匹に経鼻投与した。コントロールとして、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の希釈に使用したアルブミン加ＰＢＳのみを３匹のハムスターに経鼻投与した。ウイルス投与直後からその４日後まで毎日ハムスターの体重を測定した。
６週齢、オスのシリアンハムスター（以下、ハムスター）６匹に３種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２．０ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇの混合剤）を腹腔内投与して鎮静後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ デルタ型変異株（１０３．５ＴＣＩＤ５０／ｈｅａｄ）を経鼻投与した。経鼻投与後、アチパメゾールをハムスターに腹腔内投与して鎮静状態から回復させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２投与の１日後、再び３種混合麻酔薬を全てのハムスターに腹腔内投与して鎮静後、８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を３匹に経鼻投与した。コントロールとして、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の希釈に使用したアルブミン加ＰＢＳのみを３匹のハムスターに経鼻投与した。ウイルス投与直後からその４日後まで毎日ハムスターの体重を測定した。
【0176】
ハムスター体内でのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の中和活性評価の結果を図１８に示す。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３未投与のコントロールでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に伴う明瞭な体重減少が確認された。８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を投与すると、体重減少が抑制された。つまり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株への中和活性（治療効果）を有することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【0177】
本発明は、医薬及び診断薬の分野において有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】