特許 7415022 三連樹脂反応器ペプチド合成機

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-05

(45)【発行日】2024-01-16

(54)【発明の名称】三連樹脂反応器ペプチド合成機

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/04 20060101AFI20240109BHJP

   C07K 1/06 20060101ALI20240109BHJP

【ＦＩ】

C07K1/04

C07K1/06

【請求項の数】 39

(21)【出願番号】P 2022547725

(86)(22)【出願日】2021-01-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-29

(86)【国際出願番号】 US2021015856

(87)【国際公開番号】W WO2021158444

(87)【国際公開日】2021-08-12

【審査請求日】2022-09-22

(31)【優先権主張番号】62/970,247

(32)【優先日】2020-02-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100126778

【弁理士】

【氏名又は名称】品川 永敏

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】ジョンソン，マーティン ディ

(72)【発明者】

【氏名】コパック，マイケル イー

(72)【発明者】

【氏名】ウェブスター，ルーク ピー

(72)【発明者】

【氏名】ベルグルンド，マーク アール

(72)【発明者】

【氏名】グロスクロイツ，ステファン ロバート

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ジンヤオ

【審査官】馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】特表２００２－５０７５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０８－２３９３５０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／０４

Ｃ０７Ｋ １／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチド合成樹脂に結合した保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｘ」をカップリングするための方法であって、前記方法が、
脱保護工程：
第１の反応器および第２の反応器を得る工程であって、前記第１の反応器および前記第２の反応器が直列に配置され、それぞれペプチド合成樹脂に結合したある量の保護されたＮ－基を含有する、工程と；
第１の量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程と；
前記第１の量の脱保護試薬を前記第１の反応器から除去する工程と；
前記除去された第１の量の脱保護試薬を前記第２の反応器に添加する工程と；
前記第１の量の脱保護試薬が前記第１の反応器から除去された後に、第２の量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程と；
前記第１の量の脱保護試薬を前記第２の反応器から除去する工程と；
前記第２の量の脱保護試薬を前記第１の反応器から除去する工程と；
前記第１の量の脱保護試薬が前記第２の反応器から除去された後に、前記除去された第２の量の脱保護試薬を前記第２の反応器に添加する工程と；
前記第２の量の脱保護試薬を前記第２の反応器から除去する工程、と
洗浄工程１：
前記脱保護工程の後に、前記第１および第２の反応器の両方で前記ペプチド合成樹脂を溶媒で洗浄する工程、と
カップリング工程：
前記洗浄工程１の後に、第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程と；
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器から除去する工程と；
前記除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器に添加する工程と；
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第１の反応器から除去された後に、第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程と；
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器から除去する工程と；
前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器から除去する工程と；
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第２の反応器から除去された後に、前記除去された第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器に添加する工程と；
前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器から除去する工程、と
洗浄工程２：
前記カップリング工程の後に、前記第１および第２の反応器の両方で前記ペプチド合成樹脂を溶媒で洗浄する工程、と
を含む方法。

【請求項2】

前記第１および第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステル中に見出される前記アミノ酸「Ｘ」自体が、保護されたＮ－基を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記脱保護工程が、
前記第２の反応器から除去された第１の量の脱保護試薬を、前記第２の反応器と直列の第３の反応器に添加する工程であって、前記第３の反応器は、ペプチド合成樹脂に結合したある量の保護されたＮ－基を含む、工程と、
前記第２の反応器から除去された第２の量の脱保護試薬を前記第３の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の量の脱保護試薬が前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記洗浄工程１が、
前記第３の反応器の前記ペプチド合成樹脂を溶媒で洗浄する工程
をさらに含み、
前記カップリング工程が、
前記第２の反応器から除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器に添加する工程と、
前記第２の反応器から除去された第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記脱保護工程が、
第３の量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程であって、この第３の量の脱保護試薬は、前記第２の量の脱保護試薬が前記第１の反応器から除去された後に、前記第１の反応器に添加される、工程と、
前記第３の量の脱保護試薬を前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量の脱保護試薬が前記第２の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量の脱保護試薬を前記第２の反応器から前記第３の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量の脱保護試薬が前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量の脱保護試薬を前記第３の反応器から除去する工程と
をさらに含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記カップリング工程が、
第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第１の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第２の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器から前記第３の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器から除去する工程と
をさらに含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記カップリング工程が、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第３の反応器から除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを再び前記第１の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第１の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記脱保護工程が、
前記第１の量の脱保護試薬を前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第３の反応器から除去された第１の量の脱保護試薬を再び前記第１の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第３の量の脱保護試薬が前記第１の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記第１および第２の反応器を溶媒で前記洗浄する工程が、溶媒を前記反応器に添加することによって行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記洗浄工程２の後、方法が、
さらなる脱保護工程：
第１の追加量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程と；
前記第１の追加量の脱保護試薬を前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程と；
第２の追加量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の追加量の脱保護試薬が前記第１の反応器から除去された後に行われる、工程と；
前記第１の追加量の脱保護試薬を前記第２の反応器から除去する工程と；
前記第２の追加量の脱保護試薬を前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第１の追加量の脱保護試薬が前記第２の反応器から除去された後に行われる、工程と；
前記第２の追加量の脱保護試薬を前記第２の反応器から除去する工程、と
をさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項11】

前記さらなる脱保護工程の後、方法が、
さらなるカップリング工程：
第１の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程と；
前記第１の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルを前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程と；
第２の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルが前記第１の反応器から除去された後に行われる、工程と；
前記第１の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルを前記第２の反応器から除去する工程と；
前記第２の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルを前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第１の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルが前記第２の反応器から除去された後に行われる、工程と；
前記第２の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルを前記第２の反応器から除去する工程、と
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記さらなる脱保護工程が、
前記第２の反応器から除去された第１の追加量の脱保護試薬を、前記第２の反応器と直列の第３の反応器に添加する工程であって、前記第３の反応器は、アミノ酸「Ｘ」活性化エステルのある量の保護されたＮ－基を含む、工程と、
前記第２の反応器から除去された第２の追加量の脱保護試薬を前記第３の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の追加量の脱保護試薬が前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記さらなるカップリング工程が、
前記第２の反応器から除去された第１の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルを前記第３の反応器に添加する工程と、
前記第２の反応器から除去された第２の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルを前記第３の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の量のアミノ酸「Ｚ」活性化エステルが前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第１および第２の反応器内の前記ペプチド合成樹脂が、ＳｉｅｂｅｒまたはＲｉｎｋ樹脂である、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記第１および第２の反応器内の前記ペプチド合成樹脂が、Ｗａｎｇ樹脂またはＣＴＣ樹脂である、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

添加されるアミノ酸Ｘの量が、１．１～１．６当量である、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

直列に配置された第１の反応器および第２の反応器内に見られるペプチド合成樹脂に結合した保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｘ」をカップリングするための方法であって、前記方法が、
脱保護工程：
第１の量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程と；
前記第１の量の脱保護試薬を前記第１の反応器から除去する工程と；
前記除去された第１の量の脱保護試薬を前記第２の反応器に添加する工程と；
前記第１の量の脱保護試薬が前記第１の反応器から除去された後に、第２の量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程と；
前記第１の量の脱保護試薬を前記第２の反応器から除去する工程と；
前記第２の量の脱保護試薬を前記第１の反応器から除去する工程と；
前記第１の量の脱保護試薬が前記第２の反応器から除去された後に、前記除去された第２の量の脱保護試薬を前記第２の反応器に添加する工程と；
前記第２の量の脱保護試薬を前記第２の反応器から除去する工程、と
カップリング工程：
前記脱保護工程の後に、第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器から除去する工程と、
前記除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器に添加する工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第１の反応器から除去された後に、第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器から除去する工程と、
前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器から除去する工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第２の反応器から除去された後に、前記除去された第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器に添加する工程と、
前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器から除去する工程、と
を含む方法。

【請求項18】

前記第１および第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステル中に見出される前記アミノ酸「Ｘ」自体が、保護されたＮ－基を有する、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記脱保護工程が、
前記第２の反応器から除去された第１の量の脱保護試薬を、前記第２の反応器と直列の第３の反応器に添加する工程であって、前記第３の反応器は、ペプチド合成樹脂に結合したある量の保護されたＮ－基を含む、工程と、
前記第１の量の脱保護試薬を前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第２の反応器から除去された第２の量の脱保護試薬を前記第３の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の量の脱保護試薬が前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と、
第３の量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程であって、この第３の量の脱保護試薬は、前記第２の量の脱保護試薬が前記第１の反応器から除去された後に、前記第１の反応器に添加される、工程と、
前記第３の量の脱保護試薬を前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量の脱保護試薬が前記第２の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量の脱保護試薬を前記第２の反応器から前記第３の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量の脱保護試薬が前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含み、
前記カップリング工程が、
前記第２の反応器から除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器に添加する工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第２の反応器から除去された第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器から除去する工程と
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記カップリング工程が、
第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第１の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第２の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器から前記第３の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第３の反応器から除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを再び前記第１の反応器に添加する工程であって、この前記第３の反応器から除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルの添加は、前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第１の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ペプチド合成樹脂に結合した脱保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｘ」をカップリングするための方法であって、
第１の反応器および第２の反応器を得る工程であって、前記第１の反応器および前記第２の反応器が直列に配置され、それぞれペプチド合成樹脂に結合したある量の脱保護されたＮ－基を含有する、工程と、
第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器から除去する工程と、
前記除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器に添加する工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第１の反応器から除去された後に、第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器に添加する工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器から除去する工程と、
前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第１の反応器から除去する工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第２の反応器から除去された後に、前記除去された第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器に添加する工程と、
前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第２の反応器から除去する工程と
を含む方法。

【請求項22】

前記第１および第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第１および第２の反応器から除去された後に、前記第１の反応器および第２の反応器を溶媒で洗浄する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記第２の反応器から除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを、前記第２の反応器と直列の第３の反応器に添加する工程であって、前記第３の反応器は、ペプチド合成樹脂に結合したある量の脱保護されたＮ－基を含む、工程と、
前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルを前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第２の反応器から除去された第２の量のアミノ酸「Ｘ」を前記第３の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルが前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

第３の量のアミノ酸「Ｘ」を前記第１の反応器に添加する工程であって、この第３の量のアミノ酸「Ｘ」は、前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」が前記第１の反応器から除去された後に、前記第１の反応器に添加される、工程と、
前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」を前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」が前記第２の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」を前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」を前記第２の反応器から前記第３の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量のアミノ酸「Ｘ」が前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」を前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第３の反応器から除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」を再び前記第１の反応器に添加する工程であって、前記第３の反応器から除去された第１の量のアミノ酸「Ｘ」は、前記第３の量のアミノ酸「Ｘ」が前記第１の反応器から除去された後に、再び前記第１の反応器に添加される、工程と
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

ペプチド合成樹脂に結合した保護されたＮ－基を脱保護するための方法であって、
第１の反応器および第２の反応器を得る工程であって、前記第１の反応器および前記第２の反応器が直列に配置され、それぞれペプチド合成樹脂に結合したある量の保護されたＮ－基を含有する、工程と、
第１の量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程と、
前記第１の量の脱保護試薬を前記第１の反応器から除去する工程と、
前記除去された第１の量の脱保護試薬を前記第２の反応器に添加する工程と、
前記第１の量の脱保護試薬が前記第１の反応器から除去された後に、第２の量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程と、
前記第１の量の脱保護試薬を前記第２の反応器から除去する工程と、
前記第２の量の脱保護試薬を前記第１の反応器から除去する工程と、
前記第１の量の脱保護試薬が前記第２の反応器から除去された後に、前記除去された第２の量の脱保護試薬を前記第２の反応器に添加する工程と、
前記第２の量の脱保護試薬を前記第２の反応器から除去する工程と
を含む方法。

【請求項27】

前記第１および第２の量の脱保護試薬が前記第１および第２の反応器から除去された後に、前記第１の反応器および第２の反応器を溶媒で洗浄する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記第２の反応器から除去された第１の量の脱保護試薬を、前記第２の反応器と直列の第３の反応器に添加する工程であって、前記第３の反応器は、ペプチド合成樹脂に結合したある量の保護されたＮ－基を含む、工程と、
前記第１の量の脱保護試薬を前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第２の反応器から除去された第２の量の脱保護試薬を前記第３の反応器に添加する工程であって、この添加は、前記第１の量の脱保護試薬が前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

第３の量の脱保護試薬を前記第１の反応器に添加する工程であって、この第３の量の脱保護試薬は、前記第２の量の脱保護試薬が前記第１の反応器から除去された後に、前記第１の反応器に添加される、工程と、
前記第３の量の脱保護試薬を前記第１の反応器から前記第２の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量の脱保護試薬が前記第２の反応器から除去された後に行われる、工程と
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記第２の量の脱保護試薬を前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第３の量の脱保護試薬を前記第２の反応器から前記第３の反応器に移送する工程であって、この移送は、前記第２の量の脱保護試薬が前記第３の反応器から除去された後に行われる、工程と、
前記第３の量の脱保護試薬を前記第３の反応器から除去する工程と、
前記第３の反応器から除去された第１の量の脱保護試薬を再び前記第１の反応器に添加する工程であって、前記第３の反応器から除去された第１の量の脱保護試薬は、前記第３の量の脱保護試薬が前記第１の反応器から除去された後に、再び前記第１の反応器に添加される、工程と
をさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

複数の洗浄サイクルが、各特定のアミノ酸の添加の間に行われる、請求項９に記載の方法。

【請求項32】

各洗浄サイクルからの洗浄溶媒が、リサイクル容器に収集され、前記リサイクルされる洗浄溶媒が、次の洗浄サイクルに用いられる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記リサイクルされる洗浄溶媒が、後の洗浄サイクルの最初の半分に用いられる、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

リサイクルされる洗浄溶媒の使用が、必要な溶媒の半分を削減する、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

リサイクルされる洗浄溶媒の使用が、必要な溶媒を約７９％まで減少させる、請求項３２に記載の方法。

【請求項36】

前記溶媒が、環境に優しい溶媒またはグリーン溶媒である、請求項９に記載の方法。

【請求項37】

前記環境に優しい溶媒またはグリーン溶媒が、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、２－メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、またはＮ－ブチルピロリジノン、あるいはこれらの混合物である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記溶媒が、Ｎ－ブチルピロリジノンおよびテトラヒドロフランの混合物である、請求項９に記載の方法。

【請求項39】

前記溶媒が、Ｎ－ブチルピロリジノンおよび２－メチルテトラヒドロフランの混合物である、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ペプチドを合成的に製造するための新たなシステムおよび方法に関する。より具体的には、本開示は、固相ペプチド合成の一部としてペプチドを一緒にカップリングするための機構として直列の樹脂反応器を使用するデバイスに関する。

【背景技術】

【0002】

固相ペプチド合成（「ＳＰＰＳ」）は、ポリペプチドおよびアミノ酸配列を合成するために最も一般的に使用される方法およびシステムである。ＳＰＰＳは、活性化アミノ酸（通常は配列の末端または最後のアミノ酸）を固体支持体にカップリングすることを含む。この固体支持体は、通常、（ＮＨ_２基などで）官能化されたポリマー樹脂ビーズである。末端アミノ酸（一般に、Ｆ－ｍｏｃ、ＢＯＣまたは他の保護基によって保護されたＮＨ_２末端を有する）を樹脂と反応させて、樹脂上の官能化基が末端アミノ酸の活性化ＣＯＯＨ基と反応して結合するようにする。このようにして、末端アミノ酸は樹脂に共有結合する。

【0003】

次いで、次のステップにおいて、末端アミノ酸のＮＨ_２末端を脱保護し、それによって次の反応のためにそのＮＨ_２基を露出させる。したがって、新しいアミノ酸が導入される。この新しいアミノ酸は、保護基（Ｆｍｏｃ、ＢＯＣ、または別の保護基など）を介して保護されたＮＨ_２末端を有する。したがって、この新しいアミノ酸が加えられると、新しいアミノ酸からの活性化エステルが末端アミノ酸の新たに脱保護されたＮＨ_２基と反応し、それによってこれら２つのアミノ酸が一緒にカップリングされる。この新しいアミノ酸がカップリングされると、同様に保護されたＮＨ_２基を有し、これは続いて脱保護され、次のアミノ酸と反応する。この繰り返される反復プロセスを何度も行うことにより、全アミノ酸配列を構築することができる。配列全体が構築されたら、配列を樹脂から分離（切断）して脱保護し、それによってアミノ酸構造を生成することができる。（このプロセスを介して加えられる様々なアミノ酸（Ｒ_１、Ｒ_２など）の側鎖は、ＢＯＣ、ｔ－ブチル、またはトリチルなどの基を介して直交的に保護されて、そのような側鎖がアミノ酸合成プロセス中に反応しないようにすることができる。また、１つ以上のアミノ酸が、その構造の一部として「側鎖」または他の基を有する場合があり、これも保護する必要がある場合がある。しかしながら、当業者は、そのような側鎖または他の基が合成プロセス中にどのように構築され、保護され、その後脱保護されるかを理解するであろう。

【0004】

このＳＰＰＳプロセスは商業的に使用されており、ペプチド合成の標準となっているが、費用および時間を要するという欠点がある。加えられる各アミノ酸は脱保護およびカップリングする必要があるが、これは困難であり、通常は大量の溶媒が使用される。さらに悪いことに、これらの溶媒の多くは環境に優しくない。

【0005】

したがって、特にペプチドの商業的製造において、これらの欠点の１つ以上に対処するＳＰＰＳの新たな使用方法を見つけることが改善となるであろう。そのようなシステムがより環境に優しく、製造コストを削減できれば、さらなる進歩となるであろう。実際に、本実施形態は、廃棄物の量、ならびに使用される溶媒および試薬の量を特に削減する。そのような方法およびシステムが本明細書に開示される。

【発明の概要】

【0006】

ＳＰＰＳ樹脂に結合したアミノ酸の保護されたＮ－基（ＮＨ_２末端など）にアミノ酸「Ｘ」活性化エステルをカップリングするための方法およびシステム。一般に、システムは、直列に配置された反応器の集合を備える。いくつかの実施形態では、２つ以上の反応器が直列に配置される。好ましい実施形態では、３つ以上の反応器が直列に配置される。

【0007】

各反応器は、ペプチド合成樹脂に固定されたある量の保護されたＮ－基を含む。この保護されたＮ－基は、アミノ酸のＮＨ_２基であってもよく、または、これらに限定されないが、ＳｉｅｂｅｒアミドもしくはＲｉｎｋアミド樹脂などの樹脂自体に見出されるか、もしくは樹脂自体に共有結合したＮＨ_２基であってもよい。Ｗａｎｇ樹脂またはＣＴＣ（塩化クロロトリチル）樹脂などの他のタイプの樹脂が使用されてもよい。

【0008】

方法の第１のステップは、第１の量の脱保護試薬を第１の反応器に添加し、この試薬を保護されたＮ－基と接触させることを含む。次いで、この第１の量の脱保護試薬は、第１の反応器から第２の反応器に移送され、第２の量の脱保護試薬が第１の反応器に移送される。第１の量の脱保護試薬は第２の反応器から除去され、第２の量の脱保護試薬が第１の反応器から第２の反応器に移送される。次いで、この第２の量の脱保護試薬は第２の反応器から除去される。

【0009】

第１および第２の反応器の両方を第１および第２の量の脱保護試薬と接触させる目的は、この脱保護試薬が保護されたＮ－基と反応し、別々にまたは集合的に、第１および第２の反応器の両方でペプチド合成樹脂に固定された保護されたＮ－基を脱保護するように作用させることである。したがって、第１および第２の量の脱保護試薬を添加することにより、第１および第２の反応器の両方のＮ－基は保護されず、別のアミノ酸に結合することができる。第１の量の洗浄液が第１の反応器に添加され、次いで第２の反応器に移送され、次いで廃棄される。洗浄サイクルは数回繰り返される。溶媒による洗浄は、グリーン溶媒、または通常ＳＰＰＳで使用されるより環境に優しい溶媒により使用され得る。そのようなグリーン洗浄溶媒には、アセトニトリル（ＡＣＮ）、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、２－ＭｅｔＨＦ（２－メチルテトラヒドロフラン）、およびＣＰＭＥ（シクロペンチルメチルエーテル）、またはＮＢＰ／ＴＨＦ ２／１ ｖ／ｖなどの溶媒混合物が含まれ、これらは本明細書に例示されている。化学反応は、同じくグリーン溶媒であるＡＣＮ、ＡＣＮ／ＤＭＳＯ、またはｎ－ブチルピロリジノンでも生じ得る。

【0010】

したがって、第１の量のアミノ酸「Ｘ」および第１の量の溶媒が第１の反応器に添加され、次いで一定時間後、第１の反応器から第２の反応器に移送される。反応器に添加されるそのような量のアミノ酸「Ｘ」は、実際にはアミノ酸Ｘの「活性化エステル」であり、それによってカップリング反応が促進されることに留意されたい。しかしながら、簡略表記のために、本明細書では単に「ある量のアミノ酸Ｘ」を反応器に添加することと呼ぶことがあるが、当業者はそれが活性化エステルであることを理解するであろう。代替的に、非活性化アミノ酸が反応器に添加され、次いで活性化溶液が添加されて反応し、アミノ酸を活性化エステルに変換することができる。これもまた、本明細書で使用されるアミノ酸活性化エステルを樹脂に添加するという意味に含まれる。

【0011】

第２の量のアミノ酸「Ｘ」および第２の量の溶媒が、第１の反応器に添加される。第１および第２の量のアミノ酸「Ｘ」活性化エステルは、別々にまたは集合的に、第１の反応器内の脱保護されたＮ基にアミノ酸「Ｘ」をカップリングする。（アミノ酸「Ｘ」活性化エステルは、鎖への付加が望まれる官能化、誘導体化、または合成アミノ酸を含む任意のアミノ酸であり得る。）（本明細書で使用されるように、アミノ酸「Ｘ」がカップリングされると言及されることもあるが、当業者は、これが反応を容易にするために最も頻繁に使用される活性化エステルであることを理解するであろう。）

【0012】

第１の量のアミノ酸「Ｘ」および第１の量の溶媒が第２の反応器から除去され、第２の量のアミノ酸「Ｘ」および第２の量の溶媒が第１の反応器から第２の反応器に移送される。次いで、第２の量のアミノ酸「Ｘ」および第２の量の溶媒は第２の反応器から除去される。第１および第２の量のアミノ酸「Ｘ」は、別々にまたは集合的に、アミノ酸「Ｘ」を第２の反応器内の脱保護されたＮ－基にカップリングする。第１の量の溶媒洗浄液は第１の反応器に添加され、次いで第２の反応器に移送され、次いで廃棄される。溶媒洗浄サイクルは数回繰り返される。第２の量の溶媒洗浄液は、例えば、第２の反応器内の第１の量の溶媒洗浄液と同時に、第１の反応器内にあってもよい。したがって、これらのステップを実行した後、アミノ酸「Ｘ」は脱保護されたＮ－基に結合し、それによってアミノ酸「Ｘ」が鎖に付加される。当然ながら、他のＳＰＰＳシステムと同様に、アミノ酸「Ｘ」は保護されたＮＨ_２基を含むため、上記のプロセスを繰り返すことができる（例えば、上で概説した様式で、ＮＨ_２基を脱保護し、新しいアミノ酸をそれにカップリングする）。したがって、このプロセスを繰り返すことにより、所望のアミノ酸配列および／またはペプチドを構築することができる。合成が完了したら、構築されたアミノ酸は、第１の反応器および第２の反応器の両方で樹脂に放出（分離）される。

【0013】

上記の方法は、それぞれが樹脂を供給する直列の２つの反応器を使用するが、ある量の樹脂も含有する第３の反応器を最初の２つの反応器と直列に配置する他の実施形態を設計することができる。この実施形態では、脱保護ステップもまた第３の反応器で行われなければならない。したがって、第１の量の脱保護試薬が第２の反応器から除去されると、それは第３の反応器に添加される。この第１の量の脱保護試薬は第３の反応器から除去され、第２の反応器から除去された第２の量の脱保護試薬が第３の反応器に添加される。同様に、第３の量の脱保護試薬が第１の反応器に添加され、第２の反応器に移動され、次いで第３の反応器に移動される。第１、第２、および第３の量の脱保護試薬の目的は、別々にまたは集合的に、第３の反応器でペプチド合成樹脂に固定された保護されたＮ－基を脱保護することである。同様に、第３の反応器への第１の量のアミノ酸「Ｘ」および第１の量の溶媒は、第２の反応器から除去された後、第３の反応器に添加される。同様に、第３の反応器への第２の量のアミノ酸「Ｘ」および第２の量の溶媒は、第２の反応器から除去された後、第３の反応器に添加される。第３の量のアミノ酸「Ｘ」および第３の量の溶媒は、第１、第２および第３の反応器を通して順次循環される。第１、第２および第３の量のアミノ酸「Ｘ」は、別々にまたは集合的に、アミノ酸「Ｘ」を第３の反応器内で脱保護されたＮ－基にカップリングする。次いで、上述のように洗浄ステップが行われる。したがって、このように、アミノ酸配列は、３つすべての反応器で反復的に構築され（各アミノ酸についてこれらまたは同様のステップを繰り返すことによって）、次いで３つの反応器のそれぞれで樹脂から放出され得る。

【0014】

したがって、本実施形態は、直列に配置された様々な反応器を提供し、試薬が第１の反応器に添加され、次いでその後第２の反応器、次いで第３の反応器などに連続的に移動される。そのような反応器を直列に配置することによって、各反応器は、ペプチド配列を構築するために使用されるＳＰＰＳで使用されるある量の樹脂を含み得る。しかし、このように反応器を配置することによって、より少ない量の溶媒（洗浄剤）が必要になる。同様に、より少ない量のカップリング試薬が必要とされ得、その結果、無駄が少なくなり、より効率的で環境に優しいプロセスとなる。

【0015】

本開示の特徴および利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を考慮すると、当業者にさらに明らかになるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本明細書で使用されるペプチド合成樹脂に結合した保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｘ」をカップリングするためのシステムおよび方法の概略図である。

【図2】本明細書で使用されるペプチド合成樹脂に結合した保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｘ」をカップリングするためのシステムおよび方法の概略図である。

【図3】本明細書で使用されるペプチド合成樹脂に結合した保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｘ」をカップリングするためのシステムおよび方法の概略図である。

【図4】図３のシステムとともに使用されるオンラインＬＣＭＳのためのシステムおよび方法の概略図である。

【図5】本実施形態で使用される直列の３つの反応器の斜視図である。

【図6】本実施形態を用いて作製され得るペプチドを示す。

【図7】本実施形態を用いて作製され得るペプチドを示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本開示の原理の理解を促進する目的のために、ここで、図面に例示された実施形態を参照し、特定の言語を使用して、これを説明する。しかしながら、これによって本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されるであろう。

【0018】

ここで図１を参照すると、ペプチド合成樹脂に結合した保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｘ」をカップリングするためのシステム１００の概略図が示されている。システム１００は、本明細書で概説したプロセスを実行し、ペプチドおよび／またはアミノ酸配列を生成するように設計された改変ＳＰＰＳシステムである。システム１００は、第１の反応器１０６および第２の反応器１０８として示される少なくとも２つの反応器を備える。これらの反応器１０６、１０８は、直列に配置される。３つ以上の反応器が使用されてもよい。実際に、図１に示されるシステム１００では、第３の反応器１１２も直列に配置される。４つ以上の反応器が使用されてもよい。

【0019】

反応器の各々は、ある量の樹脂１１６を含む。樹脂は、保護されたＮ－基１２０（保護されたＮＨ_２基など）を含む。いくつかの実施形態では、保護されたＮ－基に使用されるこの保護基は、Ｆｍｏｃ基である。ＳＰＰＳの当業者は、ＳｅｉｂｅｒおよびＲｉｎｋアミド樹脂を含む、樹脂１１６として使用することができる樹脂のタイプを理解するであろう。ＳＰＰＳプロセスの一部として、保護されたＮ－基は、アミノ酸と反応する（したがって、ペプチド／アミノ酸配列を構築するために機能する）ことができるように「脱保護」されなければならない。したがって、脱保護プロセスが行われる。この脱保護は、第１の量の脱保護試薬１２６を添加することによって行われる。（この第１の量の脱保護試薬１２６は、図で矢印によって表されている）。いくつかの実施形態では、脱保護試薬はピペリジンであり得るが、他の材料／試薬も使用され得る。

【0020】

第１の量の脱保護試薬１２６は撹拌され、第１の反応器１０６内で樹脂１１６上の保護されたＮ－基１２０と一定期間反応され得る。（当業者は、ここで必要とされる正確な時間の割り当てを決定する方法を理解するであろう）。次いで、第１の量の脱保護試薬１２６が第１の反応器１０６から除去され、第２の反応器１０８に移送される（矢印１２８によって示されるように）。この第１の量の脱保護試薬１２６は撹拌され、第２の反応器１０８内で樹脂１１６上の保護されたＮ－基１２０と一定期間反応され得る。同時に、第２の量の脱保護試薬１３０が第１の反応器１０６に添加され、同様に反応される。

【0021】

これらの反応が完了すると（換言すれば、割り当てられた時間が経過すると）、第１の量の脱保護試薬１２６は第２の反応器１０８から除去され、第３の反応器１１２に移送される（矢印１３６によって示されるように）。同様に、第２の量の脱保護試薬１３０は第１の反応器１０６から除去され、第２の反応器１０８に移送される（矢印１４０によって示されるように）。次いで、第３の量の脱保護試薬１３４が第１の反応器１０６に添加される。このとき、第１の反応器１０６、第２の反応器１０８および第３の反応器１１２での反応は継続される。

【0022】

第１の反応器１０６、第２の反応器１０８および第３の反応器１１２におけるこれらの反応が終了した後（または、換言すれば、割り当てられた時間が経過した後）、第１の量の脱保護試薬１２６が第３の反応器１１２から除去される。第２の量の脱保護試薬１３０は第２の反応器１０８から除去され、第３の反応器１１２に移送される（矢印１４４によって示されるように）。第３の量の脱保護試薬１３４は第１の反応器１０６から除去され、第２の反応器１０８に添加され得る（矢印１４６によって示されるように）。

【0023】

いくつかの実施形態では、第３の反応器１１２から除去されたこの第１の量の脱保護試薬１２６は、追加の反応器に送られ得る（実施形態が追加の反応器を含む場合）。他の実施形態では、この第１の量の脱保護試薬１２６が収集され、廃棄される。これはまた、第２および第３の量の脱保護試薬１３０、１３４に対して、それらが第３の反応器１１２を循環した後に行われる。図１に示される実施形態を含む他の実施形態では、この第１の量の脱保護試薬１２６（ならびにその後の第２および第３の脱保護試薬１３０、１３４）は、所望により脱保護の追加の反復が実行され得るように第１の反応器１０６に戻され得る（矢印１４８によって示されるように）。（脱保護試薬が第１の反応器に戻される場合、このプロセスはバッチ反応に近くなり、効率が低下する可能性があることに留意されたい。）

【0024】

第３の量の試薬１３４は第１の反応器１０６から除去され、第２の反応器１０８に移送される。次いで、この量の試薬１３４は、本明細書で概説した様式で、第２の反応器１０８および第３の反応器１１２を循環する。（ただし、第２の反応器１０８から第３の反応器１１２に送られる第３の量の試薬１３４の矢印は示されていない）。

【0025】

当業者は、必要に応じて、各量（および各反応器）の試薬の体積を均一またはほぼ均一に維持するために、第１、第２または第３の量の脱保護試薬１２６、１３０、１３４のいずれかにポンピング補正を行うことができることを理解するであろう。

【0026】

当業者には容易に明らかであるように、第１、第２および第３の反応器１０６、１０８、１１２に添加される脱保護試薬１２６、１３０、１３４の目的は、別々にまたは集合的に、ペプチド合成樹脂１１６に固定された保護されたＮ－基１２０を脱保護するように動作することである。このように、本明細書で概説した様式で連続して循環される試薬の量を使用して連続してＮ－基を脱保護することによって、Ｎ－基は、Ｎ－基を別のアミノ酸にカップリングするように作用するカップリング反応にいつでも使用され得る（以下でより詳細に説明するように）。

【0027】

所望により、樹脂１１６に結合した保護されていないＮ－基を、ＤＭＦなどの溶媒で「洗浄」することができる。ＮＢＰ（Ｎ－ブチルピロリジノン）、ＮＭＰ（Ｎ－メチル－２－ピロリドン）、ＤＭＳＯ、ＭｅＴＨＦ（メチルテトラヒドロフラン）などのアセテートおよびエーテル、またはＮＢＰ／ＴＨＦ ２／１ ｖ／ｖなどの溶媒混合物を含む他の溶媒も使用され得、これは本明細書に例示されている。そのような洗浄は、脱保護試薬１２６、１３０、１３４に関して上で概説したのと同じ様式で行うことができる。換言すれば、第１の量の洗浄溶媒が第１の反応器１０６に添加され、続いて第２および第３の反応器１０８、１１２を通して循環され得る。同様に、第２および第３の量の洗浄溶媒も同様に、反応器１０６、１０８および１１２を通して循環され得る。この洗浄ステップは、５、８または１０回の異なる洗浄サイクルがあり得るように反復することができる（同じ量の溶媒または新しい量の溶媒が毎回最初の反応器に添加される）。（本明細書では詳細に記載されていないが、洗浄ステップは重要であり得、各脱保護およびカップリングステップの後に行われ得る）。同様に、ポンプ補正を使用して、反応器に添加される洗浄溶媒の各量がほぼ均一になるようにすることもできる。

【0028】

ここで図２を参照して、システム１００を使用したアミノ酸のカップリングを説明する。樹脂１１６のそれぞれは、上で概説したように脱保護されている（および任意に洗浄されている）。したがって、樹脂１１６は、（図１に示された保護されたＮ－基１２０ではなく）保護されていないＮ－基１２０ａを含むように示されている。

【0029】

第１の量のアミノ酸「Ｘ」１５０が、第１の反応器１０６に添加される。これは、図２において矢印により図示されている。図２に示される実施形態では、第１の量のアミノ酸「Ｘ」１５０は、第１の量の溶媒１５２および第１の量の他の試薬１５４と予め混合されている。より具体的には、第１の量のアミノ酸「Ｘ」１５０は、第１の反応器１０６に添加される前に、他の試薬１５４および溶媒１５２と混合されている。他の実施形態では、第１の溶媒１５２および／または他の試薬１５４もまた、第１の量のアミノ酸「Ｘ」１５０に加えて、順次および／または同時に第１の反応器１０６に添加され得る。いくつかの実施形態では、第１の量の溶媒１５２はＤＭＦであってもよい。いくつかの実施形態では、他の試薬１５４は、アミノ酸「Ｘ」１５０および／もしくは保護されていないＮ－基１２０ａを「活性化」し、ならびに／またはカップリング反応を促進するように作用する薬剤である。したがって、いくつかの実施形態では、他の試薬１５４は、ＤＩＣおよびオキシマであってもよい。

【0030】

アミノ酸「Ｘ」１５０（および第１の量の溶媒１５２および他の試薬１５４）が第１の反応器１０６に添加されると、カップリング反応が進行する。この反応は、保護されていないＮ－基１２０ａとアミノ酸「Ｘ」との間で生じる。ある期間（例えば、３０分または当業者がどのように計算／決定するかを理解するであろう他の所定の時間）の後、第１の量のアミノ酸「Ｘ」１５０は、第１の反応器１０６から除去され得る（矢印１６０で示されるように）。いくつかの実施形態では、この第１の量のアミノ酸「Ｘ」１５０は、第２の反応器１０８に移送され得る。第１の量の溶媒１５２および／または他の試薬１５４もまた、第１の反応器１０６から除去され、第２の反応器１０８に移送され得る。

【0031】

第２の反応器１０８に入ると、第１の量のアミノ酸「Ｘ」（ならびに第１の溶媒１５２および／または他の試薬１５４）は、第２の反応器１０８内で保護されていないＮ－基１２０ａと反応するように作用し得る。同様に、第２の量のアミノ酸「Ｘ」１７０が、第１の反応器１０６に添加され得る。（ここでも、この第２の量のアミノ酸「Ｘ」１７０は、他の試薬１５４および／または溶媒１５２と予め混合され得る）。ある期間（例えば３０分など）の後、第１の量のアミノ酸「Ｘ」１５０は、第２の反応器１０８から除去され得る（矢印１６４で示されるように）。この第１の量のアミノ酸「Ｘ」１５０は、第２の反応器１０８から第３の反応器１１２に移送され得る。第１の量の溶媒１５２および／または他の試薬１５４が使用された場合、それらも第２の反応器１０８から除去され、第３の反応器１１２に移送される。第２の量のアミノ酸「Ｘ」１７０は、第１の反応器１０６から除去され得る（矢印１７４で示されるように）。この第２の量のアミノ酸「Ｘ」１７０は、第１の反応器１０６から第２の反応器１０８に移送され得る。

【0032】

第３の量のアミノ酸「Ｘ」１８０が、第１の反応器１０６に添加され得る。（ここでも、この第３の量のアミノ酸「Ｘ」１８０は、他の試薬１５４および／または溶媒１５２と予め混合されてもよく、第１の量１５０および／または第２の量の１７０と同じバッチからのものであってもよい。）第１、第２、および第３の反応器１０６、１０８、１１２内の保護されていないＮ－基１２０ａがアミノ酸「Ｘ」と反応してカップリングするように、反応を進行させる。この反応が完了すると、またはある期間の後、第１の量のアミノ酸「Ｘ」は第３の反応器１１２から除去され、廃棄され得るか、または第１の反応器１０６にリサイクルされ得る（矢印１８８で示されるように）。（ここでも、そのようなリサイクルにより、この反応はバッチに近くなり、したがってあまり望ましくない場合がある。実際に、バッチモードが望ましい場合、反応器を並列に結合する方がよい場合がある。）同様に、第２の量のアミノ酸「Ｘ」１７０は第３の反応器１１２に移送され得（そして矢印１６６で示されるように反応され得）、第１の量のアミノ酸「Ｘ」１８０は第２の反応器１０８に、その後第３の反応器１１２に移送され得る（そして各反応器で反応され得る）。この反復様式では、反応は「連続して」生じ、第１、第２および第３の量のアミノ酸「Ｘ」１５０、１７０、１８０は反応器１０６、１０８、１１２を循環する。このようにして、アミノ酸量１５０、１７０、１８０は、別々にまたは集合的に、保護されていないＮ－基１２０ａと反応するように作用し、第１、第２および第３の反応器１０６、１０８、１１２内で脱保護されたＮ－基１２０ａにアミノ酸「Ｘ」をカップリングする。

【0033】

いくつかの実施形態では、溶液を１つの反応器から次の反応器に移送する（例えば、第１の反応器１０６から第２の反応器１０８に、または第２の反応器１０８から第３の反応器１１２に移送する）前に、溶液を濾過することが有利であり得る。当業者は、そのような濾過がどのように行われるかを理解するであろう。

【0034】

本明細書で概説するように、直列の反応器を使用すると、脱保護および／または洗浄ステップに使用される溶媒の量を低減することができることが理解される。例えば、従来のバッチ処理が使用される場合、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液が脱保護反応に必要となる。そのような溶液は１０容量に分割され、各バッチ反応器はこの溶液で３回反応される。これにより、各反応器で約３０Ｌ／ｋｇが使用される。しかしながら、本明細書で教示されるように、３つの反応器が直列で使用される場合、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液は、各反応器中の樹脂量に基づいて依然として１０容量に分割され、一連の３つの反応器を通して３回（反復）反応される。反応器２および３がバッチ以上の当量数のピペリジンを経験するために、１０Ｌ／ｋｇの４回目の投入が使用され得る。ここで、ピペリジン溶液の総量は、４０／３＝１３．３Ｌ／ｋｇとなり、これは２．２５分の１の低減である。

【0035】

過剰なアミノ酸の数が多くなり、アミノ酸のコストが高くなるほど、カップリングに直列反応器を使用することがより有利になる。例えば、Ｌｙｓ２０ ＩＶデカップリング試薬の価格は、１グラム当たり約２０ドルであり、したがって、過剰な試薬の量の低減は大幅なコスト削減をもたらし得る。しかしながら、過剰当量の数が少ないほど、カップリング反応を並列で実行する方が有利であり、これは、樹脂内で反応溶液が滞留し、過剰当量のあるパーセンテージが希釈せずに次の反応器に移送されるのを防ぐためである。過剰なアミノ酸当量が約２以下であり、それらが標準的な安価のアミノ酸である場合、カップリング反応を並列で実行するが、脱保護と洗浄は直列で実行することを選択した。

【0036】

いくつかの実施形態では、直列の反応器の数が多いほど、生成物１キログラム当たりに必要な全体的な溶媒および試薬が少なくなることに留意すべきである。これは、より多数のＣＳＴＲ（直列の連続撹拌槽型反応器）が理想的な栓流に近づくというフローケミストリーの原理に類似している。いくつかの実施形態では、廃棄物削減と設備コストとの間のトレードオフのために、直列の３つの反応器が最適であると考えられる。換言すれば、実施形態は、直列の４つ～５つ以上の反応器で減少リターンが達成されるように設計され得る。洗浄の最後に同じ最大残留試薬濃度を達成するために、直列の３つの反応器を操作して、単一バッチ処理に対して必要な溶媒を半分に削減することができる。当然ながら、４つ以上または６つ以上の反応器が使用される他の実施形態を設計することができる。２つの反応器を直列で使用するさらなる実施形態が設計され得る。

【0037】

いくつかの実施形態では、すべての試薬投入量を質量で測定し、ＤｅｌｔａＶ分配制御システム（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ ＵＳＡのＥｍｅｒｓｏｎ社によって提供される）を使用することが望ましい場合がある（Ｗｉｎｄｏｗｓベースの使用者インターフェースではなく）。これは、文書化もＤｅｌｔａＶで自動的に行われ、システムが実行されたマスターバッチレコードを作成することができるためである。さらに、ＤｅｌｔａＶシステムでは、操作のほとんどがリモートアクセスによって行われ、これはインターネットがあれば世界中のどこからでも達成され得る。ＤｅｌｔａＶシステムは、プロセスで重要なステップが行われている場合、または注意が必要な場合にオペレーター、化学者、エンジニア、および分析者の携帯電話に説明テキストメッセージを送信するように設定でき、その後ほとんどの状況でリモートで処理される。市販されている最高の実験室研究スケールＳＰＰＳ技術に共通する問題の１つは、ペプチド構築中のある時点で制御システムがクラッシュする、投入量をミスする、またはエラーを生じることである。試薬の投入は、レベルセンサを介して行われるためにミスされる。対照的に、システムは、重量計からの質量によってすべての試薬の投入を行うように設計され得る。個々の実験は、例えばペプチドが３０を超えるアミノ酸を有する場合など、多くの場合、１か月超実行する必要がある。１か月の実験の終わり近くにアミノ酸の投入ミスが発生すると、実験をやり直さなければならず、その１か月（または合成に必要なその他の時間）が無駄になるとともに材料が無駄になる。ＤｅｌｔａＶ自動化は、ＧＭＰ製造の業界標準であることから、信頼性および堅牢性が向上するように設計されているため、そのような事態が発生する可能性ははるかに低くなる。

【0038】

さらなる実施形態では、システムは、そのオンライン分析のために、他の市販の合成機よりもはるかに多くのプロセス情報および理解を提供するように設計され得る。樹脂上のペプチドのオンラインＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）は、すべての並列反応器におけるすべての脱保護およびカップリングの反応変換および動力学を同時に定量化する。プロセスを実行する同じＤｅｌｔａＶシステムがオンライン分析も実行するため、タイミングは化学プロセスと統合される。したがって、作業者は、事前処理の決定のために試料を採取して分析するために実験室にいる必要がない場合がある。

【0039】

オンラインＬＣＭＳシステムを得るには、次の手順が実行され得る。
１．樹脂反応器から１．０ｍＬのスラリーを抜き取る
２．小型反応器内でＴＦＡで直ちに切断する（試料を抜き取ってからＴＦＡでの切断を開始するまでの時間は約２分）
３．切断されたペプチド溶液をＬＣ（液体クロマトグラフィー）希釈剤で希釈し、混合する
４．実験室内で溶液を輸送し、ＬＣ注入ループ（ガス気泡なし）に装填する
５．ＬＣに試料を注入するループを切り替える
６．使用済み樹脂ビーズを切断反応器から廃棄物に洗い流す
７．試料弁およびチューブを溶媒で洗浄する

【0040】

しかしながら、このオンラインＬＣＭＳを実行するためには、気泡なしで完全に充填されるように流れは試料弁を通って垂直に上昇することに留意されたい。スラリー試料を試料ループから切り替え、切断および脱保護ゾーンに吹き込むために、２つの３方向弁が使用される。弁が正確に同時に切り換わるように単一のソレノイドエアラインが両方の弁のアクチュエータに接続されており、これは、試料毎に正確に１ｍＬのスラリーを得るために重要であり得る。次いで、スラリーは試料ゾーン全体を通過し、試料弁を越えて上方に進む。これは、反応器の粘度およびスラリー密度がステップ毎に変化し、弁を通過する流動距離が変化する場合でも、試料弁が代表的なスラリー密度で満たされるようにするために重要であり得る。反応器からのスラリー試料チューブは、試料弁まで上方を向いている。これは、後で逆方向に反応器にポンプで戻す場合にチューブが清浄となるのに重要である。これにより、キャリーオーバーが最小限に抑えられ、固形物の詰まりが防止される。希釈カートが試料を終了するたびに、試料弁を洗い流すために溶媒が使用される。さもないと、固形物で詰まることになる。溶媒は、試料弁と蠕動ポンプとの間で弁から逆方向に離れるように進入し、弁を通って順方向に押し出される。溶媒のスラグが切断ゾーンに流れ込み、毎回樹脂固形物を除去する。スラリーは弁を越えて上方に流れ続ける。この上方の流れは十分に長いため、代表的な試料が確実に試料ループに入るのに十分なマージンがあるが、スラリーが頂点を通過して下方に流れ始めることはない。そうなった場合、それは蠕動ポンプに到達し、キャリーオーバーの問題を引き起こす可能性があり、また樹脂を粉砕して、反応器での濾過性の問題を引き起こす。蠕動ポンプは、試料ループの上流ではなく、試料ループの斜め下方部分の後に配置される。試料ループの上流にある場合、キャリーオーバーの問題が発生し、樹脂が粉砕されて反応器の濾過性の問題を引き起こす。弁（カスタムであってもよい）を使用し、追加のポートを本体に溶接して、希釈溶媒がボールの上部に直接進入し、上方向に押すようにしてもよく、これによって希釈溶媒が切断溶液と完全に混合され、またボールの上に沈降した樹脂ベッドが破壊される。

【0041】

ここで図１および２をまとめて参照して、ペプチド配列における次のアミノ酸の付加について説明する。配列中のこの次のアミノ酸は、「Ｚ」と指定することができ、これは、それが所望の任意のアミノ酸であり得ることを意味する（一方、上記のように、アミノ酸「Ｘ」もまた、所望の任意のアミノ酸であり得る）。上記で概説したステップおよび方法は、アミノ酸「Ｘ」を樹脂にカップリングするように機能する。（したがって、アミノ酸「Ｘ」は、ペプチド配列における最初のアミノ酸になる。）このアミノ酸「Ｘ」がカップリングされ、樹脂に結合すると、第１、第２および／または第３の反応器１０６、１０８、１１２内の樹脂は溶媒で洗浄され得る。この溶媒は、一般に、上で概説したものと同じ溶媒である。そのような洗浄は、本明細書に概説された順次の（例えば連続的）様式で行うことができる。したがって、例えば、第１の追加量の溶媒が第１の反応器１０６に添加され、第１の反応器１０６内で撹拌され、次いで第２の反応器１０８に移送され得る（および第２の反応器１０８内の樹脂を洗浄するために使用され、次いで第３の反応器１１２に移送される）。同様に、第１の追加量の溶媒が第１の反応器１０６から除去されたら、第２の追加量の溶媒が第１の反応器１０６に添加され得る（および他の反応器を通して循環される）。（第３の量の追加の溶媒も同様に、システムを循環させることができる）。換言すれば、洗浄ステップは、上で概説した順序および様式で進行され得る。

【0042】

反応器１０６、１０８、１１２が溶媒で洗浄されたら、第１の追加量の脱保護試薬が第１の反応器１０６に添加され、次いで（一定期間後）第１の反応器１０６から移送され、第２の反応器１０８に添加される。次いで、この第１の追加量の脱保護試薬はまた、（一定期間後）第２の反応器１０８から除去される。第２の追加量の脱保護試薬が第１の反応器１０６に添加され、一定期間反応され、次いで第１の反応器１０６から除去され、第２の反応器１０８に移送され、そこで反応され、次いで第２の反応器１０８から除去される（次いで、本明細書で概説した様式で第３の反応器１１２に添加される）。この第１および第２の追加量の脱保護試薬（ならびに第３の追加量の脱保護試薬）は、別々にまたは集合的に、第１および第２の反応器の両方でアミノ酸「Ｘ」の保護されたＮ－基を脱保護するように機能する。

【0043】

脱保護試薬とのこの反応の後、アミノ酸「Ｘ」（樹脂に固定されている）は、所望の配列で次のアミノ酸「Ｚ」に結合する準備ができている。したがって、本明細書で概説した様式で、次のステップが行われる：
第１の量のアミノ酸「Ｚ」を第１の反応器１０６に添加するステップ、
第１の量のアミノ酸「Ｚ」を第２の反応器１０８に移送するステップ、
第２の量のアミノ酸「Ｚ」を第１の反応器１０６に添加するステップであって、第１および第２の量のアミノ酸「Ｚ」は、別々にまたは集合的に、第１の反応器１０６内のアミノ酸「Ｘ」の脱保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｚ」をカップリングするステップ、
第１の量のアミノ酸「Ｚ」を第２の反応器１０８から除去するステップ、ならびに
第２の量のアミノ酸「Ｚ」を第１の反応器１０６から第２の反応器１０８に移送するステップ、ならびに
第２の量のアミノ酸「Ｚ」を第２の反応器１０８から除去するステップであって、
第１および第２の量のアミノ酸「Ｚ」は、別々にまたは集合的に、第２の反応器１０８内のアミノ酸「Ｘ」の脱保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｚ」をカップリングするステップ。

【0044】

当業者は、アミノ酸「Ｚ」がまた、これらの一連の反応器および試薬を使用して、各アミノ酸を順次添加する同様の様式で、第３の反応器１１２においてアミノ酸「Ｘ」と反応され得ることを理解するであろう。したがって、このようにしてアミノ酸配列が構築される。次いで、既知のＳＰＰＳ合成のように、この方法を反復的に繰り返して、次のアミノ酸、また次のアミノ酸などを付加する。

【0045】

ここで図３を参照すると、ペプチド合成樹脂に結合した保護されたＮ－基にアミノ酸「Ｘ」をカップリングするためのシステム３００の別の実施形態の概略図が示されている。具体的には、システム３００は、ある量のアミノ酸を収容するように設計された複数の貯蔵タンク３０１を含む。具体的には、ペプチド鎖に付加される各特定のアミノ酸は、それ自体の別個の貯蔵タンク３０１を有し得る。さらに、各タンク３０１は、（溶液に溶解され得る）アミノ酸を貯蔵タンク３０１から活性化反応器３０７にポンピングするように設計されたそれ自体のポンプ３０３を有し得る。具体的には、ポンプ３０３は、タンク３０１からアミノ酸の溶液をライン３０９を介してライン３１１に、そして反応器３０７にポンピングする。当業者は、個々のタンク３０１から反応器３０７へのアミノ酸溶液のこの移送を達成するために、このチューブ／配管およびポンプ３０３を接続する方法を理解するであろう。図３には、３つの異なるアミノ酸タンク３０１のみが示されている。所望により、さらに多くを使用することもできる。

【0046】

任意選択で、量、流速、流れのタイミングなどを所望により調整することができるように、１つ以上のフローセンサ３１３をライン３０９および／またはポンプ３０３に取り付けて、ラインを通る（および反応器３０７に入る）アミノ酸の流れを感知することができる。さらに、弁３１７を使用して、アミノ酸の流れを供給容器３０１に迂回させてポンプをプライミングすることができる。当業者は、弁および／または不活性化ベントシステム３２７を使用する方法を理解するであろう。このベントシステムは、所望により、ベント３２９および安全のためのオーバーフロー容器を含んでもよい。

【0047】

同様に、システム３００は、ある量のＤＩＣ、オキシマなどの他の試薬、および他の洗浄溶媒を収容するように設計された複数の貯蔵タンク３５３を含む。さらに、各タンク３５３は、貯蔵タンク３５３から活性化反応器３０７またはフィルタ反応器３０６、３０８、３１２のいずれかに液体をポンピングするように設計されたそれ自体のポンプ３５５を有してもよい。当業者は、この移送を達成するために、このチューブ／配管およびポンプ３５５を接続する方法を理解するであろう。図３には、３つの異なる供給タンク３５３のみが示されている。所望により、さらに多くを使用することもできる。

【0048】

任意選択で、量、流速、流れのタイミングなどを所望により調整することができるように、１つ以上のフローセンサ３５９をポンプ３５５からのラインに取り付けて、ラインを通る流れを感知することができる。さらに、弁３５７を使用して、流れを供給容器３５３に迂回させてポンプをプライミングすることができる。当業者は、弁および／または不活性化システム３６３を使用する方法を理解するであろう。このシステムは、所望により、ベントバブラ３６１および安全のためのオーバーフロー容器を含んでもよい。

【0049】

上記のように、システム３００は、活性化反応器３０７を含む。活性化反応器３０７は、一般に、第１の反応器３０６、第２の反応器３０８および第３の反応器３１２の上流に配置される。活性化反応器３０７は、活性化反応器３０７内の内容物（溶液）を混合するように設計された撹拌機３３３を任意選択で含んでもよい。また、温度プローブ３３５を活性化反応器３０７に追加することもできる。ジャケット３４５に関連付けられたサーキュレータ３４１も（任意選択で）含めることができる。

【0050】

活性化反応器３０７は、アミノ酸溶液をＤＩＣおよびオキシマと予め混合することによってアミノ酸溶液を「活性化」するように設計され得る。当業者は、ＤＩＣおよびオキシマ（および／または溶媒およびいくつかの他の活性化剤および塩基）のそのような添加がどのように反応器３０７に添加され得るかを理解するであろう。

【0051】

システム３００はまた、脱保護試薬を収容する脱保護溶液容器３７１を含む。（図３に示される実施形態では、脱保護試薬はピペリジンであるが、他の物質が使用されてもよい。）１つ以上の弁３６９およびポンプ３６５は、脱保護試薬を（ライン３６７を介して）第１の反応器３０６内に（入口ライン３７９を介して）ポンピングするように設計され得る。任意選択でリリーフ弁３８１がライン３６７に追加されてもよい。さらに、任意選択で圧力センサ３８５が容器３７１内で使用されてもよい。所望により、容器３７１の通気システムの一部として追加の弁３８３が任意選択で使用されてもよい。

【0052】

溶媒（この場合、ＤＭＦまたは何らかの他の溶媒であってもよい）のために使用される貯蔵容器３７１ａもまた、システム３００の一部として使用され得る。貯蔵容器３７１ａは、溶媒の圧力を測定するための圧力センサ３７３を（任意選択で）含んでもよい。１つ以上の弁３７５およびポンプ３７７を使用して、溶媒容器３７１ａを送達することができる。溶媒は、ライン３８１を介して、活性化反応器３０７、第１の反応器３０６、第２の反応器３０８または第３の反応器３１２に送達される。ライン３８１を通るこの流れを測定するために、フローセンサ３８３が（任意選択で）使用されてもよい。所望により追加の通気弁３８６が任意選択で使用されてもよい。

【0053】

上記の実施形態と同様に、第１、第２および第３の反応器３０６、３０８、３１２は、その中に収容されたある量の樹脂（Ｓｉｅｂｅｒ樹脂など）を含み、活性化反応器３０７の下流に直列に配置される。これらの反応器は、安全目的のために、不活性ヘッドスペース計量窒素供給４０３および１つ以上の通気オーバーフロー容器４０１を含んでもよい。当業者には理解されるように、他のベントおよび／または安全手段が設計されてもよい。

【0054】

上記のように、溶媒溶液は、１つ以上のライン３８１を介して、第１、第２および第３の反応器３０６、３０８、３１２のそれぞれ、ならびに活性化反応器３０７に接続される。１つ以上の弁４０５が、これらの容器のそれぞれへの溶媒の流れを制御することができる。他の実施形態では、これらの反応器のそれぞれへの溶媒進入点は、容器への溶媒の効率的な導入を可能するとともに、溶媒が容器の側面（および側面上に位置し得る任意の固形物）を「洗い流す」ことを可能にする「スプレーボール」または他のスプレー機能であってもよく、それにより、すべての樹脂を試薬および洗浄溶媒に確実に混合および接触させる。（実際に、反応器３０６、３０８、および３１２内の樹脂が「洗浄」されているときの各特定のアミノ酸の添加の間に、この様式で反応器３０６、３０８、および３１２に溶媒を噴霧することが一般に推奨される。）

【0055】

上述のように、活性化反応器３０７を出る溶液は、出口底部ポートおよび接続されたチューブを介して出る。この出口ラインの流れには、任意選択で、フローセンサ４０９、流れを制御する１つ以上の弁４１１、およびポンプ４１３があってもよい。さらに、出口ラインは、溶液が廃棄物４１９または第１、第２、および／もしくは第３の反応器３０６、３０８、３１２に誘導され得るように、ラインを通る溶液の流れを選択的に制御する自動化を可能にする１つ以上の弁４１５を含んでもよい。（一般に、システム３００は、第２および第３の反応器３０８、３１２が第１の反応器３０６と直列になるように作動し、したがって流れは最初に第１の反応器３０６に向かうが、弁４１５（３方向弁（または２方向弁もしくは４方向弁など））によって所望により使用者がこの流れを制御し、変更することができる。）

【0056】

このシステム３００で使用される第１、第２および第３の反応器３０６、３０８および３１２は、上述のものと類似および／または同一である。これらの反応器３０６、３０８、および３１２はそれぞれ、任意選択で、撹拌器４２１および温度センサ４２３を含んでもよい。反応器である第１、第２および第３の反応器３０６、３０８および３１２は、ペプチドを構築するための基質として機能する樹脂を含む。この樹脂は、容器３７１からの脱保護試薬を介して脱保護され、次いで活性化アミノ酸溶液（反応器３０７で活性化された）と反応し、それによってこのアミノ酸を配列／樹脂にカップリングし得る（ＳＰＰＳ技術を使用）、保護されたＮ－基を含む。このようなステップを連続して行うことにより、所望によりタンク３０１からの異なるアミノ酸が添加され得る。

【0057】

上述のように、第１の反応器３０６、第２の反応器３０８、および第３の反応器３１２は、直列に配置され得る。したがって、上で概説した様式で、第１の量の活性化されたアミノ酸が第１の反応器３０６で反応され、次いでその量が第２および第３の反応器３０８、３１２に順次送られる（そして新たな量の活性化された溶液が第１の反応器３０６に添加される）。この流れを促進するために、各反応器３０６、３０８、３１２は、固体ペプチド樹脂ビーズおよび／または固体形成ペプチドが反応器３０６、３０８、３１２内に留まることを確実にするためのフィルタ４２７を含み得る。フローセンサ４３３、弁４３７、およびポンプ４３５は、第１、第２、および第３の反応器３０６、３０８、３１２の間でのこの「連続的」流れを誘導するために、任意選択で、および／または必要に応じて使用され得る。同様に、サンプリングデバイス４４１は、システム３００を通って流れているものをサンプリングしてシステム３００が正しく動作していることを確認する、または廃棄物ストリームをチェックしていつ洗浄すれば十分であるかを決定するために、システム全体の任意の場所に（または所望により複数のサンプリングデバイス４４１を）配置することができる。

【0058】

図３の実施形態では、弁４３７は、第１、第２および第３の反応器３０６、３０８、３１２の出力が連続的に順次流れることができるように、および／または廃棄物４１９に向かうことができるように設計され得ることに留意されたい。これは、自動化が所望の流れを制御し得るように行われる。さらに、図３では、第３の反応器３１２からの出力ラインが、廃棄物４１９に向かうことが示されている。上述のように、実施形態は、反応器３０６、３０８、および３１２ならびに／または活性化反応器３０７が溶媒で洗浄されるときに溶媒が再使用され（そして反応器に送り返され）、それによってシステムをより環境に優しくするように設計され得る。同様に、活性化されたアミノ酸溶液は、第１、第２および第３の反応器３０６、３０８および３１２を通って流れ、次いで反応を再度実行する手段として同じ反応器（および／または活性化反応器３０７）を通って再び（必要に応じて複数回）リサイクルされ得る（ただし、これが望ましい場合は、反応を並行して実行することが推奨される）。例えば、樹脂が「洗浄」されているときの各特定のアミノ酸の添加の間に、通常、この洗浄は１０の異なる洗浄ステップで行われる。その場合、最初の２～８回の洗浄は、以前に使用された溶媒で行うことができ（この溶媒には不純物が含まれている可能性があるが、最初のバッチの洗浄には十分「清浄」である）、続く最後の洗浄（２～８回）は純粋な溶媒で行うことができる。最後の２～８回の洗浄からの洗浄溶媒は、次のサイクルの最初の２～８回の洗浄に使用するためにリサイクル容器に集められる。このようにして、洗浄方法全体で使用される溶媒の量が削減される。

【0059】

ここで図４を参照すると、図１～３の実施形態と併せて使用され得るオンラインＬＣＭＳシステムであるシステム５００が示されている。具体的には、システム５００は、上で概説した反応器内の溶液および固相樹脂結合ペプチド試料の測定を行うように設計されており、それによって操作者にシステム内で何が起こっているかについてのリアルタイム情報を提供する。

【0060】

システム５００は、切断溶液タンク５０３を含む。多くの実施形態では、この切断溶液はＴＦＡであり、形成されたペプチドを樹脂から切断する（したがって形成されたペプチドを樹脂から抜き取る）ように設計されている。ＴＦＡは、カップリング反応をクエンチするためにも機能する。図４に示すように、弁５１８ｐ、５１８ｑ、および５１８ｓは、システムへのＴＦＡ溶液（または切断溶液）の流れを制御するように機能する。（窒素供給源５２２に接続された弁５１８ｒとともに）オーバーフロー容器５０９および測定ゾーン５１１とともにライン５０８を含む切断オーバーフローゾーン５０７が存在してもよい。このシステム５０７は、所望の量のＴＦＡを測定し、過剰分をすべて貯蔵容器５０３に戻すように設計されている。当業者は、ＴＦＡ溶液の流れを制御するために、これらの安全機能および／または流れ機能をどのように実装するかを理解するであろう。これは、１つ以上の弁５１８の使用を伴い得る。

【0061】

システム５００はまた、混合ポット５１０（５００ｍＬの容器であってもよい）を含む。混合ポット５１０は、弁５１８ａによって制御される溶媒ライン５１２から反応器溶媒（ＤＭＦであってもよい）からのスラリー試料を受け取ることができる。これらのライン５１２（弁５１８ｂおよび５１８ａとともに）は、反応器（活性化反応器であるか、または上述の第１、第２もしくは第３反応器であるかを問わず）からスラリーを取り出すことを可能にする。ライン５１２は、１／８インチの内径および１／４インチの外径を有し得る。ライン５１２および弁５１８ａおよび５１８ｂはまた、（窒素供給源５２２からの）ガスをシステムに加えること、ならびに「ポンプアラウンド」ループを可能にする。弁５１８ａはまた、材料が反応器リターン５２４に流れ、反応器５２５から流れることを可能にする。弁５１８ｂは、ＤＭＦ（溶媒）が所望によりヘッダ５２６から得られることを可能にする。ライン５１２の目的は、ポット５１０に添加され得るように、反応スラリーの試料（例えば１ｍＬなど）を採取することである。弁は、スラリーがポンプに到達せず、樹脂ビーズの粉砕を防止するように、材料が反応器５２５から流出する（また必要に応じて上方に流れる）ことを確実にするために使用され得る。したがって、弁を切り替えて窒素を使用することによって、ポンプ内で樹脂を粉砕することなく、スラリーを抽出し、残りを逆方向にポンピングすることにより反応器５２５に戻すことができる。当業者は、それを行う方法を理解するであろう。

【0062】

スラリー試料に加えて、混合ポット５１０への別の供給は、必要に応じて溶媒または他の材料を加えて１ｍＬ試料を希釈する希釈剤供給源５２０からのものである。この希釈剤供給源５２０は、ライン５２８を介して混合ポットに接続される。希釈剤オーバーフローシステム５２７もまた使用され得る。このシステム５２７はまた、（窒素に接続された弁５１８ｅおよび５１８ｌとともに）オーバーフロー容器５２９および測定ゾーン５２１とともにライン５２８を含む希釈剤オーバーフローゾーン５２９を含み得る。弁５１８ｈは、オーバーフロー容器５２９への流れを制御する。この希釈剤オーバーフローシステム５２７は、所望の量の希釈剤を測定し、すべての過剰分を貯蔵容器５２０に戻すように設計されている。当業者は、希釈溶液の流れを制御するために、これらの安全機能をどのように実装するかを理解するであろう。

【0063】

混合ポット５１０に入ると、切断され希釈された試料は、ライン５４０を通って弁５１８ｍに流れる。このライン５４０は、材料（一般に樹脂から切断されたペプチドまたは成長アミノ酸配列である）を分析のためにＨＰＬＣ５４４に送る。液体から気泡を重力によって分離し、必要に応じて試料を保存するために、保存ポット５４１（３００ｍＬの容器であってもよい）がＨＰＬＣの上流で使用されてもよい。

【0064】

混合ポット５１０は、所望により、ライン５５０（および弁５１８ｊ）に取り付けられ、混合ポット５１０を通気することができる。圧力または温度センサ（または他のセンサ）などのセンサ５５１は、このライン（またはシステム５００の他の場所に配置されている場合はシステム全体）の状態を測定することができる。圧力センサ５５１は、自動化されたシーケンスにおいて、いつ次のステップに進むべきかの指標として使用される。

【0065】

一般に、混合ポット５１０内で３０分間混合してペプチドの脱保護のための時間を確保した後（および希釈後）、ライン５５５を介して混合ポット５１０から材料を抽出し、弁５１８ｋまたはその近くで沈降させることができる。この弁５１８ｋが開かれると、液体および／または使用済みの樹脂ビーズがライン５５５を通って廃棄物５４６に流れ込むことができる。ライン５５５に存在し得るあらゆるＴＦＡを洗浄するための安全機構として、苛性バブラー５５７が使用され得る。必要に応じて、このスクラビングを容易にするために、ライン５６１および弁５６２を介して窒素または他のガスが廃棄物５４６に添加され得る。ノックアウトポット５６９などの他の安全機能も追加され得る。ノックアウトポット５６９は、バブラー液がシステムに吸い戻されないように設計されている。図４に示すように、このノックアウトポット５６９はまた、ライン５８０を介して、５６９、５４６、および５５７を不活性に保つために窒素または他のガスを供給する窒素供給源５８１に接続され得る。

【0066】

当業者は、反応器からのサンプリングが、図４に概説されたシステム５００を使用してサンプリングされるべき頻度を理解するであろう。いくつかの実施形態では、カップリング反応が進行している間、サンプリングは、４５分毎などの定期的な間隔で行うことができる。他の状況において、６０分毎、または洗浄ステップ中など、他の間隔でサンプリングが行われてもよい。当然ながら、当業者は他のサンプリング頻度を設計することができる。

【0067】

他の実施形態では、活性化反応器の内容物が第１の反応器に添加される前に、活性化反応器からのサンプリングが自動的に行われてもよい。この理由は、活性化反応器に追加された（そしてその後、第１、第２、および第３の反応器に追加される）アミノ酸が所望のアミノ酸であること、例えばシーケンスの次のアミノ酸であることを検証するためである。この理由は、例えば、２５のアミノ酸が既に一緒に反応し、「間違った」アミノ酸が追加された場合、ペプチド配列全体が間違っており、ペプチドの合成を一から（最初から）やり直す必要があるためである。したがって、このエラーを防ぐために、カップリング反応に入る前にアミノ酸が自動的にサンプリングされ、「間違った」アミノ酸が追加される可能性が最小限に抑えられる。

【0068】

ここで図５を参照すると、図１に示される反応器１０６、１０８、および１１２の斜視図が示されている。図５に見られるように、樹脂１２０は多孔質であり、したがって活性化エステル溶液（本明細書で概説される）の一部が細孔に吸収され、本明細書で概説されるように反応を継続することができる。

【0069】

本実施形態のさらなる態様は、オンラインＬＣＭＳシステムを第１の反応器とともに使用できることである。これは、本明細書で概説されるタイプの直列反応器システムの第１の反応器とともに使用される、本明細書で説明されるオンラインＬＣＭＳシステムであり得る。オンラインＬＣＭＳシステムが、いくつかの実施形態ではバッチ反応器であり得る単一の反応器とともに使用される他の実施形態が設計され得る。ＬＣＭＳシステムの利点は、正確な試料（１ｍＬなど）を反応中の様々な時点（反応の開始時、反応中、および／または終了時など）で自動的に抽出され得ることである。使用者は、試料が自動的に抽出されるときをプログラムできてもよい。抽出された試料は、反応がどのように進行しているか、および反応が完了しているかどうかをテストするために使用され得る。そのようなサンプリングは、活性化中、反応ステップ中、および／または洗浄ステップ中に行われてもよい。このＬＣＭＳを使用することにより、カイザーテスト（典型的には、ペプチドカップリングの進行状況を監視するために使用される）が不要となり得る（したがって、コストおよび時間が節約され得る）。サンプリングは、反応のリアルタイム監視も提供し得、これは生産規模で特に有益となり得る。現在、（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏサンプラー）などのサンプラーがあるが、この装置はＳＰＰＳ反応器では使用されず、切断および脱保護、希釈、混合、使用済み樹脂ビーズからの分離、ＬＣＭＳへの輸送、およびＬＣＭＳ切り替えループへの装填のためのデバイスおよび方法を含んでいない。図４に示すオンラインＬＣＭＳシステムの自動シーケンスの詳細な手順は次の通りである。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【実施例】

【0070】

実施例１
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によるチルゼパチドの構築
チルゼパチド（図６）は３９アミノ酸の主鎖を含み、その合成は線形固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって達成される。チルゼパチド合成は、図７に示すように、以下に説明する直列反応器法を使用して、最初に３９ｍｅｒ主鎖中間体を構築することによって進行する。チルゼパチド合成の過程で、３９－ｍｅｒ主鎖中間体（図７）は、セリン－３９に結合した－ＮＨ_２基を介して固体支持体（本明細書に記載のＳｉｅｂｅｒ樹脂）に結合することに留意されたい。

【0071】

表１は、３９アミノ酸のそれぞれがチルゼパチド主鎖の構築に使用される順序を示す。例えば、セリンは主鎖合成で使用される最初のアミノ酸であり、チルゼパチドの３９位に存在するアミノ酸である。Ｓｅｒ３９からＡｉｂ２までの線形ＳＳＰＳで使用される各アミノ酸の窒素は、α－窒素上のｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）によって保護されているＴｙｒ１を除いて、α－窒素上の９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によって保護されている。表１に示されている側鎖保護基では、酸素はｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）で保護され、窒素はトリチル（Ｔｒｔ）、１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）－３－メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）、またはＢｏｃで保護されている。

【表2-1】

【表2-2】

【0072】

直列反応器法
ＤＭＦ中のピペリジンの２０体積％溶液を次のように調製する：ピペリジン（８００ｍＬ）をＤＭＦの添加により４．０Ｌの体積まで希釈し、２０体積％の溶液を得る。

【0073】

ＤＭＦ中のオキシマの０．６８Ｍ溶液を次のように調製する：４．０Ｌの体積までＤＭＦ中にエチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート（オキシマ、３８６．８５ｇ、２．７２２ｍｏｌ）を溶解して０．６８Ｍ溶液を得、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0074】

ＤＭＦ中のＤＩＣの０．６０Ｍ溶液を次のように調製する：４．５Ｌの体積までＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（３４０．８ｇ、２．７００ｍｏｌ）をＤＭＦに溶解して０．６０Ｍ溶液を得、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0075】

ＤＭＦ中のセリンの０．３７５Ｍ溶液を次のように調製する：ＤＭＦで３．０Ｌの体積までＦＭＯＣ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（４３１．３ｇ、１．３１８ｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、振って溶解し、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。同様の様式で、表１に示す各アミノ酸の０．３７５Ｍ溶液を調製する。

【0076】

反応システムを次のように準備する：３つの同じサイズの反応器にフィルタスクリーンを装備し、溶液が排出されたときに固体樹脂を保持する。反応器「ＲＢ１」、「ＲＢ２」、および「ＲＢ３」にラベルを付け、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（５００ｇ、０．７０ｍｍｏｌ／ｇ、３５０ｍｍｏｌ）を反応器に均等に分割する。各反応器に１５００ｍＬのＤＭＦを添加し、室温で２４時間撹拌して樹脂を膨潤させる。

【0077】

一般手順Ａ－Ｆ－ｍｏｃ脱保護およびＤＭＦ洗浄プロセス：ＲＢ１にピペリジンの溶液（ＤＭＦ中２０体積％、１３６５ｍＬ）を添加し、室温で３０分間撹拌する。ＲＢ１からＲＢ２にピペリジン溶液をポンピングし、次いでピペリジン溶液（ＤＭＦ中２０体積％、１３８６ｍＬ）の別の部分をＲＢ１に投入し、反応器ＲＢ１およびＲＢ２を３０分間撹拌する。撹拌時間の終わりに、ＲＢ２からＲＢ３にピペリジン溶液をポンピングし、ＲＢ１からＲＢ２にピペリジン溶液をポンピングし、次いでＲＢ１にピペリジン溶液（ＤＭＦ中２０体積％、１４０７ｍＬ）の別の部分を投入する。室温で３０分間３つすべての反応器を撹拌する。ＲＢ３から廃棄物にピペリジン溶液をポンピングし、次いでＲＢ２からＲＢ３にピペリジン溶液をポンピングし、次いでＲＢ１からＲＢ２にピペリジン溶液をポンピングする。ＲＢ２およびＲＢ３を室温で３０分間撹拌する。ＲＢ３から廃棄物にピペリジン溶液をポンピングし、次いでＲＢ２からＲＢ３にピペリジン溶液をポンピングする。ＲＢ３を室温で３０分間撹拌し、次いでＲＢ３から廃棄物にピペリジン溶液をポンピングする。このようにして、ピペリジン溶液を直列の３つの反応器に３回ポンピングし、それぞれ３０分間撹拌した。

【0078】

ピペリジン溶液の３つすべての割り当てを３つすべての反応器を介して撹拌および廃棄物収集に送られた後、ＲＢ１にＤＭＦ（１２１８ｍＬ）を添加し、室温で５分間撹拌する。次いで、ＲＢ１からＲＢ２に溶媒をポンピングし、ＲＢ１にＤＭＦ（１２０８ｍＬ）を添加する。両方の容器を室温で５分間撹拌する。ＲＢ２からＲＢ３に、およびＲＢ１からＲＢ２に溶媒をポンピングする。ＤＭＦ（１７５８ｍＬ）をＲＢ１に追加し、３つの容器すべてを室温で５分間撹拌する。ＤＭＦ溶媒の割り当て分が直列の３つの反応器を通してポンピングされるまでこの同じ手順を繰り返し（毎回ＲＢ３から廃棄物にＤＭＦ溶媒をポンピングする）、合計１２．６６Ｌ（１１．９５ｋｇ）のＤＭＦを使用して反応器当たり合計８回の洗浄を行う。平均ＤＭＦ洗浄体積は１５８０ｍＬである。目標洗浄体積は洗浄当たり１４００ｍＬであるため、ペプチド合成の後続のアミノ酸では、後続の投入量が１４００ｍＬに近づくようにポンプおよび供給タンクの圧力を調整する。

【0079】

一般手順Ｂ－アミノ酸活性化およびカップリングプロセス：「ＲＡ」とラベル付けされたジャケット付き反応器に、セリン溶液（ＤＭＦ中０．３７５Ｍ、７７４ｇ）、オキシマ溶液（ＤＭＦ中０．６８Ｍ、４２２ｇ）、次いでＤＩＣ溶液（ＤＭＦ中０．６０Ｍ、５０６ｇ）を添加する。溶液を１５℃で３０分間撹拌して活性化セリン溶液を得、次いでこの溶液をＲＢ１に添加する。このプロセスを繰り返して、反応器ＲＡで活性化セリン溶液を調製してそれをＲＢ２に添加し、次いでプロセスを再び繰り返して活性化セリン溶液をＲＢ３に添加する。３つの反応器のそれぞれは、カップリング反応中、約２２００～２３００ｍＬの総スラリー体積を有し、これは、活性化エステル溶液に膨潤した樹脂の体積を加えたものに等しい。反応器ＲＢ１、ＲＢ２、およびＲＢ３を室温で８時間撹拌し、３つの反応器すべてから溶媒を排出する。

【0080】

一般手順Ａと同様の様式で、反応器ＲＡ、ＲＢ１、ＲＢ２およびＲＢ３をＤＭＦ溶媒で連続して各反応器当たり合計７回洗浄する。最初の３回の洗浄液は、ＲＢ１にポンピングされる前にＲＡのスプレーボールポンピングされる。したがって、最初の３回の洗浄液は、ＲＡ、ＲＢ１、ＲＢ２、およびＲＢ３を順番に通過する。しかしながら、ＲＡから各洗浄液をポンピングする場合、少量の溶媒すすぎ液がＲＡからＲＢ３（約３０ｍＬ）にポンピングされ、次いで少量の溶媒すすぎ液がＲＡからＲＢ２（約３０ｍＬ）にポンピングされ、次いで溶媒の大部分がＲＢ１にポンピングされ（約１３４０ｍＬ）、続いてＲＡとＲＢ３との間のチューブがポンピングにより清浄化され、ＲＡとＲ２との間のチューブがポンピングにより清浄化される。これにより、ＲＡと樹脂反応器のそれぞれと間の移送チューブおよび弁が洗い流され、清浄化される。次いで、４回目から７回目の洗浄では、少量のＤＭＦ溶媒がＲＢ３のスプレーボールからポンピングされ（１００ｍＬ）、次いで少量のＤＭＦ溶媒がＲＢ２のスプレーボールからポンピングされ（１００ｍＬ）、次いで１４００ｍＬのＤＭＦ溶媒がＲＢ１のスプレーボールからポンピングされた。目的は、各反応器の壁から固体樹脂粒子をすすぎ落とすことである。カップリング後の洗浄に使用される溶媒の総量は、１０．６９Ｌ（１０．０９ｋｇ）である。３９ｍｅｒペプチド主鎖合成の後半のアミノ酸の場合、スプレーボールからＲＢ２およびＲＢ３に噴霧されたＤＭＦの量は、約５０ｍＬに低減される。

【0081】

プロリン３８からＢｏｃ－チロシン１までの表１に列挙されている各アミノ酸については、一般手順Ａを使用して以前にカップリングされたアミノ酸のＦｍｏｃ脱保護を行い、続いて一般手順Ｂを使用してカップリングする。セリン３９、および次の３８アミノ酸のカップリングについは、表２に列挙されている化学量論で一般手順Ｂを使用する。表２に示されている場合、追加の活性化エステルを調製し、一般手順Ｂに従って表２に示す化学量論で再カップリングする。９９％超の変換が達成されるまで、カップリング反応物を撹拌する。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0082】

カップリング後、平均１０回のＤＭＦ洗浄が使用される（表８を参照されたい）。製造工程では、時間および溶媒を節約するために７回の洗浄を行うことが推奨される。

【0083】

３７位のプロリンカップリングから始めて、オンラインＬＣＭＳ用の自動化試料を採取する。固体樹脂を含有する自動化試料は、１５、７５、１８０、３２４、５０３、および６８４分でＲＢ３からカップリングステップに採取される。自動化試料はまた、脱保護ステップ中にＲＢ３から様々な時点で採取される。各試料について、１．０ｍＬのスラリー試料が自動ポンプおよび弁によって反応器から採取される。試料を２５ｍＬのＴＦＡで希釈し、３０分間の反応時間の間断続的に混合し、樹脂ビーズからペプチドを切断し、ペプチドから保護基を除去する。次に、試料を７５ｍＬの４：１ ＤＭＳＯ：アセトニトリルと混合する。希釈した溶液を２μＬ ＬＣ切り替えループに装填し、カラムに注入する。

【0084】

ＬＣＭＳによって決定される９９％以上の変換を達成するために、ＤＭＦ中２０％ピペリジンの洗浄回数および撹拌時間を調整する。Ｓｅｒ３９からＬｅｕ２６の場合、ＤＭＦ中２０％ピペリジンの撹拌時間は３０分であり；Ｔｒｐ２５およびＧｌｎ２４の場合４０分であり；Ｖａｌ２３からＬｅｕ１４の場合５０分である。Ａｉｂ１３の場合、５回の洗浄液を５０分間撹拌し、さらに３回の洗浄液を９０分間撹拌する。残りのアミノ酸（Ｉｌｅ１２からＢｏｃ－Ｔｙｒ１まで）については、ＤＭＦ中２０％ピペリジンの最初の３回の洗浄を２０～３０分撹拌し、次いで、４回目のピペリジン洗浄液が直列の第１の反応器に入ったときにさらに長い時間撹拌する。Ｐｒｏ３６およびＧｌｙ３４の場合、一般手順Ａに概説されているように、追加の脱保護および洗浄ステップを実行する。一般に、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで３０分間の撹拌を３回行えば、９９％以上の変換を達成するのに十分であり、これはこの手順の製造工程における時間、溶媒、および試薬を節約することに留意されたい。

【0085】

次のアミノ酸とのカップリング手順を実行する前に、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって洗浄液ストリームが６００ｐｐｍ未満のピペリジンを含むことを確認するために、ピペリジン脱保護ステップの後にＤＭＦ洗浄の回数を調整する。ピペリジン脱保護ステップ後に使用される平均洗浄回数は１１回の洗浄である（表７を参照されたい）。一般に、これは１０回の洗浄で達成されるため、製造工程ではピペリジン脱保護ステップの後に１０回のＤＭＦ洗浄を使用することが推奨される。

【0086】

表３は、オンラインＬＣＭＳ試料時間、および３９－ｍｅｒペプチド主鎖合成全体で計算された％変換を示す。図４は、オンラインＬＣＭＳの自動サンプリング、切断、脱保護、希釈、および装填カートのプロセスおよび計装図を示す。

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表4-6】

【表4-7】

【表4-8】

【表4-9】

【表4-10】

【表4-11】

【0087】

３９ｍｅｒペプチド合成中のオンラインＬＣＭＳ自動サンプリングシステムにいくつかの改良を加える。これは、固形物の詰まりおよびキャリーオーバーに関する問題のトラブルシューティングのためである。Ｐｒｏ３７からＳｅｒ３３まで、サンプリングは反応器と３方向サンプリング弁との間に位置する蠕動ポンプにより達成される。しかしながら、ポンプは樹脂を粉砕し、ＲＢ３から液体を空にするときに濾過速度を遅くする微細な固体を生成する。樹脂試料のポンピング時間を短縮し、ポンプを三方弁の後ろに移動して、樹脂が実際にポンプに入らないようにする。Ａｌａ２１カップリングおよびその後のすべてのカップリング中に、各試料の後に２つの自動３方向スラリー試料弁をＤＭＦ溶媒で洗い流す機能をインストールするようにシステムを修正する。３方向試料弁が、各シーケンスの最後に反応器に洗い流されない固形物で詰まるのを防ぐために、ＤＭＦが試料弁を通って脱保護ミックスポットに洗い流され、弁５１８ｋから廃棄される（図４）。

【0088】

合成中の間隔で、上記のように分析のために樹脂の試料を取り出し、オフラインでさらに研究するためにも試料を採取する。物質収支に基づきｍｍｏｌで表される、各反応器内の樹脂の残りの量を表４に示す。したがって、脱保護、脱保護後のＤＭＦ洗浄、アミノ酸カップリング、およびカップリング後のＤＭＦ洗浄のためにシステムに投入される材料の量は、各ステップで残留する樹脂の量に合わせて調整される。製造工程では、オフライン分析のために大量の試料が採取される可能性は低く、樹脂のｍｍｏｌ基準は劇的には変化しないことに留意されたい。

【表5-1】

【表5-2】

【0089】

アミノ酸カップリングステップで使用するアミノ酸およびカップリング試薬溶液の質量を表５に示す。

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0090】

ピペリジン脱保護後の選択されたＤＭＦ洗浄液においてＧＣによって測定されたピペリジンの濃度を、表６に示す。

【表7-1】

【表7-2】

【表7-3】

【表7-4】

【表7-5】

【表7-6】

【0091】

３９－ｍｅｒ主鎖中間体（図７）の合成を通して脱保護に使用されるピペリジン溶液洗浄およびＤＭＦ洗浄の回数および質量を、表７に示す。また、表７には、樹脂１ｍｍｏｌ当たりに使用されるこれらの溶液の質量（ｇ）の計算も示されている（表４に列挙されているように、各ステップに存在する樹脂のｍｍｏｌで質量を割ることによって決定される）。

【表8-1】

【表8-2】

【0092】

樹脂１ｍｍｏｌ当たりに使用されるカップリング試薬の質量（ｇ）、アミノ酸カップリング後のＤＭＦ洗浄の回数、および３９ｍｅｒ主鎖中間体の合成を通して樹脂１ｍｍｏｌ当たりの洗浄に使用されるＤＭＦの質量（ｇ）（図７）を、表８に示す。表７のように、表８の樹脂１ｍｍｏｌ当たりに使用される材料の質量（ｇ）は、表４に列挙されているように、各ステップに存在する樹脂のｍｍｏｌで質量を割ることによって決定される。

【表9-1】

【表9-2】

【0093】

表９は、３９アミノ酸主鎖中間体（図７）の合成中に反応容器に投入された材料の総量を示す。表９は、ピペリジン／ＤＭＦ脱保護およびその後のＤＭＦ洗浄、アミノ酸カップリングステップおよびその後のＤＭＦ洗浄、ならびにＳｉｅｂｅｒ樹脂の合計を含む。

【表10】

【0094】

Ｂｏｃ－Ｔｙｒ１のカップリング後、樹脂に結合したペプチドを３つすべての反応器から取り出し、塩化メチレンで洗浄することにより脱膨潤させ、乾燥させる。残りのステップは、自動化された直列の反応器ではなく、バッチ容器で手動で行う。製造工程では、この時点で樹脂を反応器から取り出さず、次のステップを直列の反応器で行う。これにより、必要な試薬および溶媒の量が削減される。

【0095】

Ｌｙｓ２０から－ｉｖＤｄｅ保護基を除去するために、ヒドラジン水和物（５．３４ｇ、６８．３ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１６５ｇ）を２Ｌのジャケット付きフィルタ反応器内で窒素下で混合し、次いで乾燥樹脂（５０．０ｇ、７．２４ｍｍｏｌ）を添加する。２０℃で６時間撹拌し、次いで樹脂をＤＭＦ（５×５００ｍＬ；洗浄液体積は約１００ｍＬで十分であることが推奨される）で洗浄し、洗浄毎に５分間撹拌する。

【0096】

脂肪酸／リンカーのカップリングのために、２５０ｍＬの丸底フラスコに式Ｉの酸（３，６，１２，１５－テトラオキサ－９，１８－ジアザトリコサン二酸、２２－｛［２０－（１，１－ジメチルエトキシ）－１，２０－ジオキソエイコシル］アミノ｝－１０，１９－ジオキソ－，２，３－（１，１－ジメチルエチル）エステル、（２２Ｓ）；９．５ｇ、１１ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰＹＢＯＰ；５．７ｇ、１１ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（５０ｇ）を投入することにより、活性化エステルを調製する。

【化1】

【0097】

混合物を２０分間撹拌して溶解し、次いで２，４，６－トリメチルピリジン（１．２９ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）を添加する。活性化エステル混合物を１３．５～１５．８℃で２０分間撹拌し、次いで２５℃で反応器ジャケット付きのフィルタ反応器内の樹脂に加え、追加の５ｍＬのＤＭＦを使用してすすぎ、フラスコから移す。スラリーを２９時間撹拌し、樹脂を排出してＤＭＦ（４×３００ｍＬ；洗浄液体積は１００ｍＬで十分なはずである）で洗浄し、洗浄毎に５分間撹拌する。以前と同様に調製した活性化エステルの別のバッチを反応混合物に添加し、２５℃で１９時間撹拌する。樹脂を排出し、ＤＭＦ（４×３００ｍＬ；洗浄液体積は約１００ｍＬで十分なはずである）および塩化メチレン（４×３００ｍＬ；洗浄液体積は１００ｍＬで十分なはずである）で洗浄し、洗浄毎に４分間撹拌する。使用したＰＹＢＯＰのロットは最適な品質ではないことが判明したため、別のバッチの活性化エステル（新しいＰＹＢＯＰの瓶を使用して、５０ｇのＤＭＦで以前のように試薬スケールの３分の１で調製）を反応混合物に添加し、２５℃で１８時間撹拌する。樹脂を排出し、ＤＭＦ（４×３００ｍＬ；洗浄液体積は約１００ｍＬで十分なはずである）およびイソプロパノール（４×３００ｍＬ；洗浄液体積は１００ｍＬで十分なはずである）で洗浄し、洗浄毎に５分間撹拌する。製造工程では、ＰＹＢＯＰは高品質であるべきであり、式Ｉの中間体のカップリングには活性化エステルを１回だけ使用するべきである。樹脂を真空中４０℃で一晩乾燥させる。

【0098】

切断カクテルを次のように調製する：ジチオスレイトール（ＤＴＴ；１２．３３ｇ、７９．９３ｍｍｏｌ）および水（１７．６３ｇ）を５Ｌ丸底フラスコ内で合わせる。ガラス製圧力瓶にＴＦＡ（５３８ｇ、４７２０ｍｍｏｌ）を投入し、５～１０ｐｓｉｇの窒素で４回の圧力パージサイクルで不活性化する。２分間隔で５Ｌ丸底フラスコに２０ｇ分量ずつ６０ｇの不活性ＴＦＡを添加し、残りのＴＦＡを５Ｌ丸底フラスコに２分にわたり追加する。トリイソプロピルシラン（９．３７ｇ、５９．２ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（５１ｇ）を５Ｌ丸底フラスコに添加し、混合物を１５℃に冷却する。

【0099】

樹脂からペプチドを切断して脱保護するには、乾燥樹脂をフィルタ反応器に投入し、塩化メチレンですすぐ。フィルタ反応器内の樹脂に切断カクテルを添加し、４．５時間撹拌する。樹脂から反応溶液を排出し、切断カクテルを調製した５Ｌ丸底フラスコに添加する。塩化メチレン（２０６ｇ）を樹脂に添加し、５分間撹拌し、溶液を排出して、５Ｌ丸底フラスコに添加する。得られた混合物を撹拌し、－１５℃のジャケット設定温度で冷却する。窒素を１５分間吹き込むことにより不活性化したＭＴＢＥ（７５４ｇ）を１．５時間かけて添加し、続いて緩やかな窒素パージ下に維持する。スラリーを－８℃に加温して１時間撹拌し、次いで０℃に加温して１時間撹拌する。完全に乾燥させずにスラリーを窒素下で濾過し、次いで固体をＭＴＢＥ（２×１５５ｇ）で洗浄し、真空乾燥して、ＨＰＬＣによって決定される４０．９％効力で粗チルゼパチド（３８．７ｇ）を得る。－ｉｖＤｄｅ脱保護、式Ｉの酸とのカップリング、および樹脂の切断の過程で、出発樹脂の合計０．３４ｍｍｏｌを構成する混合物から試料を採取する。これとＨＰＬＣ効力とを考慮すると、このプロセスでのチルゼピチドの粗収率は４８％である。

【0100】

バッチプロセス法
比較のために、チルゼパチドのバッチ製造プロセスを説明する。Ｆｍｏｃ Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（１７ｋｇ、０．７６ｍｍｏｌ／ｇ）を反応器に充填する。樹脂をＤＭＦで膨潤させ、２時間撹拌し、次いで樹脂を濾過してＤＭＦを除去する。次いで、樹脂をＤＭＦで合計２回洗浄する。次いで、Ｆｍｏｃ保護樹脂を２０％ＰＩＰ／ＮＭＰ処理を使用して脱保護する。Ｆｍｏｃ除去を確認するためのサンプリングは、最終的なＰＩＰ／ＮＭＰ処理の後に行い、ＵＶ分析によって９９％超Ｆｍｏｃ除去を確認する。最終的な２０％ｗ／ｗのＰＩＰ／ＮＭＰ処理後、樹脂床をＤＭＦで複数回洗浄する。次いで、各アミノ酸のカップリングおよび脱保護について以下の一般的な条件を使用して、ペプチド主鎖を構築する。

【表11】

【0101】

Ｆｍｏｃの脱保護：
ペプチド反応器内の樹脂は、２０％ｖ／ｖのＰＩＰ／ＮＭＰ溶液を３回または４回充填して処理する。各処理を樹脂上で３０分間撹拌した後、濾過してＦｍｏｃ保護基の除去を完了する。最終的な２０％ｖ／ｖのＰＩＰ／ＮＭＰ処理後、樹脂床を事前に指定されたＤＭＦ体積充填のＤＭＦで最低６回洗浄する。

【0102】

アミノ酸活性化：
１２％ｗ／ｗのＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅ／ＮＭＰの事前に調製された溶液を反応器に投入する。次いで、選択したＦｍｏｃアミノ酸を添加する。Ｆｍｏｃアミノ酸が完全に溶解するまで混合物を２０±５℃で撹拌する。次いで、わずかな発熱活性化反応を確実に制御するために、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／Ｏｘｙｍａ Ｐｕｒｅ／ＮＭＰ溶液を活性化の前に１５±３℃に冷却し、結果として生じる溶液温度を２０±５℃の指定範囲に維持する。次いで、アミノ酸溶液をＤＩＣ添加によって活性化させる。次いで、樹脂中間体上のペプチドを含有する反応器に溶液を移す前に、活性化エステル溶液を２０～３０分間撹拌する。

【0103】

カップリング：
前活性化ステップが完了すると、活性化エステル溶液を樹脂上の脱保護されたペプチドを含有する反応器に移送し、カップリング反応を開始する。ペプチドカップリング反応を２０±５℃で少なくとも４時間撹拌する。必要な撹拌時間の後、カップリング完了（ＩＰＣ）のために樹脂スラリーをサンプリングする。合格するＩＰＣ結果が得られるまで、必要に応じて特定の間隔でサンプリングを繰り返す。必要に応じて、再カップリング操作を行う。カップリングが完了したら、ペプチド反応器溶液の内容物を濾過し、次いで樹脂中間体上のペプチドをＤＭＦで数回洗浄して、次のカップリングの準備を行う。

【0104】

Ｉｌｅ（１２）のＡｉｂ（１３）へのカップリング：
Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ（１２）のＡｉｂ（１３）へのカップリングは、６当量のＦｍｏｃ－ＡＡ、３当量のＤＩＣを利用する対称性無水物アプローチを使用して行う。活性化された対称性無水物種の形成を確実にするために、このシーケンスの活性化時間を４０～６０分間延長する。ＨＰＬＣ分析で決定した反応完了（１％未満の非カップリング）を達成するには、カップリング撹拌時間を延長（１８時間）する必要がある。

【0105】

３９アミノ酸主鎖中間体の合成に使用される材料の概要（図７）：
サイクル当たり平均３．１５のピペリジン投入量を、９ｍＬ／ｇ樹脂（密度０．９３ｇ／ｍＬ）で、平均２６．４ｇ／ｇ樹脂で使用する。平均７．２回のＤＭＦ洗浄を、サイクル当たり平均６１．２ｇ／ｇ樹脂で、９ｍＬ／ｇ樹脂（密度０．９４５ｇ／ｍＬ）で脱保護後に行う。アミノ酸カップリングの場合、サイクル当たり平均７．２５ｇ／ｇ樹脂で、サイクル当たり平均７．２５ｍＬ／ｇ樹脂のカップリング溶液を使用する（密度約１ｇ／ｍＬ）。カップリング後、平均５回のＤＭＦ洗浄を、サイクル当たり平均４２．５ｇ／ｇ樹脂で、９ｍＬ／ｇ樹脂（密度０．９４５ｇ／ｍＬ）で行う。

【0106】

各サイクルの合計で、樹脂１グラム当たり平均１３７ｇの材料が使用される。３９アミノ酸主鎖中間体を生成するために３９サイクルを実行すると（図７）、樹脂１グラム当たり５３５６ｇの材料が使用される。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂のモル容量は０．７ｍｍｏｌ／ｇであるため、樹脂１ｍｍｏｌ当たり使用される材料の総質量（樹脂自体の質量を含む）は、約７６５０ｇ／ｍｍｏｌである。

【0107】

Ｌｙｓ－ｉｖＤｄｅ（２０）脱保護、式Ｉへのカップリング、樹脂の切断、粗生成物分離：
Ｌｙｓ－ｉｖＤｄｅの脱保護、式Ｉの酸のカップリング、樹脂の切断、および粗チルゼパチドの単離のための残りのステップは、基本的に直列反応器の準備について記載したように行う。全体として、４５．３９ｋｇのチルゼパチドが、４５ｗｔ％および６４％のＨＰＬＣ面積パーセントの純度で生成される。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂に基づく含有収率＝４７％。

【0108】

方法の比較
同様の粗収率が、チルゼパチドのバッチおよび直列反応器生産によって得られる（それぞれ４７％および４８％）。直列反応器法では、３９ｍｅｒの主鎖中間体を生成するために、出発樹脂１ｍｍｏｌ当たり合計５．４２ｋｇの材料（溶媒および試薬および樹脂）が使用される（図７）。バッチプロセス法では、出発樹脂１ｍｍｏｌ当たり合計７．６５ｋｇの材料が使用される。

【0109】

例：ＤＭＦリサイクルおよび削減された試薬当量を使用した断片の作製
直列設定の３つの反応器を改良し、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ－樹脂であるチルゼパチド主鎖の最初の１０アミノ酸残基を含有するペプチドを合成するために使用したが、Ｓアミノ酸はそれぞれ、ｔ－ブチル基によって保護されている。

【0110】

装置の設定は、図３の蠕動ポンプ（４３５）を圧力伝達システムに置き換えたわずかな調整を除いて、図３に示されているものと同じであった。このシステムは、溶媒をポンピングするのではなく、移送缶を真空に引き、所望の反応器（ＲＢ１、ＲＢ２またはＲＢ３）からの入口弁を開く。圧力センサを使用して、反応器が完全に排出されたときを判断する。これは、缶に溶媒ではなく窒素を引き込み始めると圧力が急速に上昇するためである。次いで、移送缶を加圧し、弁を所望の反応器（ＲＢ２、ＲＢ３または廃棄物／リサイクル）に対して開く。この技術は、反応器のより迅速かつ完全な排出を提供し、その結果、排出後の反応器内の残留溶媒が少なくなり、樹脂の洗浄が改善される。他の違いは、オンラインＧＣ（ガスクロマトグラフ）を追加してピペリジンを測定し、十分な洗浄およびＤＭＦリサイクル瓶を確保することである。

【0111】

図３のシステムとの類似点に関して、３つの反応器を直列に設定し、第１の反応器からの流出物を第２の反応器に、第２の反応器からの流出物を第３の反応器に、そして第３の反応器からの流出物を廃棄物に送った。ただし、洗浄操作のみ連続で行った。この実験では、Ｆｍｏｃ脱保護反応およびアミノ酸カップリング反応の両方に改良された条件も使用した。新しい反応条件により、過剰な試薬の大部分が排除され、一連の脱保護およびカップリング反応を最低限の利益で行うという概念が生まれた。Ｆｍｏｃ脱保護には、ＤＭＦ中２０％ピペリジンの１回の投入のみを使用した。この投入量は、約４体積量に減少した（出発乾燥樹脂の投入量基準）。この時点で、ピペリジンの廃棄物は、単一の反応器に４回以上の独立した９体積量投入量を使用した元のプロセスから約８０％削減される。この操作を連続して行うピペリジンの潜在的な節約は、第３の反応器での脱保護副生成物（ピペリジン－ジベンゾフルベン付加物）の蓄積から生じ得る潜在的な問題に値しないとみなされた。そのため、各反応器は、Ｆｍｏｃ脱保護反応のために独立して操作された。

【0112】

ＰＭＩをさらに最小限に抑えるために、ＤＭＦリサイクル容器を追加するようにシステムを変更した。（ＰＭＩはＰｒｏｃｅｓｓ Ｍａｓｓ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙであり、指定された量の製品を製造するために使用される材料の総質量として定義され、したがって１ｇの製品を製造するための２０００ｇの材料は２０００のＰＭＩである。）リサイクル容器は、Ｆｍｏｃ脱保護後の洗浄の後半を収集するために使用され、すべての洗浄が連続して行われるため第３の反応器の下流にある。例えば、リサイクル容器は１０回の洗浄のうち最後の５回を回収した。収集されたＤＭＦは、１％程度のピペリジン濃度を有する。これは、脱保護反応後の反応器内のピペリジン濃度よりも大幅に低く、収集されたＤＭＦは、その後の洗浄サイクルの前半に使用される。これにより、ＤＭＦの利用効率が向上し、廃棄物ストリーム中の平均ピペリジン濃度が上昇する。試料のキャリーオーバーを避けるためにオンラインＬＣＭＳ機器（前述）を洗浄する必要があるため、洗浄に追加の変更を加えた。ＬＣＭＳ機器の洗浄により、３つの反応器のそれぞれに約８０ｍＬのＤＭＦが得られる。この後、約５０ｍＬの新鮮なＤＭＦのスプレーボールによる迅速洗浄を各反応器に対して行い、壁の樹脂が樹脂ベッドに確実に洗い流されるようにする。オンラインＬＣＭＳおよびスプレーボール洗浄は、直列洗浄プログラムで反応器に統合され、使用されるすべてのＤＭＦは、直列の反応器を介して移送され、最終的なＰＭＩ計算に考慮される。

【0113】

以前の図３では、１つの反応器から次の反応器に材料を移送するのに蠕動ポンプを使用した。蠕動ポンプが反応器から遊離溶媒を完全に排出していない場合がある。これにより、洗浄効率が低下し、ＰＭＩが増加する。したがって、反応器からすべての液体をよりよく排液するために、圧力伝達を使用するように変更を加えた。１つの移送容器が追加し、すべての反応器、廃棄物、およびＤＭＦリサイクル容器に接続した。反応器から移送容器への移送には、自動シーケンスを使用する。移送容器を真空引きし、移送缶の容器底部の間の弁を開く。弁は、移送容器内の圧力が所定の設定値に達すると閉じる。移送容器が加圧され、ターゲット容器の上部につながる弁が開かれ、移送容器内の圧力が設定値を下回るまで移送が行われる。

【0114】

洗浄液のオンライン分析も追加した。洗浄液中の残留ピペリジンを監視できるように、廃棄物ラインにオンラインＧＣを設定した。プログラムは、第３の反応器からの最後の３回の洗浄が分析されるように設定した。さらに、カップリング後の洗浄時に残留アミノ酸の洗浄液をサンプリングするために、オンラインＬＣＭＳを利用した。収率の低下を防ぐために、洗浄試料をトリガーする前に樹脂を沈降させた。浸漬チューブは樹脂の上の液体層にあるため、これにより樹脂がサンプリングされるのが防止された。

【0115】

各サイクルのＰＭＩの正確な計算が得られた。この特定の実験のために、第３の反応器からすべての反応監視試料を採取したが、これは、洗浄効率が低いために残留材料のレベルが最も高いことから、反応が最も遅いと予想されるためである。反応器３での反応が完了すると、３つの反応器すべてが完了すると想定される。これは、各試料が受けるキャリーオーバーの影響がごくわずかであるため、オンラインＬＣＭＳでのキャリーオーバーの問題にも役立つ。キャリーオーバーが５％であると仮定すると、１００％完了したカップリング反応は、前の脱保護反応試料の５％のために９５％の完了しか測定できない場合がある。３つの反応器のそれぞれが連続してサンプリングされる場合、この５％のエラーが試料のそれぞれで広く見られる可能性があり、３時間後でも反応は完了していないように見える。反応器が１つだけサンプリングされた場合、完全な変換を仮定すると、最初の試料の変換は９５％であるが、２番目の試料は９９．７５％の変換となり、反応はわずか２時間後に停止する可能性がある。実験の履歴は、特にＦｍｏｃ脱保護反応に関して、必要以上に長く反応することに関連して品質上の不利益があることを示唆している。反応器を１つだけサンプリングするリスクは、過剰な追加の撹拌時間なしで、反応が完了したときに反応を停止することで生じる潜在的な品質改善に比べて無視できると認識される。

【0116】

この実験では、目標は、１０回の洗浄サイクルを利用してピペリジン濃度を２０００ｐｐｍに低減することであった。ピペリジン脱保護後の洗浄の結果を表１０に示す。モデルを使用して、１０回の洗浄および試料カートの清浄化サイクル後に約２０００ｐｐｍのピペリジンをもたらすのに必要な洗浄液投入量を予測した。シミュレーションでは、以前の樹脂の膨潤およびピペリジン吸着の実験データを利用した。一部の試料は機器の故障により欠落したが、最終サイクルのみを除いて、２０００ｐｐｍの目標は正常に達成された。

【表12】

【0117】

カップリング反応の後、システムを３回の洗浄液投入で連続して洗浄した。その後、同じ試料カートの清浄化手順を使用した。残留ＡＡの十分な定量化方法が開発されていなかったため、ペプチドが成長し、溶媒ホールドアップが増加するにつれて、洗浄液投入毎により徐々に多くのＤＭＦを使用した。

【0118】

直列の第３の反応器で反応の監視を行った。オンラインＬＣ－ＭＳシステムを、前の実験と同様に使用した。脱保護の結果を表１１に示す。定量化の方法論が報告不足に偏っていること、および試料分析が実際の反応より１時間遅れているという事実を理解した上で、反応を停止して続行する前に９８％の変換が望ましかった。２時間の試料が処理されるまでに、すべての脱保護が続行の閾値に達した。処理時間は１時間強である。

【表13】

【0119】

カップリング反応についても同様の監視を行った。結果を表１２に示す。Ｇｌｙ３０を除くすべてのカップリングが、２時間の試料の結果が判明するまでに停止された。Ｇｌｙ３０カップリングの変換率が低いという一般的な理論は、洗浄後に高レベルの残留ピペリジンが存在するというものであった。Ｇｌｙ３０反応のために再カップリングを行い、再カップリングによりカップリング変換率はすぐに９９．２％となり、反応を停止させた。

【表14】

【0120】

この実験の主な焦点は、最小限の原材料で高品質の材料を作製することであった。各サイクルの脱保護に使用される材料の量を表１３に示す。材料量は、各サイクルにつきｇ／ｍｍｏｌで示される。ペプチドのｍｍｏｌはサイクル毎に低減するため、１０サイクルにわたる総材料使用量を合計して最終ミリモルで割っても、開始ミリモルでも正確な数値は得られない。

【表15】

【0121】

脱保護後の洗浄に使用されるＤＭＦを表１４に示す。表１５は、３つの反応器のそれぞれについて各サイクルに使用されるカップリング試薬のモル当量を列挙している。各カップリングサイクルに使用される材料の合計を表１６に示す。表１７は、カップリング後の洗浄に使用されるＤＭＦを示す。

【表16】

【表17】

【表18】

【表19】

【0122】

各ステップからのデータを取得して、現在のバッチ製造プロセスに対して化合物毎および全体としての原材料の使用を比較した概要を作成した。表１８は、カップリング試薬の使用が３７％削減されたのに対し、ピペリジンの使用は８４％削減されたことを示している。洗浄に使用されるＤＭＦは、プロセスで使用される材料の大部分であり、総消費重量の９０％をはるかに超えており、ＤＭＦ消費量の削減がこの実験の主な目標であった。ＤＭＦの使用は、チルゼパチドのバッチ製造プロセスの最初の１０サイクルと比較して７９％削減された。合計で、新しいプロセス技術の実験的な実証では、３５７ｇ／ｍｍｏｌのペプチドが使用された。比較すると、現在のバッチ製造プロセスでは１６９０ｇ／ｍｍｏｌが使用される。これは合計で７９％の削減に相当する。

【表20】

【0123】

材料消費量のほぼ８０％の削減を確立した後、実験の最後の部分は、得られる材料が高品質であることの実証であった。３つすべての反応器からの材料を、ＡＡ Ｒ基上のすべての保護基を維持しながら樹脂からのペプチドのソフト切断に供した。表１９に示されるＨＰＬＣ分析では、３つの反応器すべてで高い品質が示された。若干驚いたことに、品質と反応器との間にはまったく相関がなかった。仮説は、直列の第３の反応器が第１の反応器ほど洗浄されていないため、３つの反応器全体でわずかな純度の低下があるというものだった。この発見は、使用された洗浄戦略が十分ではないことを証明している。理論的には、残留ピペリジンおよびＡＡの洗浄標的を増やすことができ、これにより材料の消費がさらに削減され得る。

【表21】

【0124】

例：ＤＭＦ溶媒中のＳＰＰＳによるテルゼパチド四量体の構築
次のチルゼパチド四量体は、４つのアミノ酸を含む。

【化2】

この四量体は、以下のテキストで説明されるローディング法および直列反応器法により達成される線形固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して合成される。表２０は、チルゼパチド四量体主鎖の合成に使用される４つのアミノ酸の配列を列挙している。四量体中間体の最初のアミノ酸グリシンは、以下に示すように、ローディング法を使用して２－クロロトリチルクロリド（ＣＴＣ）樹脂固体支持体に最初にロードされることに留意されたい。（ＣＴＣ樹脂固体は下の丸で示される）。

【化3】

【表22】

【0125】

残りの３つのアミノ酸は、直列反応器法を使用して構築される。グリシン、グルタミン酸、２－アミノイソ酪酸のα－窒素は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護され、チロシンのα－窒素はｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護されている。グルタミン酸およびチロシンの酸素は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）によって保護されている。

【0126】

ローディング法
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨカップリング溶液を調製する：５０００ｍＬの標本瓶にＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１４２．７ｇ、４８０．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦで１．８Ｌ溶液の体積まで溶解する。次いで、Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル－プロパン－２－アミン（３０９ｇ、２３９０．９ｍｍｏｌ）を添加し、内容物を５分間撹拌する。

【0127】

樹脂カップリング
１０Ｌガラス大規模ペプチド合成機に、ＣＴＣ樹脂（３８０ｇ、６１０ｍｍｏｌ、１．６ｍｍｏｌ／ｇ）を添加する。ＤＭＦ（２４００ｍＬ）を添加し、１５分間撹拌する。残りの溶液を排出して廃棄する。樹脂をＤＭＦ（２４００ＭＬ）で１５分間撹拌しながら２回洗浄する。さらにＮ－エチル－Ｎ－イソプロピル－プロパン－２－アミン（６２ｇ、４７９．７３ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で合計１８時間撹拌する。１８時間終了後、溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ（１８００ｍＬ）で５分間の混合とともに５回洗浄する。

【0128】

樹脂キャッピング
ＤＭＦ（９００ｍＬ）、Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル－プロパン－２－アミン（１４５．８ｇ、１１２８ｍｍｏｌ）およびメタノール（１９１ｇ、５９６０．９ｍｍｏｌ）を瓶に添加し、室温で２分間撹拌する。溶液を樹脂に添加し、６０分間撹拌し、その後溶液を排出する。樹脂をＤＭＦ（１８００ｍＬ）でそれぞれ５分間撹拌しながら５回洗浄する。さらに、樹脂をＤＣＭ（１８００ｍＬ）でそれぞれ５分間撹拌しながら５回洗浄する。樹脂を乾燥ディスクに移送し、３５℃で一定重量になるまで真空乾燥する。

【0129】

ＮＭＲによって測定された０．８５ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨローディングで、乾燥樹脂を４７３．３７ｇと秤量する。

【0130】

直列反応器法
原料調製
次のようにＤＭＦ中のピペリジンの２０体積％溶液を調製する：ＤＭＦの添加によりピペリジン（２．０Ｌ）を１０．０Ｌの体積まで希釈し、２０体積％の溶液を得る。

【0131】

ＤＭＦ中のオキシマの１．２５ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：エチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート（オキシマ、１９５．６９ｇ）をＤＭＦ（９０５．９１ｇ）に溶解して１．２５ｍｏｌ／ｋｇの溶液を得、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0132】

ＤＭＦ中のＤＩＣの１．２５ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：Ｎ，Ｎ’－５ジイソプロピルカルボジイミド（１９１．１６ｇ）をＤＭＦ（１０２０．６０ｇ）に溶解して１．２５ｍｏｌ／ｋｇの溶液を得、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0133】

ＤＭＦ中のグルタミン酸の０．４０ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ（１６２．８５ｇ）をＤＭＦ（７５５．１５ｇ）に溶解し、振って溶解し、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0134】

ＤＭＦ中のＦｍｏｃ－Ａｉｂ－ＯＨの０．４０ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－ＯＨ（１１９．５０ｇ）をＤＭＦ（７９８．５１ｇ）に溶解し、振って溶解し、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0135】

ＤＭＦ中のＢｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨの０．４０ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（１２３．８９ｇ）をＤＭＦ（７９４．１１ｇ）に溶解し、振って溶解し、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0136】

反応システムを次のように準備する：ＣＴＣ樹脂（１０８ｇ、０．８５ｍｍｏｌ／ｇ、９１．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応器「ＲＢ１」、「ＲＢ２」、および「ＲＢ３」の間で均等に分割する。各反応器に３５０ｍＬのＤＭＦを添加し、室温で２時間撹拌して樹脂を膨潤させる。

【0137】

一般手順Ａ－Ｆｍｏｃ脱保護およびＤＭＦ洗浄プロセス：Ｆｍｏｃ脱保護を、ＲＢ１、ＲＢ２、およびＲＢ３の３つの反応器すべてに対して並行して進行させる。より具体的には、ＲＢ１にピペリジンの溶液（ＤＭＦ中２０体積％、２０２．４ｇ）を添加し、５ｍｌのＤＭＦでピペリジン移送ラインをすすぎ、撹拌を開始する。同様に、２０５．４ｇおよび２０５．２ｇの２０体積％ピペリジン溶液をＲＢ２およびＲＢ３にそれぞれ添加し、ピペリジンラインをすすぐ。次いで、３つの反応器を同時に並行して脱保護するために、２０℃で１２０分間撹拌する。ＴＺＰ四量体構築全体に対するピペリジン溶液投入量を表２１にまとめる。脱保護反応は、サンプリングカートで支持されているオンラインＬＣ－ＭＳを使用して監視する。脱保護された四量体中間体の質量スペクトルは、分子量が低いために表にすることができないことから、脱保護変換を定量的に決定することはできない。しかしながら、脱保護の完了は定性的に検証して、Ｆｍｏｃ保護四量体の抽出イオンピークがゼロであることを確認することができる。

【0138】

脱保護後、圧力伝達システムを使用して、３つすべての反応器から溶液を廃棄物タンクに排出する。脱保護後のＤＭＦ洗浄は、直列反応器方式を用いて行われること、すなわち、ＤＭＦ洗浄溶媒は、最初にＲＢ１に投入され、次いでＲＢ２およびＲＢ３に移送さることに留意されたい。樹脂中の残留ピペリジンを除去するために、以下の詳細な手順で１０回のＤＭＦ洗浄サイクルが適用される。最初の５回のＤＭＦ洗浄では、ＤＭＦリサイクル容器からリサイクルＤＭＦをＲＢ１に均等に分割した溶媒質量とともに添加し、撹拌する（すなわち、リサイクル容器内のＤＭＦ質量を５回の洗浄サイクルで均等に分割し、ＲＢ１に投入する）。ＤＭＦリサイクル容器が空になり、最初の５回のＤＭＦリサイクル洗浄が完了した後、残りの５回の洗浄サイクルのために、ＤＭＦ溶媒容器から新鮮なＤＭＦが投入される。最初の５回の洗浄サイクルで使用されたＤＭＦは廃棄物タンクに廃棄されるが、残りの５回の洗浄サイクルで使用されたＤＭＦ溶媒は代わりにＤＭＦリサイクルタンクに収集され、次のアミノ酸構築で再利用される。洗浄サイクル全体で５分間の撹拌時間が適用される。１０回の洗浄サイクルが完了した後、追加の試料カート清浄化サイクルが適用され、１００ｍｌの新鮮なＤＭＦが３つの反応器のそれぞれに投入される。次いで、ＲＢ１およびＲＢ２からのＤＭＦはＲＢ３に移送され、最終的にＤＭＦ溶媒リサイクル容器に収集される。脱保護後のＤＭＦ洗浄に使用される材料を表２２にまとめる。最後の３回の洗浄サイクルから排出されたＤＭＦ溶液のピペリジン濃度は、オンラインＧＣを使用して測定され、表２３にまとめられている。最終的な残留ピペリジン濃度は、合成全体で５００ｐｐｍ未満に制御される。

【表23】

【表24】

【表25】

【0139】

一般手順Ｂ－アミノ酸の活性化およびカップリングプロセス：ジャケット付き反応器ＲＡに、グルタミン酸溶液（０．４ｍｏｌ／ｋｇ、４０１．２ｇ）、オキシマ溶液（１．２５ｍｏｌ／ｋｇ、１２８．５ｇ）、ＤＩＣ溶液（１．２５ｍｏｌ／ｋｇ、１４１．２ｇ）を添加する。溶液を２０℃で３０分間撹拌して活性グルタミン酸溶液を形成し、ＲＢ１（２２５．４ｇ）、ＲＢ２（２２５．４ｇ）およびＲＢ３（２２７．４ｇ）に添加する。１８時間のカップリング時間が適用されるチロシンカップリングを除いて、反応器ＲＢ１、ＲＢ２およびＲＢ３を２０℃で８時間撹拌する。カップリング時間に達したら、圧力伝達を使用して、３つの反応器すべてから溶液を廃棄物タンクに排出する。反応の最後に、カイザーテストによりカップリングの完了を確認する。カップリングに使用される材料を表２４にまとめるが、これは構築全体にわたる当量比の使用を詳細に示している。

【0140】

一般手順Ａと同様の直列反応器様式でカップリングした後、新鮮なＤＭＦを使用して３サイクルで反応器ＲＡ、ＲＢ１、ＲＢ２およびＲＢ３を洗浄する。より具体的には、スプレー弁を介して新鮮なＤＭＦをＲＡに添加し、次いで直列のＲＢ１、ＲＢ２およびＲＢ３に添加する。試料カート清浄化手順は、一般的順Ａと同様の様式で行われることに留意されたい。その後、３回のＤＭＦ洗浄サイクルおよび追加の試料カート清浄化サイクルからの使用済みＤＭＦはすべて、廃棄物タンクに廃棄される。カップリング後のＤＭＦ洗浄に使用される材料を表２５にまとめる。

【表26】

【表27】

【0141】

ＴＺＰ四量体純度分析法
Ｂｏｃ－Ｔｙｒ １の結合後、３つの反応器すべてから樹脂を乾燥ディスクに移送し、塩化メチレンで洗浄して脱膨潤させ、乾燥させる。四量体試料をｔＢｕでソフト切断し、Ｂｏｃ保護基がペプチドに残留し、その純度を次の方法で分析する。樹脂上のペプチド５００ｍｇ毎に、１０ｍＬの３０％ヘキサフルオロ－２－プロパノール／塩化メチレン（ｖ／ｖ）をシンチレーションバイアルに添加する。ロータリーミキサーで２時間混合する。樹脂ケーキを濾過し、塩化メチレン１０ｍｌで洗浄する。ロタベーパーで油に濃縮する。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析のために、四量体油を５０％アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）でさらに希釈する。ＲＢ１、ＲＢ２およびＲＢ３の得られたＴＺＰ四量体の純度は、それぞれ９９．２３％、９９．５８％および９９．３９％である。

【0142】

ＴＺＰ四量体合成のバッチプロセス法
６００ｍｍｏｌのＴＺＰ四量体バッチプロセスを、直列反応器技術との比較のために以下に説明する。新しい技術により使用される直列の３つのバッチ反応器の代わりに、単一のバッチ反応器がバッチプロセスに使用されることに留意されたい。使用される材料を表２６にまとめる。

【0143】

Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨローディング
ＣＴＣ樹脂（５００ｇ）を反応器に入れる。樹脂をＤＭＦで膨潤させ、撹拌する。ＤＭＦ／ＤＣＭとともにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを反応器に添加し、２時間ローディングする。溶液を排出し、ＤＭＦで洗浄する。ＤＭＦ／ＤＩＰＥＡ／ＭｅＯＨを反応器に２回添加し、キャッピングのために排水し、それぞれ２０分間撹拌する。Ｇｌｙロード樹脂をＤＭＦでさらに洗浄する。ローディングは、１．２ｍｍｏｌ／ｇと決定される。

【0144】

Ｆｍｏｃの脱保護
Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンの２回の撹拌を使用する。撹拌毎に、８０分の反応時間を適用し、脱保護試薬を排出し、濾過する。脱保護反応が完了したら、６．５容量のＤＭＦで５分間撹拌しながら８回洗浄する。脱保護の完了を確認するために、クロラニルテストを使用する。

【0145】

アミノ酸活性化
オキシマ溶液（２当量、１．２５ｍｏｌ／ｋｇ）を予備活性化反応器に添加し、次いでアミノ酸（２当量）を追加のＤＭＦ溶媒とともに添加して、アミノ酸濃度を０．４ｍｏｌ／ｋｇに希釈する。次いで、ＤＩＣ溶液（２．２当量、１．２５ｍｏｌ／ｋｇ）を反応器に添加して、活性化を開始する。Ｇｌｕには２時間の活性化時間を適用し、ＡｉｂおよびＴｙｒには１５分の撹拌を使用する。活性化プロセスを２０℃に維持する。

【0146】

カップリング
活性化エステル溶液を、樹脂上の脱保護ペプチドを含む反応器に移送する。ＧｌｕおよびＡｉｂには８時間の撹拌時間を適用するが、Ｔｙｒカップリングには１８時間が必要である。反応の完了を確認するためにカイザーテストを使用する。カップリングが完了したら、カップリング溶液を排出し、残りの活性化エステルを除去するために、３×６．５体積量のＤＭＦ洗浄液を使用する。

【0147】

純度分析
バッチプロセス用のＴＺＰ四量体試料を決定するために、ＵＰＬＣ－ＭＳとともに同様のソフト切断分析法を使用する。純度は９９．６％と決定される。

【表28】

【0148】

方法の比較
直列反応器技術およびバッチ法で同様のＴＺＰ四量体純度が得られる（それぞれ９９．３％および９９．６％）。直列反応器法では、ＴＺＰ四量体を生成するのに開始樹脂１ｍｍｏｌ当たり１１８．９ｇの全材料（溶媒、試薬は樹脂を除く）が利用される。バッチ法では、開始樹脂１ｍｍｏｌ当たり２１８．８ｇの全材料（溶媒、試薬は樹脂を除く）が適用される。全体として、新しい直列反応器により、従来のバッチ法と比較してＰＭＩを４５．７％削減することができる。

【0149】

例：Ｎ－ブチルピロリジノン／フラングリーン代替溶媒中での固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によるチルゼパチド四量体の構築
従来の固相ペプチド合成では、ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジクロロメタンなどの有毒な溶媒が大量に使用され、これは産業衛生および環境保護に課題をもたらしている。このため、次世代ＳＰＰＳ技術のための直列反応器法のＰＭＩ削減の利点を備えた、より環境に優しい代替溶媒の開発に強い関心が寄せられている。ＮＢＰ／フラン（特にテトラヒドロフランおよび２－メチルテトラヒドロフランが好ましい）二成分系は、広範な事前スクリーニング研究からの、ポリスチレンベース樹脂の優れた膨潤、カップリング試薬の溶解性、ならびに高いカップリングおよび脱保護反応性能により、代替のグリーン溶媒として選択されている。前の例でＤＭＦ溶媒を使用したＴＺＰ（テルゼパチド）四量体合成と連続して比較する目的で、ＮＢＰ／ＴＨＦグリーン代替溶媒系を適用してチルゼパチド四量体を合成する。

【化4】

【0150】

この四量体の構築は、次のテキストで説明されている直列反応器法を使用している。アミノ酸配列を表２７に示す。ここで、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基は、グリシン、グルタミン酸、および２－アミノイソ酪酸のα－窒素を保護し、一方ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）およびｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）は、それぞれチロシンのα－窒素およびグルタミン酸の酸素を保護する。ＤＭＦ溶媒例におけるＴＺＰ四量体合成で調製されたＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨロードＣＴＣ樹脂（０．８５ｍｍｏｌ／ｇのローディング）が、ＮＢＰ／ＴＨＦグリーン溶媒例に使用されることに留意されたい。詳細なローディング方法については、前の例を参照されたい。同様の直列反応器法を使用して、ＣＴＣ樹脂上のＮＢＰ／ＴＨＦ溶媒系で残りの３つのアミノ酸を構築する。これを以下に示す。

【化5】

【表29】

【0151】

ＮＢＰ／フラン代替溶媒法を用いた直列反応器
原料調製
次のようにＮＢＰ／ＴＨＦでピペリジンの２０体積％溶液を調製する：ＮＢＰ／ＴＨＦ（１．５：１ ｖ：ｖ）の添加によりピペリジン（２．０Ｌ）を１０．０Ｌの体積まで希釈し、２０体積％の溶液を得る。

【0152】

ＮＢＰ／ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）中のオキシマの０．７２ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：エチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート（オキシマ、１７６．１ｇ）をＮＢＰ：ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）（１５４５．１ｇ）に溶解して０．７２ｍｏｌ／ｋｇの溶液を得、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0153】

ＮＢＰ／ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）中のＤＩＣの０．７２ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：Ｎ，Ｎ’－５ジイソプロピルカルボジイミド（１７２．０ｇ）をＮＢＰ／ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）（１７２１．３ｇ）に溶解して０．７２ｍｏｌ／ｋｇの溶液を得、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0154】

ＮＢＰ／ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）中のグルタミン酸の０．３５ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ（１７５．８ｇ）をＮＢＰ／ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）（１００４．５ｇ）に溶解し、振って溶解し、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0155】

ＮＢＰ／ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）中のＦｍｏｃ－Ａｉｂ－ＯＨの０．３５ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－ＯＨ（１３９．４ｇ）をＮＢＰ／ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）（１０４５．９ｇ）に溶解し、振って溶解し、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0156】

ＮＢＰ／ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）中のＢｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨの０．４５ｍｏｌ／ｋｇの溶液を次のように調製する：Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（１３９．４ｇ）をＮＢＰ／ＴＨＦ（２：１、ｖ：ｖ）（１０４０．９ｇ）に溶解し、振って溶解し、次いで溶液に２ＳＣＦＨで窒素を吹き込む。

【0157】

反応システムを次のように準備する：ＣＴＣ樹脂（１０８ｇ、０．８５ｍｍｏｌ／ｇ、９１．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応器「ＲＢ１」、「ＲＢ２」、および「ＲＢ３」の間で均等に分割する。各反応器に３５０ｍＬのＮＢＰ／ＴＨＦ（１．５：１、ｖ：ｖ）を添加し、２０℃の室温で１時間撹拌して樹脂を膨潤させる。

【0158】

一般手順Ａ－Ｆｍｏｃ脱保護およびＮＢＰ／ＴＨＦ洗浄プロセス：Ｆｍｏｃ脱保護を、ＲＢ１、ＲＢ２、およびＲＢ３の３つの反応器すべてに対して並行して、３０℃で特定の期間、ＮＢＰ／ＴＨＦ（１．５：１、ｖ：ｖ）中の２０％ピペリジン溶液で進行させる。次いで、溶液を廃棄物タンクに排出し、追加のピペリジン溶液を添加して脱保護し、反応が完了するまで撹拌する。より具体的には、例としてＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨの１回目の脱保護撹拌では、ＲＢ１にピペリジンの溶液（ＮＢＰ／ＴＨＦ（１．５：１、ｖ：ｖ）中２０体積％、２０９ｇ）を添加し、５ｍｌのＮＢＰ／ＴＨＦ（１．５：１、ｖ：ｖ）溶媒混合物でピペリジン移送ラインをすすぎ、撹拌を開始する。同様に、２０８．８ｇおよび２０５ｇの２０体積％ピペリジン溶液をＲＢ２およびＲＢ３にそれぞれ添加し、ピペリジンラインをすすぐ。次いで、３つの反応器を並行して脱保護するために３０℃で４５分間撹拌し、その後溶液を排出する。オンラインＬＣ－ＭＳをサンプリングし、Ｆｍｏｃ保護四量体の抽出イオンピークがゼロであるかどうかを定性的に検証して、反応の完了を確認する。Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＣＴＣを完全に脱保護させるために、ＲＢ１／２／３にさらに５回の並行脱保護撹拌を適用する。同様の脱保護撹拌戦略を、２回の脱保護撹拌によるＧｌｕ３およびＡｉｂ４脱保護に適用する。表２８は、ＴＺＰ四量体構築全体のピペリジン溶液投入量をまとめたものである。

【0159】

ＮＢＰ／ＴＨＦ（１．５：１、ｖ：ｖ）溶媒混合物を３０℃で反応後洗浄に使用し、同様の直列反応器および溶媒リサイクル戦略を適用する。より具体的には、ＲＢ１／２／３を、ＴＺＰ四量体構築全体で１０回のＮＢＰ／ＴＨＦ洗浄サイクルで洗浄する。リサイクル容器内の使用済みＮＢＰ／ＴＨＦ溶媒を５つの投入量に均等に分割し、直列のＲＢ１／２／３に添加して、最初の５回の洗浄サイクルでそれぞれ５分間撹拌する。最初の５回のＮＢＰ／ＴＨＦ使用済み溶媒はすべて、使用後に廃棄物タンクに廃棄される。残りの５回の洗浄では、直列のＲＢ１／２／３の洗浄に新鮮なＮＢＰ／ＴＨＦを使用し、次のアミノ酸脱保護後洗浄のために準備したＮＢＰ／ＴＨＦリサイクル容器に収集する。最後に、試料カート清浄化サイクルとしてＮＢＰ／ＴＨＦを３つの反応器にそれぞれ１００ｍｌ入れ、さらにリサイクル容器に収集する。表２９は、脱保護後洗浄の物質収支をまとめたものであり、表３０は、すべてのサイクルで６００ＰＰＭ未満である合成全体での残留ピペリジン濃度を詳述したものである。

【表30】

【表31】

【表32】

【0160】

一般手順Ｂ－ＮＢＰ／ＴＨＦ中でのアミノ酸の活性化およびカップリングプロセス：活性化およびカップリング反応において、ＮＢＰ／ＴＨＦ体積比を２：１に調整して、試薬の溶解性を高める。Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨカップリングを例に挙げると、ジャケット付き反応器ＲＡに、グルタミン酸溶液（０．３５ｍｏｌ／ｋｇ、７８６．４ｇ）、オキシマ溶液（０．７２ｍｏｌ／ｋｇ、３８２．４ｇ）、ＤＩＣ溶液（０．７２ｍｏｌ／ｋｇ、４２０．６ｇ）を添加し、３０℃で７０分間撹拌して活性化グルタミン酸溶液を形成し、それぞれＲＢ１（５３１．９ｇ）、ＲＢ２（５２９．７ｇ）およびＲＢ３（５３３．９ｇ）に移送する。反応器ＲＢ１、ＲＢ２およびＲＢ３を３０℃で８時間撹拌し、その後３つの反応器すべてから溶液を廃棄物タンクに排出する。反応の最後に、カップリングの完了をカイザーテストでチェックする。Ｇｌｕカップリングは最初のカップリングステップの後で完了していないため、１．５当量比のＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ活性化溶液をさらに添加して、カイザーテストに合格するまでさらに１９時間カップリングさせる。ただし、残りのＡｉｂ２およびＴｙｒ１のカップリングでは、それぞれ８時間および１８時間の撹拌時間による１回のカップリングステップのみを適用する。表３１は、カップリング中の詳細な材料の使用をまとめたものである。

【0161】

ＮＢＰ／ＴＨＦ（１．５：１、ｖ：ｖ）溶媒を使用したカップリング後の洗浄では、ＲＡ、ＲＢ１、ＲＢ２、およびＲＢ３をすすぐために３回の洗浄サイクルを適用する。より具体的には、スプレー弁を介して新鮮なＮＢＰ／ＴＨＦ溶媒をＲＡに投入し、次いで直列のＲＢ１、ＲＢ２およびＲＢ３に３回投入する。脱保護後の洗浄として、同様の試料カート清浄化手順を行う。使用済みのカップリング後溶媒はすべて、廃棄物タンクに廃棄される。カップリング後のＮＢＰ／ＴＨＦ洗浄に使用される材料を表３２にまとめる。

【表33】

【表34】

【0162】

結果の要約
Ｂｏｃ－Ｔｙｒ１のカップリング後、樹脂を塩化メチレンで洗浄し、乾燥させる。次いで、試料を３０％ヘキサフルオロ－２－プロパノール／塩化メチレン（ｖ／ｖ）でソフト切断し、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析用に単離する。ＲＢ１、ＲＢ２およびＲＢ３の得られたＴＺＰ四量体の純度は、それぞれ９２．１９％、９４．６４％および９８．０４％である。主な不純物はグルタミン酸付加物である。これは主に、例で適用された二重グルタミン酸カップリング戦略によるものである。Ｇｌｙ４脱保護およびＧｌｕ３カップリングの問題は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＣＴＣ脱保護前の樹脂膨潤時間を長くすること（＞８時間）で軽減できることに留意されたい。例えば、１ｍｍｏｌスケールでのＮＢＰ／２－ＭｅＴＨＦ（１．５；１、ｖ：ｖ）グリーン溶媒を使用した１２時間の樹脂膨潤により、９９．６％のＴＺＰ四量体純度が得られる。このため、より最適なプロセス条件下でＮＢＰ／フラングリーン溶媒および直列反応器技術を使用することで、ペプチド純度の大幅な向上が達成され得る。ＮＢＰ／ＴＨＦグリーン溶媒を使用する直列反応器法では、ＴＺＰ四量体を生成するのに出発樹脂１ｍｍｏｌ当たり２５２．７１ｇの全材料（溶媒、試薬は樹脂を除く）が利用される。ＤＭＦを使用した従来のバッチ法では２１８．８ｇ／ｍｍｏｌが使用され、ＤＭＦを使用した直列反応器法では１１８．９ｍｍｏｌが使用された。ＮＢＰ／ＴＨＦを使用した手順は新しく、最適化されておらず、ＤＭＦを使用した手順よりも多くの全溶媒を使用した。しかしながら、直列反応器は、いずれの溶媒系についても、単一のバッチ反応器と比較してより少ない溶媒を使用する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】