特許 7415041 グルタミン生産能を向上させる形質転換用組換えベクターおよびこれを導入した菌株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-05

(45)【発行日】2024-01-16

(54)【発明の名称】グルタミン生産能を向上させる形質転換用組換えベクターおよびこれを導入した菌株

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240109BHJP

   C12N 15/77 20060101ALI20240109BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240109BHJP

   C12P 13/14 20060101ALI20240109BHJP

   C12N 9/00 20060101ALN20240109BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/77 Z

C12N1/21

C12P13/14 A

C12N9/00

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2022560115

(86)(22)【出願日】2021-03-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-24

(86)【国際出願番号】 KR2021003633

(87)【国際公開番号】W WO2021201489

(87)【国際公開日】2021-10-07

【審査請求日】2022-09-30

(31)【優先権主張番号】10-2020-0038628

(32)【優先日】2020-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】518431347

【氏名又は名称】デサン・コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】イン・ピョ・ホン

(72)【発明者】

【氏名】ボン・キ・キム

(72)【発明者】

【氏名】ミン・ジン・チェ

(72)【発明者】

【氏名】ソク・ヒョン・パク

(72)【発明者】

【氏名】ジェ・チュン・ハン

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】韓国特許第１０－１９９２－０００５９７５（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１４－００８７２０１（ＫＲ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／００１３８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０６６３５９４６（ＣＮ，Ａ）

【文献】UniProtKB/TrEMBL，[online]，A0A160PS60_CORGT，Accession No. A0A160PS60，entry version 10，[retrieved on 2023.08.04]，2019年，<URL: https://rest.uniprot.org/unisave/A0A160PS60?format=txt&versions=10>

【文献】JAKOBY M et al.，“Isolation of the Corynebacterium glutamicum glnA gene encoding glutamine synthetase I.”，FEMS microbiology letters，1997年，Vol. 154, No. 1，p.81-88

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素をコードする塩基配列を含む形質転換用ベクター。

【請求項2】

前記グルタミン合成酵素をコードする塩基配列は、配列番号２の塩基配列からなるものである、
請求項１に記載の形質転換用ベクター。

【請求項3】

前記形質転換用ベクターは、前記グルタミン合成酵素をコードする塩基配列と作動可能に連結されたプロモーターを含むものである、
請求項１に記載の形質転換用ベクター。

【請求項4】

前記形質転換用ベクターは、前記グルタミン合成酵素をコードする塩基配列と作動可能に連結された転写終結因子配列を含むものである、
請求項１に記載の形質転換用ベクター。

【請求項5】

請求項１に記載の形質転換用ベクターで形質転換された菌株。

【請求項6】

前記菌株は、内生ｇｌｎＥ遺伝子の発現が不活性化されたものである、
請求項５に記載の菌株。

【請求項7】

前記菌株は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、
請求項５に記載の菌株。

【請求項8】

請求項５に記載の菌株を培養するステップを含む、
グルタミン生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グルタミン生産能を向上させる形質転換用組換えベクターおよびこれを導入した菌株に関する。

【背景技術】

【0002】

ＧＳの活性はグルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｄｅｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＡＴａｓｅ、ｇｌｎＥ）によって調節される。ＡＴａｓｅは、ＧＳのアデニル化（ａｄｅｎｙｌｙｌａｔｉｏｎ）と脱アデニル化（ｄｅａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）を触媒してＧＳの活性を調節し、培地内の窒素濃度の影響を受ける。ＡＴａｓｅの活性はＰＩＩ（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ－ＩＩ Ｇｅｎｅ、ｇｌｎＢ）によって調節される。図１を参照すれば、窒素濃度が高ければ、ＰＩＩとＡＴａｓｅの活性化によってＧＳの活性が低下する機序が開示されている。したがって、グルタミンを生産するために窒素源を供給すれば、供給された窒素源によってＧＳの活性がフィードバック阻害（ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）されてグルタミン生産が低下する問題がある。

【0003】

したがって、グルタミン生産効率を増加させるためには、ＡＴａｓｅによるＧＳのフィードバック阻害を抑制することが要求される。日本国特許ＪＰ４８９８４４１によれば、ＧＳの活性低下に関与するｇｌｎＢおよびｇｌｎＥ遺伝子の活性を抑制することにより、グルタミン生産が増加した菌株を開示しているが、改善の余地は依然として残っている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】日本国登録公報ＪＰ４８９８４４１Ｂ２（２０１２．０１．０６）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

一具体例によれば、配列番号１のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳ）をコードする塩基配列を含むベクターを含むグルタミン生産菌株を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一態様によれば、配列番号１のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳ）をコードする塩基配列を含む形質転換用ベクターを提供する。

【0007】

前記グルタミン合成酵素は、グルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）とアンモニアからグルタミンを合成する酵素である。前記配列番号１のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素は、他の配列からなるグルタミン合成酵素よりＡＴａｓｅによって活性が抑制される程度が低いため、グルタミン生産性を向上させることができる。

【0008】

一具体例によれば、前記グルタミン合成酵素をコードする塩基配列は、配列番号２の塩基配列からなるものであってもよい。

【0009】

一具体例によれば、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素および前記配列番号２の塩基配列からなるｇｌｎＡ遺伝子は、寄託番号ＫＦＣＣ１０６９４のコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株に由来するものであってもよい。一実施例によれば、前記ＫＦＣＣ１０６９４由来ｇｌｎＡ配列は、他のコリネバクテリウムグルタミカム菌株であるＡＴＣＣ１３０３２由来ｇｌｎＡ配列の相同性を比較した結果、塩基配列の相同性が８８．２％、これから発現したグルタミン合成酵素のアミノ酸配列の相同性が９３．７％に過ぎないことが確認された。このような配列の差によって、ＫＦＣＣ１０６９４由来グルタミン合成酵素は、他の配列からなるグルタミン合成酵素よりＡＴａｓｅによって活性が抑制される程度において差がありうる。

【0010】

一具体例によれば、前記形質転換用ベクターは、前記グルタミン合成酵素をコードする塩基配列と作動可能に連結されたプロモーターを含むものであってもよい。用語「作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合して遺伝子発現を可能にする方式で連結されたことを意味する。前記プロモーターによってＧＳの発現量が増加すると、ＡＴａｓｅによる抑制が阻害されてグルタミン生産性が向上できる。前記プロモーターは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーターまたは誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーターであってもよい。例えば、前記構成的プロモーターは、Ｐ_ｃｓｐＢ、Ｐ_ａｐｒＥ、Ｐ_１８０、Ｐ_ｓｏｄ、Ｐ_ｄａｐＡ、Ｐ_ｐｏｒＢ、Ｐ_ｉｌｖＣ、Ｐ_Ｌ１０、Ｐ_Ｌ２６、Ｐ_Ｉ１６、Ｐ_Ｉ５１、Ｐ_Ｈ３０、Ｐ_Ｈ３６であってもよいし、誘導性プロモーターは、Ｐ_{ｌａｃＵＶ５}、Ｐ_ｔａｃ、Ｐ_ｔｒｃ、Ｐ_ｐｏｐＢ、Ｐ_{ａｃｅＡ／ａｃｅＢ}、Ｐ_{ｇｎｔＰ／ｇｎｔＫ}、Ｐ_{ＣＪ１ＯＸ２}、Ｐ_{ｔａｃ－Ｍ}、Ｐ_{ｍａｌＥ１}、Ｐ_ＢＡＤであってもよい。一実施例によれば、前記プロモーターは、Ｐ_ｓｏｄ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）プロモーターであってもよい。前記形質転換用ベクターは、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）のような発現調節配列を含むことができる。

【0011】

一具体例によれば、前記形質転換用ベクターは、前記グルタミン合成酵素をコードする塩基配列と作動可能に連結された転写終結因子配列を含むものであってもよい。一実施例によれば、前記転写終結因子配列は、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２配列であってもよい。

【0012】

前記形質転換用ベクターは、選択標識として抗生剤（例えば、ネオマイシン、カルベニシリン、カナマイシン、スペクチノマイシンまたはハイグロマイシンなど）耐性遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）など）を含むことができる。

【0013】

前記ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。

【0014】

他の態様によれば、前記形質転換用ベクターで形質転換された菌株を提供する。

【0015】

一具体例によれば、前記形質転換された菌株は、内生（ｎａｔｉｖｅ）ｇｌｎＡ遺伝子が不活性化されたものであってもよい。用語「内生（ｎａｔｉｖｅ）」は、微生物が天然的に有している遺伝子を意味する。前記不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、当該遺伝子の転写、解読、遺伝子産物の活性の損傷をもたらす遺伝子上の変形を意味し、プロモーターの不活性化も含まれる。このような遺伝子の特異的不活性化は、当分野にて確立された方法により行うことができる。例えば、遺伝子の欠失および異型配列（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の挿入による遺伝子の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、ナンセンス突然変異（ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、フレームシフト突然変異（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、ミスセンス突然変異（ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）などによることができる。

【0016】

一具体例によれば、前記形質転換された菌株は、内生（ｎａｔｉｖｅ）ｇｌｎＥ遺伝子が不活性化されたものであってもよい。前記内生ｇｌｎＥ遺伝子の発現が低下または喪失すれば、グルタミン合成酵素の活性を阻害するＡＴａｓｅの発現が減少するので、グルタミン生産能が向上できる。

【0017】

一具体例によれば、前記形質転換された菌株は、コリネバクテリウム属菌株であってもよいし、例えば、寄託番号ＫＦＣＣ１０６９４で寄託されたグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株であってもよい。

【0018】

前記形質転換は、当該分野にて公知のように、宿主細胞によって適したベクター導入技術を選択することができる。例えば、ベクターの導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱衝撃（ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法、またはこれらの組み合わせによって行われる。

【0019】

さらに他の態様によれば、前記形質転換された菌株を培養するステップを含むグルタミン生産方法を提供する。

【0020】

前記培養は、当業界にて知られた適切な培地と培養条件によって行われる。また、通常の技術者であれば、培地および培養条件を容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培地は、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせ培養を含むことができるが、これに限定されない。

【0021】

前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者によって適宜変形可能である。例えば、コリネバクテリア菌株に対する培養培地は、公知の文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）を参照することができる。また、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができる。使用可能な炭素源の例を挙げると、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用できる。使用可能な窒素源おしては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆小麦および尿素または無機化合物があり、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的にまたは混合物として使用することができる。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれる。培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができる。その他、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれる。また、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式によって回分式または連続式で添加可能である。

【0022】

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常２０℃～４５℃、例えば、２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、所望する量のＬ－グルタミンが生成されるまで持続可能であり、例えば、１０～１６０時間であってもよい。

【0023】

前記生産方法は、培養した微生物または培地からＬ－グルタミンを回収するステップを含むことができる。前記Ｌ－グルタミンを回収する方法は特に限定されるものではなく、培養方法により当該分野にて公知の適した方法を用いて回収できる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが使用できる。

【発明の効果】

【0024】

一具体例による菌株が発現するグルタミン合成酵素は、ＡＴａｓｅによるフィードバック抑制に対する影響が低いので、グルタミン生産量を著しく増加させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】グルタミン合成酵素活性の調節機序を示すものである。

【図2】一実施例によるｐｋ１９ｍｓ／△ｇｌｎＡベクターを示す図である。

【図3】一実施例によるｐｋ１９ｍｓ／△ｇｌｎＥベクターを示す図である。

【図4】一実施例によるｐａ’－ｇｌｎＡ（ＡＴＣＣ１３０３２）ベクターを示す図である。

【図5】一実施例によるｐａ’－ｇｌｎＡ（ＫＦＣＣ１０６９４）ベクターを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、一つ以上の具体例を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は一つ以上の具体例を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0027】

[実施例１：ＫＦＣＣ－１０６９４染色体上のｇｌｎＡ、ｇｌｎＥ遺伝子欠損用ベクターの作製]
ベクターの作製に使用した材料は、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ（ＮＥＢ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用した。

【0028】

[１－１．ｇｌｎＡ欠失用ベクターの作製]
ＫＦＣＣ－１０６９４菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＭＷＭ－８９１０２０）の染色体ＤＮＡを鋳型としてプライマー１およびプライマー２でＰＣＲを実施して、ＫＦＣＣ－１０６９４のｇｌｎＡのｌｅｆｔ ａｒｍ増幅産物を得た。同じく、プライマー３およびプライマー４の組み合わせでＰＣＲを実施して、ｇｌｎＡのｒｉｇｈｔ ａｒｍ増幅産物を得た。

【0029】

前記ｇｌｎＡのｌｅｆｔ ａｒｍとｒｉｇｈｔ ａｒｍ増幅産物をプライマー１およびプライマー４の組み合わせでクロスオーバーＰＣＲを実施して、ｌｅｆｔ ａｒｍとｒｉｇｈｔ ａｒｍが結合した増幅産物を得て、ｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターのＢａｍＨＩ位置に挿入した。作製されたｇｌｎＡ欠失用ベクターはｐＫ１９ｍｓ／△ｇｌｎＡと名付けた。（図2参照）

【0030】

[１－２．ｇｌｎＥ欠失用ベクターの作製]
前記ｇｌｎＡ欠失用ベクターと同様の方法により、プライマー５とプライマー６との組み合わせでＰＣＲを実施して、ＫＦＣＣ－１０６９４のｇｌｎＥのｌｅｆｔ ａｒｍ増幅産物を得て、プライマー７とプライマー８との組み合わせでＰＣＲを実施して、ｇｌｎＥのｒｉｇｈｔ ａｒｍ増幅産物を得た。

【0031】

前記ｇｌｎＥのｌｅｆｔ ａｒｍとｒｉｇｈｔ ａｒｍ増幅産物をプライマー５とプライマー８との組み合わせを用いたクロスオーバーＰＣＲで増幅してｌｅｆｔ ａｒｍとｒｉｇｈｔ ａｒｍとが結合した産物を得て、これをｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターのＨｉｎｄＩＩＩ位置に挿入した。作製されたｇｌｎＥ欠失用ベクターはｐＫ１９ｍｓ／△ｇｌｎＥと名付けた。（図3参照）

【0032】

前記ＫＦＣＣ－１０６９４のｇｌｎＡ、ＫＦＣＣ－１０６９４のｇｌｎＥ、プライマー１～８の塩基配列に関する情報は、下記表１に開示されている。

【表1】

【0033】

[実施例２：ｇｌｎＡ過発現ベクター２種の作製]
ＡＴＣＣ１３０３２のｇｌｎＡ遺伝子ＤＮＡを鋳型としてプライマー９およびプライマー１０の組み合わせでＰＣＲを実施して、ｇｌｎＡ（ＡＴ）増幅産物を得た。

【0034】

これとは別個に、ＫＦＣＣ１０６９４のｇｌｎＡ遺伝子ＤＮＡを鋳型としてプライマー１１およびプライマー１２の組み合わせでＰＣＲを実施して、ｇｌｎＡ（ＫＦ）増幅産物を得た。

【0035】

前記ｇｌｎＡ（ＡＴ）とｇｌｎＡ（ＫＦ）の相同性を確認した結果、塩基配列の相同性が８８．２％、アミノ酸配列の相同性が９３．７％に過ぎないことが確認された。ｇｌｎＡ（ＡＴ）とｇｌｎＡ（ＫＦ）のアミノ酸配列と塩基配列は、下記表２に記載されている。

【表2A】

【表2B】

【0036】

ｓｏｄプロモーターは、ＡＴＣＣ１３０３２染色体ＤＮＡを鋳型としてプライマー１３（ｆｏｒｗａｒｄ）とプライマー１４（ｂａｃｋｗａｒｄ）との組み合わせで増幅した第１ｓｏｄプロモーター増幅産物、プライマー１３（ｆｏｒｗａｒｄ）とプライマー１５（ｂａｃｋｗａｒｄ）との組み合わせで増幅した第２ｓｏｄプロモーター増幅産物を作製した。逆方向プライマーをプライマー１４および１５に区別して用いた理由はｇｌｎＡ配列の差のためであり、ｓｏｄプロモーター配列は同一である。（下記表3のｇｇｇｔａａａａａａｔｃｃｔｔｔｃｇ参照）

【0037】

ｒｒｎＢＴ１Ｔ２転写終結因子（ターミネーター）配列は、大膓菌ＤＨ５ａ染色体ＤＮＡを鋳型としてプライマー１６（ｆｏｒｗａｒｄ）とプライマー１７（ｂａｃｋｗａｒｄ）との組み合わせで増幅した第１ｒｒｎＢＴ１Ｔ２増幅産物；およびプライマー１８（ｆｏｒｗａｒｄ）およびプライマー１７（ｂａｃｋｗａｒｄ）の組み合わせで増幅した第２ｒｒｎＢＴ１Ｔ２増幅産物を得た。正方向プライマーをプライマー１６および１８に区別して用いた理由はｇｌｎＡ配列の差のためであり、転写終結因子の配列は同一である。（下記表3のａｇａａｔｔｔｇｃｃｔｇｇｃｇｇｃａ参照）

【0038】

プライマー１３とプライマー１７との組み合わせを用いたクロスオーバーＰＣＲを実施して、前記第１ｓｏｄプロモーター増幅産物、ｇｌｎＡ（ＡＴ）、および第１ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター増幅産物をＥ．Ｃｏｌｉ－Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍシャトルベクターであるｐａ’ベクター内のＢａｍＨＩ位置に挿入してｐａ’－ｇｌｎＡ（ＡＴ）ベクターを作製した。（図４参照）

【0039】

同じく、プライマー１３とプライマー１７との組み合わせを用いたクロスオーバーＰＣＲを実施して、前記第２ｓｏｄプロモーター増幅産物、ｇｌｎＡ（ＫＦ）、および第２ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター増幅産物をＥ．Ｃｏｌｉ－Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍシャトルベクターであるｐａ’ベクター内のＢａｍＨＩ位置に挿入してｐａ’－ｇｌｎＡ（ＫＦ）ベクターを作製した。（図５参照）

【0040】

実施例２で使用された実験材料は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）、ＢａｍＨＩ（ＮＥＢ、Ｅｎｇｌａｎｄ）である。

【0041】

前記プライマー９～１８の塩基配列は、下記表３に開示されている。

【表3】

【0042】

[実施例３：ｇｌｎＡ遺伝子および／またはｇｌｎＥ遺伝子が欠損したＫＦＣＣ１０６９４菌株の作製]
コンピテント細胞で作られたＫＦＣＣ１０６９４菌株に、前記実施例１で作製されたｐＫ１９ｍｓ／△ｇｌｎＡベクターを電気衝撃療法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で導入し、２ＹＴ ＫＭ ＡＧＡＲ培地に塗抹後、３０℃の培養器で４日間培養してコロニーを得た。１次相同組換えが誘導されたコロニーのうち形質転換が確認されたコロニーを２ＹＴ液体培地で１２時間培養後、２ＹＴ Ｓｕｃｒｏｓｅ ＧＭ ＡＧＡＲ培地に塗抹し、２次相同組換えにより抗生剤マーカーを除去した。選別されたコロニーをＰＣＲおよび配列分析によりｇｌｎＡ遺伝子が意図どおりに除去されたかを最終確認した。前記過程により作製されたｇｌｎＡ遺伝子が欠損した菌株をＤ１０６９４Ａと名付けた。

【0043】

同様の方法により、前記Ｄ１０６９４Ａ菌株に、前記実施例１で作製したｐＫ１９ｍｓ／△ｇｌｎＥベクターを用いてｇｌｎＡとｇｌｎＥ遺伝子が同時に欠損した菌株を作製した。本実験に使用された培地にはｇｌｕｔａｍｉｎｅを１００ｍｇ／Ｌの濃度で添加して使用した。前記過程により作製されたｇｌｎＡおよびｇｌｎＥ遺伝子がすべて欠損した菌株をＤ１０６９４ＡＥと名付けた。

【0044】

前記実施例３で使用された実験材料は、２ＹＴ ＡＧＡＲ（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、ＡＧＡＲ１．５％）、２ＹＴ ＫＭ ＡＧＡＲ（２ＹＴ ＡＧＡＲ、Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ１５ｍｇ／Ｌ）、２ＹＴ Ｓｕｃｒｏｓｅ ＧＭ ＡＧＡＲ（２ＹＴ ＡＧＡＲ、Ｓｕｃｒｏｓｅ１００ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ１００ｍｇ／Ｌ）、ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒａｔｏｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ、ＵＳＡ）である。

【0045】

[実施例４：ｐａ’－ｇｌｎＡ（ＡＴ）ベクターまたはｐａ’－ｇｌｎＡ（ＫＦ）ベクター導入菌株の作製]
実施例２で作製されたｐａ’－ｇｌｎＡ（ＡＴＣＣ１３０３２）ベクター、ｐａ’－ｇｌｎＡ（ＫＦＣＣ１０６９４）ベクターを、前記実施例３で作製したＤ１０６９４ＡおよびＤ１０６９４ＡＥ菌株に電気衝撃療法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で導入した。ベクターを導入した菌株を２ＹＴ ＫＭ ＡＧＡＲ培地に塗抹し、３０℃の培養器で３日間培養してコロニーを得た。前記過程により作製された菌株をＤ１０６９４Ａ／ｐａ－ｇｌｎＡ（ＡＴ）、Ｄ１０６９４Ａ／ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）、Ｄ１０６９４ＡＥ／ｐａ－ｇｌｎＡ（ＡＴ）、Ｄ１０６９４ＡＥ／ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）と名付けた。

【0046】

実施例４で使用された実験材料は、２ＹＴ ＡＧＡＲ（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、ＡＧＡＲ１．５％）、２ＹＴ ＫＭ ＡＧＡＲ（２ＹＴ ＡＧＡＲ、Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ１５ｍｇ／Ｌ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒａｔｏｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ、ＵＳＡ）である。

【0047】

[実施例５：実施例４で作製された菌株のグルタミン生産性の確認]
種培地２０ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに分注して、通常の方法により加圧滅菌した後、菌株を接種して、３０℃で２４時間振盪培養したものを種菌培養液とした。生産培地１００ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに分注して、通常の方法により加圧滅菌した後、予め用意した種菌培養液１００ｍｌを接種して、３０℃で７２時間振盪培養した。Ｄ１０６９４ＡとＤ１０６９４ＡＥ菌株に対する生産性の比較には、培地に１００ｍｇ／Ｌのグルタミンを添加した。培養終了液でのＬ－グルタミン含有量の決定は、通常のＨＰＬＣ法で定量した。

【0048】

グルタミン生産性の実験結果は、下記表４に記載されている。

【表4】

【0049】

前記表4の実験結果によれば、Ｄ１０６９４Ａ菌株およびＤ１０６９４ＡＥは、ｇｌｎＡ（ＧＳ発現遺伝子）が欠損してＬ－グルタミンが生産されなかった。

【0050】

前記表4のＤ１０６９４Ａ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＡＴ）とＤ１０６９４Ａ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）のグルタミン生産をみると、Ｄ１０６９４Ａ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＡＴ）は、親株であるＫＦＣＣ１０６９４よりＬ－グルタミン生産性が減少したのに対し、Ｄ１０６９４Ａ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）は、親株であるＫＦＣＣ１０６９４より生産性が向上した。両菌株は同一のｓｏｄプロモーターを導入したにもかかわらず、ｇｌｎＡ（ＡＴ）よりｇｌｎＡ（ＫＦ）を導入した場合、生産性が著しく高かった。これは、ｇｌｎＡ（ＡＴ）とｇｌｎＡ（ＫＦ）はフィードバック抑制の程度において差があることを示唆する。

【0051】

ＡＴａｓｅが不活性化されてフィードバック抑制を受けないＤ１０６９４ＡＥ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＡＴ）とＤ１０６９４ＡＥ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）のグルタミン生産をみると、Ｄ１０６９４ＡＥ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＡＴ）菌株は、Ｄ１０６９４Ａ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＡＴ）より生産性が約１．９１％向上したので、ＡＴａｓｅ活性の有無による差が大きいことが分かった。しかし、Ｄ１０６９４ＡＥ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）菌株は、Ｄ１０６９４Ａ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）より生産性が０．０７％向上したものの、その程度は大きくなかったので、ＡＴａｓｅ活性の有無による差が大きくないことが分かった。これは、ｇｌｎＡ（ＫＦ）はＡＴａｓｅによるフィードバック抑制の影響が少ないことを意味する。

【0052】

より詳しくみると、Ｄ１０６９４Ａ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）菌株は、親株対比約４７％増加した生産性を示し、Ｄ１０６９４ＡＥ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）菌株は、親株対比約４９％増加した生産性を示した。ここで注目すべきは、Ｄ１０６９４Ａ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）とＤ１０６９４ＡＥ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）の生産性の差が親株対比２％に過ぎず大きくなかったという点である。Ｄ１０６９４ＡＥ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）は、Ｄ１０６９４Ａ／Ｐａ－ｇｌｎＡ（ＫＦ）よりＧＳのフィードバック阻害に関与するｇｌｎＥ遺伝子を追加的に欠損させたにもかかわらず、親株対比わずか２％の生産性向上を示したので、ＡＴａｓｅ活性の有無によるグルタミン生産性の差が大きくないということである。これは、ｇｌｎＡ（ＫＦ）の導入による生産性増加は、単純にｓｏｄプロモーターの寄与によるだけでなく、ｇｌｎＡ（ＫＦ）のフィードバック阻害に対する抵抗が寄与したことを示唆する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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