▶ テナヤ セラピューティクス， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-05
(45)【発行日】2024-01-16
(54)【発明の名称】プラコフィリン２遺伝子治療の方法および組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20240109BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240109BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240109BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240109BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240109BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
C12N15/864 100Z
A61P9/00
A61K48/00
A61K35/76
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022560498
(86)(22)【出願日】2021-10-07
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-14
(86)【国際出願番号】 US2021053908
(87)【国際公開番号】W WO2022076648
(87)【国際公開日】2022-04-14
【審査請求日】2022-10-04
(31)【優先権主張番号】63/089,951
(32)【優先日】2020-10-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/172,053
(32)【優先日】2021-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/216,322
(32)【優先日】2021-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/227,801
(32)【優先日】2021-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】521087782
【氏名又は名称】テナヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100122644
【弁理士】
【氏名又は名称】寺地 拓己
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ジホン・ジェーン
(72)【発明者】
【氏名】ホ，ジャクリン
(72)【発明者】
【氏名】ライド，クリス
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ジン
【審査官】山村 祥子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／２０５８８９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５１４８１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０２１／１８７３８０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２１／０５３２２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０１０４６７９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０５２０５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０６０６１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】 Cell ，2015年，160，1111-1124
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／１７
Ｃ１２Ｎ １５／８６４
Ａ６１Ｐ ９／００
Ａ６１Ｋ ３５／７６
Ａ６１Ｋ ４８／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）の処置を必要とする個体への該処置において使用するための、少なくとも１つの心臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたプラコフィリン２（ＰＫＰ２）ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療用ベクター、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物であって、前記核酸が配列番号２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列を有し、前記ＡＡＶが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶ９からなる群から選択される、（ｉ）線維脂肪組織置換、心筋委縮、顕著な右室拡張、心室性不整脈、心臓突然死、または運動が引き起こす心イベントの少なくとも１つを好転させる、低下させる、または予防する；（ｉｉ）デスモソームの構造および／または機能を回復させる；および／または（ｉｉｉ）ＰＫＰ２タンパク質および活性のレベルを回復させる、前記組成物。
【請求項2】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＡＡＶが、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有するＡＡＶ９である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
静脈内、心臓内、心膜、または動脈内に投与される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記心臓特異的プロモーターが、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記遺伝子治療用ベクターがさらに、心臓特異的エンハンサーを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
ＰＫＰ２誘導性遺伝子発現を回復させる、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
２型リアノジン受容体（Ｒｙｒ２）、アンキリンＢ（Ａｎｋ２）、Ｃａｃｎａ１ｃ（ＣａＶ１．２）、トリアジン（Ｔｒｄｎ）、またはカルセクエストリン２（Ｃａｓｑ２）の１つまたは複数の発現を回復させる、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記個体が、デスモソームタンパク質中に少なくとも１つの変異を有すると同定される、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
前記デスモソームタンパク質がＰＫＰ２である、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記変異が、欠失、挿入、一塩基変異、またはコピー数多型を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＰＫＰ２ポリペプチドをコードする核酸が配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＰＫＰ２ポリペプチドをコードする核酸が配列番号２に対して同一である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＰＫＰ２ポリペプチドが配列番号８の配列を有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
[0001]本出願は、参照によりその各々の全体が本明細書に組み込まれている、２０２０年１０月９日に出願した米国仮出願第６３／０８９，９５１号明細書、２０２１年４月７日に出願した同第６３／１７２，０５３号明細書、２０２１年６月２９日に出願した同第６３／２１６，３２２号明細書、および２０２１年７月３０日に出願した同第６３／２２７，８０１号明細書の利益を主張するものである。
[0001]本出願は、参照によりその各々の全体が本明細書に組み込まれている、２０２０年１０月９日に出願した米国仮出願第６３／０８９，９５１号明細書、２０２１年４月７日に出願した同第６３／１７２，０５３号明細書、２０２１年６月２９日に出願した同第６３／２１６，３２２号明細書、および２０２１年７月３０日に出願した同第６３／２２７，８０１号明細書の利益を主張するものである。
【背景技術】
【0002】
[0002]不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）は、２０００人に１人～５０００人に１人に見出される遺伝性心疾患である。ＡＲＶＣは、心筋中での線維脂肪組織置換、心筋委縮、顕著な右室拡張、心室性不整脈、および心臓突然死を特徴とする（Wang等、2018）。本疾患は、特にその初期には、その不顕性症状ゆえ従来のイメージングおよびＥＣＧによる診断が困難である。後期には、本疾患は、より明白な徴候、例えば、心室性不整脈および心室での形態異常へと進行する。若年およびアスリートでの突然心停止は、ＡＲＶＣおよび運動関連の心臓壁ストレスと関連することが分かっている。これまでのところ、ＡＲＶＣの効果的な処置は存在しない（Wang等、2018）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
[0003]一態様では、心疾患または心障害の処置を必要とする個体において心疾患または心障害を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法が、（ａ）プロモーターに作動可能に連結された、プラコフィリン２（ＰＫＰ２）ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸、および３’エレメントを含む遺伝子治療用ベクター；ならびに（ｂ）薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである。いくつかの実施形態では、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該アデノ随伴ウイルスが、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有するＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、該心疾患または心障害が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である。いくつかの実施形態では、該プロモーターが、心臓を含む組織中での発現を引き起こすプロモーターまたは心臓特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、該プロモーターが、心筋、心外膜または両方での発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、該心臓特異的プロモーターが、ＰＫＰ２プロモーター、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである。いくつかの実施形態では、該ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該３’エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡ）配列、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターがさらに、心臓特異的エンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、該ＰＫＰ２遺伝子をコードする該核酸が、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、該核酸が、約４．７ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該薬学的に許容可能な担体または賦形剤が、緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、該方法が、線維脂肪組織置換；心筋委縮；顕著な右室拡張；心室性不整脈；心臓突然死；運動が引き起こす心イベント；右室心筋症、右室拡張または右心不全；左室心筋症、左室拡張または左心不全；心房性不整脈；失神；動悸；息切れ；または胸痛の少なくとも１つを好転させる、低下させる、または予防する。いくつかの実施形態では、該方法が、心筋、心外膜、または両方での線維脂肪組織置換を好転させる、低下させる、または予防する。いくつかの実施形態では、該方法が、デスモソームの構造および／または機能を回復させる。いくつかの実施形態では、該方法が、ＰＫＰ２ ｍＲＮＡの発現および／またはＰＫＰ２タンパク質および活性のレベルを回復させる。いくつかの実施形態では、該方法が、該心疾患の１つまたは複数の症状に対する直接的または間接的な効果を有する１つまたは複数の遺伝子の発現を回復させる。いくつかの実施形態では、該遺伝子が、２型リアノジン受容体（Ｒｙｒ２）、アンキリンＢ（Ａｎｋ２）、Ｃａｃｎａ１ｃ（ＣａＶ１．２）、トリアジン（Ｔｒｄｎ）、またはカルセクエストリン２（Ｃａｓｑ２）の１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、該個体が、デスモソームタンパク質中に少なくとも１つの変異を有すると同定される。いくつかの実施形態では、該デスモソームタンパク質がＰＫＰ２である。いくつかの実施形態では、該変異が、欠失、挿入、一塩基変異、またはコピー数多型を含む。
【0004】
[0004]一態様では、心疾患または心障害の処置を必要とする個体において心疾患または心障害を処置するための方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、該方法が、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結された、プラコフィリン２（ＰＫＰ２）ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む遺伝子治療用ベクターおよび薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターがウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、該ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである。いくつかの実施形態では、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ９またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶ９が、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該心疾患または心障害が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である。いくつかの実施形態では、該組成物を、静脈内、心臓内、心膜、または動脈内に投与する。いくつかの実施形態では、該プロモーターが心臓特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、該プロモーターが、心筋、心外膜または両方での発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、該心臓特異的プロモーターが、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである。いくつかの実施形態では、該トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該プロモーターがＰＫＰ２プロモーターである。いくつかの実施形態では、該ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該プロモーターが構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、該構成的プロモーターがベータアクチンプロモーターである。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターがさらに、心臓特異的エンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、該ＰＫＰ２遺伝子をコードする該核酸が、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、該薬学的に許容可能な担体または賦形剤が、緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、該方法が、線維脂肪組織置換；心筋委縮；顕著な右室拡張；心室性不整脈；心臓突然死；運動が引き起こす心イベント；右室心筋症、右室拡張または右心不全；左室心筋症、左室拡張または左心不全；心房性不整脈；失神；動悸；息切れ；または胸痛の少なくとも１つを好転させる、低下させる、または予防する。いくつかの実施形態では、該方法が、心筋、心外膜、または両方での線維脂肪組織置換を好転させる、低下させる、または予防する。いくつかの実施形態では、該方法が、デスモソームの構造および／または機能を回復させる。いくつかの実施形態では、該方法が、ＰＫＰ２ ｍＲＮＡの発現および／またはＰＫＰ２タンパク質および活性のレベルを回復させる。いくつかの実施形態では、該方法が、ＰＫＰ２誘導性遺伝子発現を回復させる。いくつかの実施形態では、該方法が、該心疾患の１つまたは複数の症状に対する直接的または間接的な効果を有する１つまたは複数の遺伝子の発現を回復させる。いくつかの実施形態では、該方法が、２型リアノジン受容体（Ｒｙｒ２）、アンキリンＢ（Ａｎｋ２）、Ｃａｃｎａ１ｃ（ＣａＶ１．２）、トリアジン（Ｔｒｄｎ）、またはカルセクエストリン２（Ｃａｓｑ２）の１つまたは複数の発現を回復させる。いくつかの実施形態では、該個体が、デスモソームタンパク質中に少なくとも１つの変異を有すると同定される。いくつかの実施形態では、該デスモソームタンパク質がＰＫＰ２である。いくつかの実施形態では、該変異が、欠失、挿入、一塩基変異、またはコピー数多型を含む。
【0005】
[0005]他の態様では、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されたプラコフィリン２遺伝子を含む遺伝子治療用ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターがウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、該ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである。いくつかの実施形態では、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ９またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶ９が、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該プロモーターが心臓特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、該プロモーターが、心筋、心外膜または両方での発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、該心臓特異的プロモーターが、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである。いくつかの実施形態では、該トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該プロモーターがＰＫＰ２プロモーターである。いくつかの実施形態では、該ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該プロモーターが構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、該構成的プロモーターがベータアクチンプロモーターである。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターがさらに、心臓特異的エンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、該ＰＫＰ２遺伝子をコードする該核酸が、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターが、緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む薬学的に許容可能な担体または賦形剤中で製剤してある。
【0006】
参照による組込み
[0006]本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照によって組み込まれていると具体的かつ個別に示されるのと同程度に参照によって本明細書に組み込まれている。
[0006]本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照によって組み込まれていると具体的かつ個別に示されるのと同程度に参照によって本明細書に組み込まれている。
【0007】
[0007]本特許または本出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公報の複写は、要請および必要な手数料の納付があった場合、官庁から提供される。
【0008】
本明細書は以下の発明の開示を包含する。
［１］少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結された、プラコフィリン２（ＰＫＰ２）ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む遺伝子治療用ベクターならびに薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む、心疾患または心障害の処置を必要とする個体において心疾患または心障害を処置するための方法。
［２］前記遺伝子治療用ベクターがウイルスベクターを含む、［１］に記載の方法。
［３］前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択される、［２］に記載の方法。
［４］前記遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである、［２］または［３］に記載の方法。
［５］前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、［４］に記載の方法。
［６］前記アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ９またはその誘導体である、［５］に記載の方法。
［７］前記ＡＡＶ９が、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［６］に記載の方法。
［８］前記遺伝子治療用ベクターが、心筋、心外膜または両方の細胞を標的とする、［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記心疾患または心障害が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である、［１］から［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記組成物を、静脈内、心臓内、心膜、または動脈内に投与する、［１］から［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、［１］から［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記心臓特異的プロモーターが、心筋、心外膜または両方での遺伝子発現を導く、［１１］に記載の方法。
［１３］前記心臓特異的プロモーターが、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］前記トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［１３］に記載の方法。
［１５］前記プロモーターがＰＫＰ２プロモーターである、［１］から［１２］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［１５］に記載の方法。
［１７］前記プロモーターが構成的プロモーターである、［１］から［１０］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記構成的プロモーターがベータアクチンプロモーターである、［１７］に記載の方法。
［１９］前記遺伝子治療用ベクターがさらに、心臓特異的エンハンサーを含む、［１］から［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記遺伝子治療用ベクターがさらに、３’エレメントを含む、［１］から［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］前記３’エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡ）配列、またはそれらの組合せを含む、［２０］に記載の方法。
［２２］前記ＰＫＰ２遺伝子をコードする前記核酸が、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、［１］から［２１］のいずれかに記載の方法。
［２３］前記遺伝子治療用ベクターが、配列番号５に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、［１］から［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］前記薬学的に許容可能な担体または賦形剤が、緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む、［１］から［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］線維脂肪組織置換、心筋委縮、顕著な右室拡張、心室性不整脈、心臓突然死、または運動が引き起こす心イベントの少なくとも１つを好転させる、低下させる、または予防する、［１］から［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］心筋、心外膜、または両方での線維脂肪組織置換を好転させる、低下させる、または予防する、［２５］に記載の方法。
［２７］デスモソームの構造および／または機能を回復させる、［１］から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］ＰＫＰ２タンパク質および活性のレベルを回復させる、［１］から［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］ＰＫＰ２誘導性遺伝子発現を回復させる、［１］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］２型リアノジン受容体（Ｒｙｒ２）、アンキリンＢ（Ａｎｋ２）、Ｃａｃｎａ１ｃ（ＣａＶ１．２）、トリアジン（Ｔｒｄｎ）、またはカルセクエストリン２（Ｃａｓｑ２）の１つまたは複数の発現を回復させる、［１］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］前記個体が、デスモソームタンパク質中に少なくとも１つの変異を有すると同定される、［１］から［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］前記デスモソームタンパク質がＰＫＰ２である、［３１］に記載の方法。
［３３］前記変異が、欠失、挿入、一塩基変異、またはコピー数多型を含む、［３２］に記載の方法。
［３４］少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されたプラコフィリン２遺伝子を含む遺伝子治療用ベクター。
［３５］ウイルスベクターを含む、［３４］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［３６］前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択される、［３５］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［３７］アデノ随伴ウイルスである、［３５］または［３６］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［３８］前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、［３７］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［３９］前記アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ９またはその誘導体である、［３８］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４０］前記ＡＡＶ９が、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［３９］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４１］心筋、心外膜または両方の細胞を標的とする、［３４］から［４０］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［４２］前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、［３４］から［４１］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［４３］前記心臓特異的プロモーターが、心筋、心外膜または両方での遺伝子発現を導く、［４２に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４４］前記心臓特異的プロモーターが、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである、［４２］または［４３］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４５］前記トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［４３］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４６］前記プロモーターがＰＫＰ２プロモーターである、［３４］から［４５］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［４７］前記ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［４６］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４８］前記プロモーターが構成的プロモーターである、［３４］から［４１］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［４９］前記構成的プロモーターがベータアクチンプロモーターである、［４８］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［５０］さらに心臓特異的エンハンサーを含む、［３４］から［４９］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５１］さらに３’エレメントを含む、［３４］から［５０］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５２］前記３’エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡ）配列、またはそれらの組合せを含む、［５１］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［５３］前記ＰＫＰ２遺伝子をコードする前記核酸が、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、［３４］から［５２］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５４］配列番号５に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、［３４］から［５３］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５５］緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む、薬学的に許容可能な担体または賦形剤中で製剤してある、［３４］から［５４］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５６］（ａ）プロモーターに作動可能に連結された、プラコフィリン２（ＰＫＰ２）ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸および３’エレメントを含む遺伝子治療用ベクター；ならびに（ｂ）薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む、心疾患または心障害の処置を必要とする個体において心疾患または心障害を処置するための方法。
［５７］前記遺伝子治療用ベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターを含む、［５６］に記載の方法。
［５８］前記遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである、［５６］に記載の方法。
［５９］前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、［５８］に記載の方法。
［６０］前記アデノ随伴ウイルスが、心筋、心外膜または両方の細胞を標的とする、［５９］に記載の方法。
［６１］前記アデノ随伴ウイルスが、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有するＡＡＶ９である、［５９］に記載の方法。
［６２］前記心疾患または心障害が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である、［５６］に記載の方法。
［６３］前記プロモーターが、心臓を含む組織中での発現を引き起こすプロモーターまたは心臓特異的プロモーターである、［５６］に記載の方法。
［６４］前記心臓特異的プロモーターが、心筋、心外膜または両方での遺伝子発現を導く、［６３］に記載の方法。
［６５］前記心臓特異的プロモーターが、ＰＫＰ２プロモーター、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである、［６３］に記載の方法。
［６６］前記ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［６５］に記載の方法。
［６７］前記トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［６５］に記載の方法。
［６８］前記３’エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡ）配列、またはそれらの組合せを含む、［５６］に記載の方法。
［６９］前記遺伝子治療用ベクターがさらに、心臓特異的エンハンサーを含む、［５６］に記載の方法。
［７０］前記ＰＫＰ２遺伝子をコードする前記核酸が、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、［５６］に記載の方法。
［７１］前記遺伝子治療用ベクターが、配列番号５に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、［５６］に記載の方法。
［７２］前記核酸が、約４．７ｋｂ以下のサイズを有する、［５６］に記載の方法。
［７３］前記薬学的に許容可能な担体または賦形剤が、緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む、［５６］に記載の方法。
［７４］線維脂肪組織置換；心筋委縮；顕著な右室拡張；心室性不整脈；心臓突然死；運動が引き起こす心イベント；右室心筋症、右室拡張または右心不全；左室心筋症、左室拡張または左心不全；心房性不整脈；失神；動悸；息切れ；または胸痛の少なくとも１つを好転させる、低下させる、または予防する、［５６］に記載の方法。
［７５］心筋、心外膜、または両方での線維脂肪組織置換を好転させる、低下させる、または予防する、［７４］に記載の方法。
［７６］デスモソームの構造および／または機能を回復させる、［５６］に記載の方法。
［７７］ＰＫＰ２ ｍＲＮＡの発現および／またはＰＫＰ２タンパク質および活性のレベルを回復させる、［５６］に記載の方法。
［７８］前記心疾患の１つまたは複数の症状に対する直接的または間接的な効果を有する１つまたは複数の遺伝子の発現を回復させる、［５６］に記載の方法。
［７９］前記遺伝子が、２型リアノジン受容体（Ｒｙｒ２）、アンキリンＢ（Ａｎｋ２）、Ｃａｃｎａ１ｃ（ＣａＶ１．２）、トリアジン（Ｔｒｄｎ）、またはカルセクエストリン２（Ｃａｓｑ２）の１つまたは複数を含む、［７８］に記載の方法。
［８０］前記個体が、デスモソームタンパク質中に少なくとも１つの変異を有すると同定される、［５６］に記載の方法。
［８１］前記デスモソームタンパク質がＰＫＰ２である、［８０］に記載の方法。
［８２］前記変異が、欠失、挿入、一塩基変異、またはコピー数多型を含む、［８１］に記載の方法。
[0008]本開示の特徴および利点の理解は、本開示の原理を利用する例示的実施形態を記載する以下の詳細な説明およびその添付図面の参照により深まる。
［１］少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結された、プラコフィリン２（ＰＫＰ２）ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む遺伝子治療用ベクターならびに薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む、心疾患または心障害の処置を必要とする個体において心疾患または心障害を処置するための方法。
［２］前記遺伝子治療用ベクターがウイルスベクターを含む、［１］に記載の方法。
［３］前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択される、［２］に記載の方法。
［４］前記遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである、［２］または［３］に記載の方法。
［５］前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、［４］に記載の方法。
［６］前記アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ９またはその誘導体である、［５］に記載の方法。
［７］前記ＡＡＶ９が、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［６］に記載の方法。
［８］前記遺伝子治療用ベクターが、心筋、心外膜または両方の細胞を標的とする、［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記心疾患または心障害が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である、［１］から［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記組成物を、静脈内、心臓内、心膜、または動脈内に投与する、［１］から［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、［１］から［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記心臓特異的プロモーターが、心筋、心外膜または両方での遺伝子発現を導く、［１１］に記載の方法。
［１３］前記心臓特異的プロモーターが、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］前記トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［１３］に記載の方法。
［１５］前記プロモーターがＰＫＰ２プロモーターである、［１］から［１２］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［１５］に記載の方法。
［１７］前記プロモーターが構成的プロモーターである、［１］から［１０］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記構成的プロモーターがベータアクチンプロモーターである、［１７］に記載の方法。
［１９］前記遺伝子治療用ベクターがさらに、心臓特異的エンハンサーを含む、［１］から［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記遺伝子治療用ベクターがさらに、３’エレメントを含む、［１］から［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］前記３’エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡ）配列、またはそれらの組合せを含む、［２０］に記載の方法。
［２２］前記ＰＫＰ２遺伝子をコードする前記核酸が、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、［１］から［２１］のいずれかに記載の方法。
［２３］前記遺伝子治療用ベクターが、配列番号５に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、［１］から［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］前記薬学的に許容可能な担体または賦形剤が、緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む、［１］から［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］線維脂肪組織置換、心筋委縮、顕著な右室拡張、心室性不整脈、心臓突然死、または運動が引き起こす心イベントの少なくとも１つを好転させる、低下させる、または予防する、［１］から［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］心筋、心外膜、または両方での線維脂肪組織置換を好転させる、低下させる、または予防する、［２５］に記載の方法。
［２７］デスモソームの構造および／または機能を回復させる、［１］から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］ＰＫＰ２タンパク質および活性のレベルを回復させる、［１］から［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］ＰＫＰ２誘導性遺伝子発現を回復させる、［１］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］２型リアノジン受容体（Ｒｙｒ２）、アンキリンＢ（Ａｎｋ２）、Ｃａｃｎａ１ｃ（ＣａＶ１．２）、トリアジン（Ｔｒｄｎ）、またはカルセクエストリン２（Ｃａｓｑ２）の１つまたは複数の発現を回復させる、［１］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］前記個体が、デスモソームタンパク質中に少なくとも１つの変異を有すると同定される、［１］から［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］前記デスモソームタンパク質がＰＫＰ２である、［３１］に記載の方法。
［３３］前記変異が、欠失、挿入、一塩基変異、またはコピー数多型を含む、［３２］に記載の方法。
［３４］少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されたプラコフィリン２遺伝子を含む遺伝子治療用ベクター。
［３５］ウイルスベクターを含む、［３４］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［３６］前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択される、［３５］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［３７］アデノ随伴ウイルスである、［３５］または［３６］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［３８］前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、［３７］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［３９］前記アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ９またはその誘導体である、［３８］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４０］前記ＡＡＶ９が、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［３９］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４１］心筋、心外膜または両方の細胞を標的とする、［３４］から［４０］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［４２］前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、［３４］から［４１］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［４３］前記心臓特異的プロモーターが、心筋、心外膜または両方での遺伝子発現を導く、［４２に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４４］前記心臓特異的プロモーターが、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである、［４２］または［４３］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４５］前記トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［４３］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４６］前記プロモーターがＰＫＰ２プロモーターである、［３４］から［４５］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［４７］前記ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［４６］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［４８］前記プロモーターが構成的プロモーターである、［３４］から［４１］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［４９］前記構成的プロモーターがベータアクチンプロモーターである、［４８］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［５０］さらに心臓特異的エンハンサーを含む、［３４］から［４９］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５１］さらに３’エレメントを含む、［３４］から［５０］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５２］前記３’エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡ）配列、またはそれらの組合せを含む、［５１］に記載の遺伝子治療用ベクター。
［５３］前記ＰＫＰ２遺伝子をコードする前記核酸が、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、［３４］から［５２］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５４］配列番号５に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、［３４］から［５３］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５５］緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む、薬学的に許容可能な担体または賦形剤中で製剤してある、［３４］から［５４］のいずれかに記載の遺伝子治療用ベクター。
［５６］（ａ）プロモーターに作動可能に連結された、プラコフィリン２（ＰＫＰ２）ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸および３’エレメントを含む遺伝子治療用ベクター；ならびに（ｂ）薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む、心疾患または心障害の処置を必要とする個体において心疾患または心障害を処置するための方法。
［５７］前記遺伝子治療用ベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターを含む、［５６］に記載の方法。
［５８］前記遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである、［５６］に記載の方法。
［５９］前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、［５８］に記載の方法。
［６０］前記アデノ随伴ウイルスが、心筋、心外膜または両方の細胞を標的とする、［５９］に記載の方法。
［６１］前記アデノ随伴ウイルスが、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有するＡＡＶ９である、［５９］に記載の方法。
［６２］前記心疾患または心障害が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である、［５６］に記載の方法。
［６３］前記プロモーターが、心臓を含む組織中での発現を引き起こすプロモーターまたは心臓特異的プロモーターである、［５６］に記載の方法。
［６４］前記心臓特異的プロモーターが、心筋、心外膜または両方での遺伝子発現を導く、［６３］に記載の方法。
［６５］前記心臓特異的プロモーターが、ＰＫＰ２プロモーター、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである、［６３］に記載の方法。
［６６］前記ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［６５］に記載の方法。
［６７］前記トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する、［６５］に記載の方法。
［６８］前記３’エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡ）配列、またはそれらの組合せを含む、［５６］に記載の方法。
［６９］前記遺伝子治療用ベクターがさらに、心臓特異的エンハンサーを含む、［５６］に記載の方法。
［７０］前記ＰＫＰ２遺伝子をコードする前記核酸が、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、［５６］に記載の方法。
［７１］前記遺伝子治療用ベクターが、配列番号５に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、［５６］に記載の方法。
［７２］前記核酸が、約４．７ｋｂ以下のサイズを有する、［５６］に記載の方法。
［７３］前記薬学的に許容可能な担体または賦形剤が、緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む、［５６］に記載の方法。
［７４］線維脂肪組織置換；心筋委縮；顕著な右室拡張；心室性不整脈；心臓突然死；運動が引き起こす心イベント；右室心筋症、右室拡張または右心不全；左室心筋症、左室拡張または左心不全；心房性不整脈；失神；動悸；息切れ；または胸痛の少なくとも１つを好転させる、低下させる、または予防する、［５６］に記載の方法。
［７５］心筋、心外膜、または両方での線維脂肪組織置換を好転させる、低下させる、または予防する、［７４］に記載の方法。
［７６］デスモソームの構造および／または機能を回復させる、［５６］に記載の方法。
［７７］ＰＫＰ２ ｍＲＮＡの発現および／またはＰＫＰ２タンパク質および活性のレベルを回復させる、［５６］に記載の方法。
［７８］前記心疾患の１つまたは複数の症状に対する直接的または間接的な効果を有する１つまたは複数の遺伝子の発現を回復させる、［５６］に記載の方法。
［７９］前記遺伝子が、２型リアノジン受容体（Ｒｙｒ２）、アンキリンＢ（Ａｎｋ２）、Ｃａｃｎａ１ｃ（ＣａＶ１．２）、トリアジン（Ｔｒｄｎ）、またはカルセクエストリン２（Ｃａｓｑ２）の１つまたは複数を含む、［７８］に記載の方法。
［８０］前記個体が、デスモソームタンパク質中に少なくとも１つの変異を有すると同定される、［５６］に記載の方法。
［８１］前記デスモソームタンパク質がＰＫＰ２である、［８０］に記載の方法。
［８２］前記変異が、欠失、挿入、一塩基変異、またはコピー数多型を含む、［８１］に記載の方法。
[0008]本開示の特徴および利点の理解は、本開示の原理を利用する例示的実施形態を記載する以下の詳細な説明およびその添付図面の参照により深まる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】[0009]心臓デスモソームが細胞をつなぎ合わせる様子を例証する。
【図2】[0010]ＡＲＶＣ疾患の徴候および可能な疾患機序の概要を示す。
【図3A】[0011]図３Ａ～３Ｃは、ｉＰＳＣＭ中でのＰＫＰ２の急性サイレンシングの８日目の結果を示す。図３Ａは、細胞膜からのＤＳＰの消失を示す。図３Ｂは、サルコメア密度の低下を例証するグラフを示す。図３Ｃは、パターン化されたｉＰＳＣＭにおける細胞コンパクションの錯綜配列を示す。
【図3B】図３Ａ～３Ｃは、ｉＰＳＣＭ中でのＰＫＰ２の急性サイレンシングの８日目の結果を示す。図３Ａは、細胞膜からのＤＳＰの消失を示す。図３Ｂは、サルコメア密度の低下を例証するグラフを示す。図３Ｃは、パターン化されたｉＰＳＣＭにおける細胞コンパクションの錯綜配列を示す。
【図3C】図３Ａ～３Ｃは、ｉＰＳＣＭ中でのＰＫＰ２の急性サイレンシングの８日目の結果を示す。図３Ａは、細胞膜からのＤＳＰの消失を示す。図３Ｂは、サルコメア密度の低下を例証するグラフを示す。図３Ｃは、パターン化されたｉＰＳＣＭにおける細胞コンパクションの錯綜配列を示す。
【図4】[0012]ＰＫＧとの共局在により特定された、ＤＳＰ膜局在の定量分析を示す。
【図5】[0013]主に不溶性画分中に検出される、ＰＫＰ２がサイレンシングされた細胞中では低下したＤＳＰタンパク質の総量を例証する免疫ブロットを示す。
【図6A】[0014]図６Ａ～６Ｂは、ＡＡＶによるＰＫＰ２形質導入の結果を示す。図６Ａは、ＡＡＶ構築物のベクターマップを示す。図６Ｂは、ＤＳＰ膜局在の回復の免疫蛍光画像を示す。図６Ｃは、ＰＫＰ２サイレンシングおよびＡＡＶ－ＰＫＰ２導入遺伝子レスキューに続くＤＳＰ総強度の定量を示す。
【図6B】図６Ａ～６Ｂは、ＡＡＶによるＰＫＰ２形質導入の結果を示す。図６Ａは、ＡＡＶ構築物のベクターマップを示す。図６Ｂは、ＤＳＰ膜局在の回復の免疫蛍光画像を示す。図６Ｃは、ＰＫＰ２サイレンシングおよびＡＡＶ－ＰＫＰ２導入遺伝子レスキューに続くＤＳＰ総強度の定量を示す。
【図6C】図６Ａ～６Ｂは、ＡＡＶによるＰＫＰ２形質導入の結果を示す。図６Ａは、ＡＡＶ構築物のベクターマップを示す。図６Ｂは、ＤＳＰ膜局在の回復の免疫蛍光画像を示す。図６Ｃは、ＰＫＰ２サイレンシングおよびＡＡＶ－ＰＫＰ２導入遺伝子レスキューに続くＤＳＰ総強度の定量を示す。
【図7A】[0015]図７Ａ～７Ｂは、収縮速度を用いた、ＡＡＶによるＰＫＰ２形質導入の結果を示す。図７Ａは、実験時系列を示す。図７Ｂは、ＰＫＰ２サイレンシング後に低下した速度の機能的レスキューを実証する２つの収縮性アッセイを示す。
【図7B】図７Ａ～７Ｂは、収縮速度を用いた、ＡＡＶによるＰＫＰ２形質導入の結果を示す。図７Ａは、実験時系列を示す。図７Ｂは、ＰＫＰ２サイレンシング後に低下した速度の機能的レスキューを実証する２つの収縮性アッセイを示す。
【図8】[0016]ヒトおよびマウスのＰＫＰ２αのＡＡＶ発現カセットの第２世代の略図を示す。左図は、発現カセット中のエレメントのすべてを示す。右図は、発現カセット中のエレメントの構成を示す。
【図9A】[0017]図９Ａおよび図９Ｂは、ｉＰＳＣ心筋細胞中でのＰＫＰ２サイレンシングに続く収縮速度の第２世代ＡＡＶ－ｈＰＫＰ２αレスキューの結果を示す。図９Ａは、異なる感染多重度で形質導入された細胞中での可溶性画分および不溶性画分における発現を示す。図９Ｂは、ＰＫＰ２サイレンシング後の細胞中での収縮速度のレスキューを示す。
【図9B】図９Ａおよび図９Ｂは、ｉＰＳＣ心筋細胞中でのＰＫＰ２サイレンシングに続く収縮速度の第２世代ＡＡＶ－ｈＰＫＰ２αレスキューの結果を示す。図９Ａは、異なる感染多重度で形質導入された細胞中での可溶性画分および不溶性画分における発現を示す。図９Ｂは、ＰＫＰ２サイレンシング後の細胞中での収縮速度のレスキューを示す。
【図10】[0018]野生型マウスでの第２世代ＡＡＶ－ＰＫＰ２αの発現を示す。
【図11A】[0019]図１１Ａ～１１Ｇは、野生型マウスでの、第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの予備的発現安全性試験の結果を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ９注入前および注入後の体重を示す。図１１Ｂは、ＡＡＶ９ヒトまたはマウスＰＫＰ２αで処置したマウスでの駆出分画を示す。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、拡張末期内径および収縮末期内径により測定したＬＶ構造を示す。図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、ＱＲＳ（１１Ｅ）、ＱＴ時間（１１Ｆ）およびＰ／Ｒ振幅（１１Ｇ）による電気生理学的活性を示す。
【図11B】図１１Ａ～１１Ｇは、野生型マウスでの、第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの予備的発現安全性試験の結果を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ９注入前および注入後の体重を示す。図１１Ｂは、ＡＡＶ９ヒトまたはマウスＰＫＰ２αで処置したマウスでの駆出分画を示す。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、拡張末期内径および収縮末期内径により測定したＬＶ構造を示す。図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、ＱＲＳ（１１Ｅ）、ＱＴ時間（１１Ｆ）およびＰ／Ｒ振幅（１１Ｇ）による電気生理学的活性を示す。
【図11C】図１１Ａ～１１Ｇは、野生型マウスでの、第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの予備的発現安全性試験の結果を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ９注入前および注入後の体重を示す。図１１Ｂは、ＡＡＶ９ヒトまたはマウスＰＫＰ２αで処置したマウスでの駆出分画を示す。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、拡張末期内径および収縮末期内径により測定したＬＶ構造を示す。図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、ＱＲＳ（１１Ｅ）、ＱＴ時間（１１Ｆ）およびＰ／Ｒ振幅（１１Ｇ）による電気生理学的活性を示す。
【図11D】図１１Ａ～１１Ｇは、野生型マウスでの、第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの予備的発現安全性試験の結果を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ９注入前および注入後の体重を示す。図１１Ｂは、ＡＡＶ９ヒトまたはマウスＰＫＰ２αで処置したマウスでの駆出分画を示す。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、拡張末期内径および収縮末期内径により測定したＬＶ構造を示す。図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、ＱＲＳ（１１Ｅ）、ＱＴ時間（１１Ｆ）およびＰ／Ｒ振幅（１１Ｇ）による電気生理学的活性を示す。
【図11E】図１１Ａ～１１Ｇは、野生型マウスでの、第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの予備的発現安全性試験の結果を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ９注入前および注入後の体重を示す。図１１Ｂは、ＡＡＶ９ヒトまたはマウスＰＫＰ２αで処置したマウスでの駆出分画を示す。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、拡張末期内径および収縮末期内径により測定したＬＶ構造を示す。図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、ＱＲＳ（１１Ｅ）、ＱＴ時間（１１Ｆ）およびＰ／Ｒ振幅（１１Ｇ）による電気生理学的活性を示す。
【図11F】図１１Ａ～１１Ｇは、野生型マウスでの、第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの予備的発現安全性試験の結果を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ９注入前および注入後の体重を示す。図１１Ｂは、ＡＡＶ９ヒトまたはマウスＰＫＰ２αで処置したマウスでの駆出分画を示す。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、拡張末期内径および収縮末期内径により測定したＬＶ構造を示す。図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、ＱＲＳ（１１Ｅ）、ＱＴ時間（１１Ｆ）およびＰ／Ｒ振幅（１１Ｇ）による電気生理学的活性を示す。
【図11G】図１１Ａ～１１Ｇは、野生型マウスでの、第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの予備的発現安全性試験の結果を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ９注入前および注入後の体重を示す。図１１Ｂは、ＡＡＶ９ヒトまたはマウスＰＫＰ２αで処置したマウスでの駆出分画を示す。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、拡張末期内径および収縮末期内径により測定したＬＶ構造を示す。図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、ＱＲＳ（１１Ｅ）、ＱＴ時間（１１Ｆ）およびＰ／Ｒ振幅（１１Ｇ）による電気生理学的活性を示す。
【図12】[0020]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。
【図13A】[0021]図１３Ａ～１３Ｂは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの右室（ＲＶ）拡張型心筋症を示す。図１３Ａ（左図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＲＶ拡張末期内径（ＲＶＩＤｄ）の増加を例証する画像を示す。図１３Ａ（右図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける経時的なＲＶＩＤｄのグラフを示す。図１３Ｂ（左図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＲＶ面積の増加を例証する画像を示す。図１３Ｂ（右図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける経時的なＲＶ面積のグラフを示す。
【図13B】図１３Ａ～１３Ｂは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの右室（ＲＶ）拡張型心筋症を示す。図１３Ａ（左図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＲＶ拡張末期内径（ＲＶＩＤｄ）の増加を例証する画像を示す。図１３Ａ（右図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける経時的なＲＶＩＤｄのグラフを示す。図１３Ｂ（左図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＲＶ面積の増加を例証する画像を示す。図１３Ｂ（右図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける経時的なＲＶ面積のグラフを示す。
【図14A】[0022]図１４Ａ～１４Ｂは、対照と比べた、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの左室（ＬＶ）拡張型心筋症の発現を示す。図１４Ａ（左図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＬＶ収縮末期内径（ＲＶＩＤｓ）およびＬＶ拡張末期内径（ＬＶＩＤｄ）の増加の画像を示す。図１４Ａ（右図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＬＶＩＤｓおよびＬＶＩＤｄの経時的な増加を示すグラフを示す。図１４Ｂは、経時的な駆出分画パーセントにより測定したＬＶパフォーマンスのグラフを示す。
【図14B】図１４Ａ～１４Ｂは、対照と比べた、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの左室（ＬＶ）拡張型心筋症の発現を示す。図１４Ａ（左図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＬＶ収縮末期内径（ＲＶＩＤｓ）およびＬＶ拡張末期内径（ＬＶＩＤｄ）の増加の画像を示す。図１４Ａ（右図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＬＶＩＤｓおよびＬＶＩＤｄの経時的な増加を示すグラフを示す。図１４Ｂは、経時的な駆出分画パーセントにより測定したＬＶパフォーマンスのグラフを示す。
【図15】[0023]対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの重度の電気生理学的表現型の発現、特にＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＱＲＳ時間の延長およびＰ／Ｒ振幅比の上昇を示す。上図は、対照およびＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの例示的心電図を示す。下図は、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＱＲＳ時間の増加およびＰ／Ｒ振幅の増加に関するグラフを示す。
【図16A】[0024]図１６Ａ～１６Ｃは、線維症遺伝子、組織リモデリング遺伝子、および心不全マーカーの発現の上昇を示す。図１６Ａは、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの、ＲＶおよびＬＶでのＰＫＰ２ ＲＮＡ発現（上図）ならびにデスモソームおよびＣｘ４３のタンパク質発現（下図）を示す。図１６Ｂは、線維症遺伝子：ＴＧＦβ１、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１；ならびに組織リモデリング遺伝子：Ｔｉｍｐ１およびＭｍｐ２の、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの発現の上昇を示す。図１６Ｃは、対照マウスと比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの、心不全マーカー、ＮＰＰＡおよびＮＰＰＢの発現の上昇を示す。
【図16B】図１６Ａ～１６Ｃは、線維症遺伝子、組織リモデリング遺伝子、および心不全マーカーの発現の上昇を示す。図１６Ａは、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの、ＲＶおよびＬＶでのＰＫＰ２ ＲＮＡ発現（上図）ならびにデスモソームおよびＣｘ４３のタンパク質発現（下図）を示す。図１６Ｂは、線維症遺伝子：ＴＧＦβ１、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１；ならびに組織リモデリング遺伝子：Ｔｉｍｐ１およびＭｍｐ２の、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの発現の上昇を示す。図１６Ｃは、対照マウスと比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの、心不全マーカー、ＮＰＰＡおよびＮＰＰＢの発現の上昇を示す。
【図16C】図１６Ａ～１６Ｃは、線維症遺伝子、組織リモデリング遺伝子、および心不全マーカーの発現の上昇を示す。図１６Ａは、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの、ＲＶおよびＬＶでのＰＫＰ２ ＲＮＡ発現（上図）ならびにデスモソームおよびＣｘ４３のタンパク質発現（下図）を示す。図１６Ｂは、線維症遺伝子：ＴＧＦβ１、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１；ならびに組織リモデリング遺伝子：Ｔｉｍｐ１およびＭｍｐ２の、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの発現の上昇を示す。図１６Ｃは、対照マウスと比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの、心不全マーカー、ＮＰＰＡおよびＮＰＰＢの発現の上昇を示す。
【図17】[0025]ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルにおける遺伝子治療としてのＰＫＰ２の有効性を評価するための実験計画を示す。
【図18】[0026]図１８Ａは、ヒトおよびマウスのＰＫＰ２αのＡＡＶ発現カセットの略図を示す。図１８Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したマウスに由来するマウスおよびヒトＰＫＰ２αのタンパク質発現の免疫ブロットを示す。
【図19】[0027]ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。
【図20A】[0028]図２０Ａ～２０Ｃは、ＲＶおよびＬＶの拡張の低下ならびに心機能の維持における、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置の有効性を示す。図２０Ａは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスにおける駆出分画の改善を例証するグラフを示す。図２０Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスにおけるＲＶ拡張の低下を例証するグラフを示す。図２０Ｃは、ＬＶＩＤｄ（上図）およびＬＶＩＤｓ（下図）における改善を例証するグラフを示す。
【図20B】図２０Ａ～２０Ｃは、ＲＶおよびＬＶの拡張の低下ならびに心機能の維持における、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置の有効性を示す。図２０Ａは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスにおける駆出分画の改善を例証するグラフを示す。図２０Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスにおけるＲＶ拡張の低下を例証するグラフを示す。図２０Ｃは、ＬＶＩＤｄ（上図）およびＬＶＩＤｓ（下図）における改善を例証するグラフを示す。
【図20C】図２０Ａ～２０Ｃは、ＲＶおよびＬＶの拡張の低下ならびに心機能の維持における、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置の有効性を示す。図２０Ａは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスにおける駆出分画の改善を例証するグラフを示す。図２０Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスにおけるＲＶ拡張の低下を例証するグラフを示す。図２０Ｃは、ＬＶＩＤｄ（上図）およびＬＶＩＤｓ（下図）における改善を例証するグラフを示す。
【図21A】[0029]図２１Ａ～２１Ｂは、ＡＡＶ：ＰＫＰ２で処置されたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＥＣＧパラメータの改善を示す。図２１Ａは、対照、ならびにＡＡＶ９：ｍＰＫＰ２および緩衝液で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの例示的な未処理のＥＣＧトレースを示す。図２１Ｂは、緩衝液での処置と比べたＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＰ／Ｒ比、ＱＴ時間、およびＱＲＳ時間の改善を例証するグラフを示す。
【図21B】図２１Ａ～２１Ｂは、ＡＡＶ：ＰＫＰ２で処置されたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＥＣＧパラメータの改善を示す。図２１Ａは、対照、ならびにＡＡＶ９：ｍＰＫＰ２および緩衝液で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの例示的な未処理のＥＣＧトレースを示す。図２１Ｂは、緩衝液での処置と比べたＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＰ／Ｒ比、ＱＴ時間、およびＱＲＳ時間の改善を例証するグラフを示す。
【図22A】[0030]図２２Ａ～２２Ｂは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける不整脈でのＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置による改善を示す。図２２Ａ（上図）は、不整脈の重症度の分類の表を示す。図２２Ａ（下図）は、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの不整脈スコアの、対照と比べた改善をまとめるグラフを示す。図２２Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける不整脈の重症度の、対照と比べた改善を示す分布グラフを示す。各々の点は、１匹の動物を表す。
【図22B】図２２Ａ～２２Ｂは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける不整脈でのＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置による改善を示す。図２２Ａ（上図）は、不整脈の重症度の分類の表を示す。図２２Ａ（下図）は、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの不整脈スコアの、対照と比べた改善をまとめるグラフを示す。図２２Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける不整脈の重症度の、対照と比べた改善を示す分布グラフを示す。各々の点は、１匹の動物を表す。
【図23】[0031]ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルを用いて、遺伝子治療としてのヒトＰＫＰ２の有効性を評価するために使用した実験計画を示す。
【図24A】[0032]図２４Ａ～２４Ｄは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２遺伝子治療処置の結果を示す。図２４Ａは、駆出分画の結果を示す。図２４Ｂは、右室サイズの結果を示す。図２４Ｃは、ＬＶＩＤｄにより測定したＬＶ拡張を示す。図２４Ｄは、ＬＶＩＤｓにより測定したＬＶ拡張を示す。
【図24B】図２４Ａ～２４Ｄは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２遺伝子治療処置の結果を示す。図２４Ａは、駆出分画の結果を示す。図２４Ｂは、右室サイズの結果を示す。図２４Ｃは、ＬＶＩＤｄにより測定したＬＶ拡張を示す。図２４Ｄは、ＬＶＩＤｓにより測定したＬＶ拡張を示す。
【図24C】図２４Ａ～２４Ｄは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２遺伝子治療処置の結果を示す。図２４Ａは、駆出分画の結果を示す。図２４Ｂは、右室サイズの結果を示す。図２４Ｃは、ＬＶＩＤｄにより測定したＬＶ拡張を示す。図２４Ｄは、ＬＶＩＤｓにより測定したＬＶ拡張を示す。
【図24D】図２４Ａ～２４Ｄは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２遺伝子治療処置の結果を示す。図２４Ａは、駆出分画の結果を示す。図２４Ｂは、右室サイズの結果を示す。図２４Ｃは、ＬＶＩＤｄにより測定したＬＶ拡張を示す。図２４Ｄは、ＬＶＩＤｓにより測定したＬＶ拡張を示す。
【図25】[0033]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２遺伝子治療処置の結果を、ＱＴ時間（上図）、Ｐ／Ｒ比（中央図）、および不整脈スコア（下図）に関して示す。
【図26A】[0034]図２６Ａ～２６Ｂは、右室（図２６Ａ）および左室（図２６Ｂ）での心不全マーカー、線維症マーカー、および組織リモデリングマーカーの発現の低下における、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置の結果を示す。
【図26B】図２６Ａ～２６Ｂは、右室（図２６Ａ）および左室（図２６Ｂ）での心不全マーカー、線維症マーカー、および組織リモデリングマーカーの発現の低下における、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置の結果を示す。
【図27A】[0035]図２７Ａ～２７Ｂは、線維症発症の低下における、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置の結果を示す。図２７Ａは、対照、ならびにＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置を伴うおよび伴わないＰＫＰ２－ｃＫＯマウスに由来する筋肉の組織学的画像を示す。図２７Ｂは、対照、ならびにＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置を伴うおよび伴わないＰＫＰ２－ｃＫＯマウスに由来するコラーゲン陽性組織のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
[0037]不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）の最も一般的な遺伝的根拠は、デスモソームのタンパク質をコードする遺伝子中の突然変異である。機能的に、デスモソームは、インターカレートされた（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）心筋細胞を結束する接着性細胞間接続である。デスモソーム遺伝子の１つであるプラコフィリン２（ＰＫＰ２）は、ＡＲＶＣの要因として最も頻繁に同定されている。膜に位置する複合体の内部で、ＰＫＰ２は、デスモソームのタンパク質であるプラコグロビン（ＰＫＧ）およびデスモプラキン（ＤＳＰ）と相互作用する。ＤＳＰは、心細胞の収縮単位であるサルコメア、および他の細胞小器官を安定化させるために絡み合ったネットワークを形成する、中間径フィラメントであるデスミンを固定する（図１、Brodehl等、2018;Moncayo-ArlandiおよびBrugada、2017）。デスモソームの損失は、細胞接着、シグナル伝達、および心筋細胞の電気的結合に影響を与えると見られている（Wang等、2018）。さらに、シグナル伝達および電気的結合の損失は、コネキシンを含有するギャップ結合（ＧＪ）のさらなる崩壊による、併発する異常結果である。ＧＪは、細胞の電気的結合において本質的であり、かつ細胞間での小分子の流れを可能にすることで同期鼓動を促進する（Green等、2019）（図２、ＡＲＶＣ疾患の徴候および可能な機序に関する概要）。さらに、心外膜分化が、ＡＲＶＣ患者またはＡＣＭ患者において認められた線維脂肪リモデリングに寄与し得る（Kohela等、2021）。
【0011】
[0038]デスモソームの機能性を明らかにするために、遺伝的マウス株および患者由来ｉＰＳＣＭモデルを生成した。ＰＫＰ２の心臓ノックアウトマウスモデル（Ｄｅｌｍａｒマウスモデル、Cerrone等、2017）は、両心室拡張、線維症、およびＣａ２＋ホメオスタシスを調節する遺伝子の著しい低下に関する重大な初期発症を示し、明白な構造変化が起きる前の不整脈の発症機序を明らかにする可能性がある。ＰＫＰ２突然変異を含有するいくつかの患者由来ｉＰＳＣＭ株は、ＰＫＰ２発現の低下、Ｃａ２＋ハンドリングの欠陥、および脂質生成誘導培地中での培養により誘導される脂肪滴蓄積を示した（Brodehl等、2019）。
【0012】
[0039]ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルでのＰＫＰ２の低下が、ＰＫＰ２突然変異を有するＡＲＶＣ患者心臓試料中で報告された（Akdis等、2016；Asimaki等、2009)。ＰＫＰ２突然変異を含むいくつかのデスモソーム遺伝子突然変異に関して、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）が提案され、変異した転写物およびタンパク質の発現の平衡を保つほとんど知られていない細胞機序が示唆される（GerullおよびBrodehl、2020；Mura等、2003)。それらの観察は、心臓中でのＷＴ ＰＫＰ２の発現レベルを回復させることによる、遺伝子治療ベースのＡＲＶＣの介入の可能性を示唆する。
【0013】
処置の方法
[0040]本明細書の種々の態様で提供されるＰＫＰ２遺伝子治療用ベクターは、心臓の疾患または状態を有する個体の処置に有用である。「処置」または「処置を必要とする状態または対象の処置」は、（１）臨床結果、例えば症状の軽減を含む、有益なもしくは所望の結果を得るための工程を行うこと；（２）該疾患を予防すること、例えば、該疾患にかかりやすい、例えば、デスモソーム遺伝子、例えばＰＫＰ２における遺伝子突然変異のキャリアであるがまだ該疾患の症状を経験しても、示してもいない患者において該疾患の臨床症状が発症しないようにさせること；（３）該疾患を抑制すること、例えば、該疾患もしくはその臨床症状の発症を阻止するもしくは軽減すること；（４）該疾患を緩和させること、例えば、該疾患もしくはその臨床症状を後退させること；または（５）該疾患を遅延させることに関する。一態様では、心疾患または心障害の処置を必要とする個体において心疾患または心障害を処置するための方法が、本明細書で提供される。いくつかの場合、該方法が、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結された、プラコフィリン２（ＰＫＰ２）ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む遺伝子治療用ベクター、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む。いくつかの場合、該心疾患または心障害が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である。いくつかの場合、本明細書中の処置の方法が、不整脈原性心筋症の少なくとも１つの症状を軽減し、線維脂肪組織置換；心筋委縮；顕著な右室拡張；心室性不整脈；心臓突然死；運動が引き起こす心イベント；右室心筋症、右室拡張または右心不全；左室心筋症、左室拡張または左心不全；心房性不整脈；失神；動悸；息切れ；または胸痛の少なくとも１つを好転させる、低下させる、または予防する方法を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該方法が、心筋、心外膜、または両方での線維脂肪組織置換を好転させる、低下させる、または予防する。いくつかの場合、該方法が、デスモソームの構造および／または機能を回復させる。いくつかの場合、該方法が、ＰＫＰ２ ｍＲＮＡの発現および／またはＰＫＰ２タンパク質および活性のレベルを回復させる。いくつかの場合、該方法が、ＰＫＰ２誘導性遺伝子発現を回復させる。いくつかの場合、ＰＫＰ２誘導性遺伝子発現は、その遺伝子の発現が１つまたは複数の疾患表現型をもたらす直接的または間接的な要因である遺伝子の発現を含む。いくつかの実施形態では、該方法が、該心疾患の１つまたは複数の症状に対する直接的または間接的な効果を有する１つまたは複数の遺伝子の発現を回復させる。いくつかの場合、該方法が、２型リアノジン受容体（Ｒｙｒ２）、アンキリンＢ（Ａｎｋ２）、Ｃａｃｎａ１ｃ（ＣａＶ１．２）、トリアジン（Ｔｒｄｎ）、またはカルセクエストリン２（Ｃａｓｑ２）の１つまたは複数の発現を回復させる。
[0040]本明細書の種々の態様で提供されるＰＫＰ２遺伝子治療用ベクターは、心臓の疾患または状態を有する個体の処置に有用である。「処置」または「処置を必要とする状態または対象の処置」は、（１）臨床結果、例えば症状の軽減を含む、有益なもしくは所望の結果を得るための工程を行うこと；（２）該疾患を予防すること、例えば、該疾患にかかりやすい、例えば、デスモソーム遺伝子、例えばＰＫＰ２における遺伝子突然変異のキャリアであるがまだ該疾患の症状を経験しても、示してもいない患者において該疾患の臨床症状が発症しないようにさせること；（３）該疾患を抑制すること、例えば、該疾患もしくはその臨床症状の発症を阻止するもしくは軽減すること；（４）該疾患を緩和させること、例えば、該疾患もしくはその臨床症状を後退させること；または（５）該疾患を遅延させることに関する。一態様では、心疾患または心障害の処置を必要とする個体において心疾患または心障害を処置するための方法が、本明細書で提供される。いくつかの場合、該方法が、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結された、プラコフィリン２（ＰＫＰ２）ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む遺伝子治療用ベクター、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む。いくつかの場合、該心疾患または心障害が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である。いくつかの場合、本明細書中の処置の方法が、不整脈原性心筋症の少なくとも１つの症状を軽減し、線維脂肪組織置換；心筋委縮；顕著な右室拡張；心室性不整脈；心臓突然死；運動が引き起こす心イベント；右室心筋症、右室拡張または右心不全；左室心筋症、左室拡張または左心不全；心房性不整脈；失神；動悸；息切れ；または胸痛の少なくとも１つを好転させる、低下させる、または予防する方法を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該方法が、心筋、心外膜、または両方での線維脂肪組織置換を好転させる、低下させる、または予防する。いくつかの場合、該方法が、デスモソームの構造および／または機能を回復させる。いくつかの場合、該方法が、ＰＫＰ２ ｍＲＮＡの発現および／またはＰＫＰ２タンパク質および活性のレベルを回復させる。いくつかの場合、該方法が、ＰＫＰ２誘導性遺伝子発現を回復させる。いくつかの場合、ＰＫＰ２誘導性遺伝子発現は、その遺伝子の発現が１つまたは複数の疾患表現型をもたらす直接的または間接的な要因である遺伝子の発現を含む。いくつかの実施形態では、該方法が、該心疾患の１つまたは複数の症状に対する直接的または間接的な効果を有する１つまたは複数の遺伝子の発現を回復させる。いくつかの場合、該方法が、２型リアノジン受容体（Ｒｙｒ２）、アンキリンＢ（Ａｎｋ２）、Ｃａｃｎａ１ｃ（ＣａＶ１．２）、トリアジン（Ｔｒｄｎ）、またはカルセクエストリン２（Ｃａｓｑ２）の１つまたは複数の発現を回復させる。
【0014】
[0041]本明細書で提供される処置の方法のいくつかの実施形態では、遺伝子治療用ベクターがウイルスベクターを含む。任意の適切なウイルスベクターが、本明細書の方法での使用に予定され、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。いくつかの場合、遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである。いくつかの場合、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９、またはそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの場合、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ９またはその誘導体である。いくつかの場合、該ＡＡＶ９が、配列番号７に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの場合、心筋または心外膜、例えば心筋細胞中の病的細胞の形質導入を改善するために、該アデノ随伴ウイルスが修飾されており、例えば、いくつかの場合、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９の誘導体である。いくつかの場合、該誘導体が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許出願第６３／０１２，７０３号明細書に記載される任意のＡＡＶである。
【0015】
[0042]本明細書で提供される処置のいくつかの実施形態または方法では、遺伝子治療用ベクターを含む組成物を、病的細胞に到達するための任意の適切な経路を介して投与する。例えば、いくつかの場合、組成物を、静脈内、心臓内、心膜、または動脈内に投与する。
【0016】
[0043]本明細書で提供される処置の方法のいくつかの実施形態では、ＰＫＰ２を、心筋または心外膜中の病的な細胞および組織、例えば心筋細胞中での発現に適切な任意のプロモーターにより発現させる。例えば、いくつかの場合、該プロモーターが心臓特異的プロモーターである。いくつかの場合、該心臓特異的プロモーターが、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである。いくつかの場合、該プロモーターがＰＫＰ２プロモーターである。いくつかの場合、心臓特異的エンハンサーを、該プロモーターと組み合わせる。いくつかの場合、該トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの場合、該ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの場合、該プロモーターが構成的プロモーターである。いくつかの場合、該構成的プロモーターがベータアクチンプロモーターである。
【0017】
[0044]本明細書で提供される処置の方法のいくつかの実施形態では、ＰＫＰ２遺伝子をコードする核酸が、例えばＰＫＰ２ポリペプチドをコードする任意の適切な配列、配列番号８の配列を有するポリペプチドをコードする任意の核酸を有する。例えば、いくつかの場合、ＰＫＰ２遺伝子が、配列番号１に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を有する。いくつかの場合、ＰＫＰ２遺伝子が、配列番号２に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を有する。いくつかの場合、ＰＫＰ２遺伝子をコードする核酸配列が、コドン最適化されている。
【0018】
[0045]本明細書で提供される処置の方法のいくつかの実施形態では、遺伝子治療用ベクターが、約３ｋｂ～約５ｋｂのサイズを有する遺伝子発現カセットを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４ｋｂ～約５ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．２ｋｂ～約４．８ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．５ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約５ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．９ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．８ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．７ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．６ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．５ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．４ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．３ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．２ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．１ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．９ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．８ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．７ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．６ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．５ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．１ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．３ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．５ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．７ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．９ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．１ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．２ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．３ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．４ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．５ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．６ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．７ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．８ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．９ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約５ｋｂのサイズを有する。
【0019】
[0046]本明細書での方法の種々の実施形態では、ＰＫＰ２遺伝子を含む遺伝子治療用ベクターが、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物中で製剤してある。例えば、いくつかの場合、該薬学的に許容可能な担体または賦形剤が、緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む。
【0020】
[0047]本明細書で提供される処置の方法のいくつかの実施形態では、個体が、デスモソームタンパク質中に少なくとも１つの変異を有すると同定される。いくつかの場合、該デスモソームタンパク質がＰＫＰ２である。いくつかの場合、該変異が、欠失、挿入、一塩基変異、またはコピー数多型を含む。いくつかの場合、ＤＮＡシーケンシング、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、または個体中の遺伝子変異を同定する他の適切な方法を介して、個体が、デスモソームタンパク質中に少なくとも１つの変異を有すると同定される。
【0021】
遺伝子治療用ベクター
[0048]他の態様では、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されたプラコフィリン２遺伝子を含む遺伝子治療用ベクターを提供する。いくつかの場合、該遺伝子治療用ベクターがウイルスベクターを含む。いくつかの場合、該ウイルスベクターが、心臓の疾患または状態を処置するための任意の適切なウイルスベクターである。いくつかの場合、該ウイルスベクターが、心筋、心外膜、または両方の細胞へと遺伝子を送達するために適切である。いくつかの場合、該ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択される。いくつかの場合、該遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである。いくつかの場合、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９、またはそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの場合、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ９またはその誘導体である。いくつかの場合、該ＡＡＶ９が、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの場合、該アデノ随伴ウイルスが、本明細書中の処置の方法により細胞に形質導入するために最適化された、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９の誘導体である。いくつかの場合、該誘導体が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許出願第６３／０１２，７０３号明細書に記載される任意のＡＡＶである。
[0048]他の態様では、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されたプラコフィリン２遺伝子を含む遺伝子治療用ベクターを提供する。いくつかの場合、該遺伝子治療用ベクターがウイルスベクターを含む。いくつかの場合、該ウイルスベクターが、心臓の疾患または状態を処置するための任意の適切なウイルスベクターである。いくつかの場合、該ウイルスベクターが、心筋、心外膜、または両方の細胞へと遺伝子を送達するために適切である。いくつかの場合、該ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択される。いくつかの場合、該遺伝子治療用ベクターがアデノ随伴ウイルスである。いくつかの場合、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９、またはそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの場合、該アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ９またはその誘導体である。いくつかの場合、該ＡＡＶ９が、配列番号７に対する少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの場合、該アデノ随伴ウイルスが、本明細書中の処置の方法により細胞に形質導入するために最適化された、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９の誘導体である。いくつかの場合、該誘導体が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許出願第６３／０１２，７０３号明細書に記載される任意のＡＡＶである。
【0022】
[0049]本明細書で提供される遺伝子治療用ベクターのいくつかの実施形態では、ＰＫＰ２を、病的な細胞および組織、例えば心筋細胞中での発現に適切な任意のプロモーターにより発現させる。いくつかの場合、ＰＫＰ２を、心筋、心外膜、または両方の細胞中で活性であるプロモーターにより発現させる。例えばいくつかの場合、該プロモーターが心臓特異的プロモーターである。いくつかの場合、該心臓特異的プロモーターが、トロポニンプロモーターまたはアルファミオシン重鎖プロモーターである。いくつかの場合、該プロモーターがＰＫＰ２プロモーターである。いくつかの場合、心臓特異的エンハンサーを、該プロモーターと組み合わせる。いくつかの場合、該トロポニンプロモーターが、配列番号３に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの場合、該ＰＫＰ２プロモーターが、配列番号４に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの場合、該プロモーターが構成的プロモーターである。いくつかの場合、該構成的プロモーターがベータアクチンプロモーターである。
【0023】
[0050]本明細書で提供される遺伝子治療用ベクターのいくつかの実施形態では、ＰＫＰ２遺伝子をコードする核酸が、例えばＰＫＰ２ポリペプチドをコードする任意の適切な配列、配列番号８の配列を有するポリペプチドをコードする任意の核酸を有する。例えば、いくつかの場合、ＰＫＰ２遺伝子が、配列番号１に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を有する。いくつかの場合、ＰＫＰ２遺伝子が、配列番号２に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を有する。いくつかの場合、ＰＫＰ２遺伝子をコードする核酸配列が、コドン最適化されている。
【0024】
[0051]本明細書で提供される遺伝子治療用ベクターのいくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターが３’エレメントを含む。いくつかの実施形態では、該３’エレメントが、該遺伝子治療用ベクターの転写産物（例えばＰＫＰ２転写物）を安定化させる。いくつかの実施形態では、該３’エレメントが、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。
【0025】
[0052]本明細書で提供される遺伝子治療用ベクターのいくつかの実施形態では、該遺伝子治療用ベクターが、約３ｋｂ～約５ｋｂのサイズを有する遺伝子発現カセットを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４ｋｂ～約５ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．２ｋｂ～約４．８ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．５ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約５ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．９ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．８ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．７ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．６ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．５ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．４ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．３ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．２ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４．１ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約４ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．９ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．８ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．７ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．６ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、約３．５ｋｂ以下のサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．１ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．３ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．５ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．７ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約３．９ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．１ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．２ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．３ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．４ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．５ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．６ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．７ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．８ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約４．９ｋｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、該遺伝子発現カセットが、少なくとも約５ｋｂのサイズを有する。
【0026】
[0053]本明細書で提供される遺伝子治療用ベクターの種々の実施形態では、ＰＫＰ２遺伝子を含む該遺伝子治療用ベクターが、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物中で製剤してある。例えば、いくつかの場合、該薬学的に許容可能な担体または賦形剤が、緩衝液、ポリマー、塩、またはそれらの組合せを含む。
【0027】
[0054]いくつかの実施形態では、本明細書の遺伝子治療用ベクターが、下記の表１中で提供される核酸配列を含む。
【0028】
【表1-1】
【0029】
【表1-2】
【0030】
【表1-3】
【0031】
【表1-4】
【0032】
【表1-5】
【0033】
【表1-6】
【0034】
【表1-7】
【0035】
【表1-8】
【0036】
【表1-9】
【0037】
【表1-10】
【0038】
【表1-11】
【0039】
【表1-12】
【0040】
ウイルスベクター
[0055]本明細書で提供される方法および遺伝子治療用ベクターに適切なウイルスベクターは、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li等（1994）Invest Opthalmol Vis Sci 35：2543～2549；Borras等（1999）Gene Ther 6：515～524；LiおよびDavidson、（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. 92：7700～7704；Sakamoto等（1999）Hum Gene Ther 5：1088～1097；国際公開第９４／１２６４９号；同９３／０３７６９号；同９３／１９１９１号；同９４／２８９３８号；同９５／１１９８４号および同９５／００６５５号）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali等（1998)Hum Gene Ther 9（l）：81～86、1998、Flannery等（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. 94：6916～6921；Bennett等（1997）Invest Opthalmol Vis Sci 38：2857～2863；Jomary等（1997）Gene Ther 4：683～690；Rolling等（1999）、Hum Gene Ther 10：641～648；Ali等（1996）Hum Mol Genet. 5：591～594；国際公開第９３／０９２３９号、Samulski等（1989）J. Vir. 63：3822～3828；Mendelson等（1988）Virol. 166：154～165；ならびにFlotte等（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. 90：10613～10617；SV40；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス(例えば、Miyoshi等（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. 94：10319～10323；Takahashi等（1999）J Virol 73：7812～7816)；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにレトロウイルス由来ベクター、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鶏白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルス）；等を含むがそれらに限定されない。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、多くは市販入手可能である。例として次のベクターを提供する。真核細胞用のｐＸＴｌ、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、およびｐＡｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。しかしながら、本開示の方法と適合性である限り、任意の他のベクターが、使用に予定される。
[0055]本明細書で提供される方法および遺伝子治療用ベクターに適切なウイルスベクターは、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li等（1994）Invest Opthalmol Vis Sci 35：2543～2549；Borras等（1999）Gene Ther 6：515～524；LiおよびDavidson、（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. 92：7700～7704；Sakamoto等（1999）Hum Gene Ther 5：1088～1097；国際公開第９４／１２６４９号；同９３／０３７６９号；同９３／１９１９１号；同９４／２８９３８号；同９５／１１９８４号および同９５／００６５５号）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali等（1998)Hum Gene Ther 9（l）：81～86、1998、Flannery等（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. 94：6916～6921；Bennett等（1997）Invest Opthalmol Vis Sci 38：2857～2863；Jomary等（1997）Gene Ther 4：683～690；Rolling等（1999）、Hum Gene Ther 10：641～648；Ali等（1996）Hum Mol Genet. 5：591～594；国際公開第９３／０９２３９号、Samulski等（1989）J. Vir. 63：3822～3828；Mendelson等（1988）Virol. 166：154～165；ならびにFlotte等（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. 90：10613～10617；SV40；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス(例えば、Miyoshi等（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. 94：10319～10323；Takahashi等（1999）J Virol 73：7812～7816)；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにレトロウイルス由来ベクター、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鶏白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルス）；等を含むがそれらに限定されない。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、多くは市販入手可能である。例として次のベクターを提供する。真核細胞用のｐＸＴｌ、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、およびｐＡｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。しかしながら、本開示の方法と適合性である限り、任意の他のベクターが、使用に予定される。
【0041】
[0056]細胞に感染するまたは受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞内に入りウイルス遺伝子を安定かつ効率よく発現する、特定のウイルスの能力が理由で、それらのウイルスは、細胞（例えば哺乳類細胞）内への外来核酸の導入用の興味深い候補となっている。ウイルスベクターは、制御配列、例えば、目的のポリペプチドの発現用プロモーターを含むと予定される。多くのウイルスベクターは、宿主細胞ゲノム内に組み込まれるものの、望ましければ、そのような組込みを妨げるために、そのような組込みを可能にする断片を除去または変更してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、該ベクターが、哺乳類の複製開始点を含有しない。選択した細胞内への、ＰＫＰ２をコードする核酸の送達における使用に予定されるウイルスベクターの非限定的な例を後記する。いくつかの実施形態では、該ウイルスベクターが、複製欠損ウイルスに由来する。
【0042】
[0057]概して、他の有用なウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的のポリペプチドで置換された非細胞変性性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性性ウイルスは、その生活環が、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写に続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス組込みを含む特定のレトロウイルスを含む。概して、該レトロウイルスは、複製欠損である（例えば、所望の転写物の合成を導けるものの、感染粒子を生産できない）。そのように遺伝子改変させたレトロウイルス発現ベクターは、ポリヌクレオチドの高効率のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入に向けて一般的な有用性を有する。
【0043】
[0058]いくつかの実施形態では、ＰＫＰ２をコードするポリヌクレオチドが、特異的結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルス内に収容されている。したがって、ウイルス粒子が、標的細胞のコグネート受容体に対し特異的に結合し、内容物を細胞へと送達する。いくつかの実施形態では、特定のウイルス指向性をもたらすようにウイルスが修飾されており、例えば、ウイルスが、好ましくは、線維芽細胞、心細胞、または特に心臓線維芽細胞（ＣＦ）に感染する。ＡＡＶに関していくつかの場合、ウイルスベクターの指向性を変更するために、カプシドタンパク質を変異させてある。例えば、レンチウイルス指向性は、頻繁に、異なるエンベロープタンパク質を使用して修飾されており、「シュードタイピング」として知られる。
【0044】
[0059]いくつかの実施形態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである。レトロウイルスは頻繁に、その遺伝子を宿主ゲノムへと組み込み、大量の外来遺伝物質を導入し、広範囲の種および細胞型に感染し、頻繁に、特殊な細胞株内にパッケージされる（Miller等、Am. J. Clin. Oncol.、15（3）：216～221、1992)。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターが、宿主細胞ゲノム内に組み込まれないように変更されている。
【0045】
[0060]いくつかの実施形態では、標的細胞内への侵入を援助するために、組換えレトロウイルスが、ウイルスポリペプチド（例えばレトロウイルスｅｎｖ）を含む。そのようなウイルスポリペプチドは、当該技術分野で確立されており、例えば、米国特許第５，４４９，６１４号明細書である。いくつかの実施形態では、該ウイルスポリペプチドが、両種指向性ポリペプチド、例えば、オリジナル宿主種外の細胞を含む複数種由来の細胞内への侵入を援助する両種指向性ｅｎｖである。いくつかの実施形態では、該ウイルスポリペプチドが、オリジナル宿主種外の細胞内への侵入を援助する異種指向性ウイルスポリペプチドである。いくつかの実施形態では、該ウイルスポリペプチドが、同種指向性ポリペプチド、例えば、オリジナル宿主種の細胞内への侵入を援助する同種指向性ｅｎｖである。
【0046】
[0061]細胞内へのレトロウイルスの侵入を援助できるウイルスポリペプチドの例は、ＭＭＬＶ両種指向性ｅｎｖ、ＭＭＬＶ同種指向性ｅｎｖ、ＭＭＬＶ異種指向性ｅｎｖ、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－ｇ）、ＨＩＶ－１ ｅｎｖ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖ、ＲＤ１１４、ＦｅＬＶ－Ｃ、ＦｅＬＶ－Ｂ、ＭＬＶ １０Ａ１ ｅｎｖ遺伝子、およびキメラを含むそれらのバリアントを含むが、それらに限定されない。Yee等（1994）Methods Cell Biol、A部：99～l 12（ＶＳＶ－Ｇ）；米国特許第５，４４９，６１４号明細書。いくつかの場合、該ウイルスポリペプチドは、発現、または受容体への結合の上昇を促進するために遺伝子修飾されている。
【0047】
[0062]実施形態では、レトロウイルス構築物が、様々なレトロウイルス、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ－１、ＳＩＶ、ＦＩＶ、または本明細書に記載される他のレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、レトロウイルス構築物が、特定ウイルスの２周期以上の複製に必要なすべてのウイルスポリペプチドをコードする。いくつかの場合、ウイルス侵入の効率を、他の要素または他のウイルスポリペプチドの添加により改善する。他の場合、レトロウイルス構築物によってコードされるウイルスポリペプチドが、２周期以上の複製を支持しない、例えば、米国特許第６，８７２，５２８号明細書。そのような場合、他の要素または他のウイルスポリペプチドの添加が、頻繁に、ウイルス侵入の促進に役立つ。一例示的実施形態では、組換えレトロウイルスが、ＶＳＶ－ｇポリペプチドを含むが、ＨＩＶ１ ｅｎｖポリペプチドは含まないＨＩＶ－１ウイルスである。
【0048】
[0063]いくつかの実施形態では、レトロウイルス構築物が、プロモーター、マルチクローニングサイト、および／または耐性遺伝子を含む。プロモーターの例は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦｌａ、β－アクチン；レトロウイルスＬＴＲプロモーター、および誘導性プロモーターを含むがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、レトロウイルス構築物が、パッケージングシグナル（例えば、ＭＦＧベクター由来のパッケージングシグナル、ｐｓｉパッケージングシグナル）を含む。当該技術分野で公知のいくつかのレトロウイルス構築物の例は、ｐＭＸ、ｐＢａｂｅＸまたはそれらの誘導体を含むがそれらに限定されない。Onishi等（1996）Experimental Hematology、24：324～329。いくつかの場合、レトロウイルス構築物が、自己不活化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ）である。Miyoshi等（1998）J. Virol 72（10）：8150～8157。いくつかの場合、レトロウイルス構築物が、ＬＬ－ＣＧ、ＬＳ－ＣＧ、ＣＬ－ＣＧ、ＣＳ－ＣＧ、ＣＬＧまたはＭＦＧである。Miyoshi（1998）J. Virol 72（10）：8150～8157；Onishi等（1996）Experimental Hematology、24：324～329；Riviere等（1995）Proc. Natl. Acad. Sci.、92：6733～6737。
【0049】
[0064]いくつかの実施形態では、複製欠損のウイルスを産生するために、ウイルスゲノム内のいくつかのウイルス配列の位置に核酸（例えば、目的のポリペプチドをコードするものまたはＲＮＡ）を挿入することにより、レトロウイルスベクターを構築する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング成分は含まないパッケージング細胞株を構築する（Mann等、Cell 33：153～159、1983）。ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを、レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に、特殊な細胞株内に導入すると（例えば、リン酸カルシウム沈殿または脂質トランスフェクションにより）、パッケージング配列が、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物を、ウイルス粒子内へとパッケージングさせ、そのウイルス粒子が次いで、培養培地中へと分泌される（NicolasおよびRubinstein、In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors and their uses、RodriguezおよびDenhardt編、Stoneham：Butterworth、494～513ページ、1988；Temin、In：Gene Transfer、Kucherlapati（編）、New York：Plenum Press、149～188ページ、1986；Mann等、Cell、33：153～159、1983）。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を捕集し、場合により濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型を感染できる。しかしながら、組込みおよび安定発現は、典型的に、宿主細胞の分裂を含む（Paskind等、Virology、67：242～248、1975）。
【0050】
[0065]いくつかの実施形態では、ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである。レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を有する他の遺伝子を含有する複雑なレトロウイルスである。レンチウイルスベクターに関する情報は、例えば、参照によりその各々の全体が本明細書に組み込まれている、Naldini等、Science 272（5259）：263～267、1996；Zufferey等、Nat Biotechnol 15（9）：871～875、1997；Blomer等、J Virol. 71（9）：6641～6649、1997；米国特許第６，０１３，５１６号明細書および同第５，９９４，１３６号明細書で提供される。レンチウイルスのいくつかの例は、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶを含む。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子の弱毒化により生成され、例えば、ベクターを生物学的に安全にするために遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させる。使用したレンチウイルスは、複製および／または組込み欠損であることもある。
【0051】
[0066]組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの両方の遺伝子導入および核酸配列の発現に使用されることもある。例えば、パッケージング機能、つまりｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、同じくｒｅｖおよびｔａｔを有する２つ以上のベクターで適切な宿主細胞をトランスフェクトする、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５，９９４，１３６号明細書に記載される。いくつかの実施形態では、該組換えウイルスが、特定の細胞型の受容体へと標的化するための抗体または特定のリガンドと、エンベロープタンパク質の結合により、標的化される。例えば、目的の核酸断片（調節領域を含む）を、特定の標的細胞型上にある受容体のリガンドをコードする他の遺伝子と共にウイルスベクター内へと挿入することにより、標的特異的ベクターを生成することもある。
【0052】
[0067]レンチウイルスベクターは、当該技術分野で公知であり、参照によりすべて本明細書に組み込まれているNaldini等（1996および1998）；Zufferey等（1997）；Dull等、1998、米国特許第６，０１３，５１６号明細書；および同第５，９９４，１３６号明細書を参照のこと。概して、これらのベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、かつ外来核酸の組込み、選択、および宿主細胞への核酸の導入のための必須配列を有するように構成されている。いくつかの場合、レンチウイルスベクターは、１つまたは複数のレンチウイルスパッケージングプラスミドと共に細胞内に導入され、そのプラスミドは、制限なしにｐＭＤ２．Ｇ、ｐＲＳＶ－ｒｅｖ、ｐＭＤＬＧ－ｐＲＲＥ、およびｐＲＲＬ－ＧＯＩを含む。レンチウイルスベクター単独またはレンチウイルスパッケージングプラスミドとの組合せでの、細胞内への導入は、いくつかの実施形態では、該レンチウイルスベクターの、レンチウイルス粒子内へのパッケージングをもたらす。いくつかの実施形態では、該レンチウイルスベクターが、非組込み型レンチウイルス（ＮＩＬ）ベクターである。ＮＩＬベクターを生成するための例示的方法、例えば、インテグラーゼ遺伝子中でのＤ６４Ｖ置換は、米国特許第８，１１９，１１９号明細書中で提供される。
【0053】
[0068]いくつかの実施形態では、ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである。アデノウイルスの遺伝子構成は、およそ３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡウイルスを含み、その構成が、７ｋｂまでの外来配列による、アデノウイルスＤＮＡの大型片の置換を可能にする（Grunhaus等、Seminar in Virology 200（2）：535～546、1992））。いくつかの場合、アデノウイルス支援トランスフェクションを使用して、ＰＫＰ２を細胞内に導入する。アデノウイルスとカップルされたシステム（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）を使用する細胞系において、トランスフェクション効率の上昇が報告された（KelleherおよびVos、Biotechniques、17（6）：1110～7、1994；Cotten等、Proc Natl Acad Sci USA、89（13）：6094～6098、1992；Curiel、Nat Immun、13（2～3）：141～64、1994）。
【0054】
[0069]いくつかの実施形態では、ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、組込みの頻度が低く、かつ非分裂細胞を感染できるため、興味深いベクター系であり、したがって、例えば組織培養（Muzyczka、Curr Top Microbiol Immunol、158:97～129、1992）またはｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳類細胞内へのポリヌクレオチドの送達用に有用にする。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、参照により各々の全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５，１３９，９４１号明細書および同第４，７９７，３６８号明細書に記載される。
【0055】
[0070]ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む長さ約４．７ｋｂである。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。該ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７で提供され；ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１４０１およびSrivastava等、J. Virol.、45：555～564（1983）で提供され；ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿１８２９で提供され；ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８２９で提供され；ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８５７１６で提供され；ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００ １８６２で提供され；ＡＡＶ－７ゲノムおよびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供され；ＡＡＶ－９ゲノムは、Gao等、J. Virol.、78：6381～6388（2004）で提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムは、Mol. Ther.、13（1）：67～76（2006）で提供され；ＡＡＶ－１１ゲノムは、Virology、330（2）：375～383（2004）で提供される。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第９，４３４，９２８号明細書で提供される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージングおよび宿主細胞染色体組込みを導くシス作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（その相対的マップ位置からｐ５、ｐｌ９、およびｐ４０と命名される）が、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐｉ９）は、単一ＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７および２２２７での）差次的スプライシングと合わさって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製を最終的に担う複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターによって発現し、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位が、３つの関連カプシドタンパク質の産生を担う。単一コンセンサスポリアデニル化部位が、ＡＡＶゲノムのマップ上の９５位に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝的特徴は、Muzyczka、Current Topics in Microbiology and Immunology、158：97～129（1992）に概説される。
【0056】
[0071]ＡＡＶは、例えば遺伝子治療における、外来ＤＮＡを細胞へと送達するためのベクターとして興味深い独自の特徴をもつ。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性性であり、かつヒトおよび他の動物の自然感染は、無症状および無症候性である。さらに、ＡＡＶは多数の哺乳類細胞に感染し、ｉｎ ｖｉｖｏで多数の異なる組織を標的化する機会を可能にする。さらに、ＡＡＶは、ゆっくり分裂する細胞および非分裂細胞に形質導入し、かつ頻繁に、転写的に活性の核エピソーム（染色体外エレメント）として、本質的に、それらの細胞の生涯にわたり存続する。本開示にとって特に重要であるのは、ＡＡＶ、特にＡＡＶ９が、心臓、例えば、心筋、心外膜、または両方の細胞に感染できることである（Prasad等、2011；Piras等、2016；Ambrosi等、2019）。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、クローンＤＮＡとしてプラスミド内に挿入されることが、組換えゲノムの構築を実現可能にする。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムカプシド形成を導くシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されているため、いくつかの場合、ゲノム（複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）の内部のおよそ４．３ｋｂの一部または全部が、外来ＤＮＡで置換されている。ＡＡＶベクターを生成するために、いくつかの場合、ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質がトランスで提供される。ＡＡＶの他の重要な特徴は、極めて安定かつ頑強なウイルスであることである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に耐えるので、ＡＡＶの低温保存はあまり重要でない。いくつかの場合、ＡＡＶは、凍結乾燥さえ可能である。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重感染に対して耐性でない。本開示のＡＡＶベクターは、自己相補性二本鎖ＡＡＶベクター、合成ＩＴＲ、および／またはパッケージング密度（ｃｏｍｐａｃｉｔｙ）の上昇したＡＡＶベクターを含む。例示的方法が、参照によりその各々の全体が組み込まれている米国特許第８，７８４，７９９号明細書；同第８，９９９，６７８号明細書；同第９，１６９，４９４号明細書；同第９，４４７，４３３号明細書；および同第９，７８３，８２４号明細書で提供される。
【0057】
[0072]ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得ると予定され、ＡＡＶ血清型のＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３およびＡＡＶ ｒｈ７４を含むがこれに限定されない。シュードタイプｒＡＡＶの産生は、例えば国際公開第０１／８３６９２号に開示される。ｒＡＡＶバリアントの他の型、例えば、カプシド突然変異を有するｒＡＡＶも予定される。例えば、Marsic等、Mol. Therapy. 22）：1900～09（2014）を参照。種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が当該技術分野で公知である。本開示のＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ３９、ＡＡＶ４３、ＡＡＶ．ｒｈ７４、およびＡＡＶ．ｒｈ８のＡＡＶベクターを含む。例示的ＡＡＶベクターは、参照によりその各々の全体が組み込まれている米国特許出願第６３／０１２，７０３号明細書、米国特許第７，１０５，３４５号明細書；米国特許出願第１５／７８２，９８０号明細書；米国特許第７，２５９，１５１号明細書；同第６，９６２，８１５号明細書；同第７，７１８，４２４号明細書；同第６，９８４，５１７号明細書；同第７，７１８，４２４号明細書；同第６，１５６，３０３号明細書；同第８，５２４，４４６号明細書；同第７，７９０，４４９号明細書；同第７，９０６，１１１号明細書；同第９，７３７，６１８号明細書；米国特許出願第１５／４３３，３２２号明細書；米国特許第７，１９８，９５１号明細書で提供される。
【0058】
[0073]いくつかの実施形態では、標的化を増強するために、ＡＡＶ発現ベクターがシュードタイプである。遺伝子導入を促進し、心筋細胞中での発現を維持するために、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が、使用に予定される。いくつかの場合、Balaji等、J Surg Res. 184：691～98（2013）に記載されるように、ＡＡＶ２ゲノムはそれぞれ、シュードタイプベクターＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７、およびＡＡＶ２／８を産生するカプシド内にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、Piras等、Gene Therapy 23：469～478（2016）に記載されるように、筋線維芽細胞様系統での発現を標的化するためにＡＡＶ９を使用する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９を使用し、いくつかの実施形態では、Asokari等、Hum Gene Ther. 24：906～13（2013）；Pozsgai等、Mol Ther. 25：855～69（2017）；Kotterman等、Nature Reviews Genetics 15：445～51（2014）；およびSchaffer等の米国特許出願公開第２０１６０３４０３９３号明細書に記載されるようにＡＡＶを操作する。いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２０１８００６６２８５号明細書に記載されるように、標的細胞の感染性を高めるために、ウイルスベクターがＡＡＶ操作されている。
【0059】
[0074]いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶベクターが、特に、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏでの心細胞、特に心筋細胞の形質導入を向上もしくは促進させるために操作されたカプシドとしての、または対象の免疫系を逃れる、または体内分布を改善する修飾カプシドを含む。例示的なＡＡＶカプシドが、参照によりその各々の全体が組み込まれている米国特許第７，８６７，４８４号明細書；同第９，２３３，１３１号明細書；同第１０，０４６，０１６号明細書；国際公開第２０１６／１３３９１７号；同第２０１８／２２２５０３号；および同第２００１９／０６０４５４号明細書で提供される。ＡＡＶカプシド（または特にＡＡＶ９カプシド）では、心筋、心外膜または両方における細胞に対する感染性を高めるために、１つまたは複数の置換が予定される。特に、いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶベクター、場合によりＡＡＶ９ベースのベクターが、そのカプシドタンパク質中に１つまたは複数の置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶベクターが、ＡＡＶ－Ａ９のカプシドおよび／または血清型を含む。それらの置換および挿入は、本開示において有用な種々のカプシドタンパク質を生成するために組み合わされることが予定されると理解される。
ウイルスベクター産生の方法
[0075]概して、ウイルスベクターは、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの構築物を産生細胞に導入することで産生される。いくつかの場合、該産生細胞は外来遺伝子を発現しない。他の場合、該産生細胞は、１つまたは複数の外来遺伝子、例えば、１つまたは複数のｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖポリペプチド、および／または１つまたは複数のレトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖポリペプチドをコードする遺伝子を含む「パッケージング細胞」である。いくつかの実施形態では、該レトロウイルスパッケージング細胞が、ウイルスポリペプチド、例えば、標的細胞への侵入を援助するＶＳＶ－ｇをコードする遺伝子を含む。いくつかの場合、該パッケージング細胞が、１つまたは複数のレンチウイルスタンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖまたはｎｅｆをコードする遺伝子を含む。いくつかの場合、該パッケージング細胞が、アデノウイルスタンパク質、例えば、Ｅｌ ＡもしくはＥｌ Ｂ、または他のアデノウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、いくつかの場合、パッケージング細胞により供給されるタンパク質が、レトロウイルス由来タンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ；レンチウイルス由来タンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｎｅｆ；ならびにアデノウイルス由来タンパク質、例えば、Ｅｌ ＡおよびＥ１ Ｂである。多くの例では、該パッケージング細胞が、該ウイルスベクターの由来先であるウイルスとは異なるウイルスに由来するタンパク質を供給する。パッケージング細胞から組換えウイルスを産生する方法およびその使用は確立されている；例えば、米国特許第５，８３４，２５６号明細書；同第６，９１０，４３４号明細書；同第５，５９１，６２４号明細書；同第５，８１７，４９１号明細書；同第７，０７０，９９４号明細書；および同第６，９９５，００９号明細書を参照。
ウイルスベクター産生の方法
[0075]概して、ウイルスベクターは、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの構築物を産生細胞に導入することで産生される。いくつかの場合、該産生細胞は外来遺伝子を発現しない。他の場合、該産生細胞は、１つまたは複数の外来遺伝子、例えば、１つまたは複数のｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖポリペプチド、および／または１つまたは複数のレトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖポリペプチドをコードする遺伝子を含む「パッケージング細胞」である。いくつかの実施形態では、該レトロウイルスパッケージング細胞が、ウイルスポリペプチド、例えば、標的細胞への侵入を援助するＶＳＶ－ｇをコードする遺伝子を含む。いくつかの場合、該パッケージング細胞が、１つまたは複数のレンチウイルスタンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖまたはｎｅｆをコードする遺伝子を含む。いくつかの場合、該パッケージング細胞が、アデノウイルスタンパク質、例えば、Ｅｌ ＡもしくはＥｌ Ｂ、または他のアデノウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、いくつかの場合、パッケージング細胞により供給されるタンパク質が、レトロウイルス由来タンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ；レンチウイルス由来タンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｎｅｆ；ならびにアデノウイルス由来タンパク質、例えば、Ｅｌ ＡおよびＥ１ Ｂである。多くの例では、該パッケージング細胞が、該ウイルスベクターの由来先であるウイルスとは異なるウイルスに由来するタンパク質を供給する。パッケージング細胞から組換えウイルスを産生する方法およびその使用は確立されている；例えば、米国特許第５，８３４，２５６号明細書；同第６，９１０，４３４号明細書；同第５，５９１，６２４号明細書；同第５，８１７，４９１号明細書；同第７，０７０，９９４号明細書；および同第６，９９５，００９号明細書を参照。
【0060】
[0076]パッケージング細胞株は、トランスフェクションが容易な任意の細胞株を含むがそれらに限定されない。パッケージング細胞株は頻繁に、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株、ＣＯＳ細胞株、またはＨｅＬａ細胞株に基づく。パッケージング細胞は頻繁に、ウイルスパッケージングに必要なタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が欠けているウイルスベクタープラスミドをパッケージングするために使用される。そのようなウイルスベクターまたはプラスミドによりコードされるタンパク質から欠けているタンパク質またはポリペプチドを供給する任意の細胞が、パッケージング細胞としての使用に予定される。パッケージング細胞株の例は、プラチナ－Ｅ（Ｐｌａｔ－Ｅ）、プラチナ－Ａ（Ｐｌａｔ－Ａ）、ＢＯＳＣ２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１５５４）およびＢｉｎｇ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１２７０）を含むがそれらに限定されない。Morita等（2000）Gene Therapy 7（12）：1063～1066；Onishi等（1996）Experimental Hematology、24：324～329；米国特許第６，９９５，００９号明細書。市販パッケージング株、例えば、Ａｍｐｈｏ－Ｐａｋ ２９３細胞株、Ｅｃｏ－Ｐａｋ ２－２９３細胞株、ＲｅｔｒｏＰａｃｋ ＰＴ６７細胞株、およびＲｅｔｒｏ－Ｘユニバーサルパッケージングシステム（すべてＣｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能）も有用である。
【0061】
[0077]ウイルスベクタープラスミド（または構築物）は、ｐＭＸｓ、ｐＭｘｓ－ＩＢ、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ、ｐＭＸｓ－ｎｅｏ（ｐＭＸｓ－ＩＢは、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラストサイジン耐性遺伝子を有するベクターである）Kimatura等（2003）Experimental Hematology 31：1007～1014；MFG Riviere等（1995）Proc. Natl. Acad. Sci.、92：6733～6737；ｐＢａｂｅＰｕｒｏ；Morgenstern等（1990）Nucleic Acids Research 18：3587～3596；ＬＬ－ＣＧ、ＣＬ－ＣＧ、ＣＳ－ＣＧ、ＣＬＧ Miyoshi等（1998）J. Vir. 72：8150～8157等をレトロウイルス系として含み、ｐＡｄｅｘｌ Kanegae等（1995）Nucleic Acids Research 23：3816～3821等をアデノウイルス系として含む。例示的実施形態では、レトロウイルス構築物が、ブラストサイジン（例えばｐＭＸｓ－ＩＢ）、ピューロマイシン（例えば、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ）、またはネオマイシン（例えばｐＭＸｓ－ｎｅｏ）を含む。Morgenstern等（1990）Nucleic Acids Research 18：3587～3596。
プロモーターおよびエンハンサー
[0078]いくつかの実施形態では、ＰＫＰ２の発現を促進するために、ＰＫＰ２をコードする核酸が、プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結されている。使用する宿主／ベクター系に応じて、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ等を含む多数の適切な転写・翻訳調節エレメントのいずれかが、発現ベクターでの使用に適切である（例えば、Bitter等（1987）Methods in Enzymology、153：516～544）。
プロモーターおよびエンハンサー
[0078]いくつかの実施形態では、ＰＫＰ２の発現を促進するために、ＰＫＰ２をコードする核酸が、プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結されている。使用する宿主／ベクター系に応じて、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ等を含む多数の適切な転写・翻訳調節エレメントのいずれかが、発現ベクターでの使用に適切である（例えば、Bitter等（1987）Methods in Enzymology、153：516～544）。
【0062】
[0079]適切な真核生物プロモーター（真核生物中で機能するプロモーター）の非限定的な例は、ＣＭＶ、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ＳＶ４０初期および後期、レトロウイルスからの長い末端反復（ＬＴＲｓ）、およびマウスメタロチオネイン－Ｉを含む。いくつかの実施形態では、心臓特異的発現をもたらすことができるプロモーターを使用し、心筋、心外膜、または両方での発現をもたらすプロモーターを含むがこれに限定されない（Prasad等、2011）。適切な心臓特異的プロモーターの非限定的な例は、アルファミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、および心臓トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＫＰ２またはデスミンプロモーターを使用する。いくつかの場合、心臓特異的発現を有するキメラプロモーターを使用する。いくつかの場合、心臓特異的エンハンサーを、該プロモーターと組み合わせる。
【0063】
[0080]ＰＫＰ２発現を駆動するために適切なプロモーターの例は、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）エレメント；構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＨＳＶ１－ＴＫ、ＳＶ４０、ＥＦ－ｌａ、β－アクチン、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ）；誘導性プロモーター、例えば、Ｔｅｔ－オペレーターエレメントを含有するようなもの；および心臓特異的プロモーター、例えば、アルファミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、および心臓トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）を含むがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＫＰ２またはデスミンプロモーターを使用する。いくつかの実施形態では、心臓特異的発現を有するキメラプロモーターを使用する。いくつかの場合、心臓特異的エンハンサーを、該プロモーターと組み合わせる。
【0064】
[0081]いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、細胞型特異的な転写制調節エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結されており、ＴＲＥは、プロモーターおよびエンハンサーを含む。適切なＴＲＥは、以下の遺伝子：ミオシン軽鎖－２、α－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、および心臓アクチン由来のＴＲＥを含むがそれらに限定されない。Franz等（1997）Cardiovasc. Res. 35：560～566；Robbins等（1995）Ann. N. Y. Acad. Sci. 752：492～505；Linn等（1995）Circ. Res. 76：584～591；Parmacek等（1994）Cell. Biol. 14：1870～1885；Hunter等（1993）Hypertension 22：608～617；およびSartorelli等（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：4047～4051。
【0065】
[0082]その代わりに、ある核酸の自然環境において通常その核酸と関連するわけではないプロモーターを意味する組換えプロモーターまたは異種プロモーターの調節下に、コードする核酸断片を配置することにより、特定の利点が得られる。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーも、ある核酸配列の自然環境において通常その核酸配列と関連するわけではないエンハンサーを意味する。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは頻繁に、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他の原核細胞、ウイルス性細胞、もしくは真核細胞から単離したプロモーターまたはエンハンサー、および「天然」でない、すなわち異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる突然変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーを含む。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列の人工的な産生に加えて、配列は、本明細書に開示される組成物と関連して、組換えクローニング、および／またはＰＣＲを含む核酸増幅技術を使用して産生されることもある（参照により各々が本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，２０２号明細書、同第５，９２８，９０６号明細書を参照）。
【0066】
[0083]いくつかの実施形態では、本開示のベクターが、１つまたは複数のポリＡシグナルを含む。本開示のベクター中で有用な例示的ポリＡシグナルは、短いポリＡシグナルおよびｂＧＨポリＡシグナルを含む。いくつかの実施形態では、本開示のベクターが、１つまたは複数の３’エレメントを含む。例示的３’エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。
【0067】
遺伝子治療用ベクター組成物
[0084]組成物を調製するために、ベクターおよび／または細胞を生成し、必要に応じてまたは望みどおりに、ベクターまたは細胞を精製する。ベクターおよび／または他の薬剤は、薬学的に許容可能な担体中に懸濁されることもある。いくつかの実施形態では、組成物を凍結乾燥する。それらのコンパウンドおよび細胞は頻繁に、適切な濃度に調整してあり、場合により他の薬剤と組み合わせる。単位用量中に含まれる任意のコンパウンドおよび／または他の薬剤の絶対重量は、広範囲にわたって変わる。投与用量および投与数は、当業者により最適化されると予定される。
[0084]組成物を調製するために、ベクターおよび／または細胞を生成し、必要に応じてまたは望みどおりに、ベクターまたは細胞を精製する。ベクターおよび／または他の薬剤は、薬学的に許容可能な担体中に懸濁されることもある。いくつかの実施形態では、組成物を凍結乾燥する。それらのコンパウンドおよび細胞は頻繁に、適切な濃度に調整してあり、場合により他の薬剤と組み合わせる。単位用量中に含まれる任意のコンパウンドおよび／または他の薬剤の絶対重量は、広範囲にわたって変わる。投与用量および投与数は、当業者により最適化されると予定される。
【0068】
[0085]例えば、いくつかの実施形態では、約１０２～１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）を投与する。いくつかの実施形態では、用量が、少なくとも約１０２ｖｇ、約１０３ｖｇ、約１０４ｖｇ、約１０５ｖｇ、約１０６ｖｇ、約１０７ｖｇ、約１０８ｖｇ、約１０９ｖｇ、約１０１０ｖｇ、またはそれ以上のベクターゲノムである。いくつかの実施形態では、用量が、約１０２ｖｇ、約１０３ｖｇ、約１０４ｖｇ、約１０５ｖｇ、約１０６ｖｇ、約１０７ｖｇ、約１０８ｖｇ、約１０９ｖｇ、約１０１０ｖｇ、またはそれ以上のベクターゲノムである。
【0069】
[0086]コンパウンドの１日量も同じく様々である。そのような１日量は頻繁に、例えば、少なくとも約１０２ｖｇ／日、約１０３ｖｇ／日、約１０４ｖｇ／日、約１０５ｖｇ／日、約１０６ｖｇ／日、約１０７ｖｇ／日、約１０８ｖｇ／日、約１０９ｖｇ／日、約１０１０ｖｇ／日、または日当たりそれ以上のベクターゲノムの範囲である。
【0070】
[0087]いくつかの実施形態では、本開示の方法が、心内注射、心筋内注射、心内膜注射、心内カテーテル挿入、または全身投与により、本開示のベクターまたはベクター系（例えば、ｒＡＡＶベクター）を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、心内注射、心筋内注射、心内膜注射、心内カテーテル挿入、または全身投与により、約１ｘ１０８～約１ｘ１０１５ＧＣの間のベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター）を投与して対象（例えばヒト）を処置する。いくつかの実施形態では、約１ｘ１０８～約１ｘ１０１５ＧＣの間、約１ｘ１０８～約１ｘ１０１５ＧＣの間、約１ｘ１０９～約１ｘ１０１４ＧＣの間、約１ｘ１０１０～約１ｘ１０１３ＧＣの間、約１ｘ１０１１～約１ｘ１０１２ＧＣの間、または約１ｘ１０１２～約１ｘ１０１３ＧＣの間のベクターを投与して対象を処置する。いくつかの実施形態では、約１ｘ１０８～約１ｘ１０１０ＧＣの間、約１ｘ１０９～約１ｘ１０１１ＧＣの間、約１ｘ１０１０～約１ｘ１０１２ＧＣの間、約１ｘ１０１１～約１ｘ１０１３ＧＣの間、約１ｘ１０１２～約１ｘ１０１４ＧＣの間、または約１ｘ１０１３～約１ｘ１０１５ＧＣの間のベクターを投与して対象を処置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１ｘ１０８、少なくとも約１ｘ１０９、少なくとも約１ｘ１０１０、少なくとも約１ｘ１０１１、少なくとも約１ｘ１０１２、少なくとも約１ｘ１０１３、または少なくとも約１ｘ１０１５ＧＣのベクターを投与して対象を処置する。いくつかの実施形態では、最高で１ｘ１０８、最高で約１ｘ１０９、最高で約１ｘ１０１０、最高で約１ｘ１０１１、最高で約１ｘ１０１２、最高で約１ｘ１０１３、または最高で約１ｘ１０１５ＧＣのベクターを投与して対象を処置する。いくつかの実施形態では、心内注射によるか全身的に、約１ｘ１０８～約１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇの間のベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター）を投与して対象（例えばヒト）を処置する。いくつかの実施形態では、約１ｘ１０８～約１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇの間、約１ｘ１０８～約１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇの間、約１ｘ１０９～約１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇの間、約１ｘ１０１０～約１ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇの間、約１ｘ１０１１～約１ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇの間、または約１ｘ１０１２～約１ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇの間のベクターを投与して対象を処置する。いくつかの実施形態では、約１ｘ１０８～約１ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇの間、約１ｘ１０９～約１ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇの間、約１ｘ１０１０～約１ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇの間、約１ｘ１０１１～約１ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇの間、約１ｘ１０１２～約１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇの間、または約１ｘ１０１３～約１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇの間のベクターを投与して対象を処置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１ｘ１０８、少なくとも約１ｘ１０９、少なくとも約１ｘ１０１０、少なくとも約１ｘ１０１１、少なくとも約１ｘ１０１２、少なくとも約１ｘ１０１３、または少なくとも約１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇのベクターを投与して対象を処置する。いくつかの実施形態では、最高で１ｘ１０８、最高で約１ｘ１０９、最高で約１ｘ１０１０、最高で約１ｘ１０１１、最高で約１ｘ１０１２、最高で約１ｘ１０１３、または最高で約１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇのベクターを投与して対象を処置する。ベクターの量および処置で用いる量は、選択される特定の担体のみならず、投与の経路、処置される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても異なると理解される。最終的に、いくつかの実施形態では、付添いの医療提供者が、適切な用量を特定する。医薬組成物は、投与用の単一単位剤形（ｓｉｎｇｌｅ ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）における各コンパウンドの適切な比率で製剤されると予定される。
【0071】
[0088]組成物は、徐放性に製剤されていることもある（例えば、マイクロカプセル化を使用、国際公開第９４／０７５２９号、および／または米国特許第４，９６２，０９１号明細書を参照）。製剤は、適切な場合、都合よく、個別の単位剤形で与えられており、いくつかの実施形態では、製薬分野では周知の方法のいずれかにより調製される。そのような方法は頻繁に、治療剤を液体担体、固体マトリクス、半固体担体、微細固体担体、またはそれらの組合せと混合する工程、次いで必要であれば、生成物を、所望の送達システムへと導入または成形する工程を含む。
【0072】
[0089]いくつかの実施形態での、コンパウンドを含有する１つまたは複数の適切な単位剤形は、非経口（皮下、静脈内、筋肉内、および腹腔内を含む）、心臓内、心膜、経口、直腸、真皮、経皮、胸腔内、肺内、および鼻腔内（呼吸）の各経路を含む、様々な経路により投与される。
【0073】
[0090]本明細書で提供される遺伝子治療用ベクターは、水溶液、懸濁液、錠剤、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセル、およびリポソーム、および他の緩効性製剤、例えば、成形型高分子ゲル（ｓｈａｐｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｇｅｌ）を含む多くの形で調製される。遺伝子治療用ベクターの投与は頻繁に、水溶液での非経口投与または局所投与を含む。同様に、遺伝子治療用ベクターを含有する組成物は、装置、スキャフォールドにおいて、または徐放性製剤として投与されることもある。異なる種類の製剤法は、米国特許第６，３０６，４３４号明細書およびその明細書に含まれる参考文献に記載される。
【0074】
[0091]いくつかの実施形態では、ベクターが、非経口投与（例えば注入、例えば、ボーラス注入または持続注入による）用に製剤されており、かつ頻繁に、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量輸液容器、または複数回投与用容器中の防腐剤を加えた単位剤形で与えられている。医薬組成物は頻繁に、油性または水性のビヒクル中での懸濁液、溶液または乳液の形を取り、製剤用薬剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤を含有することもある。適切な担体は、生理食塩水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、および当該技術分野で一般的に使用される他の材料を含む。
【0075】
[0092]組成物はさらに、他の材料、例えば、心臓の疾患、状態および負傷の処置に有用な薬剤、例えば、抗凝血剤（例えばダルテパリン（フラグミン）、ダナパロイド（オルガラン）、エノキサパリン（ロベノックス）、ヘパリン、チンザパリン（イノヘップ）、および／またはワルファリン（クマジン））、抗血小板剤（例えば、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、またはジピリダモール）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（例えば、ベナゼプリル（ロテンシン）、カプトプリル（カポテン）、エナラプリル（バソテック）、フォシノプリル（モノプリル）、リシノプリル（プリニビル、ゼストリル）、モエキシプリル（ウニバスク）、ペリンドプリル（アセオン）、キナプリル（アクプリル）、ラミプリル（アルテース）、および／またはトランドラプリル（マビック））、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（例えば、カンデサルタン（アタカンド）、エプロサルタン（テべテン）、イルベサルタン（アバプロ）、ロサルタン（コザール）、テルミサルタン（ミカルディス）および／またはバルサルタン（ディオバン）、β遮断薬（例えば、アセブトロール（セクトラール）、アテノロール（テノーミン）、ベタキソロール（ケルロン）、ビソプロロール／ヒドロクロロチアジド（ジアック）、ビソプロロール（ゼベタ）、カルテオロール（カルトロール）、メトプロロール（ロプレッサー、トプロールＸＬ）、ナドロール（コルガード）、プロプラノロール（インデラル）、ソタロール（ベタペース）、および／またはチモロール（ブロカドレン））、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン（ノルバスク、ロトレル）、ベプリジル（バスコール）、ジルチアゼム（カルジゼム、チアザック）、フェロジピン（プレンジル）、ニフェジピン（アダラート、プロカルディア）、ニモジピン（ニモトップ）、ニソルジピン（Ｓｕｌａｒ）、ベラパミル（カラン、イソプチン、ベレラン））、利尿剤（例えば、アミロリド（ミダモル）、ブメタニド（ブメックス）、クロロチアジド（ジウリル）、クロルタリドン（ハイグロトン）、フロセミド（ラシックス）、ヒドロクロロチアジド（エシドリックス、ヒドロジウリル）、インダパミド（ロゾール）、および／またはスピロノラクトン（アルダクトン））、血管拡張剤（例えば、二硝酸イソソルビド（イソルジル）、ネシリチド（ナトレコル）、ヒドララジン（アプレソリン）、硝酸塩、および／またはミノキシジル））、スタチン、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、ジゴキシン、ジギトキシン、ラノキシン、またはそれらの任意の組合せを含有することもある。
【0076】
[0093]さらなる薬剤、例えば、抗菌剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、生体応答調節剤、増殖因子、免疫調節剤、モノクローナル抗体、および／または防腐剤を含むこともある。本明細書で提供される組成物は、他の形の治療と関連して使用されることも予定される。
【0077】
[0094]本明細書に記載されるウイルスベクターは、疾患または障害を処置する目的での対象への投与に適切である。いくつかの実施形態では、そのような組成物が、例えば、受容者の生理的状態、投与の目的が外傷性損傷に対するのか、またはより持続性の治療目的のためか、および熟練の実務者に公知の他の要素に応じて、連続的または間欠的な単一用量、複数用量である。本明細書で提供されるコンパウンドおよび組成物の投与は、いくつかの実施形態では、予め選択した時間にわたり連続的に行うか、またはその代わりに、間隔をあけた一連の用量で行う。局所投与および全身投与の両方が予定される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの局所的送達が達成される。いくつかの実施形態では、心臓内で細胞の集団を生成するために、細胞および／またはベクターの局所的送達を使用する。いくつかの実施形態では、そのような局所的集団が、心臓の「ペースメーカー細胞」として機能する。
【0078】
定義
[0095]本明細書で使用する「心筋症」という用語は、心臓が異常に肥大、肥厚および／または硬直した、心筋のいずれかの疾患または機能障害に関する。その結果、血液を圧送する心筋の能力が習慣的に弱まっている。疾患または障害の病因は、いくつかの場合、炎症性、代謝性、毒性、浸潤性、線維形成性、血液学的、遺伝性、または原因不明である。心筋症の２つの一般型が存在し、虚血性（酸素不足に起因）および非虚血性である。いくつかの場合、心筋症が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である。
[0095]本明細書で使用する「心筋症」という用語は、心臓が異常に肥大、肥厚および／または硬直した、心筋のいずれかの疾患または機能障害に関する。その結果、血液を圧送する心筋の能力が習慣的に弱まっている。疾患または障害の病因は、いくつかの場合、炎症性、代謝性、毒性、浸潤性、線維形成性、血液学的、遺伝性、または原因不明である。心筋症の２つの一般型が存在し、虚血性（酸素不足に起因）および非虚血性である。いくつかの場合、心筋症が、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）である。
【0079】
[0096]「心不全（ＨＦ）」は、いずれかの構造上または機能上の心臓血管障害に頻繁に起因する複雑な臨床症候群であり、左室充満圧を過剰に上昇させることなしに身体の代謝需要に見合うには不十分な全身灌流を引き起こす。特定の症状、例えば、呼吸困難および疲労、および兆候、例えば、体液貯留を特徴とする。本明細書で使用する「慢性心不全」または「うっ血性心不全」または「ＣＨＦ」は交換可能に、進行性または持続性の心不全に関する。ＣＨＦの一般的な危険因子は、高齢、糖尿病、高血圧、および太りすぎを含む。ＣＨＦは、左室の収縮機能により、駆出分画が低下したＨＦまたは駆出分画が保たれたＨＦ（ＨＦｒＥＦおよびＨＦｐＥＦ）に大きく分類される。「心不全」という用語は、心臓が完全に停止したことまたは停止していることを意味するのではなく、心臓が、健康な人での正常よりも弱いことを意味する。いくつかの場合、状態は軽度であり、運動すると目立つ症状を引き起こし、他の場合、状態はより重度であり、安静中でさえ生命を脅かす場合もある症状を引き起こす。慢性心不全の最も一般的な症状は、息切れ、疲れ、脚および足首のむくみ、胸痛、およびせきを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法が、ＣＨＦ（例えば、ＨＦｒＥＦ）を患うまたはＣＨＦ（例えば、ＨＦｒＥＦ）の危険性がある対象において、ＣＨＦ（例えば、ＨＦｒＥＦ）の１つまたは複数の症状を減少、予防、または改善する。いくつかの実施形態では、本開示が、ＣＨＦ、およびＣＨＦをもたらすことがある状態を処置する方法を提供する。
【0080】
[0097]本明細書で使用する「急性心不全」または「非代償性心不全」は交換可能に、心臓が、正常充満圧において、身体の要求に見合うペースで血液を圧送することができないことを反映する兆候および症状の悪化の症候群に関する。ＡＨＦは典型的に、数日から数週にわたって徐々に発症してから、その兆候または症状の重症度ゆえに緊急治療または救急治療を必要とする代償不全になる。いくつかの場合、ＡＨＦは、心臓の収縮機能もしくは拡張機能における一次的障害、または異常な静脈血管収縮もしくは動脈血管収縮の結果であるが、概して、容量負荷を含む複数の要素の相互作用である。ＡＨＦ患者の大多数は、慢性心不全（ＣＨＦ）の代償不全を有し、したがって、ＣＨＦの病態生理、症状（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）および診断に関する考察のかなりは、ＡＨＦの理解に直接に関連する。他の場合、ＡＨＦは、心臓への損傷、または心機能を損なう事象、例えば、急性心筋梗塞、重度の高血圧、心臓弁の損傷、心拍リズムの異常、心臓の炎症または感染、毒素および投薬に起因する。いくつかの実施形態では、本開示の方法が、ＡＨＦを患うまたはＡＨＦの危険性がある対象において、ＡＨＦの１つまたは複数の症状を減少、予防、または改善する。いくつかの実施形態では、本開示が、ＡＨＦ、およびＡＨＦをもたらすことがある状態を処置する方法を提供する。いくつかの場合、ＡＨＦは、心筋梗塞と関連する虚血の結果である。
【0081】
[0098]本明細書で使用する「対象」または「個体」という用語は、任意の動物、例えば、飼い慣らした動物、動物園の動物、またはヒトに関する。いくつかの場合、「対象」または「個体」は、イヌ、ネコ、ウマ、家畜、動物園の動物またはヒトのような哺乳類である。その代わりにまたは組み合わせて、対象または個体は、飼い慣らした動物、例えば、トリ、ペット、または家畜である。「対象」および「個体」の具体的な例は、心臓疾患または心臓障害を有する個体、および心臓障害関連の特徴または症状、例えば、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）または不整脈原性心筋症（ＡＣＭ）を有する個体を含むがそれらに限定されない。
【0082】
[0099]本開示の実践は、異なる指定がない限り、当該分野の技術範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来技術を使用する。例えば、Sambrook and Russell編（2001）Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第3版；the series Ausubel等編（2007）Current Protocols in Molecular Biology；the series Methods in Enzymology（Academic Press, Inc., N.Y.）；MacPherson等（1991）PCR 1：A Practical Approach（IRL Press at Oxford University Press）；MacPherson等（1995）PCR 2：A Practical Approach；Harlow and Lane編（1999）Antibodies、A Laboratory Manual；Freshney（2005）Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique、第5版；Gait編（1984）Oligonucleotide Synthesis；米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Hames and Higgins編（1984）Nucleic Acid Hybridization；Anderson（1999）Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins編（1984）Transcription and Translation；IRL Press（1986）Immobilized Cells and Enzymes；Perbal（1984）A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos編（1987）Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（Cold Spring Harbor Laboratory）；Makrides編（2003）Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker編（1987）Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology（Academic Press、London）；Herzenberg等編（1996）Weir’s Handbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual、第3版（2002）Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sohail（2004）Gene Silencing by RNA Interference：Technology and Application（CRC Press）；Sell（2013）Stem Cells Handbookを参照。
【0083】
[00100]文脈が異なる指定をしない限り、本明細書に記載される開示の種々の特徴は、任意の組合せで使用可能であると明確に意図される。さらに、本開示は同じく、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組合せが除外可能または省略可能であることを予定する。例示に、本明細書が、複合体は成分Ａ、ＢおよびＣを含むと記載する場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはその組合せが、単一または任意の組合せで省略および除外されてもよいことを明確に意図する。
【0084】
[00101]範囲を含めすべての数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は近似であり、１．０または０．１の単位で（＋）または（－）に変動し、必要に応じて、またはその代わりに、＋／－１５％、その代わりに１０％、その代わりに５％、その代わりに２％の差異で変動する。常に明示的には記載されないが、すべての数字表示は、「約」という用語が先行すると理解される。そのような範囲形式は、便宜上および簡潔さのために使用されると理解され、範囲の限界と明示的に特定される数値を含むと同様に、その範囲内に含まれる個々の数値または部分範囲も、各々の数値および部分範囲が明示的に特定されているかのように含むと柔軟に理解されるものである。例えば、約１～約２００の範囲内の割合は、明示的に言及される、約１および約２００の限界を含むと同時に、個々の割合、例えば、約２、約３、および約４、ならびに部分範囲、例えば、約１０～約５０、約２０～約１００等も含むと理解されるものである。同じく、常に明示的には記載されないが、本明細書に記載される試薬は、単に例示的にすぎず、その均等物が当該技術分野では公知であると理解される。
【0085】
[00102]本明細書および添付クレームで使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なる指定をしない限り、複数の指示対象も含むと明記する。したがって、例えば、「１つの心筋細胞」への言及は、複数の心筋細胞を含む。
【0086】
[00103]同じく、本明細書で使用する「および／または」は、関連して列挙される項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組合せに関し、かつそれらを含むと同様に、代替的に解釈される場合（「または」）、組合せの欠如に関し、かつ組合せの欠如を含む。
【0087】
[00104]「投与（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」等は、本明細書で提供される遺伝子治療用ベクターまたはその組成物との関連で使用する場合、非心筋細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ投与、非心筋細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ投与、または医療従事者による対象への投与もしくは対象による自己投与による対象への投与を含むこともある直接投与、および／または本明細書で提供される遺伝子治療用ベクターを含む組成物の処方行為であることもある間接投与の両方に関する。本明細書で細胞に関して使用する場合、組成物の、細胞への導入に関する。典型的に、有効量を投与し、その量は頻繁に、当業者によって特定される必要がある。任意の適切な投与法が、使用に予定される。いくつかの場合、例えば、細胞培養培地への遺伝子治療用ベクターの添加、または心外傷の部位へのｉｎ ｖｉｖｏ注入により、該遺伝子治療用ベクターを細胞に投与する。いくつかの場合、対象への投与は、例えば、血管内注射、心筋内送達等により達成される。
【0088】
[00105]本明細書で使用する「心細胞」という用語は、心機能、例えば、心収縮または血液供給を提供するか、または心臓の構造の維持に役立つ、心臓に存在する任意の細胞に関する。本明細書で使用する心細胞は、心臓の心外膜、心筋、または心内膜中に存在する細胞を含む。心細胞はさらに、例えば心筋細胞、および心臓血管構造の細胞、例えば、冠動脈または冠静脈の細胞を含む。心細胞の他の非限定的な例は、心筋、血管、および心細胞支持構造を構成する、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心筋幹細胞、心筋前駆細胞、心臓刺激伝導細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）、および心臓ペースメーカー細胞を含む。いくつかの場合、心細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞を含む、幹細胞に由来する。
【0089】
[00106]本明細書で使用する「ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ（心筋細胞）」または「ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ（心筋細胞）」という用語は、骨格筋細胞とは対照的に、哺乳類の心臓に天然に見出されるサルコメア含有横紋筋細胞に関する。心筋細胞は、特化分子、例えば、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、心臓α－アクチニンのようなタンパク質の発現を特徴とする。本明細書で使用する「心筋細胞」という用語は、任意の心筋細胞亜集団または心筋細胞亜型、例えば、心房心筋細胞、心室心筋細胞およびペースメーカー心筋細胞を含む総称である。
【0090】
[00107]「培養」または「細胞培養」という用語は、人工的なｉｎ ｖｉｔｒｏ環境での細胞の維持を意味する。「細胞培養系」は、本明細書で、細胞の集団を単層としてまたは懸濁液中で増殖させる培養条件に関して使用する。「培養培地」は、本明細書で、細胞の培養、成長または増殖用の栄養液に関して使用する。培養培地は、いくつかの場合、機能特性、例えば、これに限定されないが、特定の状態（例えば、多能性状態、静止状態等）に細胞を維持する能力、または細胞を成熟させる能力、例えば、いくつかの実施形態では、前駆細胞の、特定の系統の細胞（例えば、心筋細胞）への分化を促進する能力を特徴とする。
【0091】
[00108]本明細書で使用する「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」または「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」という用語は、核酸またはポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程および／または転写されたｍＲＮＡが、続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程に関する。該ポリヌクレオチドまたは核酸が、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現が、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含むこともある。いくつかの場合、遺伝子のレベルの発現は、細胞試料または組織試料中でのｍＲＮＡまたはタンパク質の量の測定により特定される。
【0092】
[00109]本明細書で使用する「発現カセット」は、タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドもしくは核酸を含む、または宿主細胞中で該ポリヌクレオチドを発現するように構成された核酸を含むＤＮＡポリヌクレオチドである。典型的に、該ポリヌクレオチドの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーを含む特定の調節エレメントの制御下に置かれている。そのようなポリヌクレオチドは、該調節エレメント（例えば、プロモーター）に「作動可能に連結している（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ）」または「作動可能に連結している（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ）」と言われる。
【0093】
[00110]「薬学上許容される」という表現は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織との接触に用いるために適切である、過剰の毒性、炎症、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴わない、妥当な利益／リスク比に応じたコンパウンド、材料、組成物、および／または剤形に言及するために使用する。
【0094】
[00111]「処置（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置する（ｔｒｅａｔ）」は、疾患、障害または状態に対する、該疾患、障害、状態および／またはそれらの症状の有害または任意の他の望ましくない効果を軽減または改善するための、薬剤を用いた行為と定義される。
【0095】
[00112]本明細書で使用する「有効量」等という用語は、所望の生理学的転帰（例えば、疾患の処置）を誘導するために十分な量に関する。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬によることもある。そのような送達は、個々の単位剤形を使用する期間、組成物のバイオアベイラビリティ、投与の経路等を含む多数の変数に依存する。しかしながら、任意の特定対象に対する組成物（例えば、遺伝子治療用ベクター）の特定量は、使用する特定薬剤の活性、年齢、体重、健康全般、性別、および対象の食事、投与の時間、排出の速度、組成物組合せ、処置される特定疾患の重症度、および投与の形を含む様々な要素に依存すると理解される。
【0096】
[00113]本明細書でポリペプチドまたは核酸の配列に関して使用する「その均等物」という用語は、比較ポリペプチドまたは比較核酸の配列と異なるが本質的特性（例えば、生物活性）を維持するポリペプチドまたは核酸に関する。ポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、ヌクレオチド配列の点で他の比較ポリヌクレオチドと異なる。該バリアントのヌクレオチド配列における変化は、該比較ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることもある。いくつかの場合、ヌクレオチド変化は、該比較配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、欠失、付加、融合、およびトランケーションをもたらす。概して、差異は限定されているため、該比較ポリペプチドおよび該バリアントの配列は、全体的に酷似し、多くの領域では同一である。
【0097】
[00114]本明細書で使用する「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、かつデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー型に関する。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、線状および環状の核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、およびプライマーを含む。本明細書で使用する、遺伝子名が先行する「ポリヌクレオチド」または「核酸」という単語（例えば「ＰＫＰ２核酸」）は、対応するタンパク質（例えば「ＰＫＰ２タンパク質」）をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
【0098】
[00115]「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、かつ遺伝的にコードされた（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｄｅｄ）アミノ酸、遺伝的にコードされていない（ｎｏｎ－ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｄｅｄ）アミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾されたアミノ酸、または誘導体化アミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むこともある、任意の長さのアミノ酸のポリマー型に関する。この用語は融合タンパク質を含み、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および同種のリーダー配列を有する融合（Ｎ末端メチオニン残基を含む、または含まない）、免疫学的なタグ付きタンパク質等を含むがこれに限定されない。本明細書で使用する、遺伝子名が先行する「タンパク質」という単語（例えば「ＰＫＰ２タンパク質」）は、天然タンパク質またはその機能的バリアントのいずれか一方に関する。「天然タンパク質」は、好ましくはそれ用にベクターが意図される生物（例えば、ヒト、げっ歯類、霊長類、または獣医目的の動物）の遺伝子のゲノムコピーによって、該遺伝子の機能的アイソフォームまた機能的対立遺伝子変異のいずれかでコードされるタンパク質である。
【0099】
[00116]本明細書で使用する、タンパク質の「機能的バリアント」または「バリアント」は、例えば該タンパク質の、他の要素と共同してデスモソームの形成を誘導する能力を含む、該タンパク質の機能的属性を維持するアミノ酸の任意の数の置換、挿入、トランケーション、または内部欠失を有するバリアントである。いくつかの場合、機能的バリアントは、計算的に同定される、例えば、保存的置換のみを有するバリアント、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏのアッセイを使用して実験的に同定される。
【0100】
[00117]本明細書で使用する、ポリヌクレオチド配列の「コドンバリアント」は、比較ポリヌクレオチドと同じタンパク質をコードする、１つまたは複数の同義コドン置換を有するポリヌクレオチド配列である。同義コドンの選択は、当業者の技能の範囲内にあり、符号化は、遺伝暗号として公知である。いくつかの場合、様々な計算ツール（ＧＥＮＳＭＡＲＴ（商標）コドン最適化ツールがｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍから入手可能）を使用してコドン最適化を行う。概して、コドン最適化は、異種系における、例えば、ヒトのコード配列を細菌系で発現させる場合に、タンパク質の発現を高めるために使用する。「コドンバリアント」という用語は、そのやり方で最適化される配列、ならびに他の目的、例えば、ＣｐＧアイランドおよび／または潜在的開始部位の除去ために最適化される配列の両方を含む。
【0101】
[00118]「ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞へと送達されるポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む、高分子または分子の複合体に関する。ベクターは、修飾ＲＮＡ、脂質ナノ粒子（ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかを封入）、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組込み型レンチウイルス（ＬＶＶ）、または非組込み型ＬＶＶであることもある。したがって、本明細書で使用する「ベクター」という用語は、形質転換に使用される裸のポリヌクレオチド（例えばプラスミド）と同様に、ポリヌクレオチドを細胞へと送達するために使用する任意の他の組成物を含み、細胞に形質導入できるベクターおよび細胞のトランスフェクションに有用なベクターを含んだ。
【0102】
[00119]本明細書で使用する「ウイルスベクター」という用語は、典型的に核酸分子の導入もしくは細胞のゲノムへの組込みを促進するウイルス由来核酸エレメントを含む核酸分子、または核酸の導入を媒介するウイルス粒子のいずれか一方に関する。ウイルス粒子は、典型的に種々のウイルス成分を含み、さらには核酸に加えて細胞成分を含むこともある。
【0103】
[00120]「遺伝子修飾」という用語は、新しい核酸（すなわち、細胞に対して外来の核酸）の導入に続いて、細胞内で誘導される永続的または一過性の遺伝子変化に関する。遺伝子変化は頻繁に、心細胞のゲノムへの、新しい核酸の組込みにより、または染色体外エレメントとしての新しい核酸の一過性または安定性の維持により成し遂げられる。細胞が真核細胞である場合、永続的な遺伝子変化は頻繁に、細胞のゲノムへの核酸の導入により達成される。適切な遺伝子修飾法は、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等を含む。
【0104】
[00121]図１は、心臓デスモソームが細胞をつなぎ合わせることを示す（Brodehl等、2018；Moncayo-ArlandiおよびBrugada、2017）。上図中の赤色線は、サルコメアおよび他の細胞小器官を安定化させるネットワークを形成する、中間径フィラメントであるデスミンを描く。デスモソームのＥＭ写真を左端に示す。
【0105】
[00122]図２は、ＡＲＶＣ疾患の徴候および可能な疾患機序の概要を示す。
[00123]図３Ａ～３Ｃは、ｉＰＳＣＭ中でのＰＫＰ２の急性サイレンシングの８日目の結果が、著しい細胞表現型を示したことを示す。図３Ａおよび図３Ｃ中、ＰＫＰ２は緑色、ＤＳＰは赤色、および核は青色である。図３Ｂ中、サルコメアタンパク質Ａｃｔｎ２は緑色で、ＭｙＢＰＣはマゼンタ色である。
[00123]図３Ａ～３Ｃは、ｉＰＳＣＭ中でのＰＫＰ２の急性サイレンシングの８日目の結果が、著しい細胞表現型を示したことを示す。図３Ａおよび図３Ｃ中、ＰＫＰ２は緑色、ＤＳＰは赤色、および核は青色である。図３Ｂ中、サルコメアタンパク質Ａｃｔｎ２は緑色で、ＭｙＢＰＣはマゼンタ色である。
【0106】
[00124]図４は、様々な用量のｓｉＰＫＰ２に応じて、サイレンシングの８日目に、ＤＳＰ膜局在の定量測定が、他のデスモソームのタンパク質であるＰＫＧとの共局在により見積もられたことを示す。
【0107】
[00125]図５は、ＰＫＰ２がサイレンシングされた細胞では、サイレンシングの対照、ｓｉＮｅｇと比べて、ＰＫＰ２のサイレンシングが、主に不溶性画分中に検出される、デスモソームからのＤＳＰタンパク質の総量の低下をもたらすことを示す免疫ブロットを例証する。
【0108】
[00126]図６Ａは、ＡＡＶ－ＰＫＰ２遺伝子治療用のベクターマップを示す。図６Ｂは、ｉＰＳＣＭへのＡＡＶ媒介遺伝子送達を使用した、ＰＫＰ２導入遺伝子の発現による、ＰＫＰ２サイレンシングの１０日目およびＡＡＶ形質導入の８日目における、ＤＳＰ膜局在の回復を示す。ＧＦＰが、ｆｌａｇタグ付きＰＫＰ２と共発現する。Ｆｌａｇタグは青緑色、ＤＳＰは赤色、および核は青色である。図６Ｃは、ｉＰＳＣ心筋細胞中でのＰＫＰ２サイレンシング後の総ＤＳＰの発現のＡＡＶ－ＰＫＰ２導入遺伝子回復を示す。免疫蛍光シグナルでの総ＤＳＰ強度の定量を、ＰＫＰ２サイレンシング後にＡＡＶ－ＰＫＰ２導入遺伝子レスキューの存在下または非存在下に示す。
【0109】
[00127]図７Ａ～７Ｂは、ＰＫＰ２サイレンシング後に、ＡＡＶ ＰＫＰ２導入遺伝子発現が、ｉＰＳＣＭの収縮速度をレスキューしたことを示す。図７Ａは、ＰＫＰ２サイレンシング、ＡＡＶ形質導入、および収縮性記録スケジュールを示す。図７Ｂは、ＰＫＰ２サイレンシング後に、ＡＡＶ－ＰＫＰ２導入遺伝子が収縮速度を部分的に回復することを示す。核の数（ｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｕｎｔ）に対して正規化した収縮速度を、ＰＫＰ２サイレンシング後のＡＡＶ－ＰＫＰ２導入遺伝子レスキューの存在下または非存在下に示す。
【0110】
[00128]図８は、ヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの第２世代ＡＡＶ発現カセットの略図を示す。左表は、発現カセット中のすべてのエレメントを示す。右図は、マウスおよびヒトの発現カセットを示す。
【0111】
[00129]図９Ａ～図９Ｂは、第２世代ＡＡＶ－ｈＰＫＰ２αが、ｉＰＳＣ心筋細胞中でのＰＫＰ２サイレンシング後の収縮速度を部分的にレスキューする予備的結果を示す。図９Ａは、ヒトＰＫＰ２α導入遺伝子が、ｉＰＳＣ心筋細胞中で用量依存性に発現したことを示す。図９Ｂは、ＰＫＰ２サイレンシング後に、ヒトＰＫＰ２α導入遺伝子が、３０Ｋ ＭＯＩにおいて収縮速度の部分的な回復を示したことを示す。
【0112】
[00130]図１０は、１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス中での第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの発現解析を示す。上図は、ＨＢＳＳ対照マウス中での内在性マウスＰＫＰ２αの発現、および２つのＡＡＶ９注入用量、それぞれ１Ｅ１３および５Ｅ１３における、内在性および形質導入されたマウスＰＫＰ２α両方の発現を示す。下図は、形質導入された、いくぶん大きいホモログであるヒトＰＫＰ２αの、対応する発現解析を示す。
【0113】
[00131]図１１Ａ～１１Ｇは、１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスでの、第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの予備的発現安全性試験を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ９注入前の体重、およびＡＡＶ９注入から３週間後の体重を示す。図１１Ｂは、マウスまたはヒトのＰＫＰ２αのいずれかのＡＡＶ９注入から３週間後に、駆出分画の百分率により心機能を測定したことを示す。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、拡張末期内径および収縮末期内径の両方により測定したＬＶ構造を示す。図１１Ｅ～１１Ｇは、ＱＲＳ時間（図１１Ｅ）、ＱＴ時間（図１１Ｆ）、およびＰ／Ｒ振幅（図１１Ｇ）により測定した電気生理学的活性を示す。
【0114】
[00132]図１２は、タモキシフェン誘導後のＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。曲線は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスが、誘導から３週間後に減少し始め、（７匹のうちの）１匹のみが６週間後まで生存したことを示す。
【0115】
[00133]図１３Ａ～１３Ｂは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの右室（ＲＶ）拡張型心筋症を示す。図１３Ａ（左図）は、タモキシフェン誘導から３週間後のＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける、対照マウスと比べたＲＶ拡張末期内径（ＲＶＩＤｄ）の増加を例証する画像を示す。図１３Ａ（右図）は、対照マウスと比べた、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける経時的なＲＶＩＤｄのグラフを示す。図１３Ｂ（左図）は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＲＶ面積の増加を例証する画像を示す。ＲＶ面積は点線で示され、面積が、誘導後１週間から、３週間、および４週間において増加することを示す。図１３Ｂ（右図）は、対照マウスと比べた、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける経時的なＲＶ面積のグラフを示す。
【0116】
[00134]図１４Ａ～１４Ｂは、対照と比べた、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの左室（ＬＶ）拡張型心筋症の発現を示す。図１４Ａ（左図）は、対照と比べた、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＬＶ収縮末期内径（ＲＶＩＤｓ）およびＬＶ拡張末期内径（ＬＶＩＤｄ）の増加の画像を示す。ＬＶＩＤｓは、左側に黄色線で示され、ＬＶＩＤｄは、右側に赤色線で示される。図１４Ａ（右図）は、対照マウスと比べた、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＬＶＩＤｓおよびＬＶＩＤｄの経時的な増加を示すグラフを示す。図１４Ｂは、経時的な駆出分画パーセントにより測定した、対照マウスと比べたＬＶパフォーマンスのグラフを示す。
【0117】
[00135]図１５は、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの重度の電気生理学的表現型の発現、特にＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＱＲＳ時間の延長およびＰ／Ｒ振幅比の上昇を示す。上のパネルは、対照（上図）およびＰＫＰ２－ｃＫＯマウス（下図）の例示的心電図を示す。対照と比べてＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでは、Ｐ波の振幅の増加が示される。心電図はさらに、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＲ波の振幅の減少を示す。さらに、ＱＲＳ時間が、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでは対照と比べて延長している。下のパネルは、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＱＲＳ時間の増加およびＰ／Ｒ振幅の増加に関するグラフを示す。
【0118】
[00136]図１６Ａ～１６Ｃは、線維症遺伝子、組織リモデリング遺伝子、および心不全マーカーの発現の上昇を示す。図１６Ａは、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＲＶおよびＬＶでのＰＫＰ２ ＲＮＡ発現（上図）ならびにデスモソームおよびＣｘ４３のタンパク質発現（下図）を示す。ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、ＬＶおよびＲＶの両方において、対照と比べて約半分のＰＫＰ２の発現を示す。下のパネルは、ＰＫＰ２、ＤＳＰ、およびデスモソーム内のＰＫＧ、およびギャップ結合内のＣｘ４３に関して、ＬＶタンパク質レベルの低下を示す免疫ブロットを示す。図１６Ｂは、線維症遺伝子：ＴＧＦβ１、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１；ならびに組織リモデリング遺伝子：Ｔｉｍｐ１およびＭｍｐ２の、対照と比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの発現の上昇を示す。ここでは、ＴＧＦβ１およびＴｉｍｐ１の発現が、対照とＰＫＰ２－ｃＫＯマウスとの間で、ＲＶおよびＬＶの両方で上昇している。Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１も同じく、対照と比べてＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでは大幅に上昇しており、ＲＶと比べてＬＶでは発現の上昇がいくぶん大きい。Ｍｍｐ２は、対照と比べてＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでは上昇することが示され、ＬＶと比べてＲＶでは発現の上昇がいくぶん大きい。Ｍｍｐ９は、対照とＰＫＰ２－ｃＫＯマウスとの間で、発現の差異は示されなかった。図１６Ｃは、対照マウスと比べたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの、心不全マーカー、ＮＰＰＡおよびＮＰＰＢの発現の上昇を示す。ＮＰＰＡおよびＮＰＰＢの発現の両方、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでは、ＲＶと比べてＬＶにおいて、上昇がいくぶん大きい。
【0119】
[00137]図１７は、ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルにおける遺伝子治療としてのＰＫＰ２の有効性を評価するための実験計画を示す。計６つの個々の処置群が試験に含まれ、すべての群を、３日間続けてタモキシフェンで処置した。それらは以下である：ＷＴマウス６匹をＨＢＳＳ緩衝液で処置；ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹をＨＢＳＳ緩衝液で処置；ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹を、タモキシフェン誘導の３週間前に３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：ヒトＰＫＰ２で処置；ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹を、タモキシフェン誘導の３週間前に５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：マウスＰＫＰ２で処置；ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹を、タモキシフェン誘導直後に５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：マウスＰＫＰ２で処置；およびＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹を、タモキシフェン誘導から１週間後に５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：マウスＰＫＰ２で処置。体重、心エコー検査、およびＥＫＧのベースライン読取りは、タモキシフェン誘導前に収集した。タモキシフェン誘導後のすべての読取りは、Ｂモード、Ｍモード（ＲＶ、ＬＶ）の心エコー検査、および構造（ＬＶ内径）、ならびに３０分ＥＣＧを含めて、不整脈を定量および電気生理学的パラメータを評価するために毎週記録した。
【0120】
[00138]図１８Ａは、ヒトおよびマウスのＰＫＰ２αのＡＡＶ発現カセットの略図を示す。ＡＡＶ－ｐＴｎＴ６００－ｍＰＫＰ２－ＷＰＲＥは、４１９９塩基対を有し、５’末端および３’末端の逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ｐｃＴＮＴプロモーター、それに続くマウスＰＫＰ２αのコード配列、続くＷＰＲＥ、ならびに３’ＩＴＲ前方の３’末端にあるｂＧＨを含む。ＡＡＶ－ｐＴｎＴ６００－ｈＰＫＰ２ｏｐ－ＷＰＲＥは、４３２４塩基対を有し、５’末端および３’末端の逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ｐｃＴＮＴプロモーター、それに続くコドン最適化された、ヒトＰＫＰ２αのコード配列、続くＷＰＲＥ、ならびに３’ＩＴＲ前方の３’末端にあるｂＧＨを含む。図１８Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置した野生型マウスに由来するマウスおよびヒトＰＫＰ２αのタンパク質発現の免疫ブロットを示す（図１０の全ブロットを参照）。緩衝液処置マウスが左パネルにある。中央パネルが、ｋｇ当たり１Ｅ１３ウイルスゲノムで処置したマウスに由来する免疫ブロットを示し、上図の免疫ブロットではＡＡＶ９：ｍＰＫＰ２を用い、下図の免疫ブロットではＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２（コドン最適化）を用いた。右パネルが、ｋｇ当たり５Ｅ１３ウイルスゲノムで処置したマウスに由来する免疫ブロットを示し、上図の免疫ブロットではＡＡＶ９：ｍＰＫＰ２を用い、下図の免疫ブロットではＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２（コドン最適化）を用いた。
【0121】
[00139]図１９は、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。緩衝液で処置したマウスを赤色線で示し、タモキシフェン誘導から３週間後に減少し始め、タモキシフェン誘導から６週間後では、生存確率がほぼゼロである。処置群のすべては、タモキシフェン誘導から６週間後に９０％以上の生存確率を有する。
【0122】
[00140]図２０Ａ～２０Ｃは、ＲＶおよびＬＶの拡張の低下ならびに心機能の維持における、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置の有効性を示す。図２０Ａは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスにおける駆出分画の改善を例証するグラフを示す。このグラフ中、緩衝液処置ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、野生型およびＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスの両方と比べて、駆出分画の３４％の低下を有する。図２０Ｂは、野生型およびＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスと比べて上昇している赤色線で示される緩衝液処置マウスと比べた、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置マウスにおけるＲＶ拡張の低下を例証するグラフを示す。図２０Ｃは、ＬＶＩＤｄ（上図）およびＬＶＩＤｓ（下図）における改善を例証するグラフを示す。各処置群を別個の棒グラフで例証し、野生型および緩衝液処置ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスを左側に示す。
【0123】
[00141]図２１Ａ～２１Ｂは、ＡＡＶ：ＰＫＰ２で処置されたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＥＣＧパラメータの改善を示す。図２１Ａは、対照、ならびにＡＡＶ９：ＰＫＰ２および緩衝液で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの例示的な未処理のＥＣＧトレースを示す。緩衝液処置した対照およびＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＥＣＧトレースを、上側の２パネルに示す。ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、下側の２つのトレースに示す。図２１Ｂは、緩衝液での処置と比べたＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおけるＰ／Ｒ比（上側グラフ）、ＱＴ時間（中央グラフ）、およびＱＲＳ時間（下側グラフ）の改善を例証するグラフを示す。どの場合も、緩衝液処置ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、処置マウスおよび野生型マウスに対する外れ値である。
【0124】
[00142]図２２Ａ～２２Ｂは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける不整脈でのＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置による改善を示す。図２２Ａ（上図）は、不整脈の重症度の分類の表を示す。グレード５はＳ－ＶＴ／ＶＦ／心臓突然死を意味し；４はＮＳＶＴを意味し；３は＞１００ＰＶＣ、２連発および３連発を意味し；２は＞５０、＜１００のＰＶＣを意味し；１は＜５０のＰＶＣ、ＰＪＣ、およびＡＶブロックを意味し；０は＜１０のＰＶＣを意味する。図２２Ａ（下図）は、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの不整脈スコアの、対照と比べた改善をまとめるグラフを示す。緩衝液処置ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、タモキシフェン誘導から３週間後に始まる心室性不整脈スコアの上昇を伴う。図２２Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける不整脈の重症度の、対照と比べた改善を示す分布グラフを示す。野生型マウスを一番左側の棒グラフに示し、続いて平均スコア３を示す緩衝液処置ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスを示す。処置マウスを４つの棒グラフで表し、それらは、平均して、劇的なスコアの低下を示す。
【0125】
[00143]図２３は、ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルを用いて、遺伝子治療としてのヒトＰＫＰ２の有効性を評価するために使用した実験計画を示す。ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスを、３日間続けてタモキシフェンで処置してから、種々の用量のＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２またはＨＢＳＳで処置した。
【0126】
[00144]図２４Ａ～２４Ｄは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２遺伝子治療処置の結果を示す。図２４Ａは、駆出分画の結果を示し、対照マウスは高い駆出分画を示し、その駆出分画は、タモキシフェン誘導により低下し、かつＨＢＳＳ処置により影響を受けない。ＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２の用量を増加させた処置は、処置マウスでの駆出分画を著しく高める（Ｐ＜０．０５）。図２４Ｂは、右室サイズの結果を示す。対照マウスは、比較的小さいＲＶサイズを有し、そのＲＶサイズは、タモキシフェン誘導により増大し、かつＨＢＳＳ処置により影響を受けない。ＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、用量関連（ｄｏｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ）のＲＶサイズの低下を示す（低い方の２用量はＰ＜０．０５、最高の用量はＰ＜０．０１）。図２４Ｃは、ＬＶＩＤｄにより測定したＬＶ拡張を示す。図２４Ｄは、ＬＶＩＤｓにより測定したＬＶ拡張を示す。ＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、ＬＶＩＤｄ（Ｐ＜０．０５）およびＬＶＩＤｓ（Ｐ＜０．０５、１ｅ１４用量の場合のみ）で測定して、左室拡張の増大を著しく低下させた。
【0127】
[00145]図２５は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２遺伝子治療処置結果を、ＱＴ時間（上図）、Ｐ／Ｒ比（中央図）、および不整脈スコア（下図）に関して示す。ＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、タモキシフェン誘導から４週間後に、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでは、赤色バーで示すＨＢＳＳで処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスと比べて、ＱＴ時間の著しい減少（Ｐ＜０．０５）、Ｐ／Ｒ比の低下傾向、および不整脈の低下傾向を示した。
【0128】
[00146]図２６Ａ～２６Ｂは、右室（図２６Ａ）および左室（図２６Ｂ）での心不全マーカー、線維症マーカー、および組織リモデリングマーカーの発現の低下における、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置の結果を示す。ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、タモキシフェン誘導から４週間後に、右室および左室の両方で、心不全マーカー、線維症遺伝子および組織リモデリング遺伝子の発現の低下において有効性を示した。ＰＫＰ２の内在性および導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ＷＴ対照、ＰＫＰ２－ｃＫＯ、およびＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２形質導入した心臓のぞれぞれで評価した。ＮＰＰＡおよびＮＰＰＢは心不全マーカーである。Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１は線維症遺伝子である。Ｔｉｍｐ１は組織リモデリング遺伝子である。
【0129】
[00147]図２７Ａ～２７Ｂは、タモキシフェン誘導から４週間後の右室および左室の両方での線維症発症の低下における、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置の結果を示す。図２７Ａは、筋肉染色を赤色で、および線維症のトリクローム染色を青色で示す。黄色矢印は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの心臓における著しい線維症の領域を強調する。図２７Ｂは、対照、ならびにＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２による処置を伴うおよび伴わないＰＫＰ２－ｃＫＯマウス中でのコラーゲン陽性組織を定量するグラフを示す。未処置ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、最も大量のコラーゲン陽性組織を有し、１ｅ１３で処置したマウスは、約半分だけ低下したレベルを有する。３ｅ１３または１ｅ１４で処置したマウスは、対照マウスに近いコラーゲンレベルを有する。
【0130】
[00148]図２８Ａ～２８Ｂは、可溶性画分（図２８Ａ）および不溶性画分（図２８Ｂ）中でのＰＫＰ２および他のデスモソームタンパク質の発現を示す。可溶性画分中にはＤＳＰは検出されない。注釈：＊このマウスは心エコー検査前に死亡が認められた。＊＊ＰＫＰ２タンパク質強度は、同じウエスタンブロット上でのチューブリン強度に対して正規化。見やすくするため、ここでは２つのチューブリンブロットのうちの１つのみを示す。ＰＫＰ２は、２つのバンド、内在性マウスＰＫＰ２およびより大きいヒトＰＫＰ２として示される。
【実施例】
【0131】
[00149]以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を説明する目的のために与えられており、任意のやり方で本開示を限定するとは意図されない。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、好ましい実施形態をここで代表し、例示的であり、かつクレームの範囲に対する限定とは意図されない。当業者であれば、クレームの範囲により定義される本開示の範囲内に含まれる、その中での変更および他の使用に想到する。
【0132】
実施例１：ＰＫＰ２欠失の細胞モデル
[00150]発想の最初の証明として、ｓｉＲＮＡを使用して、ＰＫＰ２の欠失の細胞モデルを創生した。ＰＫＰ２を、人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳＣＭ）中で欠失させた。ｓｉＲＮＡによる、ＰＫＰ２の急性サイレンシングは、ｓｉＰＫＰ２および陰性対照ｓｉＲＮＡの両方を含む、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入したｓｉＲＮＡを使用して行った（４３９０８４３ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ陰性対照Ｎｏ．１ ｓｉＲＮＡ；４３９２４２０ Ａｓｓａｙ Ｉｄ ｓ５３１２０２ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ ＃１；４３９２４２０ Ａｓｓａｙ Ｉｄ ｓ５３１２０３ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ＃２；４３９２４２０ Ａｓｓａｙ Ｉｄ ｓ５３１２０４ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ ＃３；および４３９２４２０ Ａｓｓａｙ Ｉｄ ｓ１０５８５ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ ＃４）。このサイレンシングは、図３Ａの免疫蛍光が示すように、８日目に、細胞膜からＤＳＰを消失させた。ＤＳＰ膜局在を定量測定し（図４）、ＤＳＰ－ＰＫＧ共局在の著しい低下を例証した。サルコメア密度の低下が同じく、免疫蛍光により観察された（図３Ｂ）。さらに、パターン化されたｉＰＳＣＭにおける細胞コンパクションの錯綜配列が、免疫蛍光により認められた（図３Ｃ）。
[00150]発想の最初の証明として、ｓｉＲＮＡを使用して、ＰＫＰ２の欠失の細胞モデルを創生した。ＰＫＰ２を、人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳＣＭ）中で欠失させた。ｓｉＲＮＡによる、ＰＫＰ２の急性サイレンシングは、ｓｉＰＫＰ２および陰性対照ｓｉＲＮＡの両方を含む、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入したｓｉＲＮＡを使用して行った（４３９０８４３ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ陰性対照Ｎｏ．１ ｓｉＲＮＡ；４３９２４２０ Ａｓｓａｙ Ｉｄ ｓ５３１２０２ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ ＃１；４３９２４２０ Ａｓｓａｙ Ｉｄ ｓ５３１２０３ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ＃２；４３９２４２０ Ａｓｓａｙ Ｉｄ ｓ５３１２０４ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ ＃３；および４３９２４２０ Ａｓｓａｙ Ｉｄ ｓ１０５８５ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ ＃４）。このサイレンシングは、図３Ａの免疫蛍光が示すように、８日目に、細胞膜からＤＳＰを消失させた。ＤＳＰ膜局在を定量測定し（図４）、ＤＳＰ－ＰＫＧ共局在の著しい低下を例証した。サルコメア密度の低下が同じく、免疫蛍光により観察された（図３Ｂ）。さらに、パターン化されたｉＰＳＣＭにおける細胞コンパクションの錯綜配列が、免疫蛍光により認められた（図３Ｃ）。
【0133】
[00151]ｓｉＰＫＰ２ ｉＰＳＣＭ溶解物の免疫ブロットを行い、デスモソームからのＤＳＰタンパク質の総量の低下が、主に、ＰＫＰ２がサイレンシングされた細胞の不溶性画分で検出された（図５）。
【0134】
実施例２：ＡＡＶ９－ＰＫＰ２はＰＫＰ２欠失表現型をレスキューする
[00152]形質導入細胞を同定するためのＧＦＰを伴う、６００ ｎｔ心臓トロポニン（ＴｎＴ）プロモーターによって駆動されるＡＡＶ９バリアントＣＲ９－０１ ｆｌａｇタグ付きＰＫＰ２発現の送達により（図６Ａ）、ＰＫＰ２サイレンシングされたｉＰＳＣＭ中での膜へのＤＳＰの再局在が認められ（図６Ｂ）、その際、デスモソーム構造が回復された。ＰＫＰ２導入遺伝子は、ｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングに抵抗するためにコドン最適化された。技術的な困難さゆえ、どれだけのＤＳＰが、細胞間結合が起こりデスモソームが存在する膜へと特異的に局在するかを正確に定量することは不可能であった。したがって、膜に局在したＤＳＰの量の代わりに、細胞ＤＳＰの総強度を定量した。
[00152]形質導入細胞を同定するためのＧＦＰを伴う、６００ ｎｔ心臓トロポニン（ＴｎＴ）プロモーターによって駆動されるＡＡＶ９バリアントＣＲ９－０１ ｆｌａｇタグ付きＰＫＰ２発現の送達により（図６Ａ）、ＰＫＰ２サイレンシングされたｉＰＳＣＭ中での膜へのＤＳＰの再局在が認められ（図６Ｂ）、その際、デスモソーム構造が回復された。ＰＫＰ２導入遺伝子は、ｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングに抵抗するためにコドン最適化された。技術的な困難さゆえ、どれだけのＤＳＰが、細胞間結合が起こりデスモソームが存在する膜へと特異的に局在するかを正確に定量することは不可能であった。したがって、膜に局在したＤＳＰの量の代わりに、細胞ＤＳＰの総強度を定量した。
【0135】
[00153]ＰＫＰ２導入遺伝子が、心筋細胞の収縮性を機能的に回復し得ることを実証するために、ＳＯＮＹイメージングによりｉＰＳＣＭの明視野ベースの収縮を記録し、かつビデオは、ＤＡＮＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓのパルス解析ソフトウェアにより解析した。実験時系列を図７Ａに示す。この実験では、ｉＰＳＣＭ細胞中での内在性ＰＫＰ２の発現を下げるために、１日目にｓｉＲＮＡを使用した。ｓｉＲＮＡ陰性対照またはｓｉＰＫＰ２のいずれか一方に関して、２つのｓｉＲＮＡ濃度、５ｎＭおよび１．２５ｎＭを使用した。転写物をサイレンシングするために、２つのｓｉＰＫＰ２ ＃３および＃４を組み合わせた。３日目に、欠失させた細胞に形質導入するためにＡＡＶ ＰＫＰ２を使用し、ＰＫＰ２導入遺伝子の発現に応じて、ｉＰＳＣＭ中で収縮速度のレスキューが認められた（図７Ｂ）。ＡＡＶ形質導入から３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、および８日目に収縮性を記録した。収縮速度は、３つの９６ウェルプレート、および５ｎＭおよび１．２５ｎＭのｓｉＲＮＡの両方において、それぞれＡＡＶ ３００Ｋ ＭＯＩまたは１００Ｋ ＭＯＩのいずれか一方で形質導入した細胞から平均化した。速度値はさらに、それぞれ３００Ｋまたは１００Ｋ ＭＯＩに対応する平均の核の数に対して正規化した。
【0136】
実施例３：第２世代ＰＫＰ２α ＡＡＶ９を用いた処置
[00154]ヒトまたはマウスのＰＫＰ２αの発現用に、第２世代ＡＡＶ発現カセットを開発した。該第２世代カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリ（Ａ））を含んだ。該第２世代ベクターを図８に示す。
[00154]ヒトまたはマウスのＰＫＰ２αの発現用に、第２世代ＡＡＶ発現カセットを開発した。該第２世代カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリ（Ａ））を含んだ。該第２世代ベクターを図８に示す。
【0137】
[00155]導入遺伝子レスキュー試験は、ＰＫＰ２サイレンシングしたｉＰＳＣ心筋細胞中で行った。予備的結果は、第２世代ＡＡＶ－ｈＰＫＰ２αが、ｉＰＳＣ心筋細胞中でのＰＫＰ２サイレンシング後の収縮速度を部分的にレスキューしたことを示唆した。図９Ａは、異なるＭＯＩ（感染多重度、各細胞に感染するウイルス粒子の平均数）により、ヒトＰＫＰ２α導入遺伝子を、ｉＰＳＣ心筋細胞中で用量依存性に発現させた結果を示す。ＰＫＰ２およびＤＳＰ（デスモプラキン）の発現は、ＡＡＶ形質導入から３日後の細胞の可溶性画分および不溶性画分の両方において評価した。図９Ｂは、ヒトＰＫＰ２α導入遺伝子が、３０Ｋ ＭＯＩにおいて、スチューデントのｔ検定により示されるように、ＡＡＶ ＰＫＰ２導入遺伝子なしの＜０．０００１のｐ値と比べて０．０１０３のｐ値により、ＰＫＰ２サイレンシング後の収縮速度の部分的なレスキューを示したことを示す。
【0138】
[00156]１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス中での第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの発現解析を調査する実験を行った。その実験の結果を図１０に示す。後眼窩静脈内に、ＡＡＶ９－ＰＫＰ２αを、それぞれ１Ｅ１３および５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇで投与した。心臓ＬＶ組織を、注入から３．５週間後に採取した。ＬＶ組織の可溶性画分を、ウエスタンブロットで解析した。上図は、ＨＢＳＳ対照マウス中での内在性マウスＰＫＰ２αの発現、および２つのＡＡＶ９注入用量、それぞれ１Ｅ１３および５Ｅ１３における、内在性および形質導入されたマウスＰＫＰ２α両方の発現を示す。下図は、形質導入された、いくぶん大きいホモログであるヒトＰＫＰ２αの、対応する発現解析を示す。このヒトホモログは、コドン最適化されている。ＡＡＶ注入から３．５週間後に、心エコー図により、有害な心イベントは認められなかった。
【0139】
[00157]図１１Ａ～１１Ｇは、１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスでの、第２世代ＡＡＶ９のヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの予備的発現安全性試験が、ＡＡＶ注入から３週間後に、心エコー図により、いずれかの有害な心イベントを示さなかったことを示す。後眼窩静脈内に、ＡＡＶ９－ＰＫＰ２αを、それぞれ１Ｅ１３および５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇで投与した。図１１Ａは、ＡＡＶ９注入前の体重、およびＡＡＶ９注入から３週間後の体重を示す。図１１Ｂは、マウスまたはヒトのＰＫＰ２αのいずれかのＡＡＶ９注入から３週間後に、駆出分画の百分率により測定した心機能を示す。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、拡張末期内径および収縮末期内径の両方により測定したＬＶ構造を示す。図１１Ｅ～１１Ｆは、ＱＲＳ時間、ＱＴ時間、およびＰ／Ｒ振幅により測定した電気生理学的活性を示す。
【0140】
実施例４：ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルの特徴づけ
[00158]およそ３月齢の野生型マウス４匹およびＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス、αＭＹＨＣ－Ｃｒｅ－ＥＲ（Ｔ２），ＰＫＰ２ｆｌ／ｆｌ７匹に、タモキシフェン（２０ｍｇ／ｍｌトウモロコシ油１００μｌ／マウス（およそ７５ｍｇ／ｋｇ））を、４日間続けて腹腔内注射した。体重、心エコー検査、およびＥＫＧのベースライン読取りは、タモキシフェン誘導前に収集した。タモキシフェン誘導後のすべての読取りは、Ｂモード、Ｍモード（ＲＶ、ＬＶ）の心エコー検査、および構造（ＬＶ内径）、ならびに３０分ＥＣＧを含めて、不整脈を定量および電気生理学的パラメータを評価するために毎週記録した。心臓および肺を含む末端組織（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ）を、試験の終了時に収集した。
[00158]およそ３月齢の野生型マウス４匹およびＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス、αＭＹＨＣ－Ｃｒｅ－ＥＲ（Ｔ２），ＰＫＰ２ｆｌ／ｆｌ７匹に、タモキシフェン（２０ｍｇ／ｍｌトウモロコシ油１００μｌ／マウス（およそ７５ｍｇ／ｋｇ））を、４日間続けて腹腔内注射した。体重、心エコー検査、およびＥＫＧのベースライン読取りは、タモキシフェン誘導前に収集した。タモキシフェン誘導後のすべての読取りは、Ｂモード、Ｍモード（ＲＶ、ＬＶ）の心エコー検査、および構造（ＬＶ内径）、ならびに３０分ＥＣＧを含めて、不整脈を定量および電気生理学的パラメータを評価するために毎週記録した。心臓および肺を含む末端組織（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ）を、試験の終了時に収集した。
【0141】
[00159]マウスを用いて生存時間解析を行った（図１２）。カプラン・マイヤー生存曲線は、タモキシフェン誘導から３週間後に、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの生存の急激な減少を示し、１匹のみがタモキシフェン誘導から６週間に達した。誘導から３週間後、マウスは、突然死、浮腫、活性の低下、およびイソフルランに対する耐性の低下を含む重度の臨床症状を示した。
【0142】
[00160]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、タモキシフェン誘導から早くも１週間後にＲＶ拡張型心筋症を発現した。図１３Ａの左図は、タモキシフェン誘導から３週間後に、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスが、ＲＶ拡張末期内径（ＲＶＩＤｄ）の増加を発現したことを示す。図１３Ａの右図は、タモキシフェン誘導の４週間中の、体重に対して正規化したＲＶＩＤｄの連続的な増加をまとめる。図１３Ｂの左図は、ＲＶ面積の毎週の増加の画像を示し、ＲＶ拡張を示唆する。図１３Ｂの右図は、ＲＶ面積が、体重に対して正規化して増加することをまとめる。Ｐ値：スチューデントのｔ検定。エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．対照と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【0143】
[00161]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、タモキシフェン誘導後にＬＶ拡張型心筋症を発現した。図１４Ａの左図は、タモキシフェン誘導から３週間後に、ＰＫＰ２－ｃＫＯが、ＬＶ収縮末期内径（ＲＶＩＤｓ）およびＬＶ拡張末期内径（ＲＶＩＤｄ）の増加を発現したことを示す。図１４Ａの右図は、タモキシフェン誘導の４週間中の、体重に対して正規化したＬＶＩＤｓおよびＬＶＩＤｄの連続的な増加をまとめる。図１４Ｂは、駆出分画％により測定したＬＶパフォーマンスが、タモキシフェン誘導から２週間後に急激に減少したことを示す。Ｐ値：スチューデントのｔ検定。エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．対照と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【0144】
[00162]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、ＱＲＳ時間の延長およびＰ／Ｒ振幅比の上昇を発現し、心室伝導障害および心室内ブロックを示唆する。図１５の上図は、タモキシフェン誘導から３週間後に、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスが、Ｐ波振幅の増加およびＲ波振幅の減少を発現したことを示す。図１５の左下のグラフは、ＱＲＳ時間の連続的な増加を示し、右下のグラフは、タモキシフェン誘導の４週間中の、Ｐ／Ｒ振幅比の上昇を示す。Ｐ値：スチューデントのｔ検定。エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．対照と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【0145】
[00163]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、自発性心室性期外収縮（ＰＶＣ）を発現した。表２は、３０分間の連続記録中に得られたデータを示し、１週時はＰＶＣがほぼ不在であるのに対して、２週時は、すべてのＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおいて時折の期外収縮が検出された。ＰＶＣの発生は、後の時間にはさらに増加し、マウスの大半が１００超のＰＶＣを示す。３週時を起点に、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおいて心臓突然死が認められた。
【0146】
【表2】
【0147】
[00164]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスは、線維症遺伝子、組織リモデリング遺伝子、および心不全マーカーの発現の上昇を示した。図１６Ａの上図は、野生型およびＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＲＶおよびＬＶの両方におけるＰＫＰ２ ｍＲＮＡの発現を示す。赤色および青色の点が、個々のマウスを表す。図１６Ａの下図は、ＰＫＰ２、ＤＳＰ、およびデスモソーム内のＰＫＧ、およびギャップ結合内のＣｘ４３に関して、ＬＶタンパク質レベルの低下の代表的な免疫ブロットを示す。図１６Ｂは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスが、線維症遺伝子、ＴＧＦβ１、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１、ならびに組織リモデリング遺伝子、Ｔｉｍｐ１およびＭｍｐ２の発現の上昇を示したことを示す。図１６Ｃは、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスが、心不全マーカー、ＮＰＰＡおよびＮＰＰＢの発現の上昇を示したことを示す。
【0148】
実施例５：ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルにおけるＰＫＰ２遺伝子治療の有効性
[00165]図１７は、ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルを用いて、遺伝子治療標的としてのＰＫＰ２の有効性を評価するために使用した実験計画を示す。計６つの個々の処置群が試験に含まれ、すべての群を、３日間続けてタモキシフェンで処置した。処置群は次のとおり：ＨＢＳＳ緩衝液で処置した野生型マウス６匹；ＨＢＳＳ緩衝液で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹；タモキシフェン誘導の３週間前に３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：ヒトＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹；タモキシフェン誘導の３週間前に５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：マウスＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹；タモキシフェン誘導直後に５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：マウスＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹；およびタモキシフェン誘導から１週間後に５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：マウスＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹。
[00165]図１７は、ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルを用いて、遺伝子治療標的としてのＰＫＰ２の有効性を評価するために使用した実験計画を示す。計６つの個々の処置群が試験に含まれ、すべての群を、３日間続けてタモキシフェンで処置した。処置群は次のとおり：ＨＢＳＳ緩衝液で処置した野生型マウス６匹；ＨＢＳＳ緩衝液で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹；タモキシフェン誘導の３週間前に３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：ヒトＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹；タモキシフェン誘導の３週間前に５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：マウスＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹；タモキシフェン誘導直後に５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：マウスＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹；およびタモキシフェン誘導から１週間後に５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：マウスＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス１０匹。
【0149】
[00166]体重、心エコー検査、およびＥＫＧのベースライン読取りは、タモキシフェン誘導前に収集した。タモキシフェン誘導後のすべての読取りは、Ｂモード、Ｍモード（ＲＶ、ＬＶ）の心エコー検査および構造（ＬＶ内径）、ならびに３０分ＥＣＧを含めて、不整脈を定量および電気生理学的パラメータを評価するために毎週記録した。末端組織（心臓および肺）を、試験の終了時に採取する。
【0150】
[00167]ＡＡＶ９：ＰＫＰ２タンパク質の発現が、野生型マウスのＬＶ心臓組織中で検出された。図１８Ａは、ヒトおよびマウスのＰＫＰ２αの第２世代ＡＡＶ発現カセットの略図を示す。図１８Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２の後眼窩注射から３週間後におけるマウスおよびヒトのＰＫＰ２の発現を示すために行った代表的な免疫ブロットを示す（全ブロットは図１０に示す）。計５匹の８週齢のＣ５７ＢＬ６野生型マウスに、各処置に関して、ＨＢＳＳ、１Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇを注入した。
【0151】
[00168]カプラン・マイヤー生存曲線は、タモキシフェン誘導から６週間後に、すべてのＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置群において、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２が、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの寿命を延長したことを示した。ヒトおよびマウスのＰＫＰ２の両方、処置されたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの寿命の延長において有効性を実証した。図１９中、赤色線は、ＨＢＳＳ緩衝液で処置されたＰＫＰ２－ｃＫＯマウスであり、タモキシフェン誘導から３週間後に急激な低下を示す。それに対して、すべてのＡＡＶ９－ＰＫＰ２処置マウスは、タモキシフェン誘導から２０週間後まで生存した。
【0152】
[00169]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置は、ＲＶおよびＬＶの拡張の低下ならびに心機能の維持における有効性を示した。図２０Ａは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置が、ＨＢＳＳ処置マウス（赤色線で示す）と比べて、駆出分画パーセントの低下を妨げたことを示す。図２０Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置が、毎週、体重に対して正規化したＲＶ面積により評価して、ＲＶ拡張の低下を示したことを示す。図２０Ｃは、タモキシフェン誘導から４週間後に、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置が、ＬＶ拡張末期内径（ＬＶＩＤｄ）（上側グラフ）およびＬＶ収縮末期内径（ＬＶＩＤｓ）（下側グラフ）の両方により測定して（いずれも体重で正規化）、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＬＶ拡張を著しく低下させたことを示す。エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．対照と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【0153】
[00170]ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置はさらに、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＥＣＧパラメータを著しく改善した。図２１Ａは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの心臓の電気生理学的挙動の著しい改善を示した未処理のＥＣＧトレースの例を示す。図２１Ｂは、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置が、赤色線で示される、ＨＢＳＳで処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスと比べて、Ｐ／Ｒ比（上側グラフ）、ＱＴ時間（中央グラフ）、およびＱＲＳ時間（下側グラフ）の著しい改善を示したことを示す。
【0154】
[00171]ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置はさらに、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの不整脈を著しく軽減した。図２２Ａ（上図）は、麻酔ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスにおける３０分の記録中の自発性不整脈の重症度を分類するレベルチャートの表を示す。心室性期外収縮（ＩＰＶＣ）、房室結節性期外収縮（ＰＪＣ）、ＡＶブロック（房室ブロック）、非持続性心室頻拍（ＮＳＶＴ）、上室性頻拍（Ｓ－ＶＴ）、および心室細動。図２２Ａ（下図）は、レベルチャートに基づく平均スコアをまとめ、ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでの不整脈の改善を示す。図２２Ｂは、タモキシフェン誘導から４週間後における各処置群での個々のマウスの分布を示す。ＡＡＶ９：ＰＫＰ２処置は、赤色バーで示される、ＨＢＳＳ緩衝液で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスと比べた場合に不整脈スコアの改善で示されるように、不整脈イベントの頻度および重症度の両方の低下を示した。
【0155】
実施例６：ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルにおいてＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２を使用したＰＫＰ２遺伝子治療有効性試験
[00172]ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルを使用して、遺伝子治療標的としてのヒトＰＫＰ２の有効性を特定した。計５つの個々の処置群を試験に含めた。すべての群を、３日間続けてタモキシフェンで処置した。群は以下を含んだ：ＨＢＳＳ緩衝液で処置した野生型マウス４匹；ＨＢＳＳ緩衝液で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス４匹；タモキシフェン誘導から１週間後に１Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：ヒトＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス４匹；タモキシフェン誘導から１週間後に３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：ヒトＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス３匹；およびタモキシフェン誘導から１週間後に１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：ヒトＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス３匹。体重、心エコー検査、およびＥＫＧのベースライン読取りは、タモキシフェン誘導前に収集した。タモキシフェン誘導後のすべての読取りは、Ｂモード、Ｍモード（ＲＶ、ＬＶ）の心エコー検査、および構造（ＬＶ内径）、ならびに３０分ＥＣＧを含めて、不整脈を定量および電気生理学的パラメータを評価するために毎週記録した。タモキシフェン誘導から４週間後に、末端心臓組織を採取した。図２３は、実験計画を示す。
[00172]ＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウスモデルを使用して、遺伝子治療標的としてのヒトＰＫＰ２の有効性を特定した。計５つの個々の処置群を試験に含めた。すべての群を、３日間続けてタモキシフェンで処置した。群は以下を含んだ：ＨＢＳＳ緩衝液で処置した野生型マウス４匹；ＨＢＳＳ緩衝液で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス４匹；タモキシフェン誘導から１週間後に１Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：ヒトＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス４匹；タモキシフェン誘導から１週間後に３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：ヒトＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス３匹；およびタモキシフェン誘導から１週間後に１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９：ヒトＰＫＰ２で処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ ＡＲＶＣマウス３匹。体重、心エコー検査、およびＥＫＧのベースライン読取りは、タモキシフェン誘導前に収集した。タモキシフェン誘導後のすべての読取りは、Ｂモード、Ｍモード（ＲＶ、ＬＶ）の心エコー検査、および構造（ＬＶ内径）、ならびに３０分ＥＣＧを含めて、不整脈を定量および電気生理学的パラメータを評価するために毎週記録した。タモキシフェン誘導から４週間後に、末端心臓組織を採取した。図２３は、実験計画を示す。
【0156】
[00173]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、タモキシフェン誘導から４週間後に、右室（ＲＶ）および左室（ＬＶ）の拡張の低下ならびに心機能の維持における有効性を示した。図２４Ａ～２４Ｄは、このアッセイの結果を示す。ＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、ＨＢＳＳ処置マウスと比べて、駆出分画パーセントの低下を妨げた（図２４Ａ）。ＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、体重に対して正規化したＲＶ面積により評価して、ＲＶ拡張の低下を示した（図２４Ｂ）。ＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、ＬＶ拡張末期内径（ＬＶＩＤｄ）（図２４Ｃ）およびＬＶ収縮末期内径（ＬＶＩＤｓ）（図２４Ｄ）の両方により測定して（いずれも体重で正規化）、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＬＶ拡張を著しく低下させた。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定により特定した、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．対照と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【0157】
[00174]ＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、タモキシフェン誘導から４週間後に、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスでは、ＨＢＳＳで処置したＰＫＰ２－ｃＫＯマウスと比べて、ＱＴ時間の著しい減少（図２５の上図）、Ｐ／Ｒ比の低下傾向（図２５の中央図）、および不整脈の低下傾向（図２５の下図）を示した。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定により特定した、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．対照と比較して＊Ｐ＜０．０５。この試験に含めたマウスの数が少ないため、Ｐ／Ｒ比および不整脈スコアは、統計的有意性を達成しなかった。さらに、ＨＢＳＳ処置群中の１匹のマウスは、タモキシフェン誘導から４週間後に、ＥＣＧ記録後、人道的エンドポイントに達した。１ｅ１３用量群中の１匹のマウスは、心エコー検査前に死亡が判明した。全体的に、この試験の結果は、最適有効量が、３ｅ１３ｖｇ／ｋｇであることを示唆する。
【0158】
[00175]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、タモキシフェン誘導から４週間後に、右室（図２６Ａ）および左室（図２６Ｂ）の両方で、心不全マーカー、線維症遺伝子および組織リモデリング遺伝子の発現の低下において有効性を示した。ＰＫＰ２の内在性および導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを、野生型対照、ＰＫＰ２－ｃＫＯ、およびＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２形質導入した心臓のぞれぞれで評価した。ＮＰＡＡおよびＮＰＰＢは心不全マーカーである。Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１は線維症遺伝子である。Ｔｉｍｐ１は組織リモデリング遺伝子である。
【0159】
[00176]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、タモキシフェン誘導から４週間後に、右室および左室の両方で、線維症発症の低下における有効性を示した（図２７Ａ）。筋肉染色を赤色で、および線維症のトリクローム染色を青色で示す。矢印は、ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスの心臓における著しい線維症の領域を強調する。図２７Ｂではコラーゲンを定量し、ＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２による処置が、コラーゲンをほぼ対照レベルに低下させたことを示す。
【0160】
[00177]ＰＫＰ２－ｃＫＯマウスのＡＡＶ９：ｈＰＫＰ２処置は、ヒトＰＫＰ２導入遺伝子の用量依存性の発現を示した。ＰＫＰ２、ならびに他のデスモソームタンパク質ＤＳＰおよびＰＫＧの総発現レベルを、タモキシフェン誘導から４週間後に、ＬＶ組織の可溶性画分（図２８Ａ）および不溶性画分（図２８Ｂ）の両方において評価した。可溶性画分中にはＤＳＰは検出されない。注釈：＊このマウスは心エコー検査前に死亡が認められた。＊＊ＰＫＰ２タンパク質強度は、同じウエスタンブロット上でのチューブリン強度に対して正規化。見やすくするため、図２８Ａ～Ｂでは２つのチューブリンブロットのうちの１つのみを示す。ＰＫＰ２は、２つのバンド、内在性マウスＰＫＰ２およびより大きいヒトＰＫＰ２として示される。
【0161】
[00178]本開示の好ましい実施形態を、本明細書に示して記載したが、そのような実施例は、単に例として提供されるのみであることが当業者には明らかである。当業者であれば、本開示を逸脱することなく、多数の変形形態、変更および代用に想到する。本明細書に記載される実施形態の種々の代案が使用され得ると理解される。以下のクレームが本開示の範囲を定義する、かつそれらのクレームの範囲内の方法および構造ならびにその均等物が網羅されると意図される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図24D】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図27A】
【図27B】
【図28A】
【図28B】
【配列表】